CN108384757A - 一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法，取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含有新生胎牛血清的DMEM培养液中培养，在培养液中加入奥沙利铂进行诱导，待细胞恢复正常生长时，浓度递增，当细胞能在0.5μmol/L浓度下正常生长、传代时，用奥沙利铂冲击培养，更换奥沙利铂浓度为0.5μmol/L的培养基培养，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，然后浓度递增，再用奥沙利铂冲击诱导直至细胞能在10.0μmol/L的奥沙利铂中生长，获得能够在含有10.0μmol/L奥沙利铂的培养体系中稳定生长、传代的人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系。本发明建立胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法简便易行、建立时间短；耐药指数接近20。

Description

一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种细胞系，具体来说是一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法。
背景技术
胆囊癌是胆管系统最为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势，致死率一直居高不下，主要原因是胆囊癌患者在早期无特异性症状，因此大部分患者就诊时已属晚期，虽然手术切除是目前的主要治疗手段，但80％的患者在确诊时就已发生转移，手术切除率不到30％，术后复发率很高，预后极差，因此药物化疗对于晚期胆囊癌患者尤为重要。
奥沙利铂(Oxaliplatin，OXA)是第三代铂类药物，主要通过干扰DNA的合成过程发挥抗肿瘤作用，其与DNA的结合速度较顺铂和卡铂快10倍以上，细胞毒作用更强，目前主要用于大肠癌、胃癌和胰腺癌的治疗，对晚期、转移结直肠癌也有较好的治疗效果。此外，研究表明奥沙利铂在胆囊癌的系统治疗中也发挥了积极的作用。
虽然化疗是治疗晚期胆囊癌的主要手段之一，但化疗中经常出现并且难以避免、解决的多药耐药性(mμltidrμgresistance，MDR)是化疗失败的主要原因，因此研究胆囊癌的耐药机制以克服或逆转胆囊癌多药耐药性对于疗效的提升具有重大意义，但是目前尚缺乏对奥沙利铂耐药的胆囊癌细胞系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法，所述的这种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法要解决现有技术中没有合适的细胞系用于研究胆囊癌的耐药机制的技术问题。
本发明提供了一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法，包括如下步骤：
取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入奥沙利铂进行诱导，奥沙利铂的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在0.5μmol/L浓度下正常生长、传代时，用含有1.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含有 0.5μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10 天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含有1.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为 20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至人胆囊癌细胞能在含有1.0 μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含有4.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含有10.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，然后更换含有奥沙利铂浓度为4.0μmol/L、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养基培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含有10.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击，直至细胞能在含有10.0μmol/L 的奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，获得了能够在含有10.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养体系中稳定生长、传代的人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系。
进一步的，所述的人胆囊癌细胞为SGC-996。
本发明以人胆囊癌SGC-996为亲本细胞，利用奥沙利铂模拟化疗过程，采用大剂量冲击结合逐步增加剂量法，建立获得性胆囊癌耐药细胞系SGC-996/OXA，并测定其生物学特性以评价耐药细胞系。
本发明建立胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法简便易行、建立时间短；耐药指数接近20。本发明的方法可用于研究胆囊癌对奥沙利铂耐药的分子机制、逆转肿瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物，发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明以人胆囊癌细胞SGC-996为对象，采用逐步增加药物浓度法建立其奥沙利铂耐药细胞株，对胆囊癌耐药机制的研究、指导临床用药以及开发、评价新药等具有重要的应用价值。本发明建立所得的胆囊癌耐药细胞株可直接用于抗癌药物的敏感性、耐药性机制的研究、筛选和评估新型抗肿瘤药物等。
附图说明
图1倒置显微镜下SGC-996与SGC-996/OXA的形态。
图2SGC-996与SGC-996/OXA的生长曲线。
图3SGC-996与SGC-996/OXA对奥沙利铂的耐受性。
图4胆囊癌细胞及其耐药细胞的克隆形成能力(***表示p<0.001)。
图5胆囊癌细胞及其耐药细胞的迁移能力(***表示p<0.001)。
具体实施方式
实施例1：耐药细胞系的诱导
采用大剂量冲击结合逐步增加剂量法诱导，取对数生长期的人胆囊癌SGC-996细胞(JN-C0997，购自上海榕柏生物技术有限公司)接种在含20％新生胎牛血清的DMEM 培养液中(含20％新生胎牛血清的DMEM培养液均为下述培养液的基础培养液)，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。在含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入奥沙利铂进行诱导，初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L 浓度递增，当细胞能在0.5μmol/L浓度下正常生长、传代时，用含有1.0μmol/L OXA、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，立即更换OXA浓度为0.5μmol/L 的培养基培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在含有OXA1.0 μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在4.0μmol/LOXA浓度、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液正常生长、传代时，用10.0μmol/L的OXA、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，立即更换OXA浓度为4.0μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液的培养基培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在10.0μmol/L的OXA 中生长，历时四个月，最终获得了能够在含有10.0μmol/L OXA、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液的培养体系中稳定生长、传代的SGC-996细胞，命名为SGC-996/OXA。
实施例2：形态学观察
利用倒置相差显微镜观察SGC-996在奥沙利铂诱导前后的形态，并拍照记录。如图1所示，SGC-996为类多边形，部分细胞为短梭形，棱角分明，而SGC-996/OXA的形态发生了明显的变化，部分细胞明显拉长，为长梭形，部分细胞具多个伪足，此外细胞的体积也略有增大。
实施例3：生长曲线的测定
取对数生长期的SGC-996与其耐药细胞SGC-996/OXA，胰酶消化后用DMEM完全培养液重悬细胞，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔培养板中，每组设4 个复孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜后，每天以MTT法测定每组在492nm 的吸光值A，连续测定5天，以培养天数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制生长曲线。
如图2所示，SGC-996与其耐药细胞SGC-996/OXA的生长趋势基本一致，前三天生长较慢，后两天生长加速，进入指数生长期。总的来说，耐药前的SGC-996生长较快，而耐药后的SGC-996生长有所减缓。
实施例4：药物浓度—生存率曲线的绘制与耐药指数的测定
取对数生长期的SGC-996与SGC-996/OXA细胞，胰酶消化后用培养液调整细胞密度为105个/mL，接种于96孔培养板中，加入适量奥沙利铂，使其终浓度依次为0、0.05、 0.1、0.5、1、5、10、50、100μmol/L，每个浓度设4个复孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h后，采用MTT法测定每组在492nm的吸光值A，根据下式计算生存率(％)：
生存率(％)＝样品OD均值/对照OD均值×100
以OXA的浓度为横坐标，每组的生存率为纵坐标，绘制药物浓度—生存率曲线，并计算半数抑制浓度(IC50)，根据下式计算耐药指数(RI)。
耐药指数(RI)＝耐药细胞IC50/亲本细胞IC50
如图3所示，SGC-996在低剂量(0.05～0.1μmol/L)时对奥沙利铂不敏感，随着给药浓度的提升，SGC-996的存活率逐步下降，而其耐药细胞系SGC-996/OXA在0.05～10 μmol/L时对奥沙利铂表现出良好的耐受性。SGC-996与SGC-996/OXA的IC50依次为 4.73、88.89μmol/L，经计算耐药指数(RI)为18.79，提示耐药细胞系的IC50提升了 18倍左右，SGC-996奥沙利铂耐药细胞系构建成功。
实施例5：平板克隆实验
取对数生长期的SGC-996与其耐药细胞SGC-996/OXA，胰酶消化后用培养液调整细胞密度，按每孔1000个细胞的密度接种入6孔板，每种细胞设3个复孔，待细胞贴壁后加入适量奥沙利铂，使其终浓度均为1μmol/L，随后置于37℃，5％CO2培养箱中培养10-14天，当培养板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清，用PBS清洗小心浸洗2次，加4％多聚甲醛固定细胞15分钟，然后弃去固定液，PBS洗1次，加适量0.1％结晶紫染色液染10～15分钟，然后用水洗去染色液，空气干燥后拍照记录，计算六孔板中肉眼可见的克隆数，用SPSS进行统计学分析。
如图4所示，耐药细胞形成的克隆较多，部分克隆较大，而对照细胞形成的克隆稀疏，克隆数仅为耐药组的12％左右，提示耐药细胞在低剂量奥沙利铂的存在下具有更强的克隆形成能力。
实施例6：Transwell迁移实验
取对数生长期的SGC-996细胞与其耐药细胞SGC-996/OXA，胰酶消化后收集细胞，用PBS洗两遍，然后用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为4×105/ml，每个小室加入100μL细胞液，在小室外加入600μL含10％血清的培养基，每个样品设三个平行，随后置于37℃、5％CO2条件下常规培养24h。
培养结束后，弃去小室内培养基，PBS漂洗2次，用棉签擦拭去小室内部的细胞，随后加入适量90％甲醇固定，待甲醇挥去后，加入适量0.1％结晶紫染色液处理10分钟，然后用水洗去染色液，干燥后拍照记录，并在200×光镜下计数5个视野的迁移细胞数，以迁移细胞的数目表示肿瘤细胞的迁移能力。
如图5所示，SGC-996的迁移数很少，而SGC-996/OXA的迁移数约为SGC-996 的8倍左右，迁移能力显著增强(p＜0.001)，这可能与其细胞形态具有一定的相关性， SGC-996主要为类多边形，而其耐药细胞多为长梭形，具长伪足，这种形态可能更加利于细胞的迁移。

Claims (2)

1.一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法，其特征在于包括如下步骤：
取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入奥沙利铂进行诱导，奥沙利铂的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在0.5μmol/L浓度下正常生长、传代时，用含有1.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含有0.5μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含有1.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至人胆囊癌细胞能在含有1.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含有4.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含有10.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，然后更换含有奥沙利铂浓度为4.0μmol/L、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养基培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含有10.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击，直至细胞能在含有10.0μmol/L的奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，获得了能够在含有10.0μmol/L奥沙利铂、体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养体系中稳定生长、传代的人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法，其特征在于包括如下步骤：所述的人胆囊癌细胞为SGC-996。
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