CN115887443A - 表没食子儿茶素在制备结直肠癌治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了表没食子儿茶素在制备结直肠癌治疗药物中的应用。本申请研究发现了表没食子儿茶素能够通过下调STAT3抑制结直肠癌，为表没食子儿茶素研发了一种新的用途，也为结直肠癌的治疗提供了一种新的方案和途径。

Description

表没食子儿茶素在制备结直肠癌治疗药物中的应用

技术领域

本申请涉及结直肠癌治疗药物领域，特别是涉及表没食子儿茶素在制备结直肠癌治疗药物中的应用。

背景技术

绿茶是中国的常用饮品，天然健康，还具有广泛的保健功效，如预防心血管疾病、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等。绿茶包含着多种活性物质，茶多酚是最主要生物活性物质，主要包括表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）四种类型。表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）是含量较高的儿茶素，占茶多酚总量的15%～30%。

茶多酚在癌症的治疗和预防方面有较好的功效。在临床试验中，Nakachi及其同事的一项临床试验证明，健康受试者饮用10杯富含茶多酚的绿茶，对结肠癌、肝癌和胃癌等多种癌症的发病有积极预防作用。此外，与对照组相比，饮用10杯绿茶（富含茶多酚）的受试者可显著降低结肠直肠腺瘤的复发。动物实验及细胞实验表明，茶多酚可通过诱导细胞周期阻滞、抑制NF-κB活化、抑制肿瘤血管生成等方式，抑制不同器官部位的肿瘤发生，例如皮肤、肺、肝等。表没食子儿茶素（EGC）作为主要的茶多酚活性成分之一，研究发现EGC在抗氧化和诱导乳腺癌细胞凋亡方面有一定功效，然而EGC在抗肿瘤方面的作用特别是在结直肠癌中的抗肿瘤作用，鲜少有报道，且无相关作用机制分析。

发明内容

本申请的目的是提供表没食子儿茶素的一种新的应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了表没食子儿茶素在制备结直肠癌治疗药物中的应用。

本申请的另一名公开了表没食子儿茶素在制备抑制癌细胞增殖或诱导癌细胞凋亡的药物中的应用。

本申请的再一面公开了表没食子儿茶素在制备抑制癌细胞迁移、侵染或生长的药物中的应用。

本申请的再一面公开了表没食子儿茶素在制备通过下调STAT3抑制癌细胞的药物中的应用。

本申请中，癌细胞包括结直肠癌细胞。

本申请的再一面公开了表没食子儿茶素在制备下调STAT3的抑制剂中的应用。

需要说明的是，本申请研究发现，表没食子儿茶素（EGC）能够通过下调STAT3抑制结直肠癌。因此，表没食子儿茶素能够用于制备治疗结直肠癌药物；也能够用于制备抑制癌细胞增殖或诱导癌细胞凋亡的药物，尤其是制备抑制结直肠癌细胞增殖或诱导结直肠癌细胞凋亡的药物；或者用于制备抑制癌细胞，尤其是结直肠癌细胞迁移、侵染或生长的药物；当然，也能够用于制备下调STAT3的抑制剂。

本申请的有益效果在于：

本申请研究发现了表没食子儿茶素能够通过下调STAT3抑制结直肠癌，为表没食子儿茶素研发了一种新的用途，也为结直肠癌的治疗提供了一种新的方案和途径。

附图说明

图1是本申请实施例中EGC抑制结直肠癌SW480细胞增殖的结果图；

图2是本申请实施例中EGC抑制结直肠癌SW620细胞增殖的结果图；

图3是本申请实施例中EGC抑制结直肠癌LS411N细胞增殖的结果图；

图4是本申请实施例中EGC诱导结直肠癌SW480、SW620及LS411N细胞凋亡的流式细胞仪观测结果图；

图5是本申请实施例中SW480经不同EGC浓度处理后的细胞凋亡率结果；

图6是本申请实施例中SW620经不同EGC浓度处理后的细胞凋亡率结果；

图7是本申请实施例中LS411N经不同EGC浓度处理后的细胞凋亡率结果；

图8是本申请实施例中EGC导致结直肠癌细胞SW480、SW620及LS411N细胞线粒体膜电位崩溃的流式细胞仪的检查结果图；

图9是本申请实施例中SW480经不同EGC浓度处理后JC-1实验检测结果；

图10是本申请实施例中SW620经不同EGC浓度处理后JC-1实验检测结果；

图11是本申请实施例中LS411N经不同EGC浓度处理JC-1实验检测结果；

图12是本申请实施例中EGC抑制SW620迁移试验的光学显微镜拍照结果；

图13是本申请实施例中EGC抑制SW620迁移试验TScratch软件分析结果；

图14是本申请实施例中SW620在不同EGC浓度的细胞侵染的光学显微镜的拍照结果图；

图15是本申请实施例中SW620在不同EGC浓度的细胞侵染的Image J计数穿膜的细胞数统计结果图；

图16是本申请实施例中EGC处理SW620细胞24小时后，细胞中PARP、caspase-3、STAT3、Bcl-2、Bim和β-actin蛋白的表达结果图；

图17是本申请实施例中EGC处理SW620细胞24小时后，PARP的表达分析结果统计图；

图18是本申请实施例中EGC处理SW620细胞24小时后caspase-3表达分析结果统计图；

图19是本申请实施例中EGC处理SW620细胞24小时后STAT3表达分析结果统计图；

图20是本申请实施例中EGC处理SW620细胞24小时后Bcl-2和Bim表达分析结果；

图21是本申请实施例中不同浓度EGC对STAT3 mRNA 表达影响检测结果；

图22是本申请实施例中不同浓度EGC对STAT3启动子区活性影响检测结果；

图23是本申请实施例中各组小鼠分别在饲养1天、4天、7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天的体重变化统计结果图；

图24是本申请实施例中各组小鼠分别在饲养1天、4天、7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天的肿瘤大小变化统计结果图；

图25是本申请实施例中各组小鼠28天后的肿瘤照片；

图26是本申请实施例中各组小鼠28天后的肿瘤重量统计结果图；

图27是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤的组织提取蛋白中PARP、caspase-3、STAT3、Bcl-2、Bim和β-actin蛋白表达的检测结果图；

图28是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤的组织提取蛋白中PARP（cleaved）和Caspase（cleaved）的表达分析结果图；

图29是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤的组织提取蛋白中STAT3和p-STAT3的表达分析结果图；

图30是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤的组织提取蛋白中Bcl-2和Bim的表达分析结果图；

图31是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤的组织免疫组化检测p-STAT3表达结果图；

图32是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤的组织免疫组化检测Bcl-2的表达结果图；

图33是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤的组织免疫组化检测Bim的表达结果图；

图34是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤组织中细胞凋亡情况的显微镜观察结果图；

图35是本申请实施例中各组小鼠28天后肿瘤组织中的凋亡细胞的统计结果图；

图36是本申请实施例中两个样本COAD1042、COAD1045结直肠癌肿瘤类器官的抗原鉴定结果图；

图37是本申请实施例中两个样本COAD1042、COAD1045结直肠癌肿瘤类器官的HE结构的鉴定结果图；

图38是本申请实施例中EGC抑制两个样本COAD1042、COAD1045结直肠癌肿瘤类器官细胞增殖的检测结果图；

图39是本申请实施例中两个样本COAD1042、COAD1045结直肠癌肿瘤类器官在不同EGC浓度处理后的观察结果图。

具体实施方式

在绿茶的四种儿茶素中，EGC的研究相对较少，除了发现EGC在抗氧化和诱导乳腺癌细胞凋亡方面有一定功效以外，EGC对其他肿瘤的作用，尤其是对结直肠癌的作用，都少有研究或报道，且无相关作用机制分析。

本申请从细胞、动物和类器官水平探索茶多酚EGC在结直肠癌中的抗肿瘤作用并探讨相关机制。在细胞实验的基础上，利用小鼠瘤模型研究EGC在结直肠癌中的抗肿瘤、抗转移及免疫调控作用，在动物模型中验证通路相关蛋白或基因的表达；并通过接近临床组织的结直肠肿瘤类器官，进一步验证茶多酚EGC的功效。本申请揭示了茶多酚EGC在结直肠癌中的功能并初步阐明其作用机制，为天然药物EGC的抗肿瘤研究和临床应用提供参考价值。具体的，本申请研究证实了EGC能够通过下调STAT3抑制结直肠癌。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料和方法

1. 细胞培养

结直肠癌细胞系SW480、SW620、LS411N购自American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, USA)，细胞培养基由90%的 DMEM（Life technology,USA），10%的胎牛血清（Life technology, USA），1%-2%的谷氨酰胺和0.5%-1%的双抗配成。

2. 细胞增殖检测

使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT)，检测细胞增殖。用含10%胎小牛血清的培养基配成单个细胞悬液，以每孔7000个细胞接种到96孔板，设置6个复孔，置于37℃培养箱中培养24h；然后吸去96孔板中培养液，加入含有不同浓度EGC培养液，置于37℃培养箱中培养24h。到达预定时间后，直接在96孔板中加入30μL 5mg/mL的MTT，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，震动摇匀；10min后，选择540nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，记录结果，以药物浓度为横坐标，吸光值对应的细胞存活率为纵坐标，绘制曲线。

本例分别对结直肠癌细胞SW480、SW620、LS411N进行了试验，具体的，测试了SW480细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL培养液中的细胞增殖情况；SW620细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL培养液中的细胞增殖情况；LS411N细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL培养液中的细胞增殖情况。

3. 细胞凋亡检测

经EGC处理细胞24h后，收集结直肠癌细胞并用预冷的PBS洗涤2次，1000rpm，4℃离心5min；然后将细胞重悬于500μL缓冲液，加入5μL Annexin-V-FITC和5μL PI（50μg/mL），轻轻混匀，避光，室温放置5min再转至流式检测管，利用流式细胞仪(EPICS, XL-4, Beckman,CA, USA)分析细胞凋亡率。每份标本收集10000个细胞。

本例具体分析了SW480细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL培养液中处理24h的细胞凋亡率；SW620细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL培养液中处理24h的细胞凋亡率；LS411N细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL培养液中处理24h的细胞凋亡率。

4. 细胞膜电位检测

经EGC处理细胞24h后，收集结直肠癌细胞并用预冷的PBS洗涤2次，然后在37℃的JC-1染色溶液（10µM）中重悬15分钟。然后，用FACSCanto流式细胞仪（Becton Dickinson）检查染色的细胞，使用WinMDI 2.9软件进行数据分析。

本例具体分析了SW480细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL培养液中处理24h的细胞膜电位；SW620细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL培养液中处理24h的细胞膜电位；LS411N细胞分别在EGC浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL培养液中处理24h的细胞膜电位。

5. 细胞迁移检测

细胞迁移运动能力由细胞划痕实验检测。取对数生长期的结直肠癌细胞（1×10⁵/mL）接种于24孔板，并在37℃培养箱培养24h。在无血清的培养基中饥饿培养24h后，用200μL的黄色枪头划痕，每孔一条横线，然后吸去无血清培养基，并换上含有EGC的新鲜培养基，置于37℃培养箱中培养。按0、24、48h取样，光学显微镜拍照，然后用TScratch软件分析愈伤面积的百分比。

本例具体检测了SW620细胞分别在EGC浓度0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL培养液处理后的细胞迁移情况。

6. 细胞侵染检测

细胞迁移运动能力由细胞transwell实验检测。收集处于对数生长期的结直肠癌细胞，用含1%胎牛血清的培养基制备5×10⁵/mL的细胞悬液，取100μL即5×10⁴细胞接种至transwell上面的小室内，同时加入100μL含有不同浓度EGC（1% FBS培养基配置）的培养液，在下室内加入含10%FBS的完全培养基500μL。孵化培养24h后，细胞用100%的甲醇固定并用苏木精染色，晾干，普通光学显微镜下观察并拍照，随机选取4个视野，用Image J计数穿膜的细胞数。

本例具体检测了SW620细胞分别在EGC浓度0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL培养液处理后的细胞迁移情况。

7. 免疫印迹检测

用免疫印迹法检测蛋白表达。经EGC处理细胞24小时后，收集细胞蛋白；利用4×Loading Buffer，100℃煮10min；将煮好的样品加入到10%SDS-PAGE胶中，进行免疫印迹实验；转膜的PVDF膜用10%脱脂奶粉室温封闭1小时；蛋白抗体4℃过夜孵育，去除一抗，振摇洗膜10min×3次，加入带HRP标记的二抗，室温孵育1小时；去除二抗，振摇洗膜10min×3次，加入化学发光的HRP底物显色液，利用BD的CCD镜头拍照。

本例具体分析了SW620细胞分别在EGC浓度0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL培养液处理24小时的蛋白表达情况。

8. 实时定量PCR

用EGC处理后，用TRIzol试剂（Invitrogen，USA）从SW620细胞中提取总RNA。STAT3的mRNA水平按照说明通过实时定量PCR（qPCR）测定。GAPDH mRNA用作内部对照，以使每个样品中mRNA的量正常化。本实验的初步结果表明GAPDH适用于标准化目的。设计引物如下：GAPDH正向引物，5’-AAG GTG AAG GTC GGA GTC AAC-3’，反向引物：5’-GGGGGTC ATT GATGGC AAC AAT A-3’；STAT3正向引物：5’-ACC TTT GAG ACC GAG GTG TA-3’，反向引物：5’-CAC CAG GTC CCA AGA GTT TC-3’。使用ABI VII7荧光定量PCR系统（Thermo，USA）进行三次反应。使用比较ΔCt法计算STAT3的相对量，使用每三份的平均值。

本例具体检测了SW620细胞分别在EGC浓度0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL培养液处理24小时后的STAT3 mRNA表达水平。

具体试验包括：

组织提取需要预处理：无菌条件下，收集SW620细胞，加入500μL Trizol溶液，用组织研磨仪磨碎组织后继续后续实验；后续实验步骤与细胞样本提取方法一致。

细胞样本预处理：

（1）将培养皿中的培养液吸干，向培养皿中加入500μL Trizol溶液，用枪吹打至细胞完全溶解于Trizol中，然后将Trizol和细胞的混合物收集至1.5mL RNasefree离心管中混合均匀，使细胞充分裂解，室温静置5min或-80℃保存。

（2）如果-80℃保存，需取出解冻，再加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，充分混匀，室温静置3-5min。4℃下，12,000g离心机离心15min，可见混合液分为三层，RNA在上层透明水相，将上层溶液转移至另一个新的RNasefree EP管。

（3）使RNA沉淀：加入500μL异丙醇，轻柔上下颠倒，充分混合均匀，室温静置10min。4℃下，12000g离心10min，收集RNA沉淀，直接轻轻倒扣去掉上清。

（4）用75%乙醇洗涤沉淀：向EP管中加入500μL 75%乙醇上下颠倒混匀，7500g离心5min，收集沉淀，去除上清液，重复两次，置于超净台中风干。

（5）根据RNA沉淀量多少加入适量DEPC水溶解RNA，至少20μL。

（6）提取的总RNA纯度和质量鉴定：在NanoDrop上测定出RNA的浓度、OD_260/280的比值，-80℃保存。

RNA逆转录：

（1）LncRNA逆转录，计算出1.5μg RNA需要量，用DEPC-H₂O补充至13μL，每个样本再加入1μL Random，70℃ 5分钟，之后迅速置于冰上。RNA的所需质量根据浓度大小调整。

（2）miR-RNA逆转录，计算出1.5μg RNA需要量，用DEPC-H₂O补充至13μL，每个样本再加入1μL RT引物，70℃ 5分钟后置于冰上。RNA的所需质量根据浓度大小调整。

（3）mRNA逆转录，计算出1.5μg RNA需要量，用DEPC-H₂O补充至13μL，每个样本再加入1μL Oligo dT，70℃ 5分钟后置于冰上。

（4）在PCR管中加入以下混合溶液：5×RT Buffer 4μL、10mM dNTPs 1μL、逆转录酶M-MLV 1μL，最后总体系20μL。

反应条件：37℃ 60min，70℃ 15min，4℃保存

qPCR实验：

反应体系：cDNA 4μL（3个复孔）、SYBR Mix 5μL、Forward primer 0.5μL、Reverseprimer 0.5μL。

反应条件：95℃ 10min，然后进入40个循环：95℃ 15sec、55℃ 1min、72℃ 20sec，循环结束后，降温至60℃，然后加热升温至95℃变性DNA产物。

9. 荧光素酶报告基因活性测定

从SW620细胞系基因组DNA合成整个STAT3启动子区（翻译起始位点的核苷酸-1000至+1bp），并插入质粒pGL3（Promegea，USA）。然后，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）用1.2μg含有STAT3启动子序列（pLG3-STAT3）的荧光素酶报告载体转染SW620细胞，并将pLG3空载体（pLG3碱性）用作阴性对照。转染后，将EGC（40, 80µg/mL）加入SW620细胞并孵育24小时。孵育后，根据荧光双染试剂盒（Promega，USA）相关说明进行洗涤和裂解细胞，并通过平板读取器测量荧光素酶活性。

本例具体检测了SW620细胞分别在EGC浓度0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL培养液处理24小时后的STAT3启动子区活性。

具体试验包括：

细胞转染：

（1）SW620细胞以每孔5×10⁴个接种于24孔板，次日进行转染。

（2）准备1.5mL离心管，以每孔1μL lipo2000（invitrogen，货号11668-019）和24μLOpti-MEM（gibco，货号31985-070）的体系混匀，静置5min。

（3）准备新的1.5mL离心管，每孔以1.2μg荧光素酶报告载体质粒和0.012μgRenilla内参质粒的体系混匀，用Opti-MEM将最终体积补足至25μL，轻轻吹打混匀，静置5min。

（4）将两管配制液混匀，用枪轻轻吹打，最终总体积为50μL，静置20min。

（5）取出提前接种好的细胞，弃去培养液，用1×PBS清洗2次，更换新培养液。

（6）将50μL混合液逐滴加入细胞，轻轻混匀。

检测Luciferase活性：

本例采用双萤光素酶报告基因检测系统promega，货号E1960。

（1）初次使用时，配制LAR II，将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。将 1 体积 50×Stop&Glo 底物添加至装有50体积 Stop&Glo缓冲液中，每个检测样本需要50μL LAR II和50μL Stop&Glo Reagent。

（2）用1×PBS将5×裂解缓冲液稀释5倍，每孔加入100μL 1×裂解缓冲液覆盖细胞，室温孵育15分钟。

（3）准备1.5mL离心管，用枪头把细胞充分刮散后收集至离心管，4℃，14000转离心20分钟。

（4）打开发光检测仪器（promega，GloMax® 96 Microplate Luminometer），打开“GLOMAX”软件，点击“Run Promega Protocol”，选择程序“Dual Glo”打开，点击“Options”，选择需要检测的孔板位置后点击“Apply Changes”。

（5）每个样本取20μL细胞裂解产物加入96孔白板（BIOFIL，货号LTP-010-296）中，再加入50μL LAR II，置于检测仪检测，点击“START”读取第一次数值，即为Fireflyluciferase。

（6）测量结束后，取出96孔板，再加入50μL Stop&Glo®Reagent，再次置于检测仪检测，点击“START”读取第二次数值，即为Renilla luciferase。

（7）首先计算出每个样本Firefly luciferase/Renilla luciferase的比值，再以对照组的比值为1单位，即得到不同处理组的相对luciferase活性。

10. 裸鼠成瘤实验

取6-8周龄BALB/c裸鼠，4组×8只，共32只，在每只裸鼠背部皮下接种注射200μL（2×10⁶）细胞悬液，于SPF 级动物实验中心饲养。待肿瘤体积达到80mm³后，荷瘤小鼠随机分成4组，阴性对照组（Control）：腹腔注射0.2mL生理盐水/天，EGC低剂量组（EGC Low）：腹腔注射0.2mL 50mg/kg EGC/天，EGC高剂量组（EGC High）：腹腔注射0.2mL 100mg/kg EGC/天，阳性对照DOX组（DOX）：腹腔注射2mg/kgDOX，2周一次。

分别在饲养1天、4天、7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天称重，并用游标卡尺测量肿瘤大小，以肿瘤体积=1/2*长*（宽）²来计算。

4周即28天后以脱胫处死裸鼠，取出肿瘤，称量瘤重，然后再利用肿瘤提取总蛋白和总RNA，进行瘤内基因、蛋白表达分析。

11. 免疫组化

分别从阴性对照组（Control）、EGC低剂量组（EGC Low）、EGC高剂量组（EGC High）和阳性对照DOX组（DOX）中各取一个肿瘤样本，用10%的福尔马林溶液固定组织样本，石蜡包埋；利用石蜡切片机将蜡块切成5μm厚的组织切片，置于60℃的烘箱内烘干1小时；然后将切片置于以下溶液中进行脱蜡、脱水和染色：二甲苯中脱蜡3次，每次15min；100%酒精中脱水2次，每次5min；95%酒精脱水2次，每次5min；70%酒精脱水5min；然后将切片置于98℃的pH6.0的柠檬酸修复液中10min进行抗原修复，冷却至室温；切片置于甲醇配制的0.3%双氧水中20min；用PBS清洗切片3次，每次5min；用BSA溶液封闭切片20min后，用抗体于湿盒中孵育切片，4℃过夜；用PBS清洗切3次，每次5min；用相应的二抗于室温中孵育1小时；用PBS清洗切片3次，每次5min；用strepravidin-biotin peroxidase 室温中孵育30min；用PBS清洗切片3次，每次5min，然后DAB显色5min，苏木精核染1min，封片，晾干，置于显微镜下观察拍照。

12. TUNEL实验

细胞凋亡晚期的一个重要特征是DNA片段化，本试验通过TUNEL检测试剂盒FITC（Abcam）分析肿瘤组织中的细胞凋亡情况，并根据试剂盒的说明进行相关操作。分别从阴性对照组（Control）、EGC低剂量组（EGC Low）、EGC高剂量组（EGC High）和阳性对照DOX组（DOX）中各取一个肿瘤组织，经包埋、石蜡切片后，爬片，涂片，然后用DAPI复染，并在在显微镜（Olympus）下获得照片，计数凋亡细胞数。

13. 类器官实验

在获得患者或者患者家属知情同意后，收集结直肠癌手术后组织样本。首先将结直肠癌组织剪碎至1-2mm³小块，然后经组织消化液于37℃消化45min，消化终止后经70μm滤网过滤后，用Matrigel重选细胞，再以10⁴cells/ 30μL每滴接种至6孔板中。待胶滴凝固后，添加类器官培养基继续培养。收集结直肠癌类器官胶滴，用0.25%TrypLE Express 于37℃消化5 min，将消化的细胞团以1:3进行传代培养。其中，组织消化液由5μg/mL II型胶原酶，10μMY27632，以及100μg/mL DNase I组成。

刮取含结直肠癌类器官的胶滴至4%多聚甲醛固定，离心收集细胞团后采用2%的琼脂糖预包埋。而后经脱水，石蜡包埋后以6μM厚度连续切片。通过HE染色以及免疫组化（CK7，PAN，Ki-67以及CDX2）染色，对比分析结直肠癌类器官与其来源肿瘤组织的一致性。

收集含结直肠癌类器官的胶滴，用TrypLE Express于37℃消化5min。弃上清后加入含10% FBS的AdvancedDMEM/F12中和，通过40μm滤网后继续离心。离心后的细胞用类器官培养基重悬，加入2%的Matrigel后，均匀铺至384孔低吸附孔板上。待细胞恢复成球后加入稀释好的待测药物，并以DMSO为对照。药物作用4天后，通过显微镜拍摄全视野图片，分析肿瘤类器官的形态变化。利用CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay（Promega，USA）检测细胞活性。并根据对照细胞数值测算相对存活比例和IC50（Graphpad）。

本例的待测药物即EGC浓度分别为0.16μg/mL、0.8μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL、500μg/mL的培养液。

14. 统计学分析

数据分析使用one way ANOVA统计，正态分布的数据采用mean ± SD/SEM表示。检验水准以P<0.05表示差别具有统计学意义。

二、实验结果

1.茶多酚EGC抑制结直肠癌细胞增殖并诱导凋亡的检测结果

EGC抑制结直肠癌SW480、SW620及LS411N细胞增殖的结果依序如图1至图3所示。结果显示，经不同浓度EGC培养24小时后，结直肠癌细胞SW480、SW620及LS411N的增殖能力随EGC浓度增加而递减，其中SW480细胞对EGC的敏感性较高。

利用AnnexinV/PI双染及流式细胞术检测EGC是否诱导细胞凋亡的结果如图4至图7所示。图4是流式细胞仪的观测结果，其中，第一排为SW480分别经过不同EGC浓度处理的结果，第二排为SW620分别经过不同EGC浓度处理的结果，第三排为LS411N分别经过不同EGC浓度处理的结果。图5为SW480分别经过不同EGC浓度处理后的细胞凋亡率统计结果，图6为SW620分别经过不同EGC浓度处理后的细胞凋亡率统计结果，图7为LS411N分别经过不同EGC浓度处理后的细胞凋亡率统计结果。

结果显示，经不同浓度EGC处理24小时后的结直肠癌细胞用流式细胞仪检测细胞的凋亡率，相比于阴性对照组，即EGC浓度为0，EGC处理后的SW480、SW620及LS411N细胞出现不同程度的凋亡，且3种细胞凋亡率随着EGC浓度上升而上升，说明EGC诱导结直肠癌细胞凋亡呈浓度梯度依赖性。

2.EGC导致结直肠癌细胞线粒体膜电位崩溃的检测结果

细胞凋亡的一大特征是线粒体膜电位的变化。为进一步验证EGC对结直肠癌细胞的凋亡作用，本试验采用JC-1实验检测EGC作用后线粒体膜电位变化情况，结果如图8至图11所示。图8为FACSCanto流式细胞仪的检查结果，其中，第一排为SW480分别经过不同EGC浓度处理的结果，第二排为SW620分别经过不同EGC浓度处理的结果，第三排为LS411N分别经过不同EGC浓度处理的结果。图9至图11为WinMDI 2.9软件的数据分析结果，依序为SW480、SW620、LS411N分别经过不同EGC浓度处理后的统计结果。

图8至图11的结果显示，经不同浓度EGC处理24小时后，相对于阴性对照组，即EGC浓度为0，EGC作用后的SW480、SW620及LS411N细胞膜电位发生明显变化，随EGC浓度增加，膜电位去势显著增加。

3.EGC抑制结直肠癌细胞SW620迁移和侵染的检测结果

3种结直肠癌细胞中，SW620细胞对EGC的敏感性适中，选择该细胞株进行后续实验。选择细胞存活率>80%时的EGC（5, 10μg/mL）浓度，作用于SW620细胞24或48小时，进行迁移实验，结果如图12和图13所示，其中，图12为光学显微镜拍照的划痕愈伤实验结果，图13为TScratch软件分析的划痕面积统计的柱状图结果。图12和图13的结果显示，EGC对结直肠癌SW620细胞的迁移抑制作用呈浓度梯度依赖性和时间依赖性。

SW620在不同EGC浓度的细胞侵染结果如图14和图15所示。图14为光学显微镜的拍照结果，图15为Image J计数穿膜的细胞数。图14和图15的结果显示，EGC显著抑制SW620细胞的侵染，EGC浓度越高，抑制程度越高。

以上试验结果说明EGC在不影响细胞存活的情况下可有效抑制结直肠癌细胞的迁移和侵染。

4.EGC影响结直肠癌细胞中蛋白的表达

经EGC处理SW620细胞24小时后，收集细胞蛋白，用免疫印迹法检测蛋白表达，结果如图16至图20所示。图16为PARP、caspase-3、STAT3、Bcl-2、Bim和β-actin蛋白SW620细胞的表达。图17至图20分别为这些蛋白表达的数据分析结果，图17为PARP的表达分析结果，图18为caspase-3的表达分析结果，图19为STAT3的表达分析结果，图20为Bcl-2和Bim的表达分析结果。

图16至图20的结果显示，相比于阴性对照组，即EGC浓度均为0，EGC可明显促进PARP（cleaved）、Caspase-3（cleaved）和Bim的表达，并降低磷酸化STAT3和Bcl-2的表达水平，说明EGC对结直肠癌细胞SW620的凋亡诱导作用与对STAT3的磷酸化调控密切相关。

5.EGC抑制STAT3mRNA 表达及其启动子区活性

为了检测EGC是否有效调节STAT3的mRNA表达，本例进行了实时荧光定量qPCR实验，结果如图21所示。图21为不同浓度EGC对STAT3 mRNA 表达影响的检测结果。如图21所示，当EGC浓度为80μg/mL时，SW620细胞中的STAT3表达显著降低。

此外，本例采用荧光素酶报告基因活性测定来评估EGC对STAT3启动子活性的影响。将STAT3的启动子序列克隆到质粒pGL3中，并转染到SW620细胞中。然后将转染的细胞与EGC孵育24小时，并通过双荧光素酶报告物测定荧光素素酶活性，结果如图22所示。

图22的结果显示，与对照组相比，EGC 80μg/mL显著降低了具有STAT3启动子区域的报告者的荧光素酶活性，EGC在下调荧光素素酶活性方面表现出很好的效果。结果表明，EGC对STAT3启动子的抑制作用可能是STAT3转录下调的原因。

6.EGC在小鼠中显著抑制结直肠肿瘤的生长

各组小鼠分别在饲养1天、4天、7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天称重，每组取平均值绘制体重变化曲线，结果如图23所示。各组的平均肿瘤大小如图24所示。28天后各组的肿瘤照片如图25所示。28天后各组肿瘤的平均重量如图26所示。

图23的结果显示，经腹腔注射给药4周后，发现给药组小鼠体重与阴性对照组（control，EGC浓度均为0）没有明显差别，而阳性对照组（阿霉素DOX）的小鼠体重明显减轻，说明EGC对小鼠无明显毒副作用。图24的结果显示，EGC给药后可抑制小鼠肿瘤的生长，EGC高剂量组的肿瘤抑制效果明显好于EGC低剂量组，EGC低剂量组从给药22天开始可显著减少肿瘤体积增加。图25和图26的结果显示，EGC高剂量组结果与阳性对照组DOX给药效果差不多，两者无明显差异，而EGC低剂量组虽然可有效减少肿瘤体积和瘤重，但在瘤重方面无阴性对照组无明显差异。

小鼠肿瘤模型结果说明EGC可有效减轻瘤重和瘤体积，且对小鼠无明显毒副作用，高剂量组优于低剂量组。

7.EGC影响结直肠癌肿瘤中蛋白的表达

动物实验结束后，切除肿瘤，部分肿瘤用于组织蛋白提取，部分肿瘤组织用于免疫组化。提取蛋白的表达检测结果如图27至图30所示，肿瘤组织免疫组化的结果如图31至图33所示。图27为PARP、caspase-3、STAT3、Bcl-2、Bim和β-actin蛋白表达的检测结果。图28至图30分别为这些蛋白表达的数据分析结果，图28为PARP（cleaved）和Caspase（cleaved）的表达分析结果，图29为STAT3和p-STAT3的表达分析结果，图30为Bcl-2和Bim的表达分析结果。图31至图33依序为肿瘤组织的免疫组化检测p-STAT3、Bcl-2、Bim的表达检测结果。

如图27至图30所示，经提取肿瘤组织蛋白，免疫印迹检测发现， EGC可导致凋亡相关蛋白PARP（cleaved）、Caspase-3（cleaved）和Bim表达显著增加，并降低磷酸化STAT3和Bcl-2的表达水平。动物肿瘤组织免疫组化结果进一步证实了上述p-STAT3、Bcl-2和Bim蛋白的变化，如图31至图33所示。

经EGC作用后，可显著降低磷酸化STAT3的表达及Bcl-2的水平，并促进Bim的表达，且EGC高剂量组与阳性对照DOX组效果最好，EGC高剂量组结果与DOX组相近，两者无明显差异；EGC低剂量组能有效抑制磷酸化STAT3和Bcl-2的表达，并提升促凋亡蛋白Bim的表达水平，效果居中。说明EGC可通过抑制磷酸化STAT3的表达并来实现其抗肿瘤作用。

8.EGC作用后，荷瘤小鼠肿瘤中的凋亡情况变化

本试验通过TUNEL检测试剂盒分析肿瘤组织中的细胞凋亡情况，结果如图34和图35所示。图34为显微镜观察结果图，图35为凋亡细胞统计结果。如图34和图35，EGC低剂量可以一定程度诱导肿瘤凋亡，并抑制肿瘤增殖；EGC高剂量组效果更好，诱导肿瘤中大面积凋亡并显著抑制肿瘤增殖，阳性対照度DOX效果也很好。

9.EGC在结直肠癌肿瘤类器官中的作用

类器官能够高度模拟原位组织的生理结构和功能，稳定地维持肿瘤细胞在体内的特征，很好地保持肿瘤异质性，对于药物效果的鉴定，能获取接近临床的检测数据，具有极其重要的意义。本试验首先培养并鉴定了结直肠癌肿瘤组织，如图36和图37所示，图36为两个样本COAD1042、COAD1045结直肠癌肿瘤类器官的抗原鉴定结果，图37为两个样本的HE结构的鉴定结果图。

利用鉴定的肿瘤类器官（COAD1042，COAD1045）进行EGC的功效测定，结果如图38所示。图38的结果显示，2例结直肠癌肿瘤类器官均对EGC敏感，且随EGC浓度增加被显著抑制，形态学上观测也发现，EGC可抑制肿瘤类器官的活性和大小，如图39所示。图39为COAD1042，COAD1045两列样本的细胞在不同EGC浓度处理结果图。图39的结果显示，EGC能够抑制结直肠癌类器官的活性和大小，且呈浓度梯度依赖。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (6)

1.表没食子儿茶素在制备结直肠癌治疗药物中的应用。

2.表没食子儿茶素在制备抑制癌细胞增殖或诱导癌细胞凋亡的药物中的应用。

3.表没食子儿茶素在制备抑制癌细胞迁移、侵染或生长的药物中的应用。

4.表没食子儿茶素在制备通过下调STAT3抑制癌细胞的药物中的应用。

5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于：所述癌细胞包括结直肠癌细胞。

6.表没食子儿茶素在制备下调STAT3的抑制剂中的应用。

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