CN108265096A - 一种微生物发酵制备纽莫康定b0的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微生物发酵制备纽莫康定B0的方法。具体而言，该方法通过对霉菌Glarea lozoyensis的液态深层发酵，种子培养基和发酵培养基含有合适的碳源、氮源、无机盐和微量元素源，其中发酵培养基使用山梨醇作为主要碳源，并加入葡萄糖形成复合碳源。本发明提供的发酵方法，能够在工业级发酵罐上稳定地生产，纽莫康定B0的产量达到2.5g/L。

Description

一种微生物发酵制备纽莫康定B0的方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，涉及一种微生物发酵制备纽莫康定B0的方法及所使用的发酵培养基。
背景技术
卡泊芬净(caspofungin)，是第一个被批准上市的棘白菌素类抗真菌药，其由默克公司开发。它通过抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶，干扰真菌细胞壁的合成，形成抗真菌的作用。由于哺乳动物细胞没有细胞壁，因此它对人体不造成影响。卡泊芬净对曲霉菌属真菌和念珠菌属真菌均表现出体外抗菌活性。主要用于治疗念珠菌菌血症和其他念珠菌感染，食道念珠菌病，适用于感染侵袭性曲霉菌且对既往治疗无效或不能耐受的患者，以及粒细胞减少发热患者经验治疗。
卡泊芬净主要以棘白菌素类化合物纽莫康定B0(Pneumocandin B0，PB0)为原料经半合成制得。纽莫康定B0是真菌Glarea lozoyensis发酵的次级代谢产物。EP0405997B记载了纽莫康定B0的结构及通过Glarea lozoyensis发酵制备纽莫康定B0的方法，其中发酵培养基的碳源优选甘露醇。WO0008197公开了发酵培养基中的脯氨酸及微量元素对纽莫康定B0产率的影响。宋萍等(《中国抗生素杂志》,2015,40(1):6-12)总结了发酵条件对纽莫康定B0及其结构类似物产量的影响。其指出在碳源的选择方面，甘露醇和果糖有利于纽莫康定B0的产出。
在发酵生产纽莫康定B0的过程中，还会产生了一系列的纽莫康定类似物，例如纽莫康定A0、丝氨酸类似物和D0，从而影响了纽莫康定B0的发酵纯度及收率。尽管现有技术报道了很多纽莫康定B0的发酵方法，但仍然缺乏大批量、高纯度稳定生产纽莫康定B0的方法。因此，对于工业规模的生产而言，获得一种稳定、高产的纽莫康定B0发酵工艺是非常有必要的。
发明内容
本发明提供了一种高效、稳定生产纽莫康定B0的方法，可用于工业化生产。
一方面，本发明提供了一种发酵生产纽莫康定B0的发酵培养基，其包含山梨醇以及其它碳源。其中，其它碳源可以是糖类、油脂、有机酸、有机酸酯和小分子醇中的一种或多种，优选糖类，更优选葡萄糖、淀粉和糊精中的一种或多种，最优选葡萄糖。其中，山梨醇的含量为10％-15％，优选12％。其它碳源的含量为0.1％-3％，优选1％。
另外，本领域技术人员公知，发酵培养基还可包含合适的氮源、微量元素源等组分，供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
优选地，本发明发酵培养基可包含氮源，其中氮源选自棉籽饼粉、玉米蛋白粉、玉米浆粉、黄豆饼粉、豆粕、酵母粉、生豆粉、玉米浆、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母浸出粉、蚕蛹粉中的一种或多种，优选棉籽饼粉、玉米蛋白粉、玉米浆粉、黄豆饼粉中的一种或多种，更优选棉籽饼粉和玉米蛋白粉。其中，所述氮源的含量为1％-5％。当氮源为棉籽饼粉和玉米蛋白粉的组合时，棉籽饼粉的含量为0.5％-2％，优选1.2％；玉米蛋白粉的含量为1.0％-4.0％，优选为2.8％。
优选地，本发明发酵培养基还可包含微量元素源，所述微量元素优选包含磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铵、硝酸钠中的一种或多种。其中，磷酸氢二钾的含量可以为0.1～1.0％，优选为0.4％；硫酸亚铁的含量可以为0.01～0.1％，优选为0.05％；硫酸锰的含量可以为0.01～0.05％，优选为0.03％；硫酸铵的含量可以为0.05～0.3％，优选为0.2％；硝酸钠的含量可以为0.05～0.3％，优选为0.2％。所述的发酵培养基使用常规的酸碱进行调节，使其pH在灭菌前为为5.5～7.5，优选为6.5。
优选地，发酵培养基可为：1％的无水葡萄糖，12％的山梨醇，1.2％的棉籽饼粉，2.8％的玉米蛋白粉，0.4％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸亚铁，0.03％的硫酸锰，0.2％的硫酸铵以及0.2％的硝酸钠。
本发明还提供了一种微生物发酵制备纽莫康定B0的种子培养基，所述的种子培养基包含无水葡萄糖、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、磷酸二氢钾、六水合氯化镁、七水合硫酸锌、六水合氯化铁、五水合硫酸铜。
所述的种子培养基中，组分的含量可以是，无水葡萄糖的含量为2～6％，优选为4％；黄豆饼粉的含量为1～3％，优选为2％；棉籽饼粉的含量为0.5～1.5％，优选为1％；玉米浆干粉的含量为0.5～1.5％，优选为1％；磷酸二氢钾的含量为0.05～0.15％，优选为0.1％。六水合氯化镁、七水合硫酸锌、六水合氯化铁、五水合硫酸铜为微量元素源，含量为0.05PPM-1.0PPM，优选为六水合氯化镁0.486PPM，七水合硫酸锌0.418PPM，六水合氯化铁0.840PPM，五水合硫酸铜0.078PPM。所述的种子培养基使用常规的酸碱进行调节，使其pH在灭菌前为5.0～6.0，优选为5.5。
本发明还提供了一种发酵生产纽莫康定B0的方法，包括发酵时使用上述发酵培养基。
本发明的发酵方法所使用的菌株为Glarea lozoyensis或其诱变菌株，优选Glarea lozoyensis ATCC 74030。
在发酵过程中，发酵液在23.5-25℃培养；发酵液使用常规酸碱控制pH为4.5-6.5，优选的pH为5.0-5.5，最优选的pH为5.3。所述的发酵过程中，维持一定的溶氧，优选地维持溶氧≥20％。
所述的在发酵过程中，加入1-3％的脯氨酸，优选加入2％的脯氨酸。所述的在发酵过程中加入脯氨酸，加入时间包括以下两种：(1)发酵初始培养基中加入；(2)发酵过程中加入。优选的加入时间为发酵至90-110小时。所述的在发酵过程中加入脯氨酸，加入方式有以下三种：(1)一次性加入；(2)分批间歇加入；(3)流动连续加入。
在发酵中后期可补加碳源山梨醇，优选的补加时间为190h-220h起到发酵结束。所述的发酵中后期补加山梨醇，每天补加量为10-20g/L，优选的每天补加量为15g/L。所述的发酵中后期补加山梨醇，补加方式有以下三种：(1)一次性加入；(2)分批间歇加入；(3)流动连续加入。
另一方面，本发明提供了一种使用Glarea lozoyensis或其诱变菌株发酵制备纽莫康定B0的方法，包括：发酵培养基为：1％的无水葡萄糖，12％的山梨醇，1.2％的棉籽饼粉，2.8％的玉米蛋白粉，0.4％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸亚铁，0.03％的硫酸锰，0.2％的硫酸铵以及0.2％的硝酸钠；发酵方法包括将种子液接种至发酵罐，培养温度25℃，维持溶氧≥20％，体系pH5.3；在发酵过程中加入2％的脯氨酸；在发酵过程中补加山梨醇。
本发明还提供了一种制备卡泊芬净的方法，方法包括使用本发明所述的制备纽莫康定B0的方法制备得到纽莫康定B0，再用于制备卡泊芬净。
本发明的发酵方法，以山梨醇作为发酵培养主要碳源，加入少量其他碳源，使得纽莫康定B0的发酵产量达到2.5g/L，适用于工业生产。同时，通过测定发酵结束后的发酵液组成发现，纽莫康定B0的纯度较高，而杂质纽莫康定A0、丝氨酸类似物和纽莫康定D0等含量很低，这减轻了后期产品纯化的压力，利于工业化生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本发明所使用的菌株Glarea lozoyensis为Glarea lozoyensis ATCC 74030，来自美国模式菌种收集中心(ATCC)。所述培养基组分的含量均基于与发酵液总质量的比来计算(w/w％)。
实施例1：纽莫康定B0的5L发酵生产
配制一级摇瓶种子培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖4％，黄豆饼粉2％，棉籽饼粉1％，玉米浆干粉1％，磷酸二氢钾0.1％，微量元素源溶液(六水合氯化镁0.486g/L，七水合硫酸锌0.418g/L，六水合氯化铁0.840g/L，五水合硫酸铜0.078g/L)0.1％。饮用水配制，灭菌前调节pH至5.5。使用灭菌锅121℃灭菌30分钟。
一级摇瓶种子培养：种子甘油管接种1ml至一级种子摇瓶，放置于25℃摇床，220rpm，培养3天。
配制二级摇瓶种子培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖4％，黄豆饼粉2％，棉籽饼粉1％，玉米浆干粉1％，磷酸二氢钾0.1％，微量元素源溶液(六水合氯化镁0.486g/L，七水合硫酸锌0.418g/L，六水合氯化铁0.840g/L，五水合硫酸铜0.078g/L)0.1％。饮用水配制，灭菌前调节pH至5.5。使用灭菌锅121℃灭菌30分钟。
二级摇瓶种子培养：一级摇瓶种子接种0.5ml至二级种子摇瓶，放置于25℃摇床，220rpm，培养3天。
配制5L发酵罐培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖1％，山梨醇12％，棉籽饼粉1.2％，玉米蛋白粉2.8％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸亚铁0.05％，硫酸锰0.03％，硫酸铵0.2％，硝酸钠0.2％。饮用水定容至3L，灭菌前调节pH至6.5。使用灭菌锅121℃灭菌40分钟。
5L发酵罐培养：二级摇瓶种子液接种300ml至5L发酵罐。培养温度25℃，溶氧与转速联动，溶氧控制≥20％。使用氨水控制pH为5.30。培养至90-110h，补加发酵液总质量2％的脯氨酸。脯氨酸配制成水溶液，121℃灭菌30分钟，然后补加到5L发酵罐。发酵至190-220h，每天一次山梨醇，每次每L发酵液补加15g山梨醇。山梨醇配制成水溶液，121℃灭菌30分钟，然后补加到5L发酵罐，发酵培养13天。
实施例2-7：不同发酵培养基生产纽莫康定B0
采用不同碳源组成的发酵培养基，按照实施例1的发酵方法制备纽莫康定B0。发酵培养基中的无机盐组分为：磷酸氢二钾0.4％，硫酸亚铁0.05％，硫酸锰0.03％，硫酸铵0.2％，硝酸钠0.2％。发酵培养基的碳源和氮源组分见下表。
实施例 碳源组成 氮源组成
2 甘露醇12％ 棉籽饼粉1.2％+玉米蛋白粉2.8％
3 果糖12％ 棉籽饼粉1.2％+玉米蛋白粉2.8％
4 山梨醇12％ 棉籽饼粉1.2％+玉米蛋白粉2.8％
5 甘露醇12％+葡萄糖1％ 棉籽饼粉1.2％+玉米蛋白粉2.8％
6 山梨醇12％+淀粉1％ 棉籽饼粉1.2％+玉米蛋白粉2.8％
7 山梨醇12％+糊精1％ 棉籽饼粉1.2％+玉米蛋白粉2.8％
实施例8
发酵过程取样测定发酵液中纽莫康定B0和主要杂质纽莫康定A0、丝氨酸类似物、D0等的含量，处理过程为：取发酵液少量，加入乙醇，超声30分钟，离心取上清，HPLC测定其产量。
HPLC检测条件：以YMC J’sphere ODS-M80 4μm 250×4.6mm色谱柱；以A：0.1％磷酸水溶液B：乙腈为流动相，梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为1.5mL/min；柱温为30℃。洗脱梯度如下表所示：
采用上述方法测定实施例1-7中所得的发酵液的纽莫康定B0和主要杂质含量，见下表。
由上表可以看出，当发酵培养基的碳源为山梨醇和葡萄糖的组合时，相比于其他碳源，纽莫康定B0的产率高，主要杂质很低，相比于现有技术更利于工业化生产。
实施例9：纽莫康定B0的500L发酵生产
一级摇瓶种子培养，二级摇瓶种子培养同实施例1。
配制50L种子罐培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖4％，黄豆饼粉2％，棉籽饼粉1％，玉米浆干粉1％，磷酸二氢钾0.1％，微量元素源溶液(六水合氯化镁0.486g/L，七水合硫酸锌0.418g/L，六水合氯化铁0.840g/L，五水合硫酸铜0.078g/L)0.1％。饮用水定容至30L，灭菌前调节pH至5.5。蒸汽在线灭菌121℃灭菌30分钟。
50L种子罐培养：二级摇瓶种子液按照3％的接种量，接种至50L种子罐。培养温度25℃，溶氧与转速联动，溶氧控制≥20％。培养3天。
配制500L发酵罐培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖1％，山梨醇12％，棉籽饼粉1.2％，玉米蛋白粉2.8％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸亚铁0.05％，硫酸锰0.03％，硫酸铵0.2％，硝酸钠0.2％。饮用水定容至300L，灭菌前调节pH至6.5。蒸汽在线灭菌121℃灭菌40分钟。
500L发酵罐培养：50L种子罐接种30L种子液至500L发酵罐。培养温度25℃，溶氧与转速联动，溶氧控制≥20％。使用氨水控制pH为5.30。培养至90-110h，补加发酵液总质量2％的脯氨酸。脯氨酸配制成水溶液，121℃灭菌30分钟，然后补加到500L发酵罐。发酵至190-220h，每天一次山梨醇，每次每L发酵液补加15g山梨醇。山梨醇配制成水溶液，121℃灭菌30分钟，然后补加到500L发酵罐。
500L发酵罐培养12天放罐，纽莫康定B0的产量达到2.0g/L，主要杂质纽莫康定A0、丝氨酸类似物、D0与B0的比值为3.89％，2.95％，0.51％。
实施例10：纽莫康定B0的10T发酵生产
一级摇瓶种子培养，二级摇瓶种子培养同实施例1。
配制150L种子罐培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖4％，黄豆饼粉2％，棉籽饼粉1％，玉米浆干粉1％，磷酸二氢钾0.1％，微量元素源溶液(六水合氯化镁0.486g/L，七水合硫酸锌0.418g/L，六水合氯化铁0.840g/L，五水合硫酸铜0.078g/L)0.1％。饮用水定容至100L，灭菌前调节pH至5.5。蒸汽在线灭菌121℃灭菌30分钟。
150L种子罐培养：二级摇瓶种子液按照3％的接种量，接种至150L种子罐。培养温度25℃，溶氧与转速联动，溶氧控制≥20％。培养3天。
配制1000L种子罐培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖4％，黄豆饼粉2％，棉籽饼粉1％，玉米浆干粉1％，磷酸二氢钾0.1％，微量元素源溶液(六水合氯化镁0.486g/L，七水合硫酸锌0.418g/L，六水合氯化铁0.840g/L，五水合硫酸铜0.078g/L)0.1％。饮用水定容至600L，灭菌前调节pH至5.5。蒸汽在线灭菌121℃灭菌30分钟。
1000L种子罐培养：150L种子液按照3％的接种量，接种至1000L种子罐。培养温度25℃，溶氧与转速联动，溶氧控制≥20％。培养3天。
配制10T发酵罐培养基，培养基组分如下：无水葡萄糖1％，山梨醇12％，棉籽饼粉1.2％，玉米蛋白粉2.8％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸亚铁0.05％，硫酸锰0.03％，硫酸铵0.2％，硝酸钠0.2％。饮用水定容至6T，灭菌前调节pH至6.5。蒸汽在线灭菌121℃灭菌40分钟。
10T发酵罐培养：1000L种子罐接种600L种子液至10T发酵罐。培养温度25℃，溶氧与转速联动，溶氧控制≥20％。使用氨水控制pH为5.30。培养至90-110h，补加发酵液总质量2％的脯氨酸。脯氨酸配制成水溶液，121℃灭菌30分钟，然后补加到10T发酵罐。发酵至190-220h，每天一次山梨醇，每次每L发酵液补加15g山梨醇。山梨醇配制成水溶液，121℃灭菌30分钟，然后补加到10T发酵罐。
10T发酵的纽莫康定B0的产量变化如下表所示。
主要杂质纽莫康定A0、丝氨酸类似物、D0与B0的比值如下表所示。
A0 丝氨酸类似物 D0
10T发酵批次一 3.85％ 2.86％ 0.63％
10T发酵批次二 3.63％ 2.54％ 0.62％
10T发酵批次三 3.91％ 2.63％ 0.63％
由上表可以看出，10T发酵罐培养至11-12天，产量能够达到2.5g/L以上，且杂质含量较低，并且三批发酵实验的结果重现性较好。该实验证明，本发明介绍的纽莫康定B0的发酵方法是高效、稳定的，能够应用于工业化生产。
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，但是这并非用以限制本发明的内容，本发明的保护范围以申请专利的实际权利要求范围为准。

Claims (15)

1.一种用于发酵制备纽莫康定B0的发酵培养基，其包含山梨醇和葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述山梨醇的含量为10％-15％，优选12％。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述葡萄糖的含量为0.1％-3％，优选1％。
4.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基还包含氮源，其中氮源选自棉籽饼粉、玉米蛋白粉、玉米浆粉、黄豆饼粉、豆粕、酵母粉、生豆粉、玉米浆、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母浸出粉、蚕蛹粉中的一种或多种，优选棉籽饼粉、玉米蛋白粉、玉米浆粉、黄豆饼粉中的一种或多种，更优选棉籽饼粉和玉米蛋白粉。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述氮源的含量为1％-5％。
6.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述氮源为棉籽饼粉和玉米蛋白粉，其中棉籽饼粉的含量为0.5％-2％，优选1.2％；所述玉米蛋白粉的含量为1.0％-4.0％，优选为2.8％。
7.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基还包含微量元素源，所述微量元素源优选包含磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铵、硝酸钠中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述磷酸氢二钾的含量为0.1％-1.0％，优选为0.4％；所述硫酸亚铁的含量为0.01％-0.1％，优选为0.05％；所述硫酸锰的含量为0.01％-0.05％，优选为0.03％；所述硫酸铵的含量为0.05％-0.3％，优选为0.2％；所述硝酸钠的含量为0.05％-0.3％，优选为0.2％。
9.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，发酵培养基为：1％的无水葡萄糖，12％的山梨醇，1.2％的棉籽饼粉，2.8％的玉米蛋白粉，0.4％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸亚铁，0.03％的硫酸锰，0.2％的硫酸铵以及0.2％的硝酸钠。
10.一种发酵制备纽莫康定B0的方法，其特征在于，发酵使用权利要求1-9任意一项所述的发酵培养基。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在发酵过程中加入1-3％的脯氨酸，优选加入2％的脯氨酸。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括发酵液在23.5-25℃培养；发酵过程中维持溶氧≥20％；体系pH维持在5.0-5.5。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，发酵使用的菌株为Glarealozoyensis或其诱变菌株。
14.一种使用Glarea lozoyensis或其诱变菌株发酵制备纽莫康定B0的方法，其特征在于，发酵培养基：1％的无水葡萄糖，12％的山梨醇，1.2％的棉籽饼粉，2.8％的玉米蛋白粉，0.4％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸亚铁，0.03％的硫酸锰，0.2％的硫酸铵以及0.2％的硝酸钠；
制备方法包括，将种子液接种至发酵罐，培养温度25℃，维持溶氧≥20％，体系pH5.3；在发酵过程中加入2％的脯氨酸；在发酵过程中补加山梨醇。
15.一种制备卡泊芬净的方法，其特征在于，制备方法包括权利要求10-14任意一项所述制备纽莫康定B0的方法。
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