CN116023449B

CN116023449B - 层出镰刀菌伏马毒素合成以及致病力相关基因FpFUM21及其用途

Info

Publication number: CN116023449B
Application number: CN202310030580.8A
Authority: CN
Inventors: 李涛涛; 谢丽红; 吴彦菲; 屈红霞; 蒋跃明
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2023-01-05
Filing date: 2023-01-05
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2043-01-05
Also published as: CN116023449A

Abstract

本发明提供了一个影响层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)伏马毒素合成以及致病力的基因FpFUM21及其用途，属于基因工程技术领域。FpFUM21基因的蛋白编码区编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明通过敲除FpFUM21基因导致层出镰刀菌伏马毒素B1合成能力以及对香蕉果实的致病能力显著下降。因此，FpFUM21基因及其编码蛋白的表达可作为重要候选靶标位点，用于设计和筛选抗真菌和伏马毒素残留的新型保鲜剂，在水果采后真菌病害以及真菌毒素残留的防控领域进行应用。

Description

层出镰刀菌伏马毒素合成以及致病力相关基因FpFUM21及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及层出镰刀菌FpFUM21基因及其在控制层出镰刀菌对香蕉果实侵染以及伏马毒素残留中的应用。

背景技术

香蕉是世界范围内的大宗水果，在鲜果贸易中排名第一。但香蕉在贮运过程中极易发生病害，造成重大经济损失。冠腐病是香蕉采后重要病害之一，导致香蕉采后营养和品质的显著下降，已经对我国香蕉采后贮藏和运输带来很大的困难，同时也逐渐成为香蕉采后的主要病害之一。层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)是引起香蕉采后冠腐病的主要病原菌之一，并可以产生伏马毒素。伏马毒素是最危险的真菌毒素之一，尤其是伏马毒素B1(FB1)，被IARC列为2B级致癌物。因此层出镰刀菌的侵染严重降低香蕉采后贮藏品质，并影响人类的饮食健康。鉴于此，找到控制层出镰刀菌伏马毒素产生或控制层出镰刀菌的侵染的关键因子，通过调控关键因子来控制层出镰刀菌的侵染及伏马毒素的残留，对缓解香蕉采后冠腐病的进一步扩散，维持香蕉的品质和延长贮藏期具有重大的意义。

目前对伏马毒素在镰刀菌侵染过程中的作用存在争议。有研究表明伏马毒素有利于镰刀菌对宿主的侵染，与病害发生密切相关；而有些研究则表明伏马毒素存在与否并不影响镰刀菌的致病力(Desjardins等，2002)。申请人通过前期研究推测伏马毒素极有可能作为致病因子参与病原菌对香蕉果实的侵染。目前FpFUM21在层出镰刀菌侵染香蕉果实过程中的作用以及应用还未见有报道。申请人研究发现FUM21在伏马毒素生物合成过程中发挥重要作用,且影响病原菌对香蕉果实的侵染。

发明内容

基于背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种控制层出镰刀菌对香蕉果实侵染以及伏马毒素残留的基因及其应用。

一方面，本发明提供一种控制层出镰刀菌对香蕉果实侵染以及伏马毒素合成和残留的基因，名称为FpFUM21。

所述FpFUM21基因的蛋白编码区编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

优选方案中，本发明所述FpFUM21基因的蛋白编码区为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列完全互补配对的序列。

另一方面，本发明提供了层出镰刀菌FpFUM21基因在调控层出镰刀菌伏马毒素合成中的应用，其特征在于，

进一步地，FpFUM21基因作为被调控靶点在调控层出镰刀菌伏马毒素合成中应用。

在一个优选方案中，FpFUM21基因作为被调控靶点在抑制层出镰刀菌伏马毒素合成中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被抑制靶点在抑制层出镰刀菌伏马毒素合成中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被敲除靶点在抑制层出镰刀菌伏马毒素合成中应用。

在一个优选方案中，FpFUM21基因作为被调控靶点在提高层出镰刀菌伏马毒素合成中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为过表达靶点在提高层出镰刀菌伏马毒素合成中应用。

另一方面，本发明提供了层出镰刀菌FpFUM21基因在调控层出镰刀菌对香蕉侵染过程中的应用，其特征在于，

进一步地，FpFUM21基因作为被调控靶点在调控层出镰刀菌对香蕉侵染过程中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被调控靶点在抑制层出镰刀菌对香蕉侵染过程中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被抑制靶点在抑制层出镰刀菌对香蕉侵染过程中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被敲除靶点在抑制层出镰刀菌对香蕉侵染过程中应用。

另一方面，本发明提供了层出镰刀菌FpFUM21基因在调控香蕉真菌病害中的应用，其特征在于，

进一步地，FpFUM21基因作为被调控靶点在调控香蕉真菌病害中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被调控靶点在抑制香蕉真菌病害中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被抑制靶点在抑制香蕉真菌病害中应用。

进一步地，FpFUM21基因作为被敲除靶点在抑制香蕉真菌病害中应用。

优选方案中，所述真菌病害为冠腐病。

进一步地，所述冠腐病为层出镰刀菌引起的冠腐病。

另一方面，本发明提供了一种调控层出镰刀菌伏马毒素B1(FB1)合成能力的方法，其特征在于，通过调控镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量实现调控层出镰刀菌伏马毒素B1(FB1)合成能力。

优选方案中，通过降低镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量实现降低层出镰刀菌伏马毒素B1(FB1)合成能力。

进一步地，通过基因敲除、基因沉默和/或基因编辑实现降低镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量。

另一优选方案中，通过提高镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量实现提高层出镰刀菌伏马毒素B1(FB1)合成能力。

进一步地，通过增加FpFUM21基因的拷贝数、提高FpFUM21基因的启动子效率和/或优化FpFUM21基因的密码子实现提高镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量。

另一方面，本发明提供了一种降低层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力和/或降低香蕉果皮中FB1的残留的方法，其特征在于，通过降低镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量实现降低层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力和/或降低香蕉果皮中FB1的残留。

优选方案中，通过基因敲除、基因沉默和/或基因编辑实现降低镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明提供了一条全新的影响层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)伏马毒素合成以及致病力的基因FpFUM21。

2)本发明提供了一种的新的调控出镰刀菌(Fusarium proliferatum)伏马毒素合成的方法，即通过调控镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量实现调控层出镰刀菌伏马毒素B1(FB1)合成能力。

3)本发明提供了一种的新的降低层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力和/或降低香蕉果皮中FB1的残留的方法，即通过降低镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量或镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量实现降低层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力和/或降低香蕉果皮中FB1的残留。

4)本发明通过一个靶点同时实现了调控出镰刀菌(Fusarium proliferatum)伏马毒素合成，以及降低层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力和/或降低香蕉果皮中FB1的残留。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明用于降低层出镰刀菌对香蕉果实侵染以及伏马毒素残留的方法及其有益效果进行详细说明。

图1融合片段和引物示意图。

图2阳性转化子鉴定引物示意图。

图3为本发明的FpFUM21敲除突变菌株鉴定电泳图。A为利用Hyg-F和Hyg-R检测潮霉素抗性基因；B为利用CDS-F和CDS-R检测目的基因。图中1，2，3为三次重复。

图4为突变菌株产FB1能力。

图5 A为突变菌株和野生菌株侵染香蕉后的表型。

B为FB1在香蕉果皮中的残留。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。

实施例中层出镰刀菌FpFUM21基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

ATGGCTCACAGAGAATTTCATGATACAAAGTTTATTTCTCGATGTATTGATACATGCTATGCAGATCCTGAAGGCATTCGCGTATTTCTGGAGAGAAAGAGTGTTGACTCTGTTGCCGACGAGGTAGCCAAAGGTGCTTCGGCTGTTGATAGGGAAACGTCCGTTTTATTCCACTCCGTAATGGCTATTGGATGTCACGGTTTAAGTCTTGAGCAGGGCCACCACACAATTGGCAAACAAAAATACTCTGTCTCGATGATATTCAAAGAAGCTCTATACATGAGACAGAATTTGCGGGATAAGCCTACTCTTCGGGGCCTACAGGCTCTTTTGACTATGGCATACTTTTCAGGCCGAGTAGGCGATGATTCGACTTCAAGCTTGCTCGCAGATGCAGCCGTTTGCGCCCAGACATTGGAACTGCACAGTGCAAGTGCGATTGAAAAGCAATATAATAGCTCCTCGGAACAGCAGGTAGCCAAACGTGCCCTCTGGTTCTTAAATTCACTTGAGAAGCCCCGCTGCCTCGCTGAAGGCCTATTGCCGCTGATCCACGACGATTTAATCGACTATGACCCGCCGTCTTCCGCAAGCCACTCACCAGATGAGGTTGACTGGTTTGCCATCAACGCTCGGTTTGCCACCATCTGTTATTCCATCATAAGGGAGCGACCTCGCGGTAAACTTGGTCGCTCATCACCACGGCGCGGACAAGGCCAGGCGTCTCAGCATAGCGCGAGCTCGACGATAAGCAGGATTGAGTCTCTGTTGGAAGAATGGAGAGGTGACCTCCCGTTTGCCAGTGACACTAACGCAACCGAATCCAACGAATTTGCGGCGTTGACGTGTTCCGAGAGACGCCACAGGATTAAGTGTCTTAATAAATACTGGTCCGCCGTCATTGCAACGCATTCAGGACAGGCTCGTGTTGTGGTCGTAGATGGCGGTGGAGGTGTCGGATTGAGTAAAGAACGATGCGTGGAGGCCGCTCAGGAGATTCTAAAGAATAGCCACTACATTACCTCCACCGACATTTTATATGATATTCGCGACACGGGTGATCATGACTGCGGTGATCCGGGAGGCGTTTGCTGGTGA。

层出镰刀菌FpFUM21蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

MAHREFHDTKFISRCIDTCYADPEGIRVFLERKSVDSVADEVAKGASAVDRETSVLFHSVMAIGCHGLSLEQGHHTIGKQKYSVSMIFKEALYMRQNLRDKPTLRGLQALLTMAYFSGRVGDDSTSSLLADAAVCAQTLELHSASAIEKQYNSSSEQQVAKRALWFLNSLEKPRCLAEGLLPLIHDDLIDYDPPSSASHSPDEVDWFAINARFATICYSIIRERPRGKLGRSSPRRGQGQASQHSASSTISRIESLLEEWRGDLPFASDTNATESNEFAALTCSERRHRIKCLNKYWSAVIATHSGQARVVVVDGGGGVGLSKERCVEAAQEILKNSHYITSTDILYDIRDTGDHDCGDPGGVCW。

实施例1：FpFUM21敲除突变菌株(ΔFUM21)构建

1、同源重组

1)将层出镰刀菌接种到固体培养基PDA上，28℃下PDA平板上培养7天后搜集菌丝，按照美基生物真菌DNA试剂盒说明书，提取层出镰刀菌总DNA作为模板，根据目的基因在染色体上的位置，用NCBI-Primer设计引物up-F、up-R、down-F、down-R、HYG-F、HYG-R、YG5和HY3(图1A)，其中up-R/HYG-F反向互补、带有对方各20～24bp同源序列，HYG-R/down-F也是一样。

2)第一轮PCR：用高保真酶克隆出目的基因上游序列(up-F/up-R)和下游(down-F/down-R)各1500～2000bp序列，以载体pCX62作为模板克隆潮霉素抗性基因HYG(HYG-F/HYG-R)。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收纯化。

3)第二轮PCR：向PCR体系中加入相同质量的两个片段作为模板，加入分别加入N-5/HY3和YG5/N-3作为引物，通过高保真Taq酶三步法PCR将片段融合。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在融合片段分子量的位置割胶回收。将部分胶回收产物送至生工生物有限公司进行Sanger测序。得到正确的融合片段，浓缩DNA片段浓度大于1μg/μL用于原生质体转化。

克隆同源重组片段所用引物如下：

2、原生质体的制备：

1)收集菌体：将层出镰刀菌在PDA培养基上培养7天，用新的50ml PDB培养基洗下PDA上的孢子，用400目纱布过滤除去菌丝，含有的孢子滤液倒入250ml三角瓶，28℃，200rpm，避光培养14h使孢子萌发成菌体幼殖体。在超净工作台中用灭菌的400目纱布过滤收集菌丝，用灭菌的0.8M NaCl溶液充分洗涤菌丝，除去孢子和杂质。

2)将收集的菌丝放入50ml离心管，加入10ml裂解酶液(2％Driselase，1％Lyticase，0.7M NaCl)，28℃，100rpm，裂解4h，期间用显微镜观察消解情况。用两层神奇滤布过滤收集菌液，加入10ml 0.8M NaCl溶液，4℃3000g离心10min，弃上清，加入10ml灭菌的STC溶液(0.8M山梨糖醇，50mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH＝8.0)，4℃，3000g，离心10min，去上清，用1ml STC溶液重悬沉淀。

3、原生质体转化：

1)吸取10μg质粒和100μl原生质体到2ml离心管中，轻柔混匀，4℃静置20min。依次逐滴加入200μl，400μl，600μl灭菌的PTC溶液(50％PEG，50mM CaCl₂，50mM Tris-HCl,pH＝8.0)每次加入PTC溶液后轻柔混匀。室温静置40min。加入1ml STC溶液终止反应。4℃，3000g，离心10min，小心去上清。加入1ml STC溶液。

2)原生质体培养：向培养皿中倒入10ml含0.7M NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml潮霉素的PDA培养基，冷却凝固。将转化后的原生质体与10ml约40℃的含0.7M NaCl的PDA培养基混合，倒入上述培养皿，冷却凝固后放入28℃培养箱。培养24h后长出菌斑，再倒入10ml含0.7M NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml潮霉素的PDA培养基，冷却凝固，28℃培养7天。挑取阳性转化子在新的含150μg/ml潮霉素的PDA培养基上交替培养3代。

4、阳性转化子的鉴定

提取野生型层出镰刀菌和转化子的总DNA。用三对特异引物通过PCR鉴定阳性转化子：Hyg-F和Hyg-R检测潮霉素抗性基因是否被替换到层出镰刀菌的染色体上(图3A)，CDS-F和CDS-R检测目的基因是否被敲除发生同源重组(图3B)。将符合上述结果的转化子的DNA做模板，用up-F和down-R做引物，PCR克隆出的片段送至生工生物有限公司测序。根据测序结果与同源重组片段序列是否一致检验同源重组是否发生。将检验为同源重组发生的菌种在PDA平板上继续继代培养。最终确定阳性转化子电泳图如图3所示。

阳性转化子鉴定所用引物如下：

实施例2：FpFUM21敲除突变菌株FB1产量分析

1、FB1含量分析

在50mL CB培养基中分别加入5个野生型和FpFUM21敲除层出镰刀菌菌饼后培养5d,提取菌液中伏马毒素B1。真菌菌液伏马毒素的提取和纯化方法如下：

布氏漏斗抽滤或者滤纸过滤得到的滤液10mL，100％甲醇和滤液按照3:1(v/v)比例混合，室温下超声提取1h；用双层滤纸过滤，滤液调节pH为5.8-6.5后用SAX柱(500mg，6mL)进行纯化。SAX柱用8mL 100％甲醇和8mL 75％甲醇依次活化。取上述3步骤滤液8mL过柱，再依次用8mL 75％甲醇和8mL甲醇净化固相萃取柱，最后用10mL含1％乙酸的甲醇溶液洗脱。洗脱液用旋转蒸发仪浓缩，用60％甲醇定容为1mL，移入1.5ml离心管。使用0.22μm有机相孔径滤膜过滤到棕色上样管待测。

通过分析野生型和突变菌株FB1含量，发现FpFUM21敲除突变菌株产毒能力显著下降(图4)。

实施例3：FpFUM21敲除突变菌株对香蕉果实致病力分析

将层出镰刀菌野生型和突变菌株在PDA平板上28℃培养7天，用无菌水冲洗孢子并用纱布过滤，收集滤液，利用孢子计数器，将孢子浓度调至1×10⁶个孢子/mL。

挑选健康的香蕉(Musa acuminata AAA group,cv.Cavendish)果实，用无菌水清洗干净，取出晾干。利用针刺法接种层出镰刀菌：分别取10μL上述孢子滴到香蕉果实的针刺部位。所有香蕉果实均贮藏于25℃，相对湿度为85％的培养箱内，观察香蕉发病情况。

接种5天后，首先用肉眼观察到ΔFUM21菌株侵染的香蕉果皮发病较轻(图5A)，说明FpFUM21基因是层出镰刀菌的重要致病因子。]

实施例4：FpFUM21敲除突变菌株对香蕉果皮中FB1残留的影响

香蕉果皮中伏马毒素提取以接种点为中心取半径2cm的香蕉果皮样品，称量约10g样品加入30mL 100％甲醇，提取完成后按照实施例2中方法测定FB1含量，可以判断突变菌株侵染后，香蕉果皮中的FB1含量要显著少于野生型菌株(图5B)，进一步说明FpFUM基因的敲除能够控制FB1在香蕉果皮中的残留。

综上可以看出，FpFUM21基因是层出镰刀菌侵染香蕉果实的重要致病因子，敲除FpFUM21基因可以显著降低层出镰刀菌的致病性，并降低FB1在香蕉果皮中的残留，是一种理想的控制香蕉冠腐病发生及伏马毒素残留的靶标位点，通过对FpFUM21基因的定向调控，能够为开发新的抗真菌和控制伏马毒素残留的水果保鲜剂提供理论和技术支撑。

>SEQ ID NO：1

>SEQ ID NO：2

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种控制层出镰刀菌侵染香蕉果实以及香蕉果实中伏马毒素残留的基因，其特征在于，

所述基因的蛋白编码区编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.降低层出镰刀菌FpFUM21基因的表达在降低层出镰刀菌伏马毒素合成中的应用，其特征在于，

3.降低层出镰刀菌FpFUM21基因的表达在减弱层出镰刀菌对香蕉侵染过程中的应用，其特征在于，

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，FpFUM21基因作为被调控基因在减弱层出镰刀菌对香蕉侵染过程中应用。

5.降低层出镰刀菌FpFUM21基因的表达在降低香蕉真菌病害中的应用，其特征在于，所述FpFUM21基因的蛋白编码区编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述真菌病害为冠腐病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，FpFUM21基因作为被调控基因在降低香蕉真菌病害中应用。

7.一种降低层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力和/或降低香蕉果实中伏马毒素的残留的方法，其特征在于，通过降低层出镰刀菌FpFUM21基因的mRNA表达量和/或层出镰刀菌FpFUM21基因的蛋白表达量实现降低层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力和/或降低香蕉果实中伏马毒素的残留。