CN115813910B - 尼菲霉素c在制备抗鼻咽癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尼菲霉素C在制备抗癌药物中的应用。发明人对分离自链霉菌Streptomyces sp.4503发酵液的大环内酯类天然产物尼菲霉素C进行研究发现，其对测试的多种鼻咽癌细胞具有显著的抑制作用，且优于临床抗鼻咽癌治疗药物5‑氟尿嘧啶，尼菲霉素C能够促进细胞内活性氧的产生，将细胞阻滞在DNA合成前期(G1)诱导细胞凋亡。本发明的尼菲霉素C是海洋细菌来源的次生代谢产物，发明人此次为首次发现尼菲霉素C在体外具有抑制多种鼻咽癌细胞增殖的作用，扩大了尼菲霉素C的应用并为开发新的抗鼻咽癌药物提供了备选化合物，在抗鼻咽癌药物方面具有良好的应用前景和应用价值，对开发我国海洋生物资源意义重大。
Description
技术领域
本发明属于癌症治疗技术领域，尤其涉及尼菲霉素C在制备抗鼻咽癌药物中的应用。
背景技术
鼻咽癌是由鼻咽上皮细胞引起的高转移性和侵袭性的恶性肿瘤，常见于中国南部的广东和广西，是一种区域高发性肿瘤。鼻咽癌常规治疗方案为放疗联合化学治疗，然而鼻咽癌细胞对放射和化疗敏感，其产生的多药耐药性已成为治疗失败的主要原因之一。目前临床上使用的鼻咽癌化疗药物主要为紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶等，这些药物对于受多基因调控且易产生耐药性的鼻咽癌而言，难以达到缓解患者病情的目的，因此寻找新的鼻咽癌治疗药物迫在眉睫。
链霉菌能够产生具有独特生物学活性且结构多样的次生代谢产物，一直是理想的药物来源之一，目前已有多种链霉菌来源的化合物被直接或间接应用于临床，如糖肽类抗肿瘤药物博莱霉素、大环内酯类抗菌药物红霉素、非核糖体肽类抗癌药物放线菌素、聚酮类抗生素四环霉素等。
红树林极端的生存条件往往促使栖居在此的微生物进化出与陆地微生物不同的代谢路径，产生结构新颖、活性机制独特的次生代谢产物。中国专利申请《一种红树林链霉菌B4503菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用》(专利申请号202210158232.4；公开日2022.6.17)报道了一株红树林链霉菌，该菌株分离自广西红树林土壤，经发酵分离出尼菲霉素C，该专利申请公开了尼菲霉素(niphimycin)C对香蕉枯萎病原真菌的抑制作用，而对其抗肿瘤活性并未提及。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供尼菲霉素C在制备抗鼻咽癌药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
尼菲霉素C在制备抗癌药物中的应用。
抗癌药物为抗癌药物。
鼻咽癌源于鼻咽癌细胞株5-8F、TW03、舌鳞癌、肝癌或肾癌源于细胞株CAL27、SNU449和OSRC2。
抗鼻咽癌是通过抑制鼻咽癌细胞的增殖并促进细胞内活性氧ROS的产生，将细胞阻滞在DNA合成前期G1诱导细胞凋亡。
尼菲霉素C的结构式为：
尼菲霉素C分离自链霉菌Streptomyces sp.4503的发酵液。
链霉菌Streptomyces sp.4503保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019647。
发明人在中国专利申请《一种红树林链霉菌B4503菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用》(专利申请号202210158232.4；公开日2022.6.17)的基础上，对分离自链霉菌Streptomyces sp.4503发酵液的大环内酯类天然产物尼菲霉素C进行研究发现，其对测试的多种鼻咽癌细胞(5-8F和TW03)、舌鳞癌、肝癌或肾癌细胞(CAL27、SNU449和OSRC2)具有显著的抑制作用，且优于临床抗鼻咽癌治疗药物5-氟尿嘧啶(体外对鼻咽癌细胞株的IC50值尼菲霉素C低于5-氟尿嘧啶)，尼菲霉素C能够促进细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，将细胞阻滞在DNA合成前期(G1)诱导细胞凋亡。本发明的尼菲霉素C是海洋细菌来源的次生代谢产物，发明人此次为首次发现尼菲霉素C在体外具有抑制鼻咽癌细胞增殖的作用，扩大了尼菲霉素C的应用并为开发新的抗鼻咽癌药物提供了备选化合物，在抗鼻咽癌药物方面具有良好的应用前景和应用价值，对开发我国海洋生物资源意义重大。
附图说明
图1是尼菲霉素C对各种癌细胞株的细胞毒活性比较及IC50值结果图，图中：a鼻咽癌细胞系5-8F，b鼻咽癌细胞系TW03，c人舌鳞癌细胞系CAL27，d肝癌细胞系SNU449，e肾癌细胞系OSRC2。
图2是尼菲霉素C对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的增殖能力影响结果图。
图3是尼菲霉素C对鼻咽癌细胞株TW03细胞内活性氧水平的影响结果图，图中：aTW03+DMSO，b TW03+尼菲霉素C。
图4是尼菲霉素C对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的周期阻滞实验结果图，图中：aTW03+DMSO，b TW03+尼菲霉素C，c 5-8F+DMSO，d 5-8F+尼菲霉素C，e尼菲霉素C对TW03的周期阻滞,f尼菲霉素C对TW03的周期阻滞。
图5是尼菲霉素C对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的凋亡影响结果图，图中：a TW03+DMSO，b TW03+尼菲霉素C，c尼菲霉素C诱导TW03的凋亡百分比；d 5-8F+DMSO，e 5-8F+尼菲霉素C，f尼菲霉素C诱导5-8F的凋亡百分比。
保藏信息说明
红树林链霉菌(Streptomyces sp.)B4503，保藏编号为CCTCC NO:M 2019647，保藏日期：2019年8月19日，保藏地址为：中国武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
保藏条件：链霉菌(Streptomyces sp.)B4503保藏在-80℃、含有20％甘油的链霉菌液体培养基2号(麦芽提取物2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母提取物2.0g/L,pH 7.2-7.4)中。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明如何实施，其中所用试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，所用试剂和材料均为市购。其中，尼菲霉素C按中国专利申请《一种红树林链霉菌B4503菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用》(专利申请号202210158232.4；公开日2022.6.17)制得。
实施例1尼菲霉素C对多种鼻咽癌细胞株的体外细胞毒活性
尼菲霉素C使用二甲基亚砜(DMSO)溶解后经0.22μm的无菌滤头过滤制得无菌样液。分别取对数生长期的癌肿瘤细胞5-8F、TW03、CAL27、SNU449和OSRC2，用高糖DMEM培养基(美国赛默飞世尔科技公司)配制成5×104个/mL的细胞悬浮液后接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，于37℃、5％ CO2培养箱中孵育过夜培养，待细胞贴壁后每孔加入样液1μL并于同等条件下反应24h，然后每孔加入10μL细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)溶液，再继续反应1.5h后，将96孔板置于多功能酶标仪并在450nm处测量吸光值，细胞活力＝(OD实验值-OD空白)/(OD对照值-OD空白)×100％。以仅加入1μL DMSO的样品作为阴性对照，每个样品重复三次。生长抑制曲线由GraphPad Prism 9绘制，半抑制浓度(half maximalinhibitory concentration,IC50)值取三次独立实验的平均值，由IBM SPSS Statistics23计算。
结果如图1和表1所示。“-”表示未测试。
表1尼菲霉素C对多种癌细胞株的体外细胞毒活性
实施例2尼菲霉素C对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F增殖能力的影响
克隆平板实验：
取对数生长期的鼻咽癌细胞TW03和5-8F，以2×105/孔，接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育过夜，待细胞贴壁后，实验组更换23μg/mL尼菲霉素C的完全培养基，并以等量DMSO作为对照组，继续培养24小时。随后用0.25％ EDTA的胰酶消化，离心，收集细胞，用新鲜的完全培养基重悬并进行细胞计数。将细胞稀释至适当浓度，以200个/孔接种于6孔板中，轻柔吹打成均匀的细胞悬液，各组细胞设3个重复。置于37℃，5％CO2培养箱内培养，每2-3天更换1次新鲜的完全培养液，培养11-14天。当对照组培养皿中出现肉眼可见细胞克隆群落，且单个克隆细胞群落多于50个细胞时，即可终止培养。使用移液器吸掉原培养基，加入适量PBS于摇床上轻柔的清洗细胞，每次5min，共2次。随后用4％多聚甲醛室温固定约30min，然后弃掉固定液，加入适量PBS于摇床上轻柔的清洗细胞，每次5min，共2次。加入1mL/孔(6孔板)0.2％结晶紫染液，室温静置染30min，流动水冲洗染液，室温条件下风干。最后观察各组细胞的克隆团数目，并拍照记录。
结果如图2所示，尼菲霉素C能够有效抑制鼻咽癌细胞TW03和5-8F的克隆形成。
实施例3尼菲霉素C对鼻咽癌细胞内活性氧产生的影响分析
采用ROS检测试剂盒检测鼻咽癌TW03细胞中ROS的水平。取对数生长期的细胞，以1.5×105个/孔接种到6孔板中，待细胞贴壁生长后，加入N-乙酰半胱氨酸(NAC，10mmol/L)反应1h，随后加入28μg/mL尼菲霉素C处理。反应24h后加入DCFH-DA在37℃孵育30min，在荧光显微镜下观察和拍照，以不加尼菲霉素C处理的细胞ROS荧光强度为参照。
结果如图3所示，与对照组比较，尼菲霉素C处理后的鼻咽癌细胞TW03中ROS荧光强度更强，说明其能促进鼻咽癌细胞ROS的产生，破坏了鼻咽癌细胞内正常的氧化还原平衡状态。
实施例4尼菲霉素C对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F的细胞周期影响实验
应用细胞周期试剂盒，使用28μg/mL的尼菲霉素C处理鼻咽癌细胞株TW03和5-8F，24h后通过流式细胞仪检测并评价尼菲霉素C对两种鼻咽癌细胞株细胞周期的影响，以仅加入DMSO的处理组作为对照。
实验结果如图4所示，经28μg/mL的尼菲霉素C处理24h后，鼻咽癌细胞TW03和5-8F的G1期比例增加，G2比例下降，可说明尼菲霉素C可以诱导鼻咽癌细胞G1期阻滞。
实施例5尼菲霉素C对鼻咽癌细胞凋亡的影响分析
采用细胞凋亡试剂盒，使用28μg/mL尼菲霉素C处理鼻咽癌细胞TW03和5-8F，随后通过流式细胞仪检测检测处理24小时后的细胞，评价其凋亡诱导效应，以仅加入DMSO的处理组为对照组。
实验结果如图5所示，与对照组相比，经尼菲霉素C处理后的鼻咽癌细胞TW03和5-8F的总凋亡(total)、早期凋亡(early stage)和晚凋亡(later stage)比例均升高，说明尼菲霉素C可以诱导鼻咽癌细胞凋亡。
Claims (4)
1.尼菲霉素C在制备抗鼻咽癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述鼻咽癌源于鼻咽癌细胞株5-8F、TW03。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述尼菲霉素C分离自链霉菌Streptomyces sp. 4503的发酵液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述链霉菌Streptomyces sp. 4503保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2019647。
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| 海洋放线菌抗肿瘤活性物质的研究进展;丁衍等;《天然产物研究与开发》;323-333 * |
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