CN107653193B - 高效溶磷耐盐日本曲霉m1及其在作物增产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株高效溶磷、耐盐日本曲霉(Aspergillus japonicus)M1及其在作物增产中的应用。菌株M1保藏号CGMCC NO.14627，可耐受10％的NaCl。本发明的M1菌剂能够高效溶解多种难溶磷，溶解率达到36.59‑78.4％。菌株M1溶磷能力超过目前报道的国际公认的溶磷拜莱青霉菌(ATCC20851)，可以作为田间条件下提高磷矿粉作物有效性的生物措施。M1生物菌剂促生、增产效果明显，玉米盆栽实验表明，4种土壤中施用3种难溶磷，接种M1菌剂玉米鲜重比对照提高2.14‑90.91％，干重提高22.15‑268.28％。对我国农业生产节约磷肥资源和粮食持续增产具有重要意义。

Description

高效溶磷耐盐日本曲霉M1及其在作物增产中的应用
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，具体地说，涉及一株高效溶磷耐盐日本曲霉M1及其在作物增产中的应用。
背景技术
磷素是植物生长必须的三大营养元素之一，磷肥使用是粮食增产的重要措施。施入土壤的磷肥90％以上转化为难溶磷，不易被植物吸收利用，是磷肥利用效率低的主要成因。迄今，世界各国依靠大量消费磷肥确保作物增产，保障粮食安全，从而导致磷矿资源的消费量逐年增加。我国90％以上的磷矿为中低品位，按现有的年消费量，我国的磷矿使用年限将不足20年。今后，提高磷肥和磷矿资源的使用效率、提高土壤磷库的有效性，延长磷矿资源的使用寿命，对世界各国农业可持续发展具有重要意义。
溶磷微生物通过产生有机酸，分泌H+质子将难溶磷转化为有效磷，同时依靠产生植物促生物质，从而在磷素的生物有效性和作物增产中起到重要作用。近百年来，溶磷微生物研究一直受到科学家的高度重视，期望通过接种溶磷微生物制剂提高土壤难溶磷的有效性和磷肥利用效率。由于不同种类的溶磷菌或不同菌株之间的溶磷能力和接种效果差异悬殊，因此，高效溶磷菌株的筛选显得尤为重要。
目前，溶磷微生物已经作为活化土壤难溶磷，提高磷矿石的生物有效性和作物产量的有效措施广泛使用。研究显示，无论在固体培养基平板还是液体培养条件下，溶磷真菌的效果高于溶磷细菌。溶磷微生物具有增加土壤有效磷，促进磷素吸收和减少磷肥施用，促进磷矿石的生物有效性，以及促进作物生长和提高作物产量的作用。已有报道表明，溶磷微生物及其生物有机肥在溶解难溶磷、减少磷肥投入和提高作物产量方面潜力巨大。因此，在溶磷微生物筛选和应用潜力研究过程中，应注重选择既有较高溶磷能力，又能提高作物产量的高效菌株。
我国政府高度重视化肥减量高效问题，要求逐步做到化肥零增长。磷肥的过量使用导致江河湖泊的富营养化，需要降低磷肥使用量、提高磷肥利用率，减少环境进入水体的有效磷数量。为了达到磷肥零增长的目标，溶磷微生物及其生物肥料无疑成为了首选的环境友好型的技术措施。
溶磷微生物具有提高土壤有效磷含量、促进作物生长的作用，已报道的溶磷微生物有36个属、89种，以及数以万计的溶磷菌株。目前，溶磷真菌筛选报道的主要是曲霉菌(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)、木霉菌(trichoderma)、酵母菌(Saccharomyces)、正青霉菌(Eupenicillium)、篮状菌(Talaromyces)、根霉菌(Rhizopus)、镰刀菌(Fusarium)、小菌核菌(Sclerotium)和轮枝菌(Verticillium)等，其中绝大部分为青霉菌和曲霉菌，但迄今未见溶磷耐盐功能的日本曲霉报道。
发明内容
本发明主要针对我国土壤缺磷和磷肥利用率低、增产潜力下降、盐碱地耕地面积高达1300多万公顷等问题，提供一种广泛适应性的高效溶磷、耐盐促生菌日本曲霉M1，由其制备的微生物菌剂、生物肥料制剂及其应用。
为了实现本发明目的，本发明人从我国内蒙古巴彦淖尔盟临河市种植葵花的盐碱地中筛选到一株具有耐盐、高效活化土壤难溶磷的真菌M1，菌株M1经鉴定为日本曲霉(Aspergillus japonicus)。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.14627。保藏日期2017年10月16日。
M1的菌学特征如下：
在PDA培养基平板上，菌株M1生长迅速，菌落前期呈白色絮状，后变成浅棕色直到深褐色，粉末状，背面为浅黄色；分生孢子头的顶囊为椭圆形，小梗双层，内层粗大，外层短小，呈放射状排列，布满整个顶囊，褐色，顶端有链形孢子。孢子直径约2.0-5.0μm。
本发明还提供含有所述日本曲霉M1的微生物菌剂。
本发明所述菌剂中还含有添加剂和保护剂。其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉等中的至少一种。所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的至少一种。
本发明提供的菌剂由如下重量份的组分组成：
日本曲霉M1发酵菌液 1份
添加剂 0.5-3份
保护剂 0.01-0.05份
所述菌剂中日本曲霉M1活菌数为1×108～3×108CFU/g。优选所述菌剂中日本曲霉M1活菌数为2×108CFU/g。
本发明还提供由所述日本曲霉M1，或所述菌剂制备的土壤磷素活化剂。
本发明还提供由所述日本曲霉M1，或所述菌剂，或所述土壤磷素活化剂制备的生物肥料制剂。优选地，所述生物肥料制剂中还含有灭菌的有机物料和粘结剂。
本发明还提供所述日本曲霉M1或所述菌剂在使所种植的植物适应我国4种典型土壤(北京石灰性潮土、安徽黏性潮土、安徽水稻土和山东沿海盐潮土)，活化土壤难溶磷，提高磷肥利用率，增加磷矿粉生物有效性以及节约磷肥资源中应用。
本发明还提供所述日本曲霉M1或所述菌剂在提高作物产量中的应用。可将含有所述日本曲霉M1的菌剂，进行拌种，或作为基肥，或用作追肥施用于作物生长区域。
本发明所述作物为大棚蔬菜，包括玉米、花生等。所述作物种植于石灰性潮土、黏性潮土、水稻土或盐潮土中。
本发明还提供含有日本曲霉M1的生物有机肥料；所述生物有机肥料中还含有灭菌的有机物料。
本发明还提供所述日本曲霉M1或所述菌剂在制备生物有机肥、有机无机生物复混肥中的应用。
本发明还提供一种农用复混肥，由有效成分为日本曲霉M1的菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。
本发明提供的溶磷高效促生菌--日本曲霉M1，广泛适用于北京石灰性潮土、安徽黏性潮土、安徽水稻土和山东沿海盐潮土。实验表明，在固体、液体培养基条件下，能够溶解磷酸三钙、磷矿石、磷矿粉、磷酸铁、磷酸铝和磷酸锌。通过对菌株M1促进作物生长和提高作物产量的作用效果进行研究，为多种难溶磷的活化、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了宝贵的菌种资源和产品支撑。
本发明菌株M1能够高效溶解磷矿粉、磷酸铁、磷酸铝、磷酸锌和磷酸三钙。难溶磷PDA平板培养6天，对Ca3(PO4)2的溶解量达到53.71磷/平板；液体培养6天，对磷酸铝、磷酸三钙、磷矿粉、磷酸铁和磷酸锌的溶解率分别达78.4％、63.3％、49.86％、48.4％和36.59％，超过目前报道的国际公认的溶磷真菌拜莱青霉菌(ATCC 20851)。
含有菌株M1的生物肥料，在4种土壤中均能显著促进玉米生长，生物量比对照分别增加22.15-268.28％；田间条件下提高花生产量22.19％。本发明的微生物菌剂对于植物促生效果明显，且其作用效果不受化肥使用的抑制，可在正常使用化肥条件下施用，对我国农业生产节约磷肥资源，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例2中日本曲霉M1平板溶磷的效果。
图2为本发明实施例4中日本曲霉M1在PDYA平板上的菌落形态。
图3为本发明实施例1中日本曲霉M1在电镜下观察菌丝和分生孢子形态。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 日本曲霉M1菌剂的制备
1.日本曲霉M1的分离及纯化
从内蒙古巴彦淖尔盟临河市种植葵花的盐碱地中分离并纯化获得一株高效溶解难溶磷和耐盐的菌株M1。
根据菌株M1的菌学特征及ITS rDNA基因测序结果(SEQ ID NO:1)，确定菌株M1为日本曲霉(Aspergillus japonicus)。
日本曲霉M1在电镜下观察菌丝和分生孢子形态见图3。
2.日本曲霉M1的培养
(1)培养基的组成(kg/t发酵液)
可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH4)2SO4 3kg，K2HPO4 0.2kg，NaCl 2.5kg，MgSO4·7H2O 0.1kg，CaCO3 0.5kg，FeSO40.001kg，硼酸(1％)1L，pH7.0，以水配制。
(2)发酵培养过程
将日本曲霉M1接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25～28℃培养3d。将日本曲霉M1转接入1000mL三角瓶，26-28℃，220r/min下液体发酵培养36h。然后按1v/v％接种量接入50L种子罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7～1.0vvm下，培养3d。
3.日本曲霉M1菌剂的制备
向发酵液中加入保护剂海藻酸钠，日本曲霉M1以稻壳粉吸附。M1菌剂的活菌数为2×108CFU/g。
实施例2 菌株M1固体平板试验溶磷效果
为了明确日本曲霉M1溶解难溶磷的能力，本实施例中使用磷酸三钙Ca3(PO4)2为磷源，28℃培养5天，测定PDA平板上的有效磷。试验以拜莱青霉菌ATCC 20851、草酸青霉菌P8(CGMCC 2272)为对照菌株，并设有不接种对照试验。
结果显示(表1)，真菌M1溶解磷酸三钙能力最强，溶磷高达53.71mg磷/平板，比菌株ATCC 20851的溶磷量(21.05mg磷/平板)增加155.1％；菌株M1溶磷量明显高于草酸青霉菌P8的溶磷量48.76mg磷/平板。日本曲霉M1在无机磷培养基(磷酸三钙为磷源)上形成的菌落见图1。
表1 不同溶磷菌株在PDA固体平板上的溶磷效果
Figure BDA0001452657180000061
注：a、b、c字母不同表明处理之间差异显著。
实施例3 溶磷菌株M1在液体培养基中溶解难溶磷的效果
在液体培养条件下，进行了溶磷真菌M1对于磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁、磷酸锌、云南晋宁磷矿粉的溶解能力实验。结果显示(表2)，日本曲霉M1从磷酸铝中释放的有效磷最高，达995.69μg磷/mL，占加入总磷量的78.4％；菌株M1溶解磷酸三钙、磷矿粉、磷酸铁和磷酸锌的能力较强，溶液中有效磷含量分别为628.25、363.64、496.87和293.86μg磷/mL，分别占加入总磷量的63.3％、49.86％、48.4％和36.59％。磷矿粉和磷酸铝是较难溶解的磷源，目前国内外报道的高效溶解磷矿粉和磷酸铝的菌株较少，而菌株M1表现出优良的溶解效果。
表2 日本曲霉菌M1液体培养6d对5种难溶磷的溶解效果
Figure BDA0001452657180000062
Figure BDA0001452657180000071
注：a、b、c、d、e字母不同表明处理之间差异显著。
实施例4 溶磷菌株M1的耐盐能力
为了明确溶磷菌株M1对NaCl的耐受能力，在PDYA平板中添加不同含量的NaCl，置于28℃恒温培养箱中，从3d开始每日观察并记录菌丝在不同含量NaCl的PDYA平板中的生长状况。试验以溶磷黑曲霉DSM821(ATCC 9142)为对照菌株。结果表明(表3)，日本曲霉M1最高可耐受10％的盐浓度。菌株M1的耐盐胁迫能力大于菌株DSM821(7.5％的NaCl)。迄今，文献报道的溶磷菌株大多在NaCl浓度为0.4％-1.5％时，菌落生长明显受抑制，由此凸显了溶磷菌株M1良好的耐盐能力。
日本曲霉M1在PDYA平板上的菌落形态见图2。
表3 溶磷菌M1、DSM 821接入PDYA耐盐培养基生长状况(5d)
Figure BDA0001452657180000072
注：-表示菌落不生长；+表示菌落生长严重受抑制；++表示菌落生长受抑制；+++表示菌落生长旺盛。
实施例5 盆栽条件下溶磷菌对土壤有效磷的影响
盆栽试验采用完全随机设计方案，在水稻土、黏性潮土、盐潮土和石灰性潮土，添加难溶磷磷酸三钙、磷酸铝和开阳磷矿粉(KYRP)，分别接入溶磷菌M1(日本曲霉)、DSM 821，以不接菌对照CK。每个处理重复4次，共计144盆。
结果显示(表4)，日本曲霉M1菌剂分别接种于4种土壤，所有4种土壤的有效磷含量皆高于对照和菌株DSM821。以菌剂为主要因素，在接种菌剂和不接菌(CK)处理下，接种菌剂M1土壤有效磷含量最高(33.22mg/kg)，CK土壤有效磷含量最低(9.59mg/kg)，接种菌剂M1比对照增加23.61mg/kg，比接种菌剂DSM 821(30.91mg/kg)增加2.31mg/kg。
在4种土壤处理中，对所有接种菌剂和不同磷源处理下的数据计算平均值，4种土壤中以水稻土有效磷含量最高，平均为33.08mg/kg，表明溶磷菌剂M1和DSM821在水稻土活化难溶磷的能力最强，表明菌剂M1和DSM821在水稻土中溶解难溶磷的能力高于其它3种土壤。
3种磷源处理下，以磷酸铝为磷源的土壤有效磷含量最高，为32.31mg/kg，表明菌剂M1和DSM821在土壤中活化磷酸铝的能力最强，优于磷酸三钙和磷矿粉。
以上结果表明，菌剂M1比菌剂DSM 821对提高土壤有效磷的具有显著优势，菌剂M1与水稻土适配性最佳，菌剂M1与4种土壤的适配性均高于菌剂DSM 821，在农业生产中应用潜力巨大。
表4 玉米盆栽试验中土壤有效磷含量
Figure BDA0001452657180000081
Figure BDA0001452657180000091
注：a、b、c、d、e、f字母不同表明处理之间差异显著。
实施例6 盆栽条件下溶磷菌M1对玉米生长的影响
接种菌剂和不接菌(CK)处理下(表5)，接种菌剂M1的玉米生物量最高，鲜重、干重分别为23.08g/盆、3.79g/盆；比CK(鲜重15.61g/盆、干重1.50g/盆)分别增加7.47g/盆、2.29g/盆。
同种土壤中，接种菌剂M1的玉米生物量，均高于菌剂DSM821。4种土壤中接种菌剂和不同磷源处理下，1号水稻土中玉米生物量最高，鲜重、干重分别为31.29g/盆、5.18g/盆，表明菌剂M1和DSM 821在水稻土中对玉米的促生效果最好。
可见，菌剂M1对玉米生物量的作用效果优于菌剂DSM821，菌剂M1与4种土壤的适配性均高于菌剂DSM 821。
表5 溶磷菌株、难溶磷和土壤类型对玉米生物量的影响
Figure BDA0001452657180000101
Figure BDA0001452657180000111
注：a、b、c、d、e、f字母不同表明处理之间差异显著。
实施例7 溶磷生物肥料对田间花生的增产作用
在北京海淀区西二旗花生地进行了溶磷菌肥试验，小区试验地面积为10m×4m，将其划分为1.8m×0.8m的小区，每个小区接种菌剂300g，溶磷菌剂与表层约15cm厚的土壤混合均匀后培垄(200cm×20cm×20cm)，每垄种植花生16棵。花生收获后，晾干、果实和植株称重量。
添加菌剂M1对花生植株的干重、鲜重促生作用最好(表6)，与CK相比，菌剂M1处理的植株鲜重、干重分别增加43.92％和27.67％，达13.50t/hm2和6.69t/hm2；施加菌剂ATCC20851，植株鲜重、干重比CK分别增加13.96％和16.60％，达到10.69t/hm2和6.11t/hm2；菌剂DSM821处理的植株鲜重、干重比CK分别增加18.87％和14.31％，达11.15t/hm2和5.99t/hm2。添加不同的菌剂对花生植株的促生效果不同，菌剂M1与ATCC20851相比，植株鲜重提高2.81t/hm2，干重提高0.58t/hm2；菌剂M1与菌剂DSM 821相比，植株的鲜重、干重分别增加2.35t/hm2和0.7t/hm2。以上结果表明，添加菌剂M1对小区试验花生生物量的促生效果最好。
添加溶磷菌剂对花生果实的促生效果为菌剂M1>ATCC20851>DSM 821>CK。对花生果实产量影响最大的为菌剂M1，比CK花生果实鲜重、干重增产1.39t/hm2和0.81t/hm2，达5.35t/hm2和3.65t/hm2；菌剂ATCC 20851处理下的花生果实鲜重、干重，比CK增产0.80t/hm2和0.50t/hm2，达6.15t/hm2和4.15t/hm2。菌剂M1比菌剂ATCC20851处理的花生果实鲜重、干重增加9.59％和7.47％。
表6 田间条件下溶磷菌剂M1对花生的增产作用
Figure BDA0001452657180000121
注：a、b、c字母不同表明处理之间差异显著。
本发明对广泛适应性的高效溶磷促生的日本曲霉M1及其生物有机肥进行了多方面研究，施用本发明的溶磷生物肥料菌剂，能够高效活化土壤磷素，增加土壤有效磷水平，增强磷矿粉的生物有效性，与我国4种典型的农田土壤匹配性好，作物增产显著，达到了溶磷增产的效果，具有良好的农业生产应用价值。
本发明针对我国土壤磷有效性低，难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并基于我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源的现状，选育出广泛适用于我国潮土、水稻土、盐潮土的典型农田土壤类型和多种作物的高效溶磷微生物菌株，为开发高效溶磷生物有机肥和微生物菌剂提供技术支撑。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 高效溶磷耐盐日本曲霉M1及其在作物增产中的应用
<130> KHP171111117.1TQ
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 538
<212> DNA
<213> 日本曲霉(Aspergillus japonicus)
<400> 1
ggctacggat gctggtcttc gggggcaacc tcccacccgt gcttaccgta ccctgttgct 60
tcggcgggcc cgccttcggg cggcccgggg cctgcccccg ggaccgcgcc cgccggagac 120
cccaatggaa cactgtctga aagcgtgcag tctgagttga ttgataccaa tcagttaaaa 180
ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataac 240
taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt gcgccccctg 300
gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt catttctccc ctccagcccc gctggttgtt 360
gggccgcgcc cccccggggg cgggcctcga gagaaacggc ggcaccgtcc ggtcctcgag 420
cgtatggggc tctgtcaccc gctctatggg cccggccggg gcttgcctcg acccccaatc 480
ttctcagatt gacctcggat caggtaggga tacccgctga acttaagcat atcaaaaa 538

Claims (11)

1.日本曲霉(Aspergillus japonicus)M1，其保藏编号为CGMCC NO.14627。
2.含有权利要求1所述日本曲霉M1的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中还含有添加剂和保护剂；
其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉中的至少一种；
所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖中的至少一种。
4.由权利要求1所述日本曲霉M1或权利要求2或3所述菌剂制备的土壤磷素活化剂。
5.由权利要求1所述日本曲霉M1或权利要求2或3所述菌剂或权利要求4所述土壤磷素活化剂制备的生物肥料制剂。
6.权利要求1所述日本曲霉M1或权利要求2或3所述菌剂或权利要求4所述土壤磷素活化剂或权利要求5所述生物肥料制剂在提高土壤中磷素利用率以及提高作物产量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求2或3所述菌剂，进行拌种，或作为基肥，或用作追肥施用于作物生长区域。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述作物种植于石灰性潮土、黏性潮土、水稻土或盐潮土中。
9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述作物为大棚蔬菜。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述作物为玉米或花生。
11.权利要求1所述日本曲霉M1或权利要求2或3所述菌剂在制备生物有机肥、有机无机生物复混肥中的应用。
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