CN112011470B - 一种产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程领域。化学合成反式乌头酸存在副产物多，工艺复杂等缺点，为了克服反式乌头酸的生产缺陷，本发明构建一种产反式乌头酸的基因工程菌，是将At‑∆cadA土曲霉中的细胞色素P450单加氧酶基因CICC_3028g进行基因突变得到重组土曲霉菌，利用重组土曲霉菌株发酵生产反式乌头酸的含量比At‑∆cadA土曲霉生产的反式乌头酸含量显著提高。

Description

一种产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
乌头酸（丙烯-1，2，3-三羧酸，1,2,3-Propenetricarboxylic acid）因从乌头属植物中提取而得名，是一种不饱和三羧酸。因其含有不饱和双键和丰富的羟基，因此可以作制备聚合材料的单体化合物，也可以作为其他化合物的合成前体，如三甲基反式乌头酸等。乌头酸有顺、反式两种构型，其中，顺乌头酸(CAS:585-84-2)是三羧酸循环中乌头酸酶催化柠檬酸异构化生成异柠檬酸的中间产物。顺乌头酸可被顺乌头酸脱羧酶CadA催化降解生成衣康酸。乌头酸酶作为三羧酸循环中的关键酶，抑制乌头酸酶活性可以干扰三羧酸循环，从而影响生命活动。
反式乌头酸（trans-Aconitic acid，CAS：4023-65-8）为顺式乌头酸的立体异构体，可以作为竞争性抑制剂干扰乌头酸酶活性，从而产生特殊的生理功能。反式乌头酸还有诸多生物活性，有研究表明反式乌头酸具有显著的抗水肿作用；可以抑制利什曼原虫的生长，从而作为治疗黑热病的药物；具有抑制褐飞虱取食的活性；在线虫防治等方面具有较好的效果，在生物农药开发方面很好的潜力。目前，反式乌头酸主要是通过化学合成的方法生产，工艺复杂，副产物多，成本高，而且没有形成规模化生产，反式乌头酸的有效供应将促进下游应用和产品开发的主要因素。
发明内容
为了可以生产反式乌头酸，本发明提供了一种基因工程菌株，是以无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉菌株（Aspergillus terreus）为出发菌株，将出发菌株中细胞色素P450单加氧酶或者细胞色素P450单加氧酶直系同源基因进行突变所得到的。
进一步地限定，所述的出发菌株为将顺乌头酸脱羧酶CadA进行基因缺失突变而获得的土曲霉，或为不存在编码顺乌头酸脱羧酶CadA的基因的土曲霉。
进一步地限定，所述的顺式乌头酸脱羧酶CadA在NCBI的登录号是 GenBank：EAU29420.1。
进一步地限定，构建所述出发菌株的宿主菌为土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。
本发明还提供了细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码细胞胞色素P450单加氧酶基因是CICC_3028g，其序列如SEQID NO.2所示。
本发明还提供了一种所述的基因工程菌株的构建方法，所述的构建方法是将无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉中的细胞色素P450单加氧酶基因进行突变，构建重组土曲霉。
进一步地限定，所述的构建方法具体步骤包括：
1) 细胞色素P450单加氧酶基因打靶元件构建：以土曲霉CICC40205的基因组为模板，PCR扩增获得细胞色素P450单加氧酶基因CICC_3028g基因的上游同源臂片段与下游同源臂片段，作为打靶元件；
2) 将步骤1）中得到的CICC_3028g打靶元件导入无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉，筛选后获得产反式乌头酸的基因工程菌株。
进一步地限定，在所述的构建方法中，步骤1）中扩增CICC_3028g基因的上游同源臂片段的引物为U-3028g-F ：-5’-CGACGGCCAGTGAATTCGAGctggtgggatatgctgggtttagtct-3’（序列如SEQ ID NO.3所示）和U-3028g-R：5’-ctttacgcttgcgatcccgaagtcttcggaagacggcca-3’（序列如SEQ ID NO.4所示）；扩增CICC_3028g基因的下游同源臂片段的引物为D-3028g-F：5’-gaggtaaccttctttccgatatcatcgaagactgct-3’（序列如SEQ ID NO.5所示）和D-3028g-R ：5’-agatgtgcggcagatcagatccatcg-3’（序列如SEQ ID NO.6所示）。
本发明还提供了一种产反式乌头酸的基因工程菌株在生产反式乌头酸中的应用。
有益效果：本发明以无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉菌株作为出发菌株，通过遗传改造消除乌头酸的降解途径从而实现反式乌头酸合成的加强及积累，相较于传统的物理、化学等诱变方式，本发明方法目的明确，可操作性强，便于筛选。经实验证明，本发明提供重组菌株的反式乌头酸发酵产量高于出发菌株，其中产量最高的菌株在摇瓶水平上显示平均提高了13%，具有很强的应用价值。
附图说明
图1. 敲除 CICC_3028g的打靶元件构建策略示意图；
图2.构建的∆cadA∆CICC_3028g 工程菌株的基因组PCR验证结果图，其中CK是KO打靶元件，1是1号转化子，2是2号转化子，3是3号转化子，M是Marker，4是4号转化子；
图3.重组菌株∆cadA∆CICC_3028g 与出发菌株∆cadA的发酵液中反式乌头酸产量及HPLC峰图，其中A是峰形图，B是反式乌头酸产量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini KitI试剂盒（D6943-02），DNA片段回收采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒（D6492-02），凝胶回收采用OMEGA公司GelExtraction Kit试剂盒（D2500-01）。
IPM液体培养基：60g L-1葡萄糖，2 g L-1 NH4NO3，20 mg L-1 (NH4)2HPO4，20 mg L-1FeSO4，0.4 g L-1 MgSO4，4.4 mg L-1 ZnSO4，0.5g/L 玉米浆，pH 3.5。
再生筛选培养基平板PDA-SH：3.9g L-1马铃薯右旋糖琼脂培养基（DifcoTM PotatoDextrose Agar, BD,LOT:1165825），和1.2M山梨醇，灭菌后冷却至约55°C时加入潮霉素B（Solarbio，CatalogNo.：M419099）至终浓度为100μg/mL，制备平板。
土曲霉产孢培养基：10 gL-1葡萄糖，2 gL-1 NaNO3，0.2 gL-1 KH2PO4， 5gL-1MgSO4，0.02 mg L-1FeSO4，0.5gL-1NaCl，0.04gL-1ZnSO4，0.04gL-1CuSO4，0.5%麸皮，1.5%琼脂粉，115℃灭菌25min，制备平板。
有机酸发酵培养基IPM：100g L-1葡萄糖，2 g L-1 NH4NO3，0.2 g L-1（NH4）2HPO4，20mg L-1 FeSO4，0.4 g L-1 MgSO4，40 mg L-1 ZnSO4，40 mg L-1 CuSO4，用硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌30min。
本发明所用的出发菌株土曲霉∆cadA是一株产乌头酸菌株，是无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉菌株，记载在已公开的专利申请文件CN 201910649851.1中，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。
土曲霉CICC40205，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
土曲霉NRRL1960 购买自美国农业菌种保藏中心（ARS Culture Collection）。
土曲霉DSM23081购买自德国微生物菌种保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen )。
土曲霉TN484，记载在Yahiro, K., Takahama, T., Park, Y. S., Okabe, M.,Breeding of Aspergillus-Terreus Mutant Tn-484 for Itaconic Acid Productionwith High-Yield, Journal of Fermentation and Bioengineering,1995, 79(5): 506-508。
土曲霉 TN484-M1，记载在Dwiarti, L., Yamane, K., Yamatani, H., Kahar,P.,Okabe, M., Purification and characterization of cis-aconitic aciddecarboxylase from Aspergillus terreus TN484-M1, J Biosci Bioeng, 2002, 94(1): 29-33。
pSGF957，由Seoul National university得到，质粒记载在 Kim,J.G.,Choi,Y.D., Chang,Y.J.,Kim,S.U., Genetic transformation of Monascus purpureusDSM1379，Biotechnology Letters,2003,25,1509–1514。
实施例1.产反式乌头酸的基因工程菌株的构建
1.敲除 CICC_3028g的打靶元件的构建
按照图1的打靶元件策略图，构建CICC_3028g的打靶元件，描述本发明所述的重组土曲霉的构建方法。
细胞色素P450单加氧酶基因上下游同源臂的扩增：以U-3028g-F (5’-CGACGGCCAGTGAATTCGAGctggtgggatatgctgggtttagtct-3’)和U-3028g-R(hph2) (5’-ctttacgcttgcgatcccgaagtcttcggaagacggcca-3’)为引物对，以土曲霉CICC40205的基因组为模板进行PCR扩增，产物纯化回收后得到CICC_3028g基因的上游同源臂片段；以D-3028g-F(hph2) (5’-gaggtaaccttctttccgatatcatcgaagactgct-3’)和D-3028g-R (5’-agatgtgcggcagatcagatccatcg-3’)为引物对，以土曲霉CICC40205的基因组为模板进行PCR扩增，产物纯化回收后得到CICC_3028g基因的下游同源臂片段。以hph-F(5’-ttcgggatcgcaagcgtaaaga -3’)和hph-R(5’- gaaagaaggttacctctaaacaa-3’)为引物对，以质粒pSGF957为模板进行PCR扩增PtrpC-hph-TtrpC片段，PtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶基因启动子，hph 为潮霉素磷酸转移酶基因，TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；扩增产物纯化回收后，得到潮霉素B抗性hph基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC。
将CICC_3028g基因上下游同源臂和潮霉素B筛选标记基因hph表达元件利用SOEPCR的方法融合在一起，以C-3028g-F (5’-gctgggtttagtctccacatagt-3’)和C-3028g-R(5’-cgggtgccggccgtccgct-3’)为引物对，对融合产物进行PCR扩增得到3028g上游同源臂-PtrpC-hph-TtrpC-3028g下游同源臂片段，扩增产物纯化回收后，得到打靶元件3028g-KO片段，片段大小为4.1kb，可用于CICC_3028g基因敲除工作。
2.敲除土曲霉∆cadA的CICC_3028g基因
1)土曲霉∆cadA原生质体的制备:
土曲霉∆cadA是一株产乌头酸菌株，将土曲霉∆cadA的孢子悬液接种至50mL液体培养基IPM中，孢子浓度约为107个/mL，在200rmp、37 ℃培养12-18h。用无菌单层100目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO4溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取1g菌丝，加入10mL酶解液，在30°C、120rpm处理1-2h。酶解液成分为：1% 纤维素酶（Sigma，Catalog No.：C1184）、1% 裂解酶（Sigma，Catalog NO.：L1412）、1% 蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO4，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。
将上述酶解后的混合液用300目尼龙布过滤，收集滤液。在4 ℃条件下离心收集原生质体，用预冷的1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH8.0，50mM CaCl2)洗涤一次，最后把原生质体重悬于150μl预冷的STC，并用STC将原生质体浓度调整为5×107个/mL，得到原生质体悬液。
2)打靶元件3028g-KO转化土曲霉：
在上述原生质体悬液中加入约5μg（体积不超过10μL）的打靶元件3028g-KO的DNA片段，再加入50μL PSTC(40％ PEG4000，50Mm Tris-HCl pH8.0，50mM CaCl2)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1.5mL PSTC，混匀后室温放置20min。然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板PDA-SH，在30°C、黑暗条件下培养3－4天。从平板上将转化子转接至筛选平板PDA-H上（称取4g马铃薯右旋糖琼脂培养基溶解于100ml蒸馏水中，灭菌，冷却至约55°C时加入潮霉素至终浓度为100μg/mL，制备平板），在30°C培养3-5天，得到转化子。
将转化子转接到PDA-H平板上进行传代培养，传代3次。然后再分别收集孢子用生理盐水进行适当的梯度稀释，取100μL涂布于PDA-H平板上，使其长出独立的单菌落，即为单孢分离。再从单菌落上取孢子再次进行单孢分离，共进行4次单孢分离传代培养。
3)重组土曲霉菌株的基因型验证：
挑取重组土曲霉转化子接种于PDA-H平板上培养孢子，然后分别将孢子接种于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，以C-3028g-F (5’-gctgggtttagtctccacatagt-3’)和C-3028g-R (5’-cgggtgccggccgtccgct-3’)为引物对进行PCR扩增，扩增插入基因组中的3028g上游同源臂-PtrpC-hph-TtrpC-3028g下游同源臂元件，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，验证转化子中3028g上游同源臂-PtrpC-hph-TtrpC-3028g下游同源臂元件的整合情况。阳性转化子能扩增出大小为4.1kb的条带，结果如图2所示，CK为KO打靶元件，1-4分别为4个转化子，其中3号为正确的转化子，2号转化子不纯，存在CICC_3028g 的未敲除片段。
将基因型验证整合了3028g上游同源臂-PtrpC-hph-TtrpC-3028g下游同源臂元件的阳性转化子转接到PDA-H平板上进行传代培养，传代3次。然后再分别收集孢子用生理盐水进行适当的梯度稀释，取100μL涂布于PDA-H平板上，使其长出独立的单菌落，即为单孢分离。再从单菌落上取孢子再次进行单孢分离，共进行4次单孢分离传代培养。单孢分离后获得敲除细胞色素P450单加氧酶基因CICC_3028g 的重组土曲霉∆cadA-∆CICC_3028g，挑取部分验证正确的重组菌株进行摇瓶发酵。
实施例2. 重组土曲霉发酵产反式乌头酸
1.重组土曲霉菌株产反式乌头酸的摇瓶筛选
将实施例2中得到的稳定传代的重组土曲霉菌株分别接种至土曲霉产孢培养基，在32℃条件下培养6天获得成熟的孢子。再分别将各个培养至成熟的孢子接种至有机酸发酵培养基IPM中（500ml三角瓶中装有55ml IPM培养基），每株菌做两瓶平行，在37℃摇床中，转速220rpm发酵72h。过滤除去发酵液中的菌丝，发酵上清液进行适度稀释后进行高效液相色谱分析。
2.发酵液中反式乌头酸的含量及纯度分析
选取重组菌株和出发菌株的发酵上清液稀释后进行高效液相色谱分析，以不同浓度的反式乌头酸的标准品作为标准曲线，分析比较发酵液中反式乌头酸的含量及纯度。色谱条件如下：色谱柱：AminexHPX-87H Organic Acid Analysis Column,300mm×7.8mm(Bio-rad, Cat No.1250140)；流动相：5mmol/L硫酸；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；检测温度：30℃；紫外检测器（210nm）。结果如图3中A 所示，重组菌株∆cadA-∆CICC_3028g转化子∆Cad∆p450的峰形图（上方）和对照∆cadA的转化子∆Cad 的峰形图（下方），如图3中B图所示，柱高为摇瓶发酵在120h反式乌头酸的产量，点代表三次平行实验的结果。
初峰保留时间在12.8分钟的峰为反式乌头酸，8.9分钟的峰为顺式乌头酸。分析结果表明，在摇瓶发酵120h检测重组菌株发酵液中反式乌头酸产量（3次生物学重复平均9.51g/L）与出发菌株∆cadA(3次生物学重复平均8.45g/L）相比有显著提高，约提高13%，顺式乌头酸没有显著性的降低或者提高。由此可以证明敲除CICC_3028g可以提高出发菌中反式乌头酸的产量。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
山东鲁抗舍里乐药业有限公司
<120> 一种高产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 516
<212> PRT
<213> P450单加氧酶
<400> 1
Met Thr Leu Gln Ile Ile Val Ile Ala Ala Thr Ala Val Ile Tyr Phe
1 5 10 15
Leu Thr Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys Gly Ile
20 25 30
Pro Glu Ile Pro Gly Val Pro Ile Phe Gly Asn Leu Ile Gln Leu Gly
35 40 45
Val Lys His Ala Thr Val Ala Arg Gln Trp Ser Lys Lys Phe Gly Pro
50 55 60
Val Phe Gln Ala Arg Leu Gly Asn Arg Arg Val Ile Phe Ala Asn Thr
65 70 75 80
Phe Glu Ser Thr Arg Gln Leu Trp Ile Lys Glu Gln Ser Ser Met Ile
85 90 95
Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Gly Val Val Ser Ser Ser Gln
100 105 110
Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro Trp Asp Glu Ser Cys Lys Arg Arg
115 120 125
Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Val Ala Val Gln Ser Tyr
130 135 140
Met Pro Ile Ile Asp Leu Glu Ser Met Ala Ser Ile Lys Glu Leu Leu
145 150 155 160
Lys Asp Ser Gln Gly Gly Lys Ile Asp Ile Asn Pro Thr Ala Tyr Phe
165 170 175
Gln Arg Phe Ala Leu Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Tyr Arg
180 185 190
Ile Glu Gly Asn Val Asn Asp Gln Leu Leu Arg Glu Ile Cys Glu Val
195 200 205
Gln Arg Gly Val Ala Asn Leu Arg Ser Thr Ser Asn Asn Trp Gln Asp
210 215 220
Tyr Val Pro Leu Leu Arg Leu Phe Ser Asn Arg Ser Asn Gln Ala Lys
225 230 235 240
Gln Leu Arg Ala Arg Arg Asp Lys Tyr Met Ala Phe Leu Phe Asp Ile
245 250 255
Leu Lys Asp Arg Met Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile Thr Gly
260 265 270
Asn Ile Leu Lys Asn Pro Glu Thr Lys Leu Thr Asp Ala Glu Ile Lys
275 280 285
Ser Ile Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp Thr Val Pro Gly
290 295 300
Asn Leu Ile Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp Gly Gln Arg
305 310 315 320
Ile Gln Gln Lys Ala Tyr Ala Glu Ile Met Ser Val Tyr Pro Asn Gly
325 330 335
Asp Ala Trp Glu Arg Cys Leu Val Glu Glu Lys Val Pro Tyr Ile Thr
340 345 350
Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Arg Phe Trp Thr Val Met Pro Ile Cys
355 360 365
Ile Pro Arg Val Asn Ile Lys Glu Ile Val Tyr Asn Gly Ala Arg Ile
370 375 380
Pro Ala Gly Thr Thr Phe Phe Met Asn Ala Trp Ala Ala Asn Tyr Asp
385 390 395 400
Glu Asp His Phe Asp Met Pro Asn Arg Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Leu
405 410 415
Glu Pro Thr Glu Gly Phe Gly Thr Pro His Tyr Ser Phe Gly Ala Gly
420 425 430
Thr Arg Met Cys Ala Ala Ser His Leu Ala Ser Arg Glu Leu Tyr Thr
435 440 445
Val Phe Leu Arg Phe Ile Val Ala Phe Thr Ile Glu Ser Ala Gln Asp
450 455 460
Pro Ala Asp Val Pro Val Leu Asp Ala Ile Glu Cys Asn Ala Thr Pro
465 470 475 480
Thr Ser Met Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe Lys Pro
485 490 495
Arg Asp Glu Ala Ser Leu Arg Arg Trp Ile Ala Glu Ser Glu Glu Arg
500 505 510
Thr Lys Glu Leu
515
<210> 2
<211> 1690
<212> DNA
<213> CICC_3028g基因
<400> 2
atgactctcc aaatcatcgt catcgccgct accgcggtta tctacttcct cacccgctac 60
ttcaatcgca ccgacatccc taagattaag ggaatccccg agatcccggg cgtgcccatc 120
ttcggcaatc tgatacaact gggcgtcaaa cacgccacag tcgcccgcca atggtcaaag 180
aaattcgggc ctgtgttcca ggcgcgtctg ggcaataggc gcgtcatctt cgccaacacc 240
ttcgagtcca cccgccagct gtggattaag gagcagtctt cgatgatatc gcgccctaca 300
ttccacacat ttcacggtgt tgtctctagc tcgcagggtt ttacgatcgg gacgtcaccg 360
tgggatgagt cttgtaaacg gcgccgtaag gcggctgcga cagcgctcaa ccgtgtcgcg 420
gtgcagtcct atatgcccat aatcgatctg gagagtatgg ccagtattaa ggagttgctg 480
aaagattcac agggcgggaa gatagatatc aacccgactg cctacttcca gcggtttgcg 540
ctcaacacca gtttgactct gaactatggc taccgcatcg agggcaatgt gaacgaccag 600
cttctcagag agatctgcga ggtgcagcgc ggtgtggcga atctccggtc aaccagcaac 660
aactggcagg attatgttcc tctgctcagg ttgttttcga acaggagcaa ccaggcgaag 720
caactccgtg cgcggagaga taaatacatg gcctttttgt ttgatatttt gaaggatcgc 780
atggccaagg ggacagataa gccgtgcatt acggggaata ttctgaagaa tcctgagaca 840
aagcttacag acggtatgtc tatatcacga gcgatgcacc ccattatatg attggtgatt 900
atatatacta atccttctca gcggaaatca agtctatctg tctgaccatg gtctctgccg 960
gtcttgatac cgttcctggc aacttgatca tgggcatcgc gtacctggct tcggaagacg 1020
gccaacgcat tcaacagaag gcttacgcag aaattatgtc cgtgtacccg aatggcgacg 1080
cctgggagcg gtgtcttgtg gaggaaaaag tcccctatat cactgcacta gtaaaagaga 1140
ccctgcgctt ctggactgtg atgcctatct gcattccgcg tgtgaatatc aaggagatcg 1200
tctataatgg cgcgaggatt cctgctggaa caaccttttt catggtaaga tcaaaccccc 1260
taacccctaa ccccggcgtg ctatcccgtc attcctagac taattgatct gttagaatgc 1320
gtgggctgca aactacgatg aagatcattt cgacatgccc aaccgctttc tccctgagcg 1380
atacctcgag ccgactgaag gtttcggcac cccacactac agcttcggcg ccgggacacg 1440
catgtgcgcc gcctcccacc ttgcgagccg cgagctatac acggtctttc ttcggttcat 1500
cgtggcgttt accatagagt cagctcaaga cccggccgat gtgccagtgc ttgatgctat 1560
tgagtgcaac gctactccga catcgatgac aacggaaccg aagccattca aggttggttt 1620
taagccgagg gatgaggcca gtttgagaag gtggattgca gagagtgagg agcggacaaa 1680
ggagttgtag 1690
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> U-3028g-F
<400> 3
cgacggccag tgaattcgag ctggtgggat atgctgggtt tagtct 46
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> U-3028g-R
<400> 4
ctttacgctt gcgatcccga agtcttcgga agacggcca 39
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> D-3028g-F
<400> 5
gaggtaacct tctttccgat atcatcgaag actgct 36
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> D-3028g-R
<400> 6
agatgtgcgg cagatcagat ccatcg 26

Claims (8)

1.一种产反式乌头酸的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株是以无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉菌株（Aspergillus terreus）为出发菌株，将出发菌株中细胞色素P450单加氧酶基因进行敲除所得到的；所述的出发菌株为将顺乌头酸脱羧酶CadA进行基因缺失突变而获得的土曲霉；所述的细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的顺式乌头酸脱羧酶CadA在NCBI的登录号是 GenBank：EAU29420.1。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，构建所述出发菌株的宿主菌为土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，编码所述的细胞色素P450单加氧酶的基因为CICC_3028g，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求1-4任一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述的构建方法是将顺式乌头酸脱羧酶CadA进行基因缺失突变而获得的土曲霉，然后将获得的土曲霉中的细胞色素P450单加氧酶基因进行敲除，构建重组土曲霉。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述的构建方法具体步骤包括：
1) 细胞色素P450单加氧酶基因打靶元件构建：以土曲霉CICC40205的基因组为模板，PCR扩增获得细胞色素P450单加氧酶基因CICC_3028g基因的上游同源臂片段与下游同源臂片段，作为打靶元件；
2) 将步骤1）中得到的CICC_3028g打靶元件导入无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉，筛选后获得产反式乌头酸的基因工程菌株。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中扩增CICC_3028g基因的上游同源臂片段的引物为U-3028g-F：-5’-CGACGGCCAGTGAATTCGAGctggtgggatatgctgggtttagtct-3’和U-3028g-R：5’-ctttacgcttgcgatcccgaagtcttcggaagacggcca-3’；扩增CICC_3028g基因的下游同源臂片段的引物为D-3028g-F：5’-gaggtaaccttctttccgatatcatcgaagactgct-3’和D-3028g-R ：5’-agatgtgcggcagatcagatccatcg-3’。
8.权利要求1-4任意一项所述的基因工程菌株在生产反式乌头酸中的应用。
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