CN102387815A - 用于治疗癌症的具鹅膏蕈毒素的靶结合部分 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤治疗。在一个方面，本发明涉及可用于治疗癌症的靶结合部分和毒素的缀合物。具体而言，毒素为鹅膏蕈毒素，靶结合部分(例如抗体)针对肿瘤相关抗原，例如上皮细胞黏附分子(EpCAM)。在另一方面，本发明涉及包含这种靶结合部分毒素缀合物的药物组合物，以及这种靶结合部分毒素缀合物在制备这种药物组合物中的用途。本发明的靶结合部分毒素缀合物和药物组合物可用于治疗癌症，尤其是腺癌，例如胰腺癌、胆管癌、乳腺癌和结直肠癌。

Description

用于治疗癌症的具鹅膏蕈毒素的靶结合部分
发明领域
本发明涉及肿瘤治疗。在一个方面，本发明涉及可用于治疗癌症的靶结合部分和毒素的缀合物。具体而言，毒素为鹅膏蕈毒素(amatoxin)，靶结合部分(例如抗体)针对肿瘤相关抗原，例如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。在另一方面，本发明涉及包含这种靶结合部分毒素缀合物的药物组合物和这种靶结合部分毒素缀合物在制备这种药物组合物中的用途。本发明的靶结合部分毒素缀合物和药物组合物可用于治疗癌症，尤其是腺癌，例如胰腺癌、胆管癌、乳腺癌和结直肠癌。
发明背景和技术状态
鹅膏蕈毒素
鹅膏蕈毒素是由8个氨基酸组成的环肽。它们可分离自毒鹅膏(Amanita phalloides)蘑菇，或通过合成从结构单元制备。鹅膏蕈毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA依赖的RNA聚合酶II，因此亦抑制受影响细胞的转录及蛋白质生物合成。在细胞中抑制转录引起生长和增殖停止。尽管不是共价结合，但鹅膏蕈碱(amanitin)和RNA-聚合酶II之间的复合物非常紧密(KD＝3nM)。鹅膏蕈碱与酶解离是非常缓慢的过程，这使得受影响的细胞不可能恢复。当转录抑制持续时间过长时，细胞将经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
上皮细胞黏附分子
上皮细胞黏附分子(EpCAM，CD326)是人肿瘤上研究得最为透彻的靶抗原之一(Trzpis等，2007；Baeuerle和Gires，2007)。其代表表观分子量为40kDa的314个氨基酸的I型膜糖蛋白(Balzar等，1999)。其在大部分腺癌中过表达(Winter等，2003；Went等，2004)。具体而言，在结节阳性乳腺癌、上皮卵巢癌、胆管癌、胰腺癌和鳞状细胞头颈癌中，EpCAM表达增强。EpCAM表达增加在乳腺癌和胆囊癌中表示预后差(Gastl等，2000；Varga等，2004；Spizzo等，2002；Spizzo等，2004)。重要的是，在乳房癌、结直肠癌和胰腺癌中通过肿瘤起始或癌症干细胞来表达EpCAM(Al-Hajj等，2003；Dalerba等，2007；Li等，2007)。
业已将EpCAM特异性单克隆抗体作为诊断工具用于检测癌症患者中少见的循环肿瘤细胞(Allard等，2004；Nagrath等，2007)。目前在临床研究中调查几种工程改造的抗-EpCAM抗体。
鹅膏蕈毒素和抗体的缀合物
本发明人早先的专利申请EP 1 859 811 A1(2007年11月28日公开)描述了其中β-鹅膏蕈碱与清蛋白或与单克隆抗体HEA125、OKT3和PA-1偶联的缀合物。此外，研究了这些缀合物对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特氏淋巴瘤细胞(Raji)和T-淋巴瘤细胞(Jurkat)增殖的抑制作用。
构成本发明基础的技术问题
现有技术中需要靶结合部分毒素缀合物以极低浓度发挥其对靶细胞或组织的毒性作用。此外，现有技术中还需要治疗其它疾病类型，尤其是治疗其它类型的癌症，特别是那些对实际肿瘤治疗有治疗抗性或反应差的癌症。
本发明满足这些和其它的需要。例如，发明人在构成本发明基础的实验中发现，包含鹅膏蕈毒素和新的嵌合抗体huHEA125的缀合物能够以比现有技术所述缀合物低得多的浓度抑制肿瘤细胞增殖。具体而言，包含鹅膏蕈毒素和嵌合抗体huHEA125的缀合物以在使用现有技术的缀合物时所需浓度的约百分之一的浓度发挥其抑制作用。此外，发明人发现，包含鹅膏蕈毒素和EpCAM特异性抗体的缀合物不仅能抑制乳腺癌细胞的增殖，而且意想不到地亦能够抑制胰腺癌细胞、结直肠癌细胞和胆管癌细胞的增殖。另外，发明人发现选择缀合物的鹅膏蕈毒素部分中的特定连接点，产生高度有效的靶结合部分毒素缀合物(尤其抗体毒素缀合物)，其以极低浓度(IC50大约2x10-12-2x10-11M)发挥其对靶细胞的毒性活性，并对其靶细胞具有高度特异性。不希望受特定理论的束缚，该后一优点可得到解释，因为鹅膏蕈毒素是在靶细胞内而不是在靶细胞外从靶结合部分鹅膏蕈毒素缀合物上被有效释放。
上述概述未必阐述本发明解决的所有问题。
发明简述
在第一方面，本发明涉及一种用于治疗患者的胰腺癌、胆管癌或结直肠癌的抗体毒素缀合物，其中缀合物包含：(i)特异性结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)表位的抗体或其抗原结合片段；(ii)鹅膏蕈毒素；和(iii)任选的连接体L1。
在第二方面，本发明涉及一种抗体毒素缀合物，其包含：(i)特异性结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链，其中重链选自：(a1)SEQID NO：1的重链的膜结合形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH，包含位于VH框架区中的0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入，SEQ ID NO：26所示的重链恒定域包含0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入；和(a2)SEQ ID NO：2的重链的可溶形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入，SEQ ID NO：27所示的重链恒定域包含0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入；和(b)SEQ ID NO：11的huHEA125轻链，其中SEQ ID NO：12所示的轻链可变域VL包含位于VL框架区中的0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入，SEQ ID NO：28所示的轻链恒定域CL包含0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入；(ii)鹅膏蕈毒素；和(iii)任选的连接体L2。
在第三方面，本发明涉及一种用于医药的第二方面的抗体毒素缀合物。
在第四方面，本发明涉及一种用于治疗患者癌症的第二方面的抗体毒素缀合物，其中所述癌症选自胰腺癌、胆管癌、乳腺癌和结肠癌。
在第五方面，本发明涉及一种靶结合部分毒素缀合物，其包含：(i)靶结合部分；(ii)鹅膏蕈毒素；和(iii)任选的连接体L3；其中所述鹅膏蕈毒素通过鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子与所述靶结合部分或可能存在的连接体L3连接。
在第六方面，本发明涉及一种用于医药的第五方面的靶结合部分毒素缀合物。
在第七方面，本发明涉及一种用于治疗患者癌症的第五方面的靶结合部分毒素缀合物，其中所述癌症选自胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
在第八方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含第一方面或第二方面的抗体毒素缀合物或第五方面的靶结合部分毒素缀合物，且还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
该发明概述未必阐述本发明的所有特征。
附图简述
图1显示不同鹅膏蕈毒素的结构式。粗体数字(1-8)指出形成鹅膏蕈毒素的8个氨基酸的标准编号。用希腊字母α、β、γ和δ标出3号氨基酸中最重要的碳原子。亦显示(取代的)色氨酸即4号氨基酸侧链的原子编号(1’-7’号)。
图2显示通过结合竞争分析比较的huHEA125-Ama和huHEA125与靶细胞的结合亲和力。将表达EpCAM的Colo205细胞与固定量的直接FITC-标记的小鼠HEA125抗体孵育。通过流式细胞术分析与靶细胞的结合。渐增量的huHEA125-Ama或huHEA125的结合竞争显示对靶抗原的亲和力极为相似。
图3显示通过间接免疫荧光检测的不同癌细胞系中EpCAM抗原的表面表达：图3A Capan-1(人胰腺癌)；图3B Colo205(人结肠腺癌)；图3C OZ(人胆管癌)；和图3D MCF-7(人乳腺癌系)；图3E BxPC-3(人胰腺癌)；和图3F PC-3(人前列腺癌)。各图左边的灰色阴影柱状图显示用对照抗体Xolair获得的结果；各图右边具有白色区域的柱状图显示用抗体huHEA125获得的结果。
图4显示由具鹅膏蕈碱的抗体huHEA125、具鹅膏蕈碱的对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900052
和游离鹅膏蕈碱引起的抑制Capan-1细胞增殖的比较。
图5显示由具鹅膏蕈碱的抗体huHEA125、具鹅膏蕈碱的对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900053
和游离鹅膏蕈碱引起的抑制Colo205细胞增殖的比较。
图6显示由具鹅膏蕈碱的抗体huHEA125、具鹅膏蕈碱的对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900054
和游离鹅膏蕈碱引起的抑制MCF-7细胞增殖的比较。
图7显示由具鹅膏蕈碱的抗体huHEA125、具鹅膏蕈碱的对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900055
和游离鹅膏蕈碱引起的抑制OZ细胞增殖的比较。
图8显示由具鹅膏蕈碱的抗体huHEA125、具鹅膏蕈碱的对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900056
和游离鹅膏蕈碱引起的抑制BxPC-3细胞增殖。
图9显示用huHEA125-鹅膏蕈碱治疗后在NOD/SCID小鼠中的BxPC-3肿瘤异种移植物的生长抑制。
图10显示用huHEA125-鹅膏蕈碱治疗后在NOD/SCID小鼠中的PC-3肿瘤异种移植物的生长抑制。
发明详述
定义
在下文详述本发明之前，应该理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。亦应理解本文所用术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制仅由所附权利要求限定的本发明范围。除非另外定义，否则本文所用所有技术及科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的相同含义。
优选本文所用术语按照以下文献所述进行定义：“A multilingualglossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和
Figure BPA00001446671900061
H.主编(1995)，HelveticaChimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)。
除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书及以上权利要求，用词“包含”及变体例如“包括”和“含有”应理解为表示包括所述整数或步骤或者整数群或步骤群，但不排除任何其它的整数或步骤或者整数群或步骤群。
本说明书通篇引用若干文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、操作指南、GenBank登录号序列提交等)，不管是上文还是下文，皆以其整体通过引用结合到本文中。本文不应解释为承认本发明无权由于先前发明而早于这些公开。
本文所用术语“靶结合部分”指可特异性结合靶分子或靶表位的任何分子或分子部分。本申请上下文中的优选靶结合部分为：(i)抗体或其抗原结合片段；(ii)抗体样蛋白质；和(iii)核酸适配体。适合用于本发明的“靶结合部分”通常具有40000Da(40kDa)以上的分子量。
本申请上下文中，术语“靶分子”和“靶表位”分别指各由靶结合部分特异性结合的抗原和抗原表位，优选靶分子为肿瘤相关抗原，特别是与非肿瘤细胞表面相比以增加的浓度和/或不同空间构型存在于一种或多种肿瘤细胞类型表面上的抗原或表位。优选所述抗原或表位存在于一种或多种肿瘤细胞类型表面而非非肿瘤细胞表面上。
本文所用术语“抗体或其抗原结合片段”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。亦包含通过包括诸如噬菌体展示等技术选择的特异性结合靶分子(例如靶蛋白EpCAM)的免疫球蛋白样蛋白质。本发明免疫球蛋白分子可为免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。适合用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异种缀合抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(特别是CDR-嫁接的)、去免疫化(deimmunized)抗体或嵌合抗体、单链抗体(例如scFv)、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表达文库产生的片段、双抗体或四抗体(tetrabody)(HolligerP.等，1993)、纳米抗体(nanobody)、抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如抗本发明抗体的抗-Id抗体)和以上任一种的表位结合片段。
在某些实施方案中，抗原结合片段为本发明的人抗原结合抗体片段，包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(dsFv)和包含VL或VH结构域的片段。包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段可包含单独的一个或多个可变域，或与以下的整体或部分组合的一个或多个可变域：铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域。亦包括在本发明中的是还包含一个或多个可变域与铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合的抗原结合片段。
可用于本发明的抗体可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选抗体来源为人、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。特别优选抗体为人或鼠来源。本文所用“人抗体”包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并包括分离自人免疫球蛋白文库或分离自一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物(其不表达内源免疫球蛋白)的抗体，如例如Kucherlapati和Jakobovits的美国专利号5,939,598所述。
术语“抗体样蛋白”指业已经过工程改造(例如通过环诱变)以特异性结合靶分子的蛋白质。通常这样的抗体样蛋白包含至少一个两端均与蛋白质支架连接的可变肽环。这种双重结构约束将抗体样蛋白的结合亲和力大大提高到可与抗体的结合亲和力相比的水平。可变肽环的长度通常由10-20个氨基酸组成。支架蛋白可为具有良好溶解性的任何蛋白质。优选支架蛋白为小球状蛋白。抗体样蛋白包括但不限于亲和体(affibody)、抗运载蛋白(anticalin)和设计的锚蛋白重复蛋白(综述参见：Binz等，2005)。抗体样蛋白可源自大的突变体文库，例如可自大的噬菌体展示文库淘选，并可以以与常规抗体类似的方式分离。同样，可通过组合诱变球状蛋白质上的表面暴露残基来获得抗体样结合蛋白。
术语“核酸适配体”指通过多轮体外选择或SELEX(指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))进行工程改造以与靶分子结合的核酸分子(综述参见：Brody和Gold，2000)。核酸适配体可为DNA或RNA分子。适配体可含有修饰，例如修饰核苷酸，例如2’-氟取代的嘧啶。
术语“鹅膏蕈毒素”包括：分离自鹅膏属(Amanita)并在参考资料(Wieland，T.和Faulstich H.，1978)中描述的由8个氨基酸组成的所有环肽；还包括其所有的化学衍生物；还包括其所有的半合成类似物；还包括其所有根据天然化合物的主结构由结构单元构建的合成类似物(环状，8个氨基酸)；还包括含有非羟基化氨基酸取代羟基化氨基酸的所有合成或半合成类似物；还包括这样的所有合成或半合成类似物：其中硫醚亚砜部分被硫化物(sulfide)、砜取代，或被不同于硫的原子取代，例如被鹅膏蕈碱的卡巴类似物(carbaanalog)中的碳原子取代。
鹅膏蕈毒素在功能上被定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或酯肽。优选鹅膏蕈毒素为具有可与连接体分子或蛋白质(例如抗体或抗体片段)反应的官能团(例如羧基、氨基、羟基、硫醇基或硫醇捕获基团)的那些。特别适于本发明缀合物的鹅膏蕈毒素为图1所示的α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素(amanin)、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、鹅膏无毒环肽(amanullin)和一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullinic acid)以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。特别优选用于本发明的鹅膏蕈毒素为α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱和三羟鹅膏毒肽酰胺。
本文所用化合物的“衍生物”，指具有与该化合物相似的化学结构但含有至少一个该化合物中不存在的化学基团和/或缺乏至少一个该化合物中存在的化学基团的物质。该化合物相对于其衍生物被称为“母体”化合物。通常可在一个或多个化学反应步骤中从母体化合物产生“衍生物”。
本文所用化合物的“类似物”与该化合物在结构上相关但不相同，并表现出该化合物的至少一种活性。该化合物相对于其类似物被称为“母体”化合物。前述活性包括但不限于：与另一化合物的结合活性；抑制活性，例如酶抑制活性；毒性作用；激活活性，例如激活酶的活性。不要求类似物表现出与母体化合物同样的程度的这样的活性。在本申请上下文中将某化合物认为是类似物的条件是，其表现出母体化合物活性的至少1％(更优选至少5％、更优选至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％和更优选至少50％)程度的相关活性。因而，本文所用“鹅膏蕈毒素类似物”指这样的化合物：其在结构上与图1所示的α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽和一羟鹅膏毒肽羧酸中的任何一种相关，且与α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽和一羟鹅膏毒肽羧酸中的至少一种相比，表现出对哺乳动物RNA聚合酶II的抑制活性的至少1％(更优选至少5％、更优选至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％和更优选至少50％)。适合用于本发明的“鹅膏蕈毒素类似物”甚至可表现出比α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽或一羟鹅膏毒肽羧酸中任何一种更强的针对哺乳动物RNA聚合酶II的抑制活性。可通过测定发生50％抑制的浓度(IC50值)来测量抑制活性。
本申请上下文中的“连接体”，指增加两个组分之间距离的分子，例如以便减少靶结合部分和鹅膏蕈毒素之间的空间干扰，否则这种干扰可能降低鹅膏蕈毒素与RNA聚合酶II相互作用的能力。连接体可服务于另一个目的，因为其可促进鹅膏蕈毒素在由靶结合部分靶向的细胞中的特异性释放。优选连接体和优选一侧的连接体和鹅膏蕈毒素之间的键和另一侧的连接体和抗体之间的键在细胞外的生理条件(例如血液)下稳定，同时其可在细胞内被切割，特别是在靶细胞内，例如癌症细胞或免疫细胞内。为了提供这种选择性的稳定性，连接体可包含优选对pH敏感的官能性，以产生对pH敏感的连接体，例如S.Fletcher，M.R.Jorgensens和A.D.Miller；Org.Lett.2004，6(23)，第4245-4248页中所述；或可包含对蛋白酶敏感的官能性，以产生对蛋白酶敏感的连接体，例如L.DA Ibsen，Blood 2003，102，1458-65或Francisco JA，Cerreny CG，Meyer DL，Nat.Biotechnol 2003，21，778-84中所述。或者，连接连接体与靶结合部分的键可提供选择性的稳定性。优选连接体具有至少1个、优选1-20个原子的长度(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子)，其中连接体一侧与鹅膏蕈毒素反应，另一侧与靶结合部分反应。在本发明上下文中，连接体优选为任选取代的C1-20-烷基、C1-20-杂烷基、C2-20-烯基、C2-20-杂烯基、C2-20-炔基、C2-20-杂炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。连接体可含有一种或多种结构元件，例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、烃部分等。连接体亦可含有这些结构元件中两种以上的的组合。这些结构元件中每一种可在连接体中出现多于一次，例如两次、三次、四次、五次或六次。在某些实施方案中，连接体可包含二硫键。应该理解，连接体必须在单个步骤或在两个以上后续步骤中与鹅膏蕈毒素和靶结合部分连接。为此，连接体应携带两个基团，优选在近端和远端，其可(i)与优选为鹅膏蕈毒素或靶结合肽上的活化基团的基团形成共价键；或(ii)其可被或被活化以与鹅膏蕈毒素上的基团形成共价键。因此，若存在连接体，则优选化学基团在连接体的远端和近端，其为诸如酯、醚、尿烷、肽键等这样的偶联反应的结果。任选存在“连接体”，即在本发明靶结合部分毒素缀合物的某些实施方案中毒素可直接与靶结合部分的残基连接。优选连接体经由键直接与靶向部分优选在其末端连接。若靶结合部分包含游离氨基、羧基或巯基，例如呈可包含在多肽中的Asp、Glu、Arg、Lys、Cys残基形式，那么优选连接体与这样的基团偶联。
如本文所用，若第一种化合物(例如抗体)对于第二种化合物(例如抗原，例如靶蛋白质)具有以下解离常数KD，则认为其与所述第二种化合物“特异性结合”：100μM或更小、优选50μM或更小、优选30μM或更小、优选20μM或更小、优选10μM或更小、优选5μM或更小、更优选1μM或更小、更优选900nM或更小、更优选800nM或更小、更优选700nM或更小、更优选600nM或更小、更优选500nM或更小、更优选400nM或更小、更优选300nM或更小、更优选200nM或更小、甚至更优选100nM或更小、甚至更优选90nM或更小、甚至更优选80nM或更小、甚至更优选70nM或更小、甚至更优选60nM或更小、甚至更优选50nM或更小、甚至更优选40nM或更小、甚至更优选30nM或更小、甚至更优选20nM或更小和甚至更优选10nM或更小。
本文所用“患者”意指可从用本文所述靶结合部分毒素缀合物治疗获益的任何哺乳动物或鸟。优选“患者”选自实验室动物(例如小鼠或大鼠)、家畜(包括例如豚鼠、兔、驴、绵羊、山羊、鸡、骆驼、马、猫或狗)或包括人的灵长类。特别优选“患者”为人。
本文所用“治疗”疾病或病症意指实现以下一种或多种目的：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制或预防待治疗的病症的症状特征的发展；(c)抑制待治疗的病症的症状特征恶化；(d)限制或预防先前患有病症的患者的病症的复发；和(e)限制或预防先前有病症症状的患者的症状复发。
本文所用″给予″包括体内给予以及直接给予离体组织，例如静脉移植物。
“有效量”是治疗剂足以实现预期目的的量。给定治疗剂的有效量会随多种因素变化，例如药物的特性、给药途径、接受治疗药的动物的大小和物种及给药目的。可由技术人员按照本领域已建立的方法从经验上确定每一单独病例的有效量。
“药学上可接受的”意指由联邦或州政府管理机构批准，或在美国药典或其它通用公认药典中列出用于动物，更尤其是用于人。
本发明实施方案
现在将进一步阐述本发明。在以下段落中，更详细地解释了本发明的不同方面。除非明确指出与此相反，否则所解释的每一个方面可与任何其它一个或多个方面组合。特别地，指出为优选或有利的任何特征可与任何其它指出为优选或有利的特征组合。
在第一方面，本发明涉及一种用于治疗患者的胰腺癌、胆管癌或结直肠癌的抗体毒素缀合物，其中所述缀合物包含：(i)特异性结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)表位的抗体或其抗原结合片段；(ii)鹅膏蕈毒素；和(iii)任选的连接体。
在第一方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自双抗体、四抗体、纳米抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。在第一方面的一个优选实施方案中，抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv和二硫键连接的Fv(dsFv)。
在一个优选实施方案中，EpCAM表位为人EpCAM表位。
在第一方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链的CDR3结构域(SEQ ID NO：22)；和/或(b)huHEA125轻链的CDR3结构域(SEQ ID NO：25)。在一个特别优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：25所示的这两种CDR3结构域。优选抗体或其抗原结合片段另外包含以下一种或多种：(a)huHEA125重链的CDR2结构域(SEQ ID NO：21)；(b)huHEA125重链的CDR1结构域(SEQ ID NO：20)；(c)huHEA125轻链的CDR2结构域(SEQ ID NO：24)；和(d)huHEA125轻链的CDR1结构域(SEQ ID NO：23)。在一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含huHEA125重链的CDR3结构域(SEQ ID NO：22)、CDR2结构域(SEQ ID NO：21)和CDR1结构域(SEQ ID NO：20)。在一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含huHEA125轻链的CDR3结构域(SEQ ID NO：25)、CDR2结构域(SEQ ID NO：24)和CDR1结构域(SEQ ID NO：23)。在一个特别优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链的CDR3结构域、CDR2结构域和CDR1结构域，即抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：20、21、22、23、24和25所示的氨基酸序列。
在第一方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含huHEA125重链可变域(＝VH)(SEQ ID NO：3)和/或huHEA125轻链可变域(＝VL)(SEQ ID NO：12)。在一个特别优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含huHEA125的VH结构域(SEQ ID NO：3)和VL结构域(SEQ ID NO：12)二者。
在第一方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含huHEA125重链(可溶形式，SEQ ID NO：2)和/或huHEA125轻链(SEQID NO：11)。在一个实施方案中，huHEA125重链和/或huHEA125轻链相互独立地各包含可达20(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸交换、缺失或插入，其中这些氨基酸交换、缺失或插入可位于重链恒定域和/或轻链恒定域和/或重链可变域的框架区和/或轻链可变域的框架区中。在一个特别优选实施方案中，抗体为包含huHEA125两条重链(SEQ ID NO：2)和huHEA125两条轻链(SEQ ID NO：11)的完全IgG抗体，其中一条重链经由二硫键与一条轻链连接，两条重链通过一个或两个(优选两个)二硫键彼此连接。
在第一方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含huHEA125重链(膜结合形式，SEQ ID NO：1)和/或huHEA125轻链(SEQ ID NO：11)。在一个实施方案中，huHEA125重链和/或huHEA125轻链相互独立地各包含可达20(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸交换、缺失或插入，其中这些氨基酸交换、缺失或插入可位于重链恒定域和/或轻链恒定域和/或重链可变域的框架区和/或轻链可变域的框架区中。在一个特别优选实施方案中，抗体为包含huHEA125的两条重链(SEQ ID NO：1)和huHEA125的两条轻链(SEQ ID NO：11)的完全IgG抗体，其中一条重链经由二硫键与一条轻链连接，两条重链通过一个或两个(优选两个)二硫键彼此连接。
在第一方面的一个优选实施方案中，鹅膏蕈毒素选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽和一羟鹅膏毒肽羧酸(均示于图1)以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。特别优选鹅膏蕈毒素为α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱和三羟鹅膏毒肽酰胺以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。
在第一方面的一个优选实施方案中，鹅膏蕈毒素通过鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子(见图1)与抗体或可能存在的连接体L1连接。在可用于本发明的优选鹅膏蕈毒素中，所述3号氨基酸为异亮氨酸、γ-羟基异亮氨酸或γ，δ-二羟基异亮氨酸。
在第一方面的优选实施方案中，鹅膏蕈毒素通过与鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子结合的氧原子与抗体或可能存在的连接体L1连接。进一步优选鹅膏蕈毒素通过酯键、醚键或尿烷键与抗体或可能存在的连接体L1连接。在这些实施方案中，优选3号氨基酸为γ，δ-二羟基异亮氨酸。
在第一方面的优选实施方案中，抗体通过抗体中存在的氨基与鹅膏蕈毒素或可能存在的连接体L1连接。
在第一方面的一个优选实施方案中，连接体L1为任选取代的烷基、杂烷基、烯基、杂烯基、炔基、杂炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。在第一方面的另外的优选实施方案中，连接体L1包含二硫键。
在第二方面，本发明涉及一种抗体毒素缀合物，其包含：(i)特异性结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链，其中所述重链选自：(a1)SEQ ID NO：1的重链膜结合形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入，SEQ ID NO：26所示的重链恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入；和(a2)SEQ ID NO：2的重链可溶形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入，SEQ ID NO：27所示的重链恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入；和(b)SEQID NO：11的huHEA125轻链，其中SEQ ID NO：12所示的轻链可变域VL包含位于VL框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入，SEQ ID NO：28所示的轻链恒定域CL包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入；(ii)鹅膏蕈毒素；和(iii)任选的连接体。
在第二方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链，其中所述重链选自：(a1)SEQ ID NO：1的重链膜结合形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入；和(a2)SEQ ID NO：2的重链可溶形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入；和(b)SEQ ID NO：11的huHEA125轻链，其中SEQ ID NO：12所示的轻链可变域VL包含位于VL框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸插入。
在第二方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链，其中所述重链选自：(a1)SEQ ID NO：1的重链膜结合形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、氨基酸缺失和/或氨基酸插入，SEQ ID NO：26所示的重链恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、氨基酸缺失和/或氨基酸插入；和(a2)SEQ ID NO：2的重链的可溶形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、氨基酸缺失和/或氨基酸插入，SEQ ID NO：27所示的重链恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、氨基酸缺失和/或氨基酸插入；和(b)SEQ ID NO：11的huHEA125轻链，其中SEQ ID NO：12所示的轻链可变域VL包含位于VL框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、氨基酸缺失和/或氨基酸插入，SEQ ID NO：28所示的轻链恒定域CL包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换、氨基酸缺失和/或氨基酸插入。
在第二方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链，其中所述重链选自：(a1)SEQ ID NO：1的重链膜结合形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换，SEQ ID NO：26所示的重链恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换；和(a2)SEQ ID NO：2的重链的可溶形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换，SEQ ID NO：27所示的重链恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换；和(b)SEQ ID NO：11的huHEA125轻链，其中SEQ ID NO：12所示的轻链可变域VL包含位于VL框架区中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换，SEQ ID NO：28所示的轻链恒定域CL包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸交换。
在第二方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链，其中所述重链选自：(a1)SEQ ID NO：1的重链膜结合形式；和(a2)SEQ ID NO：2的重链的可溶形式；和(b)SEQID NO：11的huHEA125轻链。
在第二方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。在第二方面的一个优选实施方案中，抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2和Fd。
在第二方面的一个优选实施方案中，抗体为huHEA125或其抗原结合片段。
在第二方面的一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段与人EpCAM特异性结合。
在第二方面的一个优选实施方案中，鹅膏蕈毒素选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽和一羟鹅膏毒肽羧酸(均示于图1)，以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。特别优选鹅膏蕈毒素为α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱，和三羟鹅膏毒肽酰胺，以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。
在第二方面的一个优选实施方案中，鹅膏蕈毒素通过鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子(见图1)与抗体或可能存在的连接体L2连接。在可用于本发明的优选鹅膏蕈毒素中，所述3号氨基酸为异亮氨酸、γ-羟基异亮氨酸或γ，δ-二羟基异亮氨酸。
在第二方面的优选实施方案中，鹅膏蕈毒素通过与鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子结合的氧原子与抗体或可能存在的连接体L2连接。进一步优选鹅膏蕈毒素通过酯键、醚键或尿烷键与抗体或可能存在的连接体L2连接。在这些实施方案中，优选3号氨基酸为γ，δ-二羟基异亮氨酸。
在第二方面的优选实施方案中，抗体通过抗体中存在的氨基与鹅膏蕈毒素或可能存在的连接体L2连接。
在第二方面的一个优选实施方案中，连接体L2为任选取代的烷基、杂烷基、烯基、杂烯基、炔基、杂炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。在第五方面的另外的优选实施方案中，连接体L2包含二硫键。
在第三方面，本发明涉及用于医药的第二方面的缀合物。
在第四方面，本发明涉及用于治疗患者癌症的第二方面的缀合物，其中所述癌症选自胰腺癌、胆管癌、乳腺癌和结直肠癌。
在第五方面，本发明涉及用于制备用于治疗患者癌症的药物组合物的第二方面的缀合物，其中所述癌症选自胰腺癌、胆管癌、乳腺癌和结直肠癌。
在第五方面，本发明涉及一种靶结合部分毒素缀合物，其包含：(i)靶结合部分；(ii)鹅膏蕈毒素；和(iii)任选的连接体L3；其中鹅膏蕈毒素通过鹅膏蕈毒素3号氨基酸、优选通过鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子(见图1)与靶结合部分或可能存在的连接体L3连接。在可用于本发明的优选鹅膏蕈毒素中，所述3号氨基酸为异亮氨酸、γ-羟基异亮氨酸或γ，δ-二羟基异亮氨酸。
在第五方面的一个优选实施方案中，鹅膏蕈毒素通过与鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子结合的氧原子与靶结合部分或可能存在的连接体L3连接。进一步优选鹅膏蕈毒素通过以下方式与靶结合部分或可能存在的连接体L3连接：酯键，优选呈鹅膏蕈毒素-O-C(O)-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-O-C(O)-靶结合部分形式，更优选呈鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-靶结合部分形式，最优选呈鹅膏蕈毒素-δCH2-O-C(O)-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-δCH2-O-C(O)-靶结合部分形式；醚键，优选呈鹅膏蕈毒素-O-L3或鹅膏蕈毒素-O-靶结合部分形式，优选呈鹅膏蕈毒素-δC-O-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-δC-O-靶结合部分形式，更优选呈鹅膏蕈毒素-δCH2-O-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-δCH2-O-靶结合部分形式；或尿烷键，优选呈鹅膏蕈毒素-O-C(O)-NH-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-O-C(O)-NH-靶结合部分形式，优选呈鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-NH-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-NH-靶结合部分形式，即鹅膏蕈毒素-δCH2-O-C(O)-NH-L3-靶结合部分或鹅膏蕈毒素-δCH2-O-C(O)-NH-靶结合部分形式。在这些实施方案中，优选3号氨基酸为γ，δ-二羟基异亮氨酸。
在第五方面的优选实施方案中，存在连接体L3，且缀合物具有以下结构之一：(i)鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-L3-C(O)-NH-靶结合部分；(ii)鹅膏蕈毒素-δC-O-L3-C(O)-NH-靶结合部分；或(iii)鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-NH-L3-C(O)-NH-靶结合部分，优选(i)鹅膏蕈毒素-δCH2-O-C(O)-L3-C(O)-NH-靶结合部分；(ii)鹅膏蕈毒素-δCH2-O-L3-C(O)-NH-靶结合部分；或(iii)鹅膏蕈毒素-δCH2-O-C(O)-NH-L3-C(O)-NH-靶结合部分。
在第五方面的一个优选实施方案中，靶结合部分通过靶结合部分中存在的氨基与鹅膏蕈毒素或可能存在的连接体L3连接。
在第五方面的一个优选实施方案中，鹅膏蕈毒素选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽或一羟鹅膏毒肽羧酸(均示于图1)，以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。特别优选鹅膏蕈毒素为α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱，和三羟鹅膏毒肽酰胺，以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。
在第五方面的一个优选实施方案中，连接体L3为任选取代的烷基、杂烷基、烯基、杂烯基、炔基、杂炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。在第五方面的另外的优选实施方案中，连接体L3包含二硫键。
在第五方面的一个优选实施方案中，靶结合部分与存在于肿瘤细胞上的表位特异性结合。特别优选靶结合部分与上皮细胞黏附分子(EpCAM)的表位特异性结合。
在第五方面的一个优选实施方案中，靶结合部分选自：(i)抗体或其抗原结合片段；(ii)抗体样蛋白；和(iii)核酸适配体。在一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自双抗体、四抗体、纳米抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。在一个优选实施方案中，抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv和二硫键连接的Fv(dsFv)。在一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(a)huHEA125重链的膜结合形式(SEQ ID NO：1)或huHEA125重链的可溶形式(SEQ ID NO：2)；和/或(b)huHEA125轻链(SEQ ID NO：11)。
在第六方面，本发明涉及用于医药的第五方面的靶结合部分毒素缀合物。
在第七方面，本发明涉及用于治疗患者的癌症的第五方面的靶结合部分毒素缀合物，其中所述癌症选自胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
在第八方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含第一方面或第二方面的抗体毒素缀合物或者第五方面的靶结合部分毒素缀合物，并还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；和/或防腐剂。
第五到第七实施方案的靶结合部分在优选实施方案中是蛋白质，尤其是抗体。蛋白质尤其是抗体包含允许偶联鹅膏蕈毒素的若干氨基酸。优选氨基酸具有游离氨基、羟基或羰基，包括Lys、Gln、Glu、Asp、Asn、Thr和Ser。因此，一个蛋白质分子可偶联多于一个的鹅膏蕈毒素分子。每分子的鹅膏蕈毒素数目增加亦将增加毒性。因此，在一个优选实施方案中，第一到第四实施方案的抗体和第五到第七实施方案的靶结合部分与鹅膏蕈毒素的比率为1个蛋白质分子比1-15个鹅膏蕈毒素分子(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)。为计算比率的目的，在IgG等二聚体(dimmer)情况下认为该二聚体为一个分子。若靶结合部分不是蛋白质，优选相似的比率。
特别优选第八方面的药物组合物可以全身性给予的药物形式使用。这些包括胃肠外药物，尤其包含注射剂和输注剂。注射剂配制为安瓿或所谓即用型注射剂形式，例如即用型注射器或一次性注射器和除此之外的多次抽取的可穿刺瓶。可以以皮下(s.c)、肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)或皮内(i.c.)施用形式给予注射剂。特别是可生产作为晶体混悬液、溶液、纳米颗粒或胶体分散体系(例如水溶胶)的各自合适的注射制剂。
可进一步产生作为浓缩物的注射制剂，其可用水性等渗稀释剂溶解或分散。亦可制备等渗溶液、脂肪乳剂、脂质体制剂及微乳剂形式的输注剂。与注射剂相似，亦可制备呈用于稀释的浓缩物形式的输注制剂。在住院病人和非卧床病人治疗二者中，注射制剂亦可以固定输注形式施用，例如通过微型泵。
将以下物质加到胃肠外药物制剂中是可能的：例如清蛋白、血浆、膨胀剂、表面活性物质、有机稀释剂、影响pH的物质、络合物质或聚合物质，尤其是作为影响本发明靶结合部分毒素缀合物吸附到蛋白质或聚合物的物质，或亦可加入它们旨在降低本发明靶结合部分毒素缀合物吸附到注射器械或包装材料等材料(例如塑料或玻璃)上。
可将本发明靶结合部分毒素缀合物与胃肠外制品中的微载体或纳米颗粒结合，例如与基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolate)、聚氨基酸或聚醚氨酯的细致分散的颗粒结合。亦可将胃肠外制剂改变为长效制剂，例如，若将本发明靶结合部分毒素缀合物分别以细致分散的、分散的及混悬形式或作为药物中的晶体混悬剂引入，则基于“多单位原理”；或若将本发明靶结合部分毒素缀合物包封入制剂中，例如片剂或随后植入的棒中，则基于“单个单位原理”。这些在单个单位或多单位制剂中的植入物或长效药物通常由所谓的生物可降解聚合物组成，所述聚合物例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或聚糖。
在制备配制为胃肠外制剂的本发明药物组合物期间加入的辅料和载体，优选分别为消毒水(无菌水)；影响pH值的物质，例如有机或无机酸或碱以及其盐、用于调节pH值的缓冲物质；用于等渗的物质，例如氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖和果糖；表面活性剂(tenside和surfactant)；以及乳化剂，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇的脂肪酸偏酯(例如Tween)或例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如Cremophor
Figure BPA00001446671900232
)，脂肪油例如花生油、大豆油或蓖麻油，脂肪酸的合成酯例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和中性油(例如Miglyol
Figure BPA00001446671900233
)；以及聚合物辅料等，例如明胶、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮；提高有机溶剂溶解度的添加剂，例如丙二醇、乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、丙二醇；或形成络合物的物质，例如柠檬酸盐和脲；防腐剂，例如苯甲酸羟基丙酯和苯甲酸甲酯、苯甲醇；抗氧化剂，例如亚硫酸钠；和稳定剂，例如EDTA。
在一个优选实施方案中，当将本发明药物组合物配制为混悬剂时，加入增稠剂以防止本发明靶结合部分毒素缀合物沉降，或加入表面活性剂及聚合物电解质以确保沉淀物的可重悬性和/或加入络合物形成剂例如EDTA。亦可获得活性成分与不同聚合物的复合物。这样的聚合物的实例为聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纤维素、Pluronics
Figure BPA00001446671900234
或聚乙二醇山梨醇脂肪酸酯。本发明靶结合部分毒素缀合物亦可以例如与环糊精的包合物的形式加入到液体制剂中。在特定的实施方案中，可加入分散剂作为另外的辅料。对于冷冻干燥物的制备，可使用支架剂(scaffolding agent)，例如甘露醇、右旋糖苷、蔗糖、人清蛋白、乳糖、PVP或多种明胶。
在另一方面，本发明涉及一种治疗有需要的患者的胰腺癌、胆管癌或结直肠癌的方法，所述方法包括给予患者有效量的第一方面的抗体毒素缀合物。
在另一方面，本发明涉及一种治疗有需要的患者的胰腺癌、胆管癌、乳腺癌或结直肠癌的方法，所述方法包括给予患者有效量的第三方面的抗体毒素缀合物。
在另一方面，本发明涉及一种治疗有需要的患者的胰腺癌、胆管癌、乳腺癌或结直肠癌的方法，所述方法包括给予患者有效量的第五方面的靶结合部分毒素缀合物。
实施例
下面通过非限制性实施例来更详细地说明本发明：
实施例1：比较抗体huHEA125和抗体毒素缀合物鹅膏蕈碱-huHEA125之间的与靶细胞的结合亲和力
1.1嵌合抗体huHEA125
几年前，发明人已建立了分泌抗EpCAM小鼠单克隆抗体HEA125的杂交瘤细胞系(Moldenhauer等，1987；Momburg等，1987)。利用分子生物学技术重新构建该杂交瘤细胞系，以产生由小鼠可变域钩住人κ恒定轻链和人IgG1恒定重链组成的抗体嵌合版本。得到的抗体huHEA125以高亲和力(Kd＝2.2x10-9M)和高特异性与EpCAM-表达细胞结合。huHEA125免疫球蛋白的基因序列和氨基酸序列如下所示：
huHEA125重链
肽序列重链，膜结合形式(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1；在IGHG1下划线)(SEQ ID NO：1)：
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGLQLDET CAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSAAVTLFKVKWIFSSVVE LKQTLVPEYKNMIGQAP
肽序列重链，分泌形式(SEQ ID NO：2)：
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
肽序列(IGHV/IGHD/IGHJ＝VH结构域；框架区FR1、FR2、FR3和FR4下划线)(SEQ ID NO：3)：
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAP GKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLFLQMSKVRS EDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSS
核酸序列(按照IMGT-命名法注解，IGHV/IGHD/IGHJ；IGHD下划线；IGHJ双下划线)：
FR1(SEQ ID NO：4)：
GAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCA
CDR1(SEQ ID NO：5)：
GGATTCGATTTTAGTAGATTCTGG
FR2(SEQ ID NO：6)：
ATGACTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAA
CDR2(SEQ ID NO：7)：
ATTAATCTAGATAGCAGTACGATA
FR3(SEQ ID NO：8)：
AACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGGGACAACGCCAAAAATACGCTGTTCCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGT
CDR3(SEQ ID NO：9)：
TCAAGA
Figure BPA00001446671900251
FR4(SEQ ID NO：10)：
Figure BPA00001446671900261
huHEA125轻链
肽序列轻链(IGKV/IGKJ/IGKC；在IGKC下划线)(SEQ ID NO：11)：
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
肽序列(IGKV/IGKJ＝VL结构域；框架区FR1、FR2、FR3和FR4下划线)(SEQ ID NO：12)：
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPR LLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIWPTTFGAGTKLELK
核酸序列(按照IMGT-命名法注解，IGKV/IGKJ；IGKV下划线；IGKJ双下划线)：
FR1(SEQ ID NO：13)：
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAG TCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGT
CDR1(SEQ ID NO：14)：
CAGAGCATTGGCATAAGT
FR2(SEQ ID NO：15)：
TTACACTGGTATCAGCAAAGACCAAGTGATTCTCCAAGGC TTCTCATAAAG
CDR2(SEQ ID NO：16)：
TATGCTTCT
FR3(SEQ ID NO：17)：
GAGTCAATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGG ATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTG AAGATATTGCAGATTATTACTGT
CDR3(SEQ ID NO：18：
CAACAAAGTAATATCTGGCCAAC
FR4(SEQ ID NO：19)：
Figure BPA00001446671900272
1.2对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900273
对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900274
(Omalizumab，针对人IgE免疫球蛋白的人IgG1抗体)由Novartis，Germany生产。
1.3α-鹅膏蕈碱抗体缀合物的合成
1.3.1α-鹅膏蕈碱-戊二酸的合成
将在真空中经P4O10干燥的3.0mg(3.3μmol)α-鹅膏蕈碱溶解于0.25ml无水吡啶中，并与0.1ml吡啶中的0.9mg(79μmol)戊二酐在室温黑暗处反应24小时。通过加入7ml无水二乙醚使肽沉淀，离心，用二乙醚再次洗涤固体并离心。
通过该反应获得α-鹅膏蕈碱衍生物，其中R1＝-OH(在图1中)被R1＝-O-C(O)-(CH2)3-COOH取代。
1.3.2α-鹅膏蕈碱-戊二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
将3.4mg的α-鹅膏蕈碱戊二酸(3.3μmol)溶解于0.05ml无水二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入溶于0.01ml DMF中的2.4mg(7当量)的N-羟基琥珀酰亚胺。在加入0.01ml DMF中的1.2mg二环己基碳二亚胺后，使反应继续在室温进行16小时。将所形成的晶体与溶液分离，通过加入4ml无水二乙醚使肽沉淀。离心后再用4ml醚洗涤沉淀并离心。将固体溶于0.1ml二甲基甲酰胺中，并立即用于与抗体溶液反应。
1.3.3α-鹅膏蕈碱-戊二酸-huHEA125的合成
将3.0mg α-鹅膏蕈碱-戊二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的0.1ml溶液加入到5ml PBS中的10mg hu-HEA125抗体中，并在缓慢旋转下于5℃在黑暗中反应。16小时后，将溶液施用到用PBS平衡的SephadexG25柱(120x 1.5cm)上，并收集蛋白质流分。用13.500cm-1·M-1的鹅膏蕈毒素摩尔消光系数从蛋白质溶液相对于含有同样浓度的天然抗体的空白在310nm处的吸收差异，来分光光度测定鹅膏蕈碱的载量。该制品的α-鹅膏蕈碱∶IgG比率为大约8。
1.4结合竞争分析
在竞争实验中通过流式细胞术分析了鹅膏蕈碱-huHEA125缀合物对未缀合的huHEA125抗体的结合。如以上1.3.1-1.3.3节所述合成α-鹅膏蕈碱-huHEA125缀合物。
在FACS缓冲液(含1％热灭活胎牛血清和0.1％叠氮化钠的Dulbecco氏PBS)中洗涤Colo205靶细胞(结肠癌转移)2次，计数并调整为每毫升2x107个细胞。将50μl细胞悬液加到96孔U形底微量滴定板的各孔中，用移液管加入50μl/孔FITC-标记的huHEA125抗体。将400μg/ml-10ng/ml终稀释度的鹅膏蕈碱-huHEA125或huHEA125的系列稀释物一式三份以50μl/孔的体积加入，并在冰上孵育1小时。随后将板离心(2000rpm下2分钟)，从细胞除掉上清液。用150μl FACS缓冲液重悬细胞，并再次离心。通过离心进行两次洗涤步骤后，将细胞吸收到100μl/孔的碘化丙啶溶液(在FACS缓冲液中1μg/ml)中，以使能够区分死细胞。在FACScan细胞计数器(Becton and Dickinson，Heidelberg，Germany)上利用CellQuest软件进行分析。
如图2所示，用渐增量的huHEA125-鹅膏蕈碱缀合物或未修饰的huHEA125抗体竞争结合靶细胞显示，贯穿竞争抗体或抗体缀合物的10ng/ml-400μg/ml浓度范围的结合强度类似。因此，缀合步骤不显著改变huHEA125-鹅膏蕈碱与靶细胞的亲和力。
实施例2：通过间接免疫荧光检测EpCAM抗原在不同癌细胞系上的表面表达
将细胞系Capan-1、Colo205、OZ、MCF-7、BxPC-3和PC-3首先与huHEA125或Xolair
Figure BPA00001446671900281
孵育。在洗涤后，通过FITC-标记的F(ab’)2山羊抗人IgG(H+L)作为第二步的试剂将第一抗体的结合可视化。结果示于图3A(Capan-1)、图3B(Colo205)、图3C(OZ)、图3D(MCF-7)、图3E(BxPC-3)和图3F(PC-3)中。各图左边灰色阴影柱状图显示用对照抗体Xolair
Figure BPA00001446671900291
获得的结果；各图右边具有白色区域的柱状图显示用抗体huHEA125获得的结果。
实施例3：通过鹅膏蕈碱和鹅膏蕈碱/抗体缀合物诱导癌细胞增殖抑制
3.1癌细胞系
将以下癌细胞系用于生长抑制研究：
3.2增殖抑制测定
通过掺入[3H]-胸苷测定鹅膏蕈碱-IgG缀合物对细胞生长的抑制。在96孔平底组织培养微量滴定板的孔中以100μl体积一式三份制备，2x10-5M-6x10-13范围内的鹅膏蕈碱-huHEA125、鹅膏蕈碱-Xolair和游离鹅膏蕈碱在完全培养基(补充10％热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的RPMI 1640)中的系列稀释物。加入每孔50μl体积的密度为2x104/ml的细胞。在潮湿气氛下于37℃和5％CO2条件下孵育板72或96小时。在测定结束前的20小时加入1μCi[3H]-胸苷。随后用Tomtec细胞收获器处理板，通过液体闪烁计数(Wallac Betaplate液体闪烁计数仪，PerkinElmer Life and Analytical Sciences)测定掺入的放射性，并以cpm表示。
在胰腺癌细胞系Capan-1情况下，huHEA125-鹅膏蕈碱免疫毒素以1x10-11-3x10-10M的鹅膏蕈碱浓度诱导生长停滞，其如图4中所示。
在结肠癌症细胞系Colo205情况下，huHEA125-鹅膏蕈碱免疫毒素以1x10-12-4x10-11M的鹅膏蕈碱浓度诱导生长停滞，其如图5中所示。
在乳腺癌细胞系MCF-7情况下，huHEA125-鹅膏蕈碱免疫毒素以1x10-12-1x10-11M的鹅膏蕈碱浓度诱导生长停滞，其如图6中所示。
在胆管癌细胞系OZ情况下，huHEA125-鹅膏蕈碱免疫毒素以1x10-11-6x10-10M的鹅膏蕈碱浓度诱导生长停滞，其如图7中所示。
在胰腺细胞系BxPC-3情况下，huHEA125-鹅膏蕈碱免疫毒素以2x10-11-6x10-10M的鹅膏蕈碱浓度诱导生长停滞，其如图8中所示。
实施例4：利用两种异种移植物小鼠肿瘤模型通过鹅膏蕈碱/抗体缀合物体内抑制肿瘤生长
将5-6周龄的免疫缺陷NOD/SCID小鼠用于所有实验。将BxPC-3胰腺肿瘤细胞或PC-3前列腺肿瘤细胞(5x106个在100μl PBS中)皮下移植到小鼠的右胁。10天后，当BxPC-3肿瘤达到30-80mm3体积且PC-3肿瘤达到40-190mm3体积时，开始治疗。动物接受15mg/kg剂量的对照huHEA125mAb或50μg/kg鹅膏蕈碱剂量的huHEA125-鹅膏蕈碱缀合物(huHEA125-Ama)。单次腹膜内注射给予抗体和缀合物。
在开始治疗后监测16天的肿瘤生长。每隔3天用测径器从外部测量肿瘤大小。按照公式计算肿瘤体积：V＝π/6*a*b*c，其中a、b和c为三个维度上的直径。数据表示为从给予抗体时间起的相对肿瘤大小/体积增加。
荷有BxPC-3肿瘤的小鼠(n＝6)良好耐受50μg/kg鹅膏蕈碱剂量的huHEA125-Ama给予。小鼠体重未降低，肝酶(实验的最后一天在血清中测量LDH、ALT、AST和AP)亦未升高。肿瘤生长受到该剂量缀合物的强烈抑制。所有小鼠对治疗有响应，从给予缀合物后的第7天开始肿瘤体积显著缩小。在第16天随访结束时，50％小鼠中肿瘤完全消除。与此相比，在接受未缀合的huHEA125mAb的对照小鼠中，肿瘤体积增加约880％(图9)。
在荷有PC-3肿瘤的小鼠情况中，良好耐受50μg/kg鹅膏蕈碱剂量的huHEA125-Ama。未观察到小鼠体重降低。该剂量的缀合物强烈阻滞肿瘤生长。在给予huHEA125-Ama 10天后，肿瘤体积与开始治疗时相似。与此相比，在接受未缀合的huHEA125mAb的对照小鼠中，肿瘤体积增加约550％。由于对照组的大肿瘤体积，实验在治疗后第10天终止(图10)。
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序列表-免费的文本信息
SEQ ID NO：1：嵌合抗体huHEA125，重链，膜结合形式
SEQ ID NO：2：嵌合抗体huHEA125，重链，分泌形式
SEQ ID NO：3：嵌合抗体huHEA125，重链，VH结构域
SEQ ID NO：4：嵌合抗体huHEA125，重链，FR1区段
SEQ ID NO：5：嵌合抗体huHEA125，重链，CDR1区段
SEQ ID NO：6：嵌合抗体huHEA125，重链，FR2区段
SEQ ID NO：7：嵌合抗体huHEA125，重链，CDR2区段
SEQ ID NO：8：嵌合抗体huHEA125，重链，FR3区段
SEQ ID NO：9：嵌合抗体huHEA125，重链，CDR3区段
SEQ ID NO：10：嵌合抗体huHEA125，重链，FR4区段
SEQ ID NO：11：嵌合抗体huHEA125，轻链
SEQ ID NO：12：嵌合抗体huHEA125，轻链，VL结构域
SEQ ID NO：13：嵌合抗体huHEA125，轻链，FR1区段
SEQ ID NO：14：嵌合抗体huHEA125，轻链，CDR1区段
SEQ ID NO：15：嵌合抗体huHEA125，轻链，FR2区段
SEQ ID NO：16：嵌合抗体huHEA125，轻链，CDR2区段
SEQ ID NO：17：嵌合抗体huHEA125，轻链，FR3区段
SEQ ID NO：18：嵌合抗体huHEA125，轻链，CDR3区段
SEQ ID NO：19：嵌合抗体huHEA125，轻链，FR4区段
SEQ ID NO：20：嵌合抗体huHEA125，重链，CDR1结构域
SEQ ID NO：21：嵌合抗体huHEA125，重链，CDR2结构域
SEQ ID NO：22：嵌合抗体huHEA125，重链，CDR3结构域
SEQ ID NO：23：嵌合抗体huHEA125，轻链，CDR1结构域
SEQ ID NO：24：嵌合抗体huHEA125，轻链，CDR2结构域
SEQ ID NO：25：嵌合抗体huHEA125，轻链，CDR3结构域
SEQ ID NO：26：嵌合抗体huHEA125，重链，恒定域，膜结合形式
SEQ ID NO：27：嵌合抗体huHEA125，重链，恒定域，分泌形式
SEQ ID NO：28：嵌合抗体huHEA125，轻链，恒定域
Figure IPA00001446671300031
Figure IPA00001446671300041
Figure IPA00001446671300051
Figure IPA00001446671300081
Figure IPA00001446671300091
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Figure IPA00001446671300201
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Figure IPA00001446671300221

Claims (32)

1.一种用于治疗患者的胰腺癌、胆管癌或结直肠癌的抗体毒素缀合物，其中所述缀合物包含：
(i)特异性结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)表位的抗体或其抗原结合片段；
(ii)鹅膏蕈毒素；和
(iii)任选的连接体L1。
2.权利要求1的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自双抗体、四抗体、纳米抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。
3.权利要求1或2的缀合物，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv和二硫键连接的Fv(dsFv)。
4.权利要求1-3中任一项的缀合物，其中所述EpCAM表位为人EpCAM表位。
5.权利要求1-4中任一项的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)huHEA125重链的CDR3结构域(SEQ ID NO：22)；和/或
(b)huHEA125轻链的CDR3结构域(SEQ ID NO：25)。
6.权利要求5的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段另外包含以下一种或多种：
(a)huHEA125重链的CDR2结构域(SEQ ID NO：21)；
(b)huHEA125重链的CDR1结构域(SEQ ID NO：20)；
(c)huHEA125轻链的CDR2结构域(SEQ ID NO：24)；和
(d)huHEA125轻链的CDR1结构域(SEQ ID NO：23)。
7.权利要求1-6中任一项的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含huHEA125的VH结构域(SEQ ID NO：3)和/或huHEA125的VL结构域(SEQ ID NO：12)。
8.权利要求1-7中任一项的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)huHEA125重链的膜结合形式(SEQ ID NO：1)或huHEA125重链的可溶形式(SEQ ID NO：2)；和/或
(b)huHEA125轻链(SEQ ID NO：11)。
9.权利要求1-8中任一项的缀合物，其中所述鹅膏蕈毒素选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽或一羟鹅膏毒肽羧酸或者其盐或类似物。
10.一种抗体毒素缀合物，其包含：
(i)特异性结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)huHEA125重链，其中所述重链选自：
(a1)SEQ ID NO：1的重链的膜结合形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入，和SEQ ID NO：26所示的重链恒定域包含0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入；和
(a2)SEQ ID NO：2的重链可溶形式，其中SEQ ID NO：3所示的重链可变域VH包含位于VH框架区中的0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入，和SEQ ID NO：27所示的重链恒定域包含0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入；
和
(b)SEQ ID NO：11的huHEA125轻链，其中SEQ ID NO：12所示的轻链可变域VL包含位于VL框架区中的0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入，和SEQ ID NO：28所示的轻链恒定域CL包含0-10个氨基酸交换、0-10个氨基酸缺失和/或0-10个氨基酸插入。
(ii)鹅膏蕈毒素；和
(iii)任选的连接体L2。
11.权利要求10的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。
12.权利要求10或11的缀合物，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2和Fd。
13.权利要求10-12中任一项的缀合物，其中所述抗体为huHEA125或其抗原结合片段。
14.权利要求10-13中任一项的缀合物，其中所述鹅膏蕈毒素选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽或一羟鹅膏毒肽羧酸或者其盐或类似物。
15.用于医药的权利要求10-14中任一项的缀合物。
16.用于治疗患者癌症的权利要求10-14中任一项的缀合物，其中所述癌症选自胰腺癌、胆管癌、乳腺癌和结直肠癌。
17.一种靶结合部分毒素缀合物，其包含：
(i)特异性结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)表位的靶结合部分；
(ii)鹅膏蕈毒素；和
(iii)任选的连接体L3；
其中所述鹅膏蕈毒素通过鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子与所述靶结合部分或可能存在的所述连接体L3连接。
18.权利要求17的靶结合部分毒素缀合物，其中所述鹅膏蕈毒素通过与鹅膏蕈毒素3号氨基酸的δC-原子结合的氧原子与所述靶结合部分或可能存在的所述连接体L3连接。
19.权利要求17或18的靶结合部分毒素缀合物，其中所述鹅膏蕈毒素通过酯键、醚键或尿烷键与所述靶结合部分或可能存在的所述连接体L3连接。
20.权利要求17-19中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中存在所述连接体L3，所述缀合物具有以下结构之一：
(i)鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-L3-C(O)-NH-靶结合部分；
(ii)鹅膏蕈毒素-δC-O-L3-C(O)-NH-靶结合部分；或
(iii)鹅膏蕈毒素-δC-O-C(O)-NH-L3-C(O)-NH-靶结合部分。
21.权利要求17-20中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中所述靶结合部分通过存在于所述靶结合部分中的氨基与所述鹅膏蕈毒素或可能存在的所述连接体L3连接。
22.权利要求17-21中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中所述鹅膏蕈毒素选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟鹅膏毒肽酰胺、鹅膏无毒环肽或一羟鹅膏毒肽羧酸或者其盐或类似物。
23.权利要求17-22中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中所述连接体L3为任选取代的烷基、杂烷基、烯基、杂烯基、炔基、杂炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。
24.权利要求17-23中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中所述连接体L3包含二硫键。
25.权利要求17-24中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中所述靶结合部分与肿瘤细胞上存在的表位特异性结合。
26.权利要求17-25中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中所述靶结合部分选自：
(i)抗体或其抗原结合片段；
(ii)抗体样蛋白；和
(iii)核酸适配体。
27.权利要求26的靶结合部分毒素缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自双抗体、四抗体、纳米抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。
28.权利要求26或27的靶结合部分毒素缀合物，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv和二硫键连接的Fv(dsFv)。
29.权利要求26-27的靶结合部分毒素缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)huHEA125重链的膜结合形式(SEQ ID NO：1)或huHEA125重链的可溶形式(SEQ ID NO：2)；和/或
(b)huHEA125轻链(SEQ ID NO：11)。
30.用于医药的权利要求17-29中任一项的靶结合部分毒素缀合物。
31.用于治疗患者癌症的权利要求17-30中任一项的靶结合部分毒素缀合物，其中所述癌症选自胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
32.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项的抗体毒素缀合物或权利要求17-29中任一项的靶结合部分毒素缀合物，且还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
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