CN113940936A - 二氢丹参酮Ⅰ在制备Nrf2抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二氢丹参酮Ⅰ在制备Nrf2抑制剂中的应用本发明提供了二氢丹参酮的一种新用途，其可下调Nrf2(核因子E2相关因子2)蛋白表达水平，降低人卵巢癌细胞的抗氧化应激能力。因此，二氢丹参酮Ⅰ可作为Nrf2抑制药物使用，并起到治疗卵巢癌和作为抗卵巢癌药物的活性成分的作用；当二氢丹参酮Ⅰ作为药物使用时，动物实验表明，二氢丹参酮Ⅰ能够显著抑制肿瘤的发生发展，并且对动物的肝肾等主要脏器无影响。

Description

二氢丹参酮Ⅰ在制备Nrf2抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及二氢丹参酮Ⅰ抑制Nrf2活性的功能， 同时也与二氢丹参酮Ⅰ应用于治疗卵巢癌和抗卵巢癌药物的活性成分有关。
背景技术
丹参为双子叶唇形科鼠尾草属植物，来源历史悠久，最先记载于《神农百 草经》，药用部位为干燥根及根茎。丹参酮类化合物因在丹参中含量较高，且 具有显著的抗肿瘤作用而得到广泛的研究。丹参酮IIA(Tanshinone IIA，TAN IIA)，丹参酮I(Tanshinone I，TANI)，隐丹参酮(Cryptotanshinone，CT)和 二氢丹参酮Ⅰ(15,16-Dihydrotanshinone I，DHT)是从丹参中提取的脂溶性菲 醌类有效成分。其中，DHT可以通过抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡以及阻滞细 胞周期从而发挥抗肿瘤作用。DHT能够通过Caspase途径诱导人骨肉瘤143B细胞的凋亡，下调黏附分子VCAM-1和ICAM-1来减弱骨肉瘤细胞的迁移 (Anti-CancerAgent Me,2017；1234-1242)。DHT能够激活JNK/p38MAPK信号 通路诱导胃癌细胞SGC7901和MGC803凋亡(Pharm Biol,2016；3019-3025)。 DHT还能够通过ROS/Stat3信号途径，诱导活性氧的生产，抑制乳腺癌干细胞 的生长(Oxid Med Cell Longev,2019)。此外，DHT能够调控 MAPK/Akt/mTOR通路诱导肝癌SK-HEP-1细胞在G0/G1期发生阻滞(Journal of cancerprevention,2018；63-69)。然而，目前尚无DHT抗卵巢癌的体内药效 研究报道，同时，DHT的抗卵巢癌机制尚未明确。
核转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是一种内源性的抗氧化应激调节因子，受胞质接头蛋白(Kelch-like ECH- associatedprotein 1，Keap1)负调控。Keap1能够加速Nrf2 Neh2结构域中赖氨 酸残基的泛素化，导致Nrf2降解。正常情况下Nrf2被Keap1锚定在细胞质中，并 受Keap1-Cul3 E3泛素连接酶调控。当产生氧化应激和亲电子试剂刺激时， Keap1构象发生改变，Nrf2与Keap1解离并进入细胞核与抗氧化反应元件 (Antioxidant response element，ARE)结合，激活下游相关转录因子血红素氧 化合酶(HMOX-1)、铁蛋白重链多肽(FTH1)、NADPH醌氧化还原酶1 (NQO1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)等表达，从而抵抗氧化应激对机 体的损伤(Free RadicBiol Med,2014；36-44)。同时，有研究表明，与Keap1相 互作用蛋白的积累，可阻止Nrf2与Keap1结合，导致细胞内Nrf2的积累。p62， 也称作SQSTM1，是一种与细胞信号转导、氧化应激和自噬有关的泛素结合蛋 白。p62作为Keap1-Nrf2的一个重要调控因子，能够与Keap1的DC口袋结合从而 抑制其对Nrf2的结合，阻断Keap1对Nrf2的调控，进一步抑制Nrf2的泛素化，使 Nrf2稳定并促进下游基因的表达(Redox Biol,2018；246-258)。该途径可导致肿 瘤细胞内Nrf2的异常积累，由此获得对凋亡的保护，促进肿瘤的发生，使肿瘤 细胞对化疗产生一定的耐药性(Curr Cancer Drug Targets,2019；468-478)。
现有研究表明，在各种人类癌症中，p62和Keap1/Nrf2系统经常失调，能够 导致Nrf2的异常激活(Pharmacol Rep,2017；393-402)。肿瘤中Nrf2的积累与患 者预后不良密切相关，Nrf2高表达卵巢癌患者无病生存期(HR：2.084； 95％CI：1.229-3.536)和总生存期(HR：2.487；95％CI：1.443-4.286)降低 (Cancer Cell Int,2021；116)。因此，靶向Nrf2是治疗卵巢癌及其耐药性的有效 途径之一。有报道称，植物鸦胆子的活性成分鸦胆苦醇可作为Nrf2抑制剂，通 过增强Nrf2泛素化选择性降低其蛋白表达，抑制肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长 (Proc Natl Acad Sci,2011；1433-1438)。小分子抑制剂ML385特异性与肺癌细 胞中Nrf2的DNA结合位点Neh1结合，干扰MAFG-Nrf2蛋白复合物与DNA的结 合，从而抑制下游基因的表达，并且对Keap1突变的非小细胞肺癌的选择性和 特异性更强(ACS Chem Biol,2016；3214-3225)。然而基于Nrf2抑制对卵巢癌的 治疗作用鲜有报道。基于DHT作为Nrf2抑制剂，针对Nrf2异常激活的卵巢癌进 行治疗并未有相应技术方案的提出。
发明内容
本发明的目的在于提供DHT的一种新用途，即：用于制备Nrf2抑制剂、 与Nrf2抑制有关的抗癌药物的应用，以解决上述问题中的一个或几个。
根据本发明的一个方面，提供了DHT在制备Nrf2抑制剂中的应用，其 中，DHT结构式如下：
Figure BDA0003291746530000031
实验表明，不同浓度的DHT均能够抑制卵巢癌细胞中Nrf2的活性，且抑 制能力随DHT剂量的增加而上升。
根据本发明的另一个方面，提供了DHT在制备与Nrf2抑制有关的疾病的 治疗药物中的应用。
在一些实施方式中，药物由DHT和药学上可接受的赋形剂组成。
在一些实施方式中，药物的给药方式为腹腔注射。
在一些实施方式中，疾病为癌症。具体地，癌症为肺癌、卵巢癌等。实验 表明，DHT可下调Nrf2蛋白表达水平，降低人卵巢癌细胞HO8910PM和 SKOV3的抗氧化应激能力。
根据本发明的另一个方面，提供了DHT和顺铂用于制备抗癌药物的用 途。
在一些实施方式中，药物由所述DHT和顺铂以及药学上可接受的赋形剂 组成。
在一些实施方式中，DHT和顺铂药物组合的给药方式为腹腔注射。
在一些实施方式中，抗癌具体指抗卵巢癌。
本发明是基于中药丹参，从中分离、提取、纯化得到DHT并对其进行研 究而完成，通过试验发现DHT单独使用对人卵巢癌细胞株HO8910PM和 SKOV3皮下移植瘤的抑制作用与DDP相当，与顺铂联合使用后抑制卵巢癌细 胞生长的效果更强，因而提供了DHT的一种新用途，其可下调Nrf2蛋白表达 水平，降低人卵巢癌细胞HO8910PM和SKOV3的抗氧化应激能力，提高化疗 药物顺铂对HO8910PM和SKOV3的增殖抑制作用，可作为Nrf2抑制药物使 用，以及作为抗癌尤其是抗卵巢癌药物使用；当DHT作为药物使用时，动物 实验表明，DHT对动物的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)无明显毒性。
本发明是验证了DHT对于Nrf2的抑制作用，并证实DHT能够通过抑制 NRF2起到抗卵巢癌的作用。本发明的目的在于提供一种Nrf2抑制剂，以及临 床上治疗卵巢癌的药物，提供了DHT的新用途。
本发明的有益效果是：
(1)本发明证实了DHT可用于Nrf2蛋白的抑制剂，并且通过抑制Nrf2 蛋白起到抗癌作用，为癌症的治疗提供了一种新的思路。
(2)本发明中的DHT低毒高效且来源丰富，能够大大减少癌治疗过程中 药物对人体的毒副作用，并显著降低治疗成本。
附图说明
图1是DHT、CT、TANⅠ和TANⅡA结构图；
图2是不同浓度DHT、CT、TANⅠ和TANⅡA处理卵巢癌细胞 HO8910PM、SKOV3和A278024h和48h对细胞活力的影响结果图；
图3是不同浓度顺铂、阿霉素和5-氟尿嘧啶对卵巢癌细胞HO8910PM、SKOV3和A2780给药处理24h后对细胞活力的影响结果图。
图4是DHT干预前后HO8910PM(上)、SKOV3(中)和A2780(下)的 细胞形态变化示意图；
图5是不同浓度(A:0μM、D:1.6μM、E:3.2μM、F:6.4μM)DHT和DDP (B:20.0μM)给药后引起HO8910PM细胞凋亡结果图和统计图(C)；
图6是不同浓度(A:0μM、D:4.0μM、E:8.0μM、F:16.0μM)DHT和 DDP(B:20.0μM)给药后引起SKOV3细胞凋亡结果图和统计图(C)；
图7是不同浓度(A:0μM、B:1.6μM、C:3.2μM、D:6.4μM)DHT给药后 HO8910PM细胞S、G1、G2期结果图和统计图(E)；表明S、G1期细胞阻 滞；
图8是不同浓度(A:0μM、B:4.0μM、C:8.0μM、D:16.0μM)DHT给药 后SKOV3细胞S、G1、G2期结果图和统计图(E)；表明S、G1期细胞阻 滞；
图9是不同浓度DHT给药后引起HO8910PM、SKOV3细胞内ROS水平升 高结果图(A、C)和柱状图(B、D)；
图10是不同浓度(A:0μM、B:1.6μM、C:3.2μM、D:6.4μM)DHT给药 后引起HO8910PM细胞线粒体去极化结果图和统计图(E)；
图11是不同浓度(A:0μM、B:4.0μM、C:8.0μM、D:16.0μM)DHT给药 后引起SKOV3细胞线粒体去极化结果图和统计图(E)；
图12是DHT联合ROS抑制剂NAC不同处理组给药后HO8910PM、 SKOV3细胞活力的影响结果图(A)、ROS表达水平统计图(B、C)；
图13是DHT联合ROS抑制剂NAC不同处理组A:Ctrl.、B:NAC、C: DHT、D:NAC+DHT)给药后引起HO8910PM细胞线粒体去极化结果图和统计 图(E)；
图14是DHT联合ROS抑制剂NAC不同处理组(A:Ctrl.、B:NAC、C: DHT、D:NAC+DHT)给药后引起SKOV3细胞线粒体去极化结果图和统计图 (E)；
图15是DHT联合ROS抑制剂NAC不同处理组(A:Ctrl.、B:NAC、C: DHT、D:NAC+DHT)给药后引起HO8910PM细胞凋亡结果图和统计图 (E)；
图16是DHT联合ROS抑制剂NAC不同处理组(A:Ctrl.、B:NAC、C: DHT、D:NAC+DHT)给药后引起SKOV3细胞凋亡结果图和统计图(E)；
图17是DHT联合ROS抑制剂NAC不同处理组(A:Ctrl.、B:NAC、C: DHT、D:NAC+DHT)给药后HO8910PM细胞S、G1、G2期结果图和统计图 (E)；表明S、G1期细胞阻滞；
图18是DHT联合ROS抑制剂NAC不同处理组(A:Ctrl.、B:NAC、C: DHT、D:NAC+DHT)给药后SKOV3细胞S、G1、G2期结果图和统计图 (E)；表明S、G1期细胞阻滞；
图19是不同浓度DHT给药后HO8910PM细胞内相关蛋白表达结果图 (A)、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和周期蛋白CyclinB1、Cdc2的表 达统计图(B)；
图20是不同浓度DHT给药后SKOV3细胞内相关蛋白表达结果图(A)、 凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和周期蛋白CyclinB1、Cdc2的表达统计 图(B)；
图21是不同浓度DHT给药后HO8910PM细胞内p62/Keap1/Nrf2蛋白表达 结果图(A)统计图(B)；
图22是不同浓度DHT给药后SKOV3细胞内p62/Keap1/Nrf2蛋白表达结 果图(A)统计图(B)；
图23是DHT给药后HO8910PM(A)、SKOV3(B)细胞内Nrf2蛋白的 mRNA水平图；
图24是DHT联合蛋白酶体抑制剂MG132不同处理组给药后 HO8910PM、SKOV3 Nrf2蛋白表达结果图(A)和统计图(B、C)；
图25是DHT联合Nrf2抑制剂tBHQ不同处理组给药后HO8910PM、 SKOV3 Nrf2蛋白表达结果图(A)和统计图(B、C)；
图26是不同处理组小鼠的体重(A)、肿瘤体积(B)随时间变化结果图、 离体肿瘤照片(C)、离体肿瘤体积统计图(D)、血清肿瘤标志物CA125 (E)、HE4(F)水平结果图；
图27是不同处理组小鼠心、肝、脾、肺、肾的HE病理切片图(200×) (A)和脏器指数(B)。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明所提供的DHT用于NRF2抑制效 果、治疗与NRF2抑制有关疾病作进一步详细的说明。
以下实施例不对本发明做任何形式的限定。本发明具体实施方式中使用的 原料、设备均为已知产品，除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均通过 购买市售产品获得。
主要仪器设备：超纯水机(Millipore公司)；细胞计数仪(Couter Star公 司)；涡旋仪(Midwest公司)；CO2恒温细胞培养箱(ThermoFisher Scientific 公司)；冰箱(Haier公司)；光学显微镜(Olympus公司)；金属加热仪(杰瑞 尔电器有限公司)；低温离心机(Beckman公司)；-80℃冰箱(ThermoFisher Scientific公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；流式细胞仪(Beckman公司)； 超净工作台(上海沪净医疗器械有限公司)；酶联免疫反应检测仪(Biotek Epoch公司)；电泳仪、转膜仪和WB显影装置(上海天能科技有限公司)
主要试剂材料：RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、磷 酸盐缓冲液(Gibco公司)；丹参酮ⅡA、MTT粉末、二甲基亚砜溶液、甲醛 (Sigma公司)；吉姆萨染液(上海默克化工技术有限公司)；细胞凋亡检测试 剂盒、细胞周期检测试剂盒(Becton Dickinsonand Company)；RIPA蛋白裂解 液(ThermoFisher Scientific公司)；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(Bimake公 司)；SDS-PAGE凝胶、ECL化学发光液(上海雅酶生物科技有限公司)；Western blot抗体(Abcam公司)。
实验细胞株及动物：人卵巢癌细胞株HO8910PM，SKOV3和A2780，购 自于武汉普诺赛生物科技有限公司，冻存于本实验室的细胞存储液氮罐中。从 上海斯莱克动物实验中心购买实验所需小鼠，SPF级健康成熟的6周龄的雌性 NOD/SCID小鼠。
所有统计分析均采用Graphpad 5软件进行。多组比较采用单因素方差分析(ANOVA)检验。数据以独立实验次数的平均数±标准差(SD)表示。流式图 使用Flowjo 7.6软件进行圈门和细胞百分比的统计。P值＜0.5为有统计学差 异。
实施例1 DHT对卵巢癌细胞的体外增殖影响的研究
1.1细胞培养
(1)细胞复苏：从细胞存储液氮罐中取出人卵巢癌细胞株HO8910PM， SKOV3和A2780，分别置于37℃水浴锅中,轻轻晃动使冻存的细胞完全融化， 然后用3mL的RPMI-1640完全培养基(包含10vol％的胎牛血清+1vol％青霉素 -链霉素双抗)洗去细胞冻存液中的二甲基亚砜,1800rpm/min离心5分钟，将 上清弃去，加入1mL RPMI-1640完全培养基重悬细胞，然后将细胞悬液转移 至培养皿中，补加7mL的培养基,轻轻晃动细胞培养皿并置于37℃的CO2细胞 培养箱中培养。
(2)细胞传代：待人卵巢癌细胞株呈圆形透明状，生长状态良好，且细 胞生长到培养皿的八九成满时进行细胞传代。首先用移液枪将细胞悬液轻轻吹 匀，然后吸取一半细胞悬液转移至一个新的细胞培养皿中,两个培养皿中均补加 4mL的新培养基，置于细胞培养箱中进行细胞培养。
1.2MTT法分析DHT对卵巢癌细胞增殖的影响
MTT：四甲基偶氮唑蓝，全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮 唑溴盐，是一种可以间接检测活细胞数量的黄色染料。本次细胞活性检测实验 所用MTT浓度为5mg/mL：称取MTT 0.1g溶于20mL无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)中，用0.22μm滤膜和无菌注射器过滤除菌，分装至1mL无菌棕色离 心管中，置于4℃避光保存，备用。
(1)细胞计数：首先用移液枪将细胞悬液轻轻吹匀，然后进行台盼蓝细 胞计数。台盼蓝和细胞悬液1:1混合，吸取20μL混合液于细胞计数板上，然 后用细胞计数仪计数每毫升所含细胞浓度。
(2)细胞铺板：取对数生长期的人卵巢癌细胞系(HO8910PM， SKOV3，A2780)接种于96孔板中，加入不同浓度的DHT，CT，TAN IA， TAN IIA(化学结构如图1所示)，顺铂，阿霉素和5-氟尿嘧啶(0μM,1μM,2 μM,4μM,8μM,16μM,32μM,64μM)处理细胞24或48小时。
(3)酶联免疫反应检测仪检测：给药结束后每孔避光加入10μL的MTT 溶液，37℃培养箱中继续培养4小时。最后加入100μL的DMSO溶解甲瓒结 晶体。在酶联免疫吸附测定仪中490nm处检测细胞的光密度值。根据以下公 式进行细胞活性的计算：细胞活性＝(给药组细胞平均吸光度值-空白组细胞平 均吸光度值)/(对照组细胞平均吸光度值-空白组细胞平均吸光度值) ×100％。Graphpad 5软件进行数据处理，计算不同药物对细胞的IC50值。
二氢丹参酮(DHT)、隐丹参酮(CT)、丹参酮Ⅰ(TANⅠ)和丹参酮ⅡA (TANⅡA)对三种不同卵巢癌细胞增殖的作用MTT法检测结果如图2所 示，其中DHT的效果最好，可显著抑制卵巢癌细胞增殖，呈剂量和时间依赖 性。处理24h后，DHT对三种卵巢癌细胞HO8910PM、SKOV3和A2780的 IC50分别为3.26μM，8.03μM和4.05μM。对比化疗药物的IC50(顺铂 (DDP)：17.80μM，115.57μM，519.5μM；阿霉素(DOX)：2.29μM，46.29 μM，4.4μM；5-氟尿嘧啶(5-FU)：395.29μM，--，985.86μM)(图3)，说明 DHT对卵巢癌细胞的抑制效果与阿霉素相当，优于顺铂和5-氟尿嘧啶。
1.3细胞形态学观察(结晶紫染色)
(1)细胞处理：将生长状态良好的HO8910PM，SKOV3和A2780细胞计 数后，取2×105/mL细胞种植于六孔板中，分别加入不同浓度DHT处理细胞24 小时。
(2)结晶紫染色：给药结束后，每孔分别加入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液 1mL，润洗2遍，之后每孔分别加入4％多聚甲醛溶液1mL，固定细胞15分 钟。固定结束后，再次加入PBS溶液1mL润洗2遍。最后，每孔加入0.1％结 晶紫染色液1mL染色15分钟。染色结束后取六孔板于低速流水下轻轻冲洗， 晾干，在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。结果如图4所示，随着DHT给 药浓度的增加，细胞数量减少，且伴随着细胞破裂、核固缩等现象，表明DHT 能够抑制卵巢癌细胞的增殖并导致细胞损伤。
1.4流式细胞术分析细胞周期
(1)细胞处理：收集生长状态良好的HO8910PM，SKOV3细胞计数后， 调整细胞浓度，取2×105/mL细胞种植于六孔板中，分别加入不同浓度的DHT 和20.0μM DDP处理24小时。
(2)细胞固定：分别收集不同处理组别的HO8910PM，SKOV3和A2780 细胞于离心管中，使用PBS溶液于1800rpm/min下离心5分钟洗涤两次，弃去 上清。加入250μL预冷的PBS轻轻重悬细胞，之后在细胞涡旋仪上一边涡旋 一边逐滴加入750μL预冷的乙醇固定细胞。细胞放置在4℃过夜孵育。
(3)细胞染色：取出固定好的细胞，3000rpm/min离心5分钟，将细胞中 的乙醇除去，使用PBS溶液于1800rpm/min下离心5分钟洗涤一次，弃上清。 之后加入200μL的PBS重悬细胞，然后加入核糖核酸酶(RNase A)和50 μg/mL的碘化丙啶(PI)，将细胞混合均匀，置于室温避光孵育30分钟使细胞着 色。
(4)流式细胞仪检测：用200目滤网将处理好的细胞悬液过滤于流式管 中，最后于1小时之内通过流式细胞术分析细胞周期的分布情况。
结果表明，DHT可剂量依赖性降低G1期细胞数量，升高S期和G2期数 量，从而诱导细胞周期S、G2期阻滞(图7-8)。
1.5流式细胞术分析细胞凋亡
(1)细胞处理：收集生长状态良好的HO8910PM，SKOV3和A2780细胞 计数后，调整细胞浓度，取2×105/mL细胞种植于六孔板中，分别加入不同浓 度的DHT处理24小时。
(2)细胞收集：分别收集不同组别的HO8910PM，SKOV3和A2780细胞 于离心管中，使用PBS溶液于1800rpm/min下离心5分钟洗涤两次，弃去上 清。
(3)细胞染色：首先将细胞凋亡试剂盒中的10×结合缓冲液用去离子水稀 释成1×结合缓冲液。接着加入400μL的1×结合缓冲液重悬细胞，使最终浓度 为5×106个细胞/mL。每个样品取100μL的细胞悬液，分别加入5μL的膜联蛋 白V-FITC和5μL的碘化丙啶(PI)，将细胞混匀，在室温避光条件下培养30 分钟使细胞着色。
(4)流式细胞仪检测：每个样本中补加300μL的1×结合缓冲液，将细胞 轻轻混匀。200目滤网将细胞悬液过滤于流式管中，最后于1小时之内通过流 式细胞术分析细胞周期的分布情况。
通过流式细胞检测发现，DHT剂量依赖性诱导卵巢癌HO8910PM和 SKOV3细胞凋亡，处理24h后HO8910PM凋亡率为45.90％(6.4μM)， SKOV3凋亡率为56.60％(16.0μM)(图5-6)。
1.6流式细胞术分析细胞内活性氧水平和线粒体膜电位DHT通过激活卵巢 癌细胞氧化应激诱导细胞凋亡和周期阻滞
(1)细胞处理：收集生长状态良好的HO8910PM，SKOV3细胞计数后， 调整细胞浓度，取2×105/mL细胞种植于六孔板中，分别加入不同浓度的DHT 处理24小时。
(2)细胞染色：分别收集不同组别的HO8910PM，SKOV3细胞于离心管 中，使用PBS溶液于1800rpm/min下离心5分钟洗涤两次，弃去上清。取洗涤 后的细胞加入1mL的RPMI-1640培养基重悬。随后，加入浓度为2mM的罗 丹明123染液2μL，置于37℃恒温培养箱中避光孵育15分钟，使细胞着色用 于流式细胞仪检测线粒体膜电位。取洗涤后的细胞加入500μL终浓度为10μM 的DCFH-DA探针重悬，随后置于37℃恒温培养箱中避光孵育20分钟用于流 式细胞仪检测细胞内活性氧水平。
(3)流式细胞仪检测：细胞着色完成后，用RPMI-1640培养基1800 rpm/min离心5分钟洗涤2次，弃去上清。紧接着再加入400μL的RPMI-1640 培养基重悬细胞，于37℃恒温培养箱中避光孵育1小时。用200目滤网将处理 好的细胞悬液过滤于流式管中，在1小时之内使用流式细胞仪对样品进行线粒 体膜电位检测。
细胞内活性氧水平(ROS)结果如图9所示，发现DHT处理后，卵巢癌 HO8910PM和SKOV3细胞ROS水平显著升高，分别升高6.69倍(6.4μM)和15.16倍(16.0μM)，且呈剂量依赖性。
ROS升高伴随线粒体膜电位的变化，DHT剂量依赖性降低细胞中线粒体膜 电位水平，分别降低92.5％(6.4μM)和98.7％(16.0μM)，导致线粒体去极 化(图10-11)。
表明DHT升高肿瘤细胞中ROS水平可激活细胞氧化应激，从而杀伤肿瘤 细胞。
(4)DHT联合ROS抑制剂NAC处理分析：为了进一步印证DHT对 SKOV3和HO8910PM的细胞毒性是否与诱导氧化应激有关，使用ROS抑制剂 NAC进行干预，分别设置对照组ctrl、NAC组(10mM)、DHT组(6.4μM)、 NAC(10mM)+DHT组(6.4μM)处理人卵巢癌细胞HO8910PM，SKOV3 24 小时，并用MTT法统计不同组别卵巢癌细胞增殖结果，发现预孵育NAC(10 mM)可以完全逆转DHT诱导的增殖抑制(图12A)，采用流式细胞术分析不 同组别细胞内活性氧水平结果如图12B-C所示，ROS上升，线粒体膜电位下 降，凋亡和周期阻滞(图12-18)。进一步证实了DHT通过激活氧化应激诱导 卵巢癌细胞凋亡和周期阻滞。
1.7蛋白免疫印迹分析DHT通过促进Nrf2蛋白降解从而抑制其表达
(1)细胞处理：收集生长状态良好的HO8910PM，SKOV3细胞计数后， 调整细胞浓度，取2×105/mL细胞种植于六孔板中，分别加入不同浓度的DHT 处理24小时。
(2)蛋白提取：分别收集不同组别的HO8910PM，SKOV3细胞于离心管 中，使用PBS溶液于1800rpm/min下离心5分钟洗涤两次，弃去上清。加入含 有1％蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的高强度细胞裂解缓冲液裂解细胞的总蛋 白。裂解期间每隔5分钟超声一次样品，裂解20min。然后按照4：1的比例 加入5×的蛋白上样缓冲液，将蛋白样品在金属加热器中100℃下煮沸10分 钟。提取好的蛋白样品置于-20℃保存备用。
(3)Western blot分析：将等量的细胞总蛋白加到12％的十二烷基硫酸盐 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳(浓缩胶部分80V，分离胶部分为 120V)，分离相对分子质量不同的蛋白质。电泳结束后用湿转(恒压100V转 膜60min)的方法将凝胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF 膜与5％的脱脂牛奶于室温下，在摇床上孵育1小时，封闭PVDF膜上的非特 异性蛋白结合位点。封闭结束后，用TBST摇床上洗三次，每次8分钟。然后在4℃摇床上孵育各种主要的兔抗抗体：β-actin，Keap1，Nrf2，Caspase-3， Bax，Bcl-2，CyclinB1，cdc-2，抗体孵育过夜。次日，回收一抗于-20℃保存， 将PVDF膜用TBST摇床上洗三次，每次8分钟。然后将孵育过一抗的PVDF 膜与辣根过氧化物酶结合的抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体于室温摇床上孵育1 小时。之后用TBST摇床上洗三次，每次8分钟。最后采用增强型化学发光检 测试剂盒(ECL)检测抗体的结合。β-actin蛋白表达用于内部参照。
结果如图19-20所示，发现DHT剂量依赖性下调凋亡相关蛋白Bcl-2、 Caspase-3表达，下调周期蛋白CyclinB1、Cdc2表达，升高SKOV3细胞中Bax 表达，对HO8910PM细胞中Bax表达无影响，进一步说明DHT抑制卵巢癌细 胞增殖的作用与诱导细胞凋亡和周期阻滞有关。
图21-22是Keap1/Nrf2蛋白表达分析结果，Keap1/Nrf2信号通路是细胞中 重要的氧化应激调节系统，Keap1通过泛素化降解负调控Nrf2表达。图中结果 表明，DHT升高Keap1表达，下调Nrf2表达，并且抑制Nrf2进入细胞核。
(4)qRT-PCR分析：利用qRT-PCR分析Nrf2蛋白的mRNA水平，qRT- PCR分析发现在mRNA水平上DHT降低Nrf2的靶基因如HMOX1、GCLM、 FTH1，剂量依赖性升高KEAP1和NFE2L2的转录水平(图23A和23B)。而 在蛋白水平DHT抑制Nrf2的表达，说明DHT是通过转录后水平对Nrf2表达 进行调控。
(5)DHT联合Nrf2激活剂tBHQ处理分析：分别设置对照组、tBHQ组 (10μM)、DHT组(6.4μM)、tBHQ(10μM)+DHT组(6.4μM)处理人卵 巢癌细胞HO8910PM，SKOV3 24小时，并用Western blot分析法测试不同组别 卵巢癌细胞Nrf2蛋白表达，进一步分析发现DHT与tBHQ共孵育可逆转DHT 对Nrf2的抑制作用(图24)，证明DHT的作用靶点为Nrf2。
(6)DHT联合蛋白酶体抑制剂MG132处理分析：分别设置对照组、 MG132组(10μM)、DHT组(6.4μM)、MG132(10μM)+DHT组(6.4 μM)处理人卵巢癌细胞HO8910PM，SKOV3 24小时，并用Western blot分析 法测试不同组别卵巢癌细胞Nrf2蛋白表达，进一步分析发现DHT与MG132共 孵育可逆转DHT对Nrf2的抑制作用(图25)，说明DHT是通过促进Nrf2蛋 白降解从而抑制其表达。
实施例二DHT在小鼠体内抗肿瘤疗效的研究
小鼠皮下移植：Balb/c雌性小鼠，4-6周龄，初始体重在18克到22克之 间。收集生长状态良好的HO8910PM细胞，计数后调整细胞浓度，取 HO8910PPM细胞(1×107个细胞/100μL)，使用1mL无菌注射器在超净工作台 上将细胞悬液皮下接种到Balb/c小鼠腋窝左侧。
小鼠分组给药治疗：使用50vol％PEG 400+35vol％DMSO+15vol％生理 盐水，混合均匀后作为溶解DHT的溶剂。
当肿瘤发展到约100mm3时，小鼠腹腔注射约100μL的50vol％PEG 400+35vol％DMSO+15vol％生理盐水(空白对照组TC)，10mg/kg/d的DHT (DHT低剂量组DHT-L)，20mg/kg/d的DHT(DHT高剂量组DHT-H)，2 mg/kg/d的顺铂注射液(顺铂组DDP)，隔天一次，共给药14天。期间隔天测 量和计算一次小鼠的体重和肿瘤体积(用游标卡尺测量肿瘤的最长直径(a)和最 短直径(b)，按照V＝1/2ab2计算肿瘤体积并记录)。给药结束后利用ELISA法 检测小鼠血清中HE4和CA125水平，提取方法如下：(1)包被检测板：将所 用抗原用包被稀释液稀释至1μg/μL，每孔抗原加入100μL，37℃孵育4小时 后弃去孔中液体。
(2)封闭酶标反应孔：5％胎牛血清于37℃下封闭40分钟，封闭时将封 闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用PBS洗涤3遍，每遍 3分钟。
(3)加入待检测样品：吸取50μL不同组别Balb/c小鼠血清加入酶标反 应孔中，每个样品做3个复孔,每孔100μL，置于37℃孵育60分钟，孵育结束 后用PBS洗涤3遍，每遍3分钟。
(4)加入酶标抗体：酶标抗体：根据酶结合物提供商提供的参考工作稀 释度进行：每孔加入酶标抗体100μL，37℃下孵育60分钟，孵育结束后用 PBS洗涤3遍，每遍3分钟。
(5)加入底物液：每孔加入100μL底物液，置37℃避光放置5分钟，之 后加入终止液显色。
(6)终止反应：每孔加入终止液50μL终止反应，20min内使用酶联免疫 反应检测仪于450nm波长下测定实验结果。
结果如图26所示，DHT(20mg/kg)腹腔注射对小鼠体重无显著性影响 (图26A)，能显著抑制卵巢癌荷瘤小鼠肿瘤生长(图26B)。实验结束后处死 小鼠，测量肿瘤组织和主要脏器组织(肝脏、脾脏)重量，并进行病理组织学 染色，具体为：用石蜡切片机进行石蜡样本的切片，厚度3.5μm，连续切 片，染色程序为烤片干燥20分钟，二甲苯2次×10分钟，无水乙醇2次×2分 钟，95％乙醇1分钟，80％乙醇1分钟，70％乙醇1分钟，水洗1分钟，苏木 素8分钟，水洗2次×1分钟，0.5％盐酸酒精10秒，水洗10分钟，伊红2分 钟，水洗1分钟，80％乙醇5秒，85％乙醇5秒，90％乙醇5秒，95％乙醇1 分钟，无水乙醇2次×2分钟，无水乙醇3分钟，二甲苯2次×2分钟，结束染 色后直接用中性树胶封片。
研究发现，DHT能够降低离体肿瘤重量(图26C和26D)和血清肿瘤标志 物CA125、HE4水平(图26E和26F)，肿瘤组织HE病理切片表明DHT能够 导致荷瘤中卵巢癌细胞坏死及凋亡(图26G)。此外，与模型组相比，DHT给 药后对小鼠主要脏器病理(图27A)和脏器指数(图27B)无显著性影响，说 明DHT治疗可延缓小鼠肿瘤生长，且对小鼠无潜在毒性作用，DHT体内对小 鼠相对较安全。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的 限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由 此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种二氢丹参酮Ⅰ在制备Nrf2抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二氢丹参酮Ⅰ作为药理学成分抑制Nrf2活性，作为药物应用于Nrf2抑制有关的疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Nrf2抑制剂由所述二氢丹参酮Ⅰ和药学上可接受的赋形剂组成。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Nrf2抑制剂为胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液或注射剂。
5.根据权利要求2～4任一项所述的应用，其特征在于，所述疾病为癌症。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述癌症为卵巢癌。
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