CN110982714B

CN110982714B - 一株微小硬孔菌及其应用

Info

Publication number: CN110982714B
Application number: CN202010039807.1A
Authority: CN
Inventors: 戴玉成; 田雪梅; 吴芳
Original assignee: Beijing Forestry University; Qingdao Agricultural University
Current assignee: Beijing Forestry University; Qingdao Agricultural University
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-01-15
Also published as: CN110982714A

Abstract

本发明公开了一株微小硬孔菌，该菌株分类命名为Rigidoporus minutus，2019年12月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC19150。所述的微小硬孔菌，经实验证明，对HepG2细胞的抑制作用明显，疗效非常突出，因此，可以以该微小硬孔菌为原料制备用于抑制肿瘤的药物，比如：培养该菌获得培养物，并添加或不添加其它药物、辅料等加工制备成菌剂。本发明为研究微小硬孔菌的抑制肿瘤机制、用途、药物开发等提供了优良的菌种资源。

Description

一株微小硬孔菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株微小硬孔菌及其应用。

背景技术

肝癌是发生在肝脏的恶性肿瘤。据相关调查显示，全世界每年大概就有100万例左右肝癌患者，我国约占50%，且发病率位居世界第3位，死亡率居第2位，是严重威胁人们健康和生命的主要癌症之一。手术切除、化疗、放射治疗等都是一些传统的癌症治疗方式，但这些治疗手段需根据患者具体情况而定，并非普遍适用于所有患者，通过手术切除的手段来治疗肿瘤，能达到较好的效果，但临床上适宜手术治疗的病人仅占20%左右，因此手术切除手段并不能普及。目前治疗方式比较成熟的是化学治疗，但是副作用比较大，对患者伤害性较高。放射治疗对局部肿瘤具有较好的抑制效果，但对已转移的肿瘤治疗效果欠佳。近年来，肝癌的发病率呈持续上升的趋势，因此亟需开发研制可预防和治疗肝癌的新型药物。

我国地域辽阔，具有丰富的药用真菌资源，是将真菌用做药物来治疗疾病最早的国家，距今已有2000多年的历史。现代科学技术的高速发展使越来越多的药用真菌物种资源和活性成分资源被发掘和应用，很多研究证明某些药用真菌具有增强免疫力、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的作用，表现出直接或间接的抗肿瘤功效，在治疗肿瘤方面效果显著，已经成为开发预防和治疗肿瘤药物的研究重点。

药用真菌与传统治疗肿瘤所使用的化学及生物制品具有很大的不同，其对于肿瘤具有多环节、多途径、多层次、多靶点、多机理的综合治疗作用，并且人体对药用真菌的敏感性和适应性更佳。药用真菌作为药物具有毒副作用低，对人体无毒无害的优势，具有食药用同源的特点，且多数可通过人工栽培或液体发酵等手段进行扩大培养，可为相关药物的开发提供稳定的原料来源，因此，开发研制新兴的抗肿瘤真菌药物有着广阔良好的的市场前景，经济效益以及社会效益显著。药用真菌将为人类治疗肿瘤提供一个更广泛的空间，药用真菌来源抗肿瘤新型药物的研发已成为生物技术领域的一个研究重点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过筛选获得一株对HepG2细胞疗效非常突出的微小硬孔菌菌株，经过鉴定，确定所筛选的菌株为微小硬孔菌。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株微小硬孔菌，该菌株分类命名为Rigidoporus minutus，2019年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19150。

所述的微小硬孔菌，经实验证明，对HepG2细胞的抑制作用明显，疗效非常突出，因此，可以以该微小硬孔菌为原料制备用于抑制肿瘤的药物，比如：培养该菌获得培养物，并添加或不添加其它药物、辅料等加工制备成菌剂。本发明为研究微小硬孔菌的抑制肿瘤机制、用途、药物开发等提供了优良的菌种资源。

有益效果

本发明通过将微小硬孔菌的醇沉样品应用于HepG2细胞，在合适的加样时间，加入样品，发现对其具有明显的抑制作用，为开发新型的抗肿瘤药物提供理论支持，奠定基础。

菌种保藏信息

保藏时间：2019年12月23日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC NO.19150；

保藏单位地址：保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

分类命名：Rigidoporus minutus。

附图说明

图1 HepG2细胞生长曲线；

图2 526样品处理不同时间对HepG2细胞增殖抑制率的影响；

图3 加药处理2 d后对HepG2细胞增殖的抑制率；

图4 3种样品处理HepG2细胞2 d后的半抑制浓度；

图5 细胞形态观察。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中的微小硬孔菌Dai9847的子实体2008年5月29日采自海南省吊罗山阔叶树倒木上，采用新鲜且干净的子实体组织在PDA培养基分离培养获得其纯培养，其保藏的分类学名称为Rigidoporus minutus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.19150。

子实体形态特征：子实体一年生至多年生，完全平伏，贴生，极难与基质分离，新鲜时革质，干后木质，长达20 cm，宽达10 cm，厚达4 mm；孔口表面新鲜时白色至奶油色，干后浅黄色，有折光反应；不育边缘窄至几乎没有；孔口圆形至多角形，每毫米8–10个；管口边缘薄，全缘；菌肉奶油色至浅黄色，干后木栓质，厚达1 mm；菌管干后与孔口表面同色，干后硬木质，长达3 mm。

显微结构特征：菌丝系统一体系；生殖菌丝简单分隔，IKI–，CB+；菌丝组织在KOH试剂中无变化；菌肉菌丝无色，厚壁，具宽或窄内腔，频繁分枝，黏结，交织排列，直径为3–5.6µm；菌管菌丝无色，厚壁，具宽或窄内腔，频繁分枝，平直，平行于菌管排列，直径为2.4–5 µm；有些厚壁菌丝膨胀并伸出子实层，形成类似囊状体的结构；子实层无囊状体；锥形的拟囊状体也偶尔存在于子实层中，薄壁，大小为7.3–11.2 × 3.5–4.8 µm；担子短棍棒状至桶状，具4个担孢子梗，基部具一简单分隔，大小为7–10.6 × 4–5 µm；担孢子广椭圆形至近球形，无色，薄壁，光滑，IKI–，CB–，大小为(1.9–)2–2.5(–2.7) × (1.5–)1.6–2.1(–2.3) µm，平均长L = 2.17 µm，平均宽W = 1.88 µm，长宽比Q= 1.13–1.19 (n=90/3)。

菌种分子鉴定：子实体及菌丝体经试剂盒提取DNA，并以ITS5/ITS4引物扩增和测序，子实体和菌丝体共同的rDNA-ITS序列如下：

TCTTTAGTTACTGCGGAAGGTCATTTATTGATGAACTGAGTGAGGTTGTAGCTGGCTTCAGTCATTGGAGCATGTGCACACTTTGCTTGTTCTTCCAACCTTTACACTGTTGTGCACTTCTCATGGGATCAAGTTGTGGTATGAAATACAACCAACAGCTGTTCTCGTGTGTTTTTTTAAAAAACATACATCTGTTTGTTTAAGGAATGTTATTCATTTGTGCATCATTGCATATAAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGTATTCTCAAATCTCTTGTGTTTCTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAATACAAGCAGTTTTGGACTTGGAGGTAAATTGTTGGCTTTTGTCAGCTCCTCTGAAATGCATTAGCTTGAAACTGTACCAAGCACAATCCAGCGTGATAAACACTGCGCTGCTTTGTATTGGTTTTTATTTTTATGTTTCAAGCTTAAAACTGTTCCTGGCAAGGAACTCATTTTGGACATCTGACCTCAAATCAGTAGACACCAGTTC。

实施例1微小硬孔菌的醇沉样品

微小硬孔菌的醇沉样品的制备：

1、菌种的活化

取保存的试管母种一支，转接直径0.8cm的菌种块到制备好的平板培养基中，置24-25℃电热恒温培养箱中培养活化，倒置，避光培养6-7天。

待平板活化菌丝直径长至4-6cm时，利用活化好的平板菌种进行液体菌种活化。

500毫升三角瓶，每瓶装培养基100-200毫升，每瓶接0.8cm×0.8cm大小的菌块6-10块，置双层全温摇床23-27℃，120-150r/min震荡培养5-6d。

2、微小硬孔菌的液体发酵培养

将活化好的液体菌种以5%-10%的接种量接种至制备好的无菌液体培养基中（培养基配方：玉米淀粉1%，葡萄糖1%，麦芽糖1%，蛋白胨0.2%，酵母抽提物0.3%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%），置双层全温摇床23-27℃，120-150r/min震荡培养6-8d后终止发酵。

3、微小硬孔菌发酵液醇沉样品的制备

将终止发酵后的摇瓶取出，200目纱网将菌球过滤掉，将收集到的发酵液减压浓缩至原体积的1/8-1/10，然后向浓缩后的发酵液中加入4-5倍的95%酒精并充分混合，使混合溶液的酒精度在65%-75%左右，后4℃-15℃条件下，静置醇沉24h。醇沉结束后用低速大容量多管离心机以5000 r/min的速度离心10-30 min，所得沉淀即为微小硬孔菌发酵液醇沉样品。

实施例2

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品

药用真菌南方异担子菌醇沉物样品，编号为531，药用真菌微小多年卧孔菌醇沉物样品，编号为525，药用真菌微小硬孔菌醇沉物样品，编号为526，由青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室提供。

1.1.2 供试细胞株

人肝癌HepG2细胞，由天津师范大学惠赠。

1.1.3 药品与试剂

表1 药品

MTT溶液：高精密电子天平准确称量0.25 g MTT粉末，于离心管中用少量PBS缓冲液超声溶解后定容至50 mL，于超声工作台中经0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装至1.5mL灭菌离心管中，置于4℃冰箱中避光保存。

5-Fu溶液：用高精密电子天平准确称取0.25 g 5-Fu粉末，加入少量DMSO溶液，经超声处理至完全溶解，用DMEM完全培养基定容至10 mL，即得25 g/L的5-Fu溶液，混匀后取40 μL原液，用DMEM完全培养基定容至10 mL，即得到100 mg/L的5-Fu溶液，无菌环境中经0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，于4℃冰箱中保存备用。

DMEM完全培养基：于50 mL离心管中加入0.5 mL青链霉素混合液、5 mL的胎牛血清、和0.5 mL的非必需氨基酸，用DMEM 基础培养基定容至50 mL。于无菌环境中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱中保存备用。

0.25 %胰蛋白酶溶液：用高精密电子天平准确称量0.25 g胰蛋白酶粉末,加入少量PBS溶液，经超声处理充分溶解后，用PBS溶液定容至100 mL，无菌条件下，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装至离心管中，置于-20℃冰箱中保存备用。

细胞冻存液配方：胎牛血清：DMSO：DMEM培养基=9：1：1。

1.1.4 仪器及设备

表2 仪器

1.2 方法

1.2.1 不同浓度梯度含药培养基的配制

高精密电子天平准确称取125 mg的样品于含2 mL完全培养基的离心管中，超声处理使样品充分溶解，后5000 rpm离心5 min，收集上清液，沉淀部分经烘干后称重。将上清液于超净台中用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，得到62.5 mg/mL的样品溶液。上述样品溶液充分混匀后吸取200 μL，加入盛有800 μL完全培养基的离心管中，得到12.5 mg/mL的样品溶液，按上述方法依次稀释，得到2.5、0.5、0.1、0.02 mg/mL 6种样品溶液，6个浓度由低到高依次标记为C₁-C₆。

1.2.2 细胞复苏

在超低温冰箱（-80℃）中取出HepG2细胞的冷冻管，置于38℃的水浴锅中进行快速的溶化，不时地摇晃，在1 min内使其充分融化。在超净工作台中将其转移至离心管中，在1000 rpm的条件下离心5 min。用灭菌枪头将上清液弃除，加入适量DMEM完全培养基，用移液枪吹打均匀，将细胞悬液转移至细胞培养瓶中，加入适量完全培养基，之后放入含有5%CO₂、37℃的恒温恒湿培养箱中培养。

1.2.3 细胞传代

培养瓶中的细胞贴壁长满后，于超净台中弃掉旧的培养液。加入2 mL PBS进行冲洗，重复两次，后加入1.5 mL 0.25 %的胰酶消化2 min，将胰酶溶液弃掉后，加入2 mL完全培养基终止胰酶消化。用移液枪充分吹打细胞，制成均匀的细胞悬液，吸取1 mL悬液转移至新的细胞培养瓶中，加入适量完全培养基。将培养板瓶置于含有5 % CO₂、37℃的恒温恒湿培养箱中培养。

1.2.4 细胞冻存

在超净工作台中将已贴壁长满的细胞用2 mL PBS进行冲洗，重复两次，加入胰蛋白酶溶液消化2 min，后加入完全培养基终止消化，用移液枪充分吹打均匀，将细胞悬液转至离心管中，1000 rpm离心5 min，离心后于无菌条件下弃掉上清，加入细胞冻存液，用移液枪轻轻吹打使细胞均匀，后将细胞悬液分装至冻存管中，置于-80℃超低温冰箱中进行保存。

1.2.5 HepG2细胞生长曲线的绘制

将培养板中已贴壁的HepG2细胞用PBS冲洗后，再用0.25 %胰蛋白酶溶液消化，加入适量完全培养基后用移液枪反复吹打细胞，制成均匀的细胞悬液，吸取少量细胞悬液于血球计数板中，在光学显微镜下进行计数，最终制成2×10⁴个/mL的细胞悬液，将制成的细胞悬液均匀的接种到96孔板中，每孔接种100 μL上述细胞悬液，最外圈的孔铺设空白组，即每孔加入200 μL的PBS溶液。后放入37℃、含5 % CO₂的恒温恒湿CO₂培养箱中依次培养1、2、3、4、5、6、7、8、9 d，每隔3 d换一次培养液。每隔1 d利用MTT法于酶标分析仪中测定细胞的吸光值。即将每孔的上清液弃掉，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液和80 μL完全培养液，再放入37℃、含5 % CO₂的恒温恒湿CO₂培养箱中继续培养4 h，后弃掉上清液，每孔加入150 μL的DMSO溶液，于水平摇床上轻轻震摇15 min后，放入酶标分析仪中测定细胞在490 nm处的OD值，计算吸光值的平均值，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制HepG2细胞生长曲线。

1.2.6 HepG2细胞抑制增殖试验

在超净工作台中用0.25 %胰酶溶液消化培养已贴壁的细胞2 min，之后用DMEM完全培养基终止消化，用移液枪吹打均匀。利用血球计数板计数，最终制成2×10⁴个/mL的细胞悬液。将制成的细胞悬液均匀的接种到96孔板上，每孔接种100 μL上述细胞悬液，最外圈的孔铺设空白组，即每孔接200 μL的PBS，其他依次设置阴性对照组（完全培养基），阳性对照组（5-Fu溶液），药物组（1.2.1中分别标记为C_1-C₆）。每组设6个重复。后放入37℃、含5 %CO₂的恒温恒湿CO₂培养箱中分别培养1、2、3 d。培养相应时间后将培养板中的旧培养液弃掉，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液和80 μL的DMEM完全培养基，放入CO₂培养箱中继续培养4h，之后每孔加入150 μL的DMSO，放至水平摇床上轻轻震摇15 min，于酶标仪中检测细胞于490 nm处的OD值。

细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD值—加药组OD值）/对照组OD值×100%^]。

经Excel 软件计算出不同浓度梯度样品的抑制率后，利用Graphpad prism7软件计算供试样品对HepG2细胞增殖的半抑制浓度IC₅₀值。

1.2.7 细胞形态观察

培养瓶中的细胞贴壁长满后，于超净台中弃掉旧的培养液。加入2 mL PBS进行冲洗，重复两次，后加入1.5 mL 0.25 %的胰酶于消化2 min，将胰酶溶液弃掉后，加入2 mL完全培养基终止胰酶消化。用移液枪充分吹打，制成均匀的细胞悬液。利用血球计数板计数，最终制成2×10⁴个/mL的细胞悬液。将制成的细胞悬液均匀的接种到96孔板上，每孔接种100 μL上述细胞悬液，最外圈的孔铺设空白组，即每孔接200 μL的PBS，于37℃、含5 % CO₂的恒温恒湿CO₂培养箱中培养一定时间，后进行加药处理，继续培养一定时间。在相应时间时，于倒置显微镜下分别观察细胞悬浮、贴壁和加药后的形态。

1.2.8 统计方法

应用SPSS 23.0进行统计学分析，采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t检验。以P <0.05为差异有统计学意义。

2.结果与分析

2.1 HepG2细胞生长曲线

如图1所示，HepG2细胞在第1 d至第4 d生长较为缓慢，第4 d至第6 d呈指数增长，进入指数增长期，细胞数目急速增长。第6 d至第9 d细胞数目较稳定，进入到稳定期，且维持时间最少为3 d，因此可通过此生长曲线，确定最佳的加药时间。当细胞处于稳定期时，细胞数目较稳定，实验数据更稳定可信。由图可知，本试验于第6 d对HepG2细胞进行加药处理，加药后分别培养1-3 d，均处于细胞的稳定期阶段。

2.2 相同样品作用不同时间对HepG 2细胞增殖抑制率的影响

由图2结果可看出，随处理时间的延长，样品对HepG2细胞增殖的抑制率逐渐增大，呈现一定的时间依赖性效应。加药处理1 d后，当样品浓度较低时，对HepG2细胞生长具有促进作用，抑制效果不佳，当样品浓度较高(12.5、62.5 mg/mL)时，对细胞增殖表现出抑制作用，但明显低于处理第2 d的抑制效果。加药处理2 d后，不同浓度样品对HepG2细胞增殖均具抑制效果。加药处理3 d后，不同浓度样品对HepG2细胞增殖均表现出抑制作用，当样品浓度较低时，与第2 d的抑制率无明显差别，当样品浓度为12.5 mg/mL时，明显高于处理第2 d的抑制效果，两者抑制率相差10.9 %，差异极显著（p<0.01)，当样品浓度为62.5 mg/mL时，抑制率为81.6 %，与第2 d的抑制效果无明显差别。综合比较图中不同时间对细胞增殖的抑制情况，发现第2 d与第3 d的抑制率较高，且第2 d与第3 d 抑制率相差较小。综合来说，2d为最适药物作用时间。

2.3 不同样品作用2 d对HepG2细胞增殖抑制率的影响

如图3所示，3种样品作用2 d后，对HepG2细胞增殖均表现出抑制作用，且抑制率随样品浓度的升高而逐渐增大，呈现一定的剂量依赖性效应。当样品浓品浓度为62.5 mg/mL时，3种样品对细胞增殖的抑制效果最佳，与阴性对照组相比，差异极显著（p<0.01），且高于5-Fu药物组的抑制率。浓度为62.5 mg/mL时，525样品对HepG2细胞增殖的抑制率最高，达到97.2 %。当样品浓度为12.5 mg/mL时，3种样品均对HepG2细胞具抑制作用，与阴性对照组相比，差异极显著。

2.4 3种样品处理HepG2细胞2 d后的半抑制浓度（IC₅₀值)

IC₅₀值越低，代表样品对HepG2细胞增殖的抑制作用越显著。如图4所示，3种样品半抑制浓度的结果显示，531对HepG2细胞增殖抑制效果最好，IC₅₀值为6.8 mg/mL。其次是526和525，IC₅₀值分别为8.0 mg/mL和16.0mg/mL。

2.5 细胞形态观察

如图所示，冻存管中的细胞经融化离心后，加入DMEM完全培养基，吹打均匀后制成细胞悬液，细胞悬浮在培养液中，细胞呈圆形，且十分透亮，颗粒较少，细胞间界限清晰。HepG2细胞培养一定时间后进行贴壁生长，于倒置显微镜中可观察到在支持物表面呈梭形或不规则的三角形，细胞内颗粒少，透明且细胞之间连接十分紧密。HepG2细胞经加药处理后，细胞重新变为圆形且体积减小，细胞间的连接减弱，贴壁性变差，细胞浆内出现圆形的透明颗粒。

其他文献多在HepG2细胞对数生长期进行加药处理，但细胞在对数生长期时生长迅速，细胞数目变化大，若进行药物最佳作用时间的研究，数据的可靠性较低。为尽量避免此问题的发生，本试验通过绘制初始浓度为2×10⁴个/mL 时的HepG2细胞的生长曲线，旨在找出HepG2细胞生长的稳定期。实验结果发现，HepG2细胞于第6 d达到生长稳定期，因此确定HepG2细胞培养至第6 d时进行加药处理。培养至第6 d的HepG2细胞用不同浓度（62.5、12.5、2.5、0.5、0.1、0.02 mg/mL）药物分别处理1、2、3 d。实验结果发现，加药处理第1 d后，样品对HepG2细胞增殖的抑制效果较差，只在高浓度（12.5、62.5 mg/mL）时对细胞增殖表现出抑制作用，在低浓度时表现出促进HepG2细胞生长的作用。加药处理第2 d，3种药用真菌均对HepG2细胞增殖具抑制作用，且抑制效果较好，与第3 d的抑制率相差较小。综合考虑细胞培养时间延长存在的风险性与成本消耗，故认为2 d为药物最适作用时间，这与其他文献报道相一致。综合来看，3种样品作用2 d后，对HepG2细胞均表现出抑制作用，且通过观察加药后的形态观察，进一步证实了样品抑制细胞增殖的作用。

MTT法常被用来在体外筛选对细胞增殖具抑制作用的药物，其实验原理是具有活性的细胞线粒体中能够产生琥珀酸脱氢酶，这种酶可与MTT发生氧化还原反应，能够形成沉淀于细胞中的蓝紫色结晶—甲瓒，DMSO可使此种结晶发生溶解。经水平摇床使结晶充分溶解后，即可利用酶标分析仪在490 nm处测定细胞的吸光值，了解药物对细胞的抑制情况，死细胞因失活，故无法形成甲瓒，凋亡细胞形成甲瓒的能力也降低，吸光值也会降低，故可利用MTT法检测药物对细胞抑制作用的情况。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120> 一株微小硬孔菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 650

<212> DNA

<213> Rigidoporus minutus

<400> 1

tctttagtta ctgcggaagg tcatttattg atgaactgag tgaggttgta gctggcttca 60

gtcattggag catgtgcaca ctttgcttgt tcttccaacc tttacactgt tgtgcacttc 120

tcatgggatc aagttgtggt atgaaataca accaacagct gttctcgtgt gtttttttaa 180

aaaacataca tctgtttgtt taaggaatgt tattcatttg tgcatcattg catataaata 240

caactttcag caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 300

aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctcc 360

ttggtattcc gaggagcatg cctgtttgag tgtcatggta ttctcaaatc tcttgtgttt 420

cttttttttt taaaaaaaaa aatacaagca gttttggact tggaggtaaa ttgttggctt 480

ttgtcagctc ctctgaaatg cattagcttg aaactgtacc aagcacaatc cagcgtgata 540

aacactgcgc tgctttgtat tggtttttat ttttatgttt caagcttaaa actgttcctg 600

gcaaggaact cattttggac atctgacctc aaatcagtag acaccagttc 650

Claims

1.一株微小硬孔菌（Rigidoporus minutus），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏编号为CGMCC No.19150；保藏时间为2019年12月23日。

2.一种权利要求1所述的微小硬孔菌在制备抑制人肝癌HepG2细胞的药物中的应用。