KR101908029B1

KR101908029B1 - Glutathione, Thioredoxin, Nrf2 항산화계 병합억제를 통한 선택적 암세포사멸 유도

Info

Publication number: KR101908029B1
Application number: KR1020160174698A
Authority: KR
Inventors: 노종렬
Original assignee: 울산대학교 산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2018-10-15
Also published as: WO2018117345A1; KR20180071722A

Abstract

본 발명은 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 시스플라틴에 저항성을 가진 암에 대하여 상기 유전자의 발현을 억제하거나 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킴으로써 시스플라틴-저항성의 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Glutathione, Thioredoxin, Nrf2 항산화계 병합억제를 통한 선택적 암세포사멸 유도{Inducing apoptosis of cancer cells selectively by targeting of glutathione, thioreodoxin, Nrf2 antioxidant systems}

본 발명은 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

두경부암(Head and neck cancer)은 비강, 인두, 후두, 침샘, 갑상선 등의 조직에서 발생하는 암으로써, 세계적으로 발생 빈도가 전 악성종양의 약 5％ 정도를 차지하고 있다. 세계적으로 두경부암의 발생빈도는 점차로 증가하고 있으며, 이러한 두경부암의 치료를 위해서 현재 임상에서 사용되고 있는 항암제 중 가장 강력한 항암제인 시스플라틴이 사용되고 있다. 그러나, 시스플라틴이 다양한 종류의 암에 대하여 매우 효과적인 항암제이긴 하지만 최근 연구에 의하면 그 내성으로 인해 임상적인 문제가 증가하고 있다. 따라서, 최근에는 시스플라틴에 대한 내성을 유도하는 암세포의 단백질 및 유전자를 이용하여 시스플라틴에 내성을 갖게된 암을 치료하려는 연구가 다양하게 진행되고 있다.

암세포에서 산화적 스트레스의 증가된 양은 ROS(reactive oxygen species)의 생산 및 제거 사이의 불균형에 의한 것이다(Toyokuni S, Okamoto K, Yodoi J, Hiai H. FEBS Lett 358: 1-3, 1995). 암에서 지속적인 산화적 스트레스는 부분적으로 암세포가 ROS에 의한 손상에 쉬운 정상세포와 다른 특성을 가진 이유를 설명하고 있다(Trachootham D, Alexandre J, Huang P. Nat Rev Drug Discov 8: 579-91, 2009). 불균형의 산화환원 상태를 처리하기 위하여, 암세포는 높은 ROS 양을 상승된 자유라디칼 소기 시스템으로 대응한다(Diehn M et al., Nature 458: 780-3, 2009). 암세포에서의 산화환원 변화 및 증가된 항산화 방어 기작은 암세포에 방사선 및 화학요법의 치료에 무감각하게 한다는 보고가 있다(Hanahan D, Weinberg RA. Cell 144: 646-74, 2011). 증가된 ROS 양은 종양의 공격적인 표현형 및 좋지 않은 치료 결과로 연결된다(Kumar B, Koul S, Khandrika L, Meacham RB, Koul HK. Cancer Res 68: 1777-85, 2008). 따라서, 암세포에서 ROS 생성을 더욱 강화하거나 항산화 방어의 약화에 의한 산화환원 조절은 정상세포를 남기고 암세포를 선택적으로 제거하기 위한 유망한 전략이 될 수 있다(Schumacker PT. Cancer Cell 10: 175-6, 2006).

세포 내 항산화제인 GSH는 GCLM(glutamate cysteine ligase modifier) 및 GCLC(glutamate cysteine ligase catalytic) 서브유닛을 가지는 GCL(glutamate cysteine ligase)에 의해 합성된다고 보고되어 있고(Liu Y, Hyde AS, Simpson MA, Barycki JJ. Adv Cancer Res 122: 69-101, 2014), Trx 시스템은 티오레독신 환원효소(thioredoxin reductase)의 존재 하에 세포내 산화환원상태가 감소된 상태로 유지하는데 필수적이라고 보고되었다(Mahmood DF, Abderrazak A, El Hadri K, Simmet T, Rouis M. Antioxid Redox Signal 19: 1266-303, 2013). Nrf2는 ARE(antioxidant responsive element)에 결합하는 전사인자로서 세포 내의 산화환원의 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 한다(Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Trends Biochem Sci 39: 199-218, 2014). 그런데, 암세포는 종양 진행에 기여하는 다양한 항산화 경로를 활발히 상향 조절함으로써 세포 내 ROS 양에 의한 스트레스를 보완하는 것으로 알려져 있다(DeNicola GM et al., Nature 475: 106-9, 2011; Diehn M et al., Nature 458: 780-3, 2009; 및 Schafer ZT et al., Nature 461: 109-13, 2009).

1. Food Nutr Res. 2015 Dec 22;59:29884 2. Oncol Rep. 2016 Jan;35(1):546-51

본 발명의 목적은 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 암세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 mRNA 발현량 또는 단백질의 발현량이 억제되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현 억제제는 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하거나 상기 유전자의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA((small interfering RNA), shRNA(Short Hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글루타치온 유전자의 발현을 촉진하는 GCLM(glutamate cysteine ligase modifier) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 티오레독신 유전자의 발현을 촉진하는 TXNRD1(thioredoxin reductase 1) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 것이며, 상기 Nrf2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 또는 서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 Nrf2 유전자의 발현을 촉진하는 HO1(heme oxygenase 1) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 또는 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활성 억제제는 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글루타치온에 특이적으로 결합하는 화합물은 BSO(buthionine sulfoximine) 또는 NOV-002(glutathione disulfide mimetic)인 것이고, 상기 티오레독신에 특이적으로 결합하는 화합물은 오라노핀(auranofin), 니트로소 요소(nitrosourea) 또는 커큐민(curcumin)인 것이며, 상기 Nrf2에 특이적으로 결합하는 화합물은 트리고넬린(trigonelline), 크리신(chrysin), 아피제닌(apigenin), 브루사톨(brusatol), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 루테올린(luteolin)인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 시스플라틴에 저항성을 가지는 암인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 두경부암, 폐암, 위암, 간암, 대장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종, 건선 또는 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 (a) 암세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 mRNA 발현량 또는 단백질의 발현량이 억제되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 발현 억제제 또는 활성 억제제는 시스플라틴에 저항성을 가진 암세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 유도함으로써 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 GSH 억제제인 BSO(buthionine sulfoximine) 및 Trx 억제제인 오라노핀에 대한 시스플라틴-민감성 및 시스플라틴-저항성 HNC 세포의 사멸 유도 효과에 관한 결과이다. (A)는 농도에 따른 오라노핀에 대한 세포사멸 효과를 나타낸 것이고, (B)는 농도에 따른 BSO에 의한 세포사멸 효과를 나타낸 것이며, (C)는 BSO 및 오라노핀에 의한 세포사멸 효과를 나타낸 것이고, (D)는 다른 종류의 HNC 세포주 및 SNU 세포주에서의 BSO 및 오라노핀에 의한 세포사멸 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 GSH 억제제인 BSO(buthionine sulfoximine) 및 Trx 억제제인 오라노핀에 대한 HNC 세포에서의 ROS(reactive oxygen species) 유도 및 세포사멸 효과에 대한 결과이다. (A)는 BOS, 오라노핀 또는 BSO-오라노핀을 처리한 후 HNC 세포의 생존율을 비교한 결과이고, (B)는 HNC 세포를 현미경으로 관찰한 결과이며, (C)는 BOS, 오라노핀 또는 BSO-오라노핀을 처리하고, 항산화제인 Trolox의 처리 또는 처리하지 않은 각 군에서 ROS의 양을 측정한 결과이고, (D)는 상기 (C)의 조건에서의 세포생존율을 측정한 결과이다 (* P < 0.01; 및 ** P < 0.001).
도 3은 GSH 및 Trx의 억제에 의하여 저항성의 HNC 세포에서의 세포사멸의 차선 효과를 나타내는 결과이다. (A)는 GCLM 또는 TXNRD1 유전자의 siRNA를 형질도입하여 각각 GSH 또는 TrxR의 mRNA 발현량을 확인한 결과이고, (B)는 상기 유전자의 siRNA를 도입시킨 후 세포 내 GSH 양을 분석한 것이며, (C)는 상기 유전자의 siRNA를 도입시킨 후 TrxR 활성을 분석한 것이고, (D)는 GCLM 및/또는 TXNRD1 유전자의 siRNA를 도입한 HN3 및 HN3-cisR 세포에 BSO, 오라노핀 또는 BSO-오라노핀을 처리한 후 상대적인 세포 수를 측정한 결과이고, (E)는 아넥신-V 및 PI 염색에 의하여 세포사멸을 분석한 결과이다(A 내지 D에서 * P < 0.05; 및 E에서 * P < 0.01, ** P < 0.05, *** P < 0.01).
도 4는 BSO 및 오라노핀에 의한 Nrf2-ARE 활성 유도에 대한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 HN3 및 HN3-cisR 세포에 BOS, 오라노핀 또는 BSO-오라노핀을 처리한 후 Nrf2, Keap1, NQO1 및 HO-1의 단백질 발현량을 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이고, (B)는 NFE2L2 및 HMOX1 유전자에 대한 siRNA를 HN3-cisR 세포에 형질도입시킨 후 각 유전자의 mRNA가 억제되는지를 확인한 결과이고, (C)는 NFE2L2 및/또는 HMOX1 유전자에 대한 siRNA(각각 siGCLM, siTXNRD1 )를 HN3-cisR 세포에 형질도입시킨 후 NFE2L2, HMOX1 에 대한 siRNA(각각 siNFE2L2 , siHMOX1) 또는 트리고넬린을 처리한 후 세포생존율을 측정한 결과이며, (D)는 NFE2L2 유전자에 대한 siRNA(siNFE2L2)를 HN3-cisR 세포에 형질도입시킨 후 BSO, 오라노핀, trolox 또는 이의 조합을 처리하고 아넥신-V 및 PI 염색을 통해 세포사멸 효과에 대한 결과를 나타낸 것이다(B, C에서 * P < 0.05; 및 D에서 * P < 0.01, ** P < 0.05, *** P < 0.05).
도 5는 Nrf2 억제에 의한 BSO 및 오라노핀의 암세포사멸에 대한 향상 효과를 나타낸 결과이다. (A)는 NFE2L2 및 HMOX1 유전자에 대한 siRNA를 HN3-cisR 세포에 형질도입시킨 후 BSO, 오라노핀 또는 BSO-오라노핀을 처리하여 세포생존율을 측정한 결과이고, (B)는 HN3-cisR 세포에서 BSO, 오라노핀 또는 BSO-오라노핀에 트리고넬린을 추가 처리한 후 세포수를 측정한 결과이며, (C)는 HN3-cisR 세포에서 BSO, 오라노핀 또는 BSO-오라노핀에 트리고넬린 및/또는 Trolox를 처리한 후 ROS 양을 측정한 결과이고, (D)는 아넥신 V 및 PI 염색 후 세포사멸 효과를 측정한 결과이다(A에서 * P < 0.05, ** P < 0.01; 및 B 내지 D에서 * P < 0.05, ** P < 0.01).
도 6은 BSO, 오라노핀 및 트리고넬린에 의한 종양 이식 후 성장 억제 효과를 나타낸 결과이다. (A)는 BSO, 오라노핀, 트리고넬린 또는 이들의 조합을 처리한 후 종양의 부피를 측정한 결과이고, (B)는 종양의 무게를 측정한 결과이며, (C)는 일주일 두번 각 마우스의 몸무게를 측정한 결과이고, (D)는 TUNEL-양성 사멸세포를 측정한 결과이다(* P < 0.05, ** P < 0.01).
도 7은 GSH, Trx 및 Nrf2 항산화 경로의 차단에 의한 저항성의 악성 종양세포를 타겟팅할 수 있다는 것을 표시한 것이다.
도 8은 HN3-cisR 세포에서 GCLM, TXNRD1 및 NFE2L2 유전자에 대한 siRNA를 도입시킨 후 각 유전자에 대한 단백질 발현량을 확인한 결과이다.
도 9는 시스플라틴-민감성 또는 저항성 HNC 세포에서 Nrf2 발현량을 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 10은 siNFE2L2으로 형질도입된 HN3-cisR 세포에서 Nrf2 및 HO-1의 단백질 발현량을 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 11은 GSH 및 Trx 억제에 의한 차선의 세포사멸 효과를 나타낸 결과이다. (A)는 HN9 및 HN9-cisR 세포에서 BSO, 오라노핀, Trolox 또는 이의 조합을 처리한 후 아넥신 V 및 PI 염색에 의한 세포사멸 효과를 나타낸 것이고, (B)는 siNFE2L2으로 형질도입된 HN9-cisR 세포에서 BSO, 오라노핀, Trolox 또는 이의 조합을 처리한 후 아넥신 V 및 PI 염색에 의한 세포사멸 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 정상 구강 각질세포(keratinocytes: A) 및 섬유아세포(fibroblast: B)에 BSO, 오라노핀 및 트리고넬린을 노출시킨 후 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 13은 대조군(A)과 BSO-오라노핀-트리고넬린(B)을 처리한 종양을 가진 마우스를 나타낸 것이다.
도 14는 대조군과 BSO-오라노핀-트리고넬린의 처리에서 조직 손상 정도를 비교한 결과이다.
도 15는 대조군(A)과 BSO-오라노핀-트리고넬린(B)을 처리한 군의 종양 섹션에서 TUNEL-양성 사멸 세포를 현미경으로 분석한 결과이다.
도 16은 BSO, 오라노핀, 트리고넬린 또는 이의 조합으로 처리된 마우스의 종양 조직에서 세포 내 GSH 양을 측정한 결과이다(** P <0.01).

본 발명에 따른 "약학 조성물"은 포유동물이 걸린 특정한 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위해, 대상체, 예를 들어, 포유동물 또는 인간에게 투여되는 하나 이상의 치료제를 함유하는 혼합물 또는 용액을 지칭하는 것이다.

본 발명에 따른 "약학 조성물"은 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 유전자 또는 단백질 중 어느 하나 이상을 동시에 억제할 수 있는 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 발현 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하거나 상기 유전자의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA((small interfering RNA), shRNA(Short Hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법, 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

본 발명의 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 타겟으로 하는 miRNA, 특히, miRNA의 선도서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 "상보적 핵산-기반 억제제"로 기재될 수 있다.

본 발명의 용어, "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-BART1-3p 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명에서, 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 활성 억제제는 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 용어, "조합 투여"는 단일 환자에게 선택된 치료제를 투여하는 것을 포함하는 것으로 정의되며, 작용제가 반드시 동일한 투여 경로 또는 동시에 투여되어야 할 필요는 없는 치료 요법을 포함시키고자 하는 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "대상체" 또는 "환자"는 암, 또는 직접 또는 간접적으로 암에 관여하는 임의의 장애를 앓을 수 있거나 앓고 있는 동물을 포함한다. 대상체의 예는 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트, 및 트랜스제닉 비-인간 동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간, 예를 들어 암을 앓고 있거나, 암을 앓을 위험이 있거나, 잠재적으로 암을 앓을 가능성이 있는 인간이다.

본 발명의 용어, "시너지 효과" 또는 "시너지 작용"은 본 발명에 포함되는 (a) 글루타치온(Glutathione)의 억제제, (b) 티오레독신(Thioredoxin)의 억제제, 및 (c) Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 억제제를 단독으로 사용하여 생기는 효과들을 합한 것보다 더 크다는 것을 의미한다. 유리하게는, 이러한 시너지 작용은 동일 또는 낮은 투여량으로 보다 큰 효능을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 방법

1.1. 세포주

HNC(head and neck cancer) 세포주(Acta Otolaryngol (Stockh) 1997; 117: 775-784)는 아산병원 두경부암연구소에서 제공받아 HN2 내지 HN10로 확립시켰고, SNU 세포주는 Korea Cell Line Bank (Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였으며, STR(short tandem repeat)-기반의 DNA 핑거프린팅 및 Multiplex PCR로 증명하였다. 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함된 MEM(Eagle's minimum essential medium) 또는 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute medium) 배지를 사용하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양되었다. 정상 구강 각질세포(normal oral keratinocytes)는 구강 수술이 진행된 환자로부터 획득되었고, in vitro 어세이에 사용되었다. 또한, 세 가지 시스플라틴-저항성의 HNC 세포주(HN3-cisR, HN4-cisR 및 HN9-cisR)가 사용되었고, 상기 세 가지 세포주는 증가된 시스플라틴 농도에 계속적인 노출을 통해 각각 HN3, HN4 및 HN9으로부터 개발되었다(Nakamura M et al., Oncol Rep 14: 1281-6, 2005). 시스플라틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 IC50(half-maximal inhibitory concentrations) 값은 세포생존율 어세이를 통해 결정되었으며, 모세포에서는 2.2~3.5 μM이고, 시스플라틴-저항성 HNC 세포는 25.5~38.9 μM으로 나타났다.

1.2. 세포생존율 어세이

BSO(buthionine sulfoximine; Sigma-Aldrich), 오라노핀(auranofin; Sigma-Aldrich) 또는 트리고넬린(trigonelline; Sigma-Aldrich)에 노출시킨 후의 세포생존율은 MTT 및 trypan blue exclusion으로 측정되었다. MTT 어세이는 4시간 동안 tetrazolium compound MTT (3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide; Sigma-Aldrich)로 수행되었고, 2시간 동안 solubilization buffer에 넣은 후, SpectraMax M2 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도가 측정되었다. trypan blue exclusion은 0.4% trypan blue staining으로 수행되었고, hemocytometer를 사용하여 카운팅되었다. 세포사멸 어세이는 아넥신 V(annexin V; Sigma-Aldrich) 및 PI(propidium iodide; Sigma-Aldrich) 염색으로 수행되었고, 유세포분석기(flow cytometry) 및 Cell Quest Pro software (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 아넥신 V 또는 PI 양성세포를 카운팅하였다. 모든 어세이는 3회 3번 반복하여 수행되었다. 약물 작용의 CI(combination index)는 Chou-Talalay method을 사용하여 계산되었고, "CI < 1" 은 시너지 작용으로 간주되었다 (Chou TC. Cancer Res 70: 440-6, 2010).

1.3. 글루타치온 ( glutathion : GSH ) 합성, ROS (reactive oxygen species) 생산 및 Trx(thioredoxin: 티오레독신) 활성 측정

HNC 세포의 용해물에서의 GSH 양은 24시간 동안 다른 약물에 노출시킨 후 GSH colorimetric detection kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA)을 사용하여 측정되었다. 24시간 동안 다르게 처리된 HNC 세포 용해물의 상층액에서의 세포의 ROS 생성은 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate; Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)를 사용하여 측정되었다. ROS 양은 FACSCalibur flow cytometer equipped with CellQuest Pro (BD Biosciences)으로 분석되었다. Trx 활성은 HNC 세포에 24시간 동안 다른 약물을 처리한 후 Trx activity fluorescent assay kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 측정되었다.

1.4. siRNA 형질도입

GCLM(glutathione; GSH), TXNRD1(thioreodoxin reductase-1, TrxR1), NFE2L2(Nrf2) 및 HMOX1(heme oxygenase 1; HO1) 유전자를 억제(silencing)하기 위하여, 시스플라틴-저항성의 HN3-cisR 세포 및 HN9-cisR 세포가 접종되고, 상기 세포는 24시간 뒤 인간 유전자를 타겟하는 10 nmol/L의 siRNA(small interfering RNA) 또는 scrambled control siRNA (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)로 형질도입되었다. siRNA-유도의 유전자 억제는 웨스턴 블럿팅 및 SuperScript® III RT-PCR system (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 각 샘플에 대한 1~2μg의 총 RNA로부터 RT-qPCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction)에 의해 확인되었다.

siRNA 종류	회사	번호	Forward	Reverse
GCLM (GSH)	IDTDNA	1	5'-GCAAUAGAGCUAGGAAUUAAGAATC-3' (서열번호 1)	5'-GAUUCUUAAUUCCUAGCUCUAUUGCCC-3' (서열번호 2)
		2	5'-ACCAAAUAGUAACCAAGUUAAUCTT-3' (서열번호 3)	5'- AAGAUUAACUUGGUUACUAUUUGGUUU-3' (서열번호 4)
		3	5'-CUAAACAAUUUGACAUACAGCUGT-3' (서열번호 5)	5'-ACAGCUGUAUGUCAAAUUGUUUAGCAA-3' (서열번호 6)
TXNRD1 (TrxR1)	IDTDNA	1	5'-GGUGAUAAACUUGUAGUAGUUGACT -3' (서열번호 7)	5'- AGUCAACUACUACAAGUUUAUCACCUG-3' (서열번호 8)
		2	5'-AGCCACCAUUAAUGAAUUAGUCUAA-3' (서열번호 9)	5'-UUAGACUAAUUCAUUAAUGGUGGCUUC -3' (서열번호 10)
		3	5'-CAGAGUGUGAAGUCAAAUGCAUGCC-3' (서열번호 11)	5'-GGCAUGCAUUUGACUUCACACUCUGAA -3' (서열번호 12)
NFE2L2 (Nrf2)	IDTDNA	1	5'-GUUACAACUAGAUGAAGAGACAGGT-3' (서열번호 13)	5'-ACCUGUCUCUUCAUCUAGUUGUAACUG-3' (서열번호 14)
		2	5'-GCAAGAUUUAGAUCAUUUGAAAGAT-3' (서열번호 15)	5'- AUCUUUCAAAUGAUCUAAAUCUUGCUC -3' (서열번호 16)
		3	5'- UCAACGAAAUGAUGUCCAAAGAGCA -3' (서열번호 17)	5'- UGCUCUUUGGACAUCAUUUCGUUGAAG -3' (서열번호 18)
HO1	IDTDNA	1	5'- AACAUUGUCUGAUAGUAGCUUGAAA -3' (서열번호 19)	5'- UUUCAAGCUACUAUCAGACAAUGUUGU -3' (서열번호 20)
		2	5'- UAAACAACAUUGUCUGAUAGUAGCT -3' (서열번호 21)	5'- AGCUACUAUCAGACAAUGUUGUUUAUU -3' (서열번호 22)
		3	5'- GGUCCUUACACUCAGCUUUCUGGTG -3' (서열번호 23)	5'- CACCAGAAAGCUGAGUGUAAGGACCCA -3' (서열번호 24)

* IDTDNA = Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA

1.5. 웨스턴 블럿팅

세포는 70% confluence로 배양되면, 표시된 약물 또는 조건화된 배지로 처리되었다. 세포는 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) lysis buffer (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 4℃에서 용해되었다. 총 50μg의 단백질이 10 ~ 20% 젤의 SDS-PAGE에서 확인되었고, 니트로셀룰로오스 또는 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겨졌으며, 1차 및 2차 항체로 표지되었다. 1차 항체는 다음과 같다: Nrf2, Keap1, NQO1 및 HO-1 (Abcam, Cambridge, UK). β-actin (Sigma-Aldrich)은 대조군으로 사용되었다. 모든 항체는 1:500 내지 1:5000 에서 희석되었다.

1.6. In vivo 마우스 이종이식( xenograft ) 모델

모든 동물 연구 과정은 우리 기관의 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인에 따라 수행되었다. 6주령의 athymic BALB/c 수컷 누드마우스(nu/nu)는 중앙실험동물(주) (Seoul, Republic of Korea)에서 구입되었다. HN3-cisR 세포는 누드마우스의 옆쪽에 피하주사로 주입되었다. 종양이식으로부터 총 결절이 확인된 날부터, 마웃는 6개의 다른 처리군으로 나뉘었다: 비히클(vehicle); BSO(450 mg/kg로 매일 복강내 주사); 오라노핀(2 mg/kg로 매일 복강내 주사); 트리고넬린(50 mg/kg로 매일 경구투여); BSO 및 오라노핀 auranofin; 또는 BSO, 오라노핀 및 트리고넬린의 조합 (n = 10 each). 각 마우스의 종양 크기와 몸무게는 1주일에 두번 측정되었고, 부피는 (길이 × 넓이²)/2 로 계산되었다. 마우스는 25일에 희생되었고, 종양은 분리되고 세포의 GSH 측정에 의해 분석되었다. AFU(arbitrary fluorescence units)는 다르게 처리된 종양과 비교되었다. 종양에서 사멸된 세포는 in situ TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 어세이를 사용되어 분석되었다. Two-tailed Mann-Whitney U 테스트는 처리군 사이의 통계적 차이를 비교하는데 사용되었다.

실시예 2. BSO 및 오라노핀의 시너지 작용에 의한 HNC 세포사멸 유도 효과

티오레독신에 특이적으로 결합하는 화합물 중 하나인 오라노핀을 시스플라틴-민감성 또는 시스플라틴-저항성 HNC 세포에 처리하면, 농도-의존적으로 시스플라틴-민감성 및 시스플라틴-저항성 HNC 세포의 생존을 감소시킨다는 결과를 확인하였다(도 1A), 반면, 글루타치온에 특이적으로 결합하는 화합물 중 하나인 BSO(50 mM 까지)를 세포에 처리한 경우에는 높은 농도에도 불구하고 대조군의 50% 이상까지 세포생존율 억제를 유도하지 못했다(도 1B).

그러나, 낮은 농도의 BSO(5~25 μM)와 오라노핀(0.1~0.5 μM)은 시너지 작용으로 HNC 세포의 효과적인 사멸을 유도할 수 있음을 확인하였다(CI <1.0; 도 1C 및 1D). BSO와 오라노핀의 조합은 처리 후 1일째부터 세포수가 유의적으로 감소된 반면, 낮은 농도에서 이들의 단독처리는 세포수가 감소되지 않았다(도 2A 및 2B).

그런데, BSO 또는 BSO-오라노핀의 조합은 세포의 ROS 축적을 유도한다는 것을 확인하였고, 이것은 항산화제인 trolox((6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)의 선처리를 하는 경우 없어졌다(도 2C). 또한, trolox를 처리한 경우 BSO 및 오라노핀에 의한 세포성장의 억제를 막을 수 있음을 알 수 있었다(CI <1.0; 도 2D).

따라서, BSO는 오라노핀-유도의 세포사멸에 대한 감광제로서 역할을 한 것을 볼 수 있고, GSH 및 Trx 시스템의 억제는 암세포의 사멸을 유도할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. GSH 및 Trx 이원 차단 시스템에 의한 HNC 세포사멸 유도 효과

GSH는 GCLM(glutamate cysteine ligase modifier) 및 GCLC(glutamate cysteine ligase catalytic) 서브유닛을 가지는 GCL(glutamate cysteine ligase)에 의해 합성된다고 보고되어 있으며(Liu Y, Hyde AS, Simpson MA, Barycki JJ. Adv Cancer Res 122: 69-101, 2014), TXNRD1는 티오레독신 환원효소 1(Thioredoxin reductase 1)의 유전자이다. GCLM 및 TXNRD1 유전자의 억제는 각각 GSH 고갈 및 Trx 활성 억제를 유도할 수 있음을 확인하였다(도 3A, 3B, 3C 및 도 8).

유전적 또는 약학적으로 GSH 및 Trx 의 이중차단 시스템은 시너지 작용으로 시스플라틴-민간성 및 시스플라틴-저항성 세포의 사멸을 유도할 수 있음을 확인하였다(도 3D 및 3E). 그러나, HN3-cisR 및 HN9-cisR과 같은 시스플라틴-저항성 HNC 세포의 일부에서는 차선(suboptimal)의 효과를 보였고, 즉, 일부 세포사멸이 억제되지 않음을 확인하였다(도 1C 및 도 9).

따라서, GSH 및 Trx 시스템의 억제는 일부 시스플라틴-저항성 암세포의 사멸을 현저하게 유도하지 않음을 알 수 있었다.

실시예 4. GSH 및 Trx 시스템의 억제에 의한 Nrf2 -ARE 경로의 활성 효과

본 발명자들은 오라노핀 또는 BSO-오라노핀의 조합 처리가 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)와 NQO1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1) 및 HO-1(Heme oxygenase 1)을 포함하는 ARE(antioxidant response element) 경로의 발현을 증가시킴을 발견하였고(도 4A), 이에 따라, GSH의 합성을 억제하기 위한 GCLM 유전자 및 Trx 합성을 억제하기 위한 TXNRD1 유전자의 siRNA(각각 siGCLM, siTXNRD1)가 형질도입된 HNC 세포를 사용하여, NFE2L2(Nrf2) 또는 HMOX1 유전자의 억제, 또는 트리고넬린에 의한 Nrf2의 약학적 억제 실험을 진행하였다.

그 결과, siGCLM 및/또는 siTXNRD1에 의해 형질도입된 HNC 세포의 세포 생존율은 대조군에 비하여 감소됨을 확인하였다(도 4B 및 4C). Nrf2 및/또는 HO-1의 유전적 억제는 시스플라틴-저항성의 HN3-cisR 및 HN9-cisR 세포에서 BSO 및 오라노핀에 의한 시너지 작용의 세포사멸을 향상시켰다(도 4D 및 5A). 트리고넬린에 의한 Nrf2 의 약학적 억제는 트리고넬린을 처리하지 않거나 항산화제 Trolox의 선처리에 비해 세포성장 억제, ROS 축적 및 BSO 및 오라노핀에 의한 세포사멸을 더욱 유도하였다(도 5B, 5C 및 5D). 증가된 Nrf2 양은 시스플라틴-민감성의 HNC 세포에 비해 시스플라틴-저항성의 HNC 세포에서 발견되었다(도 10). Nrf2 억제(silencing)은 시간-의존적으로 BSO 및 오라노핀에 의해 유도된 Nrf2 증가를 막았다(도 11).

그러나, 세 가지 조합은 정상 세포의 성장을 유의적으로 억제하는 것은 아님을 확인하였다(도 12).

따라서, GSH, Trx 및 Nrf2의 억제는 정상 세포의 성장의 억제에는 영향을 주지 않으면서, 암세포, 특히 시스플라틴-저항성의 암세포에 효과적으로 세포사멸을 유도함을 알 수 있었다.

실시예 5. GSH , Trx 및 Nrf2 시스템의 차단에 의한 in vivo HNC 성장 억제 효과

BSO 및 오라노핀에 의한 GSH 및 Trx 시스템의 약학적 이중 차단은 in vivo 성장에서 HNC 세포를 유의적으로 억제하였고, 이는 트리고넬린의 추가에 의하여 강화되었음을 확인하였다(도 6A, 6B 및 도 13). BSO, 오라노핀 또는 트리고넬린 단독 또는 이들의 조합은 종양-이식된 마우스의 몸무게 또는 주요 장기의 다른 합병증에서 유의적 변화를 일으키지 않았고(도 6C 및 도 14), BSO 및 오라노핀 또는 트리고넬린이 조합된 처리는 이식된 종양에서 유의적으로 세포사멸이 증가되었다(도 6D 및 도 15). 세포의 GSH 양은 BSO, BSO-오라노핀 또는 BSO-오라노핀-트리고넬린을 처리한 마우스의 종양에서 유의적으로 감소되었다(도 16).

따라서, BSO는 다른 약물에 대한 감광제로서 역할을 하며, in vivo 조직에서 생적합성을 보였고, GSH, Trx 및 Nrf2 시스템의 차단에 의하여 시스플라틴-저항성의 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Ulsan University Asan Medical Center <120> Inducing apoptosis of cancer cells selectively by targeting of glutathione, thioreodoxin, Nrf2 antioxidant systems <130> PN1611-419 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCLM F <400> 1 gcaauagagc uaggaauuaa gaatc 25 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCLM R <400> 2 gauucuuaau uccuagcucu auugccc 27 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCLM F <400> 3 accaaauagu aaccaaguua auctt 25 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCLM R <400> 4 aagauuaacu ugguuacuau uugguuu 27 <210> 5 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCLM F <400> 5 cuaaacaauu ugacauacag cugt 24 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCLM R <400> 6 acagcuguau gucaaauugu uuagcaa 27 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNRD1 F <400> 7 ggugauaaac uuguaguagu ugact 25 <210> 8 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNRD1 R <400> 8 agucaacuac uacaaguuua ucaccug 27 <210> 9 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNRD1 F <400> 9 agccaccauu aaugaauuag ucuaa 25 <210> 10 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNRD1 R <400> 10 uuagacuaau ucauuaaugg uggcuuc 27 <210> 11 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNRD1 F <400> 11 cagaguguga agucaaaugc augcc 25 <210> 12 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNRD1 R <400> 12 ggcaugcauu ugacuucaca cucugaa 27 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFE2L2 F <400> 13 guuacaacua gaugaagaga caggt 25 <210> 14 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFE2L2 R <400> 14 accugucucu ucaucuaguu guaacug 27 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFE2L2 F <400> 15 gcaagauuua gaucauuuga aagat 25 <210> 16 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFE2L2 R <400> 16 aucuuucaaa ugaucuaaau cuugcuc 27 <210> 17 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFE2L2 F <400> 17 ucaacgaaau gauguccaaa gagca 25 <210> 18 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFE2L2 R <400> 18 ugcucuuugg acaucauuuc guugaag 27 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 F <400> 19 aacauugucu gauaguagcu ugaaa 25 <210> 20 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 R <400> 20 uuucaagcua cuaucagaca auguugu 27 <210> 21 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 F <400> 21 uaaacaacau ugucugauag uagct 25 <210> 22 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 R <400> 22 agcuacuauc agacaauguu guuuauu 27 <210> 23 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 F <400> 23 gguccuuaca cucagcuuuc uggtg 25 <210> 24 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 R <400> 24 caccagaaag cugaguguaa ggaccca 27

Claims

글루타치온 유전자의 발현을 촉진하는 GCLM(glutamate cysteine ligase modifier) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA 및 BSO(buthionine sulfoximine) 중에서 선택되는 하나 이상인 글루타치온(Glutathione)의 발현 억제제 또는 활성 억제제;
티오레독신 유전자의 발현을 촉진하는 TXNRD1(thioredoxin reductase 1) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA 및 오라노핀(auranofin) 중에서 선택되는 하나 이상인 티오레독신(Thioredoxin)의 발현 억제제 또는 활성 억제제; 및
Nrf2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA, Nrf2 유전자의 발현을 촉진하는 HO1(heme oxygenase 1) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA 및 트리고넬린(trigonelline)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는
시스플라틴에 저항성을 가지는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 글루타치온 유전자의 발현을 촉진하는 GCLM(glutamate cysteine ligase modifier) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 티오레독신 유전자의 발현을 촉진하는 TXNRD1(thioredoxin reductase 1) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 것이며,
상기 Nrf2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 또는 서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 Nrf2 유전자의 발현을 촉진하는 HO1(heme oxygenase 1) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 또는 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 암은 두경부암, 폐암, 위암, 간암, 대장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종, 건선 또는 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 시스플라틴에 저항성을 가지는 암세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 글루타치온(Glutathione), 티오레독신(Thioredoxin) 및 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)의 mRNA 발현량 또는 단백질의 발현량이 동시에 억제되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 시스플라틴에 저항성을 가지는 암 치료제의 스크리닝 방법.
삭제
제 8 항에 있어서,
상기 암은 두경부암, 폐암, 위암, 간암, 대장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종, 건선 또는 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.