CN114181906B

CN114181906B - 人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株及其用途

Info

Publication number: CN114181906B
Application number: CN202111505305.4A
Authority: CN
Inventors: 黄卫人; 牛立慢; 刘凯清
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: CN114181906A

Abstract

本申请公开了一种人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株，命名为人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株5637‑GEM‑A1，其保藏编号为GDMCC No：61948。该人膀胱癌耐药细胞株的耐药指数符合耐药株的评定要求，在研究膀胱癌耐药机制、挖掘膀胱癌吉西他滨耐药靶标、逆转膀胱癌细胞耐药性及指导病人用药方面具有重要的应用前景。

Description

人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株及其用途

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株。

背景技术

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，中晚期膀胱癌患者采用的手术半切除术辅助以化疗是延缓膀胱癌进展、延长术后生存期的重要手段，但临床上约有61％的泌尿系统肿瘤为成天然性多药耐药，导致化疗效果不佳，术后易复发。

吉西他滨(Gemcitabine)，为一种新的胞嘧啶核苷衍生物。和阿糖胞苷一样，吉西他滨进入人体内后由脱氧胞嘧啶激酶活化，由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢。吉西他滨为嘧啶类抗肿瘤药物，作用机制和阿糖胞苷相同，其主要代谢物在细胞内掺入DNA，主要作用于G1/S期，是膀胱癌治疗的临床一线用药，能够在一定程度上有效杀死癌细胞，但吉西他滨耐药限制了其在膀胱癌临床治疗中的应用效果。肿瘤细胞耐药是一个复杂的调控过程，因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。5637是用于人膀胱癌研究的良好细胞工具，但目前，国内尚无以人膀胱癌细胞株5637为诱导对象制备吉西他滨耐药细胞株，无法满足膀胱癌吉西他滨耐药的基础研究。

发明内容

本发明提供一种新的人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株。

本发明提供一种人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株，命名为人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株5637-GEM-A1，其保藏编号为GDMCC No：61948。

所述人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株应用于建立人膀胱癌多药耐药的研究模型。

所述人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株应用于解析膀胱癌吉西他滨耐药的作用机制。

所述人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株应用于筛选膀胱癌吉西他滨化疗药物中的用途。

本发明的有益效果是：该人膀胱癌耐药细胞株的耐药指数符合耐药株的评定要求，在研究膀胱癌耐药机制、逆转膀胱癌细胞耐药性和指导病人用药方面具有重要的应用前景。

附图说明

图1是5637细胞及本实施方式5637-GEM-A1细胞倒置显微镜拍照的细胞形态图，其中，标尺＝50μM；

图2是PI/Annexin V染色检测Gemcitabine刺激的5637细胞及其耐药株5637-GEM-A1细胞凋亡情况结果图，其中，Q4:活细胞比例，Q3:早期凋亡细胞，Q2：晚期凋亡细胞，Q1：机械损伤，黑色框(即Q2+Q3部分)：总凋亡细胞比率；

图3是结晶紫染色检测5637细胞及其耐药株5637-GEM-A1细胞的迁移能力结果图，其中，箭头代表迁移细胞，标尺＝100μM。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本申请作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式，各实施例所涉及的操作步骤也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的组成和/或顺序。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

本发明采用人膀胱癌细胞株5637为诱导对象，利用不同浓度的吉西他滨连续处理四个月，寻找细胞能够存活并缓慢生长的最大耐药浓度，并以此浓度作为筛选浓度继续处理上述5637细胞四个月，进一步获得能在吉西他滨处理下快速生长的人膀胱癌吉西他滨耐药株(5637-GEM-A1)。

本发明人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株，命名为5637-GEM-A1，其保藏编号为GDMCCNo：61948，分类名为：人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株，于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼。

一、本发明涉及的人膀胱癌吉西他滨耐药株5637-GEM-A1通过以下步骤构建获得：

1.细胞培养

人膀胱癌细胞5637培养于1640完全培养液中(1640+10％FBS+1xPenicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution)，并置于37℃、5％CO₂孵育箱保持饱和湿度培养，2-3天传代一次。人膀胱癌细胞5637购自于深圳市硕擎生物技术有限公司。

2.诱导建立人膀胱癌细胞5637耐药株

2.1细胞复苏，调整细胞状态，检测细胞IC50(72h，SPSS软件统计)。

2.2调整5637细胞密度60％左右，于培养基中加入一定浓度(IC30)的药物，共培养48～72h后撤药，PBS洗涤，换入正常培养基，观察细胞状态，待细胞恢复后，胰酶消化，再以合适细胞密度接种于新培养瓶中，待其逐渐长至50％—60％时，再次加入含药(浓度为IC30)培养基共培养，如此反复含药共培养，并同时进行抗药性检测，反复冻存、复苏、观察细胞株的稳定性。

3.CCK8法检测细胞耐药性

3.1细胞消化、计数、配制成浓度为3.5×10⁴个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔4.0×10³个细胞)；

3.2 96孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

3.3用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；

3.4 96孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时；

3.5将96孔板进行CCK8染色，λ＝450nm，测定OD值；

1)每孔加入10μl CCK-8，在培养箱继续培养2-3小时；

2)摇床10分钟轻轻地混匀，去除96孔板中气泡；

3)λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。

3.6计算各组别抑制率

各组别抑制率如表1所示。

表1吉西他滨对人膀胱癌细胞5637体外增殖的抑制率

4.半数抑制率及耐药指数的计算

应用SPSS(Staffstical Package for the Social Science)17.0通过机率单位加权回归法(Bliss法)计算半数抑制率(IC50)，根据IC50值计算出耐药指数(resistanceindex,RI)，RI＝耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50，RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。

本发明获得的膀胱癌细胞5637的吉西他滨耐药指数为8.5，耐药性符合耐药株要求。最终构建的耐药株5637-GEM-A1细胞培养条件为：1640+10％FBS+1x Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution，吉西他滨药物维持浓度：0.02μM。

表2吉西他滨对人膀胱癌细胞5637体外增殖的半数抑制浓度

本发明通过吉西他滨药物浓度递增法，构建了一种以人膀胱癌细胞5637为对象的人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株，耐药指数为8.5，符合耐药株的评定要求(RI>5)。

二、本发明涉及的人膀胱癌吉西他滨耐药株5637-GEM-A1与亲本细胞相比具有以下特征：

1.形态学特征：倒置显微镜记录5637及5637-GEM-A1细胞在吉西他滨诱导前后的细胞形态。如图1所示，5637-GEM-A1耐药细胞株与其亲本细胞株5637相比，大小及形态未见显著变化。

2.药物敏感性：取对数生长期的5637细胞及5637-GEM-A1耐药细胞，弃培养上清，加入0.25％胰酶，37℃二氧化碳孵育箱消化6min；将细胞吹打成单个细胞并加入至1640完全培养基中终止消化；收集细胞至离心管中，1500rpm，离心5min；弃上清，加入1ml无血清培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为5×l0⁴个/孔，共计2个副孔；于细胞铺板第2天，加入0.1μM吉西他滨(Gemcitabine)培养48小时。

流式细胞术检测5637及5637-GEM-A1细胞对Gemcitabine促凋亡敏感性。如图2所示，与敏感株5637相比，5637-GEM-A1对Gemcitabine处理更具耐药性，凋亡细胞明显减少，活细胞比例增多，提示5637-GEM-A1耐药细胞系对Gemcitabine具有良好的耐受性。

3.迁移实验：取对数生长期的5637细胞及5637-GEM-A1耐药细胞，消化并计数，调整细胞密度为1.5×l0⁴个/200ul/孔，共计3个副孔；耐药株下层小室外加入含0.02μM吉西他滨的1640完全培养基600ul，置于37℃、5％CO₂条件下常规培养48h。

培养到规定时间后，弃小室内培养基，预冷的PBS冲洗3次，用棉签轻轻擦拭去小室内部细胞，4％多聚甲醛室温固定10min，PBS冲洗3次，加入适量2％结晶紫染色液处理30分钟，PBS冲洗3次，干燥后倒置显微镜拍照记录，如图3所示，与亲本细胞5637相比，5637-GEM-A1细胞的迁移能力显著增强，提示膀胱癌吉西他滨耐药细胞系具有较强的迁移能力，对于膀胱癌细胞耐药以及侵袭方面的研究具有重要价值。

三、本发明涉及的人膀胱癌吉西他滨耐药株5637-GEM-A1具有如下应用潜能

1.本发明构建的膀胱癌5637-GEM-A1耐药细胞株对于更好的探寻膀胱癌吉西他滨耐药新机制、挖掘膀胱癌吉西他滨耐药新靶点、开发逆转膀胱癌吉西他滨耐药的联合应用型小分子药物，对于逆转膀胱癌吉西他滨耐药及指导病人临床用药方面都具有重要的应用价值。

2.该耐药细胞株能够用于筛选膀胱癌吉西他滨耐药特异性靶标，该靶标可以是：

1)RNA：包括但不限于环状RNA(circular RNA，circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)；

2)DNA：包括但不限于染色体DNA、染色体外DNA(extrachromosomal DNA)、染色体外环状DNA(eccDNA，extrachromosomal circular DNA)、双微体(double minutes)、染色体外的小片段DNA(microDNA)；

3)蛋白：包括但不限于肽、激素、抗体、血红蛋白、白蛋白、球蛋白(如蛋清蛋白，酪蛋白，胰岛素，酶等)、收缩蛋白、转运蛋白、脂蛋白、膜蛋白、核蛋白等。蛋白相关的靶通路可以为复杂的蛋白翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等。

3.该耐药细胞株还能够用于筛选吉西他滨化疗药物，该药物可以是中药或中成药、小分子类药物、多肽类药物以及基因治疗类药物等。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims

1.一种人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株，其特征在于，命名为人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株5637-GEM-A1，其保藏编号为GDMCC No：61948。

2.如权利要求1所述的人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株在用于建立人膀胱癌多药耐药的研究模型中的用途。

3.如权利要求1所述的人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株在用于探讨膀胱癌吉西他滨耐药的作用机制中的用途。

4.如权利要求1所述的人膀胱癌吉西他滨耐药细胞株在用于筛选膀胱癌吉西他滨化疗药物中的用途。