CN108299220B - 一种发酵催化液中提取l-4-羟基异亮氨酸的方法 - Google Patents

一种发酵催化液中提取l-4-羟基异亮氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分离纯化技术领域，具体涉及一种发酵催化液中提取L‑4‑羟基异亮氨酸的方法。本发明采用微滤膜、超滤膜、离子交换等步骤纯化分离L‑4‑羟基异亮氨酸发酵催化液中的L‑4‑羟基异亮氨酸，提取体系简单高效且流程简便易行，其中，滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.2～1.5wt％的氨水洗脱，可降低成品中铵盐含量，提高纯度；一次结晶利用酒精醇沉，可以提高一次粗品收率达50％以上，二次结晶用酒精醇沉，不但可以提高成品收率达50％以上，而且可以使产品液相纯度得到明显提升，最终产品总收率可达50％且产品纯度在95％以上，该方法效率高，成本低，易于大规模产业化生产。

Description

一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法
技术领域
本发明涉及分离纯化技术领域，具体涉及一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法。
背景技术
L-4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine)是一种自然界存在的非蛋白质氨基酸。研究发现，L-4-羟基异亮氨酸具有促进胰岛素分泌、提高胰岛素耐受和调节血脂等多方面作用。L-4-羟基异亮氨酸不仅能够促进周围组织对葡萄糖的摄取利用，还能够减少肝脏葡萄糖输出以提高外周组织的胰岛素耐受。相比现在已经用于治疗T2DM的药物，L-4-羟基异亮氨酸调控的胰岛素合成是严格依赖葡萄糖浓度。因此，L-4-羟基异亮氨酸不会引起类似低血糖等副作用。同时还发现L-4-羟基异亮氨酸能有效降低血液中甘油三酯和胆固醇的量，具有加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物，L-4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市场需求。
受技术和成本的限制，我国L-4-羟基异亮氨酸的产量不能满足国内和外贸出口的需求。目前报道的L-4-羟基异亮氨酸生产方法包括提取法、化学合成法以及酶法，但仅提取法用于工业化生产且存在提取率低、分离纯化困难、原材料需求量大和成本高等不足，传统的化学法不论是有机合成或化学拆分均因生产成本高而失去竞争力。生物方法中因酶催化方法制备方法效率相对较高，但仍存在操作繁琐，原料昂贵，生产成本过高的问题，而目前缺乏相关可用于工业化大规模生产的工艺技术，本方法目前已能够正式进行大规模工业生产，而且成本大大降低，产品符合医药级原料药L-4-羟基异亮氨酸的检测标准。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，该方法采用微滤膜、超滤膜、离子交换等纯化分离技术，提取体系简单高效且流程简便易行，而滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.2～1.5wt％的氨水洗脱，可降低成品中铵盐含量，提高纯度；一次结晶利用酒精醇沉，可以提高一次粗品收率达50％以上，二次结晶用酒精醇沉，不但可以提高成品收率达50％以上，而且可以使产品液相纯度得到明显提升，最终产品总收率可达50％且产品纯度在95％以上，该方法效率高，成本低，易于大规模产业化生产。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，包含如下步骤：
(1)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液升温至60～80℃，保温10～30min，然后采用微滤膜进行微滤处理以除去蛋白与菌体，得到微滤膜清液；
(2)将步骤(1)制得的微滤膜清液采用超滤膜进行超滤处理，得到超滤膜清液；
(3)将步骤(2)制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.2～1.5wt％的氨水洗脱，收集pH7.5～9.5的洗脱液；
(4)调节步骤(3)收集的pH7.5～9.5的洗脱液的pH值调节至5.0～6.0；然后在70～80℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，过滤，得到滤清液1；滤清液经浓缩，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1；加入乙醇进行醇沉育晶，得到粗品；
(5)将步骤(4)制得的粗品重溶，在70～80℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，过滤，得到滤清液2；滤清液经浓缩，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2；加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥，得到L-4-羟基异亮氨酸；
步骤(1)中所述的L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液通过如下方法制备得到：
①将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌活化后接入含有Amp的种子罐培养基中，培养至菌液的OD600值为14～16，得到种子液；
②将步骤(1)制得的种子液接入发酵罐培养基中，35～40℃条件下液体深层通风发酵培养5～8h，然后降温至30～32℃并加入IPTG继续进行培养直至发酵完成，其中，加IPTG后发酵过程残糖控制0.05wt％以下，溶氧控制在20～35％，pH6.5～7.5，底糖耗尽后，流加50wt％葡萄糖做为碳源；
③发酵至OD600为45～50时放罐，低温离心收集菌体，并对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质；然后冷冻裂解，将冷冻裂解后的菌体加入催化剂中，进行催化，得到发酵催化液；
步骤①中所述的种子罐培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1g/L，维生素B 20mg/L，维生素H 3mg/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，消泡剂0.3mL/L，其余为水；
步骤①中所述的种子罐培养基中Amp的终浓度优选为0.1g/L；
步骤①中所述的培养的条件优选为37℃，pH7.0，溶氧控制在25％以上；
步骤②中所述的发酵罐培养基的配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉2.4g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.5g/L，VB1 20mg/L，VH(生物素)2mg/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L和消泡剂0.3ml/L，其余为水；
步骤②中所述的IPTG的终浓度优选为0.1mmol/L；
步骤③中所述的洗涤优选采用0.75wt％的生理盐水进行洗涤；
步骤③中所述的催化剂优选包含如下组分：a-酮戊二酸30～35g/L、异亮氨酸26～30g/L、硫酸亚铁2.78g/L，pH6.5～7.0；
步骤③中所述的催化的条件优选为强制通风催化，催化温度为32～33℃，至溶氧快速回升，反应结束，得到L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液；其中，反应过程中pH先下降后回升，整个过程不需要进行pH调节；
步骤③中所述的催化剂的用量优选为：每100mL催化剂加入0.3g菌体；
步骤(1)所述的微滤膜的孔径优选为30nm；
步骤(1)所述的微滤处理的温度优选为60～65℃，进膜压力优选为0.2～0.35Mpa；
步骤(2)所述的超滤膜的截留分子量优选为1000分子量；
步骤(2)所述的超滤处理的温度优选为38～42℃，进膜压力为12Mpa；
步骤(4)中所述的调节洗脱液pH优选采用5wt％的稀盐酸调节洗脱液pH；
步骤(4)中所述的活性炭的用量为洗脱液重量的1～2％；
步骤(4)中所述的脱色处理的时间为40～60min；
步骤(4)中所述的过滤优选为过滤机过滤；
步骤(4)中所述的滤清液1的出料透光优选为99.0％以上；
步骤(4)中所述的浓缩优选为蒸发浓缩；
步骤(4)中所述的含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1中含L-4-羟基异亮氨酸350～500g/L；
步骤(4)中所述的醇沉育晶的条件优选为0～5℃醇沉育晶24～48h；
步骤(4)中所述的乙醇的用量优选为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1体积的1～2倍；
步骤(5)中所述的活性炭的用量为洗脱液重量的0.05～1％；
步骤(5)中所述的脱色处理的时间为40～60min；
步骤(5)中所述的过滤优选为过滤机过滤；
步骤(5)中所述的滤清液2的出料透光优选为99.5％以上；
步骤(5)中所述的浓缩优选为蒸发浓缩；
步骤(5)中所述的含有4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2中含L-4-羟基异亮氨酸350～500g/L；
步骤(5)中所述的醇沉育晶的条件优选为0～5℃醇沉育晶24～48h；
步骤(5)中所述的乙醇的用量优选为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2体积的1～2倍；
本发明的原理：
本发明将L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液先进行升温保温处理，然后过微滤膜除去蛋白与菌体，再经过超滤膜除去物料中的一部分色素，提高料液透光；超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用低浓度氨水洗脱，降低成品中铵盐含量提高纯度；洗脱液加活性炭除去色素，过滤得到滤清液，滤清液经蒸发浓缩至含酸350～500g/L，由于L-4-羟基异亮氨酸不溶于乙醇，故本发明选择低温醇沉育晶，进而提高一次粗品收率，达50％以上；粗品再次溶解加活性炭除去色素，然后浓缩至含酸350g/L～500g/L，再次低温醇沉育晶，干燥，得到成品L-4-羟基异亮氨酸，两次脱色、浓缩、低温醇沉育晶，不仅提高了成品收率，而且制得的成品纯度在95％以上，本产品符合医药级原料药L-4-羟基异亮氨酸的检测标准。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用微滤膜、超滤膜、离子交换等多种纯化分离手段提取L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液，体系简单高效且流程简便易行。
(2)本发明对超滤后制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.2～1.5wt％洗脱，可降低成品中铵盐含量，提高纯度，减少了后续单元分离难度。
(3)本发明采用两次脱色、浓缩、低温醇沉育晶，在提高L-4-羟基异亮氨酸的产率的同时，极大提高产品纯度。
(4)本发明不仅可以提高50％以上的成品收率，而且产品液相纯度得到明显提升，可达95％以上。该方法效率高，成本低，易于大规模产业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，种子罐培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1g/L，维生素B 20mg/L，维生素H 3mg/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，消泡剂0.3mL/L，其余为水；发酵罐培养基的配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉2.4g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.5g/L，VB1 20mg/L，VH 2mg/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L和消泡剂0.3ml/L，其余为水；
诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌已在申请号“201610322740.6”、申请名称“一种微生-4-羟酸的方法-4-羟物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法”中公开；
实施例1
一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，包含如下步骤：
(1)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液通过如下方法制备得到：
①将诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌活化后接入含有终浓度为0.1g/L Amp的种子罐培养基中，在37℃，pH7.0，溶氧控制在25％以上的条件下培养至菌液的OD600值为15，得到种子液；
②将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比15％接入发酵罐培养基中，36℃条件下液体深层通风发酵培养5h，然后降温至32℃并加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG继续进行培养直至发酵完成，其中，加IPTG后发酵过程残糖控制0.05wt％以下，溶氧控制在20～35％，pH7.0，底糖耗尽后，流加50wt％葡萄糖做为碳源；
③发酵至OD600为48时放罐，低温(4℃)离心收集菌体，并使用0.75wt％生理盐水对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质；然后冷冻裂解；将冷冻裂解后的菌体加入催化剂(a-酮戊二酸32g/L、异亮氨酸28g/L、硫酸亚铁2.78g/L，pH6.8)中，进行强制通风催化，每100mL催化剂加入0.3g菌体，催化温度为32℃，至溶氧快速回升，反应结束，得到L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液；其中，反应过程中pH先下降后回升，整个过程不需要进行pH调节；
(2)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液(含L-4-羟基异亮氨酸20g/L)升温至70℃，保温20min，然后采用微滤膜(孔径为30nm)进行微滤处理以除去蛋白与菌体，其中，处理的温度为62℃，进膜压力为0.3Mpa；得到微滤膜清液；
(3)将步骤(2)制得的微滤膜清液采用超滤膜(截留分子量为1000分子量)进行超滤处理，其中，处理的温度为40℃，进膜压力为12Mpa；得到超滤膜清液；
(4)将步骤(3)制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.3wt％的氨水洗脱，收集pH7.5～9.5的洗脱液；
(5)采用5wt％的稀盐酸调节步骤(4)收集的pH7.5～9.5的洗脱液的pH值至5.5；然后在75℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的1.5％，处理时间为50min；过滤机过滤，得到滤清液1，透光率为99.0％以上；滤清液经蒸发浓缩至含L-4-羟基异亮氨酸400g/L，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1；加入乙醇4℃醇沉育晶36h，乙醇的用量为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1体积的1.5倍；得到粗品；
(6)将步骤(5)制得的粗品重溶，在75℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的0.08％，脱色处理的时间为50min；过滤机过滤过滤，得到滤清液2，滤清液2的出料透光率优选为99.5％以上；滤清液经蒸发浓缩至含L-4-羟基异亮氨酸400g/L，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2；加入乙醇4℃醇沉育晶36h，乙醇的用量为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2体积的1.5倍；收集晶体，干燥，得到L-4-羟基异亮氨酸。
实施例2
一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，包含如下步骤：
(1)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液通过如下方法制备得到：
①将诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌活化后接入含有终浓度为0.1g/L Amp的种子罐培养基中，在37℃，pH7.0，溶氧控制在25％以上的条件下培养至菌液的OD600值为14，得到种子液；
②将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比15％接入发酵罐培养基中，35℃条件下液体深层通风发酵培养8h，然后降温至30℃并加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG继续进行培养直至发酵完成，其中，加IPTG后发酵过程残糖控制0.05wt％以下，溶氧控制在20～35％，pH6.5，底糖耗尽后，流加50wt％葡萄糖做为碳源；
③发酵至OD600为45时放罐，低温(4℃)离心收集菌体，并使用0.75wt％生理盐水对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质；然后冷冻裂解；将冷冻裂解后的菌体加入催化剂(a-酮戊二酸30g/L、异亮氨酸26g/L、硫酸亚铁2.78g/L，pH6.5)中，进行强制通风催化，每100mL催化剂加入0.3g菌体，催化温度为33℃，至溶氧快速回升，反应结束，得到L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液；其中，反应过程中pH先下降后回升，整个过程不需要进行pH调节；
(2)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液(含L-4-羟基异亮氨酸16g/L)升温至80℃，保温10min，然后采用微滤膜(孔径为30nm)进行微滤处理以除去蛋白与菌体，其中，处理的温度为60℃，进膜压力为0.35Mpa；得到微滤膜清液；
(3)将步骤(2)制得的微滤膜清液采用超滤膜(截留分子量为1000分子量)进行超滤处理，其中，处理的温度为42℃，进膜压力为12Mpa；得到超滤膜清液；
(4)将步骤(3)制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.2wt％的氨水洗脱，收集pH7.5～9.5的洗脱液；
(5)采用5wt％的稀盐酸调节步骤(4)收集的pH7.5～9.5的洗脱液的pH值至5.0；然后在80℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的1％，处理时间为60min；过滤机过滤，得到滤清液1，透光率为99.0％以上；滤清液经蒸发浓缩至含L-4-羟基异亮氨酸350g/L，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1；加入乙醇0℃醇沉育晶24h，乙醇的用量为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1体积的倍；得到粗品；
(6)将步骤(5)制得的粗品重溶，在80℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的0.05％，脱色处理的时间为60min；过滤机过滤过滤，得到滤清液2，滤清液2的出料透光率优选为99.5％以上；滤清液经蒸发浓缩至含L-4-羟基异亮氨酸350g/L，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2；加入乙醇0℃醇沉育晶24h，乙醇的用量为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2体积的1倍；收集晶体，干燥，得到L-4-羟基异亮氨酸。
实施例3
一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，包含如下步骤：
(1)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液通过如下方法制备得到：
①将诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌活化后接入含有终浓度为0.1g/L Amp的种子罐培养基中，在37℃，pH7.0，溶氧控制在25％以上的条件下培养至菌液的OD600值为16，得到种子液；
②将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比15％接入发酵罐培养基中，40℃条件下液体深层通风发酵培养5h，然后降温至32℃并加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG继续进行培养直至发酵完成，其中，加IPTG后发酵过程残糖控制0.05％以下，溶氧控制在20～35％，pH7.5，底糖耗尽后，流加50wt％葡萄糖做为碳源；
③发酵至OD600为50时放罐，低温(4℃)离心收集菌体，并使用0.75wt％生理盐水对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质；然后冷冻裂解；将冷冻裂解后的菌体加入催化剂(a-酮戊二酸35g/L、异亮氨酸30g/L、硫酸亚铁2.78g/L，pH7.0)中，进行强制通风催化，每100mL催化剂加入0.3g菌体，催化温度为32.5℃，至溶氧快速回升，反应结束，得到L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液；其中，反应过程中pH先下降后回升，整个过程不需要进行pH调节；
(2)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液(含L-4-羟基异亮氨酸18g/L)升温至60℃，保温30min，然后采用微滤膜(孔径为30nm)进行微滤处理以除去蛋白与菌体，其中，处理的温度为65℃，进膜压力为0.2Mpa；得到微滤膜清液；
(3)将步骤(2)制得的微滤膜清液采用超滤膜(截留分子量为1000分子量)进行超滤处理，其中，处理的温度为38℃，进膜压力为12Mpa；得到超滤膜清液；
(4)将步骤(3)制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.5wt％的氨水洗脱，收集pH7.5～9.5的洗脱液；
(5)采用5wt％的稀盐酸调节步骤(4)收集的pH7.5～9.5的洗脱液的pH值至6.0；然后在70℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的2％，处理时间为40min；过滤机过滤，得到滤清液1，透光率为99.0％以上；滤清液经蒸发浓缩至含L-4-羟基异亮氨酸500g/L，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1；加入乙醇5℃醇沉育晶48h，乙醇的用量为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1体积的2倍；得到粗品；
(6)将步骤(5)制得的粗品重溶，在70℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的1％，脱色处理的时间为40min；过滤机过滤过滤，得到滤清液2，滤清液2的出料透光率优选为99.5％以上；滤清液经蒸发浓缩至含L-4-羟基异亮氨酸500g/L，得到含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2；加入乙醇5℃醇沉育晶48h，乙醇的用量为含有L-4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1体积的2倍；收集晶体，干燥，得到L-4-羟基异亮氨酸。
对比实施例1
一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，包含如下步骤：
(1)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液通过如下方法制备得到：
①将诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌活化后接入含有终浓度为0.1g/L Amp的种子罐培养基中，在37℃，pH7.0，溶氧控制在25％以上的条件下培养至菌液的OD600值为15，得到种子液；
②将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比15％接入发酵罐培养基中，36℃条件下液体深层通风发酵培养5h，然后降温至32℃并加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG继续进行培养直至发酵完成，其中，加IPTG后发酵过程残糖控制0.05wt％以下，溶氧控制在20～35％，pH7.0，底糖耗尽后，流加50wt％葡萄糖做为碳源；
③发酵至OD600为48时放罐，低温(4℃)离心收集菌体，并使用0.75wt％生理盐水对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质；然后冷冻裂解；将冷冻裂解后的菌体加入催化剂(a-酮戊二酸32g/L、异亮氨酸28g/L、硫酸亚铁2.78g/L，pH6.8)中，进行强制通风催化，每100mL催化剂加入0.3g菌体，催化温度为32℃，至溶氧快速回升，反应结束，得到L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液；其中，反应过程中pH先下降后回升，整个过程不需要进行pH调节；
(2)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液(含L-4-羟基异亮氨酸20g/L)升温至70℃，保温20min，然后采用微滤膜(孔径为30nm)进行微滤处理以除去蛋白与菌体，其中，处理的温度为62℃，进膜压力为0.3Mpa；得到微滤膜清液；
(3)将步骤(2)制得的微滤膜清液采用超滤膜(截留分子量为1000分子量)进行超滤处理，其中，处理的温度为40℃，进膜压力为12Mpa；得到超滤膜清液；
(4)将步骤(3)制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含3wt％的氨水洗脱，收集pH7.5～9.5的洗脱液；
(5)采用5wt％的稀盐酸调节步骤(4)收集的pH7.5～9.5的洗脱液的pH值至5.5；然后在75℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的1.5％，处理时间为50min；过滤机过滤，得到滤清液1，透光率为99.0％以上；滤清液经蒸发浓缩，得到L-4-羟基异亮氨酸。
对比实施例2
一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，包含如下步骤：
(1)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液通过如下方法制备得到：
①将诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌活化后接入含有终浓度为0.1g/L Amp的种子罐培养基中，在37℃，pH7.0，溶氧控制在25％以上的条件下培养至菌液的OD600值为15，得到种子液；
②将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比15％接入发酵罐培养基中，36℃条件下液体深层通风发酵培养5h，然后降温至32℃并加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG继续进行培养直至发酵完成，其中，加IPTG后发酵过程残糖控制0.05wt％以下，溶氧控制在20～35％，pH7.0，底糖耗尽后，流加50wt％葡萄糖做为碳源；
③发酵至OD600为48时放罐，低温(4℃)离心收集菌体，并使用0.75wt％生理盐水对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质；然后冷冻裂解；将冷冻裂解后的菌体加入催化剂(a-酮戊二酸32g/L、异亮氨酸28g/L、硫酸亚铁2.78g/L，pH6.8)中，进行强制通风催化，每100mL催化剂加入0.3g菌体，催化温度为32℃，至溶氧快速回升，反应结束，得到L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液；其中，反应过程中pH先下降后回升，整个过程不需要进行pH调节；
(2)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液(含L-4-羟基异亮氨酸20g/L)升温至70℃，保温20min，然后采用微滤膜(孔径为30nm)进行微滤处理以除去蛋白与菌体，其中，处理的温度为62℃，进膜压力为0.3Mpa；得到微滤膜清液；
(3)将步骤(2)制得的微滤膜清液采用超滤膜(截留分子量为1000分子量)进行超滤处理，其中，处理的温度为40℃，进膜压力为12Mpa；得到超滤膜清液；
(4)将步骤(3)制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1wt％的氨水洗脱，收集pH7.5～9.5的洗脱液；
(5)采用5wt％的稀盐酸调节步骤(4)收集的pH7.5～9.5的洗脱液的pH值至5.5；然后在75℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，活性炭的用量为洗脱液重量的1％，处理时间为50min；过滤机过滤，得到滤清液1，透光率为99.0％以上；滤清液经蒸发浓缩，得到L-4-羟基异亮氨酸。
效果实施例
检测实施例1～3以及对比实施例1～2制得的L-4-羟基异亮氨酸的纯度、收率、灰分含量、SO4 2-和重金属含量等性能指标，结果见表1。
表1实施例1～3以及对比实施例制得的L-4-羟基异亮氨酸的性能指标
Figure BDA0001609365770000101
Figure BDA0001609365770000111
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)L-4-羟基异亮氨酸发酵催化液升温至60～80℃，保温10～30min，然后采用微滤膜进行微滤处理以除去蛋白与菌体，得到微滤膜清液；
(2)将步骤(1)制得的微滤膜清液采用超滤膜进行超滤处理，得到超滤膜清液；
(3)将步骤(2)制得的超滤膜清液上732阳离子交换树脂吸附并用氨含1.2～1.5wt％的氨水洗脱，收集pH7.5～9.5的洗脱液；
(4)调节步骤(3)收集的pH7.5～9.5的洗脱液的pH值调节至5.0～6.0；然后在70～80℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，过滤，得到滤清液1；滤清液经浓缩，得到含有4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液1；加入乙醇进行醇沉育晶，得到粗品；
(5)将步骤(4)制得的粗品重溶，在70～80℃的条件下，加活性炭进行脱色处理，过滤，得到滤清液2；滤清液经浓缩，得到含有4-羟基异亮氨酸晶体的浓缩液2；加入乙醇进行醇沉育晶，收集晶体，干燥，得到L-4-羟基异亮氨酸；
所述的发酵催化液通过如下方法制备得到：
①将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌活化后接入含有Amp的种子罐培养基中，培养至菌液的OD600值为14～16，得到种子液；
②将步骤(1)制得的种子液接入发酵罐培养基中，35～40℃条件下液体深层通风发酵培养5～8h，然后降温至30～32℃并加入IPTG继续进行培养直至发酵完成，其中，加IPTG后发酵过程残糖控制0.05wt％以下，溶氧控制在20～35％，pH6.5～7.5，底糖耗尽后，流加50wt％葡萄糖做为碳源；
③发酵至OD600为45～50时放罐，低温离心收集菌体，并对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质；然后冷冻裂解，将冷冻裂解后的菌体加入催化剂中，进行催化，得到发酵催化液；
步骤③中所述的催化剂包含如下组分：a-酮戊二酸30～35g/L、异亮氨酸26～30g/L、硫酸亚铁2.78g/L，pH6.5～7.0。
2.根据权利要求1所述的发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
步骤(1)所述的微滤膜的孔径为30nm；
步骤(1)所述的微滤处理的温度为60～65℃，进膜压力为0.2～0.35Mpa。
3.根据权利要求1所述的发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
步骤(2)所述的超滤膜的截留分子量为1000分子量；
步骤(2)所述的超滤处理的温度为38～42℃，进膜压力为12Mpa。
4.根据权利要求1所述的发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的活性炭的用量为洗脱液重量的1～2％；
步骤(4)中所述的脱色处理的时间为40～60min。
5.根据权利要求1所述的发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的滤清液1的出料透光为99.0％以上。
6.根据权利要求1所述的发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的醇沉育晶的条件为0～5℃醇沉育晶24～48h。
7.根据权利要求1所述的发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的活性炭的用量为洗脱液重量的0.05～1％；
步骤(5)中所述的脱色处理的时间为40～60min。
8.根据权利要求1所述的发酵催化液中提取L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的滤清液2的出料透光为99.5％以上。
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