ES2831157T3 - Métodos de tratamiento de cáncer que alberga una pérdida hemicigótica de TP53 - Google Patents

Métodos de tratamiento de cáncer que alberga una pérdida hemicigótica de TP53 Download PDF

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Abstract

Una composicion para usar en el tratamiento de un paciente que tiene un cancer, en donde se han analizado celulas del cancer para: (i) una perdida hemicigotica del gen TP53; (ii) una perdida hemicigotica del gen POLR2A; o (iii) un nivel de expresion reducido de un producto genico de POLR2A en relacion con un nivel de expresion de referencia, comprendiendo la composicion una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de POLR2A, en donde el inhibidor de POLR2A comprende una amatoxina y en donde la amatoxina se conjuga con un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno asociado a un tumor.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de tratamiento de cáncer que alberga una pérdida hemicigótica de TP53
Antecedentes de la invención
Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad a la solicitud provisional de Estados Unidos n.° de serie 62/128.480, presentada el miércoles, 4 de marzo de 2015.
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a los campos de la medicina y la biología del cáncer. Más particularmente, se refiere a métodos de tratamiento de cánceres que albergan pérdida hemicigótica de TP53.
2. Descripción de la técnica relacionada
TP53, un gen supresor de tumores bien conocido, se inactiva con frecuencia por mutación o deleción en la mayoría de tumores humanos (Petitgean et al., 2007; Vazquez et al., 2008). Se ha realizado un tremendo esfuerzo para restaurar la actividad de p53 en terapias contra el cáncer (Chene, 2003; Wade et al., 2013). Mientras que la terapia génica con vectores adenovíricos que expresan p53 de tipo silvestre ha mostrado actividad en varios ensayos clínicos, la administración variable e insuficiente de genes a cada célula tumoral y la presencia de un anticuerpo hospedador contra el adenovirus limitaron su uso clínico (Lane et al., 2010; Haupt y Haupt, 2004). También se han desarrollado una serie de pequeños compuestos químicos que estimulan la actividad de p53. Sin embargo, solo se pueden aplicar en cánceres humanos que poseen p53 de tipo silvestre (Cheok et al., 2011; Goldstein et al., 2011).
Mook et al. (2009) divulga ARNip dirigidos a POLR2A; también divulga que este gen se ubica muy cerca del gen p53, que muestra con frecuencia LOH (es decir, es hemicigótico) en células cancerosas. El ARNip puede inhibir selectivamente la expresión de POLR2A e inhibir la proliferación de células cancerosas y el crecimiento tumoral en ratones desnudos (véase el resumen). Fluiter et al. (2002) utilizan oligonucleótidos antisentido en lugar de ARNip. Fluiter et al. (2003) se refiere a la inhibición específica de alelos como un enfoque para el tratamiento de trastornos genéticos mediante el direccionamiento a genes que las células cancerosas han perdido.
Davis et al. (1981) divulga un conjugado de alfa-amanitina e inmunoglobulina G monoclonal dirigida al antígeno Thy 1.2, que es selectivamente tóxico para el linfoma T. Otros conjugados de anticuerpo-fármaco se describen en Adair et al. (2012). En el documento WO2014/135282 A1 se ha divulgado que la formación de un anillo a través de los dos átomos de oxígeno unidos a los átomos y- y 5-C del aminoácido 3 de amatoxina puede mejorar la tolerabilidad de los conjugados de la fracción de amatoxina de unión a la diana sin interferir con la interacción de dichas amatoxinas con su diana. En el documento WO2010/115630 A1 se han descrito conjugados de anticuerpo-toxina para el tratamiento de cáncer de páncreas, colangiocarcinoma o cáncer colorrectal que comprenden un anticuerpo específico de EpCam, una amatoxina y opcionalmente un enlazador.
Sin embargo, ninguna terapia eficaz basada en p53 se ha traducido con éxito en el tratamiento clínico del cáncer debido a la complejidad de los reguladores de p53 y su escasa capacidad de fármaco. Como tal, se necesitan nuevas estrategias para tratar cánceres deficientes en p53.
Sumario de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones.
De acuerdo con la divulgación de la presente memoria descriptiva, se proporcionan métodos para tratar a un paciente que tiene células cancerosas que exhiben (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; y/o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de expresión de referencia (por ejemplo, un nivel de expresión en una muestra no cancerosa), comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de POLR2A a dicho paciente. En determinados aspectos, el paciente tiene células cancerosas que exhiben una pérdida hemicigótica del gen TP53. En determinados aspectos, el paciente tiene células cancerosas que exhiben una pérdida hemicigótica del gen POLR2A. En determinados aspectos, el paciente tiene células cancerosas que exhiben un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de expresión de referencia.
En determinados aspectos, un inhibidor de POLR2A comprende alfa-amanitina. En algunos aspectos, la alfa-amanitina está conjugada con un anticuerpo, tal como un anticuerpo que se dirige a células cancerosas (por ejemplo, un anticuerpo de antígeno asociado a tumores). En algunos aspectos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo específico de EpCAM.
En determinados aspectos, el producto génico de POLR2A es un ARNm. Un nivel de expresión de un ARNm puede determinarse mediante transferencia Northern, PCR en tiempo real cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR, por sus siglas en inglés), protección a nucleasas, análisis del transcriptoma, un ensayo de hibridación, una plataforma de expresión basada en chips o una plataforma de ensayo de ARN invasor. En determinados aspectos, el producto génico de POLR2A es una proteína. El nivel de expresión de una proteína puede determinarse mediante espectrometría de masas, transferencia Western, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica o radioinmunoanálisis. En determinados aspectos, se detecta un número de copias genómicas para determinar la pérdida hemicigótica del gen TP53 o la pérdida hemicigótica del gen POLR2A. En algunos aspectos, el número de copias genómicas se determina mediante una técnica de hibridación genómica (por ejemplo, análisis FISH), análisis de PCR (por ejemplo, PCR en tiempo real) o análisis de fragmentos de restricción.
En determinados aspectos, el cáncer es un cáncer de pulmón, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de próstata o cáncer de páncreas. En determinados aspectos, el cáncer es metastásico, recurrente o resistente a múltiples fármacos.
De acuerdo con la divulgación de la presente memoria descriptiva, los métodos comprenden además administrar al menos una segunda terapia contra el cáncer al sujeto. En determinados aspectos, la segunda terapia contra el cáncer es una terapia quirúrgica, quimioterapia, radioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia con toxinas, inmunoterapia o terapia con citocinas. En determinados aspectos, la quimioterapia es 5-fluorouracilo, oxaliplatino o SN-38.
En determinados aspectos, el paciente es un ser humano. En determinados aspectos, el paciente es un mamífero no humano.
En determinados aspectos, el paciente se trata al menos una segunda vez. En determinados aspectos, el paciente se trata durante un período de 1 semana a 6 meses. En determinados aspectos, el paciente ha recibido previamente al menos una ronda de terapia contra el cáncer
De acuerdo con la divulgación de la presente memoria descriptiva, se proporcionan métodos para tratar a un paciente que tiene cáncer que comprenden (a) seleccionar un paciente determinado que tiene células cancerosas que comprenden (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; y/o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia; y (b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de POLR2A al paciente.
En determinados aspectos, la selección de una terapia con fármacos para un paciente con cáncer comprende obtener una muestra del cáncer y determinar si las células del cáncer comprenden (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; y/o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia. En determinados aspectos, los métodos comprenden además proporcionar un informe de la determinación. En determinados aspectos, el informe es un informe escrito o electrónico. En determinados aspectos, el informe se proporciona al paciente, a una aseguradora de atención médica, a un médico, a un agente de seguros o a un sistema electrónico.
En determinados aspectos, la selección de una terapia con fármacos para un paciente con cáncer comprende la obtención de resultados para una prueba que determina si las células del cáncer comprenden (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; y/o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia.
En determinados aspectos, las células del cáncer comprenden una pérdida hemicigótica del gen TP53. En determinados aspectos, las células del cáncer comprenden una pérdida hemicigótica del gen POLR2A. En determinados aspectos, las células del cáncer comprenden un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia (por ejemplo, un nivel de expresión en una muestra no cancerosa).
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para seleccionar una terapia con fármacos para un paciente con cáncer que comprenden (a) obtener una muestra del cáncer; (b) detectar la presencia de (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; y/o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia en las células del cáncer; y (c) seleccionar un inhibidor de POLR2A si (i) se detecta una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) se detecta una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; y/o (iii) se detecta un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación a un nivel de referencia en las células del cáncer.
De acuerdo con la divulgación de la presente memoria descriptiva, los métodos comprenden además administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de POLR2A al paciente.
En determinados aspectos, las células del cáncer comprenden una pérdida hemicigótica del gen TP53. En determinados aspectos, las células del cáncer comprenden una pérdida hemicigótica del gen POLR2A. En determinados aspectos, las células del cáncer comprenden un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia (por ejemplo, un nivel de expresión en una muestra no cancerosa).
En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden un inhibidor de POLR2A para usar en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde se ha determinado que las células del cáncer comprenden (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia (por ejemplo, un nivel de expresión en células de una muestra no cancerosa).
De acuerdo con la divulgación de la presente memoria descriptiva, se proporciona el uso de un inhibidor de POLR2A en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer, en donde se ha determinado que las células del cáncer comprenden (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia (por ejemplo, un nivel de expresión en células de una muestra no cancerosa).
Como se utiliza en el presente documento, "esencialmente libre", en términos de un componente específico, se utiliza en el presente documento para significar que ninguno de los componentes especificados se ha formulado intencionalmente en una composición y/o está presente solo como contaminante o en cantidades mínimas. La cantidad total del componente especificado resultante de cualquier contaminación no intencionada de una composición es, por tanto, muy inferior a un 0,05 %, preferentemente inferior a un 0,01 %. La más preferida es una composición en la que no se puede detectar ninguna cantidad del componente especificado con métodos analíticos estándar.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "un" o "uno/una" puede significar uno/una o más. Como se usa en la reivindicación o en las reivindicaciones, en el presente documento, cuando se usan junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "uno/una" pueden significar uno/a o más de uno/a.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse solo a alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y a "y/o". Tal como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más.
A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que se está empleando para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debería entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
FIG. 1A-H. La expresión de POLR2A, pero no de TP53, está correlacionada con el número de copias del gen. (FIG. 1A) El análisis de la base de datos TCGA muestra las frecuencias de deleción hemicigótica del locus TP53 en varios cánceres humanos. (FIG. 1B) Diagrama esquemático de genes adyacentes a TP53 en el genoma humano. (FIG. 1C) Deleción concomitante de POLR2A en tumores colorrectales que albergan pérdida hemicigótica de TP53. (FIG. 1D) Diagramas de dispersión del número de copias de POLR2A frente a expresión de ARNm para tumores colorrectales clínicos en TCGa y líneas celulares cancerosas en CCLE. Se muestran una regresión lineal y el coeficiente de correlación de Pearson (r). (FIG. 1E) Cuantificación de los niveles de proteína POLR2A en muestras de tejido de CRC y normal emparejadas (POLR2A neutro o con pérdida hemicigótica). (FIG. 1F) Variaciones del número de copias de POLR2A y TP53 en líneas celulares de CRC humanas. Las columnas de la izquierda son TP53; las columnas de la derecha son POLR2A. (FIG. 1G) Niveles de expresión relativa de POLR2A en líneas celulares de CRC (normalizadas a HCT116). (FIG. 1H) Niveles de proteína de POLR2A, p53 y p-actina en líneas celulares de CRC.
FIG. 2A-J . Las células POLR2Apérdida son muy sensibles a la inhibición de POLR2A. (FIG. 2A) Las células POLR2Apérd¡da (SW837, SNU283) son significativamente más sensibles al tratamiento con a-Amanitina que las células POLR2Aneutro (HCT116, SW480). Se muestra la tinción de las células con cristal violeta. ( FiG. 2B ) Proliferación celular de células POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da con tratamiento con a-Amanitina. (FIG. 2C) La supresión de POLR2A inducida por Dox inhibió la proliferación de células SNU283, pero no de las células HCT116. (FIG.2D) Correlación entre la expresión de ARNm de POLR2A y proliferación celular en células HCT116 y SNU283 que expresan ARNhc de POLR2A inducibles por Dox. Los datos representan la media ± DE. Las columnas de la izquierda son ARNm de POLR2A; las columnas de la derecha son Proliferación. (FIG. 2E y 2F) Curvas de supervivencia de las células SUN283 y SW837 en respuesta a dosis crecientes de tratamiento con a-Amanitina después de la transfección con cantidades crecientes de ADN del vector de expresión PORL2A. (FIG. 2G) Las células HCT116 POLR2Apérd¡da son significativamente más sensibles al tratamiento con a-Amanitina que las células HCT116 PORL2Aneutro parentales. Se muestra la tinción de las células con cristal violeta. (FIG. 2H) Proliferación celular de células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da tratadas con a-Amanitina. (FIG. 2I y 2J) Correlación entre la expresión de ARNm de POLR2A y proliferación celular (FIG. 2I; las columnas de la izquierda son ARNm de POLR2A; las columnas de la derecha son Proliferación) o apoptosis (FIG. 2J; las columnas de la izquierda son Ctrlhc; las columnas del medio son ARNhc-1; las columnas de la derecha son ARNhc-2) en células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da. Los datos representan la media ± DE.
FIG. 3A-E. La sensibilidad de células POLR2Apérdida a la inhibición POLR2A es independiente de p53. (FIG.
3A) Niveles de proteína de POLR2A, p53, EpCAM y p-actina en un perfil de líneas celulares xhCRC de cáncer colorrectal primario humano isogénico. (FIG. 3B) Curva de crecimiento de células xhCRC POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da. (FIG. 3C) Proliferación celular de células xhCRC POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da tratadas con a-Amanitina. (FIG. 3D) Sensibilidad de células xhCRC POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da al tratamiento con 5-FU, oxaliplatino (Oxa) o SN-38 combinado con o sin tratamiento con a-Amanitina. (FIG. 3E) Proliferación celular de células xhCRC POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da tratadas con conjugado de anticuerpo (anti-EpCAM)-fármaco ama-HEA125 a diversas concentraciones.
FIG. 4A-E. La supresión de POLR2A inhibe selectivamente el crecimiento tumoral de POLR2Apérdida. (FIG.
4A) Curvas de crecimiento de tumores xenoinjertados procedentes de células HCT116 (1 x 106 células) y SNU283 (2 x 106 células) implantadas subcutáneamente. Ambas líneas celulares expresan ARNhc de POLR2A de control o inducibles por Dox. Después del establecimiento inicial de tumores (100 mm3), los ratones se trataron con 1 |jg ml-1 de Dox en el agua potable. n = 5 ratones por grupo. (FIG. 4B y 4C) Curvas de crecimiento tumoral (FIG. 4B) de tumores xenoinjertados procedentes de células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da (1 x 106 células inyectadas) implantadas ortotópicamente que expresan ARNhc de POLR2A o de control inducible por Dox. Después del establecimiento inicial de tumores, los ratones se trataron con 1 jg ml-1 de Dox en agua potable. Los pesos de los tumores (FIG. 4C) se midieron (n = 5 ratones por grupo). **p < 0,01. (FIG. 4D y 4E) Curvas de crecimiento tumoral de tumores xenoinjertados procedentes de células HCT116 (FIG. 4D; 1,0 x 106 células inyectadas) o xhCRC (FIG. 4E ; 0,5 x 106 células inyectadas) POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da implantadas ortotópicamente que recibieron inyecciones intraperitoneales duales de anticuerpo anti-EpCAM (3,6 mg kg-1) o conjugado anticuerpo-fármaco ama-HEA125 (3, 10, 30 y 90 jg kg-1, correspondiente a 0,12, 0,4, 1,2 y 3,6 mg de IgG kg-1). n = 10 ratones por grupo.
FIG. 5A-B. La expresión de POLR2A se correlaciona con su número de copias de genes en tumores de colon humanos. Se realizó un análisis FISH de dos colores utilizando una sonda para el centrómero del cromosoma 17 y una sonda específica de locus para POLR2A en una micromatriz de tejido de colon humano. Se determinó la pérdida hemicigótica del gen POLR2A y los resultados se muestran en la Tabla 2. (FIG. 5A) Cuantificación de la expresión de POLR2A en muestras de tejido de colon humano normal, o tumoral neutro o con pérdida de POLR2A. Barras de error, DE. (FIG. 5B) Niveles de proteína de POLR2A y p-actina en muestras de tejido normal y de CRC emparejadas.
FIG. 6A-C. La expresión de TP53 no está asociado con su número de copias de genes. (FIG. 6A y 6B) Diagramas de dispersión del número de copias de TP53 frente a la expresión de proteínas (FIG. 6A) o la expresión de ARNm (FIG. 6B) en tumores colorrectales en la base de datos TCGa . Se muestran el coeficiente de correlación de Pearson (r) y el valor p. (FIG. 6C) Expresión relativa de ARNm de TP53 en líneas celulares de cáncer colorrectal (normalizada con respecto a la línea celular HCT116). Los datos son la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes.
FIG. 7A-G. Las células POLR2Apérdida son muy sensibles a la inhibición de POLR2A. (FIG. 7A) Proliferación celular de células POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da tratadas con actinomicina D. (FIG. 7B) Eficacia de atenuación de ARNhc específicos de POLR2A en células HCT116, SW480, SW837 y SNU283. (FIG. 7C) Efecto de la atenuación de POLR2A sobre la proliferación de cuatro líneas celulares de cáncer colorrectal. Las células que expresan GFP y ARNhc de control o específicos de POLR2A se clasificaron y mezclaron con células de control negativas para GFP (1:1) y se cuantificaron las células positivas para GFP en los pases 2, 4 y 6. **p < 0,01, ns: no significativo. (FIG. 7D) Niveles de proteína de POl R2A y p-actina en células HCT116 y SNU283 que expresan ARNhc de POLR2A inducible por Dox (1,0 jg ml-1 de Dox). (FIG. 7E) Proliferación celular de células HCT116 y SNU283 que expresan ARNhc de POLR2A inducible por Dox en presencia de 300 ng ml-1 de Dox. **p < 0,01. ( FiG.7F y 7G ) En los perfiles del ciclo celular (FIG. 7F; la parte superior de cada columna es G2/M; la parte central de cada columna es S; parte inferior de cada columna es G0/G1) y apoptosis (FIG. 7G) de células HCT116 y SNU283 que expresan ARNhc de POLR2A o de control. **p < 0,01. Los datos son la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes.
FIG. 8A-B. La expresión ectópica de POLR2A restaura la resistencia de células POLR2Apérdida al tratamiento con a-Amanitina. (FIG. 8A) Niveles de proteína de POLR2A y p-actina en células SNU283 y SW837 que expresan cantidades crecientes de POLR2A exógeno. (FIG. 8B) Tinción con cristal violeta de células SNU283 y SW837 tratadas con dosis crecientes de a-Amanitina después de la transfección con cantidades crecientes de ADN del vector de expresión POLR2A.
FIG. 9A-H. La desactivación monoalélica de POLR2A sensibiliza las células HCT116 a la inhibición de POLR2A. (FIG. 9A) Ilustración esquemática de los sitios dirigidos a Cas9/ARNgu en el gen POLR2A. Se muestran dos secuencias dirigidas de ARNgu (la flecha indica direccionalidad; las secuencias se proporcionan como SEQ ID NO: 25-26) y las secuencias del motivo adyacente al protoespaciador (PAM, por sus siglas en inglés) son los tres últimos nucleótidos de cada secuencia. (FIG. 9B) Eficacia de la escisión mediada por Cas9 de POLR2A en células HCT116 medida mediante el ensayo Surveyor. (FIG. 9C) Secuencias de alelos mutantes de POLR2A en las células de las colonias 14 y 5 (las secuencias se proporcionan como SEQ ID NO: 27-30). (FIG. 9D) Niveles de proteína de POLR2A y p-actina en células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da. (FIG. 9E) Curvas de crecimiento de células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da. (FIG. 9F) Proliferación relativa de células POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da tratadas con actinomicina D. (FIG. 9G) Efecto de la atenuación de POLR2A en células HCT1l6 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da. Los experimentos se realizaron como se describe en la FIG. 7C. **p < 0,01, ns: no significativo. (FIG. 9H) La supresión parcial de POLR2A inducida por Dox inhibió el crecimiento de células HCT116 POLR2Apérd¡da, pero no de las células HCT116 POLR2Aneutro parentales. Los datos son la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes.
FIG. 10A-G. La sensibilidad de células POLR2Apérdida a la inhibición de POLR2A es independiente de p53. (FIG. 10A) Ilustración esquemática de los sitios dirigidos a Cas9/ARNgu en el gen TP53. Se muestran dos secuencias dirigidas de ARNgu (la flecha indica direccionalidad; las secuencias se proporcionan como SEQ ID NO: 31-32) y las secuencias PAM son los últimos tres nucleótidos de cada secuencia. (FIG. 10B) Eficacia de la escisión mediada por Cas9 de TP53 en células HCT116 medida mediante el ensayo Surveyor. (FIG. 10C) Niveles de proteína de POLR2A, p53 y p-actina en un perfil de células HCT116 isogénicas. (FIG. 10D) Curvas de crecimiento de células HCT116 pOLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da. (FIG. 10E y 10F) Imágenes de tinción de cristales (FIG. 10E) y curvas de supervivencia celular (FIG. 10F) de células h Ct 116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da después del tratamiento con a-Amanitina. (FIG. 10G) Curvas de supervivencia celular de células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da en respuesta al tratamiento de ama-HEAl25.
FIG. 11A-C. La supresión de POLR2A dependiente de la dosis inhibe la tumorigénesis en tumores POLR2Apérdida, pero no de tumores POLR2Aneu,ro. (FIG. 11 A) Cuantificación de niveles de expresión de ARNm de POLR2A en tumores HCT116 y SNU283 xenoinjertados subcutáneamente que expresan ARNhc de POLR2A o de control (n = 5 ratones por grupo). **p < 0,01. (FIG. 11B) Se cuantificaron células positivas para Ki67 (proliferación celular) o con caspasa-3 escindida (apoptosis) por campo y la expresión de POLR2A mediante tinción inmunohistoquímica. **p < 0,01. Los datos son medias y DE. (FIG. 11C) Cuantificación de tamaños tumorales de tumores xenoinjertados procedentes de células HCT116 POLR2A neutro y POLR2Apérd¡da (1 x 106 células inyectadas) implantadas subcutáneamente. Ambas líneas celulares expresan ARNhc de POLR2A de control o inducibles por Dox. Después del establecimiento inicial de tumores (100 mm3), los ratones se trataron con (0,5, 1 y 2 pg ml-1) de Dox en el agua potable. n = 5 ratones por grupo. Los datos son medias y DE.
FIG. 12A-F. La supresión de POLR2A con ARNip de POLR2A encapsulado en DOPC inhibe el crecimiento de tumores POLR2Apérdida. (FIG. 12A) Transferencias Western para POLR2A y p-actina después de la transfección de ARNip de control o ARNip de POLR2A (n.° 1 y n.° 2) en células HCT116. (FIG. 12B) Ilustración esquemática de la inyección ortotópica de células HCT116 (1 x 106 células) seguido de intervalos de tratamiento con nanoliposomas DOPC. (FIG. 12C y 12D) Curvas de crecimiento tumoral de tumores xenoinjertados ortotópicos procedentes de células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da (FIG. 12C es Pol2-1ip; FIG. 12D es Pol2-2ip) que recibieron inyecciones intraperitoneales de ARNip de control (1.000 pg kg-1) o de POLR2A (125, 250, 500 y 1000 pg kg-1) dos veces semanalmente. n = 10 ratones por grupo. (FIG. 12E y 12F) Niveles de proteína representativos de POLR2A y p-actina en tumores xenoinjertados después del tratamiento con ARNip de control o de POLR2A (FIG. 12E es Pol2-1ip; FIG. 12F es Pol2-2ip).
FIG. 13A-D La supresión de POLR2A inhibe selectivamente el crecimiento tumoral de POLR2Apérdida (FIG.
13A Y 13B) Se midieron los pesos tumorales de tumores HCT116 (FIG. 13A) y xhCRC (FIG. 13B) implantados ortotópicamente (n = 10 ratones por grupo). (FIG. 13C Y 13D) Se registraron pesos corporales (FIG. 13C) y enzimas hepáticas (FIG. 13D) que incluyen alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y fosfatasa alcalina en sangre periférica como se describe en Métodos. Los datos mostrados son la media de cinco ratones en cada grupo.
FIG. 14A-F. La supresión de POLR2A mediante ama-HEA125 inhibe el crecimiento de tumores POLR2Apérdida. (FIG. 14A, 14C y 14E) Niveles de proteína de POLR2A y p-actina en células HCT116 (FIG. 14A), SW480 (FIG. 14C) o SW837 ( FiG.14E ). Estas líneas celulares son POLR2A-neutro, POLR2A-pérdida o POLR2A-restaurado. (FIG. 14B, 14D y 14F) Curvas de crecimiento tumoral de tumores xenoinjertados ortotópicos procedentes de las células correspondientes como se indica. Todos recibieron inyecciones intraperitoneales duales de anticuerpo anti-EpCAM (3,6 mg kg-1) o conjugado anticuerpo-fármaco ama-HEA125 (10 y 90 pg kg-1, correspondiente a 0,4 y 3,6 mg de IgG kg-1). n = 10 ratones por grupo.
Descripción de realizaciones ilustrativas
Los estudios proporcionados en el presente documento demuestran que la deleción genómica de TP53 abarca con frecuencia genes esenciales vecinos, lo que hace que las células cancerosas con deleción hemicigótica de TP53 sean vulnerables a una supresión adicional de dichos genes. POLR2A se identifica como un gen de mantenimiento esencial que prácticamente se elimina conjuntamente con TP53 en muchos tipos de cáncer humano. Codifica la subunidad más grande y catalítica del complejo ARN polimerasa II, que se inhibe específicamente mediante a-amanitina (Bensaude, 20l 1; Lindell et al., 1970). Como tal, en lugar de la intervención farmacológica de p53 o sus reguladores, el principio de vulnerabilidad colateral a la inhibición de POLR2A proporciona una nueva estrategia para la terapia del cáncer.
El presente análisis de muestras clínicas y líneas celulares de cáncer en The Cancer Genome Atlas (TCGA) y Cancer Cell Line Encyclopaedia (CCLE) revela que los niveles de expresión de POLR2A están estrechamente correlacionados con su número de copias génicas en tumores colorrectales humanos. La supresión de POLR2A con a-amanitina, ARN de interferencia pequeños, o ARN de horquilla corta, inhibió selectivamente la proliferación, la supervivencia y el potencial tumorigénico de células de cáncer colorrectal con pérdida hemicigótica de TP53 de una manera independiente de p53. Por otra parte, los presentes estudios clínicos previos con a-amanitina predicen la eficacia terapéutica de fármacos basados en a-amanitina o inhibidores contra POLR2A para el tratamiento del cáncer colorrectal y debería ser aplicable a muchos tipos de cánceres humanos con pérdida hemicigótica de TP53.
Las aplicaciones clínicas anteriores de a-amanitina han sido limitadas debido a su toxicidad hepática (Letschert et al., 2006). La a-amanitina libre es tóxica para el hígado porque se une específicamente mediante OATP1B3, un transportador expresado exclusivamente en la membrana de los hepatocitos (Letschert et al., 2006). Sin embargo, la a-amanitina, cuando se conjuga con anticuerpos específicos, ya no es un sustrato para OATP1B3 (Letschert et al., 2006; Moldenhauer et al., 20l2; Faulstich y Fiume, 1985). En este caso, se muestra que dosis bajas de un conjugado de a-amanitina-anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales) conjugado con a-amanitina) conduce a la regresión tumoral en modelos murinos de cáncer colorrectal humano con deleción hemicigótica de POLR2A. La inhibición de POLR2A es un nuevo enfoque terapéutico para cánceres que albergan dichas alteraciones genómicas comunes.
I. Conjugados dirigidos a células
Puede ser deseable conjugar una molécula de a-amanitina (o cualquier amatoxina) con al menos un agente de direccionamiento celular para mejorar la utilidad de la a-amanitina y reducir la toxicidad hepática. Dicho conjugado puede denominarse "inmunotoxina". Por ejemplo, para aumentar la eficacia y utilidad de la a-amanitina como agente terapéutico, puede estar conjugada o unida covalentemente a una fracción de direccionamiento celular deseada. Dicha fracción puede ser cualquier fracción con suficiente selectividad, especificidad o afinidad para dirigirse a un tipo de célula deseado mediante la unión a un receptor externo o sitio de unión en dichos tipos de células, tal como una célula cancerosa (Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2009/0304666). Ejemplos de dichas fracciones incluyen, pero sin limitación, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proteínas similares a anticuerpos y aptámeros. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos incluyen, sin limitación: (i) el fragmento Fab, que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento "Fd" que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento "Fv" que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento "dAb", que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos; (vii) moléculas Fv de cadena simple ("scFv"), en donde un dominio VH y un dominio VL están unidos mediante un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión; (viii) dímeros Fv monocatenarios biespecíficos (véase la patente de Estados Unidos N.° 5.091.513) y (ix) diacuerpos, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica (Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2005/0214860). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpos pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL. Una fracción de direccionamiento celular puede unirse específicamente a cualquier antígeno asociado a un tumor, tal como, por ejemplo, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, gpA33, mucinas, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, ERBB2, ERBB3, c-Met, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AKT, Her2/neu, Her3, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, dectina-1, gp100, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75), tirosinasa, TAG-72, CAIX, PSMA, proteína de unión a folato, gangliósidos (por ejemplo, GD2, GD3, GM2), m A G e - 1 , MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, pl5, p-catenina, MUM-1, CDK4, HPV-E6, HPV-E7, ZFP161, Ubiquilina-1, HOX-B6, IFI27, YB-1, KIAA0136, Osteonectina, F-box solo de la proteína 21, ILF3, SSX-2, PSMA, NY-ESO-1, PRAME, mesotelina, VEGF, VEGFR, integrina alphaVbeta3, Integrina alpha5betal o PLK1.
Se conocen varios métodos en la materia para la unión o conjugación de una fracción de direccionamiento celular (por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un antígeno asociado a un tumor) a un conjugado (por ejemplo, a-amanitina) (véase la Publicación de PCT WO2012/119787). Por ejemplo, una inmunotoxina puede emplear un enlazador disulfuro escindible bien conocido en la materia. La toxina puede conjugarse con la fracción de direccionamiento celular mediante el tratamiento de la toxina para proporcionar grupos sulfhidrilo y la fracción de direccionamiento celular para proporcionar restos de disulfuro de piridilo. Otros enlaces que se utilizan comúnmente y se espera que sean útiles para conjugar una toxina a fracciones de direccionamiento celular son los enlaces inminotiolano/succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato y carbodiimida. Muchos otros enlaces para conjugar proteínas de diferentes longitudes, estabilidad, flexibilidad y reactividad química son bien conocidas en la materia y en muchos casos están disponibles comercialmente. Algunos ejemplos de métodos de unión implican el uso de una reacción de intercambio de disulfuro; mediante la formación de un enlace tioéter; un complejo de quelato metálico que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico, tal como anhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA, por sus siglas en inglés); ácido etilentriaminotetraacético; N-cloro-p-toluenosulfonamida; y/o tetracloro-3-6a-difenilglicouril-3 unido a la fracción de direccionamiento celular. Las fracciones de direccionamiento celular también pueden hacerse reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehído o peryodato. Es deseable que cualquier conjugado de a-amanitina-fracción de direccionamiento celular sea estable tras una exposición prolongada a suero. Como tal, la a-amanitina puede conjugarse con un resto de lisina de una fracción de direccionamiento celular mediante un enlazador de urea estable que es estable en suero pero que liberará a-amanitina libre dentro de una célula diana después de la degradación lisosómica de la fracción de direccionamiento celular.
II. Tratamiento de una enfermedad
Determinados aspectos de las presentes realizaciones se pueden usar para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno asociado con la pérdida hemicigótica de TP53 y la pérdida asociada de POLR2A. El funcionamiento de POLR2A puede verse reducido por cualquier sustancia adecuada para tratar un cáncer que alberga pérdida hemicigótica de TP53 y/o POLR2A. Dichas sustancias a modo de ejemplo pueden ser cualquier amatoxina, aamanitina, o fracciones de direccionamiento celular conjugadas con cualquier amatoxina o a-amanitina.
Un cáncer que alberga pérdida hemicigótica de TP53y/o POLR2A puede no ser homogéneo con respecto a la pérdida de TP53 y/o POLR2A. En diversos aspectos, aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de las células que comprenden el cáncer pueden albergar una pérdida hemicigótica de TP53 y/o POLR2A. Por tanto, en algunos aspectos, aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de las células que comprenden el cáncer pueden comprender ambas copias de TP53 y/o POLR2A. En otros aspectos, varios porcentajes de células que comprenden el cáncer pueden albergar una pérdida homocigótica de TP53 y una pérdida hemicigótica de POLR2A.
"T ratamiento" y "tratar" se refieren a la administración o aplicación de un agente terapéutico a un sujeto o la realización de un procedimiento o modalidad en un sujeto con el fin de obtener un beneficio terapéutico de una enfermedad o afección relacionada con la salud. Por ejemplo, un tratamiento puede incluir la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una sustancia que inhibe la función de POLR2A.
Un "sujeto" se refiere a un ser humano o no humano, tales como primates, mamíferos y vertebrados. En realizaciones particulares, el sujeto es un ser humano.
La expresión "beneficio terapéutico" o "terapéuticamente eficaz" como se usa en esta solicitud se refiere a cualquier cosa que promueve o mejora el bienestar del sujeto con respecto al tratamiento médico de esta afección. Esto incluye, pero sin limitación, una reducción en la frecuencia o intensidad de los signos o síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento del cáncer puede implicar, por ejemplo, una reducción en el tamaño de un tumor, una reducción en la invasividad de un tumor, reducción de la tasa de crecimiento del cáncer o prevención de metástasis. El tratamiento del cáncer también puede referirse a prolongar la supervivencia de un sujeto con cáncer.
Puede administrarse un conjugado de a-amanitina para tratar un cáncer. Los cánceres para los que los presentes métodos de tratamiento son útiles incluyen cualquier tipo de células malignas, tales como las que se encuentran en un tumor sólido o un tumor hematológico. Tumores sólidos a modo de ejemplo pueden incluir, pero sin limitación, un tumor de un órgano seleccionado del grupo que consiste en páncreas, colon, ciego, estómago, cerebro, cabeza, cuello, ovario, riñón, laringe, sarcoma, pulmón, vejiga, melanoma, próstata y mama. Tumores hematológicos a modo de ejemplo incluyen tumores de la médula ósea, neoplasias malignas de linfocitos T o B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas y similares. Otros ejemplos de cánceres que pueden tratarse utilizando los métodos proporcionados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma epidermoide de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal), cáncer de páncreas, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, varios tipos de cáncer de cabeza y cuello y melanoma.
El cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico, aunque no se limita a estos: neoplasia, maligno; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes y fusiformes; carcinoma microcítico; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células basales; carcinoma pilomatricial; carcinoma de células transicionales; carcinoma papilar de células transicionales; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoideo quístico; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquioloalveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical suprarrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de anejos cutáneos; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma papilar seroso; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células de anillo de sello; carcinoma de conducto infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, mamaria; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma ovárico, maligno; tecoma, maligno; tumor de células de la granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de leydig, maligno; tumor de lipocitos, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelánico; melanoma de diseminación superficial; melanoma maligno lentigo; melanomas lentigosos acrales; melanomas nodulares; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; liomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumores filoides, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor óseo de células gigantes; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogénico olfativo; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, pequeño linfocítico; linfoma maligno, de células grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micosis fungoide; otros linfomas no Hodgkin especificados; linfoma de linfocitos B; linfoma no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés) folicular/de bajo grado; NHL linfocítico de células pequeñas (SL, por sus siglas en inglés); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL con neoplasia maligna; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; macroglobulinemia de Waldenstrom; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinófila; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; tricoleucemia; leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia mieloide aguda (LMA); y leucemia mieloblástica crónica.
MI. Tratamientos combinados
En determinadas realizaciones, las composiciones y los métodos de la presente invención implican fracciones de direccionamiento celular conjugadas con a-amanitina, en combinación con una segunda terapia o adicional. Dicha terapia se puede aplicar en el tratamiento de cualquier enfermedad que esté asociada con la pérdida hemicigótica de TP53 y/o POLR2A. Por ejemplo, la enfermedad puede ser un cáncer.
Los métodos y composiciones que incluyen terapias de combinación mejoran el efecto terapéutico o protector y/o aumentan el efecto terapéutico de otra terapia anticancerosa o antihiperproliferativa. Los métodos y composiciones terapéuticas y profilácticas se pueden proporcionar en una cantidad combinada eficaz para lograr el efecto deseado, tal como la destrucción de una célula cancerosa y/o la inhibición de la hiperproliferación celular. Este proceso puede implicar poner en contacto las células con una fracción de direccionamiento celular conjugada con a-amanitina y una segunda terapia. Un tejido, tumor o célula puede ponerse en contacto con una o más composiciones o formulaciones farmacológicas que incluyen uno o más de los agentes (es decir, unagente anticanceroso), o mediante la puesta en contacto del tejido, tumor y/o célula con dos o más composiciones o formulaciones distintas, en donde una composición proporciona 1) una fracción de direccionamiento celular conjugada con a-amanitina; 2) un agente anticanceroso, o 3) tanto una fracción de direccionamiento celular conjugada con a-amanitina como un agente anticanceroso. Asimismo, se contempla que dicha terapia de combinación se pueda usar junto con una quimioterapia, radioterapia, terapia quirúrgica o inmunoterapia.
Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplica a una célula, se utilizan en el presente documento para describir el proceso mediante el cual un anticuerpo terapéutico y un agente quimioterápico o radioterápico se administran a una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para lograr la destrucción celular, por ejemplo, ambos agentes se administran a una célula en una cantidad combinada eficaz para destruir la célula o evitar que se divida.
Se puede administrar una fracción de direccionamiento celular conjugada con a-amanitina antes, durante, después o en varias combinaciones relativas a un tratamiento contra el cáncer. Las administraciones pueden realizarse en intervalos que varían desde simultáneamente hasta minutos, días o semanas. En realizaciones en las que se proporciona el inhibidor de la expresión génica a un paciente por separado de un agente anticanceroso, habría que asegurarse, en general, de que no pasara un período de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de manera que los dos compuestos aún puedan ejercer un efecto combinado ventajoso en el paciente. En dichos casos, se contempla que se puede proporcionar a un paciente la fracción de direccionamiento celular conjugada con a-amanitina y la terapia contra el cáncer dentro de aproximadamente 12 a 24 o 72 horas entre una y otra y, más particularmente, dentro de aproximadamente 6-12 horas entre una y otra. En algunas situaciones, puede ser deseable extender significativamente el período de tiempo para el tratamiento cuando transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las respectivas administraciones.
En determinadas realizaciones, un curso de tratamiento durará de 1 a 90 días o más (este intervalo incluye los días intermedios). Se contempla que se puede administrar un agente en cualquier día del día 1 al día 90 (este intervalo incluye los días intermedios) o cualquier combinación de los mismos, y se administra otro agente en cualquier día del día 1 al día 90 (este intervalo incluye días intermedios) o cualquier combinación de los mismos. En un solo día (período de 24 horas), el paciente puede recibir una o varias administraciones del agente o agentes. Por otra parte, después de un curso de tratamiento, se contempla que hay un período de tiempo en el que no se administra ningún tratamiento contra el cáncer. Este período de tiempo puede durar de 1 a 7 días y/o de 1 a 5 semanas y/o de 1 a 12 meses o más (este intervalo incluye los días intermedios), dependiendo del estado del paciente, tal como su pronóstico, resistencia, salud, etc. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario.
Se pueden emplear distintas combinaciones. Para el siguiente ejemplo, una fracción de direccionamiento celular conjugada con la terapia de a-amanitina es "A" y una terapia contra el cáncer es "B":
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
La administración de cualquier compuesto o terapia como se describe en la divulgación de la presente memoria descriptiva a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de dichos compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hubiese, de los agentes. Por lo tanto, en algunas realizaciones hay una etapa de control de la toxicidad atribuible a la terapia de combinación.
En aspectos específicos, se contempla que una terapia estándar incluirá quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, terapia quirúrgica o terapia génica y puede emplearse en combinación con el anticuerpo inhibidor, terapia contra el cáncer, o tanto el anticuerpo inhibidor como la terapia contra el cáncer, como se describe en el presente documento.
A. Quimioterapia
Puede usarse una amplia variedad de agentes quimioterápicos de acuerdo con la presente invención. El término "quimioterapia" se refiere al uso de fármacos para tratar el cáncer. Se utiliza "agente quimioterápico" para denotar un compuesto o composición que se administra en el tratamiento del cáncer. Estos agentes o fármacos se clasifican por su modo de actividad dentro de una célula, por ejemplo, si afectan y en qué fase el ciclo celular. Como alternativa, un agente puede caracterizarse en función de su capacidad de reticular directamente el ADN, de intercalarse en el ADN o de inducir anomalías cromosómicas y mitóticas al afectar la síntesis de ácido nucleico. La mayoría de los agentes quimioterápicos se dividen en las siguientes categorías: agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos y nitrosoureas.
Ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall y calicheamicin omegaI1; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autrarnicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolindoxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (por ejemplo, CPT-11); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; carboplatino, procarbazina, plicomicina, gemcitabien, navelbina, inhibidores de la farnesil-proteína transferasa, transplatino y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (SERM, por sus siglas en inglés), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tal como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol, exemestano, formestanio, fadrozol, vorozol, letrozol y anastrozol; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular, los que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia génica y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
B. Radioterapia
Otros factores que causan daño en el ADN y se han usado ampliamente incluyen lo que comúnmente se conocen como rayos y, rayos X y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células tumorales. También se contemplan otras formas de factores que dañan el ADN, tales como microondas, irradiación con haz de protones (Patentes de Estados Unidos 5.760.395 y 4.870.287) e irradiación UV. Es muy probable que todos estos factores afecten a una amplia gama de daños en el ADN, en los precursores del ADN, en la replicación y reparación de ADN, y en el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosificación de rayos X varían de dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante períodos prolongados de tiempo (3 a 4 semanas), a dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosificación para los radioisótopos varían extensamente y dependen de la semivida del isótopo, de la fuerza y el tipo de radiación emitida, y de la captación por las células neoplásicas.
Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplica a una célula, se utilizan en el presente documento para describir el proceso mediante el cual una construcción terapéutica y un agente quimioterápico o radioterápico se administran a una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para lograr la destrucción celular, por ejemplo, ambos agentes se administran a una célula en una cantidad combinada eficaz para destruir la célula o evitar que se divida.
C. Inmunoterapia
En el contexto del tratamiento del cáncer, los productos inmunoterápicos, generalmente, se basan en el uso de células y moléculas efectoras inmunitarias para dirigirse y destruir a las células cancerosas. Trastuzumab (Herceptin™) es un buen ejemplo. El efector inmunitario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador de superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solo puede servir como un efector de la terapia o puede reunir otras células que efectúan realmente la destrucción celular. El anticuerpo también puede conjugarse con un fármaco o toxina (quimioterápico, radionúclido, la cadena A de ricina, toxina colérica, toxina pertúsica, etc.) y servir simplemente como un agente de direccionamiento. Como alternativa, el efector puede ser un linfocito que lleva una molécula de superficie que interactúa, directa o indirectamente, con una diana de células tumorales. Las diversas células efectoras incluyen a los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos NK. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, la actividad citotóxica directa y la inhibición o reducción de ErbB2, proporcionarían un beneficio terapéutico en el tratamiento de los cánceres que sobreexpresan ErbB2.
Otra inmunoterapia también podría usarse como parte de una terapia combinada con la terapia de silenciamiento génico discutida anteriormente. En un aspecto de la inmunoterapia, la célula tumoral debe portar algún marcador que pueda utilizarse como diana, es decir, no está presente en la mayoría de las otras células. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para el uso como diana en el contexto de la presente invención.
Los marcadores tumorales comunes incluyen el antígeno carcinoembrionario, el antígeno específico de la próstata, el antígeno asociado a tumor urinario, el antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, el antígeno Sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógenos, receptor de laminina, erb B y p155. Un aspecto alternativo de la inmunoterapia es combinar efectos antineoplásicos con efectos inmunoestimulantes. También existen moléculas inmunoestimulantes que incluyen citocinas, tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF y gamma-IFN, quimiocinas, tales como MIP-1, MCP-1 e IL-8, y factores de crecimiento, tales como el ligando de FLT3. Combinando moléculas inmunoestimulantes, ya sea como proteínas o mediante la administración de genes en combinación con un supresor tumoral, se ha demostrado que aumenta los efectos antitumorales (Ju et al. 2000). Por otra parte, los anticuerpos contra cualquiera de estos compuestos pueden utilizarse para direccionar a los agentes antineoplásicos discutidos en el presente documento.
Ejemplos de inmunoterapias actualmente bajo investigación o en uso son, los adyuvantes inmunitarios por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos (Patentes de Estados Unidos 5.801.005 y 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapia con citocinas, por ejemplo, interferones a, p y y; IL-1, GM-CSF y TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998), terapia génica, por ejemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; Patentes de Estados Unidos 5.830.880 y 5.846.945) y anticuerpos monoclonales, por ejemplo, antigangliósido GM2, anti-HER-2, anti-p185 (Hanibuchi et al., 1998; Patente de Estados Unidos 5.824.311). Se contempla que se puedan emplear una o más terapias contra el cáncer con las terapias de silenciamiento de genes descritas en el presente documento.
En la inmunoterapia activa, se administra un péptido, polipéptido o proteína antigénica, o una composición de células tumorales autólogas o alogénicas o "vacuna", generalmente con un adyuvante bacteriano distinto. En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del paciente, o linfocitos infiltrados en el tumor, se aíslan in vitro, se activan mediante linfocinas, tales como IL-2, o se transducen con genes de necrosis tumoral y se vuelven a administrar.
D. Cirugía
Aproximadamente un 60 % de las personas con cáncer se someterán a una cirugía de algún tipo, que incluye cirugía preventiva, diagnóstica o de estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento contra el cáncer que se puede usar junto con otras terapias, tales como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia génica, inmunoterapia y/o terapias alternativas.
La cirugía curativa incluye la resección en la que todo o parte del tejido canceroso se elimina, extirpa y/o destruye físicamente. Resección tumoral se refiere a la deleción física de al menos parte de un tumor. Además de la resección tumoral, el tratamiento quirúrgico incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía controlada microscópicamente (cirugía de Mohs). Se contempla además que determinados aspectos de la presente invención puedan utilizarse junto con la deleción de cánceres superficiales, de precánceres o de cantidades menores de tejido normal.
Tras la escisión de parte o la totalidad de las células cancerosas, tejido, o tumor, se puede formar una cavidad en el cuerpo. El tratamiento puede realizarse por perfusión, inyección directa o aplicación local al área con una terapia antineoplásica adicional. Dicho tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4 y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. Estos tratamientos pueden ser, además, de dosificaciones variables.
E. Otros agentes
Se contempla que se puedan usar otros agentes en combinación con determinados aspectos de la presente invención para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes inmunomoduladores, agentes que afectan la regulación al alza de receptores de superficie celular y uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de la adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a inductores apoptóticos u otros agentes biológicos. Los agentes inmunomoduladores incluyen el factor de necrosis tumoral; interferón alfa, beta y gamma; IL-2 y otras citocinas; F42K y otros análogos de citocinas; o MIP-1, MIP-1 beta, MCP-1, RANTES y otras quimiocinas. Se contempla además que la regulación al alza de receptores de superficie celular o sus ligandos, tales como Fas/ligando de Fas, DR4 o DR5/TRAIL (ligando Apo-2) potenciaría las capacidades inductoras apoptóticas de la presente invención mediante el establecimiento de un efecto autocrino o paracrino sobre las células hiperproliferativas. El aumento en la señalización intercelular mediante la elevación del número de uniones GAP aumentarían los efectos antihiperproliferativos en la población de células hiperproliferativas vecinas. En otras realizaciones, se pueden usar agentes citostáticos o de diferenciación en combinación con determinados aspectos de la presente invención para mejorar la eficacia antihiperproliferativa de los tratamientos. Se contemplan inhibidores de la adhesión celular para mejorar la eficacia de la presente invención. Ejemplos de inhibidores de la adhesión celular son los inhibidores de la cinasa de adhesión focal (FAK, por sus siglas en inglés) y la lovastatina. Se contempla además que otros agentes que aumentan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a la apoptosis, tal como el anticuerpo c225, podrían usarse en combinación con determinados aspectos de la presente invención para mejorar la eficacia del tratamiento.
La terapia hormonal también puede usarse junto con determinados aspectos de la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia contra el cáncer descrita previamente. El uso de hormonas puede emplearse en el tratamiento de determinados cánceres tales como el cáncer de mama, próstata, ovario o de cuello uterino para reducir el nivel o bloquear los efectos de determinadas hormonas, tales como testosterona o estrógeno. Este tratamiento se usa a menudo en combinación con al menos otra terapia contra el cáncer como opción de tratamiento 0 para reducir el riesgo de metástasis.
IV. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia deberían apreciar que las técnicas divulgadas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen bien en la práctica de la invención, y por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan.
Materiales y métodos
Cultivo celular, anticuerpos y análisis de transferencia Western. Las líneas celulares HCT116, SW480, SW837, HT29, DLD1 y HT29 se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en condiciones estándar especificadas por el fabricante. Las líneas celulares SNU283 y SNU1197 se obtuvieron del Korean Cell Line Bank y se cultivaron en medio RMPI 1640 complementado con FBS al 10 % y L-Glutamina 2 mM. El aislamiento, cultivo y mantenimiento de células de CRC primarias humanas xenoinjertadas (xhCRC, por sus siglas en inglés) se realizaron como se describió previamente (Lu et al., 2013). En resumen, los xenoinjertos procedentes de pacientes se recolectaron en condiciones estériles y se disociaron mecánicamente, seguido de 30 minutos de incubación en colagenasa II a 37 °C. La muestra se filtró a través de un tamiz estéril de 100 |jm. Los glóbulos rojos se eliminaron con un tampón de lisis de glóbulos rojos hipoosmótico (eBioscience). Las células de ratón en muestras de CRC humano xenoinjertadas se eliminaron mediante selección negativa usando un anticuerpo H-2K de molécula de MHC de clase 1 de ratón seguido del uso de un kit de purificación de perlas magnéticas (Miltenyi). Los fibroblastos se eliminaron mediante selección negativa utilizando un kit de separación de perlas magnéticas MACS (Miltenyi). Las células xhCRC recién aisladas se mantuvieron en placas de cultivo recubiertas de colágeno-1 (BD Biosciences) y se cultivaron en MEM complementado con FBS al 10 %, vitaminas (1 x), aminoácidos no esenciales (1 x), Pen-Strep (1 x), piruvato de sodio (1 x) y L-glutamina (1 x). Todos los complementos del medio se adquirieron en Sigma.
Se adquirieron anticuerpos anti-POLR2A de Santa Cruz (n.° sc-47701) y Abcam (n.° ab140509). El anticuerpo anti-Ki67 (n.° D3B5) y el anticuerpo anticaspasa-3 escindida (Asp175, n.° 5A1E) se obtuvieron de Cell Signaling. Los anticuerpos anti-p53 (n.° sc-126), anti-p-actina (n.° sc-1616), anti-IgG de cabra-HRP (n.° sc-2020), anti-IgG de conejo -HRP (n.° sc-2054) y anti-IgG de ratón-HRP (n.° sc-2055) se adquirieron de Santa Cruz. La preparación del lisado celular, SDS-PAGE y transferencia Western se realizaron como se describió anteriormente (Liu et al., 2012).
Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa. El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol (Life Technologies) y luego se sometió a transcripción inversa usando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). El ADNc resultante se usó para qPCR usando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) con cebadores específicos de genes y los resultados se normalizaron a p-actina como control. En los ensayos de RT-PCR, las secuencias de cebadores para TP53 son: 5'-GAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-TCCGTCCCAGTAGATTACCAC-3' (SEQ ID NO: 2), y para POLR2A son: 5'-TTGTATCCGTACCCACAGCA-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'-CATGATCAGCTCCCCATTCT-3' (SEQ ID NO: 4).
Atenuación de POLR2A mediada porARNhc. Los clones de ARNhc específicos de POLR2A se obtuvieron del ARNhc de MD Anderson y ORFeome Core Facility (originalmente de Open Biosystems). Se cribaron doce ARNhc dirigidos a POLR2A, de los cuales dos ARNhc atenuaron los niveles de proteínas en al menos un 50 % en las cuatro líneas celulares de cáncer colorrectal analizadas. Los números de identificación de los clones y las secuencias de ARNhc son V3LHS_645674 (5'-TTAGCTTTGTTCTTCCCGA-3' [SEQ ID NO: 5]) y V3LHS_64029 (5'-TGTTGTCCATCTCCTCCCC-3' [SEQ ID NO: 6]). Las secuencias de horquilla en el vector GIPZ se clonaron en el vector TRIPZ (Dharmacon) usando un protocolo proporcionado por el fabricante. El vector TRIPZ es un sistema inducible por Dox con un indicador de proteína rojo fluorescente.
Generación de células que expresan de manera estable ARNhc inducibles por Dox. Se produjeron partículas lentivíricas recombinantes a partir de células 293T. En resumen, se transfectaron 72 jg de ADN del vector que codifica el ARNhc, 54 jg de ADN del vector Delta 8.9 y 18 jg de ADN del vector que codifica VSVG en células 293T (sembradas en placas de 245 mm2) utilizando X-tremeGENE (Roche). Se recogió el sobrenadante que contenía partículas de virus y se filtró 72 horas después de la transfección, se concentró mediante ultracentrifugación a 90.000 g y se volvió a suspender en medio de crecimiento celular. Para generar células estables inducibles por Dox, se infectaron células HCT 116 y SNU283 con partículas víricas que expresan ARNhc en la multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) de 1. Se añadieron soluciones víricas al medio de cultivo celular que contenía 4 jg/m l de polibreno. Se seleccionaron células 48 horas después de la infección mediante 2 jg/m l de puromicina. Se cultivaron y propagaron colonias individuales, y se identificaron y analizaron las colonias que llevaban una copia única del inserto de ADN lentivírico para determinar la eficacia de atenuación.
Ensayo de competición usando ARNhc de POLR2A. Una sola copia lentivírica que expresaba ARNhc-1 o ARNhc-2 fue suficiente para suprimir los niveles de expresión de POLR2A en las cuatro líneas celulares colorrectales probadas (FIG. 6A). Las células cancerosas se infectaron con control o lentivirus que expresan ARNhc de POLR2A (cadena principal de pGIPZ que expresa GFP) en la MOI de 2. Dos días después de la infección, las células positivas para GFP se clasificaron utilizando un clasificador de células BD FACSJazz™ (BD Biosciences) en la MD Anderson Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility. A continuación, se mezclaron células positivas para GFP con células no infectadas y negativas para GFP en una proporción de 1:1 y se cultivaron durante seis pases. El número de células positivas para GFP y totales en cada pase se analizaron y cuantificaron mediante citometría de flujo y se calcularon los porcentajes de células positivas para GFP.
Generación de vectores que expresan ARNgu y ensayo Surveyor. El vector de expresión bicistrónico que expresa Cas9 y ARNgu se digirió con BbsI y se trató con fosfatasa alcalina, y el vector linealizado se purificó en gel para clonar ADN que codifica ARNgu (Cong et al., 2013). El par de oligo ADN para cada ARNgu dirigido a TP53 o POLR2A se hibridó, fosforiló y ligó al vector linealizado. Las secuencias de oligo ADN se enumeran en la Tabla 1. Se realizó el ensayo Surveyor para probar la eficacia de la edición del genoma como se describió anteriormente (Ran et al., 2013; Guschin et al., 2010). En resumen, se sembraron células en placas de seis pocillos a una densidad de 2 x 105 células por pocillo. Un día después de la siembra inicial, las células se transfectaron con 2 gg de ADN del vector que expresa Cas9/ARNgu y se recogieron 48 horas después de la transfección. Se aisló el ADN genómico y se amplificó un fragmento de ADN de 1 kb que contenía el sitio de dirección del ARNgu mediante PCR de alta fidelidad y se digirió con la endonucleasa T7 de tipo I. Como control se utilizó ADN genómico aislado de células HCT116 transfectadas con ADN de vector de control. Para permitir la hibridación de hebras complementarias pero no coincidentes, los productos de PCR se incubaron a 95 °C durante 5 minutos, 95 °C a 85 °C a una velocidad de -2 °C s-1 y 85 °C a 25 °C a una velocidad de -0,1 °C s-1. Se añadió endonucleasa T7 de tipo I y las muestras se incubaron a 37 °C durante 60 minutos para digerir los productos de PCR hibridados en los sitios de emparejamiento incorrecto. Los productos de PCR digeridos con endonucleasa T7 de tipo I se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas para la amplificación por PCR se enumeran en la Tabla 1. Los productos de la PCR de los clones positivos se ligaron a pGEM-T Easy Vector (Promega) y se confirmaron adicionalmente mediante secuenciación de ADN.
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Ensayo de proliferación y supervivencia celular. Se sembraron en placas de 12 pocillos el mismo número de células por triplicado. Las células se fijaron con metanol al 10 % y se tiñeron con cristal violeta al 0,1 % (disuelto en metanol al 10 %) en los tiempos indicados. Después de la coloración, los pocillos se lavaron tres veces con PBS y se destiñeron con ácido acético. La absorbencia de la solución de cristal violeta se midió a 590 nm. Para el ensayo de supervivencia celular, las células se sembraron a una concentración de 1.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de a-Amanitina o actinomicina D 24 horas después. La viabilidad celular se cuantificó usando reactivo WST-1 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Análisis de apoptosis y ciclo celular. Las líneas celulares HCT 116 y SNU283 se trataron con o sin a-Amanitina durante 2 días o doxiciclina durante 4 días a las concentraciones indicadas y se tiñeron con anexina V-PE y 7-AAD (Biovision). La apoptosis se analizó mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo Guava EasyCyte (Millipore) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se incluyeron en los análisis células tanto pre-apoptóticas (positivas a anexina V y negativas a 7-AAD) como apoptóticas (positivas a anexina V y positivas a 7-AAD). Para el análisis del ciclo celular, las células se fijaron en etanol al 75 % a -20 °C durante la noche. Las células se lavaron con PBS frío, se trataron con 100 |jg de RNasa A (Qiagen) y se tiñeron con 50 |jg de yoduro de propidio (Roche). Los perfiles del ciclo celular se analizaron mediante citometría de flujo utilizando el citómetro de flujo Guava EasyCyte (Millipore).
Hibridación in situ fluorescente (FISH, por sus siglas en inglés). Se realizó análisis FISH utilizando sondas POLR2A marcadas con fluoresceína (rojo) y centrómero de control (Cr 17, verde) de Empire Genomics. La hibridación y la detección se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los portaobjetos se tiñeron con DAPI y las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Nikon E800 equipado con una cámara de dispositivo acoplado de carga refrigerada (CCD, por sus siglas en inglés). Para determinar la pérdida hemicigótica del gen POLR2A, se analizaron 100 núcleos individuales para cada caso. Los núcleos en interfase se capturaron y procesaron utilizando el Sistema de procesamiento de imágenes cuantitativas (Applied Imaging).
Muestras de pacientes. Se obtuvieron muestras de tejido tumoral colorrectal y normal emparejadas de pacientes del MD Anderson Cancer Center (MDACC) mediante los consentimientos informados apropiados después de la aprobación del comité ético de investigación clínica (CEIC n.° PA11-0767). Para determinar los niveles de expresión de la proteína POLR2A, se colocaron muestras de tejido (20-40 mg) en tubos que contenían perlas de cerámica y se homogeneizaron usando un dispositivo homogeneizador Precellys 24 (Bertin Technologies). Los lisados se centrifugaron dos veces (15 minutos, 16.000 g) y se recogió el sobrenadante.
Aislamiento de ADN genómico y validación del número de copias. Se extrajo ADN genómico total de muestras de tejido humano y líneas celulares utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de purificación del fabricante. Todas las muestras de ADN se almacenaron a -20 °C. Las variaciones del número de copia para POLR2A se determinaron utilizando sondas TaqMan (Hs02023849_cn y Hs01252684_cn) y el kit de p Cr TaqMan estándar en un sistema de detección de secuencias Applied Biosystems 7900HT. Y el gen de referencia TERt se cuantificó simultáneamente en el mismo tubo para cada muestra de ADN.
Conjugación de a-Amanitina con anticuerpo anti-EpCAM (HEA125). El conjugado anticuerpo-fármaco ama-HEA125 se construyó mediante el acoplamiento de a-Amanitina a restos de lisina del anticuerpo HEA125 mediante una estructura enlazadora estable. HEA125 se une a células que expresan EpCAM con alta afinidad (Kd de aproximadamente 2,2 x 10-9 M) y alta especificidad. HEA125 se purificó mediante cromatografía de afinidad usando una columna de proteína A-Sefarosa CL-4B (GE Healthcare). La a-amanitina se unió a moléculas de inmunoglobulina mediante un enlace de urea estable en plasma destinado a liberar a-amanitina libre dentro de la célula tumoral después de la degradación lisosómica de la fracción de anticuerpo. La proporción fármaco-anticuerpo (PFA) de la molécula de a-Amanitina:IgG fue 4:1. Las características bioquímicas de ama-HEA125 se evaluaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) utilizando un sistema de HPLC PlatinBlue (Knauer). Además, se analizaron HEA125 y ama-HEA125 mediante la reducción de SDS-PAGE y la tinción de Coomassie de acuerdo con procedimientos habituales. La verificación de la carga de fármaco se realizó mediante análisis de inmunotransferencia antiamanitina de 30 ng de HEA125 y ama-HEA125 usando técnicas estándar.
Preparación de nanopartículas liposomales. Se encapsularon ARNip para administración in vivo en DOPC (1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfatidilcolina). Se mezclaron DOPC y ARNip en presencia de exceso de butanol terciario en una proporción de 1:10 (p/p) ARNip/DOPC. Se añadió Tween 20 a la mezcla en una proporción de 1:19 Tween 20:ARNip/DOPC. La mezcla se agitó con vórtex, se congeló en un baño de acetona/hielo seco y se liofilizó. Antes de la administración in vivo, esta preparación se hidrató con PBS a temperatura ambiente a una concentración de 150­ 1000 jg de ARNip/kg por inyección (cada ratón recibió 200 j l de solución de DOPC:ARNip:PBS por vía intraperitoneal).
Estudios de tumores xenoinjertados. Se adquirieron ratones NOD/SCID hembra de cuatro a seis semanas de edad de Jackson Laboratories y se alojaron en condiciones libres de patógenos. Todos los estudios fueron aprobados y supervisados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del MD Anderson Cancer Center. Cuando se utiliza en un cálculo de potencia, los presentes experimentos de predeterminación del tamaño de la muestra indicaron que 5 ratones por grupo pueden identificar el efecto esperado de POLR2A sobre el tamaño y el peso del tumor (p < 0,05) con una potencia del 90 %. Los animales se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos. Se inyectaron células HCT116 (1 x 106) y SNU283 (2 x 106) inducibles por Dox en 50 j l de medio de crecimiento (mezclado con Matrigel a 1:1) por vía subcutánea en el flanco usando una jeringa de microlitros Hamilton de 100 j l . El tamaño del tumor se midió cada cinco días usando un calibrador y el volumen del tumor se calculó usando la fórmula estándar: 0,5 x L x A2, donde L es el diámetro más largo y A es el diámetro más corto. Para el modelo de ratón ortotópico, se anestesiaron a los ratones SCID y se hizo una incisión en la piel para exponer el ciego. Se inyectaron células HCT116 inducibles por Dox (1 x 106) que expresan luciferasa en la pared cecal usando una jeringa de microlitros Hamilton de 100 j l , y luego se cerró la incisión usando grapas para heridas. Los tumores se controlaron mediante el sistema IVIS después de la inyección de luciferina durante 15 minutos. Después del establecimiento inicial del tumor (100 mm3 para implantes subcutáneos y 2 x 108 fotones/segundo, flujo total para implantes ortotópicos), los ratones se trataron con 1 jg ml-1 de doxiciclina en el agua potable durante 3 a 4 semanas. El agua con doxiciclina se cambió cada dos días.
Para estudios de tumores xenoinjertados que utilizan ARNip encapsulados en DOPC, se trasplantaron pares isogénicos de células HCT116 (1 x 106) en la pared cecal usando una jeringa de microlitros Hamilton de 100 j l . Diez días después de la inyección de células, los ratones se dividieron aleatoriamente y se asignaron para recibir ARNip de control-DOPC o ARNip de POLR2A-DOPC. Las secuencias de ARNip son las siguientes: ARNip de control (5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3' [SEQ ID NO: 19] y 5'-ACGUGACACGUUCGGA-GAA-3' [SEQ ID NO: 20]); ARNip-1 de POL2 (5'-CCAACAUGCUGACAGAUAU-3' [SEQ ID NO: 21] y 5'-AUAUCUGU-CAGCAUGUUGG-3' [SEQ ID NO: 22]); ARNip-2 de POL2 (5'-CCAAGAAGCGGCUCACACA-3' [SEQ ID NO: 23] y 5'-UGUGUGAGCCGCUUCUUGG-3' [SEq ID NO: 24]). Se administró intraperitonealmente una dosis de 150 a 1O00 |jg de ARNip/kg de ratón a intervalos de dos veces por semana. Este intervalo de concentraciones asegura la administración eficaz y la atenuación de genes diana, como se describió anteriormente (Pecot et al., 2014).
Para estudios de xenoinjerto de tumores con conjugado de anticuerpo-fármaco (CAF) a-Amanitina-HEA125, se trasplantaron pares isogénicos de células HCT116 (1 x 106), xhCRC (0,5 x 106), SW480 (1 x 106) o SW837 (2 x 106) en la pared cecal usando una jeringa de microlitros Hamilton de 100 j l . Los ratones que tenían tumores de 10 días se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (n = 10 ratones/grupo) y recibieron dos dosis intraperitoneales (con 1 semana de diferencia) de lo siguiente: 1) AcM HEA125 no conjugado de control a una dosis de 3,6 mg kg-1 de peso corporal; 2) Ama-HEA125 a una dosis de 90 jg kg-1 en términos de a-Amanitina (correspondiente a 3,6 mg kg-1 de IgG); 3) Ama-HEA125, 30 jg kg-1 en términos de a-Amanitina (correspondiente a 1,2 mg kg-1 de IgG); 4) Ama-HE125, 10 jg kg-1 en términos de a-Amanitina (correspondiente a 0,4 mg kg-1 de IgG); y 5) Ama-HEA125, 3 jg kg-1 en términos de a-Amanitina (correspondiente a 0,12 mg kg-1 de IgG). Los tumores se controlaron mediante el sistema de imágenes en vivo IVIS dos veces por semana después de la inyección de luciferina durante 15 minutos. Los pesos corporales se registraron cada cuatro días. Se obtuvo sangre mediante sangrado retroorbitario después de la anestesia el día 21 y los niveles de enzimas hepáticas en sangre (AST: aspartato aminotransferasa, ALT: amino alanina transferasa y fosfatasa alcalina) se determinaron en Patología Clínica, Centro de Medicina y Cirugía Veterinaria del MD Anderson Cancer Center.
Los ratones se sacrificaron cuando cumplieron con los criterios de eutanasia institucional para el tamaño del tumor y el estado general de salud. Se eliminaron los tumores, se fotografiaron y se pesaron. Los tejidos tumorales recién disecados se fijaron en formalina tamponada al 10 % durante la noche, se lavaron con PBS, se transfirieron a etanol al 70 %, se embebieron en parafina, se seccionaron y tiñeron con hematoxilina y eosina. Los investigadores estaban cegados a la asignación de grupos durante el experimento y cuando evaluaron el resultado.
Inmunohistoquímica y micromatriz de tejido de colon humano. La micromatriz de tejido de cáncer de colon (BC051110a) se adquirió de Biomax, incluyendo 110 muestras de tumores de colon y 10 muestras de tejido de colon normal. Las muestras se desparafinaron y rehidrataron. El antígeno se recuperó usando tampón de citrato de sodio 0,01 M (pH 6,0) a una temperatura inferior a la de ebullición durante 10 minutos después de hervir en un horno microondas. Para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, las secciones se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos. Después de 1 hora de incubación previa en suero de cabra normal al 5 % para prevenir tinciones inespecíficas, las muestras se incubaron con anticuerpo contra POLR2A n.° sc-47701, Santa Cruz), Ki67, (n.° D3B5, Cell Signaling), o caspasa-3 escindida (n.° 5A1E, Cell Signaling) a 4 °C durante la noche. Las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado (anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo biotinilada 4Plus, BioCARE) y luego se incubaron con una solución de complejo de avidina-biotina peroxidasa y se desarrollaron usando un kit de sustrato DAB (diaminobencidina) (n.° 550880, Bd Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La contratinción del color se llevó a cabo utilizando hematoxilina modificada de Harris. Todos los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon en el Automate Cellular Image System III (ACIS III) para su cuantificación mediante análisis de imágenes digitales.
Análisis bioinformático. La correlación entre el número de copias génicas y la expresión del gen correspondiente se analizó utilizando datos obtenidos de CCLE (en la red mundial en broadinstitute.org/ccle) y TCGA (en la red mundial en cbioportal.org/public-portal/) como se describió anteriormente (Nijhawan et al., 2012). El enriquecimiento de los coeficientes de correlación de Pearson se determinó mediante la permutación de los nombres de los genes. Para determinar si un gen eliminado funciona como gen de mantenimiento, primero se analizaron sus perfiles de expresión en tejidos tumorales y normales, así como sus funciones generales a partir de la bibliografía. Segundo, la conservación de genes en todas las especies y la letalidad del gen inactivado se comprobaron mediante la búsqueda de bases de datos disponibles de organismos modelo (Saccharomyces Genome Database, WormBase, FlyBase y Mouse Genome Informatics). En tercer lugar, la proximidad del posible gen diana al gen TP53 se comprobó y se analizó su deleción conjunta con TP53 en cánceres humanos. Por último, se identificaron líneas de células cancerosas con la deleción de TP53 y el gen diana para probar la presente hipótesis.
Análisis estadístico. Cada experimento se repitió tres veces o más. A menos que se indique de otro modo, los datos se presentan como media y de o eem, y la prueba t de Student (no apareado, de dos colas) se utilizó para comparar dos grupos de muestras independientes. En una prueba t no apareada, se asumió la misma varianza y no se excluyeron muestras del análisis. Los métodos estadísticos utilizados para el análisis de datos TCGA se describen anteriormente. Se consideró p < 0,05 estadísticamente significativo.
Ejemplo 1 - La expresión de POLR2A, pero no de TP53, está correlacionada con el número de copias génicas
La deleción genómica de un gen supresor de tumores a menudo abarca múltiples genes vecinos que pueden no contribuir al desarrollo del cáncer, pero son esenciales para la proliferación y supervivencia celular (Negrini et al., 2010). Se ha postulado que esta pérdida parcial de dichos genes de mantenimiento hace que las células cancerosas sean altamente vulnerables a una inhibición adicional de esos genes (Nijhawan et al., 2012). El análisis de TCGA reveló que la deleción hemicigótica del gen TP53 ocurre con frecuencia en una amplia gama de cánceres humanos (FIG. lA ). POLR2A se identificó como un gen de mantenimiento en la proximidad de TP53 (que se encuentra a ~ 200 kilobases en el genoma humano) que es esencial para la supervivencia celular (FIG. 1B). La deleción concomitante de POLR2A ocurre en prácticamente todos los tumores colorrectales humanos que albergan deleción hemicigótica de TP53 (FIG. 1C).
Entre las doce subunidades del complejo ARN polimerasa II humana, POLR2A codifica la subunidad más grande que es indispensable para la actividad de la polimerasa en la síntesis de ARNm (Shalem et al., 2014). La inhibición de POLR2A con un inhibidor específico, a-Amanitina, causa muerte celular extensa y, además, la deleción homocigótica de POLR2A es letal en células humanas (Lindell et al., 1970; Shalem et al., 2014). Se encontró que 104 (53 %) de 195 casos de cáncer colorrectal (CRC, por sus siglas en inglés) tienen pérdida parcial de la región 17p13, dando como resultado la deleción concomitante de TP53 y POLR2A (FIG. 1C). Sin embargo, no se observó deleción homocigótica de POLR2A, consistente con la noción de que POLR2A es esencial para la supervivencia celular. El análisis de las bases de datos TCGA y CCLE reveló que la expresión de POLR2A está estrechamente correlacionado con el número de copias génicas (FIG. 1D). Esta correlación positiva también se validó en veinte pares de muestras de tejido CRC y normal emparejadas y micromatrices de tejido CRC humano (FIG. IE, 5A y 5B y Tabla 2). Los números de copia de POLR2A se determinaron en un conjunto de células de cáncer colorrectal (FIG. 1f ) y se descubrió que las tres líneas celulares POLR2Apérd¡da (pérdida hemicigótica de POLR2A) expresaron proteínas POLR2A en niveles significativamente más bajos que líneas celulares POLR2Aneutro (FIG. iG y 1H). A diferencia de POLR2A, los niveles de p53 se determinaron mediante una complejidad de eventos postranscripcionales y postraduccionales (Toledo y Wahl, 2006). A pesar de una correlación entre el número de copias de TP53 y la expresión de ARNm, los niveles de proteína p53 no están asociados con el número de copias génicas en líneas celulares y tumores colorrectales (FIG.
6A-6C y 1H).
Tabla 2. La pérdida hemicigótica de POLR2A en una micromatriz de cáncer de colon humano (n.° BC051110a, Biomax) se determinó mediante el ensayo FISH
Figure imgf000018_0001
continuación
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continuación
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Ejemplo 2 - Las células POLR2Apérdida son muy sensibles a la inhibición de POLR2A
Para evaluar la sensibilidad de las células con o sin pérdida hemicigótica de TP53/POLR2A a la inhibición de POLR2A, se trató un perfil de células POLR2Aneutro (HCT116, SW480) y POLR2Apérdida (SW837, SNU283) con a-Amanitina. El tratamiento de a-Amanitina a altas concentraciones (> 1 |jg ml-1) inhibió notablemente el crecimiento celular y provocó la muerte celular completa en las cuatro líneas celulares. Sin embargo, a concentraciones de 0 a 1,0 jg ml-1, la inhibición de a-amanitina tuvo niveles significativamente más altos de efecto de destrucción celular en las células POLR2Apérdida que en las células POLR2Aneutro de control (FIG. 2A y 2B). La concentración inhibidora media máxima (CI50) fue de -1,0 jg ml-1 para las células POLR2Aneutro, que fue 10 veces mayor que la de las células POLR2Apérdida. Por el contrario, las células POLR2Apérdida no mostraron mayor sensibilidad al tratamiento con actinomicina D, un inhibidor de la transcripción inespecífico (FIG. 7A). A continuación, se evaluó la vulnerabilidad de las células POLR2Apérdida usando un ensayo de competencia directa. Se compararon las tasas de proliferación celular entre las células de control y las células positivas para GFP que expresan el ARNhc de control o específico de POLR2A. Dos ARNhc independientes atenuaron la expresión de POLR2A en un 50 %-70 % en todas las líneas celulares probadas (FIG. 7B). Después de cultivar durante seis pases, las células POLR2Aneutro (HCT116, SW480) que expresan de manera estable los ARNhc de POLR2A solo tenían una proliferación moderadamente reducida, en comparación con la de las células correspondientes que expresan ARNhc de control (FIG. 7C). Sin embargo, el silenciamiento de POLR2A en células POLR2Apérdida (SNU283, SW837) condujo a una proliferación notablemente reducida, lo que sugiere que la pérdida hemicigótica de POLR2A hace que las células cancerosas sean más propensas a una mayor inhibición de POLR2A. Se generaron líneas celulares h Ct 116 y SNU283 que expresan de manera estable ARNhc de POLR2A inducibles por doxiciclina (Dox) (FIG. 7D). A pesar de la importante atenuación de POLR2A, las células HCT116 continuaron proliferando, mientras que las células SNU283 exhibieron una detención intensa del ciclo celular G1 y apoptosis (FIG. 2c , 2D, y 7E-7G). Aproximadamente un 50% de la disminución en la expresión de POLR2A (con la adición de 30-100 ng ml-1 de Dox) redujo notablemente la proliferación de células SNU283, pero solo tuvo un efecto modesto en las células HCT116 (FIG. 2D). A continuación, se realizaron experimentos de rescate en líneas celulares POLR2Apérdida SNU283 y SW837. La reexpresión gradual de POLR2A exógeno en ambas líneas celulares restauró su resistencia a la a-Amanitina hasta un nivel comparable al de las células POLR2Aneutro HCT116 y SW480 (FIG. 2E, 2F, y 8A-8B).
Para excluir los efectos de diversos antecedentes genéticos en las líneas celulares, se empleó el sistema CRISPR (grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares)/Cas9 para generar una línea celular HCT116 isogénica con pérdida hemicigótica de POLR2A (Wang et al., 2014; Wang et al., 2013). Se diseñaron dos RNA guía único (ARNgu) para dirigir el segundo exón del gen POLR2A FIG. 9A). Ambos se dirigieron e interrumpieron eficazmente el gen POLR2A, como se muestra en el análisis Surveyor (FIG. 9B). Se seleccionaron colonias individuales de células HCT 116 que llevan deleción monoalélica de POLR2A y se verificaron mediante secuenciación de ADN (FIG. 9C). Una pequeña deleción en la región diana condujo a un cambio de marco de lectura abierto, produciendo solo un tramo corto del péptido N-terminal sin todos los dominios funcionales de POLR2A. Como resultado, la expresión de POLR2A se redujo significativamente en células POLR2Apérd¡da (FIG. 9D). Las células HCT116 POLR2Apérd¡da y POLR2Aneutro mostraron tasas de proliferación similares (FIG. 9E), lo que indica que un alelo de POLR2A es suficiente para mantener la proliferación y supervivencia celular. Sin embargo, la deleción hemicigótica de POLR2A sensibilizó notablemente las células HCT116 al tratamiento con a-Amanitina con una CI50 de ~ 0,1 |jg ml-1, que es 8 veces menor que la de las células HCT116 parentales (FIG. 2G y 2H). Como control, no se observaron diferencias sustanciales en su sensibilidad a la actinomicina D (FIG. 9F). El resultado de los ensayos de competencia directa demostró que la atenuación de POLR2A dio como resultado una proliferación notablemente reducida en células POLR2Apérd¡da, pero no en células POLR2A neutro isogénicas (FIG. 9G). También se generaron células HCT116 POLR2Apérd¡da y POLR2Aneutro que expresan ARNhc de POLR2A inducible por Dox. El aumento de las concentraciones de Dox redujo gradualmente la expresión de POLR2A. Mientras que una dosis baja de Dox (100 ng ml-1) fue suficiente para destruir notablemente las células POLR2Apérd¡da, las dosis altas de Dox solo tuvieron efectos mínimos sobre las células POLR2Aneutro (FIG. 2I, 2J y 9H).
Ejemplo 3 - La sensibilidad de células POLR2Apérdida a la inhibición de POLR2A es independiente de p53
El bloqueo de la ARN polimerasa puede conducir a la acumulación y activación de p53 (Derheimer et al., 2007). Para examinar los efectos de p53 en la respuesta celular a la inhibición de POLR2A, se recapituló la deleción concomitante de TP53 y POLR2A en las líneas celulares HCT116 y xhCRC (FIG. 3A y 10A-10C). La línea celular xhCRC (TP53+1+;POLR2A+/+) se estableció a partir de un tumor colorrectal humano xenoinjertado recientemente aislado, que demostró una tumorigenicidad mejorada in vivo (Lu et al., 2013). Excepto por una proliferación celular ligeramente aumentada, no se observaron cambios significativos en su sensibilidad a la a-Amanitina en las células xhCRC y HCT116 con deleción hemicigótica de TP53. Por el contrario, la pérdida hemicigótica de POLR2A sensibilizó notablemente estas células al tratamiento con a-Amanitina independientemente del estado de TP53 FIG. 3B, 3C, y 10D-10F). La ARN polimerasa II se encarga de la síntesis de ARNm, una función esencial para cualquier tipo de células, incluidas las células tumorales resistentes a terapia. Se examinó la sensibilidad a fármacos de células POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da a tres fármacos de quimioterapia principales para el cáncer colorrectal (5-fluorouracilo (5-FU), oxaliplatino y SN-38). La inhibición de POLR2A por a-Amanitina mejoró significativamente los efectos de destrucción celular de los tres fármacos en las células de xhCRC POLR2Apérd¡da, pero no tuvo efectos notables en las células POLR2Aneutro (FIG. 3D), lo que sugiere vulnerabilidad terapéutica de tumores colorrectales POLR2Apérd¡da en la terapia del cáncer. La a-amanitina libre es tóxica para el hígado porque se une específicamente mediante OATP1B3, un transportador expresado exclusivamente en la membrana de los hepatocitos (Letschert et al., 2006). Sin embargo, a-Amanitina, cuando se conjuga con anticuerpos específicos, ya no es un sustrato para OATP1B3 (Letschert et al., 2006; Moldenhauer et al., 20l2; Faulstich y Fiume, 1985). Esta estrategia supera la toxicidad de la a-Amanitina para aplicaciones clínicas. Se utilizó a-Amanitina conjugada con un anticuerpo monoclonal (HEA125) contra EpCAM (ama-HEA125), un antígeno del cáncer sobreexpresado en la mayoría de los adenocarcinomas (Moldenhauer et al., 2012; Went et al., 2004). El conjugado ama-HEA125 destruyó selectivamente las células cancerosas POLR2Apérd¡da xhCRC y HCT116 de una manera independiente de p53 y redujo las dosis eficaces de a-Amanitina en al menos 10.000 veces (CI50 ~ 0,01 ng ml-1) in vitro (FIG. 3E y 10G).
Ejemplo 4 - La supresión de POLR2A inhibe selectivamente el crecimiento tumoral POLR2Apérdida
Para probar el efecto antitumoral de la inhibición de POLR2A in vivo, se inyectaron células HCT116 y SNU283 que expresan ARNhc de POLR2A inducible por Dox por vía subcutánea en ratones SCID BALB/c inmunodeprimidos. Después del establecimiento inicial del tumor, la administración de Dox en agua potable suprimió la expresión de POLR2A y, en consecuencia, inhibió el crecimiento de tumores procedentes de SNU283 (FIG. 4A). Sin embargo, no se observaron diferencias sustanciales entre los tumores de control y los procedentes de HCT116 con atenuación de POLR2A. Los análisis histopatológicos demostraron que los tumores SNU283 con atenuación de POLR2A (Dox: 1,0 jg ml-1) tenían una proliferación celular significativamente reducida (tinción Ki67), pero más células apoptóticas (tinción con caspasa-3 escindida), en comparación con los tumores de control correspondientes (FIG. 11A-11B). Por el contrario, no se observaron cambios significativos en los tumores HCT116 de control o con atenuación de POLR2A. Sin embargo, la deleción heterocigótica de POLR2A sensibilizó tumores procedentes de HCT116 POLR2A+/- a la supresión del ARNhc de POLR2A inducible por Dox (FIG. 11C). A continuación, se empleó un modelo de tumor ortotópico para probar el efecto de la inhibición de POLR2A. Se inyectaron células HCT116 POLR2Aneutro y POLR2Apérd¡da en la pared cecal de ratones SCID. Una vez que se establecieron los tumores ortotópicos, a los ratones se les administró Dox (1,0 jg ml-1) en el agua potable. Las imágenes bioluminiscentes in vivo de tumores demostraron que la inhibición de POLR2A inducida por Dox condujo a una disminución significativa en la cinética de crecimiento tumoral en tumores POLR2Apérd¡da, pero no en tumores POLR2Aneutro de control FIG. 4B-C). Después de 3 semanas de tratamiento con Dox, los tumores macroscópicos fueron visibles en el grupo tumoral POLR2Aneutro, mientras que se observó un crecimiento tumoral significativamente reducido o no se observó ningún tumor visible en el grupo POLR2Apérd¡da Para probar además la eficacia del silenciamiento de POLR2A in vivo, se utilizó una plataforma de administración nanoliposomal, DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina), para la administración sistémica de ARNip de POLR2A (Pecot et al., 2014). Dos ARNip de POLR2A específicos tenían más de un 80 % de atenuación de la proteína POLR2A en líneas celulares HCT116 isogénicas (FIG. 12A). Diez días después de la inyección ortotópica de 1,0 x 106 células HCT116 isogénicas, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento (n = 10 ratones/grupo). Se inició el tratamiento dos veces por semana de ARNip incorporados en nanoliposomas DOPC (FIG.
12B). Después de cuatro semanas de terapia sistémica, en comparación con el tratamiento de control ARNip-DOPC, los ratones en los grupos de tratamiento de 125 |jg kg-1 de ARNip de POLR2A-DOPC tuvieron una reducción pronunciada del crecimiento de tumores POLR2Apérd¡da, mientras que los tumores POLR2Aneutro solo tuvieron una inhibición significativa del crecimiento a la dosis de 1.000 jg kg-1 de ARNip de POLR2A-DOPC (FIG. 12C-F).
El conjugado ama-HEA125 exhibió un alto nivel de selectividad en las células cancerosas POLR2Apérd¡da in vitro (FIG.
3E y 10G). A continuación, se investigó la actividad antitumoral de ama-HEA125 en modelos de tumores ortotópicos establecidos por pares isogénicos de células TP53/POLR2Aneutro y TP53/POLR2Apérd¡da xhCRC y HCT116 (FIG. 4D-4E y 13A-13B). En un experimento con aumento escalonado de la dosis, se administró ama-HEA125 a los ratones portadores de tumores como inyecciones intraperitoneales duales a la dosis de 3, 10, 30 o 90 jg con respecto a a-Amanitina por kg de peso corporal del ratón (n = 10 ratones por grupo). Los ratones de control recibieron AcM HEA125 no conjugado (n = 10 ratones). En los ratones que portaban tumores POLR2Apérd¡da, los ratones de control tratados con HEA125 mostraron un crecimiento tumoral continuo dentro de los 25 días posteriores a la inyección del anticuerpo. El tratamiento con ama-HEA125 mostró una fuerte inhibición del crecimiento tumoral incluso a la dosis más baja de 3 jg kg-1. Todos los tumores POLR2Apérd¡da respondieron al tratamiento con ama-HEA125 y el volumen del tumor retrocedió notablemente (FIG. 4D-4E). Se observó una regresión tumoral completa en 10 de 10 (90 jg kg-1), 8 de 10 (30 jg kg-1) y 6 de 10 (10 jg kg-1) ratones que portaban tumores POLR2Apérd¡da HCT11625 días después de la primera administración de ama-HEA125 (FIG. 4D). Por el contrario, se observó una inhibición tumoral significativa en los ratones que portaban tumores POLR2Aneutro solo a la dosis más alta de 90 jg kg-1, pero no en las dosis de 3-30 jg kg-1. Se observaron resultados similares en los ratones que portaban tumores procedentes de xhCRC (FIG. 4E). Consistente con estudios previos (Moldenhauer et al., 2012), el tratamiento con ama-HEA125 a las dosis probadas no tuvo una toxicidad notable in vivo. El análisis de los pesos corporales y las enzimas hepáticas en sangre no reveló diferencias sustanciales entre el grupo tratado con ama-HEA125 y el grupo tratado con HEA125 de control (FIG. 13C y 13D), lo que sugiere una toxicidad sistémica insignificante del conjugado ama-HEA125. Además, la actividad antitumoral de ama-HEA125 se probó adicionalmente en tumores ortotópicos procedentes de células SW480 POLR2Aneutro y células SW837 POLR2Apérd¡da (FIG. 14A-14F). El tratamiento con ama-HEA125 a una dosis de 10 jg kg-1 fue suficiente para inhibir el crecimiento tumoral en todos los tumores POLR2Apérd¡da, mientras que tumores POLR2Aneutro (SW480) o POLR2Apérd¡da con POLR2A reintroducido (SW837 que expresa POLR2A exógeno) solo fueron inhibidos significativamente por ama-HEA125 a la dosis de 90 jg kg-1.
Todas los métodos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden realizarse y ejecutarse sin excesiva experimentación a la luz de la presente divulgación. Si bien las composiciones y los métodos de la presente invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la materia que se pueden aplicar variaciones en los métodos y en las etapas o en el orden de las etapas del método descrito en el presente documento. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que estén relacionados química y fisiológicamente pueden sustituir a los agentes descritos en este documento, y obtenerse los mismos resultados o resultados similares.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para usar en el tratamiento de un paciente que tiene un cáncer, en donde se han analizado células del cáncer para: (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de expresión de referencia, comprendiendo la composición una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de POLR2A,
en donde el inhibidor de POLR2A comprende una amatoxina y en donde la amatoxina se conjuga con un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor.
2. La composición para usar de la reivindicación 1, en donde la amatoxina es alfa-amanitina.
3. La composición para usar de la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión de referencia es un nivel de expresión en células no cancerosas.
4. La composición para usar de la reivindicación 1, en donde las células cancerosas exhiben una pérdida hemicigótica del gen TP53 o una pérdida hemicigótica del gen POLR2A.
5. La composición para usar de la reivindicación 1, en donde el paciente tiene células cancerosas que exhiben un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de expresión de referencia.
6. La composición para usar de la reivindicación 1, en donde las células cancerosas son células de cáncer de pulmón, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de próstata o cáncer de páncreas.
7. La composición para usar de la reivindicación 1, en donde las células cancerosas son metastásicas, recurrentes o resistentes a múltiples fármacos.
8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usar en un método de tratamiento de un paciente que tiene cáncer, que comprende:
(a) seleccionar un paciente determinado que tiene células cancerosas que comprenden (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia; y
(b) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de POLR2A,
en donde el inhibidor de POLR2A comprende una amatoxina y en donde la amatoxina se conjuga con un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor.
9. Un método in vitro de selección de una terapia farmacológica para un paciente con cáncer, que comprende: (a) detectar, en una muestra del cáncer, la presencia de (i) una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; o (iii) un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia en las células del cáncer; y
(b) seleccionar un inhibidor de POLR2A si (i) se detecta una pérdida hemicigótica del gen TP53; (ii) se detecta una pérdida hemicigótica del gen POLR2A; o (iii) se detecta en las células del cáncer un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A con respecto a un nivel de referencia,
en donde el inhibidor de POLR2A comprende una amatoxina y en donde la amatoxina se conjuga con un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor.
10. El método de la reivindicación 9, en donde células del cáncer comprenden una pérdida hemicigótica del gen TP53 o una pérdida hemicigótica del gen POLR2A.
11. El método de la reivindicación 9, en donde células del cáncer comprenden un nivel de expresión reducido de un producto génico de POLR2A en relación con un nivel de referencia.
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