CN115975996A - FpOPSB基因和蛋白在预防香蕉冠腐病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一个影响层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)致病力的基因FpOPSB及其用途。该基因编码天冬氨酸蛋白酶，其蛋白编码区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该基因的表达在层出镰刀菌侵染香蕉过程中逐渐升高，在侵染后36小时达到峰值。敲除FpOPSB基因导致层出镰刀菌对香蕉果实的致病能力显著下降，病原菌在香蕉果皮中的生物量也显著减少。因此，FpOPSB基因及其编码蛋白的表达可作为重要候选靶标位点，用于设计和筛选抗真菌的新型保鲜剂，在水果采后真菌病害的防控领域进行应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控层出镰刀菌对香蕉果实侵染的FpOPSB基因及其应用。本发明所提供的基因及其编码蛋白质的表达可以作为抗真菌保鲜剂筛选和设计的靶标位点。
背景技术
香蕉在贮运过程中，常因采后病害的发生引起大量腐烂，造成重大经济损失。冠腐病是香蕉采后重要病害之一，冠腐病的日益加剧和蔓延，导致香蕉采后营养和品质的显著下降。由于香蕉冠腐病的蔓延和防治不当，已经对我国香蕉采后贮藏和运输带来很大的困难，同时也逐渐成为香蕉采后的主要病害之一。层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)是引起香蕉采后冠腐病的主要病原菌之一。因此鉴定层出镰刀菌侵染香蕉过程中发挥致病因子作用的关键基因并控制层出镰刀菌的侵染，对缓解香蕉采后冠腐病的进一步扩散，维持香蕉的品质和延长贮藏期具有重大的意义。
天冬氨酸蛋白酶是一类酸性水解蛋白酶，属于天冬氨酸蛋白酶家族，在细胞外起催化水解蛋白质肽键的作用。目前天冬氨酸蛋白酶在层出镰刀菌侵染香蕉果实过程中的作用以及应用还未见有报道。
发明内容
申请人对层出镰刀菌中天冬氨酸蛋白酶FpOPSB功能的研究发现，在层出镰刀菌侵染香蕉过程中，FpOPSB基因表达量上调，表明该基因在层出镰刀菌侵染过程中发挥作用。
本发明所提供的调控层出镰刀菌致病性的基因，名称为FpOPSB。所述FpOPSB基因的蛋白编码区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
FpOPSB基因CDS序列SEQ ID NO.1：
ATGAAGTCTACTCAACTATCCCCCTTGCTTTTGTCTTTGTTGCCACTCGCTCAAGGAATTTCTCTCAACAGGAGAGACAATGGCCTCGAGCCTCGTGTTATGAGCGTCGAGATCCAGAGGCGGACAATACCTGATCCTATTTCCAATGATCGAAGACGTCTTCGCAAGCGAGACGGGACGATAGAAATTGGTATTGACAATGAACAATCTCTATACTTCCTCAATGCATCATTGGGAACGCCACCTCAAGATTTCCGCCTCCATCTCGACACTGGAAGCAGTGATCTATGGGTCAATGCTGAAGGCTCAAAACTATGTTCTACTCACGCAAATATATGCAGCGAGTCTGGACTATATAGCCCCAACAAGTCGTCGACTTATGAGTACTTGAACAGCGACTTCAACATCTCCTATGCCGATGGCTCTGGTGCTTCCGGAGACTATGCTACCGAGACATTCCGCATGGGTAGTGTAAAGCTTGAGGATTTACAGTTTGGTATCGGATATGTTACATCTGACAACGAAGGCGTCCTTGGTATTGGATACAAGAGCAACGAGGCTCAGGTCGGCCAACTCAACCGAGACGCCTACGATAACTTGCCGGCCAAGTTGGCTTCCAAGGGCCTCATCGCTTCTAATGCTTACAGCTTGTATCTGAACGACCTCGAATCTGCCACTGGAACCATCCTATTTGGAGGCGTGGACCAAGAGCAGTACACCGGCGATCTAGTCACTCTCTCTATCAACAAGATGAATGGCGAGTTTTCCGAGTTCTCCATCACACTACAGAGCGTCAGCGCAGACTCAGAAACCATCGTTGACAACCTCGACCTCGCTGTTATCCTCGACTCTGGCTCAACACTGTCATATCTCCCAGCCACACTTACATCAGACATATACGACATTGTTGGCGCTCAGTACGAGGAGGGCCAGTCTGTGGCATACGTTCCCTGCGATCTTGGAAACGATTCCGGAAACTTGACGTTCAAGTTCAAAGACCCAGCAGAGATCTCAGTGCCATTGAGTGAGCTGGTTCTCGACTTCACCGACGTGACAGGGCGTCAACTATCCTTCGACAATGGCCAAGCAGCCTGTACCTTTGGGATAGCACCCACCACAGGAGACATTTCTATCTTGGGTGACACGTTTCTCAGAAGCGCCTATGTTGTTTTCGATCTTGACAATAACGAGATCTCACTAGCACAGAGCAACTTTGACGCTACAAAATCCCATATCCTCGAGATCGGTACCGGAAAGAATGCTGTTCCTACTGCCACTGGCAGTGGTTCTTCTGATAACAAGGAAAATGCCGCTGCGTCACTTTCACCATTAGGAGCCGACGCAGCTATTTCTATGGTTGCTGGGGCCTTTGCCCTCGGGTTTGCTTGGATGCTTATTTAA。
FpOPSB蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.2：
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本发明所达到的有益效果是：
本发明发现FpOPSB基因可作为新的控制香蕉病害的靶标位点，从而用于改善香蕉贮藏保鲜的水平。利用同源重组技术构建FpOPSB基因敲除突变株，对该突变株进行致病力分析，发现突变株对香蕉果实的致病性显著降低，突变菌株在香蕉果皮中的生物量也显著减少。因此设计和筛选能够抑制FpOPSB基因表达或者蛋白表达的化合物或者处理方式，可用于开发新型的保鲜剂或保鲜措施，用于病害的控制。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为层出镰刀菌侵染香蕉过程中FpOPSB基因表达；
图2为融合片段和引物示意图；
图3为阳性转化子鉴定引物示意图；
图4为本发明的FpOPSB敲除突变菌株构建电泳图；
图5为突变菌株和野生菌株侵染香蕉后的表型。
图6为病原菌在香蕉果皮中的生物量。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：FpOPSB基因克隆
1、层出镰刀菌菌丝RNA提取和cDNA合成
将层出镰刀菌接种到固体培养基PDA上，28℃下PDA平板上培养7天后收集菌丝，利用HiPure Fungal RNA Mini Kit(Magen，R4155-03)试剂盒提取层出镰刀菌菌丝RNA，然后利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，RR047A)进行反转录，获得cDNA。
2、FpOPSB基因全长扩增
设计正向引物：5’-ATGAAGTCTACTCAACTATCCCCCT-3’和反向引物：5’-TTAAATAAGCATCCAAGCAAACCCG-3’，扩增FpOPSB基因CDS全长序列，如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：FpOPSB基因在层出镰刀菌侵染香蕉过程中的表达
1、层出镰刀菌接种
将层出镰刀菌菌株在PDA平板上28℃培养7天，用无菌水冲洗孢子并用纱布过滤，收集滤液，利用孢子计数器，将孢子浓度调至1×106个孢子/mL。
挑选健康的香蕉(Musa acuminata AAA group,cv.Cavendish)果实，用无菌水清洗干净，取出晾干。利用针刺法接种层出镰刀菌：分别取10μL上述孢子滴到香蕉果实的针刺部位。所有香蕉果实均贮藏于25℃，相对湿度为85％的培养箱内。
2、FpOPSB基因表达分析
在接种后第12、24、36、48小时(h)后收集层出镰刀菌菌丝并提取RNA和cDNA合成，设计正向引物：5’-CCACCTCAAGATTTCCGCCT-3’和反向引物：5’-ACGCCTTCGTTGTCAGATGT-3’，采用荧光定量PCR方法进行基因表达分析。通过基因表达分析可以发现，在层出镰刀菌侵染香蕉过程中，FpOPSB基因表达量上调(图1)，在侵染后36小时达到峰值，表明该基因在层出镰刀菌侵染香蕉过程中发挥作用。
实施例3：FpOPSB敲除突变菌株构建
1、同源重组
1)按照美基生物真菌DNA试剂盒说明书，提取层出镰刀菌总DNA作为模板，根据目的基因在染色体上的位置，用NCBI-Primer设计引物F1、R1、F2、R2、F3、和R3(图2)，其中F1和R3为20～25bp，F2、R1、F3、和R2带有两个片段的各20～30bp同源序列。用高保真酶克隆出目的基因上游(F1/R1)和下游(F3/R3)各1500～2000bp序列，以载体pCX62作为模板克隆潮霉素抗性基因(F2/R2)。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收纯化。
克隆同源重组片段所用引物如下：
2)重叠PCR构建融合片段：向PCR体系中加入相同质量的三个片段作为模板，加入F1和R3作为引物，通过高保真Taq酶三步法PCR将片段融合。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在融合片段分子量的位置割胶回收。将部分胶回收产物送至生工生物有限公司进行Sanger测序。
3)巢式PCR扩增融合片段：在融合片段内部首尾各50～500bp位置设计引物(OPSB-in-F/OPSB-in-R)，PCR进行30～35个循环扩增融合片段。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收。需要融合片段浓度大于1μg/μl。
2、原生质体的制备：
1)收集菌体：将层出镰刀菌在PDA培养基上培养7天，用新的50ml PDB培养基洗下PDA上的孢子，用400目纱布过滤除去菌丝，含有孢子的滤液倒入250ml三角瓶，28℃，200rpm，避光培养14小时使孢子萌发成菌体幼殖体。在超净工作台中用灭菌的400目纱布过滤收集菌丝，用灭菌的0.8M NaCl溶液充分洗涤，除去孢子和杂质。
2)将收集的菌体幼殖体放入50ml离心管，加入10ml裂解酶液(2％Driselase，1％Lyticase，0.7M NaCl)，28℃，100rpm，裂解4小时，期间用显微镜观察消解情况。用两层神奇滤布过滤收集菌液，加入10ml 0.8M NaCl溶液，4℃3000g离心10分钟，弃上清，加入10ml灭菌的STC溶液(0.8M山梨糖醇，50mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH＝8.0)，4℃，3000g，离心10分钟，去上清，用1ml STC溶液重悬沉淀。
3、原生质体转化：
1)吸取10μg质粒和100μl原生质体到2ml离心管中，轻柔混匀，4℃静置20分钟。依次逐滴加入200μl，400μl，600μl灭菌的PTC溶液(50％PEG，50mM CaCl2，50mM Tris-HCl,pH＝8.0)每次加入PTC溶液后轻柔混匀。室温静置40分钟。加入1ml STC溶液终止反应。4℃，3000g，离心10分钟，小心去上清。加入1ml STC溶液。
2)原生质体培养：向培养皿中倒入10ml含0.7M NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml潮霉素的PDA培养基，冷却凝固。将转化后的原生质体与10ml约40℃的含0.7M NaCl的PDA培养基混合，倒入上述培养皿，冷却凝固后放入28℃培养箱。培养24小时后长出菌斑，再倒入10ml含0.7M NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml潮霉素的PDA培养基，冷却凝固，28℃培养7天。挑取阳性转化子在新的含150μg/ml潮霉素的PDA培养基上交替培养3代。
4、阳性转化子的鉴定
提取野生型层出镰刀菌和10个转化子的总DNA。用三对特异引物通过PCR鉴定阳性转化子(图3)：Gene-F和Gene-R检测目的基因是否被敲除；Hyg-F和Hyg-R检测潮霉素抗性基因是否被替换到层出镰刀菌的染色体上；Up-F和Hyg-R检测目的基因上游的同源重组是否发生；Hyg-F和Down-R检测目的基因下游的同源重组是否发生。将符合上述结果的转化子的DNA做模板，用Up-F和Down-R做引物，PCR克隆出的片段送至生工生物有限公司测序。将检验为同源重组发生的菌种在PDA平板上继续继代培养。最终确定阳性转化子电泳图如图4所示。
阳性转化子鉴定所用引物如下：
实施例4：FpOPSB敲除突变菌株对香蕉果实致病力分析
1、按照实施例3中方法分别进行野生型菌株和突变菌株接种香蕉果实实验，观察香蕉发病情况。
2、接种5天后，首先肉眼观察到FpOPSB敲除突变菌株侵染的香蕉果皮发病较轻(图5)，说明FpOPSB基因是层出镰刀菌的重要致病因子。
3、利用层出镰刀菌正向引物：5’-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3’和反向引物：5’-GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT-3’，以及香蕉的正向引物：5’-TAGGGATTCCGACGATTTGTTT-3’和反向引物：5’-TAGCGTCATCATTGGCTGGGA-3’进行荧光定量PCR分析，对层出镰刀菌的生物量进行统计，可以判断突变菌株在香蕉果皮上的生物量要显著少于野生型菌株(图6)，进一步说明FpOPSB基因的敲除能够抑制层出镰刀菌在香蕉果皮上的生长。
综上可以看出，FpOPSB基因是层出镰刀菌侵染香蕉果实的重要致病因子，敲除FpOPSB基因可以显著降低层出镰刀菌的致病性，是一种理想的控制香蕉冠腐病发生的靶标位点，通过对FpOPSB基因的定向调控，能够为开发新的抗真菌水果保鲜剂提供理论和技术支撑。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.SEQ ID NO.1所示的FpOPSB基因或SEQ ID NO.2所示的蛋白在调控层出镰刀菌侵染香蕉果实中的应用。
2.SEQ ID NO.1所示的FpOPSB基因或SEQ ID NO.2所示的蛋白在预防香蕉冠腐病中的应用。
3.SEQ ID NO.1所示的FpOPSB基因或SEQ ID NO.2所示的蛋白作为防治靶标在制备香蕉保鲜剂中的应用。
4.一种香蕉保鲜剂，其特征在于，含有阻断或抑制SEQ ID NO.1所示的FpOPSB基因或SEQ ID NO.2所示的蛋白表达的制剂。
5.一种香蕉保鲜方法，其特征在于，通过阻断或抑制SEQ ID NO.1所示的FpOPSB基因或SEQ ID NO.2所示的蛋白表达来保鲜。
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