CN112011468B

CN112011468B - 一种产反式乌头酸的重组土曲霉及其制备方法与应用

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Publication number: CN112011468B
Application number: CN202010866709.5A
Authority: CN
Inventors: 吕雪峰; 耿策; 黄雪年; 靳志刚; 曹海峰; 郭强; 李继彬
Original assignee: Shandong Lukang Shelile Pharmaceutical Co ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Shandong Lukang Shelile Pharmaceutical Co ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN112011468A

Abstract

一种产反式乌头酸的重组土曲霉及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提高生物法合成反式乌头酸的产量，本发明提供了一种产反式乌头酸的重组土曲霉，是以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌株，在出发菌株中敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因，并过表达乌头酸异构酶CICC00358而获得的。所述乌头酸异构酶CICC00358的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明在敲除CadA的基础上过表达CICC00358推动了顺乌头酸转化为反式乌头酸，从而获得更高的反式乌头酸产量，可用于反式乌头酸的生产。

Description

一种产反式乌头酸的重组土曲霉及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式乌头酸的重组土曲霉及其制备方法与应用。

背景技术

反式乌头酸(trans-Aconitic acid,CAS:4023-65-8)是一种不饱和三羧酸。因其含有不饱和双键和丰富的羟基，因此可以作为制备聚合材料的单体化合物，也可以作为其他化合物的合成前体，如三甲基反式乌头酸等。另外，反式乌头酸作为三羧酸循环关键中间体顺乌头酸(cis-Aconitic acid,CAS:585-84-2)的立体异构体，对三羧酸循环中的关键酶乌头酸酶具有一定的抑制作用，可以干扰三羧酸循环，从而影响生命活动，展现出一定的生物活性。

反式乌头酸主要是通过化学合成的方法生产，工艺复杂，副产物多，成本高，而且没有形成规模化生产。为了开发更加绿色、高效的反式乌头酸生产工艺，研究人员通过在土曲霉中阻断催化顺乌头酸脱羧生成衣康酸的顺乌头酸脱羧酶基因(cadA)，获得了一株能生产乌头酸的土曲霉工程菌株At-ΔcadA(图1中A)。根据生物合成途径及发酵结果分析，可推测敲除cadA积累的直接产物是顺乌头酸，而顺乌头酸作为三羧酸循环的中间体会很快被转化成异柠檬酸并进一步代谢。因此，第一时间将顺乌头酸转化为更稳定的反式乌头酸有利于实现更高的反式乌头酸产量。

发明内容

为了提高生物法合成反式乌头酸的产量，本发明提供了一种高产反式乌头酸的重组土曲霉，所述重组土曲霉以土曲霉（Aspergillus terreus）为出发菌株，是在出发菌株中突变顺乌头酸脱羧酶CadA基因，并过表达乌头酸异构酶CICC00358而获得的。

在本发明的一个实施例中，所述出发菌株为土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

本发明中所述CadA是指土曲霉中的顺乌头酸脱羧酶，本发明中不对该基因的序列做强制性的限定；在优选的实施方式中，所述cadA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；在其他的实施方式中，所述cadA还包括与所示序列具有高度同源性的氨基酸序列，优选的，所述高度同源性包括与目的序列的同源性至少99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%或60%的序列（即同源性60%以上）。

在本发明的一个实施例中，所述乌头酸异构酶CICC00358的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一个实施例中，编码所述乌头酸异构酶CICC00358的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了上述的重组土曲霉的构建方法，是以所述土曲霉为出发菌株，敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因并将所述乌头酸异构酶CICC00358的表达元件导入所述出发菌株中，构建重组土曲霉菌株。

在本发明的一个实施例中，所述乌头酸异构酶CICC00358的表达元件使用的启动子为PcadA启动子。

本发明还提供了上述重组土曲霉在生产反式乌头酸中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述应用是指将所述重组土曲霉经发酵培养后生产反式乌头酸，所述发酵条件为37 ℃，220 rpm发酵72h-168h。

在本发明的一个实施例中，所述发酵所用的培养基配方为：100 g L^-1葡萄糖，2 gL^-1 NH₄NO₃，0.2 g L^-1（NH₄）₂HPO₄，20 mg L^-1 FeSO₄，0.4 g L^-1 MgSO₄，40 mg L^-1 ZnSO₄，40mg L^-1 CuSO₄，余量为水。

有益效果

经生物信息学分析，土曲霉中CICC00358基因(ATEG_00358直系同源基因序列一致性 97%)编码的是一个prpF家族异构酶，预期具有催化乌头酸进行异构化的功能。如图1所示，本发明在敲除cadA的基础上过表达CICC00358推动了顺乌头酸转化为反式乌头酸，从而获得更高的反式乌头酸产量。

附图说明

图1.产反式乌头酸重组土曲霉菌株构建示意图；

图2.土曲霉乌头酸异构酶CICC00358生物信息学分析，系统发育树分析CICC00358(ATEG_00358直系同源基因序列一致性97％)与已证明从顺式到反式乌头酸异构酶功能的序列1Adi1(加粗)和序列5TbrA(加粗)更近分为一支；

图3.定点表达乌头酸异构酶CICC00358土曲霉菌株的构建策略示意图；

图4.构建的At-ΔcadA::CICC00358工程菌株的基因组PCR验证结果；1-5号转化子分别在1-5泳道，M为全式金公司1Kbp Ladder.1、2号转化子长度为阳性长度6kbp,为正确转化子；3-5号转化子都是阴性长度4.5kbp；

图5.重组At-ΔcadA::CICC00358菌株与出发菌株发酵产乌头酸的HPLC色谱对比图；实线为At-ΔcadA出发菌株，虚线为At-ΔcadA::CICC00358重组菌株；

图6.工程菌株摇瓶发酵产反式乌头酸及顺式乌头酸、反式乌头酸与顺式乌头酸产量比例比较分析结果；左侧黑色的为At-ΔcadA::CICC00358菌株，右侧灰色的为At-ΔcadA出发工程菌株；TAAtiter和CAAtiter是分别比较两个菌株的TAA产量和CAA产量(左Y轴)，TAA/CAA是比较TAAtiter和CAAtiter的比值(右Y轴)。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册（New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989）所记载，或按照厂商的建议条件。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini KitI试剂盒（D6943-02），DNA片段回收采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒（D6492-02），凝胶回收采用OMEGA公司GelExtraction Kit试剂盒（D2500-01）。

PDAS：3.9 g L^-1马铃薯右旋糖琼脂培养基（Difco^TMPotato Dextrose Agar, BD,LOT:1165825）和1.2 M山梨醇，灭菌后制备平板。

PDBS：2.4 g L^-1马铃薯右旋糖培养基（Difco^TMPotato Dextrose Broth, BD,LOT:9239568）、1.2 M山梨醇和0.5%琼脂糖，灭菌后制成顶层琼脂。

土曲霉产孢培养基：10 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1 NaNO₃，0.2 g L^-1 KH₂PO₄，5 g L^-1MgSO₄，0.02 g L^-1 FeSO₄，0.5 g L^-1 NaCl，0.04 g L^-1 ZnSO₄，0.04 g L^-1 CuSO₄，0.5%麸皮，1.5%琼脂粉，115 ℃灭菌25 min，制备平板。

有机酸发酵培养基IPM：100 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1 NH₄NO₃，0.2 g L^-1（NH₄）₂HPO₄，20mg L^-1 FeSO₄，0.4 g L^-1 MgSO₄，40 mg L^-1 ZnSO₄，40 mg L^-1 CuSO₄，用硫酸调整pH至3.5，115 ℃灭菌30 min。

土曲霉产孢斜面培养基：10 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1NaNO₃，0.2 g L^-1, KH₂PO₄，20mg L^-1FeSO₄，5 g L^-1 MgSO₄，0.5 g L^-1NaCl，40mg L^-1ZnSO₄，40 mg L^-1CuSO₄，0.5% 麸皮，1.5%琼脂，115 ℃灭菌15min，然后分装至试管，再115 ℃灭菌25 min，制备斜面。

土曲霉CICC40205 购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

土曲霉NRRL1960 购买自美国农业菌种保藏中心（ARS Culture Collection）。

土曲霉DSM23081购买自德国微生物菌种保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen )。

土曲霉TN484，记载在Yahiro, K., Takahama, T., Park, Y. S., Okabe, M.,Breeding of Aspergillus terreus Mutant Tn-484 for Itaconic Acid Productionwith High-Yield, Journal of Fermentation and Bioengineering,1995, 79(5): 506-508。

土曲霉 TN484-M1，记载在Dwiarti, L., Yamane, K., Yamatani, H., Kahar,P.,Okabe, M., Purification and characterization of cis-aconitic aciddecarboxylase from Aspergillus terreus TN484-M1, J Biosci Bioeng, 2002, 94(1): 29-33。

质粒pXH2-1，记载在：Huang X et al. Cloning, characterization andapplication of a native glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter forAspergillus terreus. J Ind Microbiol Biotechnol 2014, 41:585–592. 公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。质粒pXH-106：记载在：吕雪峰等，一种乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用，CN 201910649851.1 。

土曲霉（Aspergillus terreus）At-∆cadA，记载在吕雪峰等，一种乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用，CN 201910649851.1。

土曲霉At-∆ku80记载在吕雪峰等，一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，ZL201510275491.5，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。

实施例1、PrpF家族的蛋白CICC00358（ATEG_00358直系同源基因）生物信息分析。

通过HMMscanner对PrpF家族的蛋白及基因进行CICC40205菌株得全基因组挖掘得到两个具有潜在乌头酸异构酶活性的蛋白：CICC00358（GeneID: 4355110 的ATEG_00358直系同源基因）和CICC07328（GeneID: 4319292的ATEG_07328直系同源基因），系统发育树分析CICC00358（ATEG_00358 直系同源基因序列一致性97%）与已证明从顺式到反式乌头酸异构酶功能的序列1 Adi1（加粗）和序列5 TbrA（加粗）更近分为一支，而与从反式乌头酸到顺式乌头酸异构酶功能的序列4 prpF 不分在一支，由此可预测CICC00358（ATEG_00358直系同源基因）具有相似的顺式到反式乌头酸异构酶活性功能。

实施例2、高产反式乌头酸的重组土曲霉的构建。

本实施中所述重组土曲霉以土曲霉（Aspergillus terreus）为出发菌株，是在出发菌株中敲除顺乌头酸脱羧酶CadA的编码基因，并过表达乌头酸异构酶CICC00358而获得的。出发菌株为目前已知常用的土曲霉，如土曲霉CICC40205、土曲霉NRRL1960、土曲霉DSM23081、土曲霉TN484 、土曲霉TN484-M1或其他能够生产衣康酸的基因工程菌或者野生菌株等均可，本实施例中使用的出发菌株为土曲霉CICC40205，具体的构建方法为在敲除顺乌头酸脱羧酶cadA基因的土曲霉At-∆cadA中过表达乌头酸异构酶CICC00358获得的，下面描述构建方法如下：

一、敲除cadA过表达CICC_00358基因打靶元件的构建。

根据CICC土曲霉已测基因组信息和SEQ ID NO.3设计并合成如下引物：

U-cadA-F: 5’- gcgataaatgttgaacgaggc-3’；

U-cadA-R(00358) : 5’- atcgagtaggtctgtgacattggtcaatttaataggacaattttc -3’；

00358-F: 5’- atgtcacagacctactcgatcacccag-3’；

00358-R(Ttrpc) : 5’- cgttaagtggatccctataccatgactgtcaaattcca-3’；

Ttrpc-F: 5’- ggatccacttaacgttactg-3’；

Ttrpc-R: 5’- aagaaggttacctctaaacaag-3’；

pyrG/loxp-F(Ttrpc) : 5’- cttgtttagaggtaaccttctttaagggagatggtgattgaactag-3’；

pyrGAn-R(PgpdAtF743) : 5’- gcatcaaatcgtcgtaccgca-3’；

D-cadA-F(pyrGAn) : 5’- tgcggtacgacgatttgatgctaaatgggaagcgatatggaaac-3’；

D-cadA-R: 5’- cattgcagggaagtatatgcttc-3’；

C-cadA-F: 5’- tgtggttcctaccaaggtggc-3’；

C-cadA-R: 5’-cgactatagctggattgatcac-3’；

以土曲霉（Aspergillus terreus）At-∆ku80（记载在吕雪峰等，一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，ZL201510275491.5）基因组DNA为模板，采用pfuDNA聚合酶（Fermentas, 产品目录号: EP0501）进行PCR扩增，用引物U-cadA-F/U-cadA-R(00358)可以扩增获得大小约为1.2 kb的cadA基因的上游同源臂U-cadA，用引物D-cadA-F(pyrGAn)/D-cadA-R可以扩增获得大小为1.3 kb的cadA基因下游同源臂D-cadA。

以质粒pXH2-1为模板，用引物TtrpC-F和TtrpC-R进行终止子Ttrpc的PCR扩增，得到Ttrpc片段。

以质粒pXH-106为模板，用引物pyrG/loxp-F(TtrpC)和 pyrGAn-R(PgpdAtF743)进行PCR扩增黑曲霉pyrG _An基因表达元件作为筛选标记，即pyrG_An片段。

用引物00358-F和00358-R(Ttrpc)以土曲霉At-∆ku80为模板扩增获得CICC00358片段。

将所有PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-cadA片段、00358片段、TtrpC片段、pyrG_An片段和D-cadA片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C-cadA-F和C-cadA-R作为引物扩增获得大小约为6 kb的∆cadA::CICC00358基因打靶元件，可用于在cadA位点用PcadA启动子过表达CICC00358工作。

二、cadA位点异源表达CICC00358土曲霉工程菌株的构建

土曲霉At-∆ku80是针对土曲霉CICC40205进行ku80基因敲除的工程菌株，At-∆ku80-∆pyrG则是在At-∆ku80菌株基础上敲除了pyrG基因之后得到的尿嘧啶营养缺陷型工程菌株（记载在吕雪峰等，一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，ZL201510275491.5）。将工程菌株At-∆ku80-∆pyrG的孢子接种至50 mL IPM-FU（添加了1g L^-15-氟乳清酸和10 mM尿嘧啶核苷的IPM）液体培养基中，使孢子浓度约为10⁷个/mL，在200 rpm、32 ℃培养12-18 h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6 M MgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50 mL三角瓶中，根据菌丝重量加入适量酶解液（每1 g菌丝加入10 mL酶解液），在30 ℃、60 rpm处理1-3 h。将上述酶解后的混合液用300目尼龙布或擦镜纸过滤，收集滤液。在4 ℃、4000 rpm离心收集原生质体，用预冷1.0 M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC（STC组成：1.0 M 山梨醇，50 mM Tris-HCl（pH 8.0），50 mM CaCl₂）洗涤一次最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×10⁷个/mL，得到原生质体悬液。

向150 μL该原生质体悬液中加入10 μL步骤一制备的打靶元件∆cadA::CICC00358的DNA片段（约2 μg），再加入50 μL 冰浴的PSTC（PSTC组成：40％ PEG4000，1.2M山梨醇，50 mM Tris-HCl（pH8.0），50 mM CaCl₂），轻轻混匀，冰浴30 min。加入1 mL常温的PSTC，混匀后室温放置20 min。然后与30 mL的PDBS顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS平板上进行再生筛选培养，在30 ℃黑暗条件下培养5-7天。

从转化筛选平板上挑取生长状况良好的转化子转接至PDA平板上，在30 ℃培养5天进行传代纯化。将稳定传代转化子的孢子接种于IPM 液体培养基中，30 ℃、200 rpm培养48 h，收集菌丝提取基因组DNA，用引物U-cadA-F/D-cadA-R进行PCR验证，同时用At-∆ku80-∆pyrG菌株的基因组作为对照。阳性转化子能扩增出大小约为6.0 kb的条带，对照能扩增大小约为4.5 kb的条带。选取5个阳性转化子进行单孢分离纯化，每个转化子验证3个单孢，并再次用引物U-cadA-F/D-cadA-R进行基因组PCR验证，如图4所示，获得cadA位点整合了00358表达元件的纯种转化子，记为At-∆cadA::CICC00358。

实施例3、异源表达CICC00358土曲霉工程菌株的发酵产乌头酸的摇瓶分析。

分别选取3个At-∆cadA::CICC00358的阳性转化子株与对照菌株At-∆cadA分别接种至土曲霉产孢斜面培养基，32 ℃培养7天获得成熟的孢子。再分别将一支斜面上的孢子接种至一瓶有机酸发酵培养基中（500 mL三角瓶中装有55 mL培养基），接种量约为终浓度2x10⁵个孢子/mL，每个转化子设置3个摇瓶作为平行，37 ℃，220 rpm发酵72h、120h和168h。

取上清液经0.45 μm滤器过滤后进行适当稀释，用高效液相色谱分析方法（HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC）检测有机酸含量。色谱柱:Bio-rad AminexHPX-87H, 300 mm x 7.8 mm；流动相：5 mM硫酸；流速：0.5 mL/min；柱温：55 ℃；检查温度：35 ℃；紫外检测器（210 nm）。结果如图5和图6所示，在摇瓶发酵中期72h菌株At-∆cadA和At-∆cadA::CICC00358（即图中PcadA::CICC00358）的顺/反式乌头酸的色谱图差异明显：At-∆cadA::CICC00358转化子PcadA::CICC00358 的反式乌头酸产量（平均9.24g/L）和峰图远高于出发菌株At-∆cadA的转化子∆cad（平均3.28g/L），产量提高了约182%，而顺式乌头酸的产量（1.06g/L）和峰图却低于出发菌株At-∆cadA转化子∆cad（2.90g/L）；比较反式乌头酸/顺式乌头酸产量比例可以明显的发现在72h发酵中期At-∆cadA::CICC00358转化子PcadA::CICC00358（8.6：1）远大于出发菌株At-∆cadA转化子∆cad（1.1:1），以上证明引入CICC00358可以实现在发酵中期72h顺式乌头酸到反式乌头酸的转化，提高反式乌头酸的总产量，以及缩短发酵周期。

发酵108h, 重组菌株At-∆cadA::CICC00358转化子PcadA::CICC00358的反式乌头酸产量为10.77g/L ，出发菌株At-∆cadA的反式乌头酸产量为7.42g/L，反式乌头酸产量提高了45.1%；发酵168h，重组菌株At-∆cadA::CICC00358阳性转化子PcadA::CICC00358的反式乌头酸产量为14.81g/L，出发菌株At-∆cadA的反式乌头酸产量为11.87g/L，反式乌头酸产量提高了24.8%，相比较而言72h的反式乌头酸产量提高182%，发酵72h最高效的，因此从一定发酵周期内发酵产酸率来讲，72h为最佳的发酵时间。

本发明涉及的基因及氨基酸序列：

SEQ ID NO.1 顺乌头酸脱羧酶CadA

MTKQSADSNAKSGVTSEICHWASNLATDDIPSDVLERAKYLILDGIACAWVGARVPWSEKYVQATMSFEPPGACRVIGYGQKLGPVAAAMTNSAFIQATELDDYHSEAPLHSASIVLPAVFAASEVLAEQGKTISGIDVILAAIVGFESGPRIGKAIYGSDLLNNGWHCGAVYGAPAGALATGKLLGLTPDSMEDALGIACTQACGLMSAQYGGMVKRVQHGFAARNGLLGGLLAHGGYEAMKGVLERSYGGFLKMFTKGNGREPPYKEEEVVAGLGSFWHTFTIRIKLYACCGLVHGPVEAIENLQGRYPELLNRANLSNIRHVHVQLSTASNSHCGWIPEERPISSIAGQMSVAYILAVQLVDQQCLLSQFSEFDDNLERPEVWDLARKVTSSQSEEFDQDGNCLSAGRVRIEFNDGSSITESVEKPLGVKEPMPNERILHKYRTLAGSVTDESRVKEIEDLVLGLDRLTDISPLLELLNCPVKSPLV

SEQ ID NO.2

序列特征：

长度： 416 aa

分子类型：氨基酸序列

最初来源：土曲霉（Aspergillus terreus）

特异性名称：乌头酸异构酶CICC00358

MSQTYSITQTESIPVVQTIQWAQKASVRKSIPAVWMRAGTSKGLFIHRHHLPPSPADWEPILLSAMGSTKEGSRQINGVGGASSTTSKVAVVERSRRPGVDVEYTFVQVAPDQPRIDMTGNCGNIASGIGPFALDEGLVRAPEGRKEIDIRIYNTNTKQHLVETVQVAADGSFREDGEYAIPGVDGTASPVRVAFLNPGGSMTGCMFPSGLRQEMLAVVSRGYGAFDVRVSLVDAANPFVLVDAASLPVKSISALAESADPGFLALIEDIRRHGAVRFGLAADVQAASQVRGTPKIALLSPPTGDAEDVDIEVRAFTMGKPHASLQLTGAVCLGAATVIHGTIAWDLAHVKKGDCMPKHGMSIGNHQVASPLAVGIRHPAGVIHAETILRMDLTGEVDVDRVAVFRTARRLFEVMV

SEQ ID NO.3

序列特征：

长度： 1386 bp

分子类型：DNA序列

最初来源：土曲霉（Aspergillus terreus）

特异性名称：乌头酸异构酶CICC00358基因

ATGTCACAGACCTACTCGATCACCCAGACCGAATCCATCCCCGTCGTCCAGACAATCCAATGGGCCCAAAAAGCATCAGTGCGCAAGTCCATCCCAGCGGTATGGATGCGCGCCGGTACCTCCAAGGGCCTCTTCATCCACCGACACCATCTCCCGCCCTCACCCGCGGACTGGGAGCCAATCTTACTGTCTGCTATGGGCTCCACGAAGGAAGGCTCTCGGCAGATCAACGGGGTCGGCGGTGCATCTTCGACAACGTCCAAGGTGGCTGTCGTGGAACGGTCCAGGCGCCCAGGCGTCGACGTCGAGTATACCTTTGTGCAGGTCGCGCCAGACCAGCCGCGGATCGATATGACAGGGAACTGTGGGAACATTGCCTCGGGGATTGGGCCGTTCGCGCTTGATGAGGGCCTTGTGCGTGCGCCGGAGGGGAGGAAGGAGGTCCGTTCATCTGTTTTCCTTTCGAGGTGAGACGACGCTGATTGTTCCAGATTGATATCAGAATCTACAATACCAACACAAAACAGCATCTTGTCGAAACGGTGCAAGTTGCAGCGGACGGTTCGTTCCGCGAGGACGGCGAGTATGCCATCCCAGGCGTGGACGGCACGGCCAGTCCAGTCAGAGTTGCCTTCCTCAACCCCGGCGGCAGCATGACGGGGTGCATGTTTCCCAGCGGATTGCGCCAGGAGATGCTGGCGGTGGTGTCTCGGGGGTATGGAGCGTTTGACGTGCGTGTCAGTCTCGTTGACGCGGCGAACCCATTTGTGTTGGTCGACGCGGCATCTTTACCCGTGAAGAGTATCTCTGCCCTGGCAGAGTCTGCCGATCCAGGCTTCCTGGCGCTAATCGAGGACATCCGGAGGCATGGCGCGGTGCGATTTGGACTTGCGGCGGATGTGCAGGCTGCCAGCCAGGTCCGCGGGACCCCGAAAATTGCGCTCTTATCGCCCCCGACGGGTGATGCAGAGGACGTCGACATCGAAGTGCGCGCCTTCACCATGGGGAAGCCGCATGCGAGTCTGCAGCTGACGGGCGCGGTGTGTCTCGGGGCAGCTACCGTCATCCACGGCACCATTGCCTGGGATCTGGCCCATGTGAAGAAAGGCGATTGCATGCCAAAGCATGGCATGTCGATTGGAAACCACCAGGTTGCCAGCCCGCTGGCTGTGGGTATACGCCATCCAGCTGGCGTCATCCATGCCGAGACAATTCTGAGAATGGACTTGACGGGCGAGGTTGATGTTGACCGGGTGGCAGTGTTTCGGACGGCACGACGGCTGTTTGAGGGTAATGTATATTATAGAGCATGAGAGGAAACAACATAGAGAGGCATGGAGGTGCTAACGGCGCAACATTTAATGGAATTTGACAGTCATGGTATAG

SEQ ID NO.4编码顺乌头酸脱羧酶CadA的基因

ATGACCAAACAATCTGCGGACAGCAACGCAAAGTCAGGAGTTACGTCCGAAATATGTCATTGGGCATCCAACCTGGCCACTGACGACATCCCTTCGGACGTATTAGAAAGAGCAAAATACCTTATTCTCGACGGTATTGCATGTGCCTGGGTTGGTGCAAGAGTGCCTTGGTCAGAGAAGTATGTTCAGGCAACGATGAGCTTTGAGCCGCCGGGGGCCTGCAGGGTGATTGGATATGGACAGGTAAATTTTATTCACTCTAGACGGTCCACAAAGTATACTGACGATCCTTCGTATAGAAACTGGGGCCTGTTGCAGCAGCCATGACCAATTCCGCTTTCATACAGGCTACGGAGCTTGACGACTACCACAGCGAAGCCCCCCTACACTCTGCAAGCATTGTCCTTCCTGCGGTCTTTGCAGCAAGTGAGGTCTTAGCCGAGCAGGGCAAAACAATTTCCGGTATAGATGTTATTCTAGCCGCCATTGTGGGGTTTGAATCTGGCCCACGGATCGGCAAAGCAATCTACGGATCGGACCTCTTGAACAACGGCTGGCATTGTGGAGCTGTGTATGGCGCTCCAGCCGGTGCGCTGGCCACAGGAAAGCTCCTCGGTCTAACTCCAGACTCCATGGAAGATGCTCTCGGAATTGCGTGCACGCAAGCCTGTGGTTTAATGTCGGCGCAATACGGAGGCATGGTAAAGCGTGTGCAACACGGATTCGCAGCGCGTAATGGTCTTCTTGGGGGACTGTTGGCCCATGGTGGGTACGAGGCAATGAAAGGTGTCCTGGAGAGATCTTACGGCGGTTTCCTCAAGATGTTCACCAAGGGCAACGGCAGAGAGCCTCCCTACAAAGAGGAGGAAGTGGTGGCTGGTCTCGGTTCATTCTGGCATACCTTTACTATTCGCATCAAGCTCTATGCCTGCTGCGGACTTGTCCATGGTCCAGTCGAGGCTATCGAAAACCTTCAGGGGAGATACCCCGAGCTCTTGAATAGAGCCAACCTCAGCAACATTCGCCATGTTCATGTACAGCTTTCAACGGCCTCGAACAGTCACTGTGGATGGATACCAGAGGAGAGACCCATCAGTTCAATCGCAGGGCAGATGAGTGTCGCATACATTCTCGCCGTCCAGCTGGTCGACCAGCAATGTCTTTTGTCCCAGTTTTCTGAGTTTGATGACAACCTGGAGAGGCCAGAAGTTTGGGATCTGGCCAGGAAGGTTACTTCATCTCAAAGCGAAGAGTTTGATCAAGACGGCAACTGTCTCAGTGCGGGTCGCGTGAGGATTGAGTTCAACGATGGTTCTTCTATTACGGAAAGTGTCGAGAAGCCTCTTGGTGTCAAAGAGCCCATGCCAAACGAACGGATTCTCCACAAATACCGAACCCTTGCTGGTAGCGTGACGGACGAATCCCGGGTGAAAGAGATTGAGGATCTTGTCCTCGGCCTGGACAGGCTCACCGACATTAGCCCATTGCTGGAGCTGCTGAATTGCCCCGTGAAATCGCCACTGGTATAA

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所山东鲁抗舍里乐药业有限公司

<120> 一种高产反式乌头酸的重组土曲霉及其制备方法与应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 490

<212> PRT

<213> 顺乌头酸脱羧酶CadA

<400> 1

Met Thr Lys Gln Ser Ala Asp Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ile Cys His Trp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Asp Asp Ile Pro Ser

20 25 30

Asp Val Leu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Asp Gly Ile Ala Cys

35 40 45

Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Lys Tyr Val Gln Ala

50 55 60

Thr Met Ser Phe Glu Pro Pro Gly Ala Cys Arg Val Ile Gly Tyr Gly

65 70 75 80

Gln Lys Leu Gly Pro Val Ala Ala Ala Met Thr Asn Ser Ala Phe Ile

85 90 95

Gln Ala Thr Glu Leu Asp Asp Tyr His Ser Glu Ala Pro Leu His Ser

100 105 110

Ala Ser Ile Val Leu Pro Ala Val Phe Ala Ala Ser Glu Val Leu Ala

115 120 125

Glu Gln Gly Lys Thr Ile Ser Gly Ile Asp Val Ile Leu Ala Ala Ile

130 135 140

Val Gly Phe Glu Ser Gly Pro Arg Ile Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Ser

145 150 155 160

Asp Leu Leu Asn Asn Gly Trp His Cys Gly Ala Val Tyr Gly Ala Pro

165 170 175

Ala Gly Ala Leu Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Leu Thr Pro Asp Ser

180 185 190

Met Glu Asp Ala Leu Gly Ile Ala Cys Thr Gln Ala Cys Gly Leu Met

195 200 205

Ser Ala Gln Tyr Gly Gly Met Val Lys Arg Val Gln His Gly Phe Ala

210 215 220

Ala Arg Asn Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala His Gly Gly Tyr Glu

225 230 235 240

Ala Met Lys Gly Val Leu Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Lys Met

245 250 255

Phe Thr Lys Gly Asn Gly Arg Glu Pro Pro Tyr Lys Glu Glu Glu Val

260 265 270

Val Ala Gly Leu Gly Ser Phe Trp His Thr Phe Thr Ile Arg Ile Lys

275 280 285

Leu Tyr Ala Cys Cys Gly Leu Val His Gly Pro Val Glu Ala Ile Glu

290 295 300

Asn Leu Gln Gly Arg Tyr Pro Glu Leu Leu Asn Arg Ala Asn Leu Ser

305 310 315 320

Asn Ile Arg His Val His Val Gln Leu Ser Thr Ala Ser Asn Ser His

325 330 335

Cys Gly Trp Ile Pro Glu Glu Arg Pro Ile Ser Ser Ile Ala Gly Gln

340 345 350

Met Ser Val Ala Tyr Ile Leu Ala Val Gln Leu Val Asp Gln Gln Cys

355 360 365

Leu Leu Ser Gln Phe Ser Glu Phe Asp Asp Asn Leu Glu Arg Pro Glu

370 375 380

Val Trp Asp Leu Ala Arg Lys Val Thr Ser Ser Gln Ser Glu Glu Phe

385 390 395 400

Asp Gln Asp Gly Asn Cys Leu Ser Ala Gly Arg Val Arg Ile Glu Phe

405 410 415

Asn Asp Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ser Val Glu Lys Pro Leu Gly Val

420 425 430

Lys Glu Pro Met Pro Asn Glu Arg Ile Leu His Lys Tyr Arg Thr Leu

435 440 445

Ala Gly Ser Val Thr Asp Glu Ser Arg Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu

450 455 460

Val Leu Gly Leu Asp Arg Leu Thr Asp Ile Ser Pro Leu Leu Glu Leu

465 470 475 480

Leu Asn Cys Pro Val Lys Ser Pro Leu Val

485 490

<210> 2

<211> 416

<212> PRT

<213> 乌头酸异构酶CICC00358

<400> 2

Met Ser Gln Thr Tyr Ser Ile Thr Gln Thr Glu Ser Ile Pro Val Val

1 5 10 15

Gln Thr Ile Gln Trp Ala Gln Lys Ala Ser Val Arg Lys Ser Ile Pro

20 25 30

Ala Val Trp Met Arg Ala Gly Thr Ser Lys Gly Leu Phe Ile His Arg

35 40 45

His His Leu Pro Pro Ser Pro Ala Asp Trp Glu Pro Ile Leu Leu Ser

50 55 60

Ala Met Gly Ser Thr Lys Glu Gly Ser Arg Gln Ile Asn Gly Val Gly

65 70 75 80

Gly Ala Ser Ser Thr Thr Ser Lys Val Ala Val Val Glu Arg Ser Arg

85 90 95

Arg Pro Gly Val Asp Val Glu Tyr Thr Phe Val Gln Val Ala Pro Asp

100 105 110

Gln Pro Arg Ile Asp Met Thr Gly Asn Cys Gly Asn Ile Ala Ser Gly

115 120 125

Ile Gly Pro Phe Ala Leu Asp Glu Gly Leu Val Arg Ala Pro Glu Gly

130 135 140

Arg Lys Glu Ile Asp Ile Arg Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Lys Gln His

145 150 155 160

Leu Val Glu Thr Val Gln Val Ala Ala Asp Gly Ser Phe Arg Glu Asp

165 170 175

Gly Glu Tyr Ala Ile Pro Gly Val Asp Gly Thr Ala Ser Pro Val Arg

180 185 190

Val Ala Phe Leu Asn Pro Gly Gly Ser Met Thr Gly Cys Met Phe Pro

195 200 205

Ser Gly Leu Arg Gln Glu Met Leu Ala Val Val Ser Arg Gly Tyr Gly

210 215 220

Ala Phe Asp Val Arg Val Ser Leu Val Asp Ala Ala Asn Pro Phe Val

225 230 235 240

Leu Val Asp Ala Ala Ser Leu Pro Val Lys Ser Ile Ser Ala Leu Ala

245 250 255

Glu Ser Ala Asp Pro Gly Phe Leu Ala Leu Ile Glu Asp Ile Arg Arg

260 265 270

His Gly Ala Val Arg Phe Gly Leu Ala Ala Asp Val Gln Ala Ala Ser

275 280 285

Gln Val Arg Gly Thr Pro Lys Ile Ala Leu Leu Ser Pro Pro Thr Gly

290 295 300

Asp Ala Glu Asp Val Asp Ile Glu Val Arg Ala Phe Thr Met Gly Lys

305 310 315 320

Pro His Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gly Ala Val Cys Leu Gly Ala Ala

325 330 335

Thr Val Ile His Gly Thr Ile Ala Trp Asp Leu Ala His Val Lys Lys

340 345 350

Gly Asp Cys Met Pro Lys His Gly Met Ser Ile Gly Asn His Gln Val

355 360 365

Ala Ser Pro Leu Ala Val Gly Ile Arg His Pro Ala Gly Val Ile His

370 375 380

Ala Glu Thr Ile Leu Arg Met Asp Leu Thr Gly Glu Val Asp Val Asp

385 390 395 400

Arg Val Ala Val Phe Arg Thr Ala Arg Arg Leu Phe Glu Val Met Val

405 410 415

<210> 3

<211> 1386

<212> DNA

<213> 乌头酸异构酶CICC00358基因

<400> 3

atgtcacaga cctactcgat cacccagacc gaatccatcc ccgtcgtcca gacaatccaa 60

tgggcccaaa aagcatcagt gcgcaagtcc atcccagcgg tatggatgcg cgccggtacc 120

tccaagggcc tcttcatcca ccgacaccat ctcccgccct cacccgcgga ctgggagcca 180

atcttactgt ctgctatggg ctccacgaag gaaggctctc ggcagatcaa cggggtcggc 240

ggtgcatctt cgacaacgtc caaggtggct gtcgtggaac ggtccaggcg cccaggcgtc 300

gacgtcgagt atacctttgt gcaggtcgcg ccagaccagc cgcggatcga tatgacaggg 360

aactgtggga acattgcctc ggggattggg ccgttcgcgc ttgatgaggg ccttgtgcgt 420

gcgccggagg ggaggaagga ggtccgttca tctgttttcc tttcgaggtg agacgacgct 480

gattgttcca gattgatatc agaatctaca ataccaacac aaaacagcat cttgtcgaaa 540

cggtgcaagt tgcagcggac ggttcgttcc gcgaggacgg cgagtatgcc atcccaggcg 600

tggacggcac ggccagtcca gtcagagttg ccttcctcaa ccccggcggc agcatgacgg 660

ggtgcatgtt tcccagcgga ttgcgccagg agatgctggc ggtggtgtct cgggggtatg 720

gagcgtttga cgtgcgtgtc agtctcgttg acgcggcgaa cccatttgtg ttggtcgacg 780

cggcatcttt acccgtgaag agtatctctg ccctggcaga gtctgccgat ccaggcttcc 840

tggcgctaat cgaggacatc cggaggcatg gcgcggtgcg atttggactt gcggcggatg 900

tgcaggctgc cagccaggtc cgcgggaccc cgaaaattgc gctcttatcg cccccgacgg 960

gtgatgcaga ggacgtcgac atcgaagtgc gcgccttcac catggggaag ccgcatgcga 1020

gtctgcagct gacgggcgcg gtgtgtctcg gggcagctac cgtcatccac ggcaccattg 1080

cctgggatct ggcccatgtg aagaaaggcg attgcatgcc aaagcatggc atgtcgattg 1140

gaaaccacca ggttgccagc ccgctggctg tgggtatacg ccatccagct ggcgtcatcc 1200

atgccgagac aattctgaga atggacttga cgggcgaggt tgatgttgac cgggtggcag 1260

tgtttcggac ggcacgacgg ctgtttgagg gtaatgtata ttatagagca tgagaggaaa 1320

caacatagag aggcatggag gtgctaacgg cgcaacattt aatggaattt gacagtcatg 1380

gtatag 1386

<210> 4

<211> 1529

<212> DNA

<213> 编码顺乌头酸脱羧酶CadA的基因

<400> 4

atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat 60

tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac 120

cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag 180

tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga 240

caggtaaatt ttattcactc tagacggtcc acaaagtata ctgacgatcc ttcgtataga 300

aactggggcc tgttgcagca gccatgacca attccgcttt catacaggct acggagcttg 360

acgactacca cagcgaagcc cccctacact ctgcaagcat tgtccttcct gcggtctttg 420

cagcaagtga ggtcttagcc gagcagggca aaacaatttc cggtatagat gttattctag 480

ccgccattgt ggggtttgaa tctggcccac ggatcggcaa agcaatctac ggatcggacc 540

tcttgaacaa cggctggcat tgtggagctg tgtatggcgc tccagccggt gcgctggcca 600

caggaaagct cctcggtcta actccagact ccatggaaga tgctctcgga attgcgtgca 660

cgcaagcctg tggtttaatg tcggcgcaat acggaggcat ggtaaagcgt gtgcaacacg 720

gattcgcagc gcgtaatggt cttcttgggg gactgttggc ccatggtggg tacgaggcaa 780

tgaaaggtgt cctggagaga tcttacggcg gtttcctcaa gatgttcacc aagggcaacg 840

gcagagagcc tccctacaaa gaggaggaag tggtggctgg tctcggttca ttctggcata 900

cctttactat tcgcatcaag ctctatgcct gctgcggact tgtccatggt ccagtcgagg 960

ctatcgaaaa ccttcagggg agataccccg agctcttgaa tagagccaac ctcagcaaca 1020

ttcgccatgt tcatgtacag ctttcaacgg cctcgaacag tcactgtgga tggataccag 1080

aggagagacc catcagttca atcgcagggc agatgagtgt cgcatacatt ctcgccgtcc 1140

agctggtcga ccagcaatgt cttttgtccc agttttctga gtttgatgac aacctggaga 1200

ggccagaagt ttgggatctg gccaggaagg ttacttcatc tcaaagcgaa gagtttgatc 1260

aagacggcaa ctgtctcagt gcgggtcgcg tgaggattga gttcaacgat ggttcttcta 1320

ttacggaaag tgtcgagaag cctcttggtg tcaaagagcc catgccaaac gaacggattc 1380

tccacaaata ccgaaccctt gctggtagcg tgacggacga atcccgggtg aaagagattg 1440

aggatcttgt cctcggcctg gacaggctca ccgacattag cccattgctg gagctgctga 1500

attgccccgt gaaatcgcca ctggtataa 1529

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> U-cadA-F

<400> 5

gcgataaatg ttgaacgagg c 21

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> U-cadA-R(00358)

<400> 6

atcgagtagg tctgtgacat tggtcaattt aataggacaa ttttc 45

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 00358-F

<400> 7

atgtcacaga cctactcgat cacccag 27

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 00358-R(Ttrpc)

<400> 8

cgttaagtgg atccctatac catgactgtc aaattcca 38

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Ttrpc-F

<400> 9

ggatccactt aacgttactg 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Ttrpc-R

<400> 10

aagaaggtta cctctaaaca ag 22

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> pyrG/loxp-F(Ttrpc)

<400> 11

cttgtttaga ggtaaccttc tttaagggag atggtgattg aactag 46

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> pyrGAn-R(PgpdAtF743)

<400> 12

gcatcaaatc gtcgtaccgc a 21

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> D-cadA-F(pyrGAn)

<400> 13

tgcggtacga cgatttgatg ctaaatggga agcgatatgg aaac 44

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> D-cadA-R

<400> 14

cattgcaggg aagtatatgc ttc 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> C-cadA-F

<400> 15

tgtggttcct accaaggtgg c 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> C-cadA-R

<400> 16

cgactatagc tggattgatc ac 22

Claims

1.一种产反式乌头酸的重组土曲霉，其特征在于，所述重组土曲霉是以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌株，在出发菌株中敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因，并过表达乌头酸异构酶CICC00358而获得的；所述乌头酸异构酶CICC00358的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码所述乌头酸异构酶CICC00358的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述乌头酸异构酶CICC00358的表达元件使用的启动子为PcadA启动子。

2.根据权利要求1所述的重组土曲霉，其特征在于，所述出发菌株为土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

3.根据权利要求1所述的重组土曲霉，其特征在于，所述顺乌头酸脱羧酶CadA，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.权利要求1-3任意一项所述的重组土曲霉的构建方法，其特征在于，是以所述土曲霉为出发菌株，敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因并将所述乌头酸异构酶CICC00358的表达元件导入所述出发菌株中，构建重组土曲霉菌株。

5.权利要求1-3任意一项所述的重组土曲霉在生产反式乌头酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是指将所述重组土曲霉经发酵培养后生产反式乌头酸，所述发酵条件为37℃，220 rpm发酵72h-168 h。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵所用的培养基配方为：100 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1 NH₄NO₃，0.2 g L^-1 (NH₄)₂HPO₄，20 mg L^-1 FeSO₄，0.4 g L^-1 MgSO₄，40 mgL^-1 ZnSO₄，40 mg L^-1 CuSO₄，余量为水。