CN109321613B - 一种生产d-甘露糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产D‑甘露糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明优化假单胞菌(Pseudomonas sp.)SK 27.016的培养方法，以D‑果糖和葡萄糖作为混合碳源，并在培养过程中补加葡萄糖，获得高活力的菌株。以此菌株催化D‑果糖制备D‑甘露糖，产量可以得到大幅提高，最高可达41g/L，转化率达到41％。本发明方法为D‑甘露糖的大规模工业化制备提供可能。本发明生产的D‑甘露糖安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产D‑甘露糖，适于进行大规模生产。

Description

一种生产D-甘露糖的方法
技术领域
本发明涉及一种生产D-甘露糖的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
D-甘露糖，是一种目前唯一可用于在临床上的糖质营养素，广泛分布于体液和组织中，尤其是在神经、皮肤、睾丸、视网膜、肝和肠中。其直接被利用合成糖蛋白，参与免疫调节。此外，近年发现D-甘露糖有抑制肿瘤生长与转移，增加癌症存活率的作用，且其在治疗尿路感染上有不可比拟的优势。D-甘露糖，可推荐用作婴儿和儿童的补充治疗一种罕见的称为磷酸化甘露糖异构酶不足疾病，这被称为碳水化合物缺陷糖蛋白综合征1b型(CDGS Ib型)，表现为肠道蛋白流失，肝脏疾病，低血糖，和凝血障碍等。D-甘露糖的市场需求与日俱增，但其天然含量很低，因此单纯依靠天然物质的提取远远满足不了市场的需求。
目前生产D-甘露糖的方法主要有化学合成法和生物合成法。生物合成法又分为植物富集法和微生物发酵法。相比而言，化学合成法历史悠久反应迅速，但所使用的原料价格昂贵、毒性大，反应条件剧烈、安全性差，所用的溶剂腐蚀性强、存在安全隐患，不宜用于食品工业。植物富集法成本高、产率低、具有较大局限性。由于微生物具有生长速度快周期短、生长条件温和、代谢过程简单和分布广泛等优点，所以微生物发酵法生产D-甘露糖不受空间、环境、资源的限制，具有成本低、无化学残留、产量高等显著优点，是生产医药及食品级D-甘露糖的一条理想途径。但是，微生物发酵法制备D-甘露糖的产量还远不能满足生产需求，产量及生产效率亟待提高。
发明内容
本发明目的在于提供一种生产D-甘露糖的方法，以假单胞菌(Pseudomonas sp.)SK27.016为生产菌株，以D-果糖为底物。
所述方法包括以下步骤：
(1)种子培养
(2)发酵培养
发酵培养基(以g/L计)：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖12g/L，葡萄糖6g/L，去离子水配制；调pH 7.0；
发酵条件：接种量10％，温度35～37℃，摇床转速180～200rpm，当发酵培养基中葡萄糖消耗结束时，补加2g/L葡萄糖，当葡萄糖再次消耗完，停止发酵；
(3)收集菌体
(4)转化D-果糖生产D-甘露糖
用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液悬浮菌体至OD600＝2.5，然后加入100g/L的D-果糖，在温度为40℃条件下至少转化2h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)种子培养采用的种子培养基：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖12g/L，去离子水配制，调pH 7.0。种子培养条件：于平板上挑选培养良好的单菌落SK 27.016于25～37℃，摇床转速200rpm，种子培养基中培养14～20h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)收集菌体，是发酵结束后，4℃、8000rpm离心5min，收集菌体。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)还包括进一步的提取D-甘露糖的步骤，是将转化所得混合糖液离心、絮凝、脱色、板框过滤、离子交换、真空浓缩和干燥/结晶，得到纯化的D-甘露糖。所述的离心为2000～4000rpm离心5～25min。所述的絮凝为离心清液在30～80℃下，加入100～300mg/L壳聚糖搅拌絮凝。所述的脱色采用活性炭脱色。所述的板框过滤为将壳聚糖絮凝液循环压入板框过滤机滤布，直至滤液变清为止。所述的离子交换以1～3倍床体积流速上柱脱盐。所述的真空浓缩采用外循环式(真空度范围86.66～93.33KPa)，总固形物达到20％～60％停止。
所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)SK 27.016，已保藏于2014年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2014411，并公开在公开号CN104774794A、公开日2015年7月15日的专利中。
本发明的有益效果：本发明优化假单胞菌(Pseudomonas sp.)SK 27.016的培养方法，以D-果糖和葡萄糖作为混合碳源，并在培养过程中补加葡萄糖，获得高活力的菌株。以此菌株催化D-果糖制备D-甘露糖，产量可以得到大幅提高，最高可达41g/L，转化率达到41％。本发明方法为D-甘露糖的大规模工业化制备提供可能。本发明生产的D-甘露糖安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产D-甘露糖，适于进行大规模生产。
具体实施方式
发酵液中D-果糖的测定方法：将发酵液经离心后，上清液经吸附稀释过膜处理，通过安捷伦液相色谱仪，分别对D-甘露糖、D-果糖含量进行定量，分析条件如下：仪器型号：Ag1260，色谱柱：Sugar-Pak？I，6.5×300mm；流动相：二次蒸馏水；流速：0.4mL/min；检测器：示差折光检测器；柱温：85℃。
发酵液中葡萄糖的测定方法：DNS法。
D-甘露糖产量的测定：将全细胞转化液经吸附稀释过膜处理，通过安捷伦液相色谱仪，分别对D-甘露糖、D-果糖含量进行定量，分析条件如下：仪器型号：Ag1260，色谱柱：Sugar-Pak I，6.5×300mm；流动相：二次蒸馏水；流速：0.4mL/min；检测器：示差折光检测器；柱温：85℃。
实施例1假单胞菌(Pseudomonas sp.)SK 27.016的发酵培养
(1)种子培养
种子培养基：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖12g/L，去离子水配制，调pH 7.0；
种子培养条件：于平板上挑选培养良好的单菌落SK 27.016于25～37℃，摇床转速200rpm，种子培养基中培养14～20h。
(2)发酵培养
发酵培养基(以g/L计)：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖12g/L，葡萄糖6g/L，去离子水配制；调pH 7.0。
发酵条件：接种量10％，温度35～37℃，摇床转速180～200rpm，当发酵培养基中葡萄糖消耗结束时，补加2g/L葡萄糖，当葡萄糖再次消耗完，停止发酵。
(3)收集菌体
发酵结束后，4℃、8000rpm离心5min，收集菌体。
对比例1假单胞菌(Pseudomonas sp.)SK 27.016的发酵培养
(1)种子培养
种子培养基：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖12g/L，去离子水配制，调pH 7.0；
种子培养条件：于平板上挑选培养良好的单菌落SK 27.016于25～37℃，摇床转速200rpm，种子培养基中培养14～20h。
(2)发酵培养
发酵培养基(以g/L计)：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖18g/L，去离子水配制；调pH 7.0。
发酵条件：接种量10％，温度35～37℃，摇床转速180～200rpm，当发酵培养基中D-果糖消耗结束时，补加2g/L葡萄糖，当葡萄糖再次消耗完，停止发酵。
(3)收集菌体
发酵结束后，4℃、8000rpm离心5min，收集菌体。
对比例2假单胞菌(Pseudomonas sp.)SK 27.016的发酵培养
(1)种子培养
种子培养基：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖12g/L，去离子水配制，调pH 7.0；
种子培养条件：于平板上挑选培养良好的单菌落SK 27.016于25～37℃，摇床转速200rpm，种子培养基中培养14～20h。
(2)发酵培养
发酵培养基(以g/L计)：氯化氨6g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.04g/L，硫酸钠0.5g/L，D-果糖12g/L，葡萄糖6g/L，去离子水配制；调pH 7.0。
发酵条件：接种量10％，温度35～37℃，摇床转速180～200rpm，当发酵培养基中葡萄糖、D-果糖消耗完，停止发酵。
(3)收集菌体
发酵结束后，4℃、8000rpm离心5min，收集菌体。
实施例2细胞转化生产D-甘露糖
分别用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液悬浮实施例1、对比例1、对比例2菌体至OD600＝2.5，然后加入100g/L的D-果糖，在温度为40℃条件下转化2h。分别可以得到41g/L、32g/L、28g/L D-甘露糖。
转化液经冷冻离心后，收集含D-甘露糖的上清液，采用强酸性阳离子和弱碱性阴离子交换树脂串联脱盐脱色，再通过DTF-Ca2+型离子交换树脂进行分离纯化。通过高效液相色谱测定，分离得到的D-甘露糖纯度可达98％。
实施例3细胞转化生产D-甘露糖
分别用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液悬浮实施例1制备的菌体至OD600＝2.0，然后加入100g/L的D-果糖，在温度为40℃条件下转化2h，可以得到39g/L D-甘露糖。
实施例4细胞转化生产D-甘露糖
分别用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液悬浮实施例1制备的菌体至OD600＝2.5，然后加入80g/L的D-果糖，在温度为40℃条件下转化2h可以得到29g/L D-甘露糖。
实施例5细胞转化生产D-甘露糖
分别用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液悬浮实施例1制备的菌体至OD600＝2.5，然后加入500g/L的D-果糖，在温度为40℃条件下转化2.5h可以得到217g/L D-甘露糖。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，以假单胞菌 (Pseudomonas sp.) SK27.016为生产菌株，以D-果糖为底物；所述方法包括以下步骤：
（1）种子培养
（2）发酵培养
发酵培养基（以g/L计）：氯化氨6，磷酸氢二钠5，磷酸二氢钾0.5，氯化镁0.04，硫酸钠0.5，D-果糖12，葡萄糖6，去离子水配制；调pH 7.0；
发酵条件：接种量10%，温度35~37℃，摇床转速180~200 rpm，当发酵培养基中葡萄糖消耗结束时，补加2 g/L葡萄糖，当葡萄糖再次消耗完，停止发酵；
（3）收集菌体
（4）转化D-果糖生产D-甘露糖
用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液悬浮菌体至OD600=2.5，然后加入80~500 g/L的D-果糖，在温度为40℃条件下至少转化2 h。
2.根据权利要求1所述的一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，步骤（1）种子培养采用的种子培养基：氯化氨6 g/L，磷酸氢二钠5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，氯化镁0.04 g/L，硫酸钠0.5 g/L，D-果糖12 g/L，去离子水配制，调pH 7.0。
3.根据权利要求1或2所述的一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，种子培养条件：于平板上挑选培养良好的单菌落SK 27.016于25~37℃，摇床转速200 rpm，种子培养基中培养14~20 h。
4.根据权利要求1所述的一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，步骤（3）收集菌体，是发酵结束后，4℃、8000 rpm离心5 min，收集菌体。
5.根据权利要求1或2所述的一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，步骤（4）还包括进一步的提取D-甘露糖的步骤，是将转化所得混合糖液离心、絮凝、脱色、板框过滤、离子交换、真空浓缩和干燥/结晶，得到纯化的D-甘露糖。
6.根据权利要求5所述的一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，所述的离心为2000~4000 rpm离心5~25 min；所述的絮凝为离心清液在30~80℃下，加入100~300 mg/L壳聚糖搅拌絮凝；所述的脱色采用活性炭脱色；所述的板框过滤为将壳聚糖絮凝液循环压入板框过滤机滤布，直至滤液变清为止；所述的离子交换以1~3倍床体积流速上柱脱盐。
7.根据权利要求1所述的一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.) SK 27.016，已保藏于2014年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2014411，并公开在公开号CN104774794A、公开日2015年7月15日的专利中。
8.根据权利要求1或2或4或6或7所述的一种生产D-甘露糖的方法，其特征在于，步骤（4）加入100 g/L的D-果糖。
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