CN105316240A - 一种内生真菌菌株nyn8g01及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物及微生物应用领域，尤其涉及一种内生真菌菌株NYN8G01，其在降低烟草吸收重金属方面的用途。内生真菌菌株<i>Rhizopycnis？</i>sp.NYN8G01的特征为：菌落灰色，表面灰白色菌丝呈绒毛状，菌落背面中央灰色、放射状开裂，外圈变黑色，边缘灰色，呈明显的轮纹状。菌丝暗色有隔且多分支，厚垣孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状。ITS？rDNA区的序列分析鉴定为<i>Rhizopycnis</i>？sp.，ITS序列见SEQ？NO:1。

Description

一种内生真菌菌株NYN8G01及其应用

技术领域

本发明属于微生物及微生物应用领域，尤其涉及一种内生真菌菌株NYN8G01，其在降低烟草吸收重金属方面的用途。

背景技术

我国是全球最大的烟草生产国和消费国，吸烟人口超过3.2亿人。烟叶中的重金属主要来自于土壤，烟草生长过程中，根系不断地从土壤中吸收重金属，传输至茎和叶片中，并逐渐累积(杨欣等，2010)。在抽吸过程中，烟叶中的重金属元素以气溶胶的形式进入呼吸道，被人体吸收，而重金属从人体内排出非常缓慢，因此会在人体内造成累积，，每年有上百万人死于相关疾病(Roncoetal.，2005)。近年来，由于大量的工业重金属废弃物排入土壤和水生生态环境，重金属污染问题日趋突出，2010年国际烟草控制政策评估项目(ITC)组织公布的科研报告显示，13个中国国产卷烟品牌检测出含有Pb、Cd、Cr等重金属，其含量与加拿大产香烟相比，最高超出3倍以上。吸烟与健康成为国内外广泛关注的热点问题，降低烟草制品有害成分是烟草行业科技发展的焦点。烟叶和烟气中的重金属是最重要的有害成分之一，另外烟草病害也严重影响烟草产量和烤烟品质。而烟草农业对烟叶有害成分和烟叶品质具有重要影响，利用农业生物技术进行调控，尽量减少烟叶有害成分的本底含量，以达到降低烟草制品对人类健康危害的目的。

烟草中含有多种重金属元素，如砷、镉、铅、汞等，在抽吸过程中，这些重金属可通过主流烟气进入人体，对人体造成潜在的危害。烟草是对镉转移能力极强的作物，烟草中镉含量比其生长的土壤高出许多倍，镉在成熟烟株的不同叶位含量几乎相当，而在根中最低，烟叶中镉的积累量占总吸收量的79-96％。

内生真菌(endophyticfungi)即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌(Petrini，1991；Wilson，1995)，与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在(Faeth&Fagan,2002)。内生真菌广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响，对植物生长发育、抵抗病虫害等具有广泛的生物学作用，同时在一些植物及农作物的广泛应用具有重要意义。随着环境问题的持续恶化，植物资源经受着严峻的考验，而内生真菌对植物的影响是多方面的，已经成为当今国内外研究的热点问题之一。在农业生产、生态保护、中药资源开发、医药卫生的发展都有重要的现实意义。近年来，人们发现在植物体存在有益的内生细菌和内生真菌，内源性菌株对植物病害的防治作用及生物开发应用已引起科学家的广泛关注。植物内生真菌主要分布于植物的种子、花、茎、叶和根系中，与植物的关系是互惠共生的，而且植物内生真菌可以提供光合产物及矿物质，内生真菌代谢产物能够刺激寄主植物的生长发育，提高寄主植物的生物应激和非生物胁迫抗性能力，即两者之间存在物质与能量的循环交流，植物内生真菌对寄主植物的积极地促生效应，部分是通过植物内生真菌分泌的活性物质或者次级代谢产物对植物的生长作用的结果。目前研究较多的是根瘤共生体和菌根共生体，内生真菌与植物的共生体是高等植物与微生物共生关系的又一种表现形式。

内生真菌与植物的互作研究已日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域的国际热点。烟草作为我国重要的经济作物，在国民经济中占据着不可替代的地位，烟草产量和品质的提高，是烟草产业健康发展的基础。通过研究内生真菌与烟草的互作关系，对研究内生真菌与烟草的共生体系具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种内生真菌菌株(Rhizopycnissp.)NYN8G01及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种内生真菌菌株(Rhizopycnissp.)NYN8G01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015218，保藏时间2015年4月10日。

内生真菌菌株Rhizopycnissp.NYN8G01的特征为：菌落灰色，表面灰白色菌丝呈绒毛状，菌落背面中央灰色、放射状开裂，外圈变黑色，边缘灰色，呈明显的轮纹状。菌丝暗色有隔且多分支，厚垣孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状。ITSrDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnissp.，ITS序列见SEQNO:1。

菌株Rhizopycnissp.NYN8G01来源于烟草的内生真菌，该菌株属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，盘菌亚Pezizomycotina，座囊菌纲Dothideomycet，格孢腔菌目Pleosporales；根盘菌属Rhizopycnis。

本发明还提供上述内生真菌菌株(Rhizopycnissp.)NYN8G01的用途：降低烟叶中镉、砷、铅的含量。

上述的内生真菌菌株(Rhizopycnissp.)NYN8G01的用途：降低烟叶中镉、砷或铅的含量。

一种内生真菌菌肥制剂，该内生真菌菌肥制剂包括所述的内生真菌菌株NYN8G01。

一种上述的内生真菌菌肥制剂的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1)菌株活化、一级种子培养、二级种子培养

菌株活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，接种于PDA培养基上，封口后置于恒温培养箱中，24h黑暗，25℃，活化培养；

一级种子液培养：将10块直径5mm的菌饼，接种于在200ml液体种子培养基中，于150r/min，25℃培养72h；

二级种子液培养：200ml一级种子液用搅拌器打碎并摇晃混匀，吸取20ml接种于200ml液体种子培养基，于150r/min，25℃培养72h；

2)固态培养：

200ml二级种子培养液打碎并摇晃混匀，吸取2ml接种于10g固态培养基质中，于25℃条件下黑暗培养7d；

3)内生真菌菌肥制剂的制备

称取200g麸皮，添加100ml水，拌匀后置于1000ml锥形瓶内，8层纱布4层报纸封口后，121℃，0.15Mpa灭菌30min，冷却备用；

每个灭菌待的麸皮培养基，接种二级培养液40ml，置于恒温培养箱中，24h黑暗，25℃，培养。

附图说明

图1为Rhizopycnissp.NYN8G01在PDA培养基上的菌落形态。

图2为Rhizopycnissp.NYN8G01在显微镜下的形态观察，可见菌丝上着生单瓶梗和分生孢子(左)以及镰刀状分生孢子(右)。

图3为Rhizopycnissp.NYN8C05在PDA培养基上的菌落形态。

图4为Rhizopycnissp.NYN8C05在显微镜下的形态观察，可见菌丝上着生单瓶梗和分生孢子(左)以及镰刀状分生孢子(右)。

图5为Lecanicilliumsp.NYN771C06在PDA培养基上的菌落形态。

图6为Lecanicilliumsp.NYN771C06在显微镜下的形态观察，可见菌丝上着生单瓶梗和分生孢子(左)以及镰刀状分生孢子(右)。

具体实施方式

参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。

备注说明：下述所有的培养基使用前均需要按照常规方式进行高温高压的灭菌处理(121℃、0.24MPa、20分钟)。

实施例1、内生真菌菌株分离获得

2％麦芽汁琼脂培养基(maltextractagar,MEA)：在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar,PDA)：在马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

以河南南阳烟区采集烟草为植物材料，将采集的烟草用自来水漂洗干净，烟草根茎在75％(v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1％(v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无菌水漂洗3次。用无菌刀片将根切成约0.6cm长的片段，置于含50μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素的2％麦芽汁琼脂培养基(MEA)平皿上，25℃暗培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基；分离得到菌落，25℃暗培养，在PDA培养基上连续三次接种，确认为单菌落，没有其他真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养，获得的三株内生真菌分别为NYN8G01、NYN8C05和NYN771C06。

菌株编号为Rhizopycnissp.NYN8G01,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015218，保藏时间2015年4月10日。

菌株编号为(Rhizopycnissp.)NYN8C05，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015219，保藏时间2015年4月10日。

菌株编号为Lecanicilliumsp.NYN771C06，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015220，保藏时间2015年4月10日。

实施例2、内生真菌菌株的形态鉴定

本发明的Rhizopycnissp.NYN8G01(即Rhizopycnissp.NYN8G01CCTCCNO:M2015218)具有如下特性：Rhizopycnissp.NYN8G01在PDA培养基上的形态如图1所示。该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25℃，具有以下特征：该菌株属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，盘菌亚门Pezizomycotina，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleosporales；根盘菌属Rhizopycnis。菌落灰色，表面灰白色菌丝呈绒毛状，菌落背面中央灰色、放射状开裂，外圈变黑色，边缘灰色，呈明显的轮纹状，见附图1。菌丝暗色有隔且多分支，厚垣孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状，见附图2。ITSrDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnissp.，ITS序列见SEQNO:1。

本发明的(Rhizopycnissp.)NYN8C05(即(Rhizopycnissp.)NYN8C05CCTCCNO:M2015219)具有如下特性：(Rhizopycnissp.)NYN8C05在PDA培养基上的形态如图3所示。该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25℃，具有以下特征：该菌株属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，盘菌亚门Pezizomycotina，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleosporales；根盘菌属Rhizopycnis。菌落生长较慢，呈灰黑色，表生绒毛状灰色菌丝。菌落背面灰色至灰黑色，间淡色轮纹，明显轮纹状。菌丝暗色有隔且多分支，厚垣孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状，见附图4。ITSrDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnissp.，ITS序列见SEQNO:2。

本发明的Lecanicilliumsp.NYN771C06(即Lecanicilliumsp.NYN771C06CCTCCNO:M2015220)具有如下特性：Lecanicilliumsp.NYN771C06在PDA培养基上的形态如图5所示。该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25℃，具有以下特征：真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，盘菌亚门Pezizomycotina，粪壳菌纲Sordariomycetes，肉座菌目Hypocreales，虫草菌科Cordycipitaceae，蜡蚧轮枝菌属Lecanicillium。落菌初白色，后变淡黄色，正面绒毛状，背面淡黄色，见附图5。气生菌丝分枝丝状，分生孢子梗呈锥形瓶状，在气生菌丝上单生。分生孢子在瓶梗未端粘结成头状，分生孢子多为卵圆形、椭圆形至桔瓣形，两端圆或一端稍尖，单孢、无色，缺少厚坦抱子，见附图6。ITSrDNA区的序列分析鉴定为Lecanicilliumsp.，ITS序列见SEQNO:3。

实施例3、内生真菌菌株的分子鉴定

用真菌基因的快速提取法提取DNA。采用ITS扩增的通用引物ITS-4(‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)进行PCR扩增，PCR扩增反应采用50ul的反应体系:ddH2O39.5ul、10*PCRBuffer(withMg2+)5ul、10mmol/LdNTP0.4ul、20μmol/LPrimer-F0.8ul、20μmol/LPrimer-R0.5ul、DNA模板3ul、5U/ulTaq聚合酶0.8ul。PCR体系为：PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环后,72℃延伸10min。反应结束后用1.0％琼脂糖凝胶分析扩增产物。PCR产物回收后经上海生工生物工程有限公司测序，分别得到三条ITS序列(序列1、序列2和序列3)。测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索以进一步确定其分类地位，序列1的ITSrDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnissp.；序列2的ITSrDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnissp.；序列3的ITSrDNA区的序列分析鉴定为Lecanicilliumsp.。

实施例4、内生真菌菌株在降低烟草烟叶重金属含量的作用

(1)烟草育苗

取适量云烟87烟草种子，75％酒精浸泡30s，1％NaClO浸泡10min；温水浸泡置于28℃培养箱中12h；取出纱布包裹并轻轻揉搓边清水冲洗，以去掉种皮的角质与胶质；室温催芽至种子冒白；撒播于育苗穴盘；出苗长至十字期，移栽值50目穴盘，培育待用。

(2)菌株活化、一级种子培养、二级种子培养

菌株活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，接种于PDA培养基上，封口后置于恒温培养箱中(24h黑暗，25℃)活化培养。本发明中涉及的菌株有3种，分别为：

NYN8G01，即Rhizopycnissp.NYN8G01,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015218，保藏时间2015年4月10日；

NYN8C05，即(Rhizopycnissp.)NYN8C05，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015219，保藏时间2015年4月10日；

NYN771C06，即Lecanicilliumsp.NYN771C06，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015220，保藏时间2015年4月10日。

一级种子液培养：将10块直径5mm的菌饼，接种于在200ml液体种子培养基中，于150r/min，25℃培养72h。

二级种子液培养：200ml一级种子液用搅拌器打碎并摇晃混匀，吸取20ml接种于200ml液体种子培养基，于150r/min，25℃培养72h。

固态培养：200ml二级种子培养液打碎并摇晃混匀，吸取2ml接种于10g固态培养基质中，于25℃条件下黑暗培养7d。

(3)内生真菌菌肥制剂的制备

称取200g麸皮，添加100ml水，拌匀后置于1000ml锥形瓶内，8层纱布4层报纸封口后，121℃，0.15Mpa灭菌30min。冷却备用。

每个灭菌待的麸皮培养基，接种二级培养液40ml，置于恒温培养箱中(24h黑暗，25℃)培养。

(4)菌肥制剂施用

花盆按“三明治法”(刘宏玉，2013)填入100g土壤和菌剂(10g左右)，花盆放入盛满水的托盘中吸水，水分吸透后，将50目穴盘云烟87幼苗移栽至花盆中，温室中(25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替)培养。

(5)烟草盆栽的镉Cd²⁺、砷As³⁺、铅Pb²⁺胁迫处理

烟苗移入盆栽，在植物生长室中培育60天后，便可对盆栽进行重金属镉胁迫处理。

处理方式:镉Cd²⁺、砷As³⁺、铅Pb²⁺混合处理

处理浓度(mg/kg):镉Cd²⁺：5mg/kg；砷As³⁺：4mg/kg；铅Pb²⁺：200mg/kg

(6)样品采集及处理

烟叶：重金属胁迫处理后30d，选择生长状况类似、个体差异较小的实验组，进行全株取样(去除下部黄化衰老严重的叶片)。采集的样品置于烘箱中，设置105℃，1h，而后，65℃烘干至恒重，待用。

根系：在水中去除花盆中的营养土保留根系，将根系在-80℃下冻干，备用。

(7)烟草叶片中重金属含量的测定

采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定烟叶中重金属的含量。

所涉及溶液：10ng/mLMg，Cu，Rh，Cd，In，Ba，Ce，Pb，U调谐溶液、10ng/mLBe，Mg，In，Co调谐溶液、10g/mLCr，Ni，As，se，cd，cs，Pb混合标准溶液、l0g/mLHg标准溶液、1000～g/mLAu标准溶液(美国PerkinElmer公司)；1000g/mL钇标准溶液、GBW10016茶叶(中国计量科学研究院)；30％过氧化氢、浓硝酸(GR，Mer.ck公司)；超纯水(18.2M～/em)；烟叶样品(采收实施例1中所述每盆栽所有成熟烟叶)。

所用仪器：ELAN动态反应池(DRC)一电感耦合等离子体(ICP)一质谱(MS)仪(美国PerkinElmer公司)；Rotor16微波消化器(美国PerkinElmer公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)；PL601-L电子分析天平(0.0001g，瑞士梅特勒公司)。

将烘干备用的烟叶样品去梗粉碎，过40目筛，为保证数据的准确度，每个样品称取两个平行样，两个平行样0.2000g烟粉样品，称好的样品置于聚四氟乙烯消化罐内。加入样品后，依次加入(土壤消解65％浓硝酸5mL、30％过氧化氢2mL，48-51％氢氟酸1mL)旋紧密封，置于Mars5型微波消解仪(美国CEM公司)中，按设置的微波消解程序(如表1)进行消解，消解结束后，待微波消解仪的温度降至40℃以下，取出消解罐。

表1：微波消解升温程序

起始温度℃	升温时间min	终点温度℃	保持时间min
				室温	5	100	5
100	5	130	5
				130	5	160	5
160	10	190	20

在通风橱内打开消解罐，将消解罐中的试样溶液转移至预先称重的50mL聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)样品瓶中，用水(GB/T6682中一级水)洗涤消解罐内罐和瓶盖3～4次，洗涤液也转移至样品瓶中，转移样品完成后，用水(GB/T6682中一级水)定容(总重量<50g)，称量并记录样品瓶的总重量，样品摇匀后即可用于进一步的检测，对照为未加样品的空白处理液。

采用7500a电感耦合等离子体质谱仪(美国AG，ILENT公司)对消解后的烟叶样品进行分析时，打开仪器，按下述参数进行优化。

射频功率：1300W；载气流速：1.20L/min；进样速率：0.1r/s；获取模式：全定量分析；重复次数：3；元素测定参数按表2设定。

表2元素测定质量数、内标元素、积分时间

元素	测量同位素	内标元素	积分时间
				铬	53	72Ge	1.0
镍	60	72Ge	0.3
				砷	75	72Ge	1.0
硒	82	72Ge	2.0
				镉	111	115In	0.5
铅	208	209Bi	0.3

制作标准曲线：在线加入内标溶液，分别吸取标准空白溶液和不同浓度砷、镉、铅、氧化砷的标准工作溶液，注入电感耦合等离子体质谱中，在选定的仪器参数下，以待元素砷、镉、铅、氧化砷含量与对应内标元素含量的比值为横坐标，待测元素砷、镉、铅、氧化砷质荷比强度与对应内标元素质荷比强度的比值为纵坐标，建立砷、镉、铅、氧化砷的工作曲线。对校正数据进行线性回归，求得砷、镉、铅、氧化砷的回归方程，R2应不小于0.999。

样品测定：在线加入内标溶液，分别吸取试样空白溶液和试样液，注入电耦合等离子体质谱中，在选定的仪器参数下，得到待测元素砷、镉、铅、氧化砷质荷比强度与对应内标元素质荷比强度的比值，带入以上工作曲线的线性回归方程，计算得试样空白溶液和试样液中砷、镉、铅、氧化砷的浓度。

结果的计算：试样中的砷、镉、铅、氧化砷含量按下式进行计算：

$X=\frac{(c-c_0)\&times;V}{1000\&times;m\&times;(1-\mathrm{\&omega;})}$

式中：

X——试样中铬、镍、砷、硒、镉、铅的含量，单位为微克每克(μg/g)；

c——试样溶液浓度，单位为微克每升(μg/L)；

c₀——试样空白溶液浓度，单位为微克每升(μg/L)；

V——试样溶液体积，单位为毫升(mL)；

m——试样质量，单位为克(g)；

w——试样中水分含量％。

结果的表述：以两个平行样品测定的平均值为测定结果，结果精确到0.01μg/g。两次平行测定结果之间的相对偏差不应大于5.0％。

(8)统计分析

采用SPSS20.0、MATLAB.R2012b软件进行数据处理、统计分析。

(9)结果与分析

结果中的CK指没有内生真菌处理的烟草。混合胁迫中，Rhizopycnissp.NYN8G01降低烟叶中砷As³⁺含量效应达17.04％，Cd²⁺效应达27.79％，Pb²⁺效应达49.38％；(Rhizopycnissp.)NYN8C05降低烟叶中砷As³⁺含量效应达21.11％，Cd²⁺效应达32.53％，Pb²⁺效应达26.62％(表3)；Lecanicilliumsp.NYN771C06降低烟叶中砷As³⁺含量效应达11.16％，Cd²⁺效应达27.21％，Pb²⁺效应达53.86％。

表3Cd²⁺、As³⁺、Pb²⁺混合胁迫30d后不同菌肥制剂处理云烟87叶片中重金属含量

对植物和共生微生物的互作研究表明，植物根系和共生微生物的互作对植物吸收重金属和对重金属的耐受性具有重要影响。很多植物都有菌根真菌(AM)，菌根真菌在植物根部定殖增加了根的吸收表面积，在土壤中扩展延伸的真菌菌丝帮助植物吸收包括重金属在内的营养物质。菌根真菌种类和寄主植物基因型对菌根真菌在植物根部的定殖及对营养吸收的效果有显著的差异。结果表明，菌根真菌的根外菌丝能将土壤中的重金属吸收固定，但重金属从真菌到植物的迁移受到限制，或很少迁移到植物地上部。因此共生微生物能否限制或降低烟草对重金属元素的吸收，或改变重金属从植物根系到地上部的迁移，对于降低烟草重金属含量非常关键。筛选发现造成烟草重金属低积累或根茎超积累而烟叶低积累的共生微生物在烟草重金属减害方面显示良好的应用潜力。Rhizopycnissp.NYN8G01、Rhizopycnissp.NYN8C05、Lecanicilliumsp.NYN771C06实验组烟草，降低烟草的重金属，尤其是砷As³⁺、镉Cd²⁺、铅Pb²⁺含量方面有非常明显作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>浙江中烟工业有限责任公司

<120>一种内生真菌菌株NYN8G01及其应用

<130>2015

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>941

<212>DNA

<213>Rhizopycnissp.

<400>1

cgtagctcgtacgggacgcttgaccgccaggtcaaggtgatccttccgcgtaacacttgc60

cgaagccttagcagcccgaaagggtgcagttccgcgactcaaagaaaggaggactgctga120

aatgctagtctgcagaagcaggcaacactatcaaattgcgggaacaccctaaagacctca180

acaccaagcgtcatgggaaaccatggcgtggccgagctaatagccctgggtatggtaaca240

gcttgaggtatgaagccttcgcaaggaggccgaaatgggcaatccgcagccaagtcctaa300

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ttattttttactcttgacctcggatcaggtagggatacccc941

<210>2

<211>527

<212>DNA

<213>Rhizopycnissp.

<400>2

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Claims (4)

1.一种内生真菌菌株（Rhizopycnissp.）NYN8G01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015218，保藏时间2015年4月10日。

2.权利要求1所述的内生真菌菌株NYN8G01的用途，该用途用于降低烟叶中镉、砷或铅的含量。

3.一种内生真菌菌肥制剂，其特征在于该内生真菌菌肥制剂包括权利要求1所述的内生真菌菌株NYN8G01。

4.一种权利要求3所述的内生真菌菌肥制剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）菌株活化、一级种子培养、二级种子培养

菌株活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，接种于PDA培养基上，封口后置于恒温培养箱中，24h黑暗，25℃，活化培养；

一级种子液培养：将10块直径5mm的菌饼，接种于在200ml液体种子培养基中，于150r/min，25℃培养72h；

二级种子液培养：200ml一级种子液用搅拌器打碎并摇晃混匀，吸取20ml接种于200ml液体种子培养基，于150r/min，25℃培养72h；

2）固态培养：

200ml二级种子培养液打碎并摇晃混匀，吸取2ml接种于10g固态培养基质中，于25℃条件下黑暗培养7d；

3）内生真菌菌肥制剂的制备

称取200g麸皮，添加100ml水，拌匀后置于1000ml锥形瓶内，8层纱布4层报纸封口后，121℃，0.15Mpa灭菌30min，冷却备用；

每个灭菌待的麸皮培养基，接种二级培养液40ml，置于恒温培养箱中，24h黑暗，25℃，培养。