CN111837766A - 复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于柑桔无病毒苗木繁育技术领域，尤其涉及一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法及应用。柑桔黄龙病是全世界柑桔生产中毁灭性的病害，其病原是由难培养的韧皮部杆菌引起。本技术涉及降低病原浓度或控制柑桔苗木中韧皮部杆菌的病原，从而为培育无病毒苗木提供接穗或为茎尖微芽嫁接脱毒提供无毒或低毒的茎尖材料，可以大大提高脱毒效率，为解决柑桔无病毒良种繁育的瓶颈问题提供有效手段。本申请通过复合芽孢杆菌的高强度应用，寻找控制和降低黄龙病病原浓度的方法，为后续的微芽嫁接脱毒工作奠定重要的基础，达到降低母本植株的病原浓度和提高脱毒效果的目的，为产业快速提供安全健康茎尖接穗，进而实现柑橘良种无病化的目的。

Description

复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法及应用
技术领域
本发明属于柑桔无病毒苗木繁育技术领域，尤其涉及一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法及应用。
背景技术
柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)严重阻碍了全球柑橘产业的发展，由于其病原菌离体培养难度较大，导致了黄龙病致病机理的研究进展缓慢，目前，尚未有针对性的防治方法。
柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)，也称黄稍病，是由韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)细菌所引起的植物病害。目前，柑橘黄龙病已经在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲、北美洲的50多个国家发生和流行，且仍有扩张趋势。在美国和巴西，黄龙病对柑橘产业的发展产生了摧毁性的影响，并导致了世界柑橘产量的严重衰减。而在我国的广东、广西、福建、江西等11余处柑橘栽培省、区也正遭受黄龙病的威胁。虽然近几十年来世界各国均开展了大量关于黄龙病方面的研究，加强了相关检疫防控手段，但由于黄龙病在植株体内潜伏期长，致病菌可以离体培养，但难度还比较大。柑橘产业发展正面临着巨大的压力和挑战。
生防菌的生防机制主要包括拮抗作用，竞争作用，重寄生作用，诱导植物抗性，促进植物生长等，生防菌在田间条件下可能是多种机制共同作用，也可能在植株不同发育时期，不同部位某一机制在起作用，以达到抑制病原的生长，繁殖或杀灭病原的效果。拮抗作用指一种微生物在其生命活动过程中产生的次生代谢物质对其他微生物的活性产生抑制甚至杀灭作用。竞争作用指两种或多种微生物争夺生存空间，位点，营养，水分等，生防菌能在植物体内成为优势菌种，从而限制其它致病菌的生长。植物抗性的产生有两种诱导途径，一是系统获得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR)，病原物侵染后，未接种部位诱导出对病原物的抗性；二是诱导系统抗性(Induced systemic resistance,ISR)，非病原物刺激植物后，使植物体产生物理或化学屏障，从而增强了抗性。生防菌也可通过促进植物生长的作用，从而提高植株抗病性。
由于目前针对柑橘黄龙病菌仍未找到十分有效的防治手段，通常采用砍除病树、捕杀木虱控制传播媒介和种植健康无病毒的柑桔苗木进行防治，其中无病毒苗木的应用是非常重要的对策之一，因而，对不断选育的优良品种都需要进行脱毒处理，再进行推广应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法，包括将复合微生物菌剂采用灌根方式对苗木进行处理，所述复合微生物菌剂包括保藏编号为CCTCC NO:M2019874、名称为Bacillus sp.TD2-1，以及保藏编号为CCTCC NO:M2019875，名称为Bacillus sp.TD2-2的两种芽孢杆菌的菌液。
如上述的一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法在控制柑橘苗木黄龙病病害中的应用。
进一步地，所述复合微生物菌剂的制备方法为，挑取TD2-1和TD2-2单菌落，分别在LB培养基中，200rpm，37℃培养，将OD600nm＝1等量的TD2-1和TD2-2各取10ml加20g红糖，加入高压灭菌消毒的麦麸(1KG)+米糠(1KG)+玉米淀粉(0.4KG)+豆粕(0.2KG)中，按料水比1：1混匀后，在30℃固体发酵7d，其间，每天翻动一次，并打碎培养物，在60℃干燥后，用粉碎机将培养物打成细粉，检测活菌数在200亿个/g，待用；使用时按照所需剂量溶解在水中，每株用量0.5L。
进一步地，所述应用包括改善柑橘苗木根系褐变现象，促进根系新生。
进一步地，所述柑橘包括沙糖桔或南丰蜜桔。
进一步地，对沙糖桔的处理方法包括，共进行23次复合微生物菌剂处理，菌剂用量逐级递增，第1-10次处理间隔为15d，其中1-4次的菌剂用量为1.6g/L，5-10次的菌剂用量为2.5g/L，11-15次的菌剂量仍为2.5g/L但处理频率增加至每周一次，15次以后每周处理菌剂量为5g/L。
进一步地，对南丰蜜桔的处理方法包括，共进行15次复合微生物菌剂灌根处理，其中前两次处理间隔时间为20d，菌剂用量为1.6g/L；第3-9次菌剂用量增加至2.5g/L，每隔15d处理；10-15次处理时使用5g/L的菌剂量，每周处理一次。
如上述的对沙糖桔的处理方法或对南丰蜜桔的处理方法在培育柑橘无病毒苗木中的应用。
进一步地，具体包括为无病毒苗木提供接穗或为茎尖微芽嫁接脱毒提供无毒或低毒的茎尖材料。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
柑桔黄龙病是全世界柑桔生产中毁灭性的病害，其病原是由难培养的韧皮部杆菌引起。本申请涉及降低病原浓度或控制柑桔苗木中韧皮部杆菌的病原，从而为培育无病毒苗木提供接穗或为茎尖微芽嫁接脱毒提供无毒或低毒的茎尖材料，可以大大提高脱毒效率，为解决柑桔无病毒良种繁育的瓶颈问题提供有效手段。
本申请旨在通过复合芽孢杆菌的高强度应用，寻找控制和降低黄龙病病原浓度的方法，从而为后续的微芽嫁接脱毒工作奠定重要的基础，以达到降低母本植株的病原浓度和提高脱毒效果的目的，为产业快速提供安全健康茎尖接穗，进而实现柑橘良种无病化的目的。
本申请的试验表明：两个芽孢杆菌复合使用，对减轻柑橘黄龙病症状，降低病原浓度或去除病原有明显的效果。TD复合菌剂处理能使根系褐变症状显著地得到改善。使用TD菌剂后，苗木根冠发达，新根增多。本实验发现沙糖桔经TD菌剂处理23次后，采取叶片样本，经qPCR和PCR两种方法的分子检测，综合两种检测方法的结果，表明：植株的阳性率由100％下降到25％；经15次处理后，对叶片和枝皮同时进行检测QPCR和PCR检测，感病南丰蜜桔的阳性率也由100％下降至53.33％，表明TD菌剂对抑制植株病原浓度有一定效果。这对于在适当季节，如：在6-9月期间，采集茎尖进行微芽嫁接脱毒处理有着重要的实用价值，这项技术为提高柑桔无病毒苗木的繁育效率提供了有效的方法。
附图说明
图1是16S rDNA片段PCR扩增胶图；
图2是菌株TD2-1和TD2-2的系统发育树；
图3是TD菌剂处理前沙糖桔叶片OI1/OI2C检测结果；
图4是TD菌剂处理后沙糖桔叶片OI1/OI2C检测结果；
图5是TD菌剂处理前南丰蜜桔SS-28叶片OI1/OI2C检测结果；
图6是TD菌剂处理后南丰蜜桔SS-28叶片OI1/OI2C检测结果；
图7是TD菌剂处理前南丰蜜桔SS-28枝皮OI1/OI2C检测结果；
图8是TD菌剂处理后南丰蜜桔SS-28枝皮OI1/OI2C检测结果；
图9是TD菌剂处理前后沙糖桔叶片qPCR检测HLB相对含量变化；
图10是TD菌剂处理前后南丰蜜桔叶片qPCR检测HLB相对含量变化；
图11是TD菌剂处理前后南丰蜜桔枝皮qPCR检测HLB相对含量变化；
图12是TD菌剂处理对柑橘根系生长的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件下，不进行额外的冷却或加热处理。一般常温控制在10～37℃，最好是25℃-35℃。
本发明披露了复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法及应用。本申请发明人筛选了两种对黄龙病病原的防控具有一定效果的芽孢杆菌菌株，复合使用称作TD菌剂，并进行了菌株的分离培养和鉴定，通过16S rDNA基因测序，同源性比对分析，结果表明：菌株TD2-1与贝莱斯芽孢杆菌具有高度的同源性，已于2019年10月30日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2019874，名称为Bacillus sp.TD2-1。菌株TD2-2则与解淀粉芽孢杆菌具有高度的同源性，已于2019年10月30日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2019875，名称为Bacillus sp.TD2-2。
本申请中涉及的沙糖桔(Citrus reticulata Blanco cv.Shatangju)和南丰蜜桔(Citrus reticulata Blanco cv.Nanfengmiju)苗木均隔离种植于微生物工程中心网室大棚内。
本申请受国家重大研发项目2019YFD1001800、国家自然科学基金NO.31872064资助。
本申请的具体实验内容如下实施例所示。
实施例1菌株鉴定
本申请涉及的微生物菌株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供，本实施例中通过16S rDNA扩增，构建表达载体和测序，发现，菌株TD2-1与贝莱斯芽孢杆菌有高度的同源性，TD2-2与解淀粉芽孢杆菌有高度的同源性。
1、菌株分子生物学鉴定
1)细菌基因组DNA的提取
菌株活化后取2ml菌液离心收集菌体，在沉淀中加入350μl含10mg/ml溶菌酶的TE缓冲液，轻柔混匀，37℃孵育30min。之后再参考CTAB法提取细菌基因组DNA。
2)菌株16S rDNA片段扩增
以细菌基因组DNA为模板扩增细菌16S rDNA，正向引物(F27):5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'，SEQ ID NO.1；反向引物(R1492):5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'，SEQ ID NO.2。PCR反应体系和反应条件见表1所示。
表1 16S rDNA片段扩增PCR反应体系和程序
Figure BDA0002604028110000051
3)PCR扩增产物的纯化
用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在紫外灯下将含有目标片段的电泳条带快速完整地切下放入准备好的2ml离心管中，用胶回收试剂盒(康为世纪)回收目的片段。
4)目的片段连接T-载体
按照TaKaRa生物公司购买的pMD18-T Vector说明书要求在200μl离心管中依次加入2μl目的片段，0.5μl pMD18-T Vector以及2.5μl slution1。将上述连接体系于4℃反应6h。
5)重组质粒转化及阳性克隆筛选
A.将酶连产物加入100μl刚解冻的E.coli DH5α感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min。
B.42℃热击30s立即取出再置冰上2min-3min。
C.在感受态细胞中加入900μl LB液体培养基，37℃，180rpm摇床培养1h使感受态细胞活化复苏。
D.活化后的感受态细胞2000rpm离心3min，留下层100μl左右轻轻混匀，涂布于含Amp的固体培养基，置37℃过夜培养。
E.从平板上挑取阳性克隆于200μl含Amp的LB液体培养基中37℃，180rpm培养3h-5h，菌液PCR检测重组子的克隆情况。
F.将符合条件的阳性重组子接种于5ml含Amp的LB培养基中扩大培养。
使用质粒提取试剂盒(康为世纪)提取重组质粒，并对质粒再次PCR验证，最后将含有目的基因的质粒送生物公司测序(上海生工生物工程股份有限公司)。
6)16S rDNA序列分析
根据测序片段大小及两端引物序列初步判断测序结果是否为目的基因，然后将正反向测序结果在DNAMAN上进行拼接得到完整序列。将完整序列在NCBI上进行比对，用MEGE软件对目的基因进行同源比对，最大似然法进行同源性比较。
实验结果：
菌株TD2-1和TD2-2基因组16S rDNA片段克隆产物如图1所示，其中1：无菌水负对照；2-3：菌株TD2-1；4-5：菌株TD2-2；M：DL2000 Marker。结果显示两个菌株的PCR扩增产物在1500bp左右均有明显条带，测序结果显示TD2-1和TD2-2的16S rDNA片段大小分别为1598bp和1601bp。
将测序结果在NCBI数据库上进行序列比对，利用MEGA进行系统进化树的构建，用Clustalx将TD2-1和TD2-2的16S rDNA序列与Bacillus velezensis strain LC1(贝莱斯芽孢杆菌)、Bacillus velezensis strain BIM B-1312D(贝莱斯芽孢杆菌)、Bacillusamyloliquefaciens strain B43-1(解淀粉芽孢杆菌)、Bacillus subtilis strainDSAM02(枯草芽孢杆菌)、Bacillus licheniformis strain H7(地衣芽孢杆菌)、Bacillusaquimaris strainSISI39(沙地芽孢杆菌)、Bacillus thuringiensis strain FayB3(苏云金芽孢杆菌)、Bacillus sp.StrainDJ-1-10(芽孢杆菌DJ-1-10)、Bacillus cereus strainDSAM 01(蜡样芽孢杆菌)、Acetobacter methanolicus(醋酸杆菌)的16S rDNA序列进行比对，结果如图2所示。根据系统发育树的结果显示菌株TD2-1与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensisi)的同源性高度，而菌株TD2-2与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有高度的同源性。
实施例2复合菌剂处理对柑橘黄龙病病源抑制效果研究
混合发酵制备菌剂：挑取TD2-1和TD2-2单菌落，分别在LB培养基中，200rpm，37℃培养，将OD600nm＝1等量的TD2-1和TD2-2各取10ml加20g红糖，加入高压灭菌消毒的麦麸(1KG)+米糠(1KG)+玉米淀粉(0.4KG)+豆粕(0.2KG)中，按料水比1：1混匀后，在30℃固体发酵7d，其间，每天翻动一次，并打碎培养物，在60℃干燥后，用粉碎机将培养物打成细粉，检测活菌数在200亿个/g，待用。使用时按照所需剂量溶解在水中，每株用量0.5L。
1、菌剂处理方案
沙糖桔和南丰蜜桔苗木种植于含有1/3泥碳，1/3蛭石，1/3土壤的塑料大盆中，定时进行土肥水和病虫害管理，处理组和对照组的日常管理一致。TD菌剂的处理采用灌根的方式进行，每次处理前先进行松土。在本实验中沙糖桔一共进行了23次TD菌剂处理，菌剂用量逐级递增，第1-10次处理间隔为15d，其中1-4次的菌剂用量为1.6g/L，5-10次的菌剂用量为2.5g/L，11-15次的菌剂量仍为2.5g/L但处理频率增加至每周一次，15次以后每周处理菌剂量为5g/L。南丰蜜桔共进行了15次TD菌剂灌根处理，其中前两次处理间隔时间为20d，菌剂用量为1.6g/L；第3-9次菌剂用量增加至2.5g/L，每隔15d处理；10-15次处理时使用5g/L的菌剂量，每周处理一次。沙糖桔和南丰蜜桔的对照组分别以清水处理取代。
2、黄龙病检测方法
(1)黄龙病检测引物：引物由上海生工生物工程股份有限公司合成
表2柑橘黄龙病检测引物
Figure BDA0002604028110000071
(2)植物植物总DNA的提取：采样时从柑橘植株东南西北四个不同方位分别采集叶片或枝皮，用CTAB法提取植物总DNA，用核酸蛋白测定仪检测DNA提取浓度和质量，将所有DNA样品稀释成100ng/μL用于后续检测。
(3)常规PCR检测：使用OI1/OI2C和P400+/-两对引物分别进行常规PCR检测，引物序列见表2，反应总体系为10μl，其中包含上下游引物(10μM)各0.1μl、2×PCR mix(翊圣生物科技有限公司)5μl、DNA样品1μl以及3.8μl的ddH2O。反应程序如表3所示，用健康柑橘组织做负对照、分别用pMD18-16S rDNA质粒和pMD18T-P400质粒做正对照。
表3 PCR反应程序
Figure BDA0002604028110000081
(4)实时定量PCR检测：内参基因为植物细胞色素氧化酶基因COX，黄龙病检测引物是根据亚洲韧皮部杆菌核糖体蛋白基因rplJ/rplL的特异性靶序列设计的引物对CQULA04F/CQULA04R，以柑橘愈伤组织的DNA样品作为黄龙病检测的负对照，每个样品设置3个重复，qPCR反应体系和反应程序如表4所示，反应结束后以柑橘愈伤组织为负对照，以感病柑橘组织做正对照，计算样品的2-ΔΔCT值，若结果大于1则认为该样品携带黄龙病病原。
表4荧光定量PCR反应体系和反应程序
试剂 体积(μl) 反应程序
上游引物(10μM) 0.2 1.94℃ 3min
下游引物(10μM) 0.2 2.94℃ 5s
2×SYBR qPCR MIX 5 3.60℃ 30s
DNA 0.5 4.72℃ 35s
ddH<sub>2</sub>O up to 10μl 5.2to 4for 40cycles
6.72℃ 10min
7.40℃ 10s
(5)检测结果分析：黄龙病检测结果结合常规PCR和荧光定量PCR结果综合分析，其中只要有一种检测方法检测结果为阳性，则判断该植株携带黄龙病病原。
3、实验结果分析：
1)黄龙病常规PCR检测结果
TD菌剂处理前沙糖桔叶片OI1/OI2C检测结果见图3，其中TD菌剂处理组样品：图a7:STJ26；8:STJ27；9:STJ30；10:STJ31；12:STJ33；15:STJ36；21:STJ42；图b3:SS-28 47；对照组样品：图b 4:SS-28 49；6-9:STJ53、STJ54、STJ55、STJ56；图a 23:正对照24:负对照；图b 20:正对照21:负对照。
TD菌剂处理后沙糖桔叶片OI1/OI2C检测结果见图4，其中TD处理组样品：2-9：STJ26、STJ27、STJ30、STJ31、STJ33、STJ36、STJ42、STJ47；对照组样品：10-15：STJ49、STJ50、STJ53、STJ54、STJ55、STJ56；17：正对照18：负对照。
TD菌剂处理前南丰蜜桔SS-28叶片OI1/OI2C检测结果见图5，其中TD菌剂处理组样品：图a 17-21：SS-28 16，SS-28 17，SS-28 18，SS-28 19，SS-28 20；图b 1-8:SS-28 22，SS-2823，SS-28 24，SS-28 25，SS-28 26，SS-28 27，SS-28 28，SS-28 29；对照组样品：图a2:SS-282；4:SS-28 4；6:SS-28 6；7:SS-28 7；23：正对照24：负对照。
TD菌剂处理后南丰蜜桔SS-28叶片OI1/OI2C检测结果见图6，其中TD处理组样品：10-22:SS-28 16,SS-28 17,SS-28 18,SS-28 19,SS-28 20,SS-28 22,S-28 23,SS-28 24,SS-28 25,SS-2826,SS-28 27,SS-28 28,SS-28 29；对照组样品1-4:SS-28 2,SS-28 4,SS-28 6,SS-28 7；23:正对照24:负对照。
TD菌剂处理前南丰蜜桔SS-28枝皮OI1/OI2C检测结果见图7，其中TD菌剂处理组样品：图a 18-22：SS-28 16,SS-28 17,SS-28 18,SS-28 19,SS-28 20；图b 1-8:SS-28 22,SS-2823,SS-28 24,SS-28 25,SS-28 26,SS-28 27,SS-28 28,SS-28 29；对照组样品：图a6:SS-282；8:SS-28 4；10:SS-28 6；11:SS-287；23:正对照，24:负对照。
TD菌剂处理后南丰蜜桔SS-28枝皮OI1/OI2C检测结果见图8，其中TD菌剂处理组样品：10-22：SS-28 16,SS-28 17,SS-28 18,SS-28 19,SS-28 20；图b 1-8:SS-28 22,SS-2823,SS-2824,SS-28 25,SS-28 26,SS-28 27,SS-28 28,SS-28 29；对照组样品：1-4：SS-282,SS-28 4,SS-286,SS-28 7；23:正对照，24:负对照。
2)黄龙病qPCR检测结果
TD菌剂处理前后沙糖桔叶片qPCR检测HLB相对含量变化结果见图9，其中TD菌剂处理组样品：STJ26、STJ27、STJ30、STJ31、STJ33、STJ36、STJ42、STJ47；对照组样品：STJ49、STJ53、STJ54、STJ55、STJ56。
TD菌剂处理前后南丰蜜桔叶片qPCR检测HLB相对含量变化见图10，其中，TD菌剂处理组样品：SS-28 16、SS-28 17、SS-28 18、SS-28 19、SS-28 20、SS-28 22、SS-28 23、SS-2824、SS-28 25、SS-28 26、SS-28 27、SS-28 28、SS-28 29；对照组样品：SS-28 2、SS-28 4、SS-28 6、SS-28 7。
TD菌剂处理前后南丰蜜桔枝皮qPCR检测HLB相对含量变化见图11，其中TD菌剂处理组样品：SS-28 16、SS-28 17、SS-28 18、SS-28 19、SS-28 20、SS-28 22、SS-28 23、SS-2824、SS-28 25、SS-28 26、SS-28 27、SS-28 28、SS-28 29；对照组样品：SS-28 2、SS-28 4、SS-28 6、SS-28 7。
黄龙病检测结果结合qPCR和常规PCR的综合检测结果为准(其中一种方法检测结果为阳性即认为该苗木为带病植株)，对初次检测结果为阳性的柑橘苗木进行TD2-1和TD2-2菌剂灌根处理，下表5和6分别列出了经过23次菌剂处理前后沙糖桔叶片带病率变化和经15次菌剂处理前后南丰蜜桔叶片和枝皮阳性带病率变化。
结果表明沙糖桔苗木经TD菌剂处理23次后叶片检测阳性率由100％下降到25％，叶片转阴率达75％；经过15次处理后南丰蜜桔的叶片和枝皮综合阳性率也有所下降，由原来的100％下降至53.33％，而南丰蜜桔对照组叶片和枝皮综合阳性率仍为100％，以上数据说明TD2-1和TD2-2菌剂对降低HLB病原浓度有一定效果。
但对表5中对照组的检测结果的分析可以发现未经菌剂处理的沙糖桔对照组苗木叶片阳性率也在下降，这可能是由于处理后采样时间在8月份温度较高，病原菌沿着植株韧皮部向下部组织移动所导致的。因此在对南丰蜜桔的检测过程中本申请对苗木枝皮也进行了病原检测，由表6可以看到在菌剂处理前，处理组和对照组的叶片阳性检出率分别为60.00％和25.00％，而枝皮的检出率则分别达到了93.33％和100％，经15次处理后，处理组和对照组苗木叶片检出率仅为6.67％和50.00％而枝皮检出率分别是53.33％和75.00％，以上数据结果也表明在对柑橘苗木不同部位进行HLB检测时时可能存在差异，为提高检测准确率可以多部位采样进行检测。
表5沙糖桔HLB检测结果
Figure BDA0002604028110000101
表6南丰蜜桔HLB检测阳性检出率
Figure BDA0002604028110000102
4、TD菌剂处理对柑橘根系生长的影响
图12所示为TD菌剂处理组苗木与对照组苗木根系对比情况，其中，a和b为TD菌剂处理组根系，a：南丰蜜桔SS-28 23；b：南丰蜜桔SS-28 25；c和d为对照组根系，c：南丰蜜桔SS-28 2；d：南丰蜜桔SS-28 4。
从图片中可以明显观察到处理组(图12a和b)与对照组(图12c和d)相比，处理组根系较为发达，颜色较为鲜亮，须根数量多，有较多新生根系，但在根系内膛仍有褐色明显病变根系存在；而对照组苗木根系受黄龙病影响严重，颜色暗淡，大量根系腐烂脱落、坏死衰退，仅有少量侧根上有须根附着，且所有侧根几乎没有新生根系。TD菌剂处理后，供试苗木褐变现象显著改善。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> F27
<400> 1
agagtttgat cctggctcag aacgaacgct 30
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> R1492
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac ttcacccc 28
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> OI1
<400> 3
gcgcgtatgc aatacgagcg gca 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> OI2C
<400> 4
gcctcgcgac ttcgcaaccc at 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> P400+
<400> 5
gagttcatgt agaagttgtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> P400-
<400> 6
cctacaggtg gctgactcat 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> COX+
<400> 7
gtatgccacg tcgcattcca ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> COX-
<400> 8
gccaaaactg ctaagggcat tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> CQULA04F
<400> 9
tggaggtgta aaagttgcca aa 22
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> CQULA04 R
<400> 10
ccaacgaaaa gatcagatat tcctcta 27

Claims (9)

1.一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法，其特征在于，包括将复合微生物菌剂采用灌根方式对苗木进行处理，所述复合微生物菌剂包括保藏编号为CCTCC NO:M2019874、名称为Bacillus sp.TD2-1，以及保藏编号为CCTCC NO:M2019875，名称为Bacillus sp.TD2-2的两种芽孢杆菌的菌液。
2.根据权利要求1所述的一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法，其特征在于：所述复合微生物菌剂的制备方法为，挑取TD2-1和TD2-2单菌落，分别在LB培养基中，200rpm，37℃培养，将OD600nm＝1等量的TD2-1和TD2-2各取10ml加20g红糖，加入高压灭菌消毒的麦麸(1KG)+米糠(1KG)+玉米淀粉(0.4KG)+豆粕(0.2KG)中，按料水比1：1混匀后，在30℃固体发酵7d，其间，每天翻动一次，并打碎培养物，在60℃干燥后，用粉碎机将培养物打成细粉，检测活菌数在200亿个/g，待用；使用时按照所需剂量溶解在水中，每株用量0.5L。
3.如权利要求2所述的一种复合微生物处理控制苗木韧皮部杆菌病原的方法在控制柑橘苗木黄龙病病害中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用包括改善柑橘苗木根系褐变现象，促进根系新生。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述柑橘包括沙糖桔或南丰蜜桔。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：对沙糖桔的处理方法包括，共进行23次复合微生物菌剂处理，菌剂用量逐级递增，第1-10次处理间隔为15d，其中1-4次的菌剂用量为1.6g/L，5-10次的菌剂用量为2.5g/L，11-15次的菌剂量仍为2.5g/L但处理频率增加至每周一次，15次以后每周处理菌剂量为5g/L。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：对南丰蜜桔的处理方法包括，共进行15次复合微生物菌剂灌根处理，其中前两次处理间隔时间为20d，菌剂用量为1.6g/L；第3-9次菌剂用量增加至2.5g/L，每隔15d处理；10-15次处理时使用5g/L的菌剂量，每周处理一次。
8.如权利要求6中所述的对沙糖桔的处理方法或权利要求7中所述的对南丰蜜桔的处理方法在培育柑橘无病毒苗木中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：具体包括为无病毒苗木提供接穗或为茎尖微芽嫁接脱毒提供无毒或低毒的茎尖材料。
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