CN103865806A

CN103865806A - 内生真菌菌株r5-6-1的应用

Info

Publication number: CN103865806A
Application number: CN201410068912.2A
Authority: CN
Inventors: 章初龙; 林福呈; 刘宏玉; 冯晓晓
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: CN103865806B

Abstract

本发明涉及一种内生真菌菌株稻瓶霉（Phialophora oryzae）R5-6-1在降低烟草吸收重金属方面的用途，属于微生物及微生物应用领域。具体而言，本发明公开了一种内生真菌菌株R5-6-1的用途：用于降低烟草中的重金属含量；所述内生真菌菌株R5-6-1为保藏号CGMCC No.2737的稻瓶霉（Phialophora oryzae）真菌菌株R5-6-1。其主要用于降低烟叶中的重金属镉的含量。

Description

内生真菌菌株R5-6-1的应用

技术领域

本发明涉及一种内生真菌菌株稻瓶霉（Phialophora oryzae）R5-6-1在降低烟草吸收重金属方面的用途，属于微生物及微生物应用领域。

背景技术

吸烟与健康是国内外广泛关注的热点问题，降低烟草制品有害成分是烟草行业科技发展的焦点。烟叶和烟气中的重金属是最重要的有害成分之一，另外烟草病害也严重影响烟草产量和烤烟品质。而烟草农业对烟叶有害成分和烟叶品质具有重要影响，因此需要利用农业生物技术进行调控，尽量减少烟叶有害成分的本底含量，以达到降低烟草制品对人类健康危害的目的。

烟草中含有多种重金属元素，如砷、镉、铅、汞等，在抽吸过程中，这些重金属可通过主流烟气进入人体，对人体造成潜在的危害。烟草是对镉转移能力极强的作物，烟草中镉含量比其生长的土壤高出许多倍，镉在成熟烟株的不同叶位含量几乎相当，而在根中最低，烟叶中镉的积累量占总吸收量的79-96%。

内生真菌（endophytic fungi）为至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌（Petrini，1991；Wilson，1995）。与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在（Faeth&Fagan,2002）。内生真菌广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响，对植物生长发育、抵抗病虫害等具有广泛的生物学作用，同时对一些植物及农作物的广泛应用具有重要意义。随着环境问题的持续恶化，植物资源经受着严峻的考验，而内生真菌对植物的影响是多方面的，已经成为当今国内外研究的热点问题之一。在农业生产、生态保护、中药资源开发、医药卫生的发展都有重要的现实意义。近年来，人们发现在植物体内所存在的有益内生细菌和内生真菌，内源性菌株对植物病害的防治作用及生物开发应用已引起科学家的广泛关注。植物内生真菌主要分布于植物的种子、花、茎、叶和根系中，与植物的关系是互惠共生的，而且植物内生真菌可以提供光合产物及矿物质，内生真菌代谢产物能够刺激寄主植物的生长发育，提高寄主植物的生物应激和非生物胁迫抗性能力，即两者之间存在物质与能量的循环交流，植物内生真菌对寄主植物的积极地促生效应，部分是通过植物内生真菌分泌的活性物质或者次级代谢产物对植物的生长作用的结果。目前研究较多的是根瘤共生体和菌根共生体，内生真菌与植物的共生体是高等植物与微生物共生关系的又一种表现形式。

内生真菌与植物的互作研究已日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域的国际热点。烟草作为我国重要的经济作物，在国民经济中占据着不可替代的地位，烟草产量和品质的提高，是烟草产业健康发展的基础。通过研究内生真菌与烟草的互作关系，对研究内生真菌与烟草的共生体系具有重大意义。

专利号为200810162535.3的发明《一种真菌菌株及其用途》提供了一种真菌菌株，该菌株为稻瓶霉（Phialophora oryzae）真菌菌株R5-6-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2008年10月27日，保藏号：CGMCC No.2737。该真菌菌株的用途是：用于促进植物生长或增加生物量，所述植物为水稻。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种内生真菌的菌株稻瓶霉（Phialophora oryzae）R5-6-1及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种内生真菌菌株R5-6-1的用途：用于降低烟草中的重金属含量；所述内生真菌菌株R5-6-1为保藏号CGMCC No.2737的稻瓶霉（Phialophoraoryzae）真菌菌株R5-6-1。

作为本发明的内生真菌菌株R5-6-1的用途的改进：用于降低烟叶中的重金属含量。

作为本发明的内生真菌菌株R5-6-1的用途的进一步改进：所述重金属包括镉。

采用本发明所述的内生真菌菌丝，置于烟草苗根部下方1cm左右进行共培养，所得的烟叶中镉含量能明显降低。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为Phialophora oryzae R5-6-1（右图）移入盆栽的生长2个月，且处理重金属溶液后生长30天的照片，与对照CK相比，Phialophora oryzae R5-6-1具有明显的促生作用。

具体实施方式

参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。

备注说明：下述所有的培养基使用前均需要按照常规方式进行高温高压的灭菌处理（121℃、0.24MPa、20分钟）。

实施例1、内生真菌菌株（Phialophora oryzae）R5-6-1与烟草共培养：

2%麦芽汁琼脂培养基（malt extract agar,MEA）：在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）：在马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。

MS培养基（1L）：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，氯化钙440mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，Na2EDTA37.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，30g蔗糖，琼脂粉8g，H₂O定容至1L；pH值5.8。

具体操作步骤如下：

(1)选择烟草品种云烟87的种子，无菌水浸泡48h后，搓种20～30min。种子用70%（体积%）的酒精灭菌1min，2%（质量%）的次氯酸钠灭菌10min，无菌水冲洗5～6次后点在MS培养基上，于25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替下萌发两周（约长至4片叶），备用。

(2)挑选大小一致的烟草苗用于同供试菌株的共培养。将长至4片叶的烟草幼苗转移至10×10（厘米）的方形1/2MS培养基上（3株/皿），为保持烟草的良好长势，将茎叶部分的培养基去掉，根部舒展在1/2MS培养基上。挑取培养一周左右的内生真菌菌丝，置于烟草苗根部下方1cm左右进行共培养（用灭菌过的直径5毫米的打孔器截取菌丝，在每株烟草苗根部下方放置）。空白对照不接菌丝，平皿封口后置于25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替的条件下培养两周左右。

备注说明：

1/2MS培养基即为大量元素（硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙）减半，其余元素含量不变的MS培养基。

(3)共培养两周后，供试菌株表现出良好的生长效果。移入盆栽（每盆一颗植株），正常养护2个月，对照组CK与实验组Phialophora oryzae R5-6-1均生长良好。

在上述生长正常的植株（即，对照组CK与实验组Phialophora oryzae R5-6-1）盆栽内浇灌含Cd（镉）的重金属溶液（氯化镉溶液），直至盆栽土壤的重金属Cd（镉）含量为5mg/kg，共培养30天（1个月）后供烟叶重金属测试。

图1为浇灌重金属溶液（氯化镉溶液）后培养30天的烟草植株照片。

烟叶重金属测试具体如下：

采用IPC-MS同时测定烟叶中重金属的含量（属于常规技术）：

（1）前处理：

将烟叶样品去梗，于40℃下烘干(约14h)，粉碎，过40目筛。称取0.2000g烟粉样品，置于聚四氟乙烯消化罐内，加入2mL1μg／mL Au标准溶液、5mL65％（体积%）硝酸、1mL30％（体积%）过氧化氢，按照如下微波消解程序进行消解：500W(5min)→0w(2min)→500w(5min)→800w(15min)；消解结束后，待温度降至低于40℃，取出消解罐，在通风橱内将样品消解液转移至预先称重的50mL聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)样品瓶中，用超纯水洗涤消解罐内罐和瓶盖3次，洗涤液也转移至样品瓶中，称量，摇匀，得待测溶液。对照为未加烟丝的空白处理液。

（2）测定所用仪器和溶液：

10ng／mL Mg，Cu，Rh，Cd，In，Ba，Ce，Pb，U调谐溶液、10ng／mL Be，Mg，In，Co调谐溶液、10g／mL Cr，Ni，As，se，cd，cs，Pb混合标准溶液、l0g／mL Hg标准溶液、1000～g／mL Au标准溶液（美国Perkin Elmer公司）；1000g／mL钇标准溶液、GBW10016茶叶（中国计量科学研究院）；30％过氧化氢、浓硝酸(GR，Mer.ck公司)；超纯水(18.2M～／em)；烟叶样品（CK、R5-6-1)。

ELAN动态反应池(DRC)一电感耦合等离子体(ICP)一质谱(MS)仪(美国Perkin Elmer公司)；Rotor16微波消化器(美国Perkin Elmer公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)；PL601-L电子分析天平(0.0001g，瑞士梅特勒公司)。

表1、Cd²⁺处理30天后R5-6-1烟草（云烟87）叶片中重金属含量

对植物和共生微生物的互作研究表明，植物根系和共生微生物的互作对植物吸收重金属和对重金属的耐受性具有重要影响。很多植物都有菌根真菌（AM），菌根真菌在植物根部定殖增加了根的吸收表面积，在土壤中扩展延伸的真菌菌丝帮助植物吸收包括重金属在内的营养物质。菌根真菌种类和寄主植物基因型对菌根真菌在植物根部的定殖及对营养吸收的效果有显著的差异。结果表明，菌根真菌的根外菌丝能将土壤中的重金属吸收固定，但重金属从真菌到植物的迁移受到限制，或很少迁移到植物地上部。因此共生微生物能否限制或降低烟草对重金属元素的吸收，或改变重金属从植物根系到地上部的迁移，对于降低烟草重金属含量非常关键。发明人筛选发现造成烟草重金属低积累的共生微生物在烟草重金属减害方面显示良好的应用潜力。表1中，有3株对照组烟草和3株Phialophora oryzae R5-6-1实验组烟草，我们通过测定叶片中重金属元素镉的含量，Phialophora oryzae R5-6-1在降低烟草的重金属含量方面有明显作用，相比对照组，处理的实验组中重金属Cd镉的含量下降了22.8%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.内生真菌菌株R5-6-1的用途，其特征是：用于降低烟草中的重金属含量；所述内生真菌菌株R5-6-1为保藏号CGMCC No.2737的稻瓶霉（Phialophora oryzae）真菌菌株R5-6-1。

2.根据权利要求1所述的内生真菌菌株R5-6-1的用途，其特征是：用于降低烟叶中的重金属含量。

3.根据权利要求1或2所述的内生真菌菌株R5-6-1的用途，其特征是：所述重金属包括镉。