KR20170125954A - Tp53의 반접합성 손실을 지닌 암을 치료하는 방법 - Google Patents

Tp53의 반접합성 손실을 지닌 암을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

(i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 및/또는 (iii) 참조(즉, 대조군) 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 나타내는 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 및/또는 (iii) 참조(즉, 대조군) 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 갖거나 이들을 갖는 것으로 측정된 환자에게 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제(예를 들면, POLR2A 단백질, 아마톡신, 알파-아마니틴, 또는 세포 표적화 모이어티에 접합된 알파-아마니틴의 발현을 억제하는 핵산, 예를 들면, EpCAM 항체)를 투여함을 포함한다.

Description

TP53의 반접합성 손실을 지닌 암을 치료하는 방법
본 출원은 2015년 3월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 제62/128,480호에 대한 우선권 이익을 주장하고, 이의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 제R01 CA136549호 및 제U54 CA151668호 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 소정 권한을 갖는다.
1. 본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 의학 및 암 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이는 TP53의 반접합성 손실을 지닌 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 설명
익히 공지되어 있는 종양 억제 유전자인 TP53은 흔히 대다수의 사람 종양에서의 돌연변이 또는 결실에 의해 불활성화된다(Petitgean et al., 2007; Vazquez et al., 2008). 암 치료요법에서 p53 활성을 회복시키기 위한 엄청난 노력이 이루어져 왔다(Chene, 2003; Wade et al., 2013). 야생형 p53을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 치료요법이 몇몇의 임상학적 시도에서 활성을 나타낸 반면, 모든 종양 세포에의 가변성 및 불충분한 유전자 전달 및 아데노바이러스에 대한 숙주 항체의 존재는 이의 임상학적 사용을 제한하였다(Lane et al., 2010; Haupt and Haupt, 2004). p53 활성을 증가시키는 다수의 작은 화학적 화합물도 개발되어 왔다. 그러나, 이들은 야생형 p53을 보유하는 사람 암에서만 적용될 수 있다(Cheok et al., 2011; Goldstein et al., 2011). 그러나, 효과적인 p53-기반의 치료요법은 p53 조절인자의 복잡성(complexity) 및 이들의 열악한 약효성(drugability)으로 인하여 임상학적 암 치료로 성공적으로 옮겨지지 않았다. 이와 같이, p53-결핍 암을 치료하기위한 새로운 전략이 필요하다.
본 발명의 요약
몇몇의 실시형태들에서, (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 및/또는 (iii) 참조 발현 수준(예를 들면, 비-암성 샘플에서의 발현 수준)에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 나타내는 암 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이러한 환자에게 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제를 투여함을 포함하는, 방법이 제공된다. 소정 양상들에서, 상기 환자는 TP53 유전자의 반접합성 손실을 나타내는 암 세포를 갖는다. 소정 양상들에서, 상기 환자는 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 나타내는 암 세포를 갖는다. 소정 양상들에서, 상기 환자는 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 나타내는 암 세포를 갖는다.
소정 양상들에서, POLR2A 억제제는 POLR2A 단백질의 발현을 억제하는 핵산을 포함한다. 소정 양상들에서, POLR2A 억제제는 알파-아마니틴을 포함한다. 몇몇의 양상들에서, 알파-아마니틴은 항체, 예를 들면, 암 세포를 표적으로 하는 항체(예를 들면, 종양-관련 항원 항체)에 접합된다. 몇몇의 양상들에서, 상기 항체는 EpCAM-특이적 항체일 수 있다.
소정 양상들에서, POLR2A 유전자 생성물은 mRNA이다. mRNA의 발현 수준은 노던 블롯팅(Northern blotting), 역 전사-정량적 실시간 PCR(RT-qPCR), 뉴클레아제 보호, 전사체 분석, 하이브리드화 검정, 칩-기반 발현 플랫폼 또는 인베이더(invader) RNA 검정 플랫폼에 의해 측정될 수 있다. 소정 양상들에서, POLR2A 유전자 생성물은 단백질이다. 단백질의 발현 수준은 질량 분광측정법, 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침전, 면역조직화학, 또는 방사선 면역검정에 의해 측정될 수 있다. 소정 양상들에서, 게놈 카피 수는 TP53 유전자의 반접합성 손실 또는 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 측정하기 위해 검출된다. 소정 양상들에서, 게놈 카피 수는 게놈 하이브리드화 기술(예를 들면, FISH 분석), PCR 분석(예를 들면, 실시간 PCR) 또는 제한 단편 분석에 의해 측정된다.
소정 양상들에서, 상기 암은 폐암, 뇌암, 유방암, 간암, 난소암, 결장직장암, 전립선암 또는 췌장암이다. 소정 양상들에서, 상기 암은 전이성, 재발성 또는 다중-약물 내성이다.
소정 양상들에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 적어도 제2 항암 치료요법을 투여함을 추가로 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 제2 항암 치료요법은 수술 치료요법, 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 냉동 치료요법, 호르몬 치료요법, 독소 치료요법, 면역 치료요법 또는 사이토카인 치료요법이다. 소정 양상들에서, 상기 화학 치료요법은 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 SN-38이다.
소정 양상들에서, 상기 환자는 사람이다. 소정 양상들에서, 상기 환자는 비-사람 포유동물이다.
소정 양상들에서, 상기 환자는 적어도 2회 치료된다. 소정 양상들에서, 상기 환자는 1주 내지 6개월의 기간에 걸쳐 치료된다. 소정 양상들에서, 상기 환자는 이전에 적어도 1회의 항암 치료요법을 경험하였다.
몇몇의 실시형태들에서, (a) (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 및/또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는 암 세포를 갖는 것으로 측정된 환자를 선택하는 단계; 및 (b) 상기 환자에게 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
소정 양상들에서, 환자를 선택함은 암의 샘플을 수득하고 암의 세포가 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 및/또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는지를 측정함을 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 방법은 상기 측정의 리포트를 제공함을 추가로 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 리포트는 서면 또는 전자 리포트이다. 소정 양상들에서, 상기 리포트는 환자, 건강 관리비 지불인, 의사, 보험 대리점 또는 전자 시스템에 제공된다.
소정 양상들에서, 환자를 선택함은 상기 암의 세포가 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 및/또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는지를 측정하는 시험에 대한 결과를 수득함을 포함한다.
소정 양상들에서, 상기 암의 세포는 TP53 유전자의 반접합성 손실을 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 암의 세포는 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 암의 세포는 참조 발현 수준(예를 들면, 비-암성 샘플에서의 발현 수준)에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함한다.
몇몇의 실시형태들에서, 암 환자에 대한 약물 치료요법을 선택하는 방법으로서, (a) 상기 암의 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 암의 세포에서 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현의 존재를 검출하는 단계; 및 (c) 상기 암의 세포에서 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실이 검출되거나; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실이 검출되거나; 및/또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현이 검출되는 경우에 POLR2A 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, 암 환자에 대한 약물 치료요법을 선택하는 방법이 제공된다.
소정 양상들에서, 상기 방법은 상기 환자에게 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제를 투여함을 추가로 포함한다.
소정 양상들에서, 상기 암의 세포는 TP53 유전자의 반접합성 손실을 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 암의 세포는 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 암의 세포는 참조 발현 수준(예를 들면, 비-암성 샘플에서의 발현 수준)에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함한다.
몇몇의 실시형태들에서, 대상체에서의 암의 치료에 사용하기 위한 POLR2A 억제제를 포함하는 조성물로서, 상기 암의 세포는 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준(예를 들면, 비-암성 샘플의 세포에서의 발현 수준)에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는 것으로 측정된, 대상체에서의 암의 치료에 사용하기 위한 POLR2A 억제제를 포함하는 조성물이 제공된다.
몇몇의 실시형태들에서, 암의 치료를 위한 의약의 제조시 POLR2A 억제제의 용도로서, 상기 암의 세포는 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준(예를 들면, 비-암성 샘플의 세포에서의 발현 수준)에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는 것으로 측정된, 암의 치료를 위한 의약의 제조시 POLR2A 억제제의 용도가 제공된다.
본원에서 사용되는 특정 구성성분에 관하여 "필수적으로 포함하지 않는"은 본원에서 특정 구성성분들 중 의도적으로 제형화되었고/되었거나 단지 오염물질로서 또는 미량으로 존재하는 구성성분은 없음 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도되지 않은 오염물질로부터 초래되는 특정 구성성분의 총량은 0.05% 미만이고, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 표준 분석 방법으로 특정 구성성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본 명세서에 사용된 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 "한" 또는 "하나"는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 본 개시는 단지 대안 및 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지하지만, 대안만을 나타내거나 대안이 상호 배타적인 것으로 명확히 나타내어지지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 사용되는 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 출원에 걸쳐서, 용어 "약"은 하나의 값은 장치에 대한 오차의 고유한 편차, 상기 값을 결정하기 위해 사용된 방법 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 편차를 포함함을 나타내는 것으로 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 명백해질 것이다. 그러나, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 구체적 실시예는, 본 발명의 사상 및 범위 이내의 각종 변화 및 변형은 이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당해 분야 숙련가들에게 명백해질 것이므로, 본 발명의 바람질한 실시형태들을 나타내는 한편 단지 설명의 방식으로 제공됨이 이해되어야만 한다.
하기 도면은 본 명세서의 부분을 형성하고, 본 발명의 소정 양상들을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 실시형태들의 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 하나 이상을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1h. POLR2A의 발현은 유전자 카피 수와 상호 관련되어 있지만, TP53은 그렇지 않다. (도 1a) TCGA 데이터베이스의 분석은 각종 사람 암에서의 TP53 유전자좌의 반접합성 결실의 빈도를 보여준다. (도 1b) 사람 게놈에서의 TP53에 인접한 유전자의 도식적 다이아그램. (도 1c) TP53의 반접합성 결실을 지닌 결장직장 종양에서의 POLR2A의 부수적 결실. (도 1d) POLR2A 카피 수 대 TCGA에서의 임상학적 결장직장 종양 및 CCLE에서의 암 세포주에 대한 mRNA 발현의 분산도. 선형 회귀 및 피어슨 상호관계 계수(r)가 나타내어진다. (도 1e) 매칭된 정상 및 CRC 조직 샘플에서의 POLR2A 단백질 수준(중성 또는 반접합성-손실 POLR2A)의 정량화. (도 1f) 사람 CRC 세포주에서의 POLR2A 및 TP53의 카피 수 편차. 좌측 컬럼은 TP53이고; 우측 컬럼은 POLR2A이다. (도 1g) CRC 세포주에서의 POLR2A의 상대적 발현 수준(HCT116에 대해 정규화됨). (도 1h) CRC 세포주에서의 POLR2A, p53 및 β-액틴의 단백질 수준.
도 2a 내지 도 2j. POLR2A 손실 세포는 POLR2A 억제에 고도로 민감성이다. (도 2a) POLR2A손실 세포(SW837, SNU283)는 POLR2A중성 세포보다 α-아마니틴 치료에 대해 현저히 더 민감성이다. 세포의 크리스탈 바이올렛 염색이 나타내어진다. (도 2b) α-아마니틴 치료를 이용한 POLR2A중성 및 POLR2A손실 세포의 세포 증식. (도 2c) POLR2A의 Dox-유도된 억제는 SNU233 세포의 증식을 억제하였지만, HCT116 세포의 증식은 억제하지 않았다. (도 2d) Dox-유도가능한 POLR2A shRNA를 발현하는 HCT116 및 SNU283 세포에서의 POLR2A mRNA 발현과 세포 증식 사이의 상호 관계. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. 좌측 컬럼은 POLR2A mRNA이고; 우측 컬럼은 증식이다. (도 2e 및 도 2f) 증가하는 양의 PORL2A 발현 벡터 DNA를 이용한 형질감염 후 증가하는 용량의 α-아마니틴에 대한 반응으로의 SUN283 및 SW837 세포의 생존 곡선. (도 2g) POLR2A손실 HCT116 세포는 모 POLR2A중성 HCT116 세포보다 α-아마니틴 치료에 대해 현저히 더 민감성이다. 세포의 크리스탈 바이올렛 염색이 나타내어진다. (도 2h) α-아마니틴으로 치료된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포의 세포 증식. (도 2i 및 도 2j) POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포에서의 POLR2A mRNA 발현과 세포 증식(도 2i; 좌측 컬럼은 POLR2A mRNA이고; 우측 컬럼은 증식이다) 또는 아폽토시스(apoptosis)(도 2j: 좌측 컬럼은 shCtrl이고; 중간 컬럼은 shRNA-1이고; 우측 컬럼은 shRNA-2이다) 사이의 상호관계. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3e. POLR2A 억제에 대한 POLR2A손실 세포의 민감도는 p53과 무관하다. (도 3a) 동종동계(isogenic) 사람 원발성 결장직장암 xhCRC 세포주의 패널에서의 POLR2A, p53, EpCAM 및 β-액틴의 단백질 수준. (도 3b) POLR2A중성 및 POLR2A손실 xhCRC 세포의 성장 곡선. (도 3c) α-아마니틴으로 치료된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 xhCRC 세포의 세포 증식. (도 3d) α-아마니틴 치료의 존재 또는 부재 하에 병용된 5-FU, 옥살리플라틴(Oxa) 또는 SN-38 치료에 대한 POLR2A중성 및 POLR2A손실 xhCRC 세포의 민감도. (도 3e) 각종 농도로의 ama-HEA125(항-EpCAM) 항체-약물 접합체로 치료된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 xhCRC 세포의 세포 증식.
도 4a 내지 도 4e. POLR2A의 억제는 POLR2A손실 종양 성장을 선택적으로 억제한다. (도 4a) 피하 이식된 HCT116(1 x 106 세포) 및 SNU283(2 x 106 세포) 세포로부터 유도된 이종이식편 종양의 성장 곡선. 상기 세포주 둘 다는 대조군 또는 Dox-유도가능성 POLR2A shRNA를 발현한다. 초기 종양(100㎣)의 확립 후, 음용수 중의 1㎍ ml-1의 Dox로 마우스를 치료하였다. n = 그룹당 5마리의 마우스. (도 4b 및 도 4c) Dox-유도가능한 대조군 또는 POLR2A shRNA를 발현하는 정위적으로(orthotopically) 이식된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포(1 x 106 세포가 주사됨)로부터 유도된 이종이식편 종양(도 4b)의 종양 성장 곡선. 초기 종양의 확립 후, 음용수 중의 1㎍ ml-1의 Dox로 마우스를 치료하였다. 종양 중량(도 4c)을 측정하였다(n = 그룹당 5마리의 마우스). **p < 0.01. (도 4d 및 도 4e) 항-EpCAM 항체(3.6mg kg-1) 또는 ama-HEA125 항체-약물 접합체(3, 10, 30 및 90㎍ kg-1, 0.12, 0.4, 1.2 및 3.6mg의 IgG kg-1에 상당함)의 이중 복강내 주사를 투여받은 정위적으로 이식된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116(도 4d; 1.0 x 106 세포가 주사됨) 또는 xhCRC(도 4e; 0.5 x 106 세포가 주사됨) 세포로부터 유도된 이종이식된 종양의 종양 성장 곡선. n = 그룹당 10마리의 마우스.
도 5a 내지 도 5b. POLR2A의 발현은 사람 결장 종양에서의 이의 유전자 카피 수와 상호관련되어 있다. 염색체 17 동원체(centromere)에 대한 프로브 및 POLR2A에 대한 유전자좌-특이적 프로브를 이용하여 2색 FISH 분석을 수행하였다. POLR2A 유전자의 반접합성 손실이 측정되었고, 그 결과는 표 2에 나타낸다. (도 5a) 사람 결장 정상 POLR2A-중성 또는 -손실 종양 조직 샘플에서의 POLR2A 발현의 정량. 오차 막대, s.d. (도 5b) 매칭된 정상 및 CRC 조직 샘플에서의 POLR2A 및 β-액틴의 단백질 수준.
도 6a 내지 도 6c. TP53의 발현은 이의 유전자 카피 수와 관련되어 있지 않다. (도 6a 및 도 6b) TP53 카피 수 대 TCGA 데이터베이스의 결장직장 종양에서의 단백질 발현(도 6a) 또는 mRNA 발현(도 6b)의 분산도. 피어슨 상호관계 계수(r) 및 p 값이 나타내어진다. (도 6c) 결장직장 암 세포주에서의 TP53의 상대적 mRNA 발현(HCT116 세포주에서의 발현에 대해 정규화됨). 데이터는 3회의 독립적 실험들의 평균 및 s.d.이다.
도 7a 내지 도 7g. POLR2A 손실 세포는 POLR2A 억제에 대해 고도로 민감성이다. (도 7a) 악티노마이신 D로 치료된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 세포의 세포 증식. (도 7b) HCT116, SW480, SW837 및 SNU283 세포에서의 POLR2A-특이적 shRNA의 녹다운 효능. (도 7c) 4개의 결장직장암 세포주의 증식에 대한 POLR2A 녹다운의 효과. GFP 및 대조군 또는 POLR2A-특이적 shRNA를 발현하는 세포들을 분류하였고, 대조군 GFP-음성 세포와 혼합하였고(1:1), GFP 양성 세포를 계대 2, 4, 및 6에서 정량하였다. **p < 0.01, ns: 유의하지 않음. (도 7d) Dox-유도가능한 POLR2A shRNA를 발현하는 HCT116 및 SNU283 세포에서의 POLR2A 및 β-액틴의 단백질 수준(1.0㎍ ml-1 Dox). (도 7e) 300ng ml-1 Dox의 존재 하에 Dox-유도가능한 POLR2A shRNA를 발현하는 HCT116 및 SNU283 세포의 세포 증식. **p < 0.01. (도 7f 및 도 7g) 대조군 또는 POLR2A shRNA-발현 HCT116 및 SNU283 세포의 주기 프로파일(도 7f; 각각의 컬럼의 상단 부분은 G2/M이고; 각각의 컬럼의 중간 부분은 S이고; 각각의 컬럼의 하단 부분은 G0/G1이다) 및 아폽토시스(도 7g). **p < 0.01. 데이터는 3회의 독립적 실험들의 평균 및 s.d.이다.
도 8a 내지 도 8b. POLR2A의 이소성 발현은 α-아마니틴 치료에 대한 POLR2A 손실 세포의 내성을 회복시킨다. (도 8a) 증가하는 양의 외인성 POLR2A를 발현하는 SNU283 및 SW837 세포에서의 POLR2A 및 β-액틴의 단백질 수준. (도 8b) 증가하는 양의 POLR2A 발현 벡터 DNA로의 형질감염 후 증가하는 용량의 α-아마니틴으로 치료된 SNU283 및 SW837 세포의 크리스탈 바이올렛 염색.
도 9a 내지 도 9h. POLR2A 의 단일-대립유전자 녹아웃은 HCT116 세포를 POLR2A 억제에 대해 감작화시킨다 . (도 9a) POLR2A 유전자에서의 Cas9/sgRNA-표적화 부위의 도식적 도해. 2개의 sgRNA-표적화 서열이 나타내어지고(화살표는 방향성을 나타내고; 서열은 서열번호 25 내지 서열번호 26으로서 제공된다), 프로토스페이서-인접 모티프(PAM: protospacer-adjacent motif) 서열은 각각의 서열의 마지막 3개의 뉴클레오타이드이다. (도 9b) 서베이어(Surveyor) 검정에 의해 측정된 HCT116 세포에서의 POLR2A의 Cas9-매개된 절단의 효능. (도 9c) 콜로니 14 및 5의 세포에서의 돌연변이 POLR2A 대립유전자의 서열(서열은 서열번호 27 내지 서열번호 30으로서 제공된다). (도 9d) POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포에서의 POLR2A 및 β-액틴의 단백질 수준. (도 9e) POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포의 성장 곡선. (도 9f) 악티노마이신 D로 치료된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 세포의 상대적 증식. (도 9g) POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포에 대한 POLR2A 녹다운의 효과. 실험은 도 7c에 기술된 바와 같이 수행하였다. **p < 0.01, ns: 유의하지 않음. (도 9h) POLR2A의 Dox-유도된 부분적 억제는 POLR2A손실 HCT116 세포의 성장을 억제시켰지만, 모 POLR2A중성 HCT116 세포의 성장은 억제시키지 않았다. 데이터는 3회의 독립적 실험들의 평균 및 s.d.이다.
도 10a 내지 도 10g. POLR2A 억제에 대한 POLR2A 손실 세포의 민감도는 p53과 무관하다. (도 10a) TP53 유전자의 Cas9/sgRNA-표적화 부위의 도식적 도해. 2개의 sgRNA-표적화 서열이 나타내어지고(화살표는 방향성을 나타내고; 서열은 서열번호 31 내지 서열번호 32로서 제공된다), PAM 서열은 각각의 서열의 마지막 3개의 뉴클레오타이드이다. (도 10b) 서베이어 검정에 의해 측정된 HCT116 세포에서의 TP53의 Cas9-매개된 절단의 효능. (도 10c) 동종동계 HCT116 세포의 패널에서의 POLR2A, p53 및 β-액틴의 단백질 수준. (도 10d) POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포의 성장 곡선. (도 10e 및 도 10f) α-아마니틴 치료 후 POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포의 크리스탈 염색 화상(도 10e) 및 세포 생존 곡선(도 10f). (도 10g) ama-HEA125의 치료에 대한 반응으로의 POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포의 세포 생존 곡선.
도 11a 내지 도 11c. POLR2A의 용량-의존적 억제는 POLR2A 손실 에서의 종양원성을 억제하지만, POLR2A 중성 종양에서는 그렇지 않다. (도 11a) 대조군 또는 POLR2A shRNA를 발현하는 피하 이종이식된 HCT116 및 SNU283 종양에서의 POLR2A mRNA 발현 수준의 정량(n = 그룹당 5마리의 마우스). **p < 0.01. (도 11b) 면역조직화학 염색에 의해 필드당 Ki67(세포 증식) 또는 절단된 카스파제-3(아폽토시스) 및 POLR2A 발현에 대해 양성인 세포를 정량하였다. **p < 0.01. 데이터는 평균 및 s.d.이다. (도 11c) 피하 이식된 POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포(1 x 106 세포가 주사됨)로부터 유도된 이종이식편 종양의 종양 크기의 정량. 상기 세포주 둘 다는 대조군 또는 Dox-유도가능한 POLR2A shRNA를 발현한다. 초기 종양(100㎣)의 확립 후, 음용수 중의 (0.5, 1, 및 2㎍ ml-1) Dox로 마우스를 치료하였다. n = 그룹당 5마리의 마우스. 데이터는 평균 및 s.d.이다.
도 12a 내지 도 12f. DOPC-캡슐화된 POLR2A siRNA를 이용한 POLR2A의 억제는 POLR2A 손실 종양의 성장을 억제한다. (도 12a) HCT116 세포에서의 대조군 siRNA 또는 POLR2A siRNA(#1 및 #2)의 형질감염 후 POLR2A 및 액틴에 대한 웨스턴 블롯. (도 12b) HCT116 세포의 정위 주사(1 x 106 세포)에 이어지는 DOPC 나노리포솜 치료 간격의 도식적 도해. (도 12c 및 도 12d) 대조군(1,000㎍ kg-1) 또는 POLR2A siRNA(125, 250, 500 및 1,000㎍ kg-1)의 복강내 주사를 매주 2회 투여받은 POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포로부터 유도된 정위 이종이식편의 종양 성장 곡선(도 12c는 siPol2-1이고; 도 12d는 siPol2-2이다). n = 그룹당 10마리의 마우스. (도 12e 및 도 12f) 대조군 또는 POLR2A siRNA 치료 후 이종이식편 종양에서의 POLR2A 및 β-액틴의 대표적 단백질 수준(도 12e는 siPol2-1이고; 도 12f는 siPol2-2이다).
도 13a 내지 도 13d. POLR2A의 억제는 POLR2A 손실 종양 성장을 선택적으로 억제한다. (도 13a 및 도 13b) 정위 이식된 HCT116(도 13a) 및 xhCRC(도 13b) 종양의 종양 중량을 측정하였다(n = 그룹당 10마리의 마우스). (도 13c 및 도 13d) 체중(도 13c) 및 말초혈에서의 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 알칼리성 포스파타제를 포함하는 간 효소(도 13d)를 방법에 기술된 바와 같이 기록하였다. 나타낸 데이터는 각각의 그룹에서의 5마리 마우스의 평균이다.
도 14a 내지 도 14f. ama-HEA125에 의한 POLR2A의 억제는 POLR2A 손실 종양의 성장을 억제한다. (도 14a, 도 14c 및 도 14e) HCT116(도 14a), SW480(도 14c) 또는 SW837(도 14e) 세포에서의 POLR2A 및 β-액틴의 단백질 수준. 이들 세포주는 POLR2A-중성, POLR2A-손실 또는 POLR2A-회복이다. (도 14b, 도 14d 및 도 14f) 명시된 상응하는 세포로부터 유도된 정위 이종이식편 종양의 종양 성장 곡선. 이들 전부는 항-EpCAM 항체(3.6mg kg-1) 또는 ama-HEA125 항체-약물 접합체(10 및 90㎍ kg-1, 0.4 및 3.6mg IgG kg-1에 상응함)의 이중 복강내 주사를 투여받았다. n = 그룹당 10마리의 마우스.
본원에 제공되는 연구는, TP53의 게놈 결실이 흔히 이웃하는 필수 유전자를 포함하고, 이는 반접합성 TP53 결실을 갖는 암 세포가 이러한 유전자의 추가의 억제에 취약하게 만듬을 입증한다. POLR2A는, 다수의 유형의 사람 암에서 사실상 TP53과 공동-결실되는 필수적인 하우스-키핑(house-keeping) 유전자로서 확인된다. 이는 α-아마니틴에 의해 특이적으로 억제되는 RNA 폴리머라제 II 복합체의 가장 큰 촉매 서브유닛을 암호화한다(Bensaude, 2011; Lindell et al., 1970). 이와 같이, p53 또는 이의 조절인자의 약리학적 개재 대신에, POLR2A 억제에 대한 부수적 인 취약성의 원칙은 암 치료요법에 대한 새로운 전략을 제공한다.
The Cancer Genome Atlas(TCGA) 및 Cancer Cell Line Encyclopaedia(CCLE)의 임상학적 샘플 및 암 세포주의 본 발명의 분석은 POLR2A 발현 수준이 사람 결장직장 종양에서의 유전자 카피 수와 밀접하게 상호관련되어 있음을 보여준다. α-아마니틴, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 또는 짧은-헤어핀 RNA(short-hairpin RNA)를 이용한 POLR2A의 억제는 p53-독립적 방식으로 반접합성 TP53 손실을 갖는 결장직장암 세포의 증식, 생존 및 종양원성 잠재력을 선택적으로 억제하였다. 또한, α-아마니틴을 이용한 본 발명의 전임상학적(preclinical) 연구는 결장직장암을 치료하기 위한 α-아마니틴-기반 약물 또는 POLR2A에 대한 억제제의 치료학적 효능을 예측하고, TP53의 반접합성 손실을 갖는 다수의 유형의 사람 암에 적용가능해야만 한다.
α-아마니틴의 이전의 임상학적 적용은 이의 간 독성으로 인하여 제한되어 왔다(Letschert et al., 2006). 유리 α-아마니틴은 간세포의 막(membrane) 상에서만 발현되는 운반체(transporter)인 OATP1B3에 의해 특이적으로 결합되므로 간에 독성이다(Letschert et al., 2006). 그러나, α-아마니틴은 특정 항체와 접합되는 경우에 더 이상 OATP1B3에 대한 기질이 아니다(Letschert et al., 2006; Moldenhauer et al., 2012; Faulstich and Fiume, 1985). 여기서, 저용량의 α-아마니틴-항체 접합체(예를 들면, α-아마니틴-접합된 항-EpCAM(상피 세포 부착 분자) 항체)는 POLR2A의 반접합성 결실을 갖는 사람 결장직장암의 뮤린 모델에서 종양 회귀를 유도함이 밝혀진다. POLR2A를 억제함은 이러한 흔한 게놈 변경을 지닌 암에 대한 신규한 치료학적 접근법이다.
I. 세포-표적화 접합체
α-아마니틴의 유용성을 향상시키고 간 독성을 감소시키기 위해 적어도 하나의 세포-표적화 제제에 α-아마니틴 분자(또는 임의의 아마톡신)를 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 접합체는 "면역독소"라고 명명할 수 있다. 예를 들면, 치료학적 제제로서의 α-아마니틴의 효능 및 유용성을 증가시키기 위해, 원하는 세포 표적화 모이어티(moiety)에 접합되거나 공유 결합될 수 있다. 이러한 모이어티는 외부 수용체 또는 암 세포와 같은 상기 세포 유형 상의 결합 부위에 결합함으로써 원하는 세포 유형을 표적으로 하기에 충분한 선택성, 특이성 또는 친화성을 갖는 임의의 모이어티일 수 있다(U.S. 특허 공개 제2009/0304666호). 이러한 모이어티의 예로는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항체-유사 단백질 및 압타머(aptamer)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 항원-결합 항체 단편의 예로는 제한없이 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 "Fd" 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 "Fv" 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 "dAb" 단편; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편인 F(ab')2 단편; (vii) 단일 쇄 Fv 분자("scFv")(여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인이 회합되어 결합 도메인을 형성하도록 하는 펩타이드 링커에 의해 연결된다); (viii) 이-특이적 단일쇄 Fv 이량체(U.S. 특허 제5,091,513호 참조) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 이루어진 디아바디, 다가 또는 다중특이적 단편(U.S. 특허 공개 제2005/0214860호)이 포함된다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 가교의 도입에 의해 안정화될 수 있다. 세포 표적화 모이어티는 임의의 종양-관련 항원, 예를 들면, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, 암배아성(carcinoembryonic) 항원, 알파태아단백질, gpA33, 뮤신, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, ERBB2, ERBB3, c-Met, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나신, AKT, Her2/neu, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, 덱틴-1, gp100, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75), 티로시나제, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산-결합 단백질, 강글리오사이드(예를 들면, GD2, GD3, GM2), MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, p15, β-카테닌, MUM-1, CDK4, HPV-E6, HPV-E7, ZFP161, 유비퀼린-1, HOX-B6, IFI27, YB-1, KIAA0136, 오스테오넥틴, F-박스 유일 단백질(F-box only protein) 21, ILF3, SSX-2, PSMA, NY-ESO-1, PRAME, 메소텔린, VEGF, VEGFR, 인테그린 알파V베타3, 인테그린 알파5베타1, 또는 PLK1에 특이적으로 결합할 수 있다.
접합체(예를 들면, α-아마니틴)에의 세포 표적화 모이어티(예를 들면, 종양-관련 항원 지시된 항체)의 부착 또는 접합을 위한 몇몇의 방법이 당해 분야에 공지되어 있다(전문이 본원에 인용에 의해 포함되어 있는 PCT 공보 WO2012/119787). 예를 들면, 면역독소는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 절단가능한 디설파이드 링커를 사용할 수 있다. 상기 독소는 독소를 처리하여 설프하이드릴 그룹을 제공하고 세포 표적화 모이어티를 처리하여 피리딜 디설파이드 잔기를 제공함으로써 세포 표적화 모이어티에 접합될 수 있다. 세포 표적화 모이어티에 독소를 접합시키기 위해 흔히 사용되고 이에 유용한 것으로 예측되는 다른 링크는 이미노티올란/석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트 및 카르보디이미드 링크이다. 변하는 길이, 안정성, 가요성 및 화학적 반응성의 단백질을 접합하기 위한 다수의 다른 링크는 당해 분야에 익히 공지되어 있고 다수의 경우에 상업적으로 입수가능하다. 부착 방법의 몇몇의 예는 디설파이드 교환 반응; 티오에테르 결합을 형성함으로써; 예를 들면, 유기 킬레이트화 제제, 예를 들면, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA)을 사용하는 금속 킬레이트 착체; 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 세포 표적화 모이어티에 부착된 테트라클로로-3-6α-디페닐글리코우릴-3의 사용을 포함한다. 또한, 세포 표적화 모이어티는 글루타르알데하이드 또는 과요오드산염과 같은 커플링제의 존재 하에 효소와 반응할 수 있다. 임의의 α-아마니틴-세포 표적화 모이어티 접합체는 혈청에의 연장된 노출시 안정한 것이 바람직하다. 이와 같이, α-아마니틴은 혈청-안정성이지만 세포 표적화 모이어티의 리소좀성 분해 후 표적화된 세포의 내부에 유리 α-아마니틴을 방출할 것인 안정한 우레아 링커의 방법에 의해 세포 표적화 모이어티의 라이신 잔기에 접합될 수 있다.
II. 질환의 치료
본 발명의 실시형태들의 소정 양상들은 TP53의 반접합성 손실과 관련되어 있고 POLR2A의 손실과 관련되어 있는 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. POLR2A의 기능은 TP53 및/또는 POLR2A의 반접합성 손실을 지닌 암을 치료하기 위한 임의의 적합한 물질에 의해 감소될 수 있다. 이러한 예시의 물질은 임의의 아마톡신, α-아마니틴 또는 임의의 아마톡신 또는 α-아마니틴에 접합된 세포-표적화 모이어티일 수 있다.
TP53 및/또는 POLR2A의 반접합성 손실을 지닌 암은 TP53 및/또는 POLR2A의 손실에 관하여 상동성이 아닐 수 있다. 각종 양상들에서, 상기 암을 포함하는 세포의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%는 TP53 및/또는 POLR2A의 반접합성 손실을 지닐 수 있다. 따라서, 몇몇의 양상들에서, 상기 암을 포함하는 세포의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 TP53 및/또는 POLR2A의 카피 둘 다를 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 상기 암을 포함하는 세포의 각종 백분율은 TP53의 동형접합성 손실 및 POLR2A의 반접합성 손실을 지닐 수 있다.
"치료" 및 "치료하는"은 대상체에게의 치료학적 제제의 투여 또는 적용 또는 질환 또는 건강-관련 병태의 치료학적 이점을 수득할 목적을 위한 대상체에 대한 절차 또는 양식의 성능을 나타낸다. 예를 들면, 치료는 POLR2A의 기능을 억제하는 물질의 약제학적 유효량의 투여를 포함할 수 있다.
"대상체"는 사람 또는 비-사람, 예를 들면, 영장류, 포유동물 및 척추동물을 나타낸다. 특정 실시형태들에서, 상기 대상체는 사람이다.
본 출원에 걸쳐 사용되는 용어 "치료학적 이점" 또는 "치료학적으로 유효한"은 이러한 병태의 의학적 치료에 대한 대상체의 웰빙(well-being)을 촉진시키거나 향상시키는 모든 것을 나타낸다. 이로는 질환의 증후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 암의 치료는 예를 들면, 종양의 크기 감소, 종양의 침습성 감소, 암의 성장률의 감소, 또는 전이의 예방을 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 갖는 대상체의 생존을 연장시키는 것을 나타낼 수 있다.
α-아마니틴 접합체는 암을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 방법이 유용한 암으로는 임의의 악성 세포 유형, 예를 들면, 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것들이 포함된다. 예시의 고형 종양으로는 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 두부, 경부, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기관의 종양이 포함될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예시의 혈액학적 종양으로는 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 및 골수종 등이 포함된다. 본원에 제공된 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예로는 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종을 포함함), 복막의 암, 위암(위장암 및 위장 기질암을 포함함), 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 각종 유형의 두경부암, 및 흑색종이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 암은 구체적으로 하기 조직학적 유형으로 이루어질 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 악성 신생물; 암종; 암종, 미분화; 거대 세포 암종 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프상피성 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종 폴립에서의 선암종; 선암종, 가족성 폴립증; 고형 암종; 악성 유암종 종양; 기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 난염성(chromophobe) 암종; 호산성(acidophil) 암종; 호산소성(oxyphilic) 선암종; 호염기성(basophil) 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 난포성 선암종; 유두상 및 난포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점막표피상 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 혈청 낭선암종; 점액 낭선암종; 점액 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질 암종; 소엽성 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유두; 세엽 세포 암종; 선편평세포 암종; 편평세포 화생을 동반한 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 레이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유선외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 멜라닌결핍성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 악성 흑색점 흑색종; 말단 흑색점 흑색종; 결절성 흑색종; 거대 색소 모반에서의 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮐러 혼합 종양; 신모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽세포종; 악성 브레너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막 암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관 내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 골의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원성 종양; 사기질모세포성 치아육종; 악성 사기질모세포종; 사기질모세포성 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원시 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경원성 종양; 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 부육아종; 소형 림프구성 악성 림프종; 대형 세포 만성 악성 림프종; 난포성 악성 림프종; 균상식육종; 기타 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/난포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/난포성 NHL; 중간 등급 만성 NHL; 고등급 면역모세포 NHL; 고등급 림프모세포 NHL; 고등급 소형 비-절단된 세포 NHL; 거대 질환(bulky disease) NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 매크로글로불린혈증; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포성 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성(eosinophilic) 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 모발상 세포 백혈병; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 및 만성 골수모구성 백혈병.
III. 병용 치료
소정 실시형태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 α-아마니틴에 접합된 세포-표적화 모이어티를 제2 또는 추가의 치료요법과 함께 포함한다. 이러한 치료요법은 TP53 및/또는 POLR2A의 반접합성 손실과 관련되어 있는 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들면, 상기 질환은 암일 수 있다.
병용 치료요법을 포함하는 방법 및 조성물은 치료학적 또는 예방학적 효과를 향상시키고/시키거나 다른 항암 또는 항-과증식성 치료요법의 치료학적 효과를 증가시킨다. 치료학적 및 예방학적 방법 및 조성물은 암 세포의 사멸 및/또는 세포 과증식의 억제와 같은 원하는 효과를 달성하는데 효과적인 총합량(combined amount)으로 제공될 수 있다. 이러한 프로세스는 세포를 α-아마니틴에 접합된 세포-표적화 모이어티 및 제2 치료요법 둘 다와 접촉시킴을 포함할 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 조성물 또는 하나 이상의 제제(즉, 항암제)를 포함하는 약리학적 제형(들)과 접촉될 수 있거나, 조직, 종양 및/또는 세포를 2개 이상의 별개의 조성물 또는 제형과 접촉시킴으로써 접촉될 수 있고, 여기서, 하나의 조성물은 1) α-아마니틴에 접합된 세포-표적화 모이어티; 2) 항암제, 또는 3) α-아마니틴에 접합된 세포-표적화 모이어티 및 항암제 둘 다를 제공한다. 또한, 이러한 병용 치료요법은 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 수술 치료요법 또는 면역 치료요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.
세포에 적용되는 경우 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 프로세스에 의해 치료학적 항체 및 화학치료학적 제제 또는 방사선치료학적 제제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직접적인 병렬위치에 위치되는 프로세스를 기술하는 것으로 사용된다. 세포 사멸을 달성하기 위해, 예를 들면, 상기 제제 둘 다를 세포를 사멸시키거나 세포가 분열하는 것을 방지하는데 효과적인 총합량으로 세포에 전달한다.
α-아마니틴에 접합된 세포-표적화 모이어티는 항암 치료에 대한 각종 병용 전에, 각종 병용 동안, 각종 병용 후에 또는 각종 병용시에 투여될 수 있다. 상기 투여는 동시 내지 수분 내지 수일 내지 수주 범위의 간격으로 이루어질 수 있다. 환자에게 항암제와 별도로 유전자 발현의 억제제가 제공되는 실시형태들에서, 당업자는 일반적으로 두 화합물이 여전히 상기 환자에 대해 이로운 병용 효과를 발휘할 수 있도록 각각의 전달 시점 사이에 유의한 기간의 시간이 경과하지 않았음을 확실히 할 것이다. 이러한 예에서, 당업자는 환자에게 α-아마니틴에 접합된 세포-표적화 모이어티 및 항암 치료요법을 서로 약 12 내지 24 또는 72h 이내에, 그리고 보다 구체적으로는 서로 약 6 내지 12h 이내에 제공할 수 있는 것으로 생각된다. 몇몇의 상황에서, 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과하도록 치료 기간을 유의하게 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.
소정 실시형태들에서, 치료 과정은 1 내지 90일, 또는 그 이상(이러한 범위는 개재된 일수를 포함함) 지속될 것이다. 하나의 제제가 1일 내지 90일(이러한 범위는 개재된 일수를 포함함) 중 임의의 일수 또는 이들의 임의의 조합에 제공될 수 있고, 다른 제제는 1일 내지 90일(이러한 범위는 개재된 일수를 포함함) 중 임의의 일수 또는 이들의 임의의 조합에 제공될 수 있다. 1일(24시간 기간) 이내에, 상기 환자에게 제제(들)의 1회 또는 다중 투여가 제공될 수 있다. 또한, 치료 과정 후, 항암 치료가 투여되지 않은 시간의 기간이 존재하는 것으로 생각된다. 이러한 시간 기간은 환자의 병태, 예를 들면, 이들의 예후, 강도, 건강 등에 따라 1 내지 7일 및/또는 1 내지 5주 및/또는 1 내지 12개월 또는 그 이상(이러한 범위는 개재된 일수를 포함함) 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 수 있는 것으로 예측된다.
각종 병용물이 사용될 수 있다. 하기 예에 관해서, α-아마니틴 치료요법에 접합된 세포-표적화 모이어티는 "A"이고, 항암 치료요법은 "B"이다:
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
환자에게의 본 발명의 임의의 화합물 또는 치료요법의 투여는 존재하는 경우 제제들의 독성을 고려하여 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜에 따를 것이다. 따라서, 몇몇의 실시형태들에서, 병용 치료요법에 기여할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다.
특정 양상들에서, 표준 치료요법은 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 면역 치료요법, 수술 치료요법 또는 유전자 치료요법을 포함할 것이고, 본원에 기술되는 바와 같이 억제성 항체, 항암 치료요법 또는 억제성 항체 및 항암 치료요법 둘 다와 병용하여 사용될 수 있음이 고려된다.
A. 화학 치료요법
본 발명과 관련하여 다양한 화학치료학적 제제가 사용될 수 있다. 용어 "화학치료요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 말한다. "화학치료학적 제제"는 암의 치료시에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하는 것으로 사용된다. 이들 제제 또는 약물은 세포 내에서의 이들의 활성 방식에 의해, 예를 들면, 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지의 여부 또는 이들이 어떤 단계에서 세포 주기에 영향을 미치는지에 의해 분류된다. 대안으로, 제제는 DNA를 직접 가교-연결하거나, DNA에 간삽(intercalate)하거나, 또는 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사분열 이탈(aberration)을 유도하는 제제의 능력에 기초하여 특성확인될 수 있다. 대부분의 화학치료학적 제제는 하기 카테고리 내에 든다: 알킬화제, 항대사물질, 항종양 항생제, 유사분열 억제제, 및 니트로소요소.
화학치료학적 제제의 예로는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 알트레타민을 포함하는 메틸라멜라민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토파이신(구체적으로는 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8을 포함함); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소요소, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들면, 에네다인 항생제(예를 들면, 칼리케아마이신, 특히, 칼리케아마이신 감마 II 및 칼리케아마이신 오메가 II); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들면, 클로드로네이트; 에스페라마이신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소 단백질, 에네다인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티오마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 이소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들면, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티빈, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신제, 예를 들면, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들면, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK폴리사카라이드 착체; 라족산; 리조신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("아라-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀 및 도세탁셀; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 배위 착염, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들면, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들면, 레티노산; 카페시타빈; 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 겜시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스백금 및 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 상기 중 임의의 것의 유도체가 포함된다.
또한, 이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들면, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자(SERM)가 포함되고, 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜; 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절, 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트, 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸, 레트로졸 및 아나스트로졸; 및 항-안드로겐, 예를 들면, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 부착 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서의 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들면, PKC-알파, 랄프(Ralf) 및 H-Ras; 리보자임, 예를 들면, VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예를 들면, 유전자 치료요법 백신 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 중 어느 것의 유도체가 포함된다.
B. 방사선 치료요법
DNA 손상을 야기하고 광범위하게 사용되어 온 다른 인자들로는 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포에의 방사성 동위원소의 직접적인 전달로서 흔히 알려져 있는 것들이 포함된다. 다른 형태의 DNA 손상 인자들, 예를 들면, 마이크로파, 양성자 빔 조사(U.S. 특허 5,760,395 및 4,870,287) 및 UV-조사도 고려된다. 이들 인자들 전부는 DNA에, DNA의 전구체에, DNA의 복제 및 수복에, 그리고 염색체의 어셈블리(assembly) 및 유지에 광범위한 손상에 영향을 미치는 경우가 많다. X-선의 용량 범위는 연장된 시간(3 내지 4wk) 동안 50 내지 200뢴트겐의 1일 용량 내지 2000 내지 6000뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 광범위하게 다르고, 동위원소의 반감기, 조사된 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
세포에 적용되는 경우 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 프로세스에 의해 치료학적 작제물 및 화학치료학적 제제 또는 방사선치료학적 제제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직접적인 병렬위치에 위치되는 프로세스를 기술하는 것으로 사용된다. 세포 사멸을 달성하기 위해, 예를 들면, 상기 제제 둘 다를 세포를 사멸시키거나 세포가 분열하는 것을 방지하는데 효과적인 총합량으로 세포에 전달한다.
C. 면역 치료요법
암 치료와 관련하여, 면역 치료제는 일반적으로 암 세포를 표적으로 하고 이를 파괴하는 면역 효과기(effector) 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 트라스트주맙(Herceptin™)은 이러한 예이다. 면역 효과기는 예를 들면, 종양 세포의 표면 상의 몇몇의 마커에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 치료요법의 효과기로서 작용할 수 있거나, 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 유입(recruit)할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어 단지 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안으로, 효과기는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 지닌 림프구일 수 있다. 각종 효과기 세포로는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다. 치료학적 양식의 병용, 즉, 직접적인 세포독성 활성 및 ErbB2의 억제 또는 감소는 ErbB2 과발현 암의 치료시 치료학적 이점을 제공할 수 있다.
또한, 다른 면역치료요법은 상기에서 논의된 유전자 침묵 치료요법과의 병용 치료요법의 부분으로서 사용될 수 있다. 면역 치료요법의 한 양상에서, 종양 세포는 표적화할 수 있는, 즉, 대부분의 다른 세포 상에 제시되지 않는 몇몇의 마커를 가져야만 한다. 다수의 종양 마커가 존재하고 이들 중 어느 것은 본 발명과 관련하여 표적화에 적합할 수 있다. 통상적 종양 마커로는 암배아성 항원, 전립선 특이적 항원, 방광 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 류이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역치료요법의 대안의 양상은 항암 효과를 면역 자극 효과와 병용하는 것이다. 또한, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 및 감마-IFN과 같은 사이토카인, MIP-1, MCP-1 및 IL-8과 같은 케모카인, 및 FLT3 리간드와 같은 성장 인자를 포함하는 면역 자극 분자가 존재한다. 단백질로서의 또는 종양 억제인자와 병용하는 유전자 전달을 이용하는 병용 면역 자극 분자는 항종양 효과를 향상시키는 것으로 밝혀져 있다(Ju et al., 2000). 또한, 이들 화합물 중 어느 것에 대한 항체는 본원에 논의되는 항암제를 표적으로 하는데 사용될 수 있다.
현재 조사중이거나 사용중인 면역 치료요법의 예로는 면역 보강제(adjuvant), 예를 들면, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물(U.S. 특허 5,801,005 및 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), 사이토카인 치료요법, 예를 들면, 인터페론 α, β 및 γ; IL-1, GM-CSF 및 TNF(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) 유전자 치료요법, 예를 들면, TNF, IL-1, IL-2, p53(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; U.S. 특허 5,830,880 및 5,846,945) 및 모노클로날 항체, 예를 들면, 항-강글리오사이드 GM2, 항-HER-2, 항-p185(Hanibuchi et al., 1998; U.S. 특허 5,824,311)가 있다. 하나 이상의 항암 치료요법은 본원에 기술된 유전자 침묵 치료요법과 사용될 수 있음이 고려된다.
활성 면역치료요법에서, 항원성 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 자가 또는 동종이계 종양 세포 조성물 또는 "백신"은 일반적으로 별도의 세균성 보강제와 함께 투여된다. 양자 면역 치료요법에서, 환자의 순환성 림프구 또는 종양 침윤성 림프구는 시험관내에서 단리되고, IL-2와 같은 림포카인에 의해 활성화되거나 종양 괴사를 위한 유전자로 형질도입되고, 재투여된다.
D. 수술
암을 지닌 사람의 대략 60%는 몇몇 유형의 수술을 경험할 것이고, 이로는 예방적, 진단학적, 또는 병기확인, 근치적(curative) 및 고시적(palliative) 수술이 포함된다. 근치적 수술은 본 발명의 치료, 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법, 면역 치료요법 및/또는 대안의 치료요법과 같은 다른 치료요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
근치적 수술로는 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고/되거나, 절제되고/되거나, 파괴되는 절제(resection)가 포함된다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 말한다. 종양 절제 이외에도, 수술에 의한 치료로는 레이저 수술, 냉동 수술, 전기 수술 및 현미경 제어된 수술(Mohs' surgery)이 포함된다. 본 발명의 소정 양상은 표재성 암, 전암(precancer) 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제시, 강(cavity)은 신체 내에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접적 주사 또는 추가의 항암 치료요법을 이용한 부위의 국소적 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 용량으로 이루어질 수 있다.
E. 기타 제제
치료의 치료학적 효능을 개선하기 위해 다른 제제들을 본 발명의 소정 양상들과 병용하여 사용할 수 있다. 이들 추가의 제제로는 면역조정제, 세포 표면 수용체 및 GAP 연결부의 상향조절에 영향을 미치는 제제, 세포분열 억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 제제, 또는 기타 생물학적 제제가 포함된다. 면역조정제로는 종양 괴사 인자; 인터페론 알파, 베타 및 감마; IL-2 및 기타 사이토카인; F42K 및 기타 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1베타, MCP-1, RANTES 및 기타 케모카인이 포함된다. 세포 표면 수용체 또는 이들의 리간드, 예를 들면, Fas/Fas 리간드, DR4 또는 DR5/TRAIL(Apo-2 리간드)의 상향조절은 과증식성 세포에 대한 자가분비(autocrine) 또는 주변분비(paracrine) 효과의 확립에 의해 본 발명의 아폽토시스 유도 능력을 강화시킬 수 있음이 추가로 고려된다. GAP 연결의 수를 증가시킴에 의한 세포간 신호전달의 증가는 주위 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킬 수 있다. 다른 실시형태들에서, 세포분역 억제제 또는 분화제는 치료의 과증식성 효능을 개선하기 위해 본 발명의 소정 양상들과 병용하여 사용할 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 발명의 효능을 개선시키는 것으로 생각된다. 세포 부착 억제제이 예로는 국소 접착 키나제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 기타 제제, 예를 들면, 항체 c225는 치료 효능을 개선하기 위해 본 발명의 소정 양상들과 병용하여 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
또한, 호르몬 치료요법은 본 발명의 소정 양상들과 함께 또는 이전에 기술된 임의의 기타 암 치료요법과 병용하여 사용할 수 있다. 호르몬의 사용은 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 소정 호르몬의 수준을 저하시키거나 소정 호르몬의 효과를 차단하기 위해 소정 암, 예를 들면, 유방암, 전립선암, 난소암, 또는 자궁경부암의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 치료는 흔히 치료 옵션으로서 또는 전이 위험을 감소시키기 위해 적어도 하나의 다른 암 치료요법과 병용하여 사용된다.
IV. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태들을 입증하기 위해 포함된다. 이어지는 실시예에 개시되는 기술은 본 발명의 실행시 양호하게 기능하는 것으로 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서, 본 발명의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 이해되어야만 한다. 그러나, 당해 분야 숙련가들은 본 개시의 관점에서 개시되어 있는 특정 실시형태들에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 여전히 동일하거나 유사한 결과를 수득함을 이해해야만 한다.
재료 및 방법
세포 배양, 항체 및 웨스턴 블롯 분석. HCT116, SW480, SW837, HT29, DLD1, 및 HT29 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 수득하였고, 제조업자에 의해 명시된 표준 조건 하에 배양하였다. SNU283 및 SNU1197 세포주를 코리안 셀 라인 뱅크(Korean Cell Line Bank)로부터 수득하였고, 10% FBS 및 2mM L-글루타민이 보충된 RMPI 1640 배지에서 배양하였다. 이종이식된 사람 1차 CRC(xhCRC) 세포의 단리, 배양 및 유지를 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Lu et al., 2013). 간략하게, 환자-유도된 이종이식편을 멸균 조건 하에 수거하였고, 기계적으로 해리시켰고, 이어서, 37℃에서 콜라게나제 II에서 30분 인큐베이션하였다. 시험편을 멸균 100-㎛ 스트레이너(strainer)를 통해 여과하였다. 적혈구 세포를 저-삼투압 적혈구 세포 용해 완충액(eBioscience)을 이용하여 제거하였다. 이종이식된 사람 CRC 시험편 중의 마우스 세포는 마우스 MHC 클래스 I 분자 H-2K 항체를 이용한 후 자기 비드 정제 키트(Miltenyi)를 이용한 음성 선택에 의해 제거하였다. 섬유모세포는 MACS 자기 비드 분리 키트(Miltenyi)를 이용한 음성 선택에 의해 제거하였다. 신선하게 단리된 xhCRC 세포를 콜라겐-1 코팅된 배양 플레이트(BD Biosciences) 상에 유지하였고, 10% FBS, 비타민(1×), 비필수 아미노산(1×), Pen-Strep(1×), 피루브산 나트륨(1×) 및 L-글루타민(1×)이 보충된 MEM에서 배양하였다. 모든 배지 보충물은 Sigma로부터 구입하였다.
항-POLR2A 항체는 Santa Cruz(#sc-47701) 및 Abcam(#ab140509)으로부터 구입하였다. 항-Ki67 항체(#D3B5) 및 항-절단된 카스파제-3(Asp175, #5A1E) 항체는 Cell Signalling으로부터 수득하였다. 항-p53(#sc-126), 항-β-액틴(#sc-1616), HRP-항-염소 IgG(#sc-2020), HRP-항-토끼 IgG(#sc-2054) 및 HRP-항-마우스 IgG(#sc-2055) 항체는 Santa Cruz로부터 구입하였다. 세포 용해물 조제, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Liu et al., 2012).
RNA 단리 및 정량적 PCR. 총 RNA는 TRIzol 시약(Life Technologies)을 이용하여 단리되었고, 이어서, iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 이용하여 역-전사되었다. 얻어진 cDNA는 유전자-특이적 프라이머와 iTaq Universal SYBR 그린 수퍼믹스(Bio-Rad)를 이용한 qPCR에 사용하였고, 그 결과를 대조군으로서의 β-액틴에 대해 정규화하였다. RT-PCR 검정에서, TP53에 대한 프라이머 서열은 5'-GAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3'(서열번호 1) 및 5'-TCCGTCCCAGTAGATTACCAC-3'(서열번호 2)이고, POLR2A에 대해서는 5'-TTGTATCCGTACCCACAGCA-3'(서열번호 3) 및 5'-CATGATCAGCTCCCCATTCT-3'(서열번호 4)이다.
POLR2A의 shRNA-매개된 녹다운. POLR2A-특이적 shRNA 클론은 MD Anderson shRNA and ORFeome Core Facility(본래 Open Biosystems 유래)로부터 수득하였다. POLR2A를 표적으로 하는 12개의 shRNA를 스크리닝하였고, 이들 중 2개의 shRNA가 시험된 4개의 결장직장암 세포주 모두에서 단백질 수준을 적어도 50% 만큼 녹다운시켰다. 클론 확인 번호 및 shRNA 서열은 V3LHS_645674(5'-TTAGCTTTGTTCTTCCCGA-3'[서열번호 5]) 및 V3LHS_64029(5'-TGTTGTCCATCTCCTCCCC-3'[서열번호 6])이다. GIPZ 벡터 내의 헤어핀 서열은 제조업자에 의해 제공된 프로토콜을 이용하여 TRIPZ 벡터(Dharmacon)로 클로닝되었다. TRIPZ 벡터는 적색 형광성 단백질 리포터로 Dox-유도가능한 시스템이다.
Dox-유도가능한 shRNA를 안정하게 발현하는 세포의 생성. 293T 세포로부터 재조합 렌티바이러스 입자를 생산하였다. 간략하게, 72㎍의 shRNA-암호화 벡터 DNA, 54㎍의 델타 8.9 벡터 DNA 및 18㎍의 VSVG-암호화 벡터 DNA를 X-tremeGENE(Roche)을 이용하여 (245-㎟ 디쉬에 플레이팅된) 293 세포에 형질감염시켰다. 바이러스 입자를 함유하는 상청액을 수집하였고, 형질감염 후 72h에 여과하였고, 90,000g에서의 초원심분리에 의해 농축시켰고, 세포 성장 배지에 재현탁시켰다. 안정한 Dox-유도가능한 세포를 생성하기 위해, shRNA-발현 바이러스 입자를 이용하여 HCT116 및 SNU283 세포를 1의 감염 다중도(MOI: multiplicity of infection)로 감염시켰다. 4㎍/mL 폴리브렌을 함유하는 세포 배양 배지에 바이러스 용액을 부가하였다. 감염 후 48h에 2㎍/mL 퓨로마이신에 의해 세포를 선택하였다. 단일 콜로니를 배양하였고, 증식시켰고, 렌티바이러스 DNA 삽입물의 단일 카피를 지닌 콜로니를 확인하였고, 녹다운 효능에 대해 분석하였다.
POLR2A shRNA를 이용한 경쟁 검정. shRNA-1 또는 shRNA-2 중 어느 하나를 발현하는 단일 렌티바이러스 카피는 시험된 4개의 결장직장 세포주 모두에서 POLR2A 발현을 억제하는데 충분하였다(도 6a). 대조군 또는 POLR2A shRNA-발현 렌티바이러스(pGIPZ 백본 발현 GFP)를 이용하여 암 세포를 2의 MOI로 감염시켰다. 감염 후 2일에, GFP-양성 세포를 MD Anderson Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility에서 BD FACSJazz™ 세포 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 분류하였다. 이어서, GFP-양성 세포를 1:1의 비율로 비-감염 세포 및 GFP-음성 세포와 혼합하였고 6 계대 배양하였다. 각 계대에서 GFP-양성 및 총 세포의 수를 분석하였고, 유동 세포측정법에 의해 정량하였고, GFP-양성 세포의 백분율을 계산하였다.
sgRNA-발현 벡터의 생성 및 서베이어(Surveyor) 검정. Cas9 및 sgRNA를 발현하는 바이시스트론성(bicistronic) 발현 벡터를 BbsI로 분해하였고, 알칼리성 포스파타제로 처리하였고, sgRNA-암호화 DNA를 클로닝하기 위해 상기 선형화된 벡터를 겔 정제하였다(Cong et al., 2013). TP53 또는 POLR2A를 표적으로 하는 각각의 sgRNA에 대한 올리고 DNA의 쌍을 어닐링하였고, 포스포릴화하였고, 선형화된 벡터에 라이게이션하였다. 올리고 DNA의 서열은 표 1에 열거된다. 서베이어 검정은 게놈 편집 효능을 시험하기 위해 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Ran et al., 2013; Guschin et al., 2010). 간략하게, 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 2 × 105 세포의 밀도로 시딩하였다. 초기 시딩 후 1일에, 세포를 2㎍의 Cas9/sgRNA-발현 벡터 DNA로 형질감염시켰고, 형질감염 후 48h에 수거하였다. 게놈 DNA를 단리하였고, sgRNA-표적화 부위를 함유하는 1kb DNA 단편을 고-충실도(fidelity) PCR에 의해 증폭시켰고, T7 엔도뉴클레아제 I에 의해 분해하였다. 대조군 벡터 DNA로 형질감염된 HCT116 세포로부터 단리된 게놈 DNA를 대조군으로서 사용하였다. 상보성이지만 미스매치된 가닥이 어닐링되도록 하기 위해서, PCR 생성물을 95℃에서 5분 동안, -2℃ s-1의 속도로 95℃ 내지 85℃, 그리고 -0.1℃ s-1의 속도로 85℃ 내지 25℃에서 인큐베이션하였다. T7 엔도뉴클레아제 I을 부가하였고 샘플을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하여 미스매치 부위에서 어닐링된 PCR 생성물을 분해하였다. T7 엔도뉴클레아제 I-분해된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열은 표 1에 열거된다. 양성 클론으로부터의 PCR 생성물을 pGEM-T Easy Vector(Promega)에 라이게이션하였고, DNA 서열분석에 의해 추가로 확인하였다.
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세포 증식 및 생존 검정. 동일한 수의 세포를 12-웰 플레이트에 3중으로 플레이팅하였다. 세포를 10% 메탄올로 고정시켰고, 명시된 시점에 (10% 메탄올에 용해된) 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 염색 후, 웰을 PBS로 3회 세척하였고, 아세트산으로 탈색시켰다. 크리스탈 바이올렛 용액의 흡광도를 590nm에서 측정하였다. 세포 생존 검정에 관해서, 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1,000세포의 농도로 시딩하였고, 24시간 후에 명시된 농도의 α-아마니틴 또는 악티노마이신 D로 처리하였다. 제조업자의 지침에 따라 WST-1 시약(Roche)을 이용하여 세포 생존능을 정량하였다. 모든 실험은 3중으로 수행하였다.
아폽토시스 및 세포 주기 분석. HCT116 및 SNU283 세포주는 명시된 농도에서 2일 동안 α-아마니틴의 존재 또는 부재 하에 또는 4일 동안 독시사이클린의 존재 또는 부재 하에 치료하였고, 아넥신 V-PE 및 7-AAD(Biovision)로 염색하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 Guava EasyCyte 유동 세포측정기(Millipore)를 이용한 유동 세포측정법에 의해 아폽토시스를 분석하였다. 전(pre)-아폽토시스(아넥신 V-양성 및 7-AAD-음성) 및 아폽토시스(아넥신 V-양성 및 7-AAD-양성) 세포 둘 다가 분석에 포함되었다. 세포 주기 분석을 위해, 세포를 -20℃에서 밤새 75% 에탄올에 고정시켰다. 세포를 냉 PBS로 세척하였고, 100㎍의 RNase A(Qiagen)로 처리하였고, 50㎍의 프로피디움 요오다이드(Roche)로 염색하였다. 세포 주기 프로파일은 Guava EasyCyte 유동 세포측정기(Millipore)를 이용한 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
동일반응계내(in situ) 형광성 하이브리드화(FISH: Fluorescence in situ hybridization). Empire Genomics로부터의 플루오레세인-표지된 POLR2A(적색) 및 대조군 동원체(Chr 17, 녹색) 프로브를 이용하여 FISH 분석을 수행하였다. 하이브리드화 및 검출은 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 슬라이드를 DAPI로 대비염색(counterstain)하였고, 냉각된-전하 결합 소자(CCD) 카메라가 구비된 Nikon E800 현미경을 이용하여 화상을 포획하였다. POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 측정하기 위해, 100개의 각각의 핵을 각각의 경우에 대해 분석하였다. 간기(interphase) 핵을 포획하였고, 정량적 화상 프로세싱 시스템(Quantitative Image Processing System)(Applied Imaging)을 이용하여 프로세싱하였다.
환자 샘플. 기관 검토 위원회(institutional review board)(IRB#PA11-0767)에 의한 승인 후 적절한 사전 동의를 통해 매칭된 정상 및 환자 유래의 결장직장 종양 조직 샘플을 MD Anderson Cancer Center(MDACC)로부터 수득하였다. POLR2A 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해, 조직 샘플(20 내지 40mg)을 세라믹 비드를 포함하는 튜브에 넣었고, Precellys 24 균질화 장치(Bertin Technologies)를 사용하여 균질화시켰다. 용해물을 2회 스핀-다운(spin-down)시켰고(15분, 16,000g) 상청액을 수집하였다.
게놈 DNA 단리 및 카피 수 검증(validation). 제조업자의 정제 지침에 따라 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 이용하여 사람 조직 시험편 및 세포주로부터 전체 게놈 DNA를 추출하였다. 모든 DNA 샘플을 -20℃에서 보관하였다. Applied Biosystems 7900HT 서열 검출 시스템에서 TaqMan 프로브(Hs02023849_cn 및 Hs01252684_cn)와 표준 TaqMan PCR 키트를 이용하여 POLR2A의 카피 수 변화를 측정하였다. 그리고, 참조 유전자 TERT는 각각의 DNA 샘플에 대해 동일한 튜브에서 동시에 정량되었다.
항-EpCAM 항체(HEA125)에의 α-아마니틴의 접합. 항체-약물 접합체 ama-HEA125는 안정한 링커 구조에 의해 HEA125 항체의 리신 잔기에 α-아마니틴을 커플링시킴으로써 작제되었다. HEA125는 EpCAM-발현 세포에 높은 친화도(대략 2.2 × 10-9M의 KD) 및 높은 특이성으로 결합한다. HEA125는 단백질 A-세파로스 CL-4B 컬럼(GE Healthcare)을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. α-아마니틴은 항체 모이어티의 리소좀 분해 후 종양 세포 내부에서 유리 α-아마니틴을 방출시키도록 의도된 혈장 안정 요소 링크에 의해 면역글로불린 분자에 부착되었다. α-아마니틴:IgG 분자의 약물-항체 비(DAR)는 4:1이었다. ama-HEA125의 생화학적 특성은 PlatinBlue HPLC 시스템(Knauer)을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 평가하였다. 또한, HEA125 및 ama-HEA125는 통상적인 절차에 따라 SDS-PAGE 및 쿠마시(Coomassie) 염색을 환원시킴으로써 분석하였다. 약물-부하의 검증은 표준 기술을 사용하여 30ng의 HEA125 및 ama-HEA125의 항-아마니틴 면역 블롯팅 분석에 의해 수행되었다.
리포솜 나노입자 조제. 생체내 전달을 위한 siRNA를 DOPC(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린)에 캡슐화하였다. DOPC 및 siRNA를 1:10(w/w)의 siRNA/DOPC의 비율로 과량의 3차 부탄올의 존재 하에 혼합하였다. 상기 혼합물에 Tween 20을 1:19의 Tween 20:siRNA/DOPC의 비율로 부가하였다. 상기 혼합물을 와류교반하였고, 아세톤/드라이 아이스 욕조에서 동결시켰고, 동결건조시켰다. 생체내 투여 전에, 이러한 조제는 PBS를 이용하여 실온에서 주사당 150 내지 1000㎍의 siRNA/kg의 농도로 수화시켰다(각각의 마우스는 복강내 경로에 의해 200μL의 DOPC:siRNA:PBS 용액을 투여받았다).
이종이식편 종양 연구. 4 내지 6주령의 암컷 NOD/SCID 마우스를 Jackson Laboratories로부터 구입하였고, 무병원체 조건 하에 수용하였다. 모든 연구는 MD 앤더슨 암 센터의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인하고 감독하였다. 파워(power) 계산에 사용되는 경우, 본 발명의 샘플 크기 사전결정 실험은 그룹당 5마리의 마우스가 종양 크기 및 체중에 대한 POLR2A의 예측된 효과(p < 0.05)를 90% 파워로 확인할 수 있음을 나타냈다. 동물들을 무작위로 상이한 그룹들로 나누었다. 50μl 성장 배지(Matrigel과 1:1로 혼합됨) 중의 Dox-유도가능한 HCT116(1 × 106) 및 SNU283(2 × 106) 세포를 100-μl 해밀턴 마이크로리터 주사기를 사용하여 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기는 캘리퍼(caliper)를 사용하여 5일마다 측정하였고, 종양 체적은 표준 식: 0.5×L×W2(여기서, L은 최장 직경이고, W는 최단 직경이다)을 사용하여 계산하였다. 정위 마우스 모델의 경우, SCID 마우스를 마취시켰고 피부를 절개하여 맹장을 노출시켰다. 루시페라제를 발현하는 Dox-유도가능한 HCT116 세포(1×106)를 100-μl 해밀턴 마이크로리터 주사기를 사용하여 맹장 벽에 주사하였고, 이어서, 상처 클립을 사용하여 절개를 닫았다. 종양은 15분 동안 루시페린 주입 후 IVIS 시스템에 의해 모니터링하였다. 초기 종양의 확립(피하 이식물(implant)의 경우 100㎣ 및 정위 이식물의 경우 총 플럭스(flux) 2×108 광자/초) 후 3 내지 4주 동안 음용수 중의 1㎍ ml-1의 독시사이클린으로 마우스를 치료하였다. 독시사이클린 물은 격일로 교체되었다.
DOPC-캡슐화된 siRNA를 이용한 이종이식편 종양 연구를 위해, HCT116(1×106) 세포의 동종동계 쌍을 100㎕ 해밀턴 마이크로리터 주사기를 사용하여 맹장 벽에 이식하였다. 세포 주사 후 10일에, 마우스를 무작위로 나누어 대조군 siRNA-DOPC 또는 POLR2A siRNA-DOPC를 투여받도록 할당하였다. siRNA 서열은 하기와 같다: 대조군 siRNA(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'[서열번호 19] 및 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'[서열번호 20]); POL2 siRNA-1(5'-CCAACAUGCUGACAGAUAU-3'[서열번호 21] 및 5'-AUAUCUGUCAGCAUGUUGG-3'[서열번호 22]); POL2 siRNA-2(5'-CCAAGAAGCGGCUCACACA-3'[서열번호 23] 및 5'-UGUGUGAGCCGCUUCUUGG-3'[서열번호 24]). 150 내지 1000㎍ siRNA/kg 마우스의 용량을 매주 2회 간격으로 복강내 투여하였다. 이러한 농도 범위는 이전에 기술된 바와 같이(Pecot et al., 2014) 표적 유전자의 효율적인 전달과 녹다운을 보장한다.
α-아마니틴-HEA125 항체-약물 접합체(ADC)를 이용한 이종이식편 종양 연구를 위해, HCT116(1×106), xhCRC(0.5×106), SW480(1×106) 또는 SW837(2×106) 세포의 동종동계 쌍을 100㎕ 해밀턴 마이크로리터 주사기를 사용하여 맹장 벽에 이식하였다. 10일령 종양을 지닌 마우스를 5개의 그룹(n = 그룹당 10마리 마우스)으로 무작위분류하였고, 상기 마우스는 하기의 2회의 복강내 용량(1주 간격)을 투여받았다: 1) 체중 kg당 3.6mg의 용량으로의 대조군 비접합된 HEA125 mAb; 2) α-아마니틴의 관점에서 kg당 90㎍의 용량(IgG의 kg당 3.6mg에 상응함)으로의 Ama-HEA125; 3) α-아마니틴의 관점에서 kg당 30㎍의 용량(IgG의 kg당 1.2mg에 상응함)으로의 Ama-HEA125; 4) α-아마니틴의 관점에서 kg당 10㎍의 용량(IgG의 kg당 0.4mg에 상응함)으로의 Ama-HEA125; 및 5) α-아마니틴의 관점에서 kg당 3㎍의 용량(IgG의 kg당 0.12mg에 상응함)으로의 Ama-HEA125. 종양은 15분 동안의 루시페린 주입 후 매주 2회 IVIS 라이브 화상 시스템에 의해 모니터링하였다. 체중은 4일마다 기록하였다. 21일째 마취 후 안구 뒤 출혈로 혈액을 수득하였고, MD 앤더슨의 임상 병리학, 수의학 및 수술 핵심부에서 혈액 간 효소(AST: 아스파테이트 아미노 트랜스퍼라제, ALT: 아미노 알라닌 트랜스퍼라제 및 알칼리성 포스파타제)의 수준을 측정했다.
마우스는 종양의 크기와 전반적인 건강 상태에 대한 제도적인 안락사 기준을 충족시키는 경우에 안락사시켰다. 종양을 제거하였고, 사진을 촬영하였고, 칭량하였다. 새롭게 해부된 종양 조직을 10% 완충된 포르말린 중에 밤새 고정시켰고, PBS로 세척하였고, 70% 에탄올로 이동시켰고, 파라핀에 포매시켰고, 절편화하였고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 조사자는 실험 동안 및 결과의 평가시에 그룹 할당에 대해 맹검되었다.
면역조직화학 및 사람 결장 조직 마이크로어레이. 결장암 조직 마이크로어레이(BC051110a)는 110개의 결장 종양 샘플 및 10개의 정상 결장 조직 샘플을 포함하여 Biomax로부터 구입하였다. 샘플을 탈파라핀화하여 재수화하였다. 항원은 마이크로파 오븐에서 끓인 후 10분 동안 끓는 온도 아래에서 0.01M 나트륨-시트레이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 회수하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해, 절편을 3% 과산화 수소로 10분 동안 인큐베이션하였다. 비특이적 염색을 방지하기 위해 5% 정상 염소 혈청에서의 1시간의 사전-인큐베이션 후, 샘플을 POLR2A(#sc-47701, Santa Cruz), Ki67(#D3B5, Cell Signaling)에 대한 항체 또는 절단된 카스파제-3(#5A1E, Cell Signaling)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 절편을 비오티닐화된 2차 항체(4Plus 비오티닐화된 항-마우스 또는 항-토끼 IgG, BioCARE)와 함께 인큐베이션하였고, 이어서, 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 복합체 용액과 함께 인큐베이션하였고, DAB(디아미노벤지딘) 기질 키트(#550880, BD Biosciences)를 제조업자의 프로토콜에 따라 이용하여 전개시켰다. 대비염색 컬러는 Harris 변형된 헤마톡실린을 사용하여 수행하였다. 모든 면역염색된 슬라이드를 디지털 화상 분석에 의한 정량화를 위해 자동화 세포 화상 시스템(Automated Cellular Image System) III(ACIS III)에서 스캐닝하였다.
생물정보학 분석. 유전자 카피 수와 해당 유전자 발현 사이의 상호관계는 CCLE(broadinstitute.org/ccle의 월드 와이드 웹)와 TCGA(cbioportal.org/public-portal/의 월드 와이드 웹)에서 얻은 데이터를 이용하여 이전에 기술된 바와 같이(Nijhawan et al., 2012) 분석하였다. 피어슨 상호관계 계수의 강화는 유전자 명칭을 변경함으로써 결정되었다. 결실된 유전자가 하우스키핑(housekeeping) 유전자로서 기능하는지 여부를 결정하기 위해, 종양 및 정상 조직에서의 발현 프로파일 및 문헌으로부터의 이의 일반적인 기능을 우선 분석하였다. 두 번째로, 종간 유전자 보존 및 유전자 녹아웃의 치사율은 모델 유기체의 이용가능한 데이터베이스(Saccharomyces Genome Database, WormBase, FlyBase, Mouse Genome Informatics)를 검색함으로써 확인하였다. 세 번째로, TP53 유전자에 대한 잠재적 표적 유전자의 근접성을 확인하였고, 사람 암에서 TP53과의 공동-결실을 분석하였다. 마지막으로, TP53 및 표적 유전자가 결실된 암 세포주를 확인하여 현재의 가설을 시험하였다.
통계학적 분석. 각 실험은 3회 이상 반복되었다. 달리 언급하지 않는 한, 데이터는 평균 및 s.d.로서 제시되거나 또는 s.e.m. 및 스튜던츠 t-검정(Student's t-test)(독립표본(unpaired), 양방)을 이용하여 2개의 그룹의 독립적인 샘플을 비교하였다. 독립표본 t-검정에서, 균등 분산을 가정하였으며 분석으로부터 제외된 샘플은 없었다. TCGA 데이터 분석에 사용된 통계학적 방법은 상기 기술되어 있다. p <0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 1 - POLR2A 의 발현은 유전자 카피 수와 상호관련되어 있지만, TP53 은 그렇지 않다.
종양 억제 유전자의 게놈 결실은 종종 암 발병에 기여하지 않을 수 있지만 세포 증식과 생존에 필수적인 다중 주위 유전자를 포함한다(Negrini et al., 2010). 이러한 하우스키핑 유전자의 부분적 손실은 암 세포를 이들 유전자의 추가 억제에 매우 취약하게 만드는 것으로 가정되었다(Nijhawan et al., 2012). TCGA 분석 결과, 광범위한 사람 암에서 TP53 유전자의 반접합성 결실이 빈번히 발생한다는 것이 밝혀졌다(도 1a). POLR2A는 세포 생존에 필수적인 TP53(사람 게놈에서 약 200 킬로베이스(kilobase) 떨어진 곳에 위치) 부근의 하우스키핑 유전자로서 확인되었다(도 1b). POLR2A의 수반되는 결실은 실질적으로 TP53의 반접합성 결실을 지닌 모든 사람 결장직장 종양에서 발생한다(도 1c).
사람 RNA 폴리머라제 II 복합체의 12개의 서브유닛 중에서, POLR2A는 mRNA 합성시 폴리머라제 활성에 필수적인 가장 큰 서브유닛을 암호화한다(Shalem et al., 2014). 특정 억제제 α-아마니틴을 이용하여 POLR2A를 억제하는 것은 광범위한 세포 사멸을 야기하고, 또한, POLR2A의 동형접합성 결실은 사람 세포에서 치명적이다(Lindell et al., 1970; Shalem et al., 2014). 195개의 결장직장암(CRC) 사례들 중 104개(53%)가 17p13 영역의 부분적 손실을 지니고, 이는 TP53 및 POLR2A의 수반되는 결실을 초래함이 발견되었다(도 1c). 그러나, POLR2A가 세포 생존에 필수적이라는 개념과 일치하여, POLR2A의 동형접합성 결실은 관찰되지 않았다. TCGA 및 CCLE 데이터베이스의 분석은 POLR2A의 발현이 이의 유전자 카피 수와 밀접하게 상호관련됨을 밝혔다(도 1d). 또한, 이러한 양의 상호관계는 매칭된 정상 및 CRC 조직 샘플 및 사람 CRC 조직 마이크로어레이의 20쌍에서 검증되었다(도 1e, 도 5a 및 도 5b 및 표 2). POLR2A의 카피 수는 결장직장암 세포의 세트에서 결정되었고(도 1f), 3개의 POLR2A손실 세포(POLR2A의 반접합성 손실) 세포주 모두가 POLR2A중성 세포주보다 유의하게 더 낮은 수준으로 POLR2A 단백질을 발현하였음을 발견하였다(도 1g 및 도 1H). POLR2A와 달리, p53 수준은 전사-후 및 번역-후 사건의 복잡성에 의해 결정된다(Toledo and Wahl, 2006). TP53 카피 수와 mRNA 발현 사이의 상호관계에도 불구하고, p53 단백질 수준은 결장직장 종양 및 세포주에서 유전자 카피 수와 관련되어 있지 않다(도 6a 내지 도 6c 및 도 1h).
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Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 2 - POLR2A 손실 세포는 POLR2A 억제에 대해 고도로 민감성이다.
POLR2A 억제에 대한 TP53/POLR2A 반접합성 손실의 존재 또는 부재 하에 세포의 민감도를 평가하기 위해, POLR2A중성(HCT116, SW480) 및 POLR2A손실(SW837, SNU283) 세포의 패널을 α-아마니틴으로 처리하였다. 고농도(≥ 1μg ml-1)로의 α-아마니틴 치료는 세포 성장을 현저하게 억제하였고, 4개의 세포주 모두에서 완전한 세포 사멸을 야기하였다. 그러나, 0 내지 1.0μg ml-1의 농도로의 α-아마니틴 억제는 대조군 POLR2A중성 세포에 대한 것보다 POLR2A손실에 대해 유의하게 더 높은 수준의 세포-사멸 효과를 가졌다(도 2a 및 도 2b). 반-최대 억제성 농도(half-maximum inhibitory concentration)(IC50)는 POLR2A중성 세포에서 약 1.0㎍/ml이었고, 이는 POLR2A손실 세포의 것보다 10배 이상 높았다. 대조적으로, POLR2A손실 세포는 비특이적인 전사 억제제인 악티노마이신 D의 치료에 대해 더 큰 민감도를 나타내지 않았다(도 7a). 이어서, 직접적인 경쟁 검정을 사용하여 POLR2A손실 세포의 취약성을 평가했다. 대조군 세포와 대조군 또는 POLR2A-특이적 shRNA를 발현하는 GFP-양성 세포 사이에 세포 증식 속도를 비교하였다. 2개의 독립적인 shRNA는 모든 시험된 세포주에서 POLR2A 발현을 50% 내지 70% 만큼 녹다운시켰다(도 7b). 6회의 계대 배양 후, POLR2A shRNA를 안정적으로 발현하는 POLR2A중성 세포(HCT116, SW480)는 대조군 shRNA를 발현하는 상응하는 세포의 것과 비교하여 단지 약간 감소된 증식을 가졌다(도 7c). 그러나, POLR2손실 세포(SNU283, SW837)에서의 POLR2A의 침묵은 현저하게 감소된 증식을 유도하였고, 이는 POLR2A의 반접합성 손실이 암 세포가 POLR2A을 추가로 억제시키는 경향이 더 많도록 함을 시사한다. 독시사이클린(Dox)-유도가능한 POLR2A shRNA를 안정하게 발현하는 HCT116 및 SNU283 세포주가 생성되었다(도 7d). POLR2A의 유의한 녹다운에도 불구하고, HCT116 세포는 계속해서 증식하였고, 반면, SNU283 세포는 심각한 G1 세포 주기 정지 및 아폽토시스를 나타냈다(도 2c, 도 2d 및 도 7e 내지 도 7g). POLR2A 발현의 감소의 대략 50%(30 내지 100ng ml-1의 Dox 부가함)는 SNU283 세포의 증식을 현저히 감소시켰지만, HCT116 세포에 대해서는 단지 적은 영향을 가졌다(도 2d). 이어서, POLR2A손실 SNU283 및 SW837 세포주에서 구제(rescue) 실험을 수행하였다. 두 세포주 모두에서의 외인성 POLR2A의 점진적 재-발현은 POLR2A중성 HCT116 및 SW480 세포의 것과 비슷한 수준까지 α-아마니틴에 대한 이들의 내성을 회복시켰다(도 2e, 도 2f 및 도 8a 내지 도 8b).
세포주에 걸친 다양한 유전적 배경의 영향을 배제하기 위해, CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열)/Cas9 시스템을 사용하여 POLR2A의 반접합성 손실을 가진 동종동계 HCT116 세포주를 생성시켰다(Wang et al., 2014; Wang et al 2013). 2개의 단일-가이드 RNA(sgRNA)는 POLR2A 유전자의 제2 엑손을 표적으로 하도록 고안되었다(도 9a). 서베이어 분석에 나타낸 바와 같이 (도 9b), 이들 둘 다는 효율적으로 POLR2A 유전자를 표적화하고 파괴시켰다. POLR2A의 단일-대립유전자 결실을 지닌 HCT116 세포의 단일 콜로니를 선택하였고 DNA 서열분석에 의해 검증하였다(도 9c). 표적화된 영역에서의 작은 결실은 POLR2A의 모든 기능성 도메인 부재 하에 N-말단 펩타이드의 짧은 스트레치(stretch)만을 생산하는 개방 판독 프레임 시프트(shift)를 유도하였다. 그 결과, POLR2A 발현은 POLR2A손실 세포에서 유의하게 감소되었다(도 9d). POLR2A손실 및 POLR2A중성 HCT116 세포는 유사한 증식 속도를 나타냈고(도 9e), 이는 POLR2A의 하나의 대립유전자가 세포 증식 및 생존을 유지하기에 충분함을 나타낸다. 그러나, POLR2A의 반접합성 결실은 HCT116 세포를 α-아마니틴 치료에 대해 0.1㎍ ml-1의 IC50으로 현저하게 감작화시켰고, 이는 모 HCT116 세포의 것보다 8-배 더 낮다(도 2g 및 도 2h). 대조군으로서, 악티노마이신 D에 대한 이들의 민감도의 실질적인 차이는 관찰되지 않았다(도 9f). 직접 경쟁 검정의 결과는 POLR2A의 녹다운이 POLR2A손실 세포에서 현저하게 감소된 증식을 초래하였지만, 동종동계 POLR2A중성 세포에서는 그렇지 않음을 입증하였다(도 9g). Dox-유도가능한 POLR2A shRNA를 발현하는 POLR2A손실 및 POLR2A중성 HCT116 세포도 생성되었다. 증가된 농도의 Dox는 점차 POLR2A 발현을 감소시켰다. 저용량의 Dox(100ng ml-1)는 POLR2A손실 세포를 사멸시키기에 충분하였지만, 고용량의 Dox는 POLR2A중성 세포에 대해 단지 최소 효과만을 가졌다(도 2i, 도 2j 및 도 9h).
실시예 3 - POLR2A 억제에 대한 POLR2A 손실 세포의 민감도는 p53 과 무관하다
RNA 폴리머라제의 차단은 p53 축적 및 활성화를 유도할 수 있다(Derheimer et al., 2007). POLR2A 억제에의 세포 반응에 대한 p53의 효과를 실험하기 위해, HCT116 및 xhCRC 세포주에서 TP53 및 POLR2A의 수반되는 결실을 재현하였다(도 3a 및 도 10a 내지 도 10c). 새롭게 단리된 이종이식된 사람 결장직장 종양으로부터 xhCRC 세포주(TP53+/+;POLR2A+/+)를 확립하였고, 이는 생체내에서의 향상된 종양원성을 입증하였다(Lu et al., 2013). 약간 증가된 세포 증식을 제외하고, α-아마니틴에 대한 이들의 민감도의 유의한 변화는 TP53의 반접합성 결실을 갖는 HCT116 및 xhCRC 세포 둘 다에서 관찰되지 않았다. 대조적으로, POLR2A의 반접합성 결실은 이들의 TP53 상태와 관계없이 α-아마니틴 치료에 대해 이들 세포를 현저하게 감작화시켰다(도 3b, 도 3c 및 도 10d 내지 도 10f). RNA 폴리머라제 II는 치료요법-내성 종양 세포를 포함하는 임의의 유형의 세포에 대해 필수적인 기능인 mRNA 합성을 담당한다. 결장직장암에 대한 3개의 주요 화학치료요법 약물(5-플루오로우라실(5-FU), 옥살리플라틴 및 SN-38)에 대한 POLR2A중성 및 POLR2A손실 세포의 약물 민감도를 실험하였다. α-아마니틴에 의한 POLR2A의 억제는 POLR2A손실 xhCRC 세포에서 3개의 약물 모두의 세포-사멸 효과를 유의하게 향상시켰지만, POLR2A중성 세포에 대해서는 주목할만한 효과를 갖지 않았고(도 3d), 이는 암 치료요법에서의 POLR2A손실 결장직장 종양의 치료학적 취약성을 시사한다. 유리 α-아마니틴은 간세포의 막 상에서만 발현되는 운반체인 OATP1B3에 의해 특이적으로 결합되므로 간에 독성이다(Letschert et al., 2006). 그러나, α-아마니틴은 특정 항체와 접합되는 경우에 더 이상 OATP1B3에 대한 기질이 아니다(Letschert et al., 2006; Moldenhauer et al., 2012; Faulstich and Fiume, 1985). 이러한 전략은 임상학적 적용에 대한 α-아마니틴의 독성을 극복한다. 대다수의 선암종에서 과발현되는 암 항원인, EpCAM에 대한 모노클로날 항체(HEA125)에 접합된 α-아마니틴(Moldenhauer et al., 2012; Went et al., 2004)을 사용하였다. ama-HEA125 접합체는 POLR2A손실 xhCRC 및 HCT116 암 세포를 p53-독립적 방식으로 선택적으로 사멸시켰고, 시험관내에서의 α-아마니틴의 효과적인 용량을 적어도 10,000-배만큼(IC50 약 0.01ng ml-1) 감소시켰다(도 3e 및 도 10g).
실시예 4 - POLR2A 의 억제는 POLR2A 손실 종양 성장을 선택적으로 억제한다
생체내에서의 POLR2A 억제의 항-종양 효과를 시험하기 위해서, Dox-유도가능한 POLR2A shRNA를 발현하는 HCT116 및 SNU283 세포를 면역약화된(immunocompromised) SCID BALB/c 마우스에게 피하 주사하였다. 초기 종양 확립 후, 음용수 중의 Dox의 투여는 POLR2A 발현을 억제시켰고, 결과적으로 SNU283-유도된 종양의 성장을 억제시켰다(도 4a). 그러나, 대조군과 POLR2A-녹다운 HCT116-유도된 종양 사이의 실질적인 차이는 관찰되지 않았다. 조직병리학적 분석은 POLR2A-녹다운(Dox: 1.0㎍ ml-1) SNU283 종양이, 상응하는 대조군 종양과 비교하여, 세포 증식(Ki67 염색)을 유의하게 감소시켰지만 더 많은 아폽토시스 세포를 나타냈음을 입증하였다(도 11a 내지 도 11b). 대조적으로, 대조군 또는 POLR2A-녹다운 HCT116 종양에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그러나, POLR2A의 이형접합성 결실은 Dox-유도가능한 POLR2A shRNA의 억제에 대해 POLR2A+/- HCT116-유도된 종양을 감작화시켰다(도 11c). 이어서, 정위 종양 모델을 사용하여 POLR2A 억제의 효과를 시험하였다. POLR2A중성 및 POLR2A손실 HCT116 세포를 SCID 마우스의 맹장 벽에 주사하였다. 일단 정위 종양이 확립되면, 마우스에게 음용수 중의 Dox(1.0㎍ ml-1)를 투여하였다. 종양의 생체내 생물발광 화상은 Dox-유도된 POLR2A 억제가 POLR2A손실 종양에서 종양 성장 속도(kinetics)에서 유의한 감소를 유도하였지만, 대조군 POLR2A중성 종양에서는 그렇지 않음을 입증하였다(도 4b 내지 도 4c). Dox의 3주 치료 후, POLR2A중성 종양 그룹에서 전체 종양은 가시적이었지만, 반면 POLR2A손실 그룹에서는 유의하게 감소된 종양 성장이 관찰되었거나 또는 가시적 종양이 관찰되지 않았다. 생체내에서의 POLR2A 침묵의 효능을 추가로 시험하기 위해서, 나노리포솜 전달 플랫폼인 DOPC(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린)를 POLR2A siRNA의 전신적 전달을 위해 사용하였다(Pecot et al., 2014). 2개의 특이적 POLR2A siRNA는 동종동계 HCT116 세포주에서 POLR2A 단백질의 80% 초과의 녹다운을 가졌다(도 12a). 1.0×106 동종동계 HCT116 세포의 정위 주사 후 10일에, 마우스에게 무작위로 치료 그룹을 할당하였다(n = 그룹당 10마리의 마우스). DOPC 나노리포솜에 통합된 siRNA의 2주마다의 치료가 시작되었다(도 12b). 4주의 전신 치료요법 후, 대조군 siRNA-DOPC 치료와 비교하여, 125μg kg-1의 POLR2A siRNA-DOPC 치료 그룹의 마우스는 POLR2A손실 종양의 현저한 성장 감소를 가졌고, 한편, POLR2A중성 종양은 POLR2A siRNA-DOPC의 1,000μg kg-1의 용량에서만 유의한 성장 억제를 가졌다(도 12c 내지 도 12f).
ama-HEA125 접합체는 시험관내 POLR2A손실 암 세포에 대해 높은 수준의 민감도를 나타냈다(도 3e 및 도 10g). 이어서, TP53/POLR2A중성 및 TP53/POLR2A손실 xhCRC 및 HCT116 세포의 동종동계 쌍에 의해 확립된 정위 종양 모델에서의 ama-HEA125의 항-종양 활성을 조사하였다(도 4d 내지 도 4e 및 도 13a 내지 도 13b). 용량 상승 실험에서, ama-HEA125는 종양을 지닌 마우스에게 이중 복강내 주사로서 마우스 체중의 kg당 α-아마니틴에 관하여 3, 10, 30 또는 90㎍의 용량으로 투여되었다(n = 그룹당 10마리의 마우스). 대조군 마우스는 비접합된 HEA125 mAb를 투여받았다(n = 10마리의 마우스). POLR2A손실 종양을 지닌 마우스에서, 대조군 HEA125-치료된 마우스는 항체 주사 후 25일 이내에 연속적 종양 성장을 보여주었다. ama-HEA125의 치료는 심지어 3㎍ kg-1의 최저 용량에서도 종양 성장에 대한 강한 억제를 나타냈다. 모든 POLR2A손실 종양은 ama-HEA125 치료에 반응하였고, 종양 체적은 현저하게 퇴행하였다(도 4d 내지 도 4e). ama-HEA125의 제1 투여 후 25일에 POLR2A손실 HCT116 종양을 지닌 마우스 10마리 중 10마리(90㎍ kg-1), 10마리 중 8마리(30㎍ kg-1) 및 10마리 중 6마리(10㎍ kg-1)에서 완전한 종양 퇴행이 관찰되었다(도 4d). 대조적으로, POLR2A중성 종양을 지닌 마우스에서는 단지 90㎍ kg-1의 최고 용량에서만 유의한 종양 억제가 관찰되었고, 3 내지 30㎍ kg-1의 용량에서는 그렇지 않았다. xhCRC-유도된 종양을 지닌 마우스에서 유사한 결과가 관찰되었다(도 4e). 이전 연구들(Moldenhauer et al., 2012)과 일치하여, 시험된 용량으로의 ama-HEA125의 치료는 생체내에서 현저한 독성을 갖지 않았다. 체중 및 혈액 간 효소의 분석은 ama-HEA125-치료된 그룹과 대조군 HEA125-치료된 그룹(도 13c 및 13d) 사이의 어떠한 실질적인 차이도 나타내지 않았고, 이는 ama-HEA125 접합체의 시스템 독성은 무시할만함을 시사한다. 또한, ama-HEA125의 항-종양 활성은 POLR2A중성 SW480 세포 및 POLR2A손실 SW837 세포로부터 유도된 정위 종양에서 추가로 시험되었다(도 14a 내지 도 14f). 10㎍ kg-1의 용량으로의 ama-HEA125의 치료는 모든 POLR2A손실 종양에서 종양 성장을 억제하기에 충분하였지만, POLR2A중성(SW480) 또는 POLR2A-재도입된(외인성 POLR2A를 발현하는 SW837) POLR2A손실 종양은 90㎍ kg-1의 용량에서 ama-HEA125에 의해서만 유의하게 억제되었다.
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본원에 개시되고 주장되는 방법들은 전부 본 개시의 관점에서 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태들의 관점에서 기술되어 왔지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 방법에 그리고 본원에 기술된 방법의 단계에 또는 본원에 기술된 방법의 단계의 순서에 변화가 적용될 수 있음은 당해 분야 숙련가들에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 물리적으로 관련되어 있는 소정 제제들은 본원에 기술되어 있는 제제에 대해 치환될 수 있고, 한편, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당해 분야 숙련가들에게 명백한 이러한 유사한 치환체 및 변형은 모두 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신, 범위 및 개념 이내인 것으로 생각된다.
참조문헌
하기 참조문헌은 이들이 본원에 제시된 것에 보충하여 예시적 절차 또는 다른 상세설명을 제공하는 정도로 본원에 인용에 의해 구체적으로 포함된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> METHODS OF TREATING CANCER HARBORING HEMIZYGOUS LOSS OF TP53 <130> UTFC.P1262WO <150> US 62/128,480 <151> 2015-03-04 <160> 32 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 gaggttggct ctgactgtac c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 2 tccgtcccag tagattacca c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 3 ttgtatccgt acccacagca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 catgatcagc tccccattct 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 5 ttagctttgt tcttcccga 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 6 tgttgtccat ctcctcccc 19 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 7 caccgcggcc tccctcagtc gtctc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 8 aaacgagacg actgagggag gccgc 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 9 caccggccgc tgccaaacat gtgc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 10 aaacgcacat gtttggcagc ggcc 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 11 aaaatctcca tctggacacg aaagg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 12 agcgcaaaac tttcattgtc ttcac 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 13 caccgccatt gttcaatatc gtccg 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 14 aaaccggacg atattgaaca atggc 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 15 caccgggcag ctacggtttc cgtc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 16 aaacgacgga aaccgtagct gccc 24 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 17 gaggagccgc agtcagatcc ta 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 18 gatacggcca ggcattgaag tc 22 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 19 uucuccgaac gugucacgu 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 20 acgugacacg uucggagaa 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 21 ccaacaugcu gacagauau 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 22 auaucuguca gcauguugg 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 23 ccaagaagcg gcucacaca 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 24 ugugugagcc gcuucuugg 19 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 25 ctggccgctg ccaaacatgt gcagg 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 26 gcggcctccc tcagtcgtct ctgg 24 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 27 ggggcggcct ccctcagtcg tctctgggta tttgatgcc 39 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 28 ggggcggcct ccctcagtcc tctgggtatt tgatgcc 37 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 29 ggactggccg ctgccaaaca tgtgcaggta agtgctgg 38 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 30 ggactggccg ctgccaaact gctgg 25 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 31 gggcagctac ggtttccgtc tgg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 32 ccattgttca atatcgtccg ggg 23

Claims (47)

  1. 암을 갖는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 조성물로서, 상기 암의 세포는: (i) TP53 유전자의 반접합성(hemizygous) 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 나타내고, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제를 포함하는, 암을 갖는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 POLR2A 억제제가, POLR2A 단백질의 발현을 억제하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 POLR2A 억제제가 아마톡신을 포함하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아마톡신이 알파-아마니틴인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 아마톡신이 항체에 접합되어 있는, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체가 항-EpCAM 항체인, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체가 종양-관련 항원에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 POLR2A 유전자 생성물이 mRNA인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준이 노던 블롯팅(Northern blotting), 역 전사-정량적 실시간 PCR(RT-qPCR), 뉴클레아제 보호, 전사체 분석, 하이브리드화 검정, 칩-기반 발현 플랫폼 또는 인베이더(invader) RNA 검정 플랫폼에 의해 측정되는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 POLR2A 유전자 생성물이 단백질인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준이 질량 분광측정법, 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침전, 면역조직화학, 또는 방사선 면역검정에 의해 측정되는, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 참조 발현 수준이 비-암성 세포에서의 발현 수준인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 TP53 유전자의 반접합성 손실 또는 POLR2A 유전자의 반접합성 손실이 게놈 하이브리드화 기술, PCR 분석 또는 제한 단편 분석에 의해 측정되는, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 TP53 유전자의 반접합성 손실을 나타내는, 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 나타내는, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 환자가, 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 나타내는 암 세포를 갖는, 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암, 뇌암, 유방암, 간암, 난소암, 결장직장암, 전립선암 또는 췌장암 세포인, 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 전이성, 재발성 또는 다중-약물 내성인, 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 적어도 제2 항암 치료제를 추가로 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제2 항암 치료제가 화학 치료학적 제제인, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 화학 치료학적 제제가 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 SN-38인, 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 환자가 사람인, 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 환자가 비-사람 포유동물인, 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 환자가 이전에 적어도 1회의 항암 치료요법을 경험한, 조성물.
  25. (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 나타내는 암 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이러한 환자에게 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제를 투여함을 포함하는, 암 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 환자가 적어도 2회 치료받는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 환자가 1주 내지 6개월의 기간에 걸쳐 치료받는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 대상체에게 적어도 제2 항암 치료요법을 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제2 항암 치료요법이 수술 치료요법, 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 냉동 치료요법, 호르몬 치료요법, 독소 치료요법, 면역 치료요법 또는 사이토카인 치료요법인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 화학 치료요법이 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 또는 SN-38인, 방법.
  31. (a) (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는 암 세포를 갖는 것으로 측정된 환자를 선택하는 단계; 및
    (b) 상기 환자에게 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제를 투여하는 단계
    를 포함하는, 암을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  32. 환자 유래의 암 세포가 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는지를 측정함을 포함하는, POLR2A 억제제를 이용한 치료를 위한 환자를 선택하는 시험관내 방법.
  33. 제32항에 있어서, 환자를 선택함이 암의 샘플을 수득하고 상기 암의 세포가 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는지를 측정함을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 측정의 리포트를 제공함을 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 리포트가 서면 또는 전자 리포트인, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 리포트가 환자, 건강 관리비 지불인, 의사, 보험 대리점 또는 전자 시스템에 제공되는, 방법.
  37. 제32항에 있어서, 환자를 선택함이 상기 암의 세포가 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는지를 측정하는 시험에 대한 결과를 수득함을 포함하는, 방법.
  38. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 TP53 유전자의 반접합성 손실을 포함하는지를 측정함을 포함하는, 방법.
  39. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 포함하는지를 측정함을 포함하는, 방법.
  40. 제32항에 있어서, 상기 암 세포가 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자의 발현을 포함하는지를 측정함을 포함하는, 방법.
  41. 암 환자에 대한 약물 치료요법을 선택하는 시험관내 방법으로서,
    (a) 상기 암의 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 암의 세포에서 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현의 존재를 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 암의 세포에서 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실이 검출되거나; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실이 검출되거나; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현이 검출되는 경우에 POLR2A 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, 암 환자에 대한 약물 치료요법을 선택하는 시험관내 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 POLR2A 억제제를 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 암의 세포가 TP53 유전자의 반접합성 손실을 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 암의 세포가 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 포함하는, 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 암의 세포가 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는, 방법.
  46. 대상체에서의 암의 치료에 사용하기 위한 POLR2A 억제제를 포함하는 조성물로서, 상기 암의 세포는 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는 것으로 측정된, 대상체에서의 암의 치료에 사용하기 위한 POLR2A 억제제를 포함하는 조성물.
  47. 암의 치료를 위한 의약의 제조시 POLR2A 억제제의 용도로서, 상기 암의 세포는 (i) TP53 유전자의 반접합성 손실; (ii) POLR2A 유전자의 반접합성 손실; 또는 (iii) 참조 발현 수준에 비해 감소된 수준의 POLR2A 유전자 생성물의 발현을 포함하는 것으로 측정된, 암의 치료를 위한 의약의 제조시 POLR2A 억제제의 용도.
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