KR20110140124A - 암치료용 아미톡신-활성 표적 결합 부위 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양치료에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명은 암의 치료에 유용한 표적 결합 부위 및 독소의 복합체(conjugate)에 관한 것이다. 특히 독소는 아마톡신이며 또한 표적 결합 부위 (예, 항체)는 상피세포접착분자(EpCAM) 등의 종양 관련 항원에 대한 것이다. 추가의 양상에서, 본 발명은 이러한 표적-결합 부위 독소 복합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이러한 약학적 조성물의 제조를 위한 상기 표적 결합 부위 독소 복합체의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체 및 약제학적 조성물은 암 특히 샘암종, 예를 들어 췌장암, 담관암, 유방암 및 대장암의 치료에 유용하다.

Description

암치료용 아미톡신-활성 표적 결합 부위{AMATOXIN-ARMED TARGET-BINDING MOIETIES FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 종양치료에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명은 암의 치료에 유용한 표적 결합 부위 및 독소의 복합체(conjugate)에 관한 것이다. 특히 독소는 아마톡신이며 또한 표적 결합 부위 (예, 항체)는 상피세포접착분자(EpCAM) 등의 종양 관련 항원에 대한 것이다. 추가의 양상에서, 본 발명은 이러한 표적-결합 부위 독소 복합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이러한 약학적 조성물의 제조를 위한 상기 표적 결합 부위 독소 복합체의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체 및 약제학적 조성물은 암 특히 샘암종, 예를 들어 췌장암, 담관암, 유방암 및 대장암의 치료에 유용하다.
아마톡신((amatoxin)은 8개 아미노산으로 이루어진 환상 펩티드이다. 이들은 아마니타 팔로이데스(Amanita phalloides)버섯으로부터 분리되거나 또는 합성에 의해 빌딩 블록으로부터 제조할 수 있다. 아마톡신은 포유동물 세포의 DNA-의존성 RNA 중합효소 II를 특이적으로 억제하며, 따라서 영향을 받은 세포들의 전사 및 단백질 생합성을 특이적으로 억제한다. 세포 중에 전사의 억제는 성장 및 증식의 정지 원인이 된다. 아마니틴과 RNA-중합효소II 사이의 복합은 공유결합되지 않았지만 매우 견고하다(KD = 3nM). 상기 효소로부터 아마니틴의 해리는 영향을 받은 세포의 회복을 어렵게 하는 매우 느린 공정이다. 전사의 억제가 너무 오래 지속하는 경우, 세포는 프로그램 세포사(세포 자멸사)를 당할 것이다.
상피세포접착 분자
상피세포접착분자(EpCAM, CD326)은 인간 종양에 대해 가장 잘 연구된 표적 항원중의 하나이다(Trzpis et al., 2007; Baeuerle and Gires, 2007). 이것은 겉보기 분자량 40 kDa를 갖는 314개 아미노산의 타입 I 막 당단백질을 나타낸다(Balzar et al., 1999). 이것은 대부분의 샘암종에서 과잉 발현된다(Winter et al., 2003; Went et al., 2004). 특히 EpCAM 발현은 림프절 양성 유방암, 난소상피암, 담관암, 췌장 샘암종, 및 편평세포 경두부 암에서 증가된다. 증가된 EpCAM 발현은 유방 및 담낭 암에서 매우 낮은 예측을 나타낸다(Gastl et al., 2000; Varga et al., 2004; Spizzo et al., 2002; Spizzo et al., 2004). 중요하게는, EpCAM는 유방, 대장 및 췌장 암종에서 종양 개시 또는 암 줄기세포에 의해 발현된다 (Al-Hajj et al., 2003; Dalerba et al., 2007; Li et al., 2007).
EpCAM 특이적 모노클로날 항체는 암 환자에서 희귀 순환성 종양세포의 검출을 위한 진단도구로서 사용되었다 (Allard et al., 2004; Nagrath et al., 2007). 한 쌍의 변환 안티-EpCAM 항체는 임상 연구에서 최근에 조사되고 있다.
아마톡신 및 항체의 복합체
본 발명자들의 선행 특허출원 EP 1 859 811 A1 (2007년 11월 28일 공개)는 β-아마니틴이 알부민에 결합되거나 또는 모노클로날 항체 HEA125, OKT3 및 PA-1에 결합되는 복합체를 기술하고 있다. 더욱이 유방암 세포(MCF-7), Burkitt 림프종 세포(Raji) 및 T-림프종 세포(Jurkat)의 증식에 대한 이들 복합체의 억제 효과가 연구되었다.
선행기술에서는 훨씬 더 낮은 농도에서 표적 세포 또는 조직에 대한 독성 효과를 발휘하는 표적 결합 부위 독소 복합체에 대한 요구가 있었다. 더욱이, 선행기술에서는 다른 유형의 질환을 치료하기 위한 요구, 특히 다른 유형의 암을 치료하기 위한 요구가 남아 있으며, 이들 질환은 치료 내성이 있거나 또는 실제 종양 치료에 낮게 반응한다.
본 발명은 이들 및 다른 요구들을 충족시킨다. 예를 들면, 본 발명자들은 본 발명의 주요한 실험들을 통하여 아마톡신을 포함하는 복합체 및 신규 키메라 항체 huHEA125가 선행기술에 기술된 복합체보다 훨씬 더 낮은 농도에서 종양세포 증식을 억제할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 특히 아마톡신을 포함하는 복합체 및 키메라 항체 huHEA125가 선행기술의 복합체를 사용할 때 요구되는 농도의 약 100이 되는 농도에서 이들의 억제 효과를 발휘한다. 더욱이 본 발명자들은 아마톡신을 포함하는 복합체 및 상기 huHEA125 특이적 항체가 유방암 세포의 증식을 억제할 수 없지만, 놀랍게도 췌장 샘암종 세포, 대장암 세포 및 담관암 세포의 증식을 억제할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 그 외에, 본 발명자들은 복합체의 아마톡신 부분에서 특수한 결합 지점이 매우 낮은 농도(IC50 대략 2x10-12 내지 2x10-11 M)에서 표적 세포에 대한 이들의 독성 활성을 발휘하며 또한 이들의 표적 세포에 고도로 특이적인 매우 효과적인 표적 결합 부위 독소 복합체 (특히 항체 독소 복합체)을 생산한다는 것을 밝혀냈다. 특정한 이론으로 구속받고 싶지는 않지만, 이러한 후자의 이점은 아마톡신이 표적 세포 내측에 (그러나 세포 외측은 아님) 표적 결합 부위 아마톡신 복합체로부터 효율적으로 분리된다고 설명될 수 있다.
상술한 개요는 본 발명에 의해 해결되는 모든 과제들을 필수적으로 설명하지 않는다.
첫 번째 양상에서, 본 발명은 환자의 췌장암, 담관암 또는 대장암을 치료하기 위한 항체 독소 복합체이며, 여기서 상기 복합체가 (i) 상피 세포 접착 분자(EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; (ii) 아마톡신; 및 (iii) 임의로 링커 L1을 포함하는 항체 독소 복합체에 관한 것이다.
두 번째 양상에서 본 발명은 하기 (i) 내지 (iii)를 포함하는 항체 독소 복합체(antibody toxin conjugate)에 관한 것이다.
(i) 상피 세포 접착 분자(EpCAM)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 (a) 및 (b)를 포함함:
(a) huHEA125의 중쇄, 여기서 상기 중쇄가 하기 (a1) 및 (a2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
(a1) 서열번호 1에 따른 중쇄의 막 결합 형태, 여기서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 여기서 서열번호 26으로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함함; 및
(a2) 서열번호 2에 따른 중쇄의 가용형태, 여기서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 여기서 서열번호 27로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함함; 및
(b) 서열번호 11에 따른 huHEA125의 중쇄, 여기서 서열번호 12로 나타낸 바와 같은 경쇄 VL의 가변영역은 VL의 골격부위에 위치한 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함하며,또한 여기서 서열번호 28로 나타낸 바와 같은 경쇄 CL의 불변영역은 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함함;
(ii) 아마톡신; 및
(iii) 임의로 링커 L2.
세 번째 양상에서 본 발명은 약제로 사용되는 두 번째 양상에 따른 항체 독소 복합체에 관한 것이다.
네 번째 양상에서 본 발명은 환자의 암을 치료하기 위한 두 번째 양상에 따른 항체 독소 복합체이며, 여기서 상기 암은 췌장암, 담관암, 유방암 및 결장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체 독소 복합체에 관한 것이다.
다섯 번째 양상에서, 본 발명은 (i) 표적 결합 부위; (ii) 아마톡신; 및 (iii) 임의로 링커 L3을 포함하는 표적 결합 부위 독소 복합체이며, 여기서 상기 아마톡신이 표적 결합 부위에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자를 통해 링커 L3에 연결되는 표적 결합 부위 독소 복합체에 관한 것이다.
여섯 번째 양상에서, 본 발명은 약제로 사용되는 다섯 번째 양상에 따른 표적 결합 부위 독소 복합체에 관한 것이다.
일곱 번째 양상에서, 본 발명은 환자의 암을 치료하기 위한 다섯 번째 양상에 따른 표적 결합 부위 독소 복합체이며, 여기서 상기 암은 췌장암, 담관암, 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표적 결합 부위 독소 복합체에 관한 것이다.
여덟 번째 양상에서, 본 발명은 첫 번째 양상 또는 두 번째 양상에 따른 항체 독소 복합체 또는 다섯 번째 양상에 따른 표적결합 부위 독소 복합체를 포함하며 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제, 충진제, 결합제, 윤활제, 활제, 붕괴제, 흡수제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 요약은 본 발명의 모든 특징들을 반드시 설명하는 것은 아니다.
도 1은 상이한 아마톡신의 구조식을 나타낸다. 굵은 글씨의 번호(1 내지 8)은 아마톡신을 형성하는 8개 아미노산의 표준 번호를 나타낸다. 아미노산 3에서 가장 중요한 탄소 원자는 그리스 문자 α,β,γ, 및 δ로 표식된다. (치환된) 트립토판의 측쇄에서 원자번호, 즉 아미노산 번호 4도 또한 나타낸다 (번호 1' 내지 7').
도 2는 결합 경쟁 분석에 의해 표적 세포에 huHEA125-Ama 및 huHEA125의 결합 친화력의 비교를 나타낸다. EpCAM-발현 Colo205 세포들은 일정량의 직접 FITC-표식된 마우스 HEA125 항체로 접종하였다. 표적 세포에 대한 결합은 흐름 세포측정법(flow cytometry)에 의해 분석하였다. 증가하는 량의 huHEA125-Ama 및 huHEA125로의 결합 경쟁은 표적 항원에 대해 매우 유사한 친화력을 나타냈다.
도 3은 간접 면역 형광법에 의해 검출된 다양한 암종 세포주에 대한 EpCAM 항원의 표면 발현을 나타낸다. 도 3A는 Capan-1 (인간 췌장 샘암종); 도 3B는 Colo-205 (인간 결장 샘암종); 도 3C는 OZ (인간 담관암); 및 3D는 MCF-7 (인간 유방 샘암종 라인), 3E는 BxPC-3 (인간 췌장 샘암종), 및 3F는 PC-3 (인간 전립선 샘암종)이다. 각 다이어그램의 좌측에서 회색 음영 히스토그램은 대조 항체 Xolair®로 얻어진 결과를 나타낸다; 각 다이어그램의 우측에서 백색 부위를 갖는 히스토그램은 항체 huHEA125로 얻어진 결과를 나타낸다.
도 4는 아마니틴-활성 항체 huHEA125, 아마니틴-활성 대조 항체 Xolair®, 및 자유 아마니틴으로 기인한 Capan-1 세포 증식의 억제의 비교를 나타낸다.
도 5는 아마니틴-활성 항체 huHEA125, 아마니틴-활성 대조항체 Xolair®, 및 자유 아마니틴으로 기인한 Colo 205 세포 증식의 억제의 비교를 나타낸다.
도 6은 아마니틴-활성 항체 huHEA125, 아마니틴-활성 대조 항체 Xolair®, 및 자유 아마니틴으로 기인한 MCF-7 세포 증식의 억제의 비교를 나타낸다.
도 7은 아마니틴-활성 항체 huHEA125, 아마니틴-활성 대조 항체 Xolair®, 및 자유 아마니틴으로 기인한 OZ 세포 증식의 억제의 비교를 나타낸다.
도 8은 아마니틴-활성 항체 huHEA125, 아마니틴-활성 대조 항체 Xolair®, 및 자유 아마니틴으로 기인한 BxPC-3 세포 증식의 억제의 비교를 나타낸다.
도 9는 huHEA125-아마니틴 처리 후 NOD/SCID 마우스에서 BxPC-3 종양 이종이식의 성장 억제를 나타낸다.
도 10은 huHEA125-아마니틴 처리 후 NOD/SCID 마우스에서 PC-3 종양 이종이식의 성장 억제를 나타낸다.
정의
본 발명을 이하에 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 여기에서 기술되는 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약은 변화할 수 있기 때문에 이들로 제한되지 않는 것으로 이해해야 할 것이다. 또한 여기에서 사용되는 용어는 특정한 실시양태를 단지 설명할 목적이지, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위로만 제한되는 것으로 이해해야 할 것이다. 별도로 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다.
바람직하게, 여기에서 사용되는 용어들은 "생물공학적 용어의 다국어 용어집: (IUPAC 권장)"에 기술된 바와 같이 정의된다[Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kobl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, 스위스].
본 명세서 및 이후의 특허청구범위 전반을 통해서, 문맥에서 별도로 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형어 "포함하다" 및 "포함하는" 등은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수의 그룹 또는 단계들을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수의 그룹 또는 단계들을 제외하지 않는 것을 암시하는 것으로 이해해야 할 것이다.
여러 가지 문헌들은 본 명세서의 문맥 전반에 걸쳐 인용되어 있다. 여기에 인용된 문헌들 (모든 특허, 특허출원, 과학적 간행물, 제조업자 설명서, 지침서, GenBank 수탁번호 서열 제안 등을 포함)의 각각은, 앞에서든지 아래에서 든지, 그의 전체가 여기에서 참고로 인용된다. 본 명세서에서 발명이 선행발명에 의해서 이러한 기술내용을 선행할 자격이 없다는 인정으로 해석되어야 하는 것은 아니다.
여기에서 사용되는 용어 "표적 결합 부위"는 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 언급한다. 본 출원의 문맥에서 바람직한 표적 결합부위는 (i) 항체 또는 이의 항원결합 단편; (ii) 항체 유사 단백질; 및 (iii) 핵산 앱타머(aptamer)이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 "표적 결합 부위"는 전형적으로 40,000 Da (40kDa) 이상의 분자량을 갖는다.
본 출원의 문맥에서 용어 "표적 분자" 및 "표적 에피토프"는 각각 표적 결합 부위(target-binding moieties)에 의해 특이적으로 결합되는 항원 및 항원의 에피토프를 언급하며, 바람직하게 상기 표적 분자는 비-종양세포의 표면에 비하여 증가된 농도에서 및/또는 상이한 입체 배열에서 하나 이상의 종양 세포 유형의 표면상에 존재하는 종양 관련 항원, 특히 항원 또는 에피토프이다. 바람직하게, 상기 항원 또는 에피토프는 하나 이상의 종양 세포 타입의 표면상에 존재하지만 비-종양 세포의 표면상에는 존재하지 않는다.
여기에서 사용되는 용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 면역글로불린 분자 및 면역 글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원을 면역특이적으로 결합하는 항원 결합부위를 포함하는 분자를 언급한다. 또한 예를 들면 표적 분자 예를 들어 표적 단백질 EpCAM에 특이적으로 결합할 수 있는 파지 디스플레이(phage display)을 포함하는 기술들을 통하여 선택되는 면역 글로불린 유사 단백질이 포함된다. 본 발명의 면역 글로불린 분자는 임의의 타입 (예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역 글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 "항체 및 이의 항원-결합 단편"은 폴리클로날, 모노클로날, 일가, 이중 특이성, 헤테로 복합체, 다중 특이성, 인간, 인간화 (특히 CDR-그라프트 결합), 탈면역화 또는 키메르 항체, 단일쇄 항체 (예, scFv), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 2중 항체 또는 4중 항체(Holliger P. et al., 1993), 나노항체(nanobody), 항-이디오타입 (안티-Id) 항체 (예를 들면 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체), 및 상기의 어느 하나의 에피토프 결합 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 항원-결합 단편은 본 발명의 인간 항원-결합 항체 단편이며 또한 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fvs (scFv), 단일쇄 항체, 디설파이드 결합 Fvs (dsFv) 및 VL 또는 VH 영역을 포함하는 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 단일쇄 항체를 포함하는 항원 결합 항체 단편은 가변 영역(들) 단독으로 또는 다음의 전부 또는 일부와 조합되게 포함할 수 있다: 힌지 영역, CL, CH1, CH2, 및 CH3 영역. 또한 본 발명에는 가변영역(들)과 힌지 영역, CL, CH1, CH2, 및 CH3 영역과의 특정한 조합을 포함하는 항원 결합 단편이 포함된다.
본 발명에 사용 가능한 항체는 조류 및 포유류를 포함하는 특정한 동물 기원으로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 항체는 인간, 설치류 (예, 마우스 및 래트), 당나귀, 산양, 토끼, 염소, 기니 피그(guinea pig), 낙타, 말 또는 닭이다. 항체는 인간 또는 생쥐 기원인 것이 특히 바람직하다. 여기에서 사용되는 "인간 항체"는 인간 면역 글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며 또한 인간 면역 글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역 글로불린에 유전자 삽인 동물로부터 분리된 항체를 포함하며, 이는 예를 들면 Kucherlapati & Jakobovits의 미국특허 제5,939,598호에 기술된 바와 같이 내인성 면역 글로불린을 발현하지 않는다.
용어 "항체 유사 단백질"은 표적분자에 특이적으로 결합하도록 (예, 루프의 돌연변이발생에 의해) 구성된 단백질을 언급한다. 전형적으로, 이러한 항체 유사 단백질은 단백질 골격에 양끝에 부착된 적어도 하나의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 압박은 항체의 것에 필적할 만한 수준으로 항체 유사 단백질의 결합 친화력을 크게 증가시킨다. 가변 펩티드 루프의 길이는 전형적으로 10 내지 20개의 아미노산으로 이루어져 있다. 골격 단백질은 양호한 용해 특성을 갖는 특정한 단백질일 수 있다. 바람직하게, 골격 단백질은 작은 구상 단백질이다. 항체 유사 단백질은 제한적이지 않지만 애피바디(affibodies), 안티칼린(anticalins), 및 고안된 안키린(ankyrin) 반복 단백질을 포함한다 (검토; Binz et al. 2005 참조). 항체 유사 단백질은 돌연변이체의 큰 라이브러리로부터 유도할 수 있으며, 예를 들면 큰 파지 진열 라이브러리로부터 설계할 수 있으며 또한 규칙적 항체에 유사하게 분리할 수 있다. 또한 항체 유사 결합 단백질은 구상 단백질에서 표면 노출 잔기의 조합 변이 발생에 의해 얻어질 수 있다.
용어 "핵산 앱타머"(aptamer)는 표적 분자에 결합하기 위하여 반복 라운드의 in vitro 선택 또는 SELEX (급격한 증균에 의한 리간드의 계통적 진화)를 통하여 제작된 핵산 분자를 언급한다 (검토: Brody and Gold, 2000 참조). 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 앱타머는 변형, 예들 들면 2'-불소-치환된 피리미딘 등의 개질 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
용어 "아마톡신"은 속 아마니타(Amanita)로부터 분리되고 문헌(Wieland, T. and Faulstich H., 1978)에 기술된 8개의 아미노산으로 이루어진 모든 환상 펩티드; 추가로 이의 모든 화학적 유도체; 추가로 이의 모든 반합성 유사체; 추가로 천연 화합물(환상, 8개의 아미노산)의 주요 구조체에 따른 빌딩 블록으로부터 구축된 모든 합성 유사체, 추가로 하이드록실화 아미노산 대신에 비-하이드록실화 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체, 추가로 티오에테르 설폭사이드 부위가 설파이드, 추가로 설폰에 의해 또는 황과 상이한 원자, 예들 들어 아마니틴의 카르바아날로그에서와 같은 탄소 원자에 의해 치환되는 모든 합성 또는 반합성 유사체를 포함한다.
기능적으로, 아마톡신은 포유동물 RNA 중합효소 II를 억제하는 펩티드 또는 뎁시펩티드로서 정의된다. 바람직한 아마톡신은 항체 또는 항체 단편 등의 링커 분자 또는 단백질과 반응할 수 있는 작용기(예, 카르복실기, 아미노기, 하이드록실기, 티올 또는 티올-캡처링 그룹)을 갖는 것들이다. 본 발명의 복합체에 특히 적합한 아마톡신은 도 1에 나타낸 바와 같은 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,δ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 아마눌린산은 물론 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체이다. 본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴 및 아마니아미드이다.
여기에서 사용되는 화합물의 "유도체"는 상기 화합물에 존재하지 않는 적어도 하나의 화학적 그룹을 함유하는 상기 화합물에 유사하며 및/또는 상기 화합물에 존재하는 적어도 하나의 화학적 그룹이 불충분한 화학구조를 갖는 종을 언급한다. 상기 유도체에 비교되는 화합물은 "모체" 화합물로 알려져 있다. 전형적으로, "유도체"는 하나 이상의 화학반응 단계에서 모체 화합물로부터 생산할 수 있다.
여기에서 사용되는 화합물의 "유사체"는 상기 화합물에 구조적으로 관련이 되어 있지만 이와 동일하지는 않으며 또한 상기 화합물의 적어도 하나의 활성을 나타낸다. 유사체에 비교되는 화합물은 "모체" 화합물로 알려져 있다. 전술한 활성은 제한적이지 않지만 또 하나의 화합물에 대한 결합활성, 억제 활성, 예를 들면 효소 억제 활성; 독성 효과; 활성화 작용, 예를 들면 효소 활성화 작용을 포함한다. 상기 유사체는 이러한 작용을 모체 화합물과 동일한 정도로 나타내는 것이 요구되지 않는다. 화합물은 모체 화합물의 활성의 적어도 1% (더욱 바람직하게 적어도 5%, 더욱 바람직하게 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게 적어도 약 40%, 및 더욱 바람직하게 적어도 약 50%) 정도로 관련 활성을 나타내는 경우, 본 출원의 문맥 중에서 유사체로서 인정된다. 따라서 여기에서 사용되는 "아마톡신의 유사체"는 도 1에 나타낸 바와 같은 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 및 아마눌린산 중 어느 하나에 구조적으로 관련되며, 또한 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 및 아마눌린산의 적어도 하나에 비하여 포유동물 RNA 중합효소 II에 대한 억제 활성의 적어도 1% (더욱 바람직하게 적어도 5%, 더욱 바람직하게 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게 적어도 약 40%, 및 더욱 바람직하게 적어도 약 50%)를 나타내는 화합물을 언급한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 "아마톡신의 유사체"는 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 또는 아마눌린산의 어느 것보다 포유동물 RNA 중합효소 II에 대하여 더 큰 억제 활성을 나타낼 수도 있다. 억제 활성은 50% 억제가 발생하는 농도(IC50값)을 결정하여 측정할 수 있다.
본 출원의 문맥에서 "링커"는 예를 들면 표적 결합부위와 아마톡신 사이의 입체장애를 경감하기 위하여 두 개의 성분 사이의 거리를 증가시키며, 그렇지 않으면 RNA 중합효소II와 상호작용할 수 있는 아마톡신의 능력을 감소시키는 분자를 말한다. 링커는 표적 결합 부위에 의해 표적화 되는 세포에서 특이적으로 아마톡신의 방출을 촉진할 수 있기 때문에 또 하나의 목적으로 작용할 수 있다. 링커 및 바람직하게는 한 측에서는 링커와 아마톡신 사이의 결합 및 다른 측에서는 링커와 항체 사이의 결합이 혈액 등의 세포 외측의 생리적 조건에서 안정하며, 반면 세포 내측, 특히 표적 세포, 예를 들면 암세포 또는 면역세포 내측에서 분할될 수 있다. 이러한 선택적 안정성을 제공하기 위하여, 링커는 문헌[S. Fletcher, M. R. Jorgensens and A. D. Miller; Org. Lett. 2004, 6(23), pp 4245-4248]에 기술된 바와 같이 pH-민감성 링커를 생성하기 위하여 바람직하게는 pH에 민감하거나 또는 예를 들면 문헌[L. DA Ibsen, Blood 2003, 102, 1458-65 또는 Francisco JA, Cerreny CG, Meyer DL, Nat. Biotechnol 2003, 21, 778-84]에 기술된 바와 같이 단백질 분해효소 민간성 링커를 생산하기 위하여 단백질 분해효소에 민감한 작용기성(functionality)을 포함할 수 있다. 이와는 달리, 표적 결합 부위에 링커를 연결하는 결합은 선택적 안정성을 제공할 수 있다. 바람직하게는 링커는 적어도 1의 길이, 바람직하게는 1-20의 원자 길이 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 원자)을 가지며, 여기에서 링커의 한 측은 아마톡신과 반응하였으며 또한 다른 측은 표적 결합 부위와 반응하였다. 본 발명의 문맥에서 링커는 바람직하게, 임의로 치환된, C1 -20-알킬, C1 -20-헤테로알킬, C2 -20-알케닐, C2 -20-헤테로알케닐, C2 -20-알키닐, C2 -20-헤테로알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 헤테로아르알킬 그룹이다. 링커는 하나 이상의 구조 원자 예를 들면 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 탄화수소 부위 등을 포함할 수 있다. 링커는 또한 이들 구조 원자의 2개 이상의 조합을 포함할 수 있다. 이들 구조 원자 중의 하나는 한 번 이상, 예를 들면 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번 또는 여섯 번 링커 내에 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서 링커는 디설파이드 결합을 포함할 수 있다. 링커는 단일 단계에서 또는 둘 이상의 후속 단계에서 아마톡신 및 표적 결합 부위에 부착해야 하는 것으로 이해된다. 그 말단에 링커는 바람직하게 근위 및 먼쪽 말단에서 두 개의 그룹을 가질 것이며, 이는 (i) 아마톡신 또는 표적 결합 펩티드 상의 한 그룹, 바람직하게 활성화 그룹에 공유결합을 형성하거나 또는 (ii) 아마톡신 상의 한 그룹과 공유결합을 형성하기 위하여 존재하거나 활성화될 수 있다. 따라서 링커가 존재하는 경우, 화학적 그룹은 링커의 근위 및 먼 쪽 말단에서 있는 것이 바람직하며, 이들 그룹은 이러한 커플링 반응, 예를 들면 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩티드 결합 등의 결과이다. "링커"의 존재는 임의적이며, 즉 독소는 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체의 일부 실시양태에서 표적 결합 부위의 잔기에 직접 연결될 수 있다. 링커는 바람직하게는 그의 말단에서 표적 부위에 결합을 통해 직접 연결되는 것이 바람직하다. 표적 결합 부위가 예를 들면 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는, Asp, Glu, Arg, Lys, Cys 잔기의 형태로, 자유 아미노, 카르복시 또는 설프히드릴 그룹을 포함하는 경우, 링커는 이러한 그룹에 연결되는 것이 바람직하다.
여기에서 사용되는 첫 번째 화합물 (예, 항체)는 상기 화합물에 대한 해리 상수 KD가 100μΜ 이하, 바람직하게 50 μΜ 이하, 바람직하게 30μM 이하, 바람직하게 20 μΜ 이하, 바람직하게 10μM 이하, 바람직하게 5 μΜ 이하, 더욱 바람직하게 1μM 이하, 더욱 바람직하게 900 nΜ 이하, 더욱 바람직하게 800nM 이하, 더욱 바람직하게 700nM 이하, 더욱 바람직하게 600 nΜ 이하, 더욱 바람직하게 500 nM 이하,더욱 바람직하게 400 nM 이하, 더욱 바람직하게 300 nΜ 이하, 더욱 바람직하게 200 nM 이하, 더더욱 바람직하게 100 nM 이하, 더더욱 바람직하게 90 nΜ 이하, 더더욱 바람직하게 80 nM 이하, 더욱 바람직하게 70 nM 이하, 더더욱 바람직하게 60 nM 이하, 더더욱 바람직하게 50 nΜ 이하, 더더욱 바람직하게 40 nM 이하, 더더욱 바람직하게 30 nM 이하, 더더욱 바람직하게 20 nΜ 이하, 및 더더욱 바람직하게 10 nM 이하인 경우, 두 번째 화합물 (예, 표적 단백질 등의 항원)에 "특이적으로 결합"하는 것으로 여겨진다.
여기에서 사용되는 "환자"는 여기에서 기술되는 표적 결합 부위 독소 복합체에 의한 처리로부터 유익할 수 있는 특정한 포유류 또는 조류를 의미한다. 바람직하게, "환자"는 실험실 동물 (예, 마우스 또는 래트), 가축 (예, 구니 픽, 토끼, 당나귀, 면양, 염소, 닭, 낙타, 말, 고양이 또는 개를 포함), 또는 인간을 포함한 영장류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. "환자"는 인간인 것이 특히 바람직하다.
여기에서 사용되는 질병 또는 질환의 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 다음 (a) 내지 (e)중의 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다: (a) 장애의 중증도를 감소시킴; (b) 치료 대상의 질환(들)의 증상 특성의 진전을 제한 또는 예방함; (c) 치료되는 질환(들)의 증상 특성의 악화를 억제시킴; (d) 이전에 질환(들)을 가졌던 환자에서 질환(들)의 재발을 제한 또는 예방함; 및 (e) 질환(들)에 대해 이전에 증상을 가졌던 환자에서 증상의 재발을 제한 또는 예방함.
여기에서 사용되는 "투여하는"은 생체내 투여는 물론 정맥 이식편 등의 생체외 조직에 직접 투여를 포함한다.
"유효량"은 의도된 목적을 달성하는데 충분한 치료제의 량이다. 소정의 치료제의 유효량은 약제의 성격, 투여 경로, 치료제를 수용하는 동물의 크기 및 종, 및 투여 목적에 따라 변화할 것이다. 각 개체의 경우에 유효량은 당해 분야에 확립된 방법에 따라 기술자에 의해 경험적으로 결정할 수 있다.
"약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 동물 및 더욱 특히 인간에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 리스트 되어 있는 것을 의미한다.
발명의 실시양태
본 발명은 이하에 더욱 설명될 것이다. 다음의 설명들에서 본 발명의 상이한 양상들은 더욱 자세하게 정의된다, 이렇게 정의된 각각의 양상은 별도로 분명하게 지적되지 않는 한 특정의 다른 양상 또는 양상들과 조합할 수 있다. 특히 바람직하거나 또는 유리한 것으로 지적된 어떠한 특징은 바람직하거나 또는 유리한 것으로 지적된 어떠한 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
첫 번째 양상에서 본 발명은 환자의 췌장암, 담관암 또는 대장암을 치료하기 위한 항체 독소 복합체이며, 여기서 상기 복합체가 (i) 상피 세포 접착 분자(EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; (ii) 아마톡신; 및 (iii) 임의로 링커를 포함하는 항체 독소 복합체에 관한 것이다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이중항체, 사중항체, 나노항체, 키메라 항체, 탈면역화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체로부터 선택된다. 첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv, 및 디설파이드-결합 Fvs (dsFv)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서 EpCAM의 에피토프는 인간 EpCAM의 에피토프이다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) huHEA125의 중쇄의 CDR3 영역 (서열번호: 22); 및/또는 (b) huHEA125의 경쇄의 CDR3 영역 (서열번호: 25)를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 22 및 서열번호: 25로 기술된 바와 같은 이들 CDR3 영역의 둘 다를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 (a) 내지 (d)중의 하나 이상을 추가로 포함한다: (a) huHEA125의 중쇄의 CDR2 영역 (서열번호: 21); (b) huHEA125의 중쇄의 CDR1 영역 (서열번호: 20); (c) huHEA125의 경쇄의 CDR2 영역 (서열번호: 24); 및 (d) huHEA125의 경쇄의 CDR1 영역 (서열번호: 23). 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 huHEA125의 중쇄의 CDR3 영역 (서열번호: 22), CDR2 영역 (서열번호: 21), 및 CDR1 영역 (서열번호: 20)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 huHEA125의 경쇄의 CDR3 영역 (서열번호: 25), CDR2 영역 (서열번호: 24), 및 CDR1 영역 (서열번호: 23)을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 중쇄 및 경쇄의 CDR3 영역, CDR2 영역 및 CDR1 영역을 포함하며, 즉 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 20, 21, 22, 23, 24 및 25에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 huHEA125의 중쇄(=VH)의 가변 영역 (서열번호: 3), 및/또는 huHEA125의 경쇄(=VL)의 가변 영역 (서열번호: 12)를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 huHEA125의 VH 영역 (서열번호: 3), 및 VL 영역 (서열번호: 12) 둘 다를 포함한다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 huHEA125의 중쇄 (가용 형태, 서열번호: 2), 및/또는 huHEA125의 경쇄 (서열번호: 12)를 포함한다. 하나의 실시양태에서 huHEA125의 중쇄 및/또는 huHEA125의 경쇄는 각각 서로 20 이하 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)의 아미노산 교환, 결실 또는 첨가와 독립적으로 포함하며, 여기에서 이들 아미노산 교환, 결실 또는 첨가는 중쇄의 불변 영역에서 및/또는 경쇄의 불변 영역에서 및/또는 중쇄의 가변 영역의 골격 부위에서 및/또는 경쇄의 가변 영역의 골격 부위에서 위치할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서,상기 항체는 huHEA125의 2개 중쇄 (서열번호: 2) 및 huHEA125의 2개 경쇄 (서열번호: 11)을 포함하는 완전한 IgG항체이며, 여기에서 하나의 중쇄는 디설파이드 결합을 통해 하나의 경쇄에 연결되며 또한 상기 중쇄는 하나 또는 두 개의 (바람직하게 두 개)의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 huHEA125의 중쇄 (막 결합 형태, 서열번호: 1) 및/또는 huHEA125의 경쇄 (서열번호: 11)을 포함한다. 하나의 실시양태에서 huHEA125의 중쇄 및/또는 huHEA125의 경쇄는 각각 서로 20 이하 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)의 아미노산 교환, 결실 또는 첨가와 독립적으로 포함하며, 여기에서 이들 아미노산 교환, 결실 또는 첨가는 중쇄의 불변 영역에서 및/또는 경쇄의 불변 영역에서 및/또는 중쇄의 가변 영역의 골격 부위에서 및/또는 경쇄의 가변 영역의 골격 부위에서 위치할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 huHEA125의 2개 중쇄 (서열번호: 1) 및 huHEA125의 2개 경쇄 (서열번호: 11)을 포함하는 완전한 IgG항체이며, 여기에서 하나의 중쇄는 디설파이드 결합을 통해 하나의 경쇄에 연결되며 또한 상기 중쇄는 하나 또는 두 개 (바람직하게 두 개)의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 아마눌린산(모두 도 1에 나타냄)은 물론 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체로부터 선택된다. 특히 바람직한 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴 및 아마닌아미드는 물론 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체이다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 아마톡신은 항체에 연결되거나 또는 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δＣ-원자를 통해 링커 L1에 연결된다(도 1 참조). 본 발명에서 사용 가능한 바람직한 아마톡신에서 상기 아미노산 3은 이소류신, γ-하이드록시-이소류신 또는 γ,δ-디하이드록시-이소류신이다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 아마톡신은 항체에 연결되거나 또는 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δＣ-원자에 결합된 산소 원자를 통해 링커 L1에 연결된다. 아마톡신은 항체에 연결되거나 또는 존재하는 경우, 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해 링커 L1에 연결된다. 이들 실시양태에서 아미노산 3은 γ,δ-디하이드록시-이소류신이 바람직하다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 아마톡신에 연결되거나 또는 존재하는 경우, 항체 내에 존재하는 아미노산을 통해 링커 L1에 연결된다.
첫 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 링커 L1은, 임의로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 헤테로알케닐, 알키닐, 헤테로알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 헤테로아르알킬 그룹이다. 첫 번째 양상의 더욱 바람직한 실시양태에서 링커 L1은 디설파이드 결합을 포함한다.
두 번째 양상에서 본 발명은 하기 (i) 내지 (iii)를 포함하는 항체 독소 복합체에 관한 것이다.
(i) 상피 세포 접착 분자(EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 여기에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 (a) 및 (b)를 포함하며:
(a) huHEA125의 중쇄, 여기에서 상기 중쇄가 하기 (a1) 및 (a2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
(a1) 서열번호 1에 따른 중쇄의 막 결합 형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 서열번호 26으로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함하며; 또한
(a2) 서열번호 2에 따른 중쇄의 가용형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 서열번호 27로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함하며; 및
(b) 서열번호 11에 따른 huHEA125의 중쇄, 여기서 서열번호 12로 나타낸 바와 같은 경쇄 VL의 가변영역은 VL의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 서열번호 28로 나타낸 바와 같은 경쇄 CL의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함함;
(ii) 아마톡신; 및
(iii) 임의로 링커.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (a) 및 (b)를 포함한다:
(a) huHEA125의 중쇄, 여기에서 상기 중쇄가 하기 (a1) 및 (a2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
(a1) 서열번호 1에 따른 중쇄의 막 결합 형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 (a2) 서열번호 2에 따른 중쇄의 가용형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함하며; 및
(b) 서열번호 11에 따른 huHEA125의 경쇄, 여기서 서열번호 12로 나타낸 바와 같은 경쇄 VL의 가변영역은 VL의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 첨가를 포함한다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (a) 및 (b)를 포함한다:
(a) huHEA125의 중쇄, 여기에서 상기 중쇄가 하기 (a1) 및 (a2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
(a1) 서열번호 1에 따른 중쇄의 막 결합 형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 서열번호 26으로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산 첨가를 포함하며
(a2) 서열번호 2에 따른 중쇄의 가용형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 서열번호 27로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산 첨가를 포함하며; 및
(b) 서열번호 11에 따른 huHEA125의 경쇄, 여기서 서열번호 12로 나타낸 바와 같은 경쇄 VL의 가변영역은 VL의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산 첨가를 포함하며 또한 서열번호 28로 나타낸 바와 같은 경쇄 CL의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산 첨가를 포함한다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (a) 및 (b)를 포함한다:
(a) huHEA125의 중쇄, 여기에서 상기 중쇄가 하기 (a1) 및 (a2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
(a1) 서열번호 1에 따른 중쇄의 막 결합 형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환을 포함하며, 서열번호 26으로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환을 포함하며, 또한
(a2) 서열번호 2에 따른 중쇄의 가용형태, 여기에서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환을 포함하며, 또한 서열번호 27로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환을 포함하며; 및
(b) 서열번호 11에 따른 huHEA125의 경쇄, 여기서 서열번호 12로 나타낸 바와 같은 상기 경쇄 VL의 가변영역은 VL의 골격부위에 위치한 0 내지 10(예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환을 포함하며 또한 서열번호 28로 나타낸 바와 같은 경쇄 CL의 불변영역은 0 내지 10 (예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 아미노산 교환을 포함한다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (a) 및 (b)를 포함한다:
(a) huHEA125의 중쇄, 여기에서 상기 중쇄가 하기 (a1) 및 (a2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
(a1) 서열번호 1에 따른 중쇄의 막 결합 형태, 및 (a2) 서열번호 2에 따른 중쇄의 가용형태; 및
(b) 서열번호 11에 따른 huHEA125의 경쇄.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항체, 탈면역화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체로부터 선택된다. 두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서,상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2 및 Fd로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 huHEA125 또는 이의 항원 결합 단편이다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 EpCAM에 특이적으로 결합한다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 아마눌린산 (모두 도 1에 나타냄)은 물론 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체로부터 선택된다. 특히 바람직한 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, 및 아마닌아미드는 물론 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체이다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 아마톡신은 항체에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자를 통해 링커 L2에 연결된다 (도 1 참조). 본 발명에서 사용 가능한 바람직한 아마톡신에서 상기 아미노산 3은 이소류신, γ-하이드록시-이소류신 또는 γ,δ-디하이드록시-이소류신이다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 아마톡신은 항체에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자에 결합된 산소원자를 통해 링커 L2에 연결된다. 아마톡신은 항체에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해 링커 L2에 연결되는 것이 더욱 바람직하다. 이들 실시양태에서 아미노산 3은 γ,δ-디하이드록시-이소류신인 것이 바람직하다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 아마톡신에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 항체 내에 존재하는 아미노산 그룹을 통해 링커 L2에 연결된다.
두 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 링커 L2는, 임의로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 헤테로알케닐, 알키닐, 헤테로알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 헤테로아르알킬 그룹이다. 다섯 번째 양상의 더욱 바람직한 실시양태에서, 링커 L2는 디설파이드 결합이다.
세 번째 양상에서 본 발명은 의약으로 사용되는 두 번째 양상의 복합체에 관한 것이다.
네 번째 양상에서 본 발명은 환자의 암을 치료하기 위한 두 번째 양상의 복합체이며, 여기에서 상기 암은 췌장암, 담관암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복합체에 관한 것이다.
다섯 번째 양상에서 본 발명은 환자의 암 치료용 약제학적 조성물의 제조를 위한 두 번째 양상의 복합체이며, 여기에서 상기 암은 췌장암, 담관암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복합체에 관한 것이다.
다섯 번째 양상에서 본 발명은 (i) 표적 결합 부위; (ii) 아마톡신; 및 (iii) 임의로 링커 L3을 포함하는 표적 결합 부위 독소 복합체이며, 여기에서 상기 아마톡신은 표적 결합 부위에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3, 바람직하게 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자를 통해 링커 L3에 연결되는 표적 결합 부위 독소 복합체에 관한 것이다 (도 1 참조). 본 발명에서 사용 가능한 바람직한 아마톡신에서, 상기 아미노산 3은 이소류신, γ-하이드록시-이소류신 또는 γ,δ-디하이드록시-이소류신이다.
다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 아마톡신은 표적 결합 부위에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자에 결합된 산소원자를 통해 링커 L3에 연결된다. 아마톡신은 표적 결합 부위에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 바람직하게 -O-C(O)-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신-O-C(O)-표적 결합 부위, 더욱 바람직하게 아마톡신-δC-O-C(O)-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신- δC-O-C(O)-표적 결합 부위 및 가장 바람직하게 아마톡신-δCH2-O-C(O)-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신-δCH2-O-C(O)-표적 결합 형태의 에스테르 결합; 바람직하게 아마톡신-O-L3 또는 아마톡신-O-표적 결합 부위, 바람직하게 아마톡신-δC-O-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신-δC-O-표적 결합 부위, 더욱 바람직하게 아마톡신-δCH2-O-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신-δCH2-O-표적 결합 부위 형태의 에테르 결합; 또는 바람직하게 아마톡신-O-C(O)-NH-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신-O-C(O)-NH-표적 결합 부위, 바람직하게 아마톡신-δC-O-C(O)-NH-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신-δC-O-C(O)-NH-표적 결합 부위, 즉 아마톡신-δCH2-O-C(O)-NH-L3-표적 결합 부위 또는 아마톡신-δCH2-O-C(O)-NH-표적 결합 부위 형태의 우레탄 결합을 통해 링커 L3에 연결된다. 이들 실시양태에서 아미노산 3은 γ,δ-디하이드록시-이소류신인 것이 바람직하다.
다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 링커 L3이 존재하며 또한 상기 복합체는 다음 구조 (i) 내지 (iii) 중의 하나를 갖는다: (i) 아마톡신-δC-O-C(O)-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위; (ii) 아마톡신-δC-O-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위; 또는 (iii) 아마톡신-δC-O-C(O)-NH-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위, 바람직하게 (i) 아마톡신-δCH2-O-C(O)-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위; (ii) 아마톡신-δCH2-O-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위; 또는 (iii) 아마톡신-δCH2-O-C(O)-NH-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위.
다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 표적 결합 부위는 아마톡신에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 표적 결합 부위에 존재하는 아미노 그룹을 통해 L3에 연결된다.
다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 또는 아마눌린산(모두 도 1에 나타냄)은 물론 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체로부터 선택된다. 특히 바람직한 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, 및 아마닌아미드는 물론 이의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 및 합성 유사체이다.
다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 링커 L3은, 임의로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 헤테로알케닐, 알키닐, 헤테로알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 헤테로아르알킬 그룹이다. 다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 링커 L3은 디설파이드 결합이다.
다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 표적 결합 부위는 종양 세포에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 표적 결합 부위는 상피세포 접착 분자(EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것이 특히 바람직하다.
다섯 번째 양상의 바람직한 실시양태에서, 상기 표적 결합 부위는 (i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편; (ii) 항체 유사 단백질; 및 (iii) 핵산 앱타머로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이중 항체, 사중항체, 나노항체, 키메라 항체, 탈면역화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv 및 디설파이드-결합 Fvs(dsFv)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) huHEA125의 중쇄의 막 결합 형태 (서열번호: 1) 또는 huHEA125의 중쇄의 가용 형태 (서열번호: 2); 및/또는 (b) huHEA125의 경쇄 (서열번호: 11)를 포함한다.
여섯 번째 양상에서 본 발명은 의약으로 사용되는 다섯 번째 양상에 따른 표적 결합 부위 독소 복합체에 관한 것이다.
일곱 번째 양상에서 본 발명은 환자의 암을 치료하기 위한 다섯 번째 양상에 따른 표적 결합 부위 독소 복합체이며, 여기에서 상기 암은 췌장암, 담관암, 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표적 결합 부위 독소 복합체에 관한 것이다.
여덟 번째 양상에서 본 발명은 첫 번째 양상 또는 두 번째 양상의 항체 독소 복합체 또는 다섯 번째 양상에 따른 표적결합 부위 독소 복합체를 포함하며 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제, 충진제, 결합제, 윤활제, 활제, 붕괴제, 흡수제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다섯 번째 내지 일곱 번째 실시양태의 표적 결합 부위는 바람직한 실시양태에서는 단백질, 특히 항체이다. 단백질 및 특히 항체는 아마톡신을 커플링 시키는 여러 가지 아미노산을 포함할 것이다. 바람직한 아미노산은 자유 아미노, 하이드록시 또는 카르보닐-그룹이며, Lys, Gln, Glu, Asp, Asn, Thr, 및 Ser을 포함한다. 따라서 하나의 단백질 분자에 하나 이상의 아마톡신 분자를 커플링 할 수 있다.분자당 아마톡신 수의 증가는 또한 독성을 증가시킬 것이다. 따라서 바람직한 실시양태에서 아마톡신에 대한 첫 번째 내지 네 번째 실시양태의 항체와 다섯 번째 내지 일곱 번째 실시양태의 표적 결합 부위의 비는 1의 단백질 분자 대 1 내지 15의 아마톡신 분자, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다.이량체 유사 IgGs의 경우에 비의 계산을 목적으로 상기 이량체는 1 분자로서 간주된다. 유사한 비는 표적 결합 부위가 단백질이 아닌 경우에 바람직하다.
여덟 번째 양상의 약제학적 조성물은 전신적으로 투여되는 약제의 형태로 사용할 수 있는 것이 특히 바람직하다. 이들은 다른 것 중에서 주사액 및 주입액을 포함하는 비경구적 조성물을 포함한다. 주사액은 앰플 또는 소위 이미 사용 가능한 주사액, 예를 들면 기제 시린지 또는 단일 사용 시린지 형태로 제형화 되며 또한 이외에 여러 번 회수용 구멍 뚫린 플라스크 속에 제형화 된다. 주사액의 투여는 주사액의 투여는 피하(s.c.), 근육내(i.m.), 정맥내(i.v.) 또는 피내(i.c.) 적용 형태일 수 있다. 특히 각각의 적합한 주사 제형을 결정의 현탁액, 용액, 나노입자 또는 콜로이드 분산계 유사물 예를 들면 히드로졸(hydrosol)로서 제조할 수 있다.
주사 제형은 추가로 수성 등장 희석제로 용해 또는 분산될 수 있는 농축제로 제조될 수 있다. 주입액은 또한 등장액, 지방 유탁액, 리포좀 제형 및 미세 유탁액 형태로 제조할 수 있다. 주사액과 유사하게, 주입 제형은 또한 희석용 농축제 형태로 제조할 수 있다. 주사 제형은 또한 입원환자 및 외래 치료에서 예를 들면 미니펌프에 의해서 영구 주입액 형태로 적용할 수 있다.
비경구 약물 제형 예를 들면 알부민, 플라즈마, 익스팬더(expander), 표면활성 물질, 유기 희석액, pH 영향성 물질, 복합성 물질 또는 고분자 물질, 특히 단백질 또는 고분자에 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체의 흡수에 영향을 미치는 물질로서 첨가할 수 있다. 또는 이들은 또한 물질 유사 주사기구 또는 충진 물질, 예를 들면 플라스틱 또는 유리에 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체의 흡수를 감소시킬 목적으로 첨가할 수 있다.
본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체는 예를 들면 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리아미노산 또는 폴리에테르 우레탄을 기본으로 하는 미세 분산 입자에 비경구 형태로 미세 담체 또는 나노입자에 결합할 수 있다. 비경구 제형은 또한 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체가 각각 미세하게 분산, 분산 및 현탁된 형태로 주입되는 경우 예를 들어 "복수단위 원칙"(multiple unit principle)을 기본으로 데포 제형으로 변형되거나, 또는 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체가 제형 중에 예를 들어 이후에 임플란트 되는 로드(rod) 또는 정제 중에 봉입되는 경우 "단일 단위 원칙"(single unit principle)을 기본으로 또는 약제 중에 결정의 현탁액으로서 변형할 수 있다. 단일 단위 및 복수 단위 제형 중에 이들 임플란트 또는 데포 약물은 흔히 소위 생분해성 고분자, 예를 들어 락산 및 글리콜산의 폴리에스터, 폴리에테르 우레탄, 폴리아미노산, 폴리(메트)아크릴레이트 또는 폴리사카라이드로 이루어진다.
비경구 약제로서 제형화된 본 발명의 약제학적 조성물의 제조 중에 첨가되는 보조제 및 담체는 바람직하게는 수성멸균(멸균수), pH값 영향성 물질, 예를 들면 유기 또는 무기산 또는 염기는 물론 그의 염, pH값 조절용 완충물질, 등장화 물질, 예를 들어 염화 나트륨, 탄산수소 나트륨, 글루코오스 및 프럭토오스, 표면 활성제 및 계면활성제, 및 유화제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산의 부분 에스테르 (예들 들면, Tween®) 또는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌의 지방산 에스테르 (예를 들면, Cremophor®), 지방오일 예를 들어 땅콩유, 대두유 또는 피마자유, 지방산의 합성 에스테르 예를 들어 에틸 올리에이트, 이소프리필 미리스테이트 및 중성 오일 (예를 들면 Miglyol®)은 물론 고분자 보조제 예를 들어 젤라틴, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 유기용매의 용해도를 증가시키는 첨가제 예를 들어 프로필렌 글리콜, 에탄올, N,N-디메틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜 또는 복합물 형성 물질 예를 들어 구연산염 및 우레아, 보존제 예를 들어 벤조산 하이드록시 프로필 에스테르 및 메틸 에스테르, 벤질 알코올, 항산화제 예를 들어 소듐 설파이트 및 안정화제 예를 들어 EDTA이다.
현탁액으로서 본 발명의 약제학적 조성물을 제형화 하는 경우, 바람직한 실시양태에서는 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체의 세팅(setting)을 방지하기 위한 증점제, 또는 침전제 및/또는 복합물 형성제 예를 들어 EDTA의 재현탁성을 보증하기 위한 표면활성제 및 고분자 전해질이 첨가된다. 또한 활성성분과 다양한 고분자의 복합물을 형성할 수 있다. 이러한 고분자의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리스티롤, 카르복시메틸 셀룰로오스, Pluronics® 또는 폴리에틸렌 글리콜 소르비트 지방산 에스테르이다. 본 발명의 표적 결합 부위 독소 복합체는 또한 예를 들어 사이클로덱스트린과 포접 화합물 형태의 액상 제제 중에 혼입할 수 있다. 특별한 실시양태에서 분산제는 추가의 조제로서 첨가할 수 있다. 동결건조물의 제조에 있어서, 스카폴딩 제(scaffolding agent) 예를 들어 만니트, 덱스트란, 사카로오스, 인간 알부민, 락토오스, PVP 또는 다양한 젤라틴이 사용될 수 있다.
추가의 양상에서 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 첫 번째 양상에서 정의된 바와 같은 항체 독소 복합체의 유효량을 투여함을 포함하는 상기 환자의 췌장암, 담관암, 또는 대장암의 치료방법에 관한 것이다.
추가의 양상에서 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 세 번째 양상에서 정의된 바와 같은 항체 독소 복합체의 유효량을 투여함을 포함하는 상기 환자의 췌장암, 담관암, 유방암 또는 대장암의 치료방법에 관한 것이다.
추가의 양상에서 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 다섯 번째 양상에서 정의된 바와 같은 표적 결합 부위 독소 복합체의 유효량을 투여함을 포함하는 상기 환자의 췌장암, 담관암, 유방암 또는 대장암의 치료방법에 관한 것이다.
실시예
다음에서 본 발명은 비 제한적인 실시예에 의거하여 더욱 자세하게 설명된다.
실시예 1: 항체 huHEA125 와 항체 독소 복합체 아마니틴 - huHEA125 사이의 표적 세포의 결합 친화력의 비교
1.1 키메라 항체 huHEA125
여러 해전에, 본 발명자들은 안티-EpCAM 마우스 모노클로날 항체 HEA125를 분비하는 하이브리도마 세포주을 밝혀냈다(Moldenhauer et al., 1987; Momburg et al., 1987). 분자 생물학 기술을 사용하여, 이러한 하이브리도마 주는 인간 kappa 불변 경쇄 및 인간 IgG1 불변 중쇄에 연결된 마우스 가변 영역으로 이루어진 키메라 버전의 항체를 생산하도록 재구성하였다. 수득된 항체 huHEA125는 높은 친화력(Kd = 2.2x10-9M) 및 높은 특이성을 갖는 EpCAM-발현 세포에 결합한다. huHEA125 면역 글로불린의 유전자 서열 및 아미노산 서열은 하기에 나타낸다:
huHEA125 중쇄
펩티드 서열 중쇄, 막 결합 형태(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1; IGHG1는 밑줄로 표시) (서열번호: 1):
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGLQLDETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSAAVTLFKVKWIFSSVVELKQTLVPEYKNMIGQAP
펩티드 서열 중쇄, 분비된 형태 (서열번호: 2):
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
펩티드 서열 (IGHV/IGHD/IGHJ = VH 영역; 골격 부위 FR1, FR2, FR3 및 FR4 는 밑줄로 표시) (SEQ ID NO: 3):
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSS
핵산 서열 (IMGT-명명법에 따라 주석을 달았음, IGHV/IGHD/IGHJ; IGHD는 밑줄로 표시하였음; IGHJ는 이중 밑줄로 표시하였음):
FR1 (서열번호: 4): GAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCA
CDR1 (서열번호: 5):
GGATTCGATTTTAGTAGATTCTGG
FR2 (서열번호: 6): ATGACTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAA
CDR2 (서열번호: 7):
ATTAATCTAGATAGCAGTACGATA
FR3 (서열번호: 8): AACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGGGACAACGCCAAAAATACGCTGTTCCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGT
CDR3 (서열번호: 9):
TCAAGAGGTATTTCTATGGACTAC
FR4 (서열번호: 10):
TGGGGTCAGGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
huHEA125 경쇄
펩티드 서열 경쇄 (IGKV/IGKJ/IGKC; IGKC는 밑줄로 표시함) (서열번호: 11):
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
펩티드 서열 (IGKV/IGKJ = VL 부위; 골격 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 밑줄로 표시) (서열번호: 12):
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINS VESEDIADYYCQQSNIWPTTFGAGTKLELK
핵산 서열 (IMGT-명명법에 따라 주석을 달았음, IGKV/IGKJ; IGKV는 밑줄로 표시; IGKJ는 이중 밑줄로 표시):
FR1 (서열번호: 13): GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAG T
CDR1 (서열번호: 14):
CAGAGCATTGGCATAAGT
FR2 (서열번호: 15):
TTACACTGGTATCAGCAAAGACCAAGTGATTCTCCAAGGCTTCTCATAAAG
CDR2 (서열번호: 16):
TATGCTTCT
FR3 (서열번호: 17): GAGTCAATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGT GGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGT
CDR3 (서열번호: 18):
CAACAAAGTAATATCTGGCCAACCACG
FR4 (서열번호: 19):
TTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
1.2 대조항체 Xolair®
대조 항체 Xolair®(Omalizumab, 인간 IgE 면역 글로불린에 대한 인간IgG1 항체)는 독일 Novartis에 의해 제조되었다.
1.3 α- 아마니틴 항체 복합체의 합성
1.3.1 α- 아마니틴 글루타레이트의 합성
P4O10로 진공 건조된 3.0 mg (3.3 μmol)의 α-아마니틴을 0.25 ml의 무수 피리딘 중에 용해하고 어두운 곳에서 실온 하에 24시간 0.1 ml의 피리딘 중에 0.9 mg (79 μmol) 무수 글루타르산과 반응시켰다. 펩티드는 7 ml의 무수 디에틸에테르를 첨가하여 침전시키고, 원심분리하고, 고체는 디에틸에테르로 재차 세척하고 원심분리하였다.
이 반응에 의하여, R1　=　-OH (도　1)이 R1　=　-O-C(O)-(CH2)3-COOH로 치환된 α-아마니틴 유도체를 얻었다.
1.3.2 α- 아마니틴 글루타르산 N- 하이드록시 숙신이미데이트의 합성
3.4 mg of α-아마니틴 글루타레이트 (3.3 μmol)을 0.05 ml의 무수 디메틸포름아미드(DMF)중에 용해하고, 0.01 ml의 DMF중에 용해된 2.4 mg (7 당량)의 N-하이드록시-숙신이미드를 첨가하였다. 0.01 ml의 DMF중에 1.2 mg의 디사이클로헥실카르보디이미드를 첨가한 후, 반응을 실온에서 16시간 진행시켰다. 용액을 형성된 결정으로부터 분리하고, 펩티드는 4 ml의 무수 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. 원심분리 후, 펠렛은 또 다른 4 ml의 에테르로 세척하고 원심분리하였다. 고체는 0.1 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고 항체 용액과 반응을 위해 즉시 사용하였다.
1.3.3 α- 아마니틴 - 글루타레이트 - huHEA125 의 합성
3.0 mg의 α-아마니틴-글루타르산 N-하이드록시숙신이미데이트의 용액 0.1 ml을 5 ml의 PBS 중에 10 mg의 hu-HEA125 항체에 첨가하고 어두운 곳에서 5 ℃하에 서서히 회전시키면서 반응시켰다. 16 시간 후, 용액은 PBS로 평형된 Sephadex G25 칼럼(120 x 1.5 cm)에 적용시키고 단백질 분획을 수집하였다. 아마니틴 량은 13.500 cm-1ㆍM-1의 아마톡신에 대한 몰 흡광 계수를 사용하여 동일 농도의 천연 항체를 함유하는 블랭크에 대한 310nm의 단백질 용액에서 흡수 차로부터 분광 광도법으로 측정하였다. 이 제제의 α-아마니틴:IgG의 비는 ca. 8이었다.
1.4 결합 경쟁분석
아마니틴-huHEA125 복합체와 비-복합 huHEA125 항체의 결합은 흐름 세포측정법에 의해 경쟁 실험에서 분석하였다. α-아마니틴-huHEA125 복합체는 상기 항목 1.3.1 내지 1.3.3에서 기술된 바와 같이 합성하였다.
Colo205 표적세포 (결장암 전이)는 2x107 세포/ml로 계수 및 조절된 FACS 완충액(1% 열 불활성화 소 태아 혈청 및 0.1% 아지드화 나트륨을 갖는 Dulbecco의 PBS)중에서 2회 세척하였다. 50㎕의 세포 현탁액을 96 웰 U-바닥 미량 역가 플레이트의 각 웰에 제공하고 50㎕/웰의 FITC 표식 huHEA125 항체를 피펫팅 하였다. 최종 희석액 400㎍/ml내지 10ng/ml 범위의 아마니틴-huHEA125 또는 huHEA125의 계열 희석액은 50㎕/웰의 용적으로 3회 첨가하고 얼음 위에 1시간 배양하였다. 다음에, 플레이트를 원심분리하고 (200rpm에서 2 분), 상등액을 세포로부터 제거하였다. 세포를 150㎕의 FACS 완충액에 재현탁한 다음 다시 원심분리하였다. 원심분리에 의한 2번 세척 단계 이후에, 세포는 100㎕/웰의 요오드화 프로피듐 용액(FACS 완충액 중에 1㎍/ml) 중에서 취하고 죽은 세포를 구별시켰다. 분석은 CellQuest 소프트웨어를 사용하는 FACScan 세포측정기(Becton and Dickinson, Heidelberg, 독일)로 수행하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이 증가 량의 huHEA125-아마니틴 복합체 또는 미변형 huHEA125 항체로 표적 세포에 결합하는 경쟁은 경쟁 항체 또는 항체 복합체 10ng/ml 내지 400㎍/ml 범위의 전체 농도에 걸쳐 상당한 결합 강도를 나타냈다. 따라서 결합 절차는 표적 세포에 대한 huHEA125-아마니틴의 친화력을 현저하게 변화시키지 않았다.
실시예 2: 간접 면역 형광에 의해 검지된 다양한 암종 세포주에 대한 EpCAM 항원의 표면 발현
세포 주 Capan-1, Colo205, OZ, MCF-7, BxPC-3 및 PC-3은 먼저 huHEA125 또는 Xolair®로 배양하였다. 세척 후, 일차 항체의 결합은 2단계 시약으로 FITC-표식 F(ab')2 염소 항-인간IgG (H+L)에 의해 가시화하였다. 그 결과들은 도3A (Capan-1), 도 3B (Colo205), 도 3C (OZ), 도 3D (MCF-7), 도 3E (BxPC-3), 및 도 3F (PC-3)에 나타낸다. 각 다이어그램의 좌측에서 회색 음영 히스토그램은 대조 항체 Xolair®로 얻은 결과를 나타내며; 각 다이어그램의 우측에서 백색 영역을 갖는 히스토그램은 항체 huHEA125로 얻은 결과를 나타낸다.
실시예 3: 아마니틴 및 아마니틴 /항체 복합체에 의한 암종 세포 증식 억제의 유도
3.1 암종 세포주
다음의 암종 세포주들은 성장 억제 분석을 위해 사용하였다:
Capan-1, BxPC-3 인간 췌장 샘암종
MCF-7 인간 유방 샘암종
Colo205 인간 결장암 전이
OZ 인간 담관암종
PC-3 인간 전립선 샘암종
3.2 증식 억제 분석
아마니틴-IgG 복합체의 억제는 [3H]-티미딘을 혼입시켜 측정하였다. 2x10-5 M 내지 6x10-13 범위의 완전 배지 (10% 열 불활성화 FCS, 2 mM L-글루타민 및 1mM 피루빈산 나트륨으로 보충된 RPMI 1640)중에 아마니틴-huHEA125, 아마니틴-Xolair 및 자유 아마니틴의 단계 희석액은 96웰 편평 바닥 조직 배양 미량 역가 플레이트의 웰 속에서 100㎕의 용적으로 3회 제조하였다. 세포들은 2x104/ml의 밀도에서 웰당 50㎕의 용적으로 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2의 습윤 분위기에서 72 또는 96 시간 배양하였다. 분석 종료 20 시간 전에, 1μCi의 [3H]-티미딘을 첨가하였다. 다음에 플레이트를 Tomtec 셀 하베스터로 가공처리하고 혼입된 방사능은 액상 신틸레이션 계수(Wallac Betaplate Liquid Scintillation Counter, PerkinElmer Life and Analytical Sciences)로 측정하고 cpm으로 나타냈다.
췌장 암 세포주 Capan-1의 경우에, 도 4에 도시된 바와 같은 1x10-11 내지 3x10-10M의 아마니틴 농도에서 huHEA125-아마니틴 면역 독소 유도 성장 억제.
결장암 세포주 Colo205의 경우에, 도 5에 도시된 바와 같은 1x10-12 내지 4x10-11M의 아마니틴 농도에서 huHEA125-아마니틴 면역 독소 유도 성장 억제.
유방 암 세포주 MCF-7의 경우에, 도 6에 도시된 바와 같은 1x10-12 내지 1x10-11M의 아마니틴 농도에서 huHEA125-아마니틴 면역 독소 유도 성장 억제.
담관암 세포주 OZ의 경우에, 도 7에 도시된 바와 같은 1x10-11 내지 6x10-10M의 아마니틴 농도에서 huHEA125-아마니틴 면역 독소 유도 성장 억제.
췌장 세포주 BxPC-3의 경우에, 도 8에 도시된 바와 같은 2x10-11 내지 6x10-10M의 아마니틴 농도에서 huHEA125-아마니틴 면역 독소 유도 성장 억제.
실시예 4: 두 개의 이종이식 마우스 종양 모델을 사용하는 아마니틴 /항체 복합체에 의해 생체내 종양 성장의 억제
5 내지 6주령 면역 결핍 NOD/SCID 마우스는 모든 실험에서 사용하였다. BxPC-3 췌장 또는 PC-3 전립선 종양세포(100㎕ PBS 중 5x106)를 마우스의 우측 플랭크에 피하로 이식하였다. 10일 후에, BxPC-3 종양이 30-80 mm3의 용적에 도달하고 또한 PC-3 종양이 40-190 mm3의 용적에 도달하였을 때, 치료를 개시하였다. 동물은 대조 huHEA125 mAb를 15 mg/kg의 용량으로 또는 huHEA125-아마니틴 복합체 (huHEA125-Ama)를 아마니틴의 50㎍/kg의 용량으로 투여받았고 또한 복합체를 단일 복강내 주사로 투여하였다.
종양 성장은 치료 개시 후 16일 동안 모니터링 하였다. 종양 크기는 캘리퍼(caliper)를 사용하여 3일마다 외부에서 측정하였다. 종양 용적은 수식 V = π/6*a*b*c (식 중, a, b 및 c는 3차원의 직경이다)에 따라 계산하였다. 데이터는 항체 투여 시로부터 상대 종양 크기/용적 증가로서 나타낸다.
아마니틴의 50 ㎍/kg의 용량으로 huHEA125-Ama의 투여는 BxPC-3 종양을 갖는 마우스 (n=6)으로 잘 내성화 하였다. 마우스의 체중 감소나 간 효소의 증가는 없었다 (LDH, ALT, AST 및 AP는 실험의 마지막 날에 혈청에서 측정하였다). 종양 성장은 복합체의 이러한 용량으로 강하게 억제하였다. 모든 마우스는 치료에 반응하였으며 또한 종양 용적은 복합체의 투여 후 7일부터 시작하여 급격하게 감소하였다. 16일 후속조치 종료시에 종양은 마우스의 50%에서 완전히 박멸되었다. 반면, 비-복합 huHEA125 mAb를 투여받은 대조 마우스에서 종양 용적은 대략 880%로 증가하였다 (도 9).
아마니틴의 50 ㎍/kg의 용량으로 PC-3 종양을 갖는 마우스 huHEA125-Ama의 경우에는 잘 내성화 하였다. 마우스의 체중의 감소는 관찰되지 않았다. 종양 성장은 복합체의 이러한 용량에 의해 강하게 방해받았다. huHEA125-Ama 투여 10일 후에 종양 용적은 치료의 개시에서의 종양 용적과 유사하였다. 반면, 비 복합 huHEA125 mAb를 투여받은 대조 마우스에서 종양 용적은 대략 550%로 증가하였다. 실험은 대조군에서 종양의 큰 크기로 인하여 정지하였다 (도 10).
[참고문헌]
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Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (32)

  1. 환자의 췌장암, 담관암 또는 대장암을 치료하기 위한 항체 독소 복합체이며, 여기에서 상기 복합체가 (i) 상피 세포 접착 분자(EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; (ii) 아마톡신; 및 (iii) 임의로 링커 L1을 포함하는 항체 독소 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 이중 항체, 사중항체, 나노항체, 키메라 항체, 탈면역화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체로부터 선택되는 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv 및 디설파이드-결합 Fvs(dsFv)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, EpCAM의 에피토프가 인간 EpCAM의 에피토프인 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 (a) huHEA125의 중쇄의 CDR3 영역 (서열번호: 22); 및/또는 (b) huHEA125의 경쇄의 CDR3 영역 (서열번호: 25)를 포함하는 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 (a) 내지 (d)의 하나 이상을 추가로 포함하는 복합체:
    (a) huHEA125의 중쇄의 CDR2 영역 (서열번호: 21);
    (b) huHEA125의 중쇄의 CDR1 영역 (서열번호: 20);
    (c) huHEA125의 경쇄의 CDR2 영역 (서열번호: 24); 및
    (b) huHEA125의 경쇄의 CDR1 영역 (서열번호: 23);
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 huHEA125의 VH영역 (서열번호: 3) 및/또는 huHEA125의 VL영역 (서열번호: 12)를 포함하는 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 (a) huHEA125의 중쇄의 막 결합 형태 (서열번호: 1) 또는 huHEA125의 중쇄의 가용 형태(서열번호: 2); 및/또는 (b) huHEA125의 경쇄 (서열번호: 11)를 포함하는 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아마톡신이 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 또는 아마눌린산, 또는 이의 염 또는 유사체인 복합체.
  10. 하기 (i) 내지 (iii)를 포함하는 항체 독소 복합체:
    (i) 상피 세포 접착 분자(EpCAM)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 (a) 및 (b)를 포함함:
    (a) huHEA125의 중쇄, 여기서 상기 중쇄가 하기 (a1) 및 (a2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
    (a1) 서열번호 1에 따른 중쇄의 막 결합 형태, 여기서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 여기서 서열번호 26으로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함함; 및
    (a2) 서열번호 2에 따른 중쇄의 가용형태, 여기서 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 중쇄 VH의 가변영역은 VH의 골격부위에 위치한 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 여기서 서열번호 27로 나타낸 바와 같은 중쇄의 불변영역은 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함함; 및
    (b) 서열번호 11에 따른 huHEA125의 경쇄, 여기서 서열번호 12로 나타낸 바와 같은 경쇄 VL의 가변영역은 VL의 골격부위에 위치한 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함하며, 또한 여기서 서열번호 28로 나타낸 바와 같은 경쇄CL의 불변영역은 0 내지 10의 아미노산 교환, 0 내지 10의 아미노산 결실 및/또는 0 내지 10의 아미노산 첨가를 포함함;
    (ii) 아마톡신; 및
    (iii) 임의로 링커 L2.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 키메라 항체, 탈면역화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체로부터 선택되는 복합체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, 및 Fd로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복합체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항체 있어서, 상기 항체가 huHEA125 또는 이의 항원 결합 단편인 복합체.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아마톡신이 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 또는 아마눌린산, 또는 이의 염 또는 유사체인 복합체.
  15. 약제로 사용되는 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 복합체.
  16. 환자의 암을 치료하기 위한 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 복합체이며, 상기 암이 췌장암, 담관암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복합체.
  17. (i) 상피세포 접착분자(EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 표적 결합 부위; (ii) 아마톡신; 및 (iii) 임의로 링커 L3을 포함하는 표적 결합 부위 독소 복합체이며, 여기서 상기 아마톡신이 표적 결합 부위에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자를 통해 링커 L3에 연결되는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 아마톡신이 표적 결합 부위에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자에 결합된 산소원자를 통해 링커 L3에 연결되는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 아마톡신이 표적 결합 부위에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 우레탄 결합을 통해 링커 L3에 연결되는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 L3가 존재하며 또한 상기 복합체가 다음 구조 중의 하나를 갖는 표적 결합 부위 독소 복합체.
    (i) 아마톡신-δC-O-C(O)-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위;
    (ii) 아마톡신-δC-O-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위; 또는
    (iii) 아마톡신-δC-O-C(O)-NH-L3-C(O)-NH-표적 결합 부위.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 결합 부위가 아마톡신에 연결되거나 또는, 존재하는 경우, 표적 결합 부위에 존재하는 아미노 그룹을 통해 링커 L3에 연결되는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아마톡신이 α-아마니틴, β-아마니틴,γ-아마니틴,ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 또는 아마눌린산으로부터, 또는 이의 염 또는 유사체로부터 선택되는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 L3가, 임의로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 헤테로알케닐, 알키닐, 헤테로알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 헤테로아르알킬 그룹인 표적 결합 부위 독소 복합체.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 L3가 디설파이드 결합을 포함하는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 결합 부위가 종양 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 결합 부위가 (i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편; (ii) 항체 유사 단백질; 및 (iii) 핵산 앱타머로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 결합 부위 독소 복합체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 이중 항체, 사중항체, 나노항체, 키메라 항체, 탈면역화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체로부터 선택된 표적 결합 부위 독소 복합체.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv 및 디설파이드-결합 Fvs(dsFv)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 결합 부위 독소 복합체.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 (a) huHEA125의 중쇄의 막 결합 형태(서열번호: 1) 또는 huHEA125의 중쇄의 가용 형태(서열번호: 2); 및/또는 (b) huHEA125의 경쇄(서열번호: 11)를 포함하는 표적 결합 부위 독소 복합체.
  30. 약제로 사용되는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 표적 결합 부위 독소 복합체.
  31. 환자의 암을 치료하기 위한 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항의 표적 결합 부위 독소 복합체이며, 여기서 상기 암이 췌장암, 담관암, 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 결합 부위 독소 복합체.
  32. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 독소 복합체 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 표적결합 부위 독소 복합체를 포함하며 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제, 충진제, 결합제, 윤활제, 활제, 붕괴제, 흡수제, 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
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