CN112852643A - 一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，涉及生物制药技术领域。该重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，包括如下步骤：菌株的分离纯化、菌株鉴定、Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取、发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验。本发明的Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物均对CT26、HepG2和HeLa细胞表现出一定的毒性作用，其中对CT26和HepG2细胞作用更加明显，且对人正常肝细胞无显著作用，为研究开发新型抗肿瘤药物提供先导化合物。

Description

一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体为一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
重楼为传统名贵中药材，被广泛运用于抗肿瘤、抗菌消炎，以及免疫调节中，由于效果好，市场需求量大。其抗癌物质基础及抗癌机制值得深入研究。植物内生真菌是指存在于健康植物的各种组织器官而不使植株表现出任何病害症状的一类真菌，能够分泌与宿主相同或相似的活性物质，直接或间接影响药材主要药效成分的合成。为此，筛选其内生真菌，展开抗癌活性分析及活性物质鉴定具有十分重要的意义。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，提供了抗肿瘤活性的内生真菌。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，包括如下步骤：菌株的分离纯化、菌株鉴定、Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取、发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验，所述菌落特征为在马铃薯平板培养基(PDA培养基)上28℃生长15d后，菌落直径为90mm，菌落呈灰白色，环状；菌丝体稠密，表面呈绒毛状；菌落背面中心呈灰色，有径向裂纹，外部呈深棕色，并带有浅红色斑块，在培养过程中未形成分生孢子；分生孢子细胞为肠母细胞，菌落状，有多个分枝，透明光滑；菌丝体中形成不规则的黑色厚壁孢子，颜色为棕色或黑色，厚壁，常具球状突起，短链至长链。
优选的，所述菌株的分离纯化方法如下：将采集的新鲜重楼块茎用75％乙醇和0.1％升汞消毒后接种于马铃薯琼脂平板上(添加了质量浓度为100μg/L的青霉素G钠和硫酸链霉素)，置于28℃霉菌培养箱中培养7天，挑取重楼块茎上生长出的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，再生长7天后，挑取菌落外围的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，反复转接3-5次，以获得纯种的菌种。
优选的，所述菌株鉴定方法为：提取分离菌株的基因组DNA，并扩增其ITS及LSU序列，将扩增产物送测序部门，将获得的基因序列在NCBI上进行序列相似性比对分析，再使用MEGA 7.0构建邻接(Neighbor-Joining)法系统发育进化树；结合菌株形态鉴定，并将将该菌株鉴定为Rhizopycnis vagum，并命名为AS6-ASP。
优选的，所述Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取：将纯化好的菌株接种于液体发酵培养基(麦芽糖4g/L，天冬酰胺40g/L，KH2PO41.52g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O 0.52g/L，FeSO4·7H2O 0.001g/L，ZnSO4·7H2O 0.001g/L，CuSO4·5H2O0.001g/L，pH 6.0)中，置于全温振荡培养箱中28℃、200r/min培养6天，将发酵液6000r/min4℃离心15min，收集上清，并用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤；将过滤液用70％的硫酸铵进行沉淀，冰浴条件下搅拌1h，4℃条件下静置过夜；进一步将沉淀后的溶液12000r/min 4℃离心30min，收集沉淀，并溶解于少量的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)中；再用截留分子量为10kDa的超滤离心管4000r/min 4℃离心15min；将过滤后的溶液进行冷冻干燥成粉末，并冻于-80℃备用。
优选的，所述发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验方法如下：取对数生长期的CT26(结直肠癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、HeLa(宫颈癌细胞)、和L02细胞(人正常肝细胞)接种于96孔板(每孔接种5×103个细胞，100μL/孔)，37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时；用不含血清的DMEM培养基对接种细胞进行饥饿处理24小时，使所有细胞同步于细胞周期的G0/G1期；将冷冻干燥后的样品用含2％血清的DMEM培养基的配成5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL 7个药物浓度进行给药处理48h，用相同浓度的Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)作为对照，每个浓度设置5个副孔，阴性对照组为有细胞但不给药的无血清培养基，空白对照组为无细胞不给药的无血清培养基，培养结束后，小心吸弃上清，将无血清DMEM培养基与CCK-8溶液按9：1的比例配置成溶液，并向每孔里面加入100μL，继续培养2小时，酶标仪450nm条件下测定OD值。根据公式：细胞存活率＝[(A实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％即可求得细胞存活率，细胞存活率越低，药物抑制作用越大。
(三)有益效果
本发明提供了一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用。具备以下有益效果：
本发明的Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物均对CT26、HepG2和HeLa细胞表现出一定的毒性作用，其中对CT26和HepG2细胞作用更加明显，且对人正常肝细胞无显著作用，为研究开发新型抗肿瘤药物提供先导化合物。
附图说明
图1为本发明Rhizopycnis vagum菌株形态特征图；
图2为本发明ITS序列，LSU序列及建树结果图；
图3为经CCK-8法体外抗肿瘤实验得到的体外抗肿瘤活性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
如图1-3所示，本发明实施例提供一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，包括如下步骤：菌株的分离纯化、菌株鉴定、Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取、发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验，所述菌落特征为在马铃薯平板培养基(PDA培养基)上28℃生长15d后，菌落直径为90mm，菌落呈灰白色，环状；菌丝体稠密，表面呈绒毛状；菌落背面中心呈灰色，有径向裂纹，外部呈深棕色，并带有浅红色斑块，在培养过程中未形成分生孢子；分生孢子细胞为肠母细胞，菌落状，有多个分枝，透明光滑；菌丝体中形成不规则的黑色厚壁孢子，颜色为棕色或黑色，厚壁，常具球状突起，短链至长链。
菌株的分离纯化方法如下：将采集的新鲜重楼块茎用75％乙醇和0.1％升汞消毒后接种于马铃薯琼脂平板上(添加了质量浓度为100μg/L的青霉素G钠和硫酸链霉素)，置于28℃霉菌培养箱中培养7天，挑取重楼块茎上生长出的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，再生长7天后，挑取菌落外围的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，反复转接3-5次，以获得纯种的菌种。
菌株鉴定方法为：提取分离菌株的基因组DNA，并扩增其ITS及LSU序列，将扩增产物送测序部门，将获得的基因序列在NCBI上进行序列相似性比对分析，再使用MEGA 7.0构建邻接(Neighbor-Joining)法系统发育进化树；结合菌株形态鉴定，并将将该菌株鉴定为Rhizopycnis vagum，并命名为AS6-ASP。
Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取：将纯化好的菌株接种于液体发酵培养基(麦芽糖4g/L，天冬酰胺40g/L，KH2PO41.52g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O0.52g/L，FeSO4·7H2O0.001g/L，ZnSO4·7H2O 0.001g/L，CuSO4·5H2O 0.001g/L，pH 6.0)中，置于全温振荡培养箱中28℃、200r/min培养6天，将发酵液6000r/min4℃离心15min，收集上清，并用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤；将过滤液用70％的硫酸铵进行沉淀，冰浴条件下搅拌1h，4℃条件下静置过夜；进一步将沉淀后的溶液12000r/min 4℃离心30min，收集沉淀，并溶解于少量的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)中；再用截留分子量为10kDa的超滤离心管4000r/min 4℃离心15min；将过滤后的溶液进行冷冻干燥成粉末，并冻于-80℃备用。
发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验方法如下：取对数生长期的CT26(结直肠癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、HeLa(宫颈癌细胞)和L02细胞(人正常肝细胞)接种于96孔板(每孔接种5×103个细胞，100μL/孔)，37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时；用不含血清的DMEM培养基对接种细胞进行饥饿处理24小时，使所有细胞同步于细胞周期的G0/G1期；将冷冻干燥后的样品用含2％血清的DMEM培养基的配成5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL 7个药物浓度进行给药处理48h，用相同浓度的Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)作为对照，每个浓度设置5个副孔，阴性对照组为有细胞但不给药的无血清培养基，空白对照组为无细胞不给药的无血清培养基，培养结束后，小心吸弃上清，将无血清DMEM培养基与CCK-8溶液按9：1的比例配置成溶液，并向每孔里面加入100μL，继续培养2小时，酶标仪450nm条件下测定OD值，根据公式：细胞存活率＝[(A实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％即可求得细胞存活率，细胞存活率越低，药物抑制作用越大，经CCK-8法体外抗肿瘤实验表明：发酵液初提物对CT26、HepG2和Hela细胞均具有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.01)，抑制作用CT26>HepG2>Hela细胞，同时对L02(人正常肝细胞)无显著性抑制作用，差异无统计学意义(P>0.05)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：菌株的分离纯化、菌株鉴定、Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取、发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验，所述菌落特征为在马铃薯平板培养基(PDA培养基)上28℃生长15d后，菌落直径为90mm，菌落呈灰白色，环状；菌丝体稠密，表面呈绒毛状；菌落背面中心呈灰色，有径向裂纹，外部呈深棕色，并带有浅红色斑块，在培养过程中未形成分生孢子；分生孢子细胞为肠母细胞，菌落状，有多个分枝，透明光滑；菌丝体中形成不规则的黑色厚壁孢子，颜色为棕色或黑色，厚壁，常具球状突起，短链至长链。
2.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述菌株的分离纯化方法如下：将采集的新鲜重楼块茎用75％乙醇和0.1％升汞消毒后接种于马铃薯琼脂平板上(添加了质量浓度为100μg/L的青霉素G钠和硫酸链霉素)，置于28℃霉菌培养箱中培养7天，挑取重楼块茎上生长出的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，再生长7天后，挑取菌落外围的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，反复转接3-5次，以获得纯种的菌种。
3.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述菌株鉴定方法为：提取分离菌株的基因组DNA，并扩增其ITS及LSU序列，将扩增产物送测序部门，将获得的基因序列在NCBI上进行序列相似性比对分析，再使用MEGA7.0构建邻接(Neighbor-Joining)法系统发育进化树；结合菌株形态鉴定，并将将该菌株鉴定为Rhizopycnis vagum，并命名为AS6-ASP。
4.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取：将纯化好的菌株接种于液体发酵培养基(麦芽糖4g/L，天冬酰胺40g/L，KH2PO4 1.52g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O0.52g/L，FeSO4·7H2O 0.001g/L，ZnSO4·7H2O 0.001g/L，CuSO4·5H2O 0.001g/L，pH 6.0)中，置于全温振荡培养箱中28℃、200r/min培养6天，将发酵液6000r/min 4℃离心15min，收集上清，并用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤；将过滤液用70％的硫酸铵进行沉淀，冰浴条件下搅拌1h，4℃条件下静置过夜；进一步将沉淀后的溶液12000r/min 4℃离心30min，收集沉淀，并溶解于少量的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)中；再用截留分子量为10kDa的超滤离心管4000r/min 4℃离心15min；将过滤后的溶液进行冷冻干燥成粉末，并冻于-80℃备用。
5.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验方法如下：取对数生长期的CT26(结直肠癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、HeLa(宫颈癌细胞)、和L02细胞(人正常肝细胞)接种于96孔板(每孔接种5×103个细胞，100μL/孔)，37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时；用不含血清的DMEM培养基对接种细胞进行饥饿处理24小时，使所有细胞同步于细胞周期的G0/G1期；将冷冻干燥后的样品用含2％血清的DMEM培养基的配成5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL 7个药物浓度进行给药处理48h，用相同浓度的Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)作为对照，每个浓度设置5个副孔，阴性对照组为有细胞但不给药的无血清培养基，空白对照组为无细胞不给药的无血清培养基，培养结束后，小心吸弃上清，将无血清DMEM培养基与CCK-8溶液按9：1的比例配置成溶液，并向每孔里面加入100μL，继续培养2小时，酶标仪450nm条件下测定OD值，根据公式：细胞存活率＝[(A实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％即可求得细胞存活率，细胞存活率越低，药物抑制作用越大。
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