CN109206312A - 一种从d-乳酸铵发酵液中分离纯化d-乳酸的方法 - Google Patents

一种从d-乳酸铵发酵液中分离纯化d-乳酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从D‑乳酸铵发酵液中分离纯化D‑乳酸的方法，包括顺序相接的如下步骤：1)将D‑乳酸铵发酵液进行固液分离及蛋白和色素的去除，得到澄清的发酵液；2)将步骤1)中所得到的澄清发酵液进行浓缩；3)将步骤2)中所得到的浓缩发酵液进行酸化、结晶操作；4)将步骤3)中所得到的液固混合物进行过滤，获得副产物硫酸铵；5)将步骤4)结晶后的含有D‑乳酸的发酵液进行离子交换；6)将步骤5)所得离子交换后的发酵液进行纳滤脱色；7)将纳滤后的发酵液进行浓缩从而获得D‑乳酸。上述乳酸提取方法简单、易操作，无废液污染，能耗低，回收率高，产品品质高。

Description

一种从D-乳酸铵发酵液中分离纯化D-乳酸的方法
技术领域
本发明涉及一种从D-乳酸铵发酵液中分离纯化D-乳酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
乳酸是世界三大有机酸之一，它可以广泛的用于食品、医药、化工和农业等领域。特别的D-乳酸可以广泛的应用于医药、化工和农业领域。以D-乳酸为单体合成的聚乳酸以其良好的生物可降解性能及其他优良的使用特性(如透明性、热塑性、产物安全性等)已成为21世纪最具发展前景的绿色环保材料。此外以高纯的D-乳酸制造的生物农药“骠马”和“威霸”等除草剂，作为新型的低毒性农药，能够有效的除草杀虫既经济又可靠。市场上，同等级的D-乳酸价格比L-乳酸贵5～10倍。因此D-乳酸的生产和纯化逐渐受到重视。
乳酸的制备方法有发酵法、化学合成法和酶法。其中，发酵法和化学合成法已得到工业上的应用，而我国主要采用发酵法。
传统的乳酸提取工艺为乳酸钙结晶-酸解工艺，该工艺成熟易于控制，但是存在工艺路线长，单元操作多，废液污染严重，能耗较高，整个分离过程自动化程度较低等缺点，乳酸回收率也一般在40～50％之间，且获得的产品品质较低。
发明内容
为了解决现有技术中乳酸提取存在的工艺路线长，单元操作多，废液污染严重，能耗较高，回收率低，产品品质低等缺陷，本发明提供一种从D-乳酸铵发酵液中分离纯化D-乳酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种从D-乳酸铵发酵液中分离纯化D-乳酸的方法，包括顺序相接的如下步骤：
1)将D-乳酸铵发酵液进行固液分离及蛋白和色素的去除，得到澄清的发酵液；
2)将步骤1)中所得到的澄清发酵液进行浓缩；
3)将步骤2)中所得到的浓缩发酵液进行酸化、结晶操作；
4)将步骤3)中所得到的液固混合物进行过滤，所得固体为副产物硫酸铵；
5)将步骤4)中所得滤液进行离子交换；
6)将步骤5)所得离子交换后的发酵液进行纳滤脱色；
7)将纳滤后的发酵液进行浓缩从而获得D-乳酸。
上述乳酸提取方法简单、易操作，无废液污染，能耗低，回收率高，产品品质高。
为了进一步提高产品品质，步骤1)中，发酵液的固液分离采用离心或者膜过滤(微滤)的方式；步骤1)中蛋白以及色素的去除采用超滤的方式进行。进一步优选，超滤时，超滤膜的截留分子量为2000-5000D。
为了进一步提高产品品质，步骤2)中，浓缩采用减压蒸发操作，温度控制在50～70℃，真空度控制在80～200mbar，浓缩倍数为2～5倍。
为了简化操作，同时保证产品品质，步骤3)中，酸化采用浓硫酸进行酸化，结晶的温度控制在0～40℃。本申请中的浓硫酸指质量浓度为98％的硫酸。酸化优选的pH为1-3，时间为30-60分钟。前述酸化、结晶为同一过程，在酸化的同时结晶。结晶温度也即酸化温度，酸化时间也即酸化和结晶共用时间。
为了进一步提高产品品质，步骤5)中，离子交换采用阳离子树脂和阴离子树脂相结合的方法进行。进一步优选，步骤5)中，发酵液先过阳离子柱再过阴离子柱，阳离子交换树脂为732阳离子树脂，阴离子树脂为717阴离子树脂。
为了进一步提高产品品质，步骤6)中的脱色采用纳滤膜进行脱色，纳滤膜的截留分子量为200～500。
本发明所述的发酵菌种为一株高生长产酸速率的D-乳酸生产菌，已于2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，其分类命名为芽孢乳杆菌(Sporolactobacillussp.)BS1-5，保藏登记号为CCTCC NO.M2012516，其更具体分类为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillussp.inulinus)。
步骤1)中D-乳酸铵发酵液的制备方法包括顺序相接的如下步骤：
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间20～48h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间12～24h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3％～15％，发酵温度30～45℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.0～7.0。
接种量为菌种相对培养基的质量用量。
步骤(1)中，平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10～30，酵母膏1～3，无水乙酸钠1～4，无水硫酸镁0.1～0.4，磷酸二氢钾1～3，琼脂15～25；步骤(2)中，种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖10～40，酵母膏1～3，蛋白胨1～3，无水硫酸镁0.1～0.4，碳酸钙10～30；步骤(3)中，发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150～180，酵母膏8～12，玉米浆干粉4～6，硫酸镁0.4～0.6。
本发明从D-乳酸铵发酵液中分离纯化D-乳酸的方法通过固液分离，可以能够实现发酵液的澄清；通过超滤可以去除大部分大分子的蛋白和一些小分子的蛋白，同时可以起到部分脱色的作用；通过真空浓缩，可在较低温度下实现对澄清后发酵液的浓缩，便于后续的结晶操作；通过离子交换可以除去未结晶的硫酸铵和发酵液中的一些其他杂质离子。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
与现有工艺相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明分离的是乳酸铵发酵液，可以直接在常温下进行固液分离和膜分离操作，连续性强，而传统的处理乳酸钙发酵液的固液分离是需要在高温下采用板框过滤的手段，相对传统的处理方式本发明操作能耗较低，自动化程度高；
(2)本发明不需要在高温下进行时间较长的酸解工艺，在此只需在常温下进行酸化，且酸化时间短，避免了在高温下色素的产生给后续处理带来麻烦，并且可以大大减少能源的消耗；
(3)本发明通过微滤、超滤的步骤可以有效降低发酵液中的蛋白的含量，从而大大降低产品中的氮含量的指标；
(4)本发明产生了附加值较高的副产物硫酸铵，一方面可以降低分离成本，另一面也大大降低了废水中的盐离子的浓度，降低了废水处理的难度和成本；
(5)本发明采用纳滤操作对发酵液进行脱色，保证了D-乳酸产品的色度；
(6)本发明整个的工艺流程在能实现高品质的D-乳酸分离基础上，做到了操作最优化，降低了发酵法生产D-乳酸中分离纯化的费用。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：
D-乳酸铵发酵液的制备如下：
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30℃，培养时间48h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30℃，培养时间24h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为15％，发酵温度30℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.0。
上述平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母膏1，无水乙酸钠1，无水硫酸镁0.1，磷酸二氢钾1，琼脂15。
上述种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母膏1，蛋白胨1，无水硫酸镁0.1，碳酸钙10。
上述发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150，酵母膏8，玉米浆干粉4，硫酸镁0.4。
发酵产酸阶段采用氨水作为pH调节剂，以芽孢杆菌生产菌株的D-乳酸铵发酵液，其中D-乳酸浓度100g/L，无残糖。取发酵结束后的D-乳酸铵发酵液经微滤进行固液分离，随后采用截留分子量为5000D的超滤膜进行超滤，分离出大分子蛋白、色素后进行减压蒸发，减压蒸发温度控制在70℃真空度控制在200mbar，待发酵液浓缩2倍，将浓缩后的发酵液送到结晶器中进行酸化(酸化采用浓硫酸，酸化pH为2)、结晶，温度为0℃，时间为30分钟；将副产物硫酸铵析出然后进行过滤；将过滤后的发酵液进行离子交换，离子交换选用732阳离子树脂与717阴离子交换树脂，先过阳离子柱再过阴离子柱；将离子交换后的发酵液进行纳滤脱色，纳滤膜的截留分子量为500D，最后送入多效蒸发器进行减压蒸发即得到高品质D-乳酸，得到的D-乳酸含量为89％，光学纯度为99.5％。
实施例2：
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度45℃，培养时间20h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度45℃，培养时间12h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3％，发酵温度45℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在7.0。
上述平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖30，酵母膏3，无水乙酸钠4，无水硫酸镁0.4，磷酸二氢钾3，琼脂25。
上述种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖40，酵母膏3，蛋白胨3，无水硫酸镁0.4，碳酸钙30.
上述发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖180，酵母膏12，玉米浆干粉6，硫酸镁0.6。
发酵产酸阶段采用氨水作为pH调节剂，以芽孢杆菌生产菌株的D-乳酸铵发酵液，其中D-乳酸浓度115g/L，无残糖。取发酵结束后的D-乳酸铵发酵液经微滤进行固液分离，随后采用截留分子量为2000D的超滤膜进行超滤，分离出大分子蛋白、色素后进行减压蒸发，减压蒸发温度控制在50℃真空度控制在80mbar，待发酵液浓缩5倍，将浓缩后的发酵液送到结晶器中进行酸化(酸化采用浓硫酸，酸化pH为2)、结晶，温度为40℃，时间为30分钟；将副产物硫酸铵析出然后进行过滤；将过滤后的发酵液进行离子交换，离子交换选用732阳离子树脂与717阴离子交换树脂，先过阳离子柱再过阴离子柱；将离子交换后的发酵液进行纳滤脱色，纳滤膜的截留分子量为500D，最后送入多效蒸发器进行减压蒸发即得到高品质D-乳酸，得到的D-乳酸产品含量为88％，光学纯度为99.5％。
实施例3：
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间24h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间20h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为10％，发酵温度37℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.5。
上述平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，无水乙酸钠2，无水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾2，琼脂20。
上述种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，无水硫酸镁0.3，碳酸钙20。
上述发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖160，酵母膏10，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5。
发酵产酸阶段采用氨水作为pH调节剂，以芽孢杆菌生产菌株的D-乳酸铵发酵液，其中D-乳酸浓度116g/L，无残糖。取发酵结束后的D-乳酸铵发酵液经微滤进行固液分离，随后采用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，分离出大分子蛋白、色素后进行减压蒸发，减压蒸发温度控制在55℃真空度控制在100mbar，待发酵液浓缩4倍，将浓缩后的发酵液送到结晶器中进行酸化(酸化采用浓硫酸，酸化pH为2)、结晶，温度为20℃，时间为30分钟；将副产物硫酸铵析出然后进行过滤；将过滤后的发酵液进行离子交换，离子交换选用732阳离子树脂与717阴离子交换树脂，先过阳离子柱再过阴离子柱；将离子交换后的发酵液进行纳滤脱色，纳滤膜的截留分子量为300，最后送入多效蒸发器进行减压蒸发即得到高品质D-乳酸，得到的D-乳酸产品含量为90％，光学纯度为99.7％。
实施例4：
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间24h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间20h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为10％，发酵温度37℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.5。
上述平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，无水乙酸钠2，无水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾2，琼脂20。
上述种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，无水硫酸镁0.3，碳酸钙20。
上述发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150，酵母膏10，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5，麸皮10。
发酵产酸阶段采用氨水作为pH调节剂，以芽孢杆菌生产菌株的D-乳酸铵发酵液，其中D-乳酸浓度110g/L，无残糖。取5L，含550g D-乳酸的发酵液经微滤进行固液分离，微滤D-乳酸收率为99％，微滤后得到D-乳酸的质量为544.5g，
随后采用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，分离出大分子蛋白、色素，超滤的D-乳酸得率为99％经超滤后D-乳酸的总质量为539.055g。
随后进行减压蒸发，减压蒸发温度控制在55℃真空度控制在100mbar，待发酵液浓缩3倍，将浓缩后的发酵液送到结晶器中进行酸化(酸化采用浓硫酸，pH为2)、结晶，温度为20℃，时间为40分钟；将副产物硫酸铵析出然后进行过滤；共获得硫酸铵产品312g，硫酸铵的得率为72％，获得的滤液含D-乳酸为510g。
将过滤后的发酵液进行离子交换，离子交换选用732阳离子树脂与717阴离子交换树脂；先进行阳离子交换后进行阴离子交换，将离子交换后的发酵液进行纳滤脱色，纳滤膜的截留分子量为200D，纳滤后的发酵液含D-乳酸质量为405g。
最后送入多效蒸发器进行减压蒸发即得到高品质D-乳酸，得到的D-乳酸产品含量为90％，光学纯度为99.5％，共得到D-乳酸产品为451g。
最终从含有D-乳酸铵发酵液中分离提取D-乳酸产品的总收率(回收率)为82％。

Claims (10)

1.一种从D-乳酸铵发酵液中分离纯化D-乳酸的方法，其特征在于：包括顺序相接的如下步骤：
1)将D-乳酸铵发酵液进行固液分离及蛋白和色素的去除，得到澄清的发酵液；
2)将步骤1)中所得到的澄清发酵液进行浓缩；
3)将步骤2)中所得到的浓缩发酵液进行酸化、结晶操作；
4)将步骤3)中所得到的液固混合物进行过滤，所得固体为副产物硫酸铵；
5)将步骤4)中所得滤液进行离子交换；
6)将步骤5)所得离子交换后的发酵液进行纳滤脱色；
7)将纳滤后的发酵液进行浓缩从而获得D-乳酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，发酵液的固液分离采用离心或者膜过滤的方式；步骤1)中蛋白以及色素的去除采用超滤的方式进行。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：超滤时，超滤膜的截留分子量为2000-5000D。
4.如权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：步骤2)中，浓缩采用减压蒸发操作，温度控制在50～70℃，真空度控制在80～200mbar，浓缩倍数为2～5倍。
5.如权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，酸化采用浓硫酸进行酸化，结晶的温度控制在0～40℃。
6.如权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：步骤5)中，离子交换采用阳离子树脂和阴离子树脂相结合的方法进行。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤5)中，发酵液先过阳离子柱再过阴离子柱，阳离子交换树脂为732阳离子树脂，阴离子树脂为717阴离子树脂。
8.如权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：步骤6)中的脱色采用纳滤膜进行脱色，纳滤膜的截留分子量为200～500。
9.如权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：步骤1)中D-乳酸铵发酵液的制备方法包括顺序相接的如下步骤：
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间20～48h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间12～24h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3％～15％，发酵温度30～45℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.0～7.0。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10～30，酵母膏1～3，无水乙酸钠1～4，无水硫酸镁0.1～0.4，磷酸二氢钾1～3，琼脂15～25；步骤(2)中，种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖10～40，酵母膏1～3，蛋白胨1～3，无水硫酸镁0.1～0.4，碳酸钙10～30；步骤(3)中，发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150～180，酵母膏8～12，玉米浆干粉4～6，硫酸镁0.4～0.6。
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