CN112646821B - 与致病力相关的灰霉菌基因Bcmet16及其应用 - Google Patents

Abstract

本分案申请公开了与致病力相关的灰霉菌基因Bcmet16及其在防治灰霉病中的应用，属于农业防治技术领域。本发明研究首次表明Bcmet16是影响灰霉菌致病的重要基因，通过敲除这个基因可显著降低灰霉菌的侵染能力。Bcmet16基因可以作为靶标在设计和筛选抗灰霉菌药剂或其他处理中应用，为开发新型杀菌剂提供新的选择。

Description

与致病力相关的灰霉菌基因Bcmet16及其应用

本申请为申请号202010082092.8、申请日2020年2月7日、发明名称“与致病力相关的灰霉菌基因Bcmet3和Bcmet16及应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及农业防治技术领域，尤其是通过敲除Bcmet16基因防治灰霉菌侵染果实的方法。

背景技术

灰霉菌(Botrytis cinerea)是一种典型的致死型病原菌，它侵入宿主体内后通过引发宿主细胞程序性死亡，被灰霉菌侵染的果实出现明显的腐烂，灰霉菌可以侵染200多种植物，如草莓、番茄、葡萄和蔬菜等，对双子叶植物寄主成熟或衰老组织的破坏性最大。当宿主的生理发生变化且环境不利于灰霉菌萌发生长时，这种真菌在组织腐烂之前可以保持相当长时间的静止，因此，农作物从苗期到产品成熟，灰霉菌的侵染都有可能发生，在收获看似健康的作物后，在采后贮藏阶段仍然可能会发生严重腐败损害。采收后的果蔬在零售链中，包括储存、运输到遥远的市场或在零售商展示期间都会爆发灰霉病，在农业生产中的采前和采后阶段都造成巨大经济损失。

在防治灰霉病的措施中，使用杀菌剂是控制灰霉菌的最常用方法。杀菌剂的使用所引发的最大的问题是灰霉菌的抗药性越来越强，目前相当一部分真菌种群对杀菌剂具有抗药性，这种多药耐药主要是由于ABC转运体基因表达增加所引起的(Leroch,M.,Kretschmer,M.and Hahn,M.(2011)Fungicide resistance phenotypes of Botrytiscinerea isolates from commercial vineyards in South WestGermany.J.Phytopathol.159,63–65.)。

在新型的灰霉菌防控手段中，针对灰霉菌中的特定蛋白或基因开发新的生物防控制剂已取得初步进展。如邱德文等人提供了一种采用灰霉菌分泌型蛋白激发子BcXyl1蛋白来诱导果蔬自身抗病性的方法，从而减少灰霉病的发生(专利申请号201811041393.5)。

灰霉菌的基因组已经被通过测序明确，结合目前一系列的分子操纵手段(如基因敲除、基因沉默等)，可以对灰霉菌的致病机理进行深入探究，以期待寻找有效的防治灰霉菌的作用靶点。如专利文献CN 109467594 A公开了Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控灰霉菌致病力与分生孢子产生中起到重要作用，可以作为防控灰霉的新的靶标位点进行应用；专利文献CN 106497943A公开了灰霉菌的致病基因BcSEP5所编码的蛋白可以作为靶标在设计和筛选抗灰霉菌药剂中应用。

发明内容

本发明的目的在于提供与灰霉菌致病力相关的基因，以此作为作用靶点实现果实灰霉病的防治。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明采用基因敲除技术敲除灰霉菌的硫同化基因Bcmet16对灰霉菌自身硫代谢途径进行干扰，发现其不会影响真菌的正常生长，但会显著降低灰霉菌的侵染能力，表明该基因与灰霉菌致病相关。

本发明提供了Bcmet16基因在降低灰霉菌致病性中的应用，所述应用为通过敲除Bcmet16基因来降低灰霉菌的侵染性，所述Bcmet16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明证明了Bcmet16基因的缺失，导致灰霉菌致病力显著降低，表明Bcmet16基因是灰霉菌引起作物灰霉病的重要基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉菌病的发生。

本发明提供了Bcmet16基因或其编码的蛋白质作为靶标在制备抗灰霉病药剂中的应用，所述Bcmet16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种防治植物灰霉病的方法，包括通过敲除核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的Bcmet16基因来降低灰霉菌的侵染能力。

所述植物为番茄果实。

本发明具备的有益效果：

本发明研究首次表明Bcmet16是影响灰霉菌致病的重要基因，通过敲除这个基因可显著降低灰霉菌的侵染能力。Bcmet16基因可以作为靶标在设计和筛选抗灰霉菌药剂或其他处理中应用，为开发新型杀菌剂提供新的选择。

附图说明

图1为基因敲除菌株ΔBcmet3的构建原理图。

图2为Bcmet3基因缺失突变体的PCR验证电泳图，其中Δmet3为Bcmet3基因敲除菌株，B05.10为野生型灰霉菌。

图3为Bcmet16基因缺失突变体的PCR验证电泳图，其中Δmet16为Bcmet16基因敲除菌株，B05.10为野生型灰霉菌。

图4为Bcmet3、Bcmet16基因回补的PCR验证电泳图，其中pBcmet3、pBcmet16为回补菌株。

图5为PNAN-OGG质粒酶切位点示意图。

图6为ΔBcmet3和ΔBcmet16灰霉菌的孢子萌发情况。

图7为ΔBcmet3和ΔBcmet16灰霉菌的菌丝生长情况。

图8为基因敲除菌株ΔBcmet3和ΔBcmet16与野生型菌株侵染番茄果实能力对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1灰霉菌硫代谢缺陷型菌株ΔBcmet3和ΔBcmet16的构建与基因回补

1.1敲除载体构建

Bcmet3基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和Bcmet16基因(核苷酸序列如SEQID NO：2所示)是灰霉菌同化外界无机硫(硫酸根离子)通路上两个关键基因，本实验通过将这两个基因沉默，以探究影响硫同化对该真菌侵染果实的影响。

本案例以同源重组的方法构建转化片段，并以潮霉素磷酸转移酶(HPH)为筛选标记。如图1所示，以Bcmet3(Bcmet16)基因为例，首先，利用引物对P1/P2和P3/P4分别从野生型菌株B05.10基因组DNA中扩增出位于Bcmet3上游1409bp(1214bp)和下游1362bp(609bp)的侧方片段(引物见表1)。随后，用引物对P5/P6从pKHT质粒中扩增出含有trpC启动子的1764bp HPH cassette(耐潮霉素B)。然后将两个Bcmet3侧翼片段以1:1:3的摩尔比与HPHcassette混合，作为融合PCR的模板，体系：4μl融合模板，2μl dNTP(2.5mM)，2.5μl 10×PCRbuffer，15.25μl ddH₂O，0.25μl Taq聚合酶。程序如下：94℃2min，94℃30s，58℃10min，72℃5min，10到15个循环，终延伸72℃10min。利用引物对P7/P8从融合PCR产物中扩增出3479bp(3320bp)DNA片段，用于转化野生型菌株B05.10原生质体。

表1

1.2原生质体转化

灰霉菌菌株将PDA培养2-3天，取菌落边缘菌碟(8碟/100mL)接种于YEPD培养液(10mg/mL蛋白胨，3mg/mL酵母提取物，20mg/mL葡萄糖)中。25℃175rpm，16h/8光暗交替培摇1天，用无菌过滤器收集新鲜菌丝，用平衡缓冲液(0.6MKCL；50mM CaCl₂)洗两次。然后，放入15ml 1.5％lyases细胞壁裂解缓冲液(0.6M KCl,50mM CaCl₂)中，置于摇床，30℃、85rpm培养60-90min后，将酶液过滤，除去菌丝，用平衡缓冲液冲洗两次，收集滤液，1500rpm离心5min。滤液中的原生质体用STC缓冲液(0.8M山梨醇，0.05M Tris,pH 8.0,50mm CaCl₂)重悬并离心2次，STC溶液重悬原生质体，其浓度调至2x10⁸个/mL，并加入SPTC稀释(STC:SPTC＝4:1)(SPTC：40％PEG6000的STC溶液STC,w/v)，冰上待用。

取100μL原生质体悬浮液、30μg的DNA和5μL肝素钠(5mg/mL)溶液加入到转化管中，轻轻混匀，冰育90分钟；加入1mLSPTC溶液，混匀，25℃放置30min。原生质体混合液加入至200mL冷却至43℃的再生培养基(1g/L酵母提取物,1g/L酪水解干酪素,274g/L蔗糖和16g/L琼脂粉)中，摇匀，倒平板(每个20mL)，25℃培养12-16h；覆盖10mL含筛选药剂(100mg/mL潮霉素B)的选择培养基(同再生培养基，仅以琼脂糖10g代替琼脂粉16g)，25℃培养4-10天；挑选转化子于筛选药剂(100mg/mL潮霉素B)的PDA平板上，25℃培养1-2天，挑转化子用于PCR检测。验证Bcmet部分片段(P11/P12)、验证片段1(P10/P13)以及验证片段2(P9/P14)，如图2、3所示。

1.3 Bcmet3、Bcmet16基因回补

以灰霉菌B05.10 cDNA为模板，利用引物P15/P16进行PCR扩增得到目的Bcmet3(Bcmet16)基因片段。用NotⅠ酶切开PNAN-OGG质粒(如图5)，将其与目的基因用无缝克隆试剂盒(EVERBRIGHT，US)进行融合完成定向克隆并转化至感受态大肠杆菌中，将感受态大肠杆菌均匀涂布于含Amp抗生素的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含抗生素的LB液体培养基中扩培，取1μL进行菌落PCR鉴定，鉴定正确送样进行测序。将测序正确的质粒扩配，提取质粒，利用ApaⅠ和SacⅡ酶将质粒切开，用凝胶电泳分离，切取含目的基因的片段进行DNA回收，用于转化突变型菌株原生质体。

原生质体转化同上所示，以Bcmet3为例，将Bcmet3突变菌株采用PDA培养制取原生质体，取100μL原生质体悬浮液、30μg上述回收DNA片段和5μL肝素钠混匀转化，摇匀，筛选药剂为100mg/mL诺尔斯菌素，挑转化子用于PCR检测，验证引物为P17/P18，如图4所示。

实施例2ΔBcmet3和ΔBcmet16灰霉菌对孢子萌发及菌丝生长2.1实验材料

1)供试病原菌：灰霉菌菌株(Botrytis cinerea,B05.10)由本实验室保存使用、ΔBcmet3和ΔBcmet16由实施例1得到，采用PDA进行培养，本案例所用孢子都为PDA培养基培养四代以内。

2)供试药剂：PDB培养基(马铃薯葡萄糖肉汤培养基，美国BD公司)2.2实验方法

用刮板刮取成熟新鲜平板孢子(PDA培养基培养10-12天)，然后用2mL 0.01％Triton X-100的无菌水溶液冲洗，将洗下来的孢子液倒入15mL离心管中，再反复冲洗2次，所得菌液全部倒入离心管中，26℃涡旋震荡5min，以脱脂棉过滤得到孢子悬浮液，采用血球计数板计数灰霉菌孢子，稀释至1×10⁷CFU/mL备用。

吸取40μL孢子悬浮液于细胞培养皿(35mm*10mm)中，并加入3mL PDB培养基中，混匀后，用封口膜密闭封口，置于26℃培养箱中。培养5h进行拍照，用于测定孢子萌发率，培养9h进行拍照，用于测定菌丝长度。

孢子萌发率测定：5h后光学显微镜下随机选取9个视野进行拍照(放大倍数为125)，然后利用显微镜capture软件对视野内的各个孢子进行测定和统计，每个视野内的孢子个数在30个左右，取每个视野的平均孢子萌发率作为一个平行。孢子萌发的判定：菌体伸长为孢子平均轴向长度(约41μm)两倍以上视为萌发(>82μm)；孢子萌发率＝视野内萌发的孢子个数/视野内所有的孢子个数。

菌丝长度测定：9h后光学显微镜下随机选取9个视野进行拍照(放大倍数为125)，然后利用显微镜capture软件配套的图像测量软件对视野内的各个菌体轴向总长度进行测量和统计。每个视野内的菌体个数在30个左右，取每个视野的平均菌体长度作为一个平行。

整个实验独立进行两次重复。

2.3结果分析

野生型菌株和基因敲除菌株的孢子萌发如图6所示。利用PDB培养基培养5h后孢子萌发率无显著性差异，结果表明Bcmet3和Bcmet16基因敲除后对灰霉菌的孢子萌发无显著性差异，不影响灰霉菌孢子的萌发。

野生型菌株和基因敲除菌株的菌丝生长长度如图7所示。利用PDB培养基培养9h后菌丝生长长度无显著性差异，结果表明Bcmet3和Bcmet16基因敲除后对灰霉菌的菌丝生长无显著性差异，不影响灰霉菌的菌丝生长。

实施例3ΔBcmet3和ΔBcmet16灰霉菌侵染果实实验

3.1实验材料

番茄果实，樱桃番茄“新太阳”(Solanum lycopersicum L.cv XinTaiyang)，于本地田间新鲜采摘，80％成熟度，采摘后3h内运动到实验室，果实用0.5％次氯酸钠浸泡4min进行表面杀菌，再用清水浸泡2min清洗2次，自然风晾干后待用。

灰霉菌菌株(Botrytis cinerea,B05.10)由本实验室保存使用，采用PDA进行培养。

3.2灰霉菌侵染番茄果实

野生型灰霉菌B05.10(WT)用PDA培养基培养10-12天，产生孢子。

采用果实接种法，评价突变菌株致病力变化情况。刮取灰霉菌孢子，用Triton X-100无菌水溶液洗脱并过滤菌丝得到孢子悬浮液，采用血球计数板计数灰霉菌孢子，调整孢子悬浮液浓度为4×10⁵CFU/mL。将突变菌株ΔBcmet3和ΔBcmet16以及回补菌株接种至果实上，用野生型灰霉菌(WT)作为对照。将处理好的果实去除果梗，在无菌条件下，于超净台中先将番茄果实进行伤口处理。用注射器针头在番茄果实赤道部位打2×2×2mm的小孔，接种5μl孢子悬液置伤口处，放置30min晾干。将果实放置于灭菌的托盘中，放置于23℃湿度90％培养箱培养8d，用游标卡尺，采用十字交叉法测量果实表面病菌生长的直径，每组20个果实，试验重复3次。用菌斑直径大小来评价评价突变菌株的致病力。

实验结果如图8所示，在番茄表面处理的三种菌在处理期内的菌斑大小均有明显的增长。在day3及以前，所有样本都未观察到菌斑的生长，从day 4开始可以观察到接种ΔBcmet16与WT的样本出现菌斑，而ΔBcmet3的菌斑从day 5开始才能被观察到，然而它在day7至day8的时间内菌斑直径快速增长。三种菌斑中，始终为WT的菌斑最大，ΔBcmet16次之，ΔBcmet3最小，且差别均达到统计学显著水平(P<0.05)。在接种8天后，ΔBcmet3菌株所引起的果实菌斑大小较WT菌株所侵染果实菌斑降低37.5％，ΔBcmet16菌株组降低12.5％。结果表明：在番茄果实上，突变菌株的菌斑直径显著小于野生型菌株，突变菌株致病力均显著下降。

综上所述，Bcmet 3和Bcmet16能影响灰霉菌侵染番茄果实的能力。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 与致病力相关的灰霉菌基因Bcmet16及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1722

<212> DNA

<213> 灰霉菌(Botrytis cinerea)

<400> 1

atggcaaact ctcctcatgg cggtgtcctc aaagatcttc tcgcaagaga tttgtcaaga 60

cacaacgaac ttgcaacaga ggccgaaact cttcccgctg ttgttctctc tgagagacaa 120

ctttgcgatc tcgaattgat tttgagtggt ggtttctctc cccttgaagg ttttatgacc 180

gagaaggact acaatggtgt cgttgagaac aaccgattgg cagatggcaa cgtcttcagt 240

atgccaatta cactcgatgt ctcccaagaa caaattgagg agttaggaat taaagcagga 300

gcaagagtta ctcttcgtga tttccgtgac gacagaaacc ttgcaattat caacgtcgag 360

gatgtttaca gacccaacaa ggagaaggaa gccaaggagg ttttcggtgg tgatgccgat 420

caccctgcag ttaaatactt atacaacacc gcagctgaat tctacgttgg aggaaagatt 480

gacgccatca accgtttaga acattacgat tatgttgctt tgagatatac ccccgcagaa 540

atgagacttc acttcgacaa gctcggctgg tccaaggttg tcgcattcca aaccagaaac 600

cctatgcaca gagcccacag agagttgacc gttcgtgccg ctagagctcg tcaagccaac 660

gttcttatcc acccagtcgt cggtcttacc aagccaggtg atattgacca tttcacccgt 720

gtccgtgttt accaggcact tcttcctaga taccccaacg gaatggccgt tcttggtctt 780

cttcctctcg ccatgcgtat gggtggacct cgtgaggctg tttggcacgc cattatcaga 840

aagaactacg gtgccacaca tttcattgtc ggacgtgatc acgccggacc aggaaaaaac 900

agcaagggag aggaattcta tggtccatat gacgctcaat acgctgttga gaagttcaag 960

gacgagctcg gaattgaggt tgttcctttc caaatgatga cttacctccc agatagcgac 1020

gaatatagac caaaggacga ggtcccacaa ggtacccgta ctctcgacat ctccggaact 1080

gagcttcgtt ctagacttcg ctctggtcgt gagattccag aatggttttc ttacccagag 1140

gttgtccgtg ttcttagaga atctcaccca cctcgttctg ctcaaggttt caccgtattc 1200

cttactggtt accacagctc tggtaaagac gcaattgctc gtgctttgca aactaccctc 1260

aaccaacaag gtggacgttc cgtctcactt ttattgggtg agactgttcg cgccgagctt 1320

tcctccgaac ttggcttcag ccgtgctgat agaacccgca acatcggccg cattgcattc 1380

gttgcttccg agttgacccg ttccggtgct gccgtcattg ctgcaccaat tgcaccatac 1440

gaagacgctc gcaagcacgc tcgtgaaatg gttgagaagt atggtgactt ctacctcgtt 1500

cacgttgcta ccagtcttga gcactctgag aagatcgaca agaagggtgt ctacgccaag 1560

gctcgtaacg gcgaaatcaa gggtttcact ggtgttgatg atccttatga gatcccttcc 1620

aaggctgact tcactgttga tatcgagaag accagtgtca gaaatgctgt tcactcgatc 1680

attttgatgt tggagagcgc gggtttgttg gatcgtctat ag 1722

<210> 2

<211> 927

<212> DNA

<213> 灰霉菌(Botrytis cinerea)

<400> 2

atgggacacc accgcgaatc atctgcctcg aatcacgagt cgggatatgc ttctggagca 60

tcttctcaag gctctcttcc ccaaatcgtc ctcacaaagc ctcacctcaa gttcatcaat 120

gcatcactca acaaccttca acccatagac attctccgat gggccaaaat aacctttcca 180

aacctctacc aaaccactgc ttttggagta acaggtcttg tcacacttga catgttaagt 240

aagcttcaaa aggaaacacc agagctacca agcgtcgatg ctatcttcct tgacaccttg 300

tatcacttca acgaaacact tgaattggtt gagaagacca agactaaata cccaaacgta 360

aacttgcatg tttataagcc agaaggttgc caaaatgttg gagagttcga gggaaagcat 420

ggtaaagagc tatggaagac caacgccgat ttgtatgatt gggttgccaa ggtcgaaccc 480

gctcaacgag catacagtga gttagatgtt gctgcagtct tgactggcag aagaagaagt 540

caaggtgcaa agagagagag cttggacatc gtcgaggtgg acgaagctgg cttgattaag 600

atcaaccctt tggcaggatg gagcttcaag gaggtacaaa actatatcaa ggagaatgat 660

gtcccataca acgacttgtt ggatcgtgga tacaagagtg ttggagattg gcactcaact 720

gagccagtaa aggaagggga ggacgaacgt gctggaagat ggaagggcac tgagaagacc 780

gagtgcggaa ttcacaacaa acgatcgaag tatgcacaat acctgtacga aatggaacaa 840

aagaaacaac aagaggaact ttccgcagca ttggaaaagg tccaggttag ggaagggaag 900

attgaaaaca ttactgtcgg ggtttaa 927

Claims (2)

1.Bcmet16基因在降低灰霉菌致病性中的应用，其特征在于，通过敲除灰霉菌中的Bcmet16基因来降低灰霉菌的侵染性，所述Bcmet16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种防治番茄果实灰霉病的方法，其特征在于，包括：通过敲除灰霉菌中核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Bcmet16基因来降低灰霉菌的侵染能力。

Images