CN113249229B

CN113249229B - 一种假瓶霉属内生真菌p-b313及其应用

Info

Publication number: CN113249229B
Application number: CN202110529926.XA
Authority: CN
Inventors: 林福呈; 苏珍珠; 朱加楠
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2041-05-14
Also published as: CN113249229A; US20220361506A1

Abstract

本发明公开了一株假瓶霉属内生真菌P‑B313及其应用，属于微生物应用领域。所述内生真菌菌株P‑B313的保藏号为CCTCC M 2021504，分类命名假瓶霉Pseudophialophora sp.。内生真菌菌株P‑B313能够提高水稻对苗叶瘟的抗病性，防治效果达到87.56％，病情指数下降了62.59。内生真菌P‑B313对水稻苗叶瘟的生物防治作用在农业领域内的推广应用具有巨大价值。

Description

一种假瓶霉属内生真菌P-B313及其应用

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术领域，具体涉及一株假瓶霉属内生真菌菌株P-B313及其在防治水稻苗叶瘟中的应用。

背景技术

稻瘟病又名稻热病，是世界性重要稻病，与纹枯病、白叶枯病被列为水稻三大病害。该病为通过气流传播的流行病，对水稻生产威胁极大，危害程度因品种、栽培技术以及气候条件不同有差别，一般减产10％-20％，局部田块绝收。稻瘟病在整个水稻生育期都会发生，根据受害时间不同和部位不同，可以分为苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、苗叶瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等,其中苗叶瘟对产量影响最大。

目前，预防该病发生的最经济有效的途径是种植水稻抗病品种。但是长期种植抗病基因单一的水稻品种，抗病性会因为病菌小种变异或适应而丧失，造成病害再次流行。此外，化学药剂防治也是防治稻瘟病的常用方法。但是，长期过量使用化学农药不仅提高水稻生产成本，而且还会造成稻米质量安全与生态环境的污染。因此，寻求高效、环保、绿色、安全的生物防治措施已成为植物病害防控的研究热点。

生物防治是利用有益微生物对病原菌产生各种不利作用(例如，抗菌，溶菌、竞争、重寄生等)，降低病原菌的数量或致病性；同时，用于生物防治的有益微生物还能诱导植物抗病性增强，提高植物免疫力，延缓、减轻或者抑制病害的发生。

在自然生态系统中藏匿着大量的有益微生物，其中植物内生真菌就是其中之一。植物内生真菌是指至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌，普遍存在于生态系统中，且与宿主植物进行着非常稳定的长期互作关系。在植物内生真菌与寄主形成互惠共生关系的过程中，一方面植物内生真菌从寄主中获取水分、矿物营养等生长所需的养分，另一方面植物内生真菌赋予植物丰富多样的生物学功能，例如促进植物生长，提高植物生物量，增强寄主植物的抗生物和非生物胁迫的能力。

申请号为201910044093.0的发明专利公开了内生真菌菌株R5-6-1在防治水稻白叶枯病中的应用。目前尚无报道指出野生稻内其他内生真菌菌株在防治水稻苗叶瘟方面的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一株野生稻内的内生真菌，该菌株能够提高水稻对稻瘟病的抗病性，实现水稻苗叶瘟的防治。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明从云南疣粒野生稻根系中分离到一株假瓶霉内生真菌，其ITS序列如SEQID No.1所示，主要生物学特征为：在PDA平板上菌落生长缓慢，25℃生长10天后菌落直径达6cm；气生菌丝不发达，匍匐状贴于培养基表面，菌落呈白色；菌丝宽0.5-4.0μm，有隔膜；分生孢子梗单生，不分支；分生孢子椭圆形或哑铃型，顶端有突起，有隔膜，隔膜数0-1个，11-15×3.5-6.5μm。鉴定该菌株属于假瓶霉。于2021年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC M 2021504，分类命名为假瓶霉Pseudophialophora sp.。

假瓶霉属内生真菌P-B313菌株培养条件：将内生真菌P-B313菌丝接种于PDA固体培养基，25℃黑暗培养5-7天。

本发明研究发现将内生真菌菌株P-B313定殖于水稻根部组织后，对水稻苗期苗叶瘟的防治效果达到87.56％。

因此，本发明提供了假瓶霉属内生真菌P-B313在防治水稻稻瘟病中的应用。

所述应用包括：将假瓶霉属内生真菌P-B313定殖于水稻根部组织。

进一步的，所述应用包括：水稻种子萌发后与假瓶霉属内生真菌P-B313共培养，使其定殖于水稻苗根部，以提高水稻苗期对苗叶瘟的抗性。

作为优选，水稻种子经表面消毒后于22-25℃条件下萌发。具体方法：将水稻种子去壳，用1％的NaClO表面消毒15分钟，用无菌水清洗3次。再将消毒后的种子放在1/2MS培养基上，在恒温培养箱培养2-3天，待其萌发。

作为优选，种子露白后移入1/2MS培养基，同时接入假瓶霉属内生真菌P-B313菌饼。

作为优选，共培养的条件为：22-25℃下培养15-20天，每天光照16h，暗培养8h。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了一株能够提高水稻对稻瘟病抗病性的假瓶霉属内生真菌P-B313。将内生真菌P-B313菌株与水稻共培养，使其定殖于水稻苗根部，减少稻瘟病菌产生的叶部危害，增强水稻苗期对苗叶瘟的抗病性，对照组病情指数为71.48，P-B313菌株处理组病情指数为8.89，病情指数下降了62.59，防治效果达到87.56％。内生真菌P-B313对水稻苗叶瘟的生物防治作用在农业领域内的推广应用具有巨大价值。

附图说明

图1为假瓶霉P-B313菌株菌落形态图。

图2为假瓶霉P-B313菌株在电子显微镜下分生孢子形态。标尺为2μm。

图3为假瓶霉P-B313菌株在光学显微镜下分生孢子形态。标尺为10μm。

图4为假瓶霉P-B313菌株在光学显微镜下菌丝形态。标尺为10μm。

图5为假瓶霉P-B313菌株在水稻根部的定殖。标尺为50μm。其中A为P-B313菌株与水稻的共培养；B为接种P-B313菌株的根系横切面在光学显微镜下的示意图；C为接种P-B313荧光标记菌株的根系横切面在共聚焦显微镜下的示意图；D为接种P-B313菌株的根系纵切面在光学显微镜下的示意图；E为接种P-B313荧光标记菌株的根系纵切面在共聚焦显微镜下的示意图；F为D图和E图的拼合图。

图6为假瓶霉P-B313菌株对水稻苗叶瘟的防效。其中A：P-B313菌株处理组和对照组叶片稻瘟病发病情况；B：P-B313菌株处理组和对照组水稻苗叶瘟病级指数频率分布；C：P-B313菌株处理组与对照组的苗叶瘟病情指数，图中数据为平均数±标准误。显著水平(t-test)：****P<0.0001。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。若无特别说明，实施例中采用的技术手段均为常规技术手段，原料、试剂均为市售商品。

实施例1假瓶霉菌株P-B313的分离及鉴定

一、P-B313菌株的分离纯化

P-B313菌株分离自云南疣粒野生稻根系。首先，用自来水连续冲洗野生稻根系，仔细去除土壤颗粒和附属物。选取健康根组织，进行表面消毒处理，75％乙醇浸泡1-2min，1％次氯酸钠4-5min，再用无菌去离子水清洗3次。将根组织块切成0.5cm小段，然后放入2％麦芽粉琼脂培养基(MEA，malt extract agar，OXOID；加入50mg/L的氯霉素抑制内生细菌的生长)平板上孵育，25℃黑暗培养。培养至第5天，从组织切口边缘处长出内生真菌菌丝，用接种针小心将其挑出后转接到新鲜PDA培养基上纯化培养并记录菌株编号P-B313。

二、菌株鉴定

1、形态鉴定

P-B313菌株经过分离纯化后，接种到PDA培养基上，25℃培养7天。用挑针挑取少量菌体，制成玻片，在显微镜下观察，测量，拍照。菌落生长状态如图1所示，分生孢子形态如图2所示。

其形态特征为：在PDA平板上菌落生长缓慢，25℃生长10天后菌落直径达6cm；菌落为白色，菌丝束呈轮状螺旋，气生菌丝不发达。分生孢子梗单生，不分支；分生孢子椭圆形或哑铃型，有突起(图3)；菌丝宽0.5-4.0μm(图4)。

2、分子鉴定

(1)DNA提取

①在PDA平板上25℃培养P-B313菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μL提取缓冲液(1M KCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH＝8.0)1.5mL离心管中；

②用电磨机研碎，剧烈震荡2min；

③10000rpm离心10min；

④吸取上清液，转移至另一新的离心管中，弃沉淀；

⑤在上清液中加入等体积的异丙醇(分析纯)，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min，沉淀核酸；

⑥轻轻倒去上清液，将含有沉淀的离心管倒置在吸水纸上排干水分；

⑦再加入300μL 70％乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min；

⑧轻轻倒去上清液，重复步骤⑦一次；

⑨将离心管倒置在吸水纸上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；

⑩用50μL ddH₂O重悬沉淀，得到P-B313基因组DNA，浓度达到30ng/μL。

(2)真菌ITS rDNA基因的PCR扩增

PCR扩增在50μL反应体系中进行，体系中含有：上下游引物各2μM，dNTPs 200μM，MgCl₂ 1.5mM，10×PCR buffer 5μL，模版DNA 2μL，Taq酶2U。

上游引物ITS1序列为：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，

下游引物ITS4序列为：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行。反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。

(3)PCR产物的回收纯化

PCR反应结束后，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行，步骤如下：

①将50μL PCR产物全部加到1％的琼脂糖凝胶的点样孔中，按5V/CM的电泳条件电泳30min；

②电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管中，称重；

③按照1mg凝胶加入3mL的DE-A缓冲液的标准，加入DE-A缓冲液到收集凝胶的2mL离心管中，75℃保温10min，期间振荡数次，至完全融化；

④加入0.5倍DE-A体积的DE-B缓冲液，混合均匀；

⑤将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃上清；

⑥将DNA制备管放回2mL离心管中，加500μL缓冲液W1，12000rpm离心30s；

⑦将DNA制备管放回2mL离心管中，加700μL缓冲液W2，12000rpm离心30s；

⑧重复步骤⑦一次；

⑨将DNA制备管放回2mL离心管中，12000rpm离心2min。以排干膜上洗涤液；

⑩将DNA制备管放回2mL离心管中，加50μL的ddH₂O，10000rpm离心1min，洗脱DNA置-20℃下保存。

(4)基因的测序和序列分析

经电泳检测后的已经纯化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID No.1所示的长度为558bp的DNA片段序列。

在NCBI网站上，将测得的核苷酸序列用BLAST在GenBank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。经过BLAST比对，该序列与登录号为MK808146和MK808157的序列覆盖率分别为96％和95％，相似度分别达到99.44％和99.25％。这两个序列都是来自假瓶霉属(Pseudophialophora sp.)的ITS rDNA。

上述分子鉴定与形态鉴定结果表明，新分离的菌株属于假瓶霉属真菌，因此，将其命名为假瓶霉Pseudophialophora sp.P-B313。于2021年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC M 2021504。

实施例2

供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，CO39。

1、P-B313菌株培养

将保存于滤纸片上的P-B313菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d，备用。

PDA培养基：每升含葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂15g。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。

2、P-B313菌株与水稻根部共培养

将水稻种子去壳后放置在三角瓶中，用1％的NaClO表面消毒15min，用无菌水清洗3次后备用。将消毒后的种子均匀平铺在1/2MS(Murashige and Skoog)培养基上，用Parafilm封口膜封口，置于25℃植物培养箱(16h光照/8h黑暗)。3天后种子露白，将其移入含1/2MS培养基的组培瓶中，每瓶10颗种子。同时接入3块P-B313菌饼(直径为0.5cm)。对照组为无菌PDA琼脂块。设3个重复。待水稻苗长至三叶一心期(15-20天)，观察根部内生真菌根部定殖(图5)，叶部用于接种稻瘟病菌。

3、稻瘟病菌分生孢子的喷施

将稻瘟病菌菌株Guy11接种于CM固体培养基中，25℃光照培养10-12天。用无菌水将Guy11分生孢子洗下，三层滤纸过滤，配置成孢子悬浮液，浓度为1×10⁵。随后，配置0.4％明胶溶液，按体积比1:1与孢子悬浮液混合，使稻瘟病菌孢子悬浮液终浓度为5×10⁴。

CM培养基(1L)：Yeast Extract(1g)，Casamino acid(1g)，D-glucose(10g)，KH₂PO₄(1.52g)，NaNO₃(6g)，Peptone140(2g)，KCl(0.52g)，MgSO₄·7H₂O(0.52g)，0.1％(v/v)Vitamin solution，0.1％(v/v)Trace Element。用NaOH调节PH至6.5，固体培养基中加入15g/L琼脂。采用高压蒸汽灭菌，条件为121℃，15min。

用喷雾器将孢子悬浮液均匀地喷洒到水稻苗叶片上，每瓶用量1ml。然后，将组培瓶置于25℃植物培养箱，黑暗培养2天。2天后，补充光照，16h光照/8h黑暗，培养4-5天，记录叶片发病等级，统计病情指数。

结果如图6所示，对照组苗叶瘟发病严重，叶片发病等级主要集中在7-9级，病情指数为71.48；P-B313菌株处理组苗叶瘟发病显著降低，大多数叶片发病等级为0-1级，病情指数为8.89，与对照组相比，病情指数下降了62.59，防治效果达到87.56％。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种假瓶霉属内生真菌P-B313及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> Pseudophialophora sp.

<400> 1

tgcctgcgga gggatcatta tcgagttgca aaactctaac cctttgtgaa catacctcag 60

tcgttgcttc ggcggtggac ggcctgtttt tcggaacggc cggaagccgc cggaggttcc 120

aaactcgtat tttttagtgt atctctgagc ctgaaaacaa ataatcaaaa ctttcaacaa 180

cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat 240

tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgccg gtattccggc 300

gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc ctcaagccca gcttggtgtt ggggcacccg 360

gccgcctggc cggcccgggg ccctcaagtg tatcggcggt ctcgtcggga ctctgagcgc 420

agtaactcgc ggtaaaacgc gcttcgcttg gtctgtctcc ggcgggctcc ggccgctaaa 480

cccccctctc tcccagagtt gacctcggat caggtaggat tacccgctga acttaagcat 540

atcaataagc cggaggaa 558

Claims

1.一种假瓶霉属内生真菌P-B313，其特征在于，其保藏号为：CCTCC M 2021504，分类命名为假瓶霉(Pseudophialophora sp.)。

2.如权利要求1所述的假瓶霉属内生真菌P-B313，其特征在于，该菌株的ITS序列如SEQID No.1所示。

3.如权利要求1所述的假瓶霉属内生真菌P-B313，其特征在于，该菌株在PDA平板上25℃生长10天后菌落直径达6cm；气生菌丝不发达，匍匐状贴于培养基表面，菌落呈白色；菌丝宽0.5-4.0μm，有隔膜；分生孢子梗单生，不分支；分生孢子椭圆形或哑铃型，顶端有突起，有隔膜，隔膜数0-1个，11-15μm×3.5-6.5μm。

4.如权利要求1所述的假瓶霉属内生真菌P-B313在防治水稻稻瘟病中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将假瓶霉属内生真菌P-B313定殖于水稻根部组织。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：水稻种子萌发后与假瓶霉属内生真菌P-B313共培养，使其定殖于水稻苗根部，以提高水稻苗期对苗叶瘟的抗性。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，水稻种子经表面消毒后于22-25℃条件下萌发。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，种子露白后移入1/2MS培养基，同时接入假瓶霉属内生真菌P-B313菌饼。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，共培养的条件为：22-25℃下培养15-20天，每天光照16h，暗培养8h。