CN109745333A - 一种用于膀胱癌治疗的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于膀胱癌治疗的药物组合物及其应用。本申请用于膀胱癌治疗的药物组合物，其活性成份由阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯组成。本申请的药物组合物，利用EGCG与DOX的协同抗膀胱癌作用，不仅降低了药物组合物整体的心脏毒性，而且对正常膀胱尿路上皮细胞毒副作用小。本申请的药物组合物与单独使用DOX相比，具有更好的膀胱癌细胞增长抑制效果，不仅可以更好可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵染，而且具有更好的诱导膀胱癌细胞凋亡效果。本申请的药物组合物，为膀胱癌的治疗提供了一种抗癌效果更好，且毒性更小的新药。

Description

一种用于膀胱癌治疗的药物组合物及其应用

技术领域

本申请涉及膀胱癌治疗药物领域，特别是涉及一种用于膀胱癌治疗的药物组合物及其应用。

背景技术

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的，泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是人体全身十大常见肿瘤之一。膀胱癌占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。膀胱癌甚至可发生于儿童，并且发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。

阿霉素(Doxorubicin，缩写DOX)是常用的癌症化疗药物，也是治疗膀胱癌的一线化疗药。阿霉素抗瘤谱广，疗效好；但该药毒性较大，长期使用易诱导严重的心脏毒性。因此寻找具有协同抗肿瘤功效的联合治疗方案是膀胱癌症研究的重要方向。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于膀胱癌治疗的药物组合物及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于膀胱癌治疗的药物组合物，该药物组合物的活性成份由阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯组成。

需要说明的是，本申请的药物组合物，采用阿霉素(缩写DOX)和表没食子儿茶素没食子酸酯(缩写EGCG)联合用药，两者协同抗肿瘤；与单独使用阿霉素相比，一方面，降低了阿霉素的用量，不仅降低了药物组合物整体的心脏毒性，而且对正常膀胱尿路上皮细胞毒副作用小；另一方面，联合用药对膀胱癌细胞增长抑制效果、癌细胞凋亡诱导效果，以及抑制膀胱癌细胞迁移和侵染的效果，都优于单独使用DOX或EGCG。

可以理解，本申请的药物组合物只要DOX和EGCG联合使用都具有本申请的降低心脏毒性，提高细胞增长抑制效果、提高细胞凋亡诱导效果和提高癌细胞迁移和侵染抑制效果等功效，并且，研究显示，以上功效的改善在一定范围内与EGCG的用量成正比，也就是说，EGCG的量越大，功效改善越显著。本申请的一种实现方式中，EGCG+DOX对膀胱癌细胞的抑制作用呈浓度依赖关系，DOX浓度为0.1μM时，EGCG浓度在100μM-400μM的范围内，随着用量增加膀胱癌细胞抑制效果越明显，在400μM时，T24细胞的存活率低于20％。

还需要说明的是，本申请的药物组合物，其活性成份为DOX和EGCG，根据不同的使用需求，还可以在其中添加药物学允许的辅助材料或添加剂，例如制成水剂或类似糖浆的浆料时，可以添加适量的药物学允许的溶剂或糖，制成丸剂时，可以添加药物学允许的成型辅料，在此不做具体限定。可以理解，本申请的药物组合物根据使用需求，可以制成各种药物学允许的剂形，例如制成水剂、丸剂、胶囊等，在此不做具体限定。

优选的，阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯的物质的量比为1:1000～1:250。

本申请的再一方面公开了本申请的药物组合物在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

可以理解，本申请的药物组合物，由于能够降低心脏毒性，提高膀胱癌细胞增长抑制效果、提高膀胱癌细胞凋亡诱导效果和提高膀胱癌细胞迁移和侵染抑制效果，因此特别适合用于制备治疗膀胱癌的药物，至于具体的剂形，可以根据具体使用需求而定，在此不做具体限定。

本申请的再一方面公开了表没食子儿茶素没食子酸酯在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

需要说明的是，本申请经过研究发现EGCG可以与DOX协同抗膀胱癌，不仅可以降低单独使用DOX的心脏毒性，而且抗癌效果比单独使用DOX更好，从而研发了EGCG用于制备治疗膀胱癌药物的新用途。至于EGCG的具体用量，如何与DOX配伍，可以根据具体的剂形和使用需求而定，在此不做限定。

本申请的再一方面公开了阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯的组合物在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。优选的，其中，阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯的物质的量比为1:1000～1:250。

本申请的有益效果在于：

本申请的药物组合物，利用EGCG与DOX的协同抗膀胱癌作用，不仅降低了药物组合物整体的心脏毒性，而且对正常膀胱尿路上皮细胞毒副作用小。本申请的药物组合物与单独使用DOX相比，具有更好的膀胱癌细胞增长抑制效果，不仅可以更好可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵染，而且具有更好的诱导膀胱癌细胞凋亡效果。本申请的药物组合物，为膀胱癌的治疗提供了一种抗癌效果更好，且毒性更小的新药。

附图说明

图1是本申请实施例中不同浓度的EGCG和/或DOX影响下T24的细胞生长曲线；

图2是本申请实施例中不同浓度的EGCG和/或DOX影响下SW780的细胞生长曲线；

图3是本申请实施例中不同浓度的EGCG和/或DOX影响下SV-HUC-1的细胞生长曲线；

图4是本申请实施例中不同浓度的EGCG和/或DOX分别对SW780、T24处理后流式细胞仪统计的细胞分散图；

图5是本申请实施例中统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对T24细胞凋亡的影响图；

图6是本申请实施例中统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对SW780细胞凋亡的影响图；

图7是本申请实施例中不同浓度EGCG和/或DOX的影响下T24划痕愈伤实验照片；

图8是本申请实施例中T24划痕面积的柱状图；

图9是本申请实施例中不同浓度EGCG和/或DOX的影响下T24细胞侵染的染色照片；

图10是本申请实施例中统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对T24细胞侵染的影响图；

图11是本申请实施例中不同浓度EGCG和/或DOX的影响下SW780划痕愈伤实验照片；

图12是本申请实施例中SW780划痕面积的柱状图；

图13是本申请实施例中不同浓度EGCG和/或DOX的影响下SW780细胞侵染的染色照片；

图14是本申请实施例中统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对SW780细胞侵染的影响；

图15是本申请实施例中不同浓度的EGCG和/或DOX对SW780的蛋白表达影响的检测结果；

图16是本申请实施例中不同浓度的EGCG和/或DOX对肿瘤中蛋白表达的检测结果；

图17是本申请实施例中免疫组化检测MDM2和p53在肿瘤中的表达结果；

图18是本申请实施例中小鼠的体重检测结果；

图19是本申请实施例中小鼠的血液生化指标检测结果；

图20是本申请实施例中小鼠的肿瘤生长检测结果；

图21是本申请实施例中各组小鼠的肿瘤重量；

图5、图6、图8、图10、图12、图14和图21中，*表示与对照组相比，p值小于0.05；**表示与对照组相比，p值小于0.01；***表示与对照组相比，p值小于0.001；#表示各组之间比较，p值小于0.05；##表示各组之间比较，p值小于0.01；###表示各组之间比较，p值小于0.001。

具体实施方式

绿茶是中国的常用饮品，是除水以外的第一大饮料，天然健康，且具有广泛保健功效。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中含量最高的活性物质，也是绿茶保健功效的重要成分之一。体内外实验证明EGCG具有显著的清除体内自由基、抗氧化、抗肥胖、抗炎等功效。多项研究证实EGCG可在体内广泛分布并抑制癌症在皮肤、食管、胃、肠、肝脏、前列腺等组织及器官的发生发展，且没有毒副作用。此外，EGCG与临床药物的联合用药也有报道。例如，Wang等人研究发现，EGCG与顺铂联合用药可增加顺铂的药物积累，并提高其对卵巢癌SKOV3的敏感性。

但是，EGCG与DOX联合用药用于治疗膀胱癌尚没有相关的研究和报道，本申请分别从动物、细胞和分子水平研究了EGCG和DOX联合用药对膀胱癌的协同抗肿瘤作用，探讨相关机制，从而研发了EGCG制备治疗膀胱癌药物的新用途，进而得到了本申请的用于膀胱癌治疗的药物组合物，即活性成份由阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯组成的药物组合物。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料和方法

1.主要材料

本例用于试验的细胞系包括：膀胱癌细胞系SW780、T24，和正常膀胱尿路上皮细胞SV-HUC-1。其中，膀胱癌细胞系SW780和T24分别购自American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,USA)，SV-HUC-1分离培养自正常膀胱尿路上皮细胞。

本例的基础培养基由90％的DMEM培养基和10％的胎牛血清组成，DMEM培养基和胎牛血清均购自Life technology,USA。除特别说明以外，本例以下试验中所说的培养基都是基础培养基。本例的测试培养基是在基础培养基或DMEM培养基的基础上添加EGCG和/或DOX而成，用于测试EGCG和/或DOX对细胞的影响，具体的EGCG和/或DOX添加量详见以下各试验。

另外，根据具体使用需求还可以添加1％-2％的谷氨酰胺和0.5％-1％的双抗配成。

本例以下各试验中所涉及到的数据分析，都采用one way ANOVA统计，正态分布的数据采用mean±SD/SEM表示。检验水准以P<0.05表示差别具有统计学意义。

2.细胞增殖检测

使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(缩写MTT)，检测细胞增殖。采用基础培养基，作为单个细胞悬液，以每孔7000个细胞接种到96孔板，设置6个重复，置于37℃培养箱中培养24h；然后吸去96孔板中培养液，加入含有不同浓度EGCG和/或DOX的测试培养基，置于37℃培养箱中培养24、48h。到达预定时间后，直接在96孔板中加入30μl 5mg/mL的MTT，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清，每孔加入二甲基亚砜(缩写DMSO)150μL，震动摇匀；10min后，选择540nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

本试验分别用不同浓度EGCG和/或DOX的测试培养基，分别对SW780、T24和SV-HUC-1进行细胞增殖检测，详细如下：

T24的细胞增殖检测，分别在DOX浓度为0μM、0.1μM、0.2μM的培养基中，设置浓度为0μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM的EGCG浓度梯度，共计18组不同浓度EGCG和DOX的测试培养基，用于T24细胞增殖检测。

SW780的细胞增殖检测，分别在DOX浓度为0μM、0.1μM、0.2μM的培养基中，设置浓度为0μM、7μM、14μM、25μM、50μM、100μM的EGCG浓度梯度，共计18组不同浓度EGCG和DOX的测试培养基，用于SW780细胞增殖检测。

SV-HUC-1的细胞增殖检测，分别在DOX浓度为0μM、0.1μM、0.2μM的培养基中，设置浓度为0μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM的EGCG浓度梯度，共计18组不同浓度EGCG和DOX的测试培养基，用于SV-HUC-1细胞增殖检测。

3.细胞凋亡检测

经测试培养基分别对SW780和T24细胞培养24h后，收集膀胱癌细胞并用预冷的PBS洗涤2次，1000rpm，4℃离心5min；然后将细胞重悬于500μL缓冲液，加入5μL的Annexin-V-FITC和5μL的50μg/mL的PI，轻轻混匀，避光，室温放置5min再转至流式检测管，利用流式细胞仪(EPICS,XL-4,Beckman,CA,USA)分析细胞凋亡率。每份标本收集10000个细胞。并采用one way ANOVA统计分析不同浓度EGCG和/或DOX对细胞凋亡率的影响。

本试验的测试培养基，分别设置阴性对照组、DOX对照组、EGCG对照组和试验组，各组详细如下：

阴性对照组，即基础培养基中不含EGCG和DOX；

DOX对照组，即DOX浓度为0.2μM，EGCG浓度为0的基础培养基；

EGCG对照组，培养基中DOX浓度为0，而根据待测对象不同培养基中EGCG浓度不同，T24细胞的培养基中EGCG浓度为400μM，SW780的培养基中EGCG浓度为100μM；即EGCG对照组包括EGCG浓度400μM的EGCG对照组1和EGCG浓度100μM的EGCG对照组2；

试验组，即基础培养基中同时含有EGCG和DOX，其中DOX浓度为0.2μM，根据待测对象不同培养基中EGCG浓度不同，T24细胞的培养基中EGCG浓度为400μM，SW780的培养基中EGCG浓度为100μM；即试验组包括，DOX浓度为0.2μM和EGCG浓度400μM的试验组1，DOX浓度为0.2μM和和EGCG浓度100μM的试验组2。

4.细胞迁移检测

细胞迁移能力由细胞划痕实验检测。取对数生长期的膀胱癌细胞，即1×10⁵/mL的细胞培养液，接种于24孔板，并在37℃培养箱培养24h。在无血清的DMEM培养基中饥饿培养24h后，用200μL的黄色枪头划痕，每孔一条横线两条竖直线，然后吸去无血清培养基，并换上测试培养基，置于37℃培养箱中培养。按0、24h取样，光学显微镜拍照，然后用TScratch软件分析愈伤面积的百分比。本试验分别对SW780和T24细胞进行了测试。并采用one wayANOVA统计分析不同浓度EGCG和/或DOX对细胞迁移的影响。

本试验的测试培养基，分别设置阴性对照组、DOX对照组、EGCG对照组和试验组，各组详细如下：

阴性对照组，即基础培养基中不含EGCG和DOX；

DOX对照组，即DOX浓度为0.1μM，EGCG浓度为0的基础培养基；

EGCG对照组，即DOX浓度为0，EGCG浓度为25μM的基础培养基；

试验组，即基础培养基中同时含有EGCG和DOX，其中DOX浓度为0.1μM，EGCG浓度为25μM。

本试验中EGCG和/或DOX的浓度，选择细胞存活率>80％时的浓度，即EGCG为25μM，DOX为0.1μM。

5.细胞侵染检测

细胞侵染能力由细胞transwell实验检测。收集处于对数生长期的膀胱癌细胞，用含1％胎牛血清的DMEM培养基制备5×10⁵/mL的细胞悬液，取100μL即5×10⁴细胞接种至transwell上面的小室内，同时加入100μL含有不同浓度EGCG和/或DOX的测试培养液，在下室内加入含10％FBS的基础培养基500μL。孵化培养20-24h后，细胞用100％的甲醇固定并用苏木精染色，晾干，普通光学显微镜下观察并拍照，随机选取4个视野，用Image J计数穿膜的细胞数。本试验分别对SW780和T24细胞进行了测试。并采用one way ANOVA统计分析不同浓度EGCG和/或DOX对细胞侵染的影响。

本试验中，10％FBS的基础培养基，即正常的基础培养基，由90％的DMEM培养基和10％的胎牛血清组成；含1％胎牛血清的DMEM培养基是减少胎牛血清含量配制的培养基；通过在下室中添加富含胎牛血清的培养基，测试细胞的迁移侵染能力。本试验的测试培养基就是在含1％胎牛血清的DMEM培养基的基础上配制的。同样的本试验的测试培养基，分别设置阴性对照组、DOX对照组、EGCG对照组和试验组，各组详细如下：

阴性对照组，即1％胎牛血清DMEM培养基中不含EGCG和DOX；

DOX对照组，即DOX浓度为0.1μM，EGCG浓度为0的1％胎牛血清DMEM培养基；

EGCG对照组，即DOX浓度为0，EGCG浓度为25μM的1％胎牛血清DMEM培养基；

试验组，即1％胎牛血清DMEM培养基中同时含有EGCG和DOX，其中DOX浓度为0.1μM，EGCG浓度为25μM。

6.免疫印迹检测

用免疫印迹法检测蛋白表达。经测试培养基培养SW780细胞24小时后，收集细胞；利用4×Loading Buffer，100℃煮10min；将煮好的样品加入到10％SDS-PAGE胶中，进行免疫印迹实验；转膜的PVDF膜用10％脱脂奶粉室温封闭1小时；蛋白抗体4℃过夜孵育，去除一抗，振摇洗膜三次，每次10min，加入带HRP标记的二抗，室温孵育1小时；去除二抗，振摇洗膜三次，每次10min，加入化学发光的HRP底物显色液，利用BD的CCD镜头拍照。

本例中，一抗可以采用p53、p21、p-MDM2、p-NF-κB、Bcl-2、PARP、β-actin，二抗为相应的鼠或兔的二抗。

本试验的测试培养基，分别设置阴性对照组、DOX对照组、EGCG对照组和试验组，各组详细如下：

Ctl(Control)阴性对照组，即基础培养基中不含EGCG和DOX；

DOX对照组，即DOX浓度为0.1μM，EGCG浓度为0的基础培养基；

EGCG对照组，即DOX浓度为0，EGCG浓度为25μM的基础培养基；

试验组，即基础培养基中同时含有EGCG和DOX，其中DOX浓度为0.1μM，EGCG浓度为25μM。

7.裸鼠成瘤实验

取6-8周龄BALB/c裸鼠，共28只，在每只裸鼠背部皮下接种注射200μL菌含量为2×10⁶的SW780细胞悬液，于SPF级动物实验中心饲养。待肿瘤体积达到80mm³后，将28只荷瘤小鼠随机平均分为4组，每组7只，各组小鼠分别进行如下试验：

阴性对照组：腹腔注射0.2mL生理盐水/天；

EGCG组：腹腔注射0.2mL 50mg/kg EGCG/天；

DOX组：腹腔注射0.2mL 2mg/kg DOX/月；

DOX+EGCG组：腹腔注射50mg/kg/天的EGCG，同时，注射2mg/kg/月的DOX。

分别在注射以上试剂1天、4天、7天、10天、14天、18天、23天和28天称取小鼠的体重；并用游标卡尺测量肿瘤大小2次，肿瘤体积按照公式计算：

V＝(a×b²)÷2

其中，V为肿瘤体积，a为长，b为宽，b²即宽的平方。

4周后心脏抽血，离心获得血清，然后采用ELISA方法检测EGCG对小鼠血液生化指标的影响。同时，以脱胫处死裸鼠，取出肿瘤，称量瘤重。

以上测量完成后，切取小块肿瘤，经匀浆器破碎后采取没裂解法提取肿瘤中的蛋白，然后用免疫印迹分析肿瘤内蛋白表达情况。

8.免疫组化检测

用10％的福尔马林溶液固定肿瘤组织样本，石蜡包埋；利用石蜡切片机将蜡块切成5μm厚的组织切片，置于60℃的烘箱内烘干1小时；然后将切片置于以下溶液中进行脱蜡、脱水和染色：二甲苯中脱蜡3次，每次15min；100％酒精中脱水2次，每次5min；95％酒精脱水2次，每次5min；70％酒精脱水5min；然后将切片置于98℃的pH 6.0的柠檬酸修复液中10min进行抗原修复，冷却至室温；切片置于甲醇配制的0.3％双氧水中20min；用PBS清洗切片3次，每次5min；用BSA溶液封闭切片20min后，用抗体于湿盒中孵育切片，4℃过夜；用PBS清洗切3次，每次5min；用相应的二抗于室温中孵育1小时；用PBS清洗切片3次，每次5min；用strepravidin-biotin peroxidase室温中孵育30min；用PBS清洗切片3次，每次5min，然后DAB显色5min，苏木精核染1min，封片，晾干，置于显微镜下观察拍照。

二、结果和分析

1.细胞增殖检测结果

不同浓度的EGCG和/或DOX分别对SW780、T24和SV-HUC-1的细胞增殖检测结果如图1至图3所示，其中，图1为不同浓度的EGCG和/或DOX影响下T24的细胞生长曲线，图2为不同浓度的EGCG和/或DOX影响下SW780的细胞生长曲线，图3为不同浓度的EGCG和/或DOX影响下SV-HUC-1的细胞生长曲线，图1至图3中，带“●”的曲线为DOX浓度为0μM时的细胞生长曲线，带“■”的曲线为DOX浓度为0.1μM时的细胞生长曲线，带“▲”的曲线为DOX浓度为0.2μM时的细胞生长曲线。

图1至图3的结果显示，EGCG和阿霉素联合用药可明显抑制膀胱癌细胞T24和SW780的增殖，联合用药的效果均好于单独使用的效果，且EGCG+DOX对膀胱癌细胞的抑制作用呈浓度依赖关系。在EGCG浓度为400μM、DOX浓度为0.1μM时，T24细胞的存活率低于20％，而同等浓度下膀胱尿路上皮细胞的存活率达58％，说明EGCG+DOX对正常细胞的毒副作用比膀胱癌细胞小很多。

2.细胞凋亡检测结果

不同浓度的EGCG和/或DOX分别对SW780、T24的细胞凋亡检测结果如图4至图6所示，图4是流式细胞仪统计的细胞分散图，图中第一排为T24在不同浓度EGCG和/或DOX影响下的细胞分散图，第二排为SW780在不同浓度EGCG和/或DOX影响下的细胞分散图；图5是采用one way ANOVA统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对T24细胞凋亡的影响；图6是采用oneway ANOVA统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对SW780细胞凋亡的影响。图4至图6中，Control表示阴性对照组、EGCG表示EGCG对照组、DOX表示DOX对照组、DOX+EGCE表示试验组。

图4至图6的结果显示，相比于EGCG和DOX浓度均为0的阴性对照组，EGCG和DOX单独处理后的T24和SW780细胞出现不同程度的凋亡，EGCG和DOX联合用药后，细胞凋亡率显著增加，且与EGCG和DOX单独使用时有显著差异，如图5和图6所示，说明EGCG和DOX联合用药后可有效诱导膀胱癌细胞凋亡。

3.细胞迁移和侵染检测结果

不同浓度的EGCG和/或DOX对T24的细胞迁移和侵染检测结果如图7至图10所示，图7是不同浓度EGCG和/或DOX的影响下T24划痕愈伤实验照片，图中24h表示培养24h的划痕愈伤实验照片；图8是划痕面积的柱状图和采用one way ANOVA统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对T24细胞迁移的影响；图9是不同浓度EGCG和/或DOX的影响下T24细胞侵染的染色照片；图10是采用one way ANOVA统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对T24细胞侵染的影响。

不同浓度的EGCG和/或DOX对SW780的细胞迁移和侵染检测结果如图11至图14所示，图11是不同浓度EGCG和/或DOX的影响下SW780划痕愈伤实验照片，图中24h表示培养24h的划痕愈伤实验照片；图12是划痕面积的柱状图和采用one way ANOVA统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对SW780细胞迁移的影响；图13是不同浓度EGCG和/或DOX的影响下SW780细胞侵染的染色照片；图14是采用one way ANOVA统计分析的不同浓度EGCG和/或DOX对SW780细胞侵染的影响。图7至图14中，Control表示阴性对照组、EGCG表示EGCG对照组、DOX表示DOX对照组、DOX+EGCE表示试验组。

图7至图14的结果显示，相比于EGCG和DOX浓度均为0的阴性对照组，EGCG和DOX单独使用时可不同程度的抑制膀胱癌细胞的迁移和侵染，但二者联用后，对膀胱癌细胞的迁移和侵染抑制效果显著增加，且与EGCG或DOX单独使用时有明显差异，如图8、10、12和14所示。说明EGCG和DOX在不影响细胞存活的情况下可有效抑制膀胱癌细胞的迁移和侵染。

4.免疫印迹检测和免疫组化检测的结果

不同浓度的EGCG和/或DOX对SW780的蛋白表达的检测结果如图15所示，图15中，Ctl即Control的缩写，表示阴性对照组，即不含EGCG和DOX；EGCG表示EGCG组、DOX表示DOX组、DOX+EGCE表示DOX+EGCG组，p53、p21、p-MDM2、p-NF-κB、Bcl-2、PARP、β-actin分别表示各蛋白在不同浓度的EGCG和/或DOX下的表达情况。

对从小鼠身上取得的SW780感染的肿瘤免疫组化检测结果如图16和17所示；图16为不同浓度的EGCG和/或DOX对肿瘤中蛋白表达的检测结果，图16中，Ctl表示阴性对照组、DOX表示DOX组、EGCG表示EGCG组、DOX+EGCE表示DOX+EGCG组，p53、p-MDM2、p-NF-κB、β-actin分别表示各蛋白在不同浓度的EGCG和/或DOX下的表达情况；图17为免疫组化检测MDM2和p53在肿瘤中的表达情况，图17中，Control表示阴性对照组、DOX+EGCE表示DOX+EGCG组。

图15至图17的结果显示，相比于EGCG和DOX浓度均为0的阴性对照组，EGCG、DOX和EGCG+DOX可明显影促进p53和PARP的表达，并降低磷酸化MDM2和NF-κB的表达水平，且三个用药组中，EGCG+DOX联合用药的效果最好，说明EGCG和DOX对膀胱癌细胞SW780的凋亡诱导作用与对MDM2和NF-κB的调控密切相关。该结果在取自小鼠SW780感染的肿瘤的检测中也得以体现，用药组EGCG、DOX和EGCG+DOX可调控p53、p-MDM2、p-NF-κB在膀胱癌肿瘤中的表达，且EGCG+DOX联合用药组效果最佳。免疫组化的结果也显示，EGCG和DOX联合用药可有效的降低磷酸化MDM2的表达，并促进p53的表达；说明EGCG可影响MDM2和NF-κB的表达并促进DOX的抗肿瘤作用，因此EGCG与DOX的联合用药作用才更佳。

5.裸鼠成瘤实验结果

小鼠感染后，腹腔注射不同的试剂，对小鼠的体重影响如图18所示，图中，分别展示了阴性对照组、EGCG组、DOX组、DOX+EGCG组的小鼠在1天、4天、7天、10天、14天、18天、23天和28天的体重，图18的柱形图中，各天由左至右依序为阴性对照组、EGCG组、DOX组、DOX+EGCG组的小鼠的重量，例如1天对应的四个柱依序为Control表示阴性对照组的小鼠的重量、EGCG表示EGCG组的小鼠的重量、DOX表示DOX组的小鼠的重量、EGCE+DOX表示DOX+EGCG组的小鼠的重量，其余类同。

对小鼠的血液生化指标检测结果如图19所示，图19中，ALT表示血液生化指标检测中丙氨酸转氨酶在不同用药情况下的变化、AST表示天冬氨酸转氨酶在不同用药情况下的变化、CK表示肌酸激酶在不同用药情况下的变化，图19中，Control表示阴性对照组、EGCG表示EGCG组、DOX表示DOX组、EGCE+DOX表示DOX+EGCG组。

小鼠感染后，腹腔注射不同的试剂，对小鼠的肿瘤生长的影响如图20所示，图中，分别展示了阴性对照组、EGCG组、DOX组、DOX+EGCG组的小鼠在1天、4天、7天、10天、14天、18天、23天和28天时的各组肿瘤的平均体积，图20中，带“●”的曲线即Control为阴性对照组的肿瘤生长曲线，带“■”的曲线为EGCG组的肿瘤生长曲线，带“▲”的曲线为DOX组的肿瘤生长曲线，带“▼”的曲线为DOX+EGCG组的肿瘤生长曲线，曲线末端由上到下的曲线依序为阴性对照组、EGCG组、DOX组和DOX+EGCG组的生长曲线，图中，*表示与对照组相比，p值小于0.05；**表示与对照组相比，p值小于0.01。

称取的各组小鼠的肿瘤重量如图21所示，图中，分别展示了阴性对照组、EGCG组、DOX组、DOX+EGCG组的小鼠4周后的各组肿瘤的平均重量，图中，Control表示阴性对照组、EGCG表示EGCG组、DOX表示DOX组、EGCE+DOX表示DOX+EGCG组。

图18至图21的结果显示，经腹腔注射给药4周后，给药组小鼠体重与阴性对照组没有明显差别，如图18所示；且血液生化指标检测显示阴性对照组与用药组相比，丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和肌酸激酶没有显著差别，如图19所示；EGCG和DOX单独给药时可抑制小鼠肿瘤的生长，但经统计学分析两者单独用药的效果无显著差异，而EGCG和DOX联合用药后，肿瘤体积明显减小，且肿瘤重量减轻，与阴性对照有显著差异，如图20和21所示，说明联合用药组效果最佳。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (6)

1.一种用于膀胱癌治疗的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成份由阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯组成。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯的物质的量比为1:1000～1:250。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

4.表没食子儿茶素没食子酸酯在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

5.阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯的组合物在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用其特征在于：所述阿霉素和表没食子儿茶素没食子酸酯的物质的量比为1:1000～1:250。