CN113046250B - 生产纽莫康定b0的基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用。所述基因工程菌可过表达异源脯氨酸羟化酶基因，其中所述基因工程菌的出发菌株为丝状真菌Glarea lozoyensis。该基因工程菌在生产纽莫康定B0过程中取得了良好的效果：当发酵培养基中不添加脯氨酸时，发酵产物中的PC0/(PB0+PC0)从33.5％降低至11％，当发酵培养基中添加2％的脯氨酸时，发酵产物中无PC0的产生。

Description

生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
纽莫康定(Pneumocandins)属于棘白霉素类抗生素，该类抗生素可以非竞争性抑制参与真菌细胞壁合成的β-(1,3)-D-葡聚糖合酶，因其作用机制使该类抗生素具有毒副作用小的优点。目前，上市的棘白霉素类抗生素有卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净，主要用于深部真菌感染的治疗。
纽莫康定是由丝状真菌G.lozoyensis产生的一系列结构相似的化合物，其中PB0具有较好的抗真菌活性，经化学修饰后生成卡泊芬净。PB0作为合成卡泊芬净的中间体，其纯度需要严格控制。而由于微生物代谢的复杂性，该菌株在产生PB0的同时，伴随着一系列结构相似的化合物的产生，其中PC0与PB0结构十分相似，极性相差较小，分离纯化十分困难。在结构上PC0与 PB0的区别在于环上第6个氨基酸残基(图1)，PB0为trans-3-hydroxyproline (3-Hyp)，而PC0为trans-4-hydroxyproline(4-Hyp)。因极性相差较小，利用反向HPLC上难以分离PB0和PC0，只能测得PB0和PC0的总量，需通过正向 HPLC来检测PC0的含量。
目前，主要通过在发酵培养基中添加脯氨酸来降低PC0的产生，但由于脯氨酸价格昂贵，且添加脯氨酸后产物中仍含有一定量的PC0，还需进一步利用高压制备硅胶柱进行分离，因此使得卡泊芬净的生产成本大幅度提高。本领域急需一种不需要添加或仅需添加脯氨酸，且不需要通过柱层析纯化即能制备高纯度的PB0的基因工程菌及其生产方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为克服现有技术中G.lozoyensis在产生PB0的同时产生杂质PC0的缺陷，提供发酵PB0时杂质PC0产量大大降低的一种生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用。
据文献(Aspergillus pachycristatus棘白菌素B合成中脯氨酸羟化酶的功能分析及CRISPR/Cas9基因编辑体系的构建[D].山东大学,2019.)报道，ap- htyE基因在体外以L-Pro为底物时，生成反式-4-Hyp和反式-3-Hyp的比例为2.5:1，即基因在体外会产生更多的4-Hyp并会导致PC0的产生。而在本发明中，发明人意外发现：将ap-htyE基因导入Glarealozoyensis菌体内时，获得了目标产物PB0的增加和杂质PC0的减少的效果。
故本发明采取的技术方案之一为：一种基因工程菌，其中，所述基因工程菌可过表达异源脯氨酸羟化酶基因，其中所述基因工程菌的出发菌株为丝状真菌Glarealozoyensis。
在一较佳的实施例中，所述基因工程菌中，所述异源脯氨酸羟化酶基因构建于质粒中，或通过同源重组随机整合在所述丝状真菌的基因组上。
在一些更佳的实施例中，所述异源脯氨酸羟化酶基因选自编码以下蛋白的基因中的一个或多个：Asperillus pachycristatus或皱褶曲霉(Aspergillus rugulosus)的HtyE、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)NRRL 8112的AniF、 Aspergillus mulundensis的AMOXY2、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的 AAOXY2、Coleophoma empetri的CCOXY2、Coleophoma crateriformis的 CEOXY2、Coleophoma cylindrospora的CCROXY2和来自Venustampulla echinocandica的VEOXY2。
在一些具体的较佳实施例中，所述Asperillus pachycristatus或皱褶曲霉(Aspergillus rugulosus)的HtyE的氨基酸序列如GenBank登录号K0DZA0.1 中的氨基酸序列所示，优选地，编码所述Asperillus pachycristatus和皱褶曲霉(Aspergillusrugulosus)的HtyE的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述AniF的氨基酸序列如GenBank登录号AMM63174.1中的氨基酸序列所示，所述AMOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号AKJ70940.1中的氨基酸序列所示，所述AMOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号AKJ70940.1中的氨基酸序列所示，所述AAOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号 AXC33065.1中的氨基酸序列所示，所述CCOXY2的氨基酸序列如GenBank 登录号序列RDW69672.1中的氨基酸序列所示，所述CEOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号BAN91495.1中的氨基酸序列所示，所述CCROXY2的氨基酸序列如GenBank登录号RDW80795.1中的氨基酸序列所示，所述 VEOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号RDL32346.1中的氨基酸序列所示。
较佳地，所述的过表达为：将所述异源脯氨酸羟化酶基因转化入所述丝状真菌Glarea lozoyensis，并使其表达；优选地，所述出发菌株为丝状真菌 Glarea lozoyensisATCC 74030。
较佳地，所述异源脯氨酸羟化酶基因在一基因表达盒中，其上游和下游分别具有启动子和终止子；较佳地，所述启动子和终止子分别为glgpd启动子和glgpd终止子。
较佳地，所述基因表达盒在一表达载体中，所述的表达载体的骨架优选质粒pAgG。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种如上所述的基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
1)构建含有所述异源脯氨酸羟化酶基因的表达载体；
2)以所述丝状真菌(Glarea lozoyensis)为宿主菌，用步骤1)得到的表达载体进行转化，获得过表达异源脯氨酸羟化酶的基因工程菌；
优选地，所述1)中，所述表达载体的构建方法为：
A、构建含gpd启动子片段、gpd终止子片段的基因表达盒的表达载体；
B、将所述异源htyE基因插入所述基因表达盒即得。
较佳地，所述的转化利用AMT技术，即农杆菌介导的转化 (Agrobacteriummediated Transformation,AMT)技术。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种如上所述的基因工程菌在制备纽莫康定B0上的用途。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：当发酵培养基中不添加脯氨酸时，发酵产物中的PC0/(PB0+PC0)从33.5％降低至11％，当发酵培养基中添加2％的脯氨酸时，发酵产物中PC0/(PB0+PC0)由6％降低至0。
附图说明
图1为Pneumocandin B0和Pneumocandin C0的化学结构式；
图2为pAgG-sgRNA-gloF-ap-htyE质粒图谱；
图3为本发明Gl(PC)-ap-htyE工程菌株发酵产物正相HPLC检测图谱；
图4为pAgG-ap-htyE质粒图谱；
图5为Gl-ap-htyE工程菌株不添加脯氨酸时的发酵产物的正相HPLC检测图谱；
图6为Gl-ap-htyE工程菌株添加2％脯氨酸时的发酵产物的正相HPLC 检测图谱；
图7为出发菌株G.lozoyensis ATCC74030不添加脯氨酸时的发酵产物的正相HPLC检测图谱；
图8为出发菌株G.lozoyensis ATCC74030添加2％脯氨酸时的发酵产物的正相HPLC检测图谱；
图9为本发明同源重组技术的原理图；图中T-DNA即质粒pAgG-sgRNA- gloF-ap-htyE的T-DNA区域；
图10为pAg1-H3质粒图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1工程菌株Gl(PC)-ap-htyE的构建、发酵和HPLC检测
1、工程菌株Gl(PC)-ap-htyE的构建
首先，将cas9表达质粒pDHt/sk-PC(中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学元件与数据库研究组)利用AMT (Agrobacterium-mediatedtransformation，农杆菌介导的转化)导入G. lozoyensis菌株(ATCC菌种保藏中心)中，得到cas9表达菌株G.lozoyensis (PC)。
然后，构建sgRNA表达质粒pAgG-sgRNA-gloF，利用G.lozoyensis基因组(利用本领域常规技术自提)为模板，5S-F/R为引物(本实施例所用引物的碱基序列见下表1，其中-F表示上游引物，-R表示下游引物，下同)， PCR得到5s rRNA片段。用N20-gloF-F和sgRNA-R为引物，PCR得到可特异性识别gloF的sgRNA片段。以5s rRNA片段和sgRNA片段作为模板，用5S-F和sgRNA-R为引物进行重叠PCR，得到sgRNA表达盒。将该表达盒利用同源重组试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit，Vazyme公司) 连接至BglII/EcoRI酶切处理的pAgG线性载体(pAgG为实验室构建，专利中有介绍pAgG的来源：以pAg1-H3为模板，用引物Ptrpc-F/R进行PCR得到trpC启动子片段。以质粒pEGFP-N2为模板，用引物NeoR-F/R进行PCR得到G418抗性基因Neo片段。以pAg1-H3为模板，用引物Ttrpc-F/R进行 PCR，得到trpC终止子片段。以PCR片段1，片段2，片段3为模板，用引物Ptrpc-F和Ttrpc-R进行重叠PCR，得到G418抗性基因表达盒，将该表达盒连接至HindIII/SpeI线性化的pAg1-H3载体上，最终得到质粒pAg1-HG。 pAg1-HG利用EcoRI单切后自连得到pAgG。质粒pAg1-H3来自于中国科学院微生物研究所(质粒图谱见图10)，质粒pEGFP-N2为商购，淼灵质粒公司。)上得到质粒pAgG-sgRNA-gloF。
为了将gloF基因替换为ap-htyE基因，需要在pAgG-sgRNA-gloF的基础上引入修复模板。方法为：以G.lozoyensis基因组为模板，分别以5-gloF- F/R和3-gloF-F/R为引物，PCR得到5'同源臂和3'同源臂。以A.pachycristatus NRRL11440或A.rugulosus的cDNA为模板，htyE-F/R为引物PCR得到ap- htyE基因。将5'同源臂，3'同源臂和ap-htyE基因作为模板，用引物5-gloF- F和3-gloF-R进行重叠PCR，得到修复模板片段，最后利用同源重组试剂盒将该片段连接至SalI/BglII双酶切的pAgG-sgRNA-gloF线性化载体上，得到质粒pAgG-sgRNA-gloF-ap-htyE(质粒图谱如图2所示)。
表1PCR中涉及的引物序列
Figure BDA0002341075360000061
2、工程菌株Gl(PC)-ap-htyE的构建
利用AMT，将质粒pAgG-sgRNA-gloF-ap-htyE导入G.lozoyensis(PC) 菌株中，使其发生同源重组(其技术路线如图9所示)，筛选得到工程菌株 Gl(PC)-ap-htyE。
上述构建过程中，其他涉及的序列如下所示。
5s rRNA及其上游441bp基因序列(SEQ ID NO:25)：
gcttcatttgatcgatgttccaacacaaatgacactcgcctacgtattacaaccaactctctagcaactaactgc caaacactctatcgaacttagtcgagcagtccgtctgaagttgattcattaagagtaacagactgccttgaatctctcaa ctcagcatttaccaagaaagcgttctaaaatccgtaccacacgccgtcatttctgacataacttgaatcggcctcccat cacgtgacgcaccccgactcccttaacaaccgcacaagtcctcacacaccacaaccccctcaaccacacaaccac ccttcttccaccaaaacacaatttccctacaaactcatatagctgtgtttgtgtttctctcatcacacccccccgctctttttt cagccctccagcgtcaactatataaatctaaaaccacccacctttgtcac atacgatcatagactgatgagaattgggcatcccgtccgctctgccacacacaagcatcagatcggtagattagta gttgggtgggtgaccaccagcgaatacctactgtcgtatg
其中，5s rRNA基因序列用下划线标出。
gloF的sgRNA序列(SEQ ID NO:26)：
catcgtggttggagtgctgtgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtggcaccgagtcggtgcttttttt
其中，N20用下划线标出。
ap-htyE的cDNA基因序列(SEQ ID NO:13)：
atggctatcactacgctagattttaaccaattccgcagcaccagcgcagatgagcgccagatattctgcgctg atctctgcgagactctctcagtctacggtttcgcaaagattcgcaacacgacactgtcgaacgaactgatagacgaaa tattcaaatacactcggtccttcttcgcccttccgaacgacatcaaagccaaagccaagcaccccaacgccccgaat cctcatcgcggatggagcgccattggccaagagcgcgtgtggaagatttctggcttcgagcagaacaaagagcgc accgacagctacaatgagttccgggaatcttttgaccaaggcgccgcagacgaccagctctttccaaacagatgggt agacgaggatgacctcccgggcttccaagccttcatggaaggattctacaaatcgtgcgacgagctacacgcgcat ctcttgcgcgccatttcaacgggcctcaagctacctgataccctattaccctccaaacaccgccacaacaccagcga actccgtctgctgcactacccaccgatcccctgcagcgcactccgcagcaacatgcgcatcggggagcactccga cttcggcacactaacgctcctcctccaagactctgtcggggggctccaagtcgaggatcagcggaatccaagaagc tttatccccgttgaaccggaggacgggtatgaggttgtgattaatataggggattgtttgcagcggtggacgaatagg cggctttgttcggcgaatcatcgggttatgttgccggaggggaaggacgtggattcggaggaagtgttggatgatcg gtactcggttgcgtattttgggaagccggatcgcgatgtccttgttgatacgctgccggagtgtgttgaggtgggaga gagggtggagtatggcgaccatttgactgcgttgcagtataatcagattaagttgacgaggacctatgggtaa
3、工程菌株Gl(PC)-ap-htyE的发酵
为了确认Gl(PC)-ap-htyE菌株的PC0产量，将其接种于20mL种子培养基中，25℃，220rpm，培养4d，按10％接种量接种到30mL发酵培养基中， 25℃，220rpm，培养10天。
本发明所用的培养基
1、种子培养基配方(1L)：
葡萄糖20g，黄豆饼粉10g，KH2PO4 2g，余量为水。pH值为5.5；121℃灭菌20分钟。
2、发酵培养基配方(1L)：
甘露醇100g，棉籽饼粉5g，黄豆饼粉10g，K2HPO4 4g，CaCO3 1g，L- Pro 20g，余量为水。pH值为6.5；121℃灭菌20分钟。
4、HPLC检测
利用反相HPLC(安捷伦)检测发酵液中PB0和PC0的总量：取2mL发酵液，加8ml无水乙醇充分混匀，超声震荡30min，过滤后得滤液进行检测。
流动相：乙腈：H2O＝55：45
柱子：4.6*250mm C18 ODS，大连依利特
波长：210nm
流速：1.0mL/min
然后，利用正相HPLC检测发酵液中PC0/PB0的比例：取10mL发酵液离心(9000g)去上清，加无水乙醇至10mL刻度，充分混匀，超声震荡(超声波清洗仪器)30min后离心，过滤(0.22μm，上海安谱实验科技股份有限公司)得滤液。控制温度50-60℃，真空度-0.08-0.095MPa，把滤液蒸干。加正相流动相3mL溶解，用于正相柱分析。
流动相：二氯甲烷：甲醇：H2O＝80：20：1.5
柱子：4.6*250mm正相SiO2柱(Elite,Dalian)
波长：276nm
流速：1.0mL/min
正相HPLC检测结果：发酵培养基中不添加脯氨酸时，发酵样品经处理后检测如图3所示。HPLC结果显示：无论发酵培养基中是否添加脯氨酸，该工程菌株都不产生PC0。
实施例2Gl-ap-htyE工程菌株的构建、发酵和HPLC检测
1、质粒构建：
(1)pAgG及pAgG-Pgpd-Tgpd的构建
以pAg1-H3为模板，用引物Ptrpc-F/R(本实施例使用的引物的碱基序列见下表2)进行PCR得到trpC启动子片段(片段1)。以质粒pEGFP-N2 为模板，用引物NeoR-F/R进行PCR得到G418抗性基因Neo片段(片段2)。以pAg1-H3为模板，用引物Ttrpc-F/R进行PCR，得到trpC终止子片段 (片段3)。以PCR片段1、片段2、片段3为模板，用引物Ptrpc-F和Ttrpc- R进行重叠PCR(方法为本领域常规)，得到G418抗性基因表达盒，将该表达盒连接至HindIII/SpeI线性化的pAg1-H3载体上，最终得到质粒pAg1-HG。 pAg1-HG利用EcoRI单切后自连得到pAgG。
以G.lozoyensis ATCC74030基因组为模板，分别利用引物Pgpd-F/R和 Tgpd-F/R进行PCR，得到glgpd启动子和终止子片段。利用获得的两个片段为模板，Pgpd-F和Tgpd-R为引物进行重叠PCR，得到Pglgpd-Tglgpd。将该片段利用同源重组试剂盒连接至SpeI/EcoRI线性化的pAgG载体上，得到 pAgG-Pgpd-Tgpd。
(2)表达质粒pAgG-ap-htyE的构建
构建ap-htyE基因的表达质粒pAgG-ap-htyE。以A.pachycristatus NRRL11440(购自美国NRRL)的cDNA为模板，ap-htyE-F/R为引物PCR 得到ap-htyE基因，将该基因利用同源重组试剂盒连接至SpeI/SalI双酶切的 pAgG-Pgpd-Tgpd线性化载体上，得到质粒pAgG-ap-htyE(质粒图谱见图4)。
表2PCR中涉及的引物及其序列
Figure BDA0002341075360000101
glgpd启动子序列(SEQ ID NO:14)
tgtcacttcgcgtctttgtctgttacacgatacagcaaactttaagaatgaacctttctggcggctcctaaatcaatgaaagacggact cggacccaatgaggccaacaacggaagttggtacgtttcagggccccaaagtatccttcgctccatgatatgaatgtctagatttagcgac tctctaaccaagaatatctacggtctgacctagtgcagaacaatgtattcgtgaaaggaaagattgaaacattctgcggcagcaataaggc agctagttctactaacgttaaactgaaagcgaagggatttgaaagttgatgaacagttgtaagtgacacagtaaatccttaagagcctaaga tatgatattgtggtttgaaagaagttatttttctatgtaagcacgtaaaacagcgaaagatcaaagactattgtggcattagatctttgttagaaa gaagtacattttgtttggcgaagagatgtgagcataaaagggtgaatgaaagatgtatgaatggttgtccggcagaatcagatgtggatttc tgctggtgaacccgtaagagaaagcctcacgtgtctcccgatcataaatccataacagttccaaaaaattcatgagcgcgagcgcgagc ggcaataaatcagcttttttcaagattgtcacgagttatgaagccatgcaggtttccgagttttcaacacattctgttgtataatcatcgatgcat agcacgtgatttctggctcgaaagcaaacaagattgggaggctttgggcagctctttatctggcgagaaatctgaatgagaatgcttctcgt gcgaaagaataacgctgttggcaattagagggcgaattcagccacctgcaatgacaataggagcttagcttcaagtcagataaaaggcg tggggcgttatcgagaataagaaaagcccgaagatttggccggctgccgttaaatatttgtcaagcaaaaggcagggaatgagtgttact catatggattgagggaataacactttgcaagaaggatgccatgcaatgagaaaagtctgaactacacgtggcggcgcaacgcaacgctc cgcagttaggaggaggtttagctgacagcgcagtctggagacaccgagaggaaatgttcctgttgacgatggagcttccattttgaatctt caaggggggttggtgttctggagtttgatattggtatggtcaggaccacgagaaacagattacctaggtaaagaataatagcttcgccgttc gaacgatagctcggttaaagaattacttccattctatccgaattatcgtggagtatctagttcctcatagcaccgtatctccccggcggctcg gagcgagtcgcctgctcttaaagtgtgacgtgatggtgactctgctcactctgctcactctgctcactcctccagcctcatcgactgcaggt ggtggtgagactgtattattgagagatttaaatctccgtcagcttttcctgatcatctggagcgaaaggaataaataaaaacttcgtaaagcg taacgggaacacgattgcgcaggggcgcgaccggatgcacgataagatgagtgaggaagccaattgaggactcatccactccacgtc gagaaaaatcatcatctagtctgtggtgtttccagctggttggttgccagacagccttgtcgcagtgattgcttgcttggtttcggtggtcgtg gtcgtggcttgcccctcttttccgtagcgtagcgcatcttcccatctcaacaacaccccaccacgagcacaaactctctcattttcgtctcgat tcttcttccttcgacatcgtacgaaacaaccaacctaagaaaaacaatcaacgaaacatgtatgtatatccttccccatctgttcactctgcca gtcgcccatcctctacatcgagaattcttgtcgctccttcgtcatcgcggggctaatcttcaccagaaaacaat
glgpd终止子序列(SEQ ID NO:15)：
ggtcttcaccactcatttctcacatttgtatcaatggtatcgctttctgattctcttttcccctggcagagaagtgctgaaaggtaaacttt aaaggggaatgaacaaggatagacatctttacatacaatgattgacggcacaccaatgcctttacgatagcatgaaaatagaagtcctcaa ttgagtgtatcatcctctcagattttcatacatgactctttgcaatttgcatgttcctcgtgctagacaagagcagtttcagtgccaaaaagatct ttcacccacttccttaaactgctttgttatgatgagaacacaggctgtccagtggcattccctttcggtctcctccatgttaatatgcaaatgtac ttcgtacgagatctacccttacccgctcctttgacaaacctacatgccctgtttttgccatactgctcttctcctactatgttctgcgatttcgcca tcgactcac
2、Gl-ap-htyE工程菌株的构建和发酵
将质粒pAgG-ap-htyE利用AMT导入G.lozoyensis菌株中，得到工程菌株Gl-ap-htyE。
为了确认Gl-ap-htyE菌株的PC0产量，将其接种于20mL种子培养基中， 25℃，220rpm，培养4d，按10％接种量接种到30mL发酵培养基中，25℃， 220rpm，培养10天。种子培养基和发酵培养基的配方同实施例1。
3、HPLC检测及结果分析
HPLC检测的方法同实施例1。
结果显示：当发酵培养基中不添加脯氨酸时，Gl-ap-htyE菌株产生的PC0/(PB0+PC0)为11％(图5)，当发酵培养基中添加2％脯氨酸时，Gl-ap-htyE 菌株不产生PC0(图6)。
实施例3其它脯氨酸羟化酶基因对PC0/(PB0+PC0)比例的影响
根据上述实施例的方法，在基因工程菌中过表达下表中其它脯氨酸羟化酶，也获得了高纯度的PB0，即降低了PC0/(PB0+PC0)的比例。
1、表3随机整合脯氨酸羟化酶基因，同时在发酵培养基中不添加脯氨酸时，PC0/(PB0+PC0)的比例如下所示：
菌株 蛋白 GenBank PC0/(PB0+PC0)
Aspergillus nidulans NRRL 8112 AniF AMM63174.1 12％
Aspergillus mulundensis AMOXY2 AKJ70940.1 11％
Aspergillus aculeatus AAOXY2 AXC33065.1 13％
Coleophoma cylindrospora CCOXY2 RDW69672.1 20％
Coleophoma empetri CEOXY2 BAN91495.1 13％
Coleophoma crateriformis CCROXY2 RDW80795.1 14％
Venustampulla echinocandica VEOXY2 RDL32346.1 15％
2、表4在丝状真菌Glarea lozoyensis的基因组上敲除gloF基因，并定点整合脯氨酸羟化酶基因，同时在发酵培养基中不添加脯氨酸时， PC0/(PB0+PC0)的比例如下所示：
Figure BDA0002341075360000121
Figure BDA0002341075360000131
3、另外，发明人还构建了向丝状真菌Glarea lozoyensis导入含上述表格中的异源脯氨酸羟化酶基因的质粒，同时异源脯氨酸羟化酶基因仅存在于质粒中，但即不随机整合也不定点整合到丝状真菌Glarea lozoyensis的基因组上的基因工程菌，同时在发酵培养基中不添加脯氨酸时， PC0/(PB0+PC0)的比例与1中随机整合脯氨酸羟化酶基因的效果相仿。
对比实施例1出发菌株G.lozoyensis ATCC74030发酵产物中PC0含量的检测
利用和实施例2中相同的发酵和实施例3的HPLC检测方法来进行检测。
结果显示：当发酵培养基中不添加脯氨酸时，菌株产生PC0/(PB0+PC0)为 33.5％(图7)，当发酵培养基中添加2％的脯氨酸时，菌株产生的PC0/(PB0+PC0) 为6％(图8)。
总结：由上可知，丝状真菌Glarea lozoyensis过表达异源脯氨酸羟化酶基因后产生的PC0/(PB0+PC0)与上述的对比实施例1中的出发菌株发酵过程中产生的PC0/(PB0+PC0)相比，有显著性的减少。本发明实施例2和实施例3 第1、3部分中，即丝状真菌Glarealozoyensis的基因组随机整合了异源脯氨酸羟化酶基因或该基因仅包括在游离的质粒上而存在于基因工程菌中的前提下，在不添加脯氨酸时，PC0/(PB0+PC0)的比例优于出发菌株；在添加2％脯氨酸时不产生PC0，也优于出发菌株。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海医药工业研究院
中国医药工业研究总院
<120> 生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用
<130> P19014506C
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ptrpc上游引物
<400> 1
acccaagctt gggaatcgat gatcaggcct cgac 34
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ptrpc下游引物
<400> 2
aatccatctt gttcaatcat ttggatgctt gggtagaata 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NeoR上游引物
<400> 3
tattctaccc aagcatccaa atgattgaac aagatggatt 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NeoR下游引物
<400> 4
gatcccggtc ggcatctact tcagaagaac tcgtcaagaa 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ttrpc上游引物
<400> 5
ttcttgacga gttcttctga agtagatgcc gaccgggatc 40
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ttrpc下游引物
<400> 6
ctggactagt ccttcgtccg gcgtagagga tcct 34
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pgpd上游引物
<400> 7
gttgtaaaac gacggccagt gtgtcacttc gcgtctttgt c 41
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pgpd下游引物
<400> 8
ccgtcgacag cgctactagt attgttttct ggtgaagatt agcc 44
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tgpd上游引物
<400> 9
actagtagcg ctgtcgacgg tcttcaccac tcatttctca 40
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tgpd下游引物
<400> 10
tcctctacgc cggacgaagg agtgagtcga tggcgaaatc g 41
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ap-htyE
<400> 11
aatcttcacc agaaaacaat atggctatca ctacgctaga 40
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ap-htyE下游引物
<400> 12
agaaatgagt ggtgaagacc gttacccata ggtcctcgtc a 41
<210> 13
<211> 990
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ap-htyE基因
<400> 13
atggctatca ctacgctaga ttttaaccaa ttccgcagca ccagcgcaga tgagcgccag 60
atattctgcg ctgatctctg cgagactctc tcagtctacg gtttcgcaaa gattcgcaac 120
acgacactgt cgaacgaact gatagacgaa atattcaaat acactcggtc cttcttcgcc 180
cttccgaacg acatcaaagc caaagccaag caccccaacg ccccgaatcc tcatcgcgga 240
tggagcgcca ttggccaaga gcgcgtgtgg aagatttctg gcttcgagca gaacaaagag 300
cgcaccgaca gctacaatga gttccgggaa tcttttgacc aaggcgccgc agacgaccag 360
ctctttccaa acagatgggt agacgaggat gacctcccgg gcttccaagc cttcatggaa 420
ggattctaca aatcgtgcga cgagctacac gcgcatctct tgcgcgccat ttcaacgggc 480
ctcaagctac ctgataccct attaccctcc aaacaccgcc acaacaccag cgaactccgt 540
ctgctgcact acccaccgat cccctgcagc gcactccgca gcaacatgcg catcggggag 600
cactccgact tcggcacact aacgctcctc ctccaagact ctgtcggggg gctccaagtc 660
gaggatcagc ggaatccaag aagctttatc cccgttgaac cggaggacgg gtatgaggtt 720
gtgattaata taggggattg tttgcagcgg tggacgaata ggcggctttg ttcggcgaat 780
catcgggtta tgttgccgga ggggaaggac gtggattcgg aggaagtgtt ggatgatcgg 840
tactcggttg cgtattttgg gaagccggat cgcgatgtcc ttgttgatac gctgccggag 900
tgtgttgagg tgggagagag ggtggagtat ggcgaccatt tgactgcgtt gcagtataat 960
cagattaagt tgacgaggac ctatgggtaa 990
<210> 14
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glgpd启动子序列
<400> 14
tgtcacttcg cgtctttgtc tgttacacga tacagcaaac tttaagaatg aacctttctg 60
gcggctccta aatcaatgaa agacggactc ggacccaatg aggccaacaa cggaagttgg 120
tacgtttcag ggccccaaag tatccttcgc tccatgatat gaatgtctag atttagcgac 180
tctctaacca agaatatcta cggtctgacc tagtgcagaa caatgtattc gtgaaaggaa 240
agattgaaac attctgcggc agcaataagg cagctagttc tactaacgtt aaactgaaag 300
cgaagggatt tgaaagttga tgaacagttg taagtgacac agtaaatcct taagagccta 360
agatatgata ttgtggtttg aaagaagtta tttttctatg taagcacgta aaacagcgaa 420
agatcaaaga ctattgtggc attagatctt tgttagaaag aagtacattt tgtttggcga 480
agagatgtga gcataaaagg gtgaatgaaa gatgtatgaa tggttgtccg gcagaatcag 540
atgtggattt ctgctggtga acccgtaaga gaaagcctca cgtgtctccc gatcataaat 600
ccataacagt tccaaaaaat tcatgagcgc gagcgcgagc ggcaataaat cagctttttt 660
caagattgtc acgagttatg aagccatgca ggtttccgag ttttcaacac attctgttgt 720
ataatcatcg atgcatagca cgtgatttct ggctcgaaag caaacaagat tgggaggctt 780
tgggcagctc tttatctggc gagaaatctg aatgagaatg cttctcgtgc gaaagaataa 840
cgctgttggc aattagaggg cgaattcagc cacctgcaat gacaatagga gcttagcttc 900
aagtcagata aaaggcgtgg ggcgttatcg agaataagaa aagcccgaag atttggccgg 960
ctgccgttaa atatttgtca agcaaaaggc agggaatgag tgttactcat atggattgag 1020
ggaataacac tttgcaagaa ggatgccatg caatgagaaa agtctgaact acacgtggcg 1080
gcgcaacgca acgctccgca gttaggagga ggtttagctg acagcgcagt ctggagacac 1140
cgagaggaaa tgttcctgtt gacgatggag cttccatttt gaatcttcaa ggggggttgg 1200
tgttctggag tttgatattg gtatggtcag gaccacgaga aacagattac ctaggtaaag 1260
aataatagct tcgccgttcg aacgatagct cggttaaaga attacttcca ttctatccga 1320
attatcgtgg agtatctagt tcctcatagc accgtatctc cccggcggct cggagcgagt 1380
cgcctgctct taaagtgtga cgtgatggtg actctgctca ctctgctcac tctgctcact 1440
cctccagcct catcgactgc aggtggtggt gagactgtat tattgagaga tttaaatctc 1500
cgtcagcttt tcctgatcat ctggagcgaa aggaataaat aaaaacttcg taaagcgtaa 1560
cgggaacacg attgcgcagg ggcgcgaccg gatgcacgat aagatgagtg aggaagccaa 1620
ttgaggactc atccactcca cgtcgagaaa aatcatcatc tagtctgtgg tgtttccagc 1680
tggttggttg ccagacagcc ttgtcgcagt gattgcttgc ttggtttcgg tggtcgtggt 1740
cgtggcttgc ccctcttttc cgtagcgtag cgcatcttcc catctcaaca acaccccacc 1800
acgagcacaa actctctcat tttcgtctcg attcttcttc cttcgacatc gtacgaaaca 1860
accaacctaa gaaaaacaat caacgaaaca tgtatgtata tccttcccca tctgttcact 1920
ctgccagtcg cccatcctct acatcgagaa ttcttgtcgc tccttcgtca tcgcggggct 1980
aatcttcacc agaaaacaat 2000
<210> 15
<211> 481
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glgpd终止子序列
<400> 15
ggtcttcacc actcatttct cacatttgta tcaatggtat cgctttctga ttctcttttc 60
ccctggcaga gaagtgctga aaggtaaact ttaaagggga atgaacaagg atagacatct 120
ttacatacaa tgattgacgg cacaccaatg cctttacgat agcatgaaaa tagaagtcct 180
caattgagtg tatcatcctc tcagattttc atacatgact ctttgcaatt tgcatgttcc 240
tcgtgctaga caagagcagt ttcagtgcca aaaagatctt tcacccactt ccttaaactg 300
ctttgttatg atgagaacac aggctgtcca gtggcattcc ctttcggtct cctccatgtt 360
aatatgcaaa tgtacttcgt acgagatcta cccttacccg ctcctttgac aaacctacat 420
gccctgtttt tgccatactg ctcttctcct actatgttct gcgatttcgc catcgactca 480
c 481
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA下游引物
<400> 16
gactagtcgg gggatcctct agatcttctg caggtcgact ctagag 46
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5S上游引物
<400> 17
gttgtaaaac gacggccagt gcttcatttg atcgatgttc c 41
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5S下游引物
<400> 18
ggtgtttcgt cctttcatac gacagtaggt attcgc 36
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> htyE上游引物
<400> 19
atggctatca ctacgctaga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> htyE下游引物
<400> 20
ttacccatag gtcctcgtca 20
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-gloF上游引物
<400> 21
ctttttttga attctctaga gagcggttgt cattattgcg ac 42
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-gloF下游引物
<400> 22
tctagcgtag tgatagccat ggtgttgata actctaattc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-gloF上游引物
<400> 23
tgacgaggac ctatgggtaa aaagttgaac caaaatgtat 40
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-gloF下游引物
<400> 24
gactagtcgg gggatcctct agcctaggac aggcccataa tt 42
<210> 25
<211> 559
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5s rRNA及其上游441bp基因序列
<400> 25
gcttcatttg atcgatgttc caacacaaat gacactcgcc tacgtattac aaccaactct 60
ctagcaacta actgccaaac actctatcga acttagtcga gcagtccgtc tgaagttgat 120
tcattaagag taacagactg ccttgaatct ctcaactcag catttaccaa gaaagcgttc 180
taaaatccgt accacacgcc gtcatttctg acataacttg aatcggcctc ccatcacgtg 240
acgcaccccg actcccttaa caaccgcaca agtcctcaca caccacaacc ccctcaacca 300
cacaaccacc cttcttccac caaaacacaa tttccctaca aactcatata gctgtgtttg 360
tgtttctctc atcacacccc cccgctcttt tttcagccct ccagcgtcaa ctatataaat 420
ctaaaaccac ccacctttgt cacatacgat catagactga tgagaattgg gcatcccgtc 480
cgctctgcca cacacaagca tcagatcggt agattagtag ttgggtgggt gaccaccagc 540
gaatacctac tgtcgtatg 559
<210> 26
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gloF的sgRNA序列
<400> 26
catcgtggtt ggagtgctgt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 103

Claims (12)

1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达异源脯氨酸羟化酶基因，其中所述基因工程菌的出发菌株为丝状真菌，所述异源脯氨酸羟化酶基因选自编码以下蛋白的基因中的一个或多个：Asperillus pachycristatus或皱褶曲霉（Aspergillus rugulosus）的HtyE、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）NRRL 8112的AniF、Aspergillus mulundensis的AMOXY2、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的AAOXY2、Coleophoma empetri的CCOXY2、Coleophoma crateriformis的CEOXY2、Coleophoma cylindrospora的CCROXY2和来自Venustampulla echinocandica的VEOXY2；编码所述Asperillus pachycristatus和皱褶曲霉（Aspergillus rugulosus）的HtyE的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；所述AniF的氨基酸序列如GenBank登录号AMM63174.1中的氨基酸序列所示，所述AMOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号AKJ70940.1中的氨基酸序列所示，所述AAOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号AXC33065.1中的氨基酸序列所示，所述CCOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号序列RDW69672.1中的氨基酸序列所示，所述CEOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号BAN91495.1中的氨基酸序列所示，所述CCROXY2的氨基酸序列如GenBank登录号RDW80795.1中的氨基酸序列所示，所述VEOXY2的氨基酸序列如GenBank登录号RDL32346.1中的氨基酸序列所示；所述丝状真菌为Glarea lozoyensis。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中，所述异源脯氨酸羟化酶基因构建于质粒中，或通过同源重组随机整合在所述丝状真菌的基因组上。
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述Asperillus pachycristatus或皱褶曲霉（Aspergillus rugulosus）的HtyE的氨基酸序列如GenBank登录号K0DZA0.1中的氨基酸序列所示。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的过表达为：将所述异源脯氨酸羟化酶基因转化入所述丝状真菌Glarea lozoyensis，并使其表达。
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株为丝状真菌Glarea lozoyensis ATCC 74030。
6.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述异源脯氨酸羟化酶基因在一基因表达盒中，其上游和下游分别具有启动子和终止子。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述启动子和终止子分别为glgpd启动子和glgpd终止子。
8.如权利要求6或7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因表达盒在一表达载体中，所述的表达载体的骨架为质粒pAgG。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤：
1）构建含有所述异源脯氨酸羟化酶基因的表达载体；
2）以所述丝状真菌为宿主菌，用步骤1）得到的表达载体进行转化，获得过表达异源脯氨酸羟化酶的基因工程菌。
10.如权利要求9所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述1）中，所述表达载体的构建方法为：
A、构建含gpd启动子片段、gpd终止子片段的基因表达盒的表达载体；
B、将所述异源htyE基因插入所述基因表达盒即得。
11.如权利要求9述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述的转化利用AMT技术。
12.如权利要求1-8中任一项所述的基因工程菌在制备纽莫康定B0上的用途。
CN201911376330.XA 2019-12-27 2019-12-27 生产纽莫康定b0的基因工程菌及其制备方法和应用 Active CN113046250B (zh)

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