TWI822740B - 抗her2雙互補位抗體-藥物結合物及使用方法 - Google Patents

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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Abstract

提供抗HER2雙互補位抗體-藥物結合物(ADC)，其中該藥物為澳瑞他汀類似物且以低平均藥物:抗體比率(DAR)結合於該抗體，及使用該等ADC來治療HER2表現性癌症之方法。當以相同毒素劑量投與時，如與DAR ≥3.9之相應ADC相比，如本文所述之低平均DAR (＜3.9) ADC具有經改良耐受性及減少之毒性。

Description

抗HER2雙互補位抗體-藥物結合物及使用方法
本發明係關於癌症治療劑之領域，且詳言之係關於包含雙互補位抗HER2抗體及澳瑞他汀類似物之抗體-藥物結合物。
HER2 (ErbB2)為跨膜表面結合之受體酪胺酸激酶，其為受體酪胺酸激酶之ErbB家族的成員且通常牽涉於引起細胞生長及分化之信號轉導路徑中。HER2為用於乳癌治療之有前景標靶，因為發現其在約四分之一之乳癌患者中過表現(Bange等人, Nature Medicine 7:548 (2001))。
Herceptin® (曲妥珠單抗，美國專利第5,821,337號)為首次開發用於HER2陽性乳癌之治療的單株抗體且具有增加之患者生存時間，因此其現在同樣用於具有HER2陰性乳癌之患者。帕妥珠單抗(Perjeta®，美國專利第7,862,817號)為人類化單株抗體，其特定地經設計以預防HER2受體與細胞表面上之其他HER受體(EGFR/HER1、HER3及HER4)配對(二聚化)，該配對為咸信在腫瘤生長及生存中發揮作用之過程。Perjeta、Herceptin及化學療法之組合被視為提供HER信號傳導路徑之更全面阻斷。帕妥珠單抗結合於HER2中二聚化所必需之域II，而曲妥珠單抗結合於HER2之細胞外域IV。
Li等人(Cancer Res., 73:6471-6483 (2013))描述了HER2之雙特異性、二價抗體，該等抗體係基於原生曲妥珠單抗及帕妥珠單抗序列且克服了曲妥珠單抗抗性。其他雙特異性抗HER2抗體已加以描述(國際專利申請公開案第WO 2015/077891號及第WO 2016/179707號；美國專利申請公開案第2014/0170148號、第2015/0284463號、第2017/0029529號及第2017/0291955號；美國專利第9,745,382號)。包含位點特異性結合於微管溶素衍生物之HER2靶向性雙互補位抗體的抗體-藥物結合物亦已加以描述(Li等人, Cancer Cell, 29:117-129 (2016))。
澳瑞他汀為多拉司他汀10 (dolastatin 10)之合成類似物，多拉司他汀10為具有抗癌活性之有效微管抑制劑。包含諸如單甲基澳瑞他汀E (MMAE)或單甲基澳瑞他汀F (MMAF)之澳瑞他汀有效載荷的抗體-藥物結合物已加以描述(美國專利第7,498,298號及第7,659,241號；國際專利申請公開案第WO 2002/088172號及第WO 2016/041082號)。國際專利申請公開案第WO 2106/041082號描述了經N-醯基磺醯胺修飾之澳瑞他汀及其作為抗體-藥物結合物有效載荷之用途。
此背景資訊出於獲得申請人咸信與本發明可能相關之已知資訊的目的經提供。既不必意欲承認，亦不應認為任何前述資訊構成所主張之發明的先前技術。
本文描述抗HER2雙互補位抗體-藥物結合物及使用方法。在一態樣中，本發明係關於包含經由連接體(L)以低平均藥物:抗體比率(DAR)結合於澳瑞他汀類似物之抗HER2雙互補位抗體的抗體-藥物結合物，其中該抗HER2雙互補位抗體包含結合第一HER2抗原決定基之第一抗原結合多肽構築體及結合第二HER2抗原決定基之第二抗原結合多肽構築體，該第一及該第二HER2抗原決定基為不同抗原決定基，且其中該低平均DAR為小於3.9之平均DAR。
在該抗體-藥物結合物之某些實施例中，澳瑞他汀類似物-連接體具有通式(II )： (II ) 其中： X為-C(O)NHCH(CH2 R2 )-，或X不存在； R1 係選自：及； L為連接體，且表示連接體-毒素與該抗HER2雙互補位抗體之附接點； 其中該抗HER2雙互補位抗體包含結合第一HER2抗原決定基之第一抗原結合多肽構築體及結合第二HER2抗原決定基之第二抗原結合多肽構築體，該第一及該第二HER2抗原決定基為不同抗原決定基，且 其中該低平均DAR為小於3.9之平均DAR。
在某些實施例中，該抗體-藥物結合物之低平均DAR係在0.5與3.5之間，或在0.5與2.5之間。
在某些實施例中，該抗體-藥物結合物包含5%或5%以上DAR0物質或15%或15%以上DAR0物質。在一些實施例中，該抗體-藥物結合物包含約5%與約50%之間DAR0物質，或約10%與約30%之間DAR0物質，或約10%與約25%之間DAR0物質，或約15%與約25%之間DAR0物質。
在某些實施例中，該抗體-藥物結合物包含25%或25%以下DAR6或更高物質，或15%或15%以下DAR6或更高物質。在一些實施例中，該抗體-藥物結合物包含0%與約15%之間DAR6或更高物質，或約0%與約10%之間DAR6或更高物質。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含如本文所述之抗HER2雙互補位抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
另一態樣係關於一種抑制HER2表現性癌細胞之生長的方法，該方法包含使該癌細胞與有效量之如本文所述之抗HER2雙互補位抗體-藥物結合物接觸。
另一態樣係關於一種治療HER2表現性癌症之方法，其包含向具有HER2表現性癌症之個體投與有效量的如本文所述之抗HER2雙互補位抗體-藥物結合物。
另一態樣係關於如本文所述之抗體-藥物結合物，其用於療法中。
另一態樣係關於如本文所述之抗體-藥物結合物，其用於治療有需要之個體中的HER2表現性癌症。
另一態樣係關於如本文所述之抗體-藥物結合物用於製造用於治療HER2表現性癌症之藥劑的用途。
另一態樣係關於抗體-藥物結合物組合物，其包含經由連接體(L)結合於澳瑞他汀類似物之抗HER2雙互補位抗體，澳瑞他汀類似物-連接體具有通式(II )： (II ) 其中： X不存在； R1 係選自：及； L為連接體，且表示澳瑞他汀類似物-連接體與該抗HER2雙互補位抗體之附接點； 其中該抗HER2雙互補位抗體包含結合HER2之ECD4上的第一HER2抗原決定基之第一抗原結合多肽構築體及結合HER2之ECD2上的第二HER2抗原決定基之第二抗原結合多肽構築體，且 其中該抗體-藥物結合物組合物具有0.5與2.5之間之平均DAR且包含約10%與約30%之間DAR0物質及0%與約15%之間DAR6或更高物質。
本發明係關於抗HER2雙互補位抗體-藥物結合物(ADC)，其中該藥物為澳瑞他汀類似物且以低平均藥物:抗體比率(DAR)結合於該抗體。當以相同毒素(澳瑞他汀類似物)劑量投與時，如與DAR ≥3.9之相應ADC相比，如本文所述之ADC的低平均DAR (＜3.9)具有經改良耐受性及減少之毒性。尤其關注具有約2.5或更低之平均DAR (諸如約1.8與2.5之間)之ADC。
本發明亦係關於使用本文所述之ADC來治療HER2表現性癌症之方法。 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有如熟習此項技術者通常所理解之相同意義。
如本文所用，術語「個體」係指動物，在一些實施例中指哺乳動物，其為治療、觀察或實驗之對象。動物可為人類、非人類靈長類動物、伴侶動物(例如，犬、貓或其類似動物)、農場動物(例如，牛、綿羊、豬、馬或其類似動物)或實驗室動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、非人類靈長類動物或其類似動物)。在某些實施例中，該個體為人類。
如本文所用，術語「哺乳動物」包括但不限於人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、鼠科動物、牛、馬及豬。在某些實施例中，該哺乳動物為人類。
如本文所用，術語「約」係指既定值之大約+/-10%變化。應理解，該種變化始終包括於本文所提供之任何既定值中，無論其是否特定地經提及。
當在本文中聯合術語「包含(comprising)」使用時，措辭「一(a)」或「一(an)」之使用可意謂「一個(one)」，但在某些實施例中亦與「一或多個(one or more)」、「至少一個(at least one)」或「一個或超過一個(one or more than one)」一致。
如本文所用，術語「包含(comprising)」、「具有(having)」、「包括(including)」及「含有(containing)」及其語法變化形式為包括性或開放式且不排除額外、未陳述要素及/或方法步驟。當在本文中結合組合物、用途或方法使用時，術語「基本上由......組成(consisting essentially of)」表示額外要素及/或方法步驟可存在，但此等附加物不會在本質上影響所陳述之組合物、方法或用途起作用之方式。當在本文中結合組合物、用途或方法使用時，術語「由......組成(consisting of)」排除額外要素及/或方法步驟之存在。本文中描述為包含某些要素及/或步驟之組合物、用途或方法亦可在某些實施例中基本上由彼等要素及/或步驟組成，且在其他實施例中由彼等要素及/或步驟組成，無論此等實施例是否特定地經提及。
預期本文所論述之任何實施例均可關於本文所揭示之任何方法、用途或組合物實施。
結合本文所揭示之實施例描述的特定特性、結構及/或特徵可以任何合適方式與結合本文所揭示之另一實施例描述的特性、結構及/或特徵組合以提供一或多個其他實施例。
亦應理解，在一實施例中對特性之明確陳述充當用於在替代實施例中排除該特性之基礎。例如，在針對既定實施例或技術方案呈遞選項之清單的情況下，應理解一或多個選項可自該清單刪除且縮短之清單可形成替代實施例，無論該種替代實施例是否特定地經提及。 抗 HER2 雙互補位抗體 - 藥物結合物
本發明之抗體-藥物結合物(ADC)包含經由連接體以低平均藥物:抗體比率(DAR)結合於毒素之抗HER2雙互補位抗體，該毒素為基於澳瑞他汀之毒素(或「澳瑞他汀類似物」)。基於澳瑞他汀之毒素之實例為此項技術中已知的。
在某些實施例中，該澳瑞他汀類似物為通式(I )之化合物： (I ) 其中： X為-C(O)NHCH(CH2 R2 )-，或X不存在； R1 係選自：及，且 R2 為苯基。
如本文所用，「低DAR」係定義為小於3.9但大於0.5之平均DAR。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR小於3.5。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR小於3.4，例如小於3.3、小於3.2或小於3.1。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR為3.0或更低。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR為2.9或更低，例如2.8或更低、2.7或更低或2.6或更低。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR為2.5或更低，例如2.4或更低、2.3或更低或2.2或更低。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR為約2.0。
在一些實施例中，該等ADC之平均DAR係在0.5與3.8之間，例如在0.5與3.5之間或在0.5與2.5之間。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR係在0.7與3.8之間，例如在0.7與3.5之間、在0.7與3.0之間或在0.7與2.5之間。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR係在1.0與3.8之間，例如在1.0與3.5之間、在1.0與3.0之間或在1.0與2.5之間。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR係在1.5與3.8之間，例如在1.5與3.5之間、在1.5與3.0之間或在1.5與2.5之間。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR係在1.6與3.8之間，例如在1.6與3.5之間、在1.6與3.0之間或在1.6與2.5之間。在一些實施例中，該等ADC之平均DAR係在1.8與2.8之間，例如在1.8與2.5之間。
如上所述，當以相同毒素劑量投與時，如與DAR ≥3.9之相應ADC相比，如本文所述之低平均DAR (＜3.9) ADC具有經改良耐受性及減少之毒性。如此項技術中已知，大多數結合方法產生包括多種DAR物質之ADC組合物，其中所報告之DAR為個別DAR物質之平均值。不受任何特定理論限制，低DAR ADC之較高耐受性及減少之毒性可歸因於ADC組合物中的高DAR (6或更高)物質之減少及/或ADC組合物中的DAR0物質之增加中的一或兩者。
在某些實施例中，包括超過某一閾值之比例的DAR0物質之ADC組合物可為有利的。因此，在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括5%或5%以上DAR0物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括10%或10%以上DAR0物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括15%或15%以上DAR0物質，例如20%或20%以上DAR0物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括約5%與約50%之間DAR0物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括約10%與約50%之間DAR0物質，例如約10%與約40%之間、約10%與約30%之間DAR0物質，或約10%與約25%之間DAR0物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括約12%與約28%之間DAR0物質，例如約12%與約28%之間DAR0物質，或約15%與約25%之間DAR0物質。
在某些實施例中，包括低於某一閾值之比例的DAR6或更高物質之ADC組合物可為有利的。因此，在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括少於約35% DAR6或更高物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括30%或更少DAR6或更高物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括25%或更少DAR6或更高物質，例如20%或更少、15%或更少或10%或更少DAR6或更高物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括9%或更少DAR6或更高物質，例如8%或更少、7%或更少、6%或更少或5%或更少DAR6或更高物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括0%與約35%之間DAR6或更高物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括0%與約30%之間DAR6或更高物質，例如0%與約25%之間或0%與約20%之間DAR6或更高物質。在一些實施例中，低DAR ADC組合物可包括0%與約15%之間DAR6或更高物質，例如約0%與約10%之間、約0%與約8%之間或0%與約5%之間DAR6或更高物質。
某些實施例係關於ADC，其包含經由連接體(L)以低平均藥物:抗體比率(DAR)結合於澳瑞他汀類似物之抗HER2雙互補位抗體，澳瑞他汀類似物-連接體具有通式(II )： (II ) 其中X及R1 如關於通式(I )所定義； L為連接體，且表示澳瑞他汀類似物-連接體與該抗HER2雙互補位抗體之附接點。
某些實施例係關於具有通式(III )之ADC： (III) 其中X及R1 如關於通式(I )所定義； L為連接體； n為平均藥物:抗體比率(DAR)且小於3.9，且 Ab為抗HER2雙互補位抗體。 抗 HER2 雙互補位抗體
本文所述之ADC包含結合於HER2之兩個不同抗原決定基的抗HER2雙互補位抗體。
如本文所用，術語「抗體」一般係指具有免疫球蛋白樣功能之蛋白質結合分子。抗體之典型實例為免疫球蛋白，以及仍保持結合特異性之其衍生物或功能片段。用於抗體產生之技術為此項技術中熟知的。術語「抗體」亦可包括不同類別(亦即，IgA、IgG、IgM、IgD及IgE)及亞類(諸如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 )之免疫球蛋白。抗體之說明性實例為全抗體及其抗原結合片段，諸如Fab片段、F(ab')2 、Fv片段、單鏈Fv片段(scFv)、雙功能抗體、域抗體及其組合。域抗體可為單域抗體、單一可變域抗體或僅具有一個可變域(其可為重鏈可變域或輕鏈可變域)之免疫球蛋白單一可變域，該免疫球蛋白單一可變域獨立於其它可變區或域特異性地結合抗原或抗原決定基。術語「抗體」亦包括諸如嵌合、單鏈及人類化抗體之實施例。
典型全抗體包含藉由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)。重鏈恆定區包含三個域：CH1、CH2及CH3。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域係稱作α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)及μ (IgM)。各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區僅包含一個域：CL。輕鏈經分類為κ (kappa)或λ (lambda)。該等VH及VL區可進一步再分成具有高變異性之區(稱作互補決定區(CDR))，散佈有更保守之區(稱作構架區(FW))。各VH及VL由自胺基端至羧基端依以下次序經安排之三個CDR及四個FW構成：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域(互補位)。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統的多種細胞(諸如效應子細胞)及作為補體系統之組分的C1q。
在某些實施例中，包括於本文所述之ADC中之抗HER2雙互補位抗體包含兩種抗原結合多肽構築體，其中每一者結合於HER2之不同抗原決定基。如本文所用，「抗原結合多肽構築體」可為基於免疫球蛋白之構築體，例如抗體片段，或其可為非基於免疫球蛋白之抗體模擬物形式，諸如anticalin、fynomer、affimer、alphabody、DARPin或avimer。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體可為基於免疫球蛋白之構築體。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體可為抗體片段。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體可各自獨立地為Fab片段、Fab′片段、scFv或sdAb。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體可各自獨立地為Fab片段或scFv。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之一抗原結合多肽構築體可為Fab片段且另一抗原結合多肽構築體可為scFv。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體中的至少一者可為Fab片段或Fab′片段。「Fab片段」含有輕鏈之恆定域(CL)及重鏈之第一恆定域(CH1)，連同輕鏈及重鏈之可變域(分別為VL及VH)。Fab′片段與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH1域之C端處添加數個胺基酸殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab片段亦可為單鏈Fab分子，亦即其中Fab輕鏈及Fab重鏈藉由肽連接體連接以形成單一肽鏈之Fab分子。例如，在單鏈Fab分子中，Fab輕鏈之C端可連接至Fab重鏈之N端。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體中的至少一者可為單鏈Fv (scFv)。「scFv」包括呈單一多肽鏈之抗體重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。scFv可視情況進一步包含在VH與VL域之間之多肽連接體，其使得scFv能夠形成抗原結合所需之結構。例如，scFv可包括藉由多肽連接體自C端連接至VH之N端的VL。或者，scFv可包含藉由多肽鏈或連接體經由C端連接至VL之N端的VH (參見PluckthunThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁(1994)中之回顧)。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體中的至少一者可呈單域抗體(sdAb)形式。sdAb形式係指單一免疫球蛋白域。sdAb可例如具有駱駝科動物起源。駱駝科動物抗體缺乏輕鏈且其抗原結合位點由稱作「VHH」之單域組成。sdAb包含形成抗原結合位點之三個CDR/高變環：CDR1、CDR2及CDR3。sdAb相當穩定且容易表現為例如具有抗體Fc鏈之融合物(參見例如Harmsen及De Haard, Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007))。抗體形式
用於包括於本文所述之ADC中之抗HER2雙互補位抗體可具有多種形式。該抗HER2雙互補位抗體之最低限度組分為結合於第一HER2抗原決定基之第一抗原結合多肽構築體及結合於第二HER2抗原決定基之第二抗原結合多肽構築體，該第一及該第二HER2抗原決定基為不同的。包含結合於不同HER2抗原決定基之兩種抗原結合多肽構築體的抗體可被視為二價、雙互補位抗體。某些實施例係關於二價、抗HER2雙互補位抗體。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含一或多種額外抗原結合多肽構築體，其中每一者結合於第一或第二HER2抗原決定基。例如，在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可為三價或四價。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體進一步包含連接第一及第二抗原結合多肽構築體之連接體。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體進一步包含骨架且第一及第二抗原結合多肽構築體可操作性連接至該骨架。如本文所用，術語「可操作性連接」意謂所描述之組分呈允許其以其預期方式起作用之關係。
該等抗HER2雙互補位抗體因此可被視為具有包括兩個抗原結合多肽構築體模塊且視情況包括連接體模塊及骨架模塊中之一或兩者的模塊架構。熟習此項技術者應理解，此等模塊可以多種方式組合以提供具有不同形式之抗HER2雙互補位抗體。此等形式一般地基於此項技術中已知之抗體形式(參見例如Brinkmann及Kontermann, MABS, 9(2):182-212 (2017)，及Müller及Kontermann, 「Bispecific Antibodies 」Handbook of Therapeutic Antibodies , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)中之回顧)。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體包含可操作性連接至骨架之兩種抗原結合多肽構築體。合適骨架描述於下文中。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體包含可操作性連接至骨架之兩種抗原結合多肽構築體，且該等抗原結合多肽構築體中之至少一者為scFv。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體包含可操作性連接至骨架之兩種抗原結合多肽構築體，且該等抗原結合多肽構築體中之至少一者為Fab。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含三種或四種抗原結合多肽構築體，及骨架。以此形式，至少第一及第二抗原結合構築體可操作性連接至骨架。第三及視情況選用之第四抗原結合多肽構築體可各自獨立地可操作性連接至骨架，或連接至第一抗原結合多肽構築體，或連接至第二抗原結合多肽構築體。
缺乏骨架之抗HER2雙互補位抗體典型地包含藉由一或多個連接體可操作性連接之兩種抗原結合多肽構築體。該等抗原結合多肽構築體可呈scFv、Fab、sdAb或其組合之形式。例如，使用scFv作為抗原結合多肽構築體時，可構建諸如串聯scFv ((scFv)2 或taFv)之形式，其中scFv藉由柔性連接體連接在一起。scFv亦可用於構建雙功能抗體形式，該等雙功能抗體形式包含藉由短連接體(通常約5個胺基酸長度)連接之兩個scFv。該連接體之受限長度導致該等scFv以頭尾相接方式二聚化。在任何前述形式中，該等scFv可藉由包括域間二硫鍵而進一步穩定化。例如，二硫鍵可經由在各鏈中引入額外半胱胺酸殘基而經引入於VL與VH之間(例如，在VH中之位置44及VL中之位置100處) (參見例如Fitzgerald等人, Protein Engineering, 10:1221-1225 (1997))，或二硫鍵可經引入於兩個VH之間以提供具有DART形式之構築體(參見例如Johnson等人, J Mol. Biol., 399:436-449 (2010))。
同樣，包含經由合適連接體連接在一起之兩個sdAb (諸如VH或VHH)之形式可用於一些實施例中。
缺乏骨架之抗HER2雙互補位抗體形式的其他實例包括基於Fab片段之彼等形式(例如Fab2 及F(ab’)2 形式)，其中Fab片段經由連接體或IgG鉸鏈區連接。
亦可使用不同形式之抗原結合多肽構築體之組合以產生替代無骨架形式。例如，scFv或sdAb可融合至Fab片段之輕鏈及重鏈中的任一者或兩者之C端，從而產生二價(Fab-scFv/sdAb)構築體。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含兩種抗原結合多肽構築體及一或多個連接體，且不包括骨架。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體包含兩種抗原結合多肽構築體及一或多個連接體，且不包括骨架，該兩種抗原結合多肽構築體為scFv、Fab、sdAb或其組合。骨架
包含骨架之抗HER2雙互補位抗體可藉由連接該兩種抗原結合多肽構築體至合適骨架而經構建。該等抗原結合多肽構築體可呈上述形式(例如，scFv、Fab及/或sdAb)之一，或其組合。合適骨架之實例更詳細地描述於下文中且包括但不限於免疫球蛋白Fc區、白蛋白、白蛋白類似物及衍生物、雜二聚肽(諸如白胺酸拉鍊、源於Jun及Fos之雜二聚體形成性「拉鍊」肽、IgG CH1及CL域或barnase-barstar毒素)、細胞因子、趨化因子或生長因子。其他實例包括基於由IBC Pharmaceuticals, Inc.及Immunomedics, Inc.開發之DOCK-AND-LOCKTM (DNLTM )技術的抗體(參見例如Chang等人, Clin Cancer Res 13:5586s-5591s (2007))。
在一些實施例中，該等抗HER2雙互補位抗體包含兩種或兩種以上抗原結合多肽構築體，及骨架。在一些實施例中，該等抗HER2雙互補位抗體包含可操作性連接至骨架之兩種抗原結合多肽構築體。
骨架可為肽、多肽、聚合物、奈米粒子或其他化學實體。在骨架為多肽之情況下，該抗HER2雙互補位抗體之各抗原結合多肽構築體可連接至多肽骨架之N或C端。某些實施例亦預期包含多肽骨架之抗HER2雙互補位抗體，其中該等抗原結合多肽構築體中之一或多者例如經由具有或不具有連接體之胺基酸的側鏈連接至非N或C端之區。
在其中骨架為肽或多肽之實施例中，該等抗原結合多肽構築體可藉由基因融合或化學結合連接至骨架。典型地，當骨架為肽或多肽時，該等抗原結合多肽構築體藉由基因融合連接至骨架。在其中骨架為聚合物或奈米粒子之一些實施例中，該等抗原結合多肽構築體可藉由化學結合連接至骨架。
此項技術中已知多種蛋白質域，其包含兩種不同多肽之選擇性對且可用於形成骨架。實例為選擇性配對在一起之白胺酸拉鍊域，諸如Fos及Jun (Kostelny等人, J Immunol, 148:1547-53 (1992)；Wranik等人, J. Biol. Chem., 287: 43331-43339 (2012))。其他選擇性配對分子對包括例如barnase barstar對(Deyev等人, Nat Biotechnol, 21:1486-1492 (2003))、DNA鏈對(Chaudri等人, FEBS Letters, 450(1–2):23-26 (1999))及分裂螢光蛋白對(國際專利申請公開案第WO 2011/135040號)。
蛋白質骨架之其他實例包括免疫球蛋白Fc區、白蛋白、白蛋白類似物及衍生物、毒素、細胞因子、趨化因子及生長因子。與抗原結合部分組合之蛋白質骨架之用途已加以描述(參見例如Müller等人, J Biol Chem, 282:12650-12660 (2007)；McDonaugh等人, Mol Cancer Ther, 11:582-593 (2012)；Vallera等人, Clin Cancer Res, 11:3879-3888 (2005)；Song等人, Biotech Appl Biochem, 45:147-154 (2006)，及美國專利申請公開案第2009/0285816號)。
例如，使諸如scFv、雙功能抗體或單鏈雙功能抗體之抗原結合部分融合至白蛋白已顯示出改良該等抗原結合部分之血清半衰期(Müller等人, 如上)。抗原結合部分可視情況經由連接體融合於白蛋白之N及/或C端。
已描述呈雜多聚體形式之白蛋白衍生物，其包含藉由白蛋白之區段化獲得的兩種轉運體多肽，以致該等轉運體多肽自組裝以形成準原生白蛋白(參見國際專利申請公開案第WO 2012/116453號及第WO 2014/012082號)。由於白蛋白之區段化，該雜多聚體包括四個末端且因此可視情況經由連接體融合於多達四種不同抗原結合部分。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含蛋白質骨架。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於免疫球蛋白Fc區、白蛋白或白蛋白類似物或衍生物之蛋白質骨架。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於免疫球蛋白Fc區(例如，IgG Fc區)之蛋白質骨架。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於白蛋白(例如，人類血清白蛋白(HSA))或白蛋白類似物或衍生物之蛋白質骨架。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於如國際專利申請公開案第WO 2012/116453號或第WO 2014/012082號所述之白蛋白衍生物之蛋白質骨架。Fc 區
如本文所用，術語「Fc區」、「Fc」或「Fc域」係指免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異體Fc區。除非本文中另外規定，否則該Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，該系統亦稱為EU指數，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)中所述。
在某些實施例中，該等抗HER2雙互補位抗體可包含基於免疫球蛋白Fc區之骨架。在一些實施例中，該Fc區可為二聚的且由兩種Fc多肽構成。在一些實施例中，該Fc區可由單一多肽構成。
二聚體Fc之「Fc多肽」係指形成二聚體Fc域之兩種多肽之一，亦即包含免疫球蛋白重鏈之一或多個C端恆定區、能夠穩定自締合的多肽。術語「第一Fc多肽」及「第二Fc多肽」可互換地使用，其限制條件在於該Fc區包含一第一Fc多肽及一第二Fc多肽。
Fc區包含CH3域，或CH3及CH2域。例如，二聚體IgG Fc區之Fc多肽包含IgG CH2及IgG CH3恆定域序列。該CH3域包含兩個CH3序列，分別來自二聚體Fc區之兩種Fc多肽中之每一者。該CH2域包含兩個CH2序列，分別來自二聚體Fc區之兩種Fc多肽中之每一者。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於IgG Fc區之骨架。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於人類Fc區之骨架。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於人類IgG Fc區(例如，人類IgG1 Fc區)之骨架。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於IgG Fc區之骨架，該IgG Fc區為雜二聚體Fc區，包含第一Fc多肽及第二Fc多肽，各多肽包含CH3序列及視情況存在之CH2序列。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於包含第一及第二Fc多肽之Fc區之骨架，且第一抗原結合多肽構築體可操作性連接至第一Fc多肽且第二抗原結合多肽構築體可操作性連接至第二Fc多肽。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於包含第一及第二Fc多肽之Fc區之骨架，其中第一抗原結合多肽構築體可操作性連接至第一Fc多肽且第二抗原結合多肽構築體可操作性連接至第二Fc多肽，且其中第一及第二抗原結合多肽構築體獨立地為Fab片段或scFv。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於包含兩個CH3序列之Fc區之骨架，該兩個CH3序列中的至少一者包含一或多種胺基酸修飾。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於包含兩個CH3序列及兩個CH2序列之Fc區之骨架，該等CH2序列中的至少一者包含一或多種胺基酸修飾。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體包含包括經修飾CH3域之雜二聚體Fc區，其中該經修飾CH3域為非對稱修飾CH3域。一般而言，該雜二聚體Fc之第一Fc多肽包含第一CH3序列且第二Fc多肽包含第二CH3序列。
如本文所用，「非對稱胺基酸修飾」係指如下修飾，其中第一CH3序列上之特定位置處的胺基酸不同於第二CH3序列上相同位置處之胺基酸。關於包含非對稱胺基酸修飾之CH3序列，第一及第二CH3序列將典型地優先配對以形成雜二聚體，而非均二聚體。此等非對稱胺基酸修飾可為各序列上之相同各別胺基酸位置處之兩種胺基酸中僅一者具有修飾或各序列上在第一及第二CH3序列中之每一者上的相同各別位置處之兩種胺基酸具有不同修飾之結果。雜二聚體Fc之第一及第二CH3序列中之每一者可包含一種或超過一種非對稱胺基酸修飾。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含基於如國際專利申請公開案第WO 2012/058768號或第WO 2013/063702號所述之經修飾Fc區之骨架。
表1提供人類IgG1 Fc序列之胺基酸序列(SEQ ID NO:1)，對應於全長人類IgG1重鏈之胺基酸231至447。該CH3序列包含全長人類IgG1重鏈之胺基酸341-447。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含包括經修飾CH3域之雜二聚體Fc骨架，該經修飾CH3域包含促進形成雜二聚體Fc而非均二聚體Fc之非對稱胺基酸修飾。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含雜二聚體Fc骨架，該骨架包括在以下位置中之一或多者處之修飾：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400及/或N390，使用EU編號。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含包括經修飾CH3域之雜二聚體Fc，該經修飾CH3域具有在位置F405及Y407處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置L351處包含胺基酸修飾之第一多肽序列，及在位置T366及T394處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置K392處包含胺基酸修飾之第二多肽序列。在一些實施例中，該經修飾CH3域之第一多肽序列可在位置F405及Y407處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置L351處包含胺基酸修飾，且該經修飾CH3域之第二多肽序列在位置T366及T394處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置K392處包含胺基酸修飾，且在位置F405處之胺基酸修飾為F405A、F405I、F405M、F405S、F405T或F405V；在位置Y407處之胺基酸修飾為Y407I或Y407V；在位置T366處之胺基酸修飾為T366I、T366L或T366M；在位置T394處之胺基酸修飾為T394W；在位置L351處之胺基酸修飾為L351Y，且在位置K392處之胺基酸修飾為K392F、K392L或K392M。在一些實施例中，在位置F405處之胺基酸修飾為F405A、F405S、F405T或F405V。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含包括經修飾CH3域之雜二聚體Fc，該經修飾CH3域具有在位置F405及Y407處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置L351處包含胺基酸修飾之第一Fc多肽序列，及在位置T366及T394處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置K392處包含胺基酸修飾之第二Fc多肽序列，且在位置F405處之胺基酸修飾為F405A、F405I、F405M、F405S、F405T或F405V；在位置Y407處之胺基酸修飾為Y407I或Y407V；在位置T366處之胺基酸修飾為T366I、T366L或T366M；在位置T394處之胺基酸修飾為T394W；在位置L351處之胺基酸修飾為L351Y，且在位置K392處之胺基酸修飾為K392F、K392L或K392M，且第一及第二Fc多肽序列中之一者或兩者進一步包含胺基酸修飾T350V。在一些實施例中，在位置F405處之胺基酸修飾為F405A、F405S、F405T或F405V。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含包括如上文所述之經修飾CH3域之雜二聚體Fc，其中第一Fc多肽序列在位置F405及Y407處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置L351處包含胺基酸修飾，且第二Fc多肽序列在位置T366及T394處包含胺基酸修飾且視情況進一步在位置K392處包含胺基酸修飾，且其中第一Fc多肽序列進一步在位置S400或Q347中之一者或兩者處包含胺基酸修飾及/或第二Fc多肽序列進一步在位置K360或N390中之一者或兩者處包含胺基酸修飾，其中在位置S400處之胺基酸修飾為S400E、S400D、S400R或S400K；在位置Q347處之胺基酸修飾為Q347R、Q347E或Q347K；在位置K360處之胺基酸修飾為K360D或K360E，且在位置N390處之胺基酸修飾為N390R、N390K或N390D。在一些實施例中，在位置F405處之胺基酸修飾為F405A、F405S、F405T或F405V。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含具有經修飾CH3域之雜二聚體Fc骨架，該經修飾CH3域包含變異體1、變異體2、變異體3、變異體4或變異體5中任一者之修飾，如表1所示。表 1 ： IgG1 Fc 序列
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含具有經修飾CH3域之雜二聚體Fc骨架，該經修飾CH3域具有包含選自L351Y、F405A及Y407V的一或多種胺基酸修飾之第一CH3序列，及包含胺基酸修飾T366L或T366I、K392L或K392M及T394W之第二CH3序列，且第一及第二CH3序列中之一者或兩者可視情況進一步包含胺基酸修飾T350V。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含具有經修飾CH3域之雜二聚體Fc骨架，該經修飾CH3域包含如上文所述之非對稱胺基酸修飾，該等非對稱胺基酸修飾促進形成其中雜二聚體CH3域具有可與野生型均二聚體CH3域相當的穩定性之雜二聚體Fc。該CH3域之穩定性可藉由例如藉由差示掃描熱量測定(DSC)來量測該CH3域之熔融溫度(Tm)來評估。在一些實施例中，該一或多種非對稱胺基酸修飾促進形成如下雜二聚體Fc域，其中該CH3域具有如在差示掃描熱量測定研究中經由熔融溫度(Tm)所觀察之穩定性，該熔融溫度(Tm)在關於相應對稱野生型均二聚體CH3域所觀察之熔融溫度的約8℃內，例如約7℃、約6℃、約5℃或約4℃內。
如與表現產物中之均二聚體Fc相比，可形成具有至少約75%純度之包含經修飾CH3序列之雜二聚體Fc。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含具有經修飾CH3域之雜二聚體Fc骨架，該經修飾CH3域包含促進形成具有大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%或大於約97%之純度的雜二聚體Fc之非對稱胺基酸修飾。
用於修飾單體Fc多肽以促進雜二聚體Fc形成之額外方法為此項技術中已知的且包括例如描述於國際專利申請公開案第WO 96/027011號(杵臼)；Gunasekaran等人 J Biol Chem, 285, 19637-46 (2010) (靜電設計以實現選擇性雜二聚化)；Davis等人, Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (2010) (鏈交換工程改造域(SEED)技術)，及Labrijn等人, Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (2013) (Fab-臂交換)中之彼等方法。
在其中該抗HER2雙互補位抗體包含雜二聚體Fc骨架之一些實施例中，該雜二聚體Fc亦包含CH2域。在一些實施例中，該CH2域為經修飾CH2域。Fc之CH2域的一實例為表1所示之序列之胺基酸231-340。數種效應子功能藉由Fc受體(FcR)介導，該等Fc受體結合於抗體之Fc。
Fc受體(FcR)包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，包括此等受體之等位基因變異體及替代剪接形式。術語FcR亦可在某些實施例中包括新生兒受體FcRn。
CH2域中之修飾可影響FcR與Fc之結合。此項技術中已知Fc中用於選擇性地改變Fc對不同Fcγ受體之親和力之多種胺基酸修飾。在其中該抗HER2雙互補位抗體包含具有經修飾CH2域之雜二聚體Fc骨架之一些實施例中，該經修飾CH2域可包含一或多種修飾以促進Fcγ受體之選擇性結合。
改變FcR對Fc之結合之修飾的非限制性實例包括S298A/E333A/K334A及S298A/E333A/K334A/K326A (Lu等人, J Immunol Methods, 365(1-2):132-41 (2011))；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L及F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen等人, Cancer Res, 67(18):8882-90 (2007)及Nordstrom JL等人, Breast Cancer Res, 13(6):R123 (2011))；F243L (Stewart等人, Protein Eng Des Sel. 24(9):671-8 (2011))；S298A/E333A/K334A (Shields等人, J Biol Chem, 276(9):6591-604 (2001))；S239D/I332E/A330L及S239D/I332E (Lazar等人, Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005-10 (2006))；S239D/S267E及S267E/L328F (Chu等人, Mol Immunol, 45(15):3926-33 (2008))。影響FcR對Fc之結合之額外修飾描述於Therapeutic Antibody Engineering (Strohl及Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine第11期, ISBN 1 907568 37 9, 2012年10月, 第283頁)中。包含影響FcR之結合之非對稱修飾的Fc區描述於國際專利公開案第WO 2014/190441號中。
可對Fc區進行額外修飾以改良其介導效應子功能之能力。該等修飾為此項技術中已知的且包括無海藻糖基化，或工程改造Fc針對活化受體(關於ADCC，主要為FcγRIIIa，且關於CDC，針對C1q)之親和力。在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含經修飾以改良介導效應子功能之能力的Fc區。
產生在Fc糖基化位點(Asn 297，EU編號)上具有極少或不具有海藻糖而未改變胺基酸序列之抗體之方法為此項技術中熟知的。例如，GlymaX®技術(ProBioGen AG) (參見von Horsten等人, Glycobiology, 20(12):1607-18 (2010)及美國專利第8,409,572號)。在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含無糖基化Fc區。在此背景中，該抗HER2雙互補位抗體可完全地無海藻糖基化(亦即，不含可偵測海藻糖)或部分地無海藻糖基化，以致該抗HER2雙互補位抗體含有關於由哺乳動物表現系統產生之相似構築體通常所偵測之海藻糖之量的少於95%、少於85%、少於75%、少於65%、少於55%、少於45%、少於35%、少於25%、少於15%或少於5%或其間任何量。
降低FcγR及/或補體結合及/或效應子功能之Fc修飾為此項技術中已知的且包括上文所述之彼等修飾。多個公開案描述了已用於工程改造具有降低或沉默之效應子活性之抗體的策略(參見例如Strohl, Curr Opin Biotech 20:685-691 (2009)，及Strohl及Strohl, 「Antibody Fc engineering for optimal antibody performance 」Therapeutic Antibody Engineering , Cambridge: Woodhead Publishing (2012), 第225-249頁)。此等策略包括經由糖基化、使用IgG2/IgG4骨架或在Fc之鉸鏈或CH2區中引入突變之修飾降低效應子功能(亦參見美國專利公開案第2011/0212087號、國際專利公開案第WO 2006/105338號、美國專利公開案第2012/0225058號、美國專利公開案第2012/0251531號及Strop等人, J. Mol. Biol. 420: 204-219 (2012))。
降低與Fc之FcγR或補體結合之已知胺基酸修飾的特定、非限制性實例包括表2中鑑別之彼等修飾。表 2 ：降低與 Fc 之 Fc γR 或補體結合之修飾
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含包括經修飾CH2域之Fc區，該經修飾CH2域具有表2中鑑別之一或多種突變。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含包括經修飾CH2域之Fc區，該經修飾CH2域具有在位置L234、L235及/或D265處之胺基酸修飾。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體可包含包括經修飾CH2域之Fc區，該經修飾CH2域具有胺基酸修飾L234A、L235A及D265S。HER2 抗原決定基
該抗HER2雙互補位抗體所包含之兩種抗原結合多肽構築體各自結合於HER2之不同抗原決定基，亦即第一抗原結合多肽構築體結合於第一HER2抗原決定基且第二抗原結合多肽構築體結合於第二HER2抗原決定基。在本發明之背景中，該等抗原結合多肽構築體各自特異性地結合於其標靶抗原決定基。
「特異性地結合」或「特異性結合」意謂該結合對抗原具選擇性且可與不需要或非特異性相互作用相區別。抗原結合多肽構築體結合於特定抗原決定基之能力可例如經由酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、表面電漿共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上進行分析) (Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))或傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))來量測。在一些實施例中，如例如藉由SPR所量測，當該抗原結合多肽構築體與無關蛋白質結合之程度小於該抗原結合多肽構築體與其標靶抗原決定基之結合的約10%時，該抗原結合多肽構築體被視為特異性地結合於其標靶抗原決定基。
「HER2」 (亦稱作ErbB2)係指描述於例如Semba等人, PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985)及Yamamoto等人, Nature, 319:230-234 (1986)中之人類HER2蛋白(GenBank寄存編號X03363)。術語「erbB2」及「neu」係指編碼人類HER2蛋白之基因。術語p185或p185neu亦可用於指neu基因之蛋白質產物。
HER2包含典型地結合HER配位體之細胞外域、親脂性跨膜域、保守細胞內酪胺酸激酶域及具有可磷酸化之數個酪胺酸殘基之羧基端信號傳導域。HER2之細胞外(ecto)域包含四個域，即域I-IV。HER2之序列提供於表3中(SEQ ID NO:2)。細胞外域(ECD)邊界為：域I-大約胺基酸1-165；域II-大約胺基酸166-322；域III-大約胺基酸323-488，及域IV-大約胺基酸489-607。表 3 ： 人類 HER2 之胺基酸序列 (SEQ ID NO:2)
「抗原決定基2C4」為HER2之細胞外域中與抗體2C4結合之區且包含來自HER2之細胞外域中的域II (亦稱作ECD2)之殘基。2C4及帕妥珠單抗在域I、II及III之接合點處結合於HER2之細胞外域(Franklin等人Cancer Cell 5:317-328 (2004))。
「抗原決定基4D5」為HER2之細胞外域中與抗體4D5 (ATCC CRL 10463)及曲妥珠單抗結合之區。此抗原決定基接近HER2之跨膜域，且在HER2之域IV (亦稱作ECD4)內。
一般而言，本發明之抗HER2雙互補位抗體將結合於HER2之細胞外域內的抗原決定基。在一些實施例中，由該抗HER2雙互補位抗體之第一及第二抗原結合多肽構築體結合之第一及第二HER2抗原決定基為非重疊抗原決定基。在一些實施例中，由該抗HER2雙互補位抗體之第一及第二抗原結合多肽構築體結合之第一及第二HER2抗原決定基係在HER2之不同細胞外域上。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之第一抗原結合多肽構築體結合於HER2之第一域上的第一HER2抗原決定基，且第二抗原結合多肽構築體結合於HER2之第二域上的第二HER2抗原決定基。在一些實施例中，HER2之第一域為ECD2且HER2之第二域為ECD4。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一與曲妥珠單抗競爭結合於HER2。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一與帕妥珠單抗競爭結合於HER2。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一與曲妥珠單抗競爭結合於HER2，且另一抗原結合多肽構築體與帕妥珠單抗競爭結合於HER2。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一係呈Fab或scFv形式且與曲妥珠單抗競爭結合於HER2，且另一抗原結合多肽構築體係呈Fab或scFv形式且與帕妥珠單抗競爭結合於HER2。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一係呈Fab形式且與曲妥珠單抗競爭結合於HER2，且另一抗原結合多肽構築體係呈scFv形式且與帕妥珠單抗競爭結合於HER2。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一結合於HER2上與曲妥珠單抗相同之抗原決定基。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一結合於HER2上與帕妥珠單抗相同之抗原決定基。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一結合於HER2上與曲妥珠單抗相同之抗原決定基，且另一抗原結合多肽構築體結合於HER2上與帕妥珠單抗相同之抗原決定基。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體所包含之抗原結合多肽構築體之一包含曲妥珠單抗或其包含已知增加HER2結合的一或多種突變之變異體之CDR序列，且另一抗原結合多肽構築體包含帕妥珠單抗或其包含已知增加HER2結合的一或多種突變之變異體之CDR。已知增強曲妥珠單抗或帕妥珠單抗之HER2結合的文獻突變包括列於下表4及5中之彼等突變(HC =重鏈；LC =輕鏈)。亦預期此等突變之組合。表 4 ：增加與 HER2 之結合之曲妥珠單抗突變 表 5 ： 增加與 HER2 之結合之帕妥珠單抗突變
多種抗HER2雙互補位抗體為此項技術中已知的且可為用於包括於本文所述之ADC中之合適候選抗體。實例包括描述於美國專利申請公開案第2014/0170148號；第2015/0284463號；第2016/0289335號；第2017/0029529號；第2017/0291955號及第2018/0022820號，及國際專利申請公開案第WO 2016/179707號中之抗體。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體為描述於美國專利申請公開案第2016/0289335號中之雙互補位抗體之一。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體為v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一(參見表6、6A及6B，及序列表)。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2結合臂之VH序列及VL序列。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2結合臂之VH序列及VL序列，且另一抗原結合多肽構築體包含來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4結合臂之VH序列及VL序列。
在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2結合臂之CDR序列。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2結合臂之CDR序列，且另一抗原結合多肽構築體包含來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4結合臂之CDR序列。
熟習此項技術者應理解，有限數目之胺基酸取代可經引入至已知抗體之CDR序列中或VH或VL序列，而未使該抗體喪失其結合其標靶之能力。候選胺基酸取代可藉由電腦模型化或藉由此項技術中已知之技術(諸如丙胺酸掃描)來鑑別，所得變異體藉由標準技術測試結合活性。因此，在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2結合臂之CDR集合具有90%或90%以上、95%或95%以上、98%或98%以上、99%或99%以上或100%序列一致性的CDR集合(亦即，重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3)，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD2之能力。在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含此等CDR序列的變異體，在該六個CDR之間包含1個與10個之間胺基酸取代(亦即，該等CDR可藉由包括多達10個胺基酸取代而經修飾，其中CDR之任何組合均經修飾)，例如在該等CDR之間包含1個與7個之間胺基酸取代、1個與5個之間胺基酸取代、1個與4個之間胺基酸取代、1個與3個之間胺基酸取代、1個與2個之間胺基酸取代或1個胺基酸取代，其中該變異體保持結合ECD2之能力。典型地，該等胺基酸取代將為保守胺基酸取代。在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v10000的ECD2結合臂之CDR集合具有90%或90%以上、95%或95%以上、98%或98%以上、99%或99%以上或100%序列一致性之CDR集合(亦即，重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3)，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD2之能力。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2結合臂之VH序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VH序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD2之能力。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2結合臂之VL序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VL序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD2之能力。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v10000的ECD2結合臂之VH序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VH序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD2之能力。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v10000的ECD2結合臂之VL序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VL序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD2之能力。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4結合臂之CDR集合具有90%或90%以上、95%或95%以上、98%或98%以上、99%或99%以上或100%序列一致性的CDR集合(亦即，重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3)，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD4之能力。在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含此等CDR序列的變異體，在該六個CDR之間包含1個與10個之間胺基酸取代(亦即，該等CDR可藉由包括多達10個胺基酸取代而經修飾，其中CDR之任何組合均經修飾)，例如在該等CDR之間包含1個與7個之間胺基酸取代、1個與5個之間胺基酸取代、1個與4個之間胺基酸取代、1個與3個之間胺基酸取代、1個與2個之間胺基酸取代或1個胺基酸取代，其中該變異體保持結合ECD4之能力。典型地，該等胺基酸取代將為保守胺基酸取代。在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v10000的ECD4結合臂之CDR集合具有90%或90%以上、95%或95%以上、98%或98%以上、99%或99%以上或100%序列一致性之CDR集合(亦即，重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3)，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD4之能力。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4結合臂之VH序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VH序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD4之能力。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4結合臂之VL序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VL序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD4之能力。
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v10000的ECD4結合臂之VH序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VH序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD4之能力。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含與來自v10000的ECD4結合臂之VL序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之VL序列，其中該抗原結合多肽構築體保持結合ECD4之能力。表 6 ：例示性抗 HER2 雙互補位抗體 * 根據Kabat之Fab或可變域編號(Kabat等人, Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, US Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號, 第647頁, 1991)§ 根據EU指數之CH3編號，如在Kabat中(Edelman等人, 1969, PNAS USA, 63:78-85)表 6A ： 變異體 v5019 、 v5020 、 v7091 、 v10000 、 v6902 、 v6903 及 v6717 之 ECD2 結合臂之 CDR 序列 表 6B ： 變異體 v5019 、 v5020 、 v7091 、 v10000 、 v6902 、 v6903 及 v6717 之 ECD4 結合臂之 CDR 序列
在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體為描述於國際專利申請公開案第WO 2016/179707號中之雙互補位抗體之一。此申請案描述了抗HER2抗體帕妥珠單抗之高親和力變異體，包括包含來自高親和力變異體之序列作為一抗原結合域之雙互補位抗體。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體為v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085之一(參見表7及7A，及序列表)。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085之一的ECD2結合臂之VH序列及VL序列。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085之一的ECD2結合臂之CDR序列。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085之一的ECD2結合臂之VH序列及VL序列，且另一抗原結合多肽構築體包含來自曲妥珠單抗之VH序列及VL序列。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體之抗原結合多肽構築體之一包含來自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085之一的ECD2結合臂之CDR序列，且另一抗原結合多肽構築體包含來自曲妥珠單抗之CDR序列。表 7 ：額外例示性抗 HER2 雙互補位抗體 * 根據Kabat之Fab或可變域編號(Kabat等人, Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, US Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號, 第647頁, 1991)§ 根據EU指數之CH3編號，如在Kabat中(Edelman等人, 1969, PNAS USA, 63:78-85)表 7A ： 變異體 v7133 、 v15079 、 v15080 、 v15081 、 v15082 、 v15083 、 v15084 及 v15085 之 ECD2 結合臂之 CDR 序列 抗 HER2 雙互補位抗體之特性
在低DAR下毒素之結合尤其有利於抗HER2雙互補位抗體，與相應二價單特異性抗體相比，該等抗體顯示增加的與HER2之結合及/或較高程度內化至HER2表現細胞中。相應二價單特異性抗體可包含兩種由該雙互補位抗體包含之第一抗原結合多肽構築體，或兩種第二抗原結合多肽構築體。
在某些實施例中，與相應二價單特異性抗體相比，該等抗HER2雙互補位抗體顯示增加的與HER2之結合(亦即，以較高親和力結合)。增加的結合可例如藉由解離常數之減少及/或最大結合之增加來顯示。
解離常數或(KD )係指特定配位體-蛋白質相互作用(諸如抗體-抗原相互作用)之平衡解離常數。KD 量度了兩種蛋白質(例如，AB)可逆地解離成較小組分(A+B)之傾向，且係定義為解離速率(亦稱作「解離速率(off-rate)」或k解離 )與締合速率(亦稱作「締合速率(on-rate)」或k締合 )之比率。因此，KD 等於k解離 /k締合 且經表述為莫耳濃度(M)。其遵循KD 愈小，結合之親和力愈強。針對抗體之KD 值可使用此項技術中充分確立之方法來測定。該等方法之實例包括表面電漿共振(SPR)，典型地使用諸如Biacore®系統之生物感測器系統；及等溫滴定量熱法(ITC)。
表觀KD 或表觀平衡解離常數表示觀察到版最大細胞結合時所處之抗體濃度。表觀KD 依賴於細胞結合實驗之條件，諸如在細胞上表現之不同受體水準及培育條件，且因此表觀KD 一般不同於自諸如SPR及ITC之無細胞分子實驗測定的KD 值。然而，不同方法之間一般存在良好一致。
最大結合(或「Bmax」)係指在抗體之飽和濃度下細胞上之最大抗體結合水準。此參數可以用於相對比較之任意單位MFI報告，或使用標準曲線轉化為對應於結合於細胞之抗體的數目之絕對值。
Bmax及表觀KD 可藉由多種技術來測定。一實例為藉由流式細胞術量測與標靶抗原表現細胞之結合。典型地，在該種實驗中，標靶抗原表現細胞用不同濃度之抗體培育，洗滌，用用於偵測抗體之第二試劑培育，洗滌，且在流式細胞儀中進行分析以量測表示細胞上之偵測信號的強度之中值螢光強度(MFI)，該中值螢光強度又與結合於細胞之抗體的數目相關。抗體濃度對MFI數據接著經擬合至飽和結合等式中以產生Bmax及表觀KD 。
在某些實施例中，如與相應參考抗體相比，該抗HER2雙互補位抗體對呈現HER2之標靶細胞呈現Bmax之增加。關於如本文所述之包含第一抗原結合多肽構築體及第二抗原結合多肽構築體之抗HER2雙互補位抗體，相應參考抗體將為包含兩種第一抗原結合多肽構築體或兩種第二抗原結合多肽構築體之二價單特異性抗體。在某些實施例中，針對抗HER2雙互補位抗體測定之Bmax為相應參考抗體之Bmax的至少約110%。在一些實施例中，針對抗HER2雙互補位抗體測定之Bmax為相應參考抗體之Bmax的至少約125%，例如相應參考抗體之Bmax的150%或相應參考抗體之Bmax的至少約200%。
在一些實施例中，針對抗HER2雙互補位抗體測定之Bmax為參考抗體之Bmax的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0倍。
在某些實施例中，該等抗HER2雙互補位抗體顯示與相應參考二價單特異性抗體相比較高程度內化至HER2表現細胞中。該等抗HER2雙互補位抗體經由結合於受體HER2內化至HER2+細胞中。該等抗HER2雙互補位抗體因此可被視為能夠誘導HER2+細胞中之受體內化。
抗體內化可使用此項技術中已知之方法，例如藉由直接內化方法根據詳述於Schmidt, M.等人, Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008)中之方案來量測。如此項技術中已知，癌細胞可以不同水準表現HER2。對HER2表現細胞分類之一方法係分類為HER2 1+、2+或3+ (分別為低、中等及高)。在某些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體在以3+水準表現HER2之細胞中顯示與相應參考二價單特異性抗體相比較高程度內化。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體在以2+水準表現HER2之細胞中顯示與相應參考二價單特異性抗體相比較高程度內化。在一些實施例中，該抗HER2雙互補位抗體在以1+水準表現HER2之細胞中顯示與相應參考二價單特異性抗體相比較高程度內化。表現不同水準之HER2之細胞株的實例更詳細地描述於下文中。
在本發明之背景下，當內化至HER2表現細胞中之抗HER2雙互補位抗體的量為內化至相同HER2表現細胞中之參考二價單特異性抗體的量之至少1.2倍大時，該抗HER2雙互補位抗體被視為證明了與相應參考二價單特異性抗體相比較高程度內化至HER2表現細胞中。在某些實施例中，內化抗體之量藉由直接內化方法根據詳述於Schmidt, M.等人, Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008)中之方案來測定。在一些實施例中，內化抗體之量在以2+水準表現HER2之HER2表現細胞中測定。
在一些實施例中，當內化至HER2表現細胞中之抗HER2雙互補位抗體的量為內化至相同HER2表現細胞中之參考二價單特異性抗體的量之至少1.3倍大時，該抗HER2雙互補位抗體被視為證明了與相應參考二價單特異性抗體相比較高程度內化至HER2表現細胞中。在一些實施例中，當內化至HER2表現細胞中之抗HER2雙互補位抗體的量為內化至相同HER2表現細胞中之參考二價單特異性抗體的量之至少1.4倍大，例如至少1.5倍大、1.6倍大、1.7倍大、1.8倍大、1.9倍大或2.0倍大時，該抗HER2雙互補位抗體被視為證明了與相應參考二價單特異性抗體相比較高程度內化至HER2表現細胞中。在某些實施例中，內化抗體之量藉由直接內化方法根據詳述於Schmidt, M.等人, Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008)中之方案來測定。在一些實施例中，內化抗體之量在以2+水準表現HER2之HER2表現細胞中測定。 澳瑞他汀類似物
本文所述之ADC包含基於澳瑞他汀之毒素(或「澳瑞他汀類似物」)。多種澳瑞他汀類似物為此項技術中已知的。實例包括但不限於單甲基澳瑞他汀F (MMAF)、單甲基澳瑞他汀E (MMAE)、澳瑞他汀EB (AEB)、澳瑞他汀EVB (AEVB)及澳瑞他汀F苯二胺(AFP)。多種澳瑞他汀類似物之合成及結構描述於美國專利第6,884,869號；第7,098,308號；第7,256,257號及第7,498,298號中。
在某些實施例中，包括於本文所述之ADC中之澳瑞他汀類似物可為如國際專利申請公開案第WO 2016/041082號中所述之澳瑞他汀類似物。在某些實施例中，包括於本文所述之ADC中之澳瑞他汀類似物為通式(I )之化合物： (I ) 其中： X為-C(O)NHCH(CH2 R2 )-，或X不存在； R1 係選自：及，且 R2 為苯基。
在某些實施例中，在通式(I )之化合物中，R1 係選自：及。
在某些實施例中，在通式(I )之化合物中，X不存在。
在某些實施例中，通式(I )之化合物具有通式(IV )： (IV ) 其中R1 如關於通式(I )所定義。
在某些實施例中，在式(IV )之化合物中，R1 係選自：及。
在某些實施例中，在式(IV )之化合物中，R1 為：或。
在某些實施例中，在式(IV )之化合物中，R1 為：。
在某些實施例中，通式(I )之化合物具有通式(V )： (V ) 其中R1 如關於通式(I )所定義。
在某些實施例中，在式(V )之化合物中，R1 係選自：及。
在某些實施例中，在式(V )之化合物中，R1 為：或。
在某些實施例中，在式(V )之化合物中，R1 為：。
通式(I )之化合物可藉由標準合成有機化學方案由市售起始材料製備。例示性方法提供於國際專利申請公開案第WO 2016/041082號中及下文實例部分中。
應理解，在本發明之剩餘部分中對通式(I )之化合物的提及在多個實施例中包括通式(IV )及(V )之化合物，其程度就如同個別地陳述此等式中每一者之實施例均特定地經陳述一般。
在某些實施例中，本發明之ADC包含經由連接體(L)結合於澳瑞他汀類似物(毒素)之抗HER2雙互補位抗體，其中連接體-毒素具有通式(II )： (II ) 其中： X為-C(O)NHCH(CH2 R2 )-，或X不存在； R1 係選自：及； R2 為苯基； L為連接體，且表示連接體-毒素與該抗HER2雙互補位抗體之附接點。
在一些實施例中，在通式(II )之連接體-毒素中，R1 係選自：及。
在一些實施例中，在通式(II )之連接體-毒素中，X不存在。
在一些實施例中，在通式(II )之連接體-毒素中，L為可裂解連接體。
在一些實施例中，在通式(II )之連接體-毒素中，L為含肽連接體。
在某些實施例中，通式(II )之連接體-毒素具有通式(X )： (X ) 其中R1 、L及如上文關於通式(II )所定義。
在一些實施例中，在通式(X )之連接體-毒素中，R1 係選自：及。
在一些實施例中，在通式(X )之連接體-毒素中，R1 為：或。
在一些實施例中，在式(X )之化合物中，R1 為：。
在一些實施例中，在通式(X )之連接體-毒素中，L為可裂解連接體。
在一些實施例中，在通式(X )之連接體-毒素中，L為含肽連接體。
在一些實施例中，在通式(X )之連接體-毒素中，L為蛋白酶可裂解連接體。
在某些實施例中，通式(II )之連接體-毒素具有通式(XI )： (XI ) 其中R1 、L及如上文關於通式(II )所定義。
在一些實施例中，在通式(XI )之連接體-毒素中，R1 係選自：及。
在一些實施例中，在通式(XI )之連接體-毒素中，R1 為：或。
在一些實施例中，在通式(XI )之連接體-毒素中，R1 為：。
在一些實施例中，在通式(XI )之連接體-毒素中，L為可裂解連接體。
在一些實施例中，在通式(XI )之連接體-毒素中，L為含肽連接體。
在一些實施例中，在通式(XI )之連接體-毒素中，L為蛋白酶可裂解連接體。
本文中亦預期包含結合於通式(II )、式(X )或式(XI )之連接體-毒素之抗HER2雙互補位抗體的ADC，其中該連接體具有如下文所示之通式(VIII )或(IX )。
在某些實施例中，該ADC包含具有如下結構之連接體-毒素：， 其中A-S-為與該抗HER2雙互補位抗體之附接點。
在某些實施例中，包含經由連接體(L)結合於澳瑞他汀類似物(毒素)之抗HER2雙互補位抗體的本發明之ADC具有通式(III )： (III) 其中X及R1 如關於通式(II )所定義； L為連接體； n為平均藥物:抗體比率(DAR)且小於3.9，且 Ab為抗HER2雙互補位抗體。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，R1 係選自：及。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，X不存在。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，R1 為：或，且 X不存在。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，R1 為：，且 X不存在。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，X為-C(O)NHCH(CH2 R2 )-
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，R1 為：或，且 X為-C(O)NHCH(CH2 R2 )-。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，R1 為：，且 X為-C(O)NHCH(CH2 R2 )-。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，L為可裂解連接體。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，L為含肽連接體。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，L為蛋白酶可裂解連接體。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，n在0.5與3.8之間。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，n在0.7與3.8之間、在0.7與3.5之間、在0.7與3.0之間或在0.7與2.5之間。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，n在1.0與3.8之間、在1.0與3.5之間、在1.0與3.0之間或在1.0與2.5之間。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，n在1.5與3.8之間、在1.5與3.5之間、在1.5與3.0之間或在1.5與2.5之間。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，n在1.6與3.8之間、在1.6與3.5之間、在1.6與3.0之間或在1.6與2.5之間。
在一些實施例中，在通式(III )之ADC中，n在1.8與2.8之間或在1.8與2.5之間。
亦預期針對通式(III )之化合物的前述實施例中任一者之組合且各組合出於本發明目的形成獨立實施例。 連接體
在本文所述之ADC中，該抗HER2雙互補位抗體藉由連接體連接至澳瑞他汀類似物(毒素)。連接體為能夠連接一或多個毒素分子至抗體之雙官能或多官能部分。連接體可為雙官能(或單價)，以致其連接單一藥物至抗體上之單一位點，或其可為多官能(或多價)，以致其連接超過一個毒素分子至抗體上之單一位點。能夠連接一毒素分子至抗體上之超過一個位點之連接體亦可被視為多官能。
連接體附接至抗體可以多種方式，諸如經由抗體上之表面離胺酸、還原性偶合至抗體上之經氧化碳水化合物或經由抗體上藉由還原鏈間二硫鍵釋放之半胱胺酸殘基實現。或者，連接體附接至抗體可藉由修飾抗體以包括額外半胱胺酸殘基(參見例如美國專利第7,521,541號；第8,455,622號及第9,000,130號)或提供反應性把手之非天然胺基酸，諸如硒代甲硫胺酸、對乙醯基苯丙胺酸、甲醯基甘胺酸或對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(參見例如Hofer等人, Biochemistry, 48:12047-12057 (2009)；Axup等人, PNAS, 109:16101-16106 (2012)；Wu等人, PNAS, 106:3000-3005 (2009)；Zimmerman等人, Bioconj. Chem., 25:351-361 (2014))，以允許位點特異性結合而實現。
連接體包括能夠與抗體上之一或多個標靶基團反應的官能基，及能夠與毒素上之標靶基團反應的一或多個官能基。合適官能基為此項技術中已知的且包括描述於例如Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press)中之彼等官能基。
用於與游離半胱胺酸或硫醇反應之官能基的非限制性實例包括順丁烯二醯亞胺、鹵代乙醯胺、鹵基乙醯基、經活化酯(諸如丁二醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酐、醯氯、磺醯氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。如Lyon等人, Nat. Biotechnol., 32:1059-1062 (2014)中所述之「自穩定」順丁烯二醯亞胺亦適用於本文。
用於與抗體上之表面離胺酸及毒素上之游離胺反應的官能基之非限制性實例包括經活化酯(諸如N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯、磺基-NHS酯)、醯亞胺酯(諸如Traut氏試劑)、異硫氰酸酯、醛及酸酐(諸如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA))。其他實例包括四氟硼酸丁二醯亞胺基-1,1,3,3-四-甲基金尿(TSTU)及六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻(PyBOP)。
能夠與抗體或毒素上之親電子基團(諸如醛或酮羰基)反應之官能基的非限制性實例包括醯肼、肟、胺基、肼、硫代半卡巴胂、肼羧酸酯及芳基醯肼。
其他連接體包括具有允許橋接抗體上之兩個鏈間半胱胺酸的官能基之彼等連接體，諸如ThioBridgeTM 連接體(Badescu等人, Bioconjug. Chem., 25:1124–1136 (2014))、二硫代順丁烯二醯亞胺(DTM)連接體(Behrens等人, Mol. Pharm., 12:3986–3998 (2015))、基於二硫芳基(TCEP)噠口井二酮之連接體(Lee等人, Chem. Sci., 7:799-802 (2016))、基於二溴噠口井二酮之連接體(Maruani等人, Nat. Commun., 6:6645 (2015))及此項技術中已知之其他連接體。
連接體可包含一或多種連接體組分。典型地，連接體將包含兩種或兩種以上連接體組分。例示性連接體組分包括用於與抗體反應之官能基、用於與毒素反應之官能基、延伸體、肽組分、自降解基團、自消除基團、親水性部分及其類似物。多種連接體組分為此項技術中已知的，其中一些描述於下文中。
某些適用連接體組分可獲自多個商業來源，諸如Pierce Biotechnology, Inc. (現為Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)及Molecular Biosciences Inc. (Boulder, Colo.)，或可根據此項技術中所述之程序合成(參見例如Toki等人, J. Org. Chem., 67:1866-1872 (2002)；Dubowchik等人, Tetrahedron Letters, 38:5257-60 (1997)；Walker, M. A., J. Org. Chem., 60:5352-5355 (1995)；Frisch等人, Bioconjugate Chem., 7:180-186 (1996)；美國專利第6,214,345號及第7,553,816號，及國際專利申請公開案第WO 02/088172號)。
連接體組分之實例包括但不限於N-(β-順丁烯二醯亞胺基丙氧基)-N-羥基丁二醯亞胺酯(BMPS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)丁二醯亞胺酯(EMCS)、N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]丁二醯亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯基碸(HBVS)、丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸酯) (LC-SMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、丁二醯亞胺基3-(溴乙醯胺基)丙酸酯(SBAP)、丁二醯亞胺基碘乙酸酯(SIA)、丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(STAB)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、丁二醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、丁二醯亞胺基6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸酯] (SMPH)、亞胺基硫烷(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB及丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯(SVSB)。
額外實例包括雙-順丁烯二醯亞胺試劑，諸如二硫雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、雙-順丁烯二醯亞胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2 及BM(PEG)3 ；醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
合適連接體典型地在化學上對細胞外部之條件比對細胞內部之條件更穩定，不過在某些情形中可預期不太穩定連接體，諸如當毒素為選擇性的或經靶向且對正常細胞具有低毒性時。連接體可為「可裂解連接體」或「不可裂解連接體」。可裂解連接體典型地在細胞內條件下易經受裂解，例如經由溶酶體過程。實例包括蛋白酶敏感性、酸敏感性、還原敏感性或光敏性連接體。相比之下，不可裂解連接體依賴於抗體在細胞中之降解，該降解典型地導致胺基酸-連接體-毒素部分之釋放。
合適可裂解連接體包括例如包含肽組分之連接體，該肽組分包括兩種或兩種以上胺基酸且可藉由細胞內蛋白酶(諸如溶酶體蛋白酶或內體蛋白酶)裂解。肽組分可包含天然存在之胺基酸殘基及/或次要胺基酸及/或非天然存在之胺基酸類似物(諸如瓜胺酸)。肽組分可經設計且針對特定酶之酶裂解經最佳化，例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C或D或血纖維蛋白溶酶蛋白酶。
在某些實施例中，包括於ADC中之連接體可為含二肽連接體，諸如含有纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)或苯丙胺酸-離胺酸(Phe-Lys)之連接體。用於包括於連接體中之合適二肽的其他實例包括Val-Lys、Ala-Lys、Me-Val-Cit、Phe-homoLys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3 Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys及Met-(D)Lys。可裂解連接體亦可包括較長肽組分，諸如三肽、四肽或五肽。實例包括但不限於三肽Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys及(D)Ala-Phe-Lys，及四肽Gly-Phe-Leu-Gly及Ala-Leu-Ala-Leu。
可裂解連接體之額外實例包括含二硫化物之連接體，諸如N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫)丁酸酯(SPBD)及N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPBD)。含二硫化物之連接體可視情況包括鄰近二硫鍵之額外基團以提供位阻，以便改良該連接體之細胞外穩定性，例如包括鄰二甲基。其他合適連接體包括在特定pH下或在pH範圍內可水解之連接體，諸如腙連接體。包含此等官能基之組合之連接體亦可適用，例如包含腙及二硫化物兩者之連接體為此項技術中已知的。
可裂解連接體之進一步實例為包含β-葡糖苷酸之連接體，該β-葡糖苷酸可藉由β-葡糖苷酸酶裂解，該β-葡糖苷酸酶為存在於溶酶體及腫瘤間質中的酶(參見例如De Graaf等人, Curr. Pharm. Des., 8:1391–1403 (2002))。
可裂解連接體可視情況進一步包含一或多種額外組分，諸如自降解及自消除基團、延伸體或親水性部分。
用於連接體之自降解及自消除基團包括例如對胺基苯甲氧基羰基(PABC)及對胺基苯甲基醚(PABE)基團，及甲基化乙二胺(MED)。自降解基團之其他實例包括但不限於在電子上類似於PABC或PABE基團之芳族化合物，諸如雜環衍生物，舉例而言，如美國專利第7,375,078號中所述之2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物。其他實例包括在醯胺鍵水解時經受環化之基團，諸如經取代及未經取代4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人, Chemistry Biology, 2:223-227 (1995))及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人, J. Org. Chem., 55:5867-5877 (1990))。
用於ADC之連接體之延伸體包括例如伸烷基，及基於脂族酸、二酸、胺或二胺的延伸體，諸如二乙醇酸鹽、丙二酸鹽、己酸鹽及己醯胺。其他延伸體包括例如基於甘胺酸之延伸體、聚乙二醇(PEG)延伸體及單甲氧基聚乙二醇(mPEG)延伸體。PEG及mPEG延伸體亦充當親水性部分。
在一些實施例中可用於本發明之ADC中之可裂解連接體中通常發現的組分之實例包括但不限於SPBD、磺基-SPBD、腙、Val-Cit、順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC或mc)、mc-Val-Cit、mc-Val-Cit-PABC、Phe-Lys、mc-Phe-Lys、mc-Phe-Lys-PABC、順丁烯二醯亞胺基三伸乙基乙醇酸酯(MT)、MT-Val-Cit、MT-Phe-Lys及己二酸酯(AD)。
在某些實施例中，包括於本發明之ADC中的連接體為基於肽之連接體，其具有通式(VI )： (VI ) 其中： Z為能夠與抗體上之標靶基團反應的官能基； Str為延伸體； AA1 及AA2 各自獨立地為胺基酸，其中AA1 -[AA2 ]m 形成蛋白酶裂解位點； X為自降解基團； D為與澳瑞他汀類似物之附接點； s為0或1； m為1與4之間的整數，且 o為0、1或2。
在一些實施例中，在通式(VI )中，Z為：。
在一些實施例中，在通式(VI )中，Str係選自：；；；；及， 其中： R為H或C1 -C6 烷基； p為2與10之間的整數，且 q為1與10之間的整數。
在一些實施例中，在通式(VI )中，Str為：、或， 其中p及q如上文所定義。
在一些實施例中，在通式(VI )中，Str為：或， 其中p為2與6之間的整數，且 q為2與8之間的整數。
在一些實施例中，在通式(VI )中，AA1 -[AA2 ]m 係選自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3 Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys、(D)Ala-Phe-Lys、Gly-Phe-Leu-Gly及Ala-Leu-Ala-Leu。
在一些實施例中，在通式(VI )中，m為1 (亦即，AA1 -[AA2 ]m 為二肽)。
在一些實施例中，在通式(VI )中，AA1 -[AA2 ]m 為選自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit及Trp-Cit之二肽。
在一些實施例中，在通式(VI )中，各X獨立地選自對胺基苯甲氧基羰基(PABC)、對胺基苯甲基醚(PABE)及甲基化乙二胺(MED)。
在一些實施例中，在通式(VI )中，m為1、2或3。
在一些實施例中，在通式(VI )中，s為1。
在一些實施例中，在通式(VI )中，o為0。
在一些實施例中，在通式(VI )中： Z為； Str為或，其中p為2與6之間的整數，且q為2與8之間的整數； m為1且AA1 -[AA2 ]m 為選自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit及Trp-Cit之二肽； s為1，且 o為0。
在一些實施例中，該連接體為含二硫化物之連接體且該ADC具有通式(VII )： (VII ) 其中： A為抗體； D為澳瑞他汀類似物； Y為–(CH2 )p -或–(CH2 CH2 O)q -，其中p及q各自獨立地為1與10之間的整數； 各R獨立地為H或C1 -C6 烷基； r為1、2或3，且 其中表示在該連接體與抗體上之表面離胺酸之ε-胺基之間形成的醯胺鍵。
在一些實施例中，在通式(VII )中，p及q各自獨立地為1與4之間的整數。
在一些實施例中，在通式(VII )中，Y為–(CH2 )p -且p為1與4之間的整數。
在一些實施例中，在通式(VII )中，各R獨立地為H或Me。
在一些實施例中，在通式(VII )中，r為1或2。
用於連接藥物至抗體之多種不可裂解連接體為此項技術中已知的且在某些實施例中可適用於本發明之ADC。不可裂解連接體之實例包括具有用於與抗體反應之N-丁二醯亞胺基酯或N-磺基丁二醯亞胺基酯部分以及用於與毒素反應之基於順丁烯二醯亞胺基或鹵基乙醯基之部分的連接體，或反之亦然。該種不可裂解連接體之實例係基於磺基丁二醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)。該等連接體之其他非限制性實例包括基於N-丁二醯亞胺基4-(順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷甲酸酯(SMCC)、N-丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸酯) (「長鏈」 SMCC或LC-SMCC)、κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷酸N-丁二醯亞胺基酯(KMUA)、γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-丁二醯亞胺基酯(GMBS)、ε-順丁烯二醯亞胺基己酸N-羥基丁二醯亞胺酯(EMCS)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)、N-(α-順丁烯二醯亞胺基乙醯氧基)-丁二醯亞胺酯(AMAS)、丁二醯亞胺基-6-(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸酯(SMPH)、N-丁二醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)及N-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)異氰酸酯(PMPI)之彼等連接體。其他實例包括包含基於鹵基乙醯基之官能基之彼等連接體，諸如N-丁二醯亞胺基-4-(碘乙醯基)-胺基苯甲酸酯(SIAB)、N-丁二醯亞胺基碘乙酸酯(SIA)、N-丁二醯亞胺基溴乙酸酯(SBA)及N-丁二醯亞胺基3-(溴乙醯胺基)丙酸酯(SBAP)。
不可裂解連接體之其他實例包括順丁烯二醯亞胺基羧酸，諸如順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC)。
用於既定ADC之適當連接體的選擇可容易地由熟習此項技術者考慮到相關因素，諸如與抗體之附接點、毒素之任何結構限制及毒素之疏水性來進行(參見例如Nolting, 第5章,Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology , 2013, Ducry (編), Springer中的回顧)。
在某些實施例中，包括於本發明之ADC中的連接體具有通式(VIII )： (VIII ) 其中： A-S-為與抗HER2雙互補位抗體之附接點； Y為一或多種額外連接體組分，或不存在，且 D為與澳瑞他汀類似物之附接點。
在某些實施例中，包括於本發明之ADC中的連接體具有通式(IX )： (IX ) 其中： A-S-為與抗HER2雙互補位抗體之附接點； Y為一或多種額外連接體組分，或不存在，且 D為與澳瑞他汀類似物之附接點。 抗體藥物結合物之製備
本發明之ADC可藉由此項技術中已知的數種途徑之一，使用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備(參見例如Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press，及本文中提供之實例)。例如，結合可藉由(1)抗體之親核基團或親電子基團與雙官能連接體經由共價鍵反應以形成抗體-連接體中間物Ab-L，隨後與經活化澳瑞他汀類似物(D)反應，或(2)澳瑞他汀類似物之親核基團或親電子基團與連接體經由共價鍵反應以形成連接體-毒素D-L，隨後與抗體之親核基團或親電子基團反應來實現。結合方法(1)及(2)可使用多種抗體、澳瑞他汀類似物及連接體以製備本文所述之ADC。
如上文所述，澳瑞他汀類似物可經由適當連接體結合於抗體上之多種基團以提供ADC。例如，結合可經由表面離胺酸、經由經氧化碳水化合物或經由已藉由還原一或多個鏈間二硫鍵釋放之半胱胺酸殘基實現。或者，抗體可經修飾以包括額外半胱胺酸殘基或提供反應性把手之非天然胺基酸，諸如硒代甲硫胺酸、對乙醯基苯丙胺酸、甲醯基甘胺酸或對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸。該等修飾為此項技術中熟知的(參見例如美國專利第7,521,541號；第8,455,622號及第9,000,130號；Hofer等人, Biochemistry, 48:12047-12057 (2009)；Axup等人, PNAS, 109:16101-16106 (2012)；Wu等人, PNAS, 106:3000-3005 (2009)；Zimmerman等人, Bioconj. Chem., 25:351-361 (2014))。
在某些實施例中，本發明之ADC包含經由適當連接體結合於已藉由還原一或多個鏈間二硫鍵釋放之半胱胺酸殘基的澳瑞他汀類似物。
在本文所述之ADC中，該抗HER2雙互補位抗體經由連接體以低平均藥物:抗體比率(DAR)，特定言之小於3.9但超過0.5，例如在某些實施例中在約1.5與約2.5之間之平均DAR結合於毒素。
此項技術中已知多種方法製備具有低平均DAR之ADC (參見例如McCombs及Owen, The AAPS Journal, 17(2):339-351 (2015)及其中參考文獻；Boutureira及Bernardes, Chem. Rev., 115:2174-2195 (2015)之回顧)。
例如，關於結合於半胱胺酸殘基，可進行抗體鏈間二硫鍵之部分還原，隨後結合於連接體-毒素。部分還原可藉由限制用於還原反應之還原劑的量來實現(參見例如Lyon等人, Methods in Enzymology, 502:123-138 (2012)，及其中實例，及本文所提供之實例)。合適還原劑為此項技術中已知的且包括例如二硫蘇糖醇(DTT)、參(2-羧基乙基)膦(TCEP)、2-巰基乙醇、半胱胺及多種水溶性膦。或者，或另外，可使用較少當量之連接體-毒素以便獲得低平均DAR。
或者，可使用經工程改造抗體，其中構成鏈間二硫鍵之半胱胺酸殘基中的一或多者經絲胺酸殘基置換，從而產生較少可用於結合之半胱胺酸殘基(參見McDonagh等人, Protein Eng. Des. Sel. PEDS, 19(7):299-307)。經工程改造抗體可接著用還原劑處理且結合於連接體-毒素。
另一方法係使用雙-硫醇連接體，其橋接通常構成鏈間二硫鍵之兩個半胱胺酸。若所有四個鏈間二硫鍵均經還原且經雙-硫醇連接體置換，則僅攜帶一個毒素分子之雙-硫醇連接體的使用將產生具有針對全長抗體之最大DAR4的ADC。鏈間二硫鍵之部分還原及/或較少當量之連接體可用於與雙-硫醇連接體結合以便進一步降低DAR。多種雙-硫醇連接體為此項技術中已知的(參見例如Badescu等人, Bioconjug. Chem., 25(6):1124-1136 (2014)；Behrens等人, Mol. Pharm., 12:3986–3998 (2015)；Lee等人, Chem. Sci., 7:799-802 (2016)；Maruani等人, Nat. Commun., 6:6645 (2015))。
亦可使用半胱胺酸工程改造方法以便產生具有低平均DAR之ADC。該等方法涉及工程改造溶劑可及性半胱胺酸至抗體中以便提供用於結合之位點特異性把手。用於引入半胱胺酸殘基之適當位點的數目已用IgG結構加以鑑別，且包括描述於Junutula等人, J. Immunol Methods, 332(1-2):41-52 (2008)；Junutula等人, Nat. Biotechnol., 26(8), 925-932 (2008)，及美國專利第9,315,581號；第9,000,130號；第8,455,622號；第8,507,654號及第7,521,541號中之彼等。
低平均DAR ADC亦可藉由使用限制量之經活化連接體-毒素之離胺酸結合來製備。亦可使用在抗體N端胺基酸處之選擇性反應。例如，N端絲胺酸可用高碘酸鹽氧化為醛，接著與連接體-毒素反應(參見例如Thompson等人, Bioconjug. Chem., 26(10):2085-2096 (2015))。同樣，N端半胱胺酸殘基可與醛選擇性地反應以生成噻唑啶酮(參見例如Bernardes等人, Nature Protocols, 8:2079-2089)。
額外方法包括工程改造抗體以包括一或多種非天然胺基酸，諸如對乙醯基苯丙胺酸(pAcPhe)或硒代半胱胺酸(Sec)。pAcPhe中之酮基可與包含末端烷氧基胺或醯肼之連接體-毒素反應以形成肟或腙鍵(參見例如Axup等人, PNAS USA, 109:16101-16106 (2012))。含Sec抗體可與含順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺之連接體-毒素反應以形成硒醚結合物(參見例如Hofer等人, Biochemistry, 48:12047-12057 (2009))。
抗體亦可經工程改造以包括藉由某些酶識別以允許酶催化之結合的肽標籤。例如，分選酶-A (SortA)識別序列LPXTG。此五肽可經工程改造為抗體之N或C端以允許SortA介導之結合(參見例如美國專利申請公開案第2016/0136298號；Kornberger及Skerra, mAbs, 6(2):354-366 (2014))。亦已使用麩醯胺轉胺酶以藉由使用已在位置N297處去糖基化之抗體(其使Q295暴露以用於酶結合)或藉由工程改造抗體以包括「麩醯胺標籤」 (LLQG)來產生DAR2 ADC (Jeger等人, Angew. Chem., 49:9995-9997 (2010)；Strop等人, Chem. Biol., 20(2):161-167 (2013))。在另一方法中，甲醯基甘胺酸殘基可藉由工程改造適當共有序列至抗體中且用甲醯基甘胺酸產生酶(FGE)共表現經工程改造抗體而經引入至抗體中。經引入之甲醯基甘胺酸的醛官能可接著用作用於毒素之結合的把手(參見例如Drake等人, Bioconjug. Chem., 25(7):1331-1341 (2014))。
用於產生DAR2 ADC之另一方法係使連接體-毒素結合於在糖基化抗體上發現之原生糖。結合於糖基化抗體可例如藉由末端糖殘基之高碘酸鹽氧化以生成可接著結合於適當連接體-毒素之醛，或藉由糖工程改造方法來實現，在該等糖工程改造方法中，原生糖經末端唾液酸殘基修飾，該等末端唾液酸殘基可接著經氧化以生成用於結合於連接體-毒素之醛(Zhou等人, Bioconjug. Chem., 25(3):510-520 (2014))。
用於使活性部分結合於抗體之UV交聯之使用亦已加以報告。此方法使用核苷酸結合位點(NBS)以用反應性硫醇部分對抗體進行位點特異性共價官能化。使用半胱胺酸之吲哚-3-丁酸(IBA)結合形式以使反應性硫醇部分在NBS處位點特異性光交聯至抗體。該硫醇部分可接著用於結合具有硫醇反應性基團之連接體-毒素(Alves等人, Bioconjug. Chem., 25(7):1198-1202 (2014))。
或者，具有低平均DAR之ADC可使用層析分離技術，諸如疏水性相互作用層析自含有DAR物質之混合物的ADC製劑分離(參見例如Hamblett等人, Clin. Cancer Res., 10:7063-7070 (2004)；Sun等人, Bioconj Chem., 28:1371-81 (2017)；美國專利申請公開案第2014/0286968號)。
低平均DAR之ADC製劑亦可藉由添加未結合(亦即，DAR0)抗體至具有＞ 3.9之平均DAR的ADC製劑中而產生。如此項技術中已知，大多數結合方法產生包括多種DAR物質之ADC製劑，其中所報告之DAR為個別DAR物質之平均值。在某些實施例中，包括一定比例的DAR0物質之ADC製劑可為有利的。在一些實施例中，具有小於3.9之平均DAR之ADC製劑可包括至少5% DAR0物質。在一些實施例中，ADC製劑可包括至少10% DAR0物質，例如至少15% DAR0物質或至少20% DAR0物質。在一些實施例中，ADC製劑可包括約5%與約50%之間DAR0物質。在一些實施例中，ADC製劑可包括約10%與約50%之間DAR0物質，例如約10%與約40%之間或約10%與約30%之間DAR0物質。
針對ADC之平均DAR可藉由標準技術，諸如UV/VIS光譜分析、基於ELISA的技術、諸如疏水性相互作用層析(HIC)之層析技術、UV-MALDI質譜分析(MS)及MALDI-TOF MS來測定。另外，藥物連接形式之分佈(例如，DAR0、DAR1、DAR2等物質的分數)亦可藉由此項技術中已知之多種技術，包括MS (具有或不具有伴隨層析分離步驟)、疏水性相互作用層析、逆相HPLC或等電聚焦凝膠電泳(IEF)來分析(參見例如Sun等人, Bioconj Chem., 28:1371-81 (2017)；Wakankar等人, mAbs, 3:161-172 (2011))。
在某些實施例中，ADC之平均DAR藉由疏水性相互作用層析(HIC)技術來測定。
在結合之後，ADC可藉由此項技術中已知之純化方法經純化且自未結合反應物及/或任何結合物聚集體分離。該等方法包括但不限於尺寸排阻層析(SEC)、疏水性相互作用層析(HIC)、離子交換層析、層析聚焦、超濾、離心超濾及其組合。 測試
ADC在HER2表現性癌細胞中之抗癌活性可使用標準技術活體外及/或活體內測試。
例如，ADC之細胞毒性活性可藉由使HER2表現性癌細胞在細胞培養基中暴露於ADC，培養該等細胞持續適當時期(例如，約6 h至約7天)，接著量測細胞活力來量測。非HER2表現細胞可作為對照物包括在內。
可用於測試ADC之多種以變化水準表現HER2之癌細胞株為此項技術中已知的且多種可購得(例如，購自American Type Culture Collection, Manassas, VA；Addexbio Technologies, San Diego, CA；DSMZ, Braunschweig, Germany)。實例包括BT-474 (3+)、SK-BR-3 (3+)、HCC1954 (3+)、JIMT-1 (2+)及ZR-75-1 (1+)細胞株。此等及其他實例概述於表8中。表 8 ： HER2 在所關注之細胞株中的相對表現水準
ADC抑制活體內腫瘤生長之能力可在適當動物模型中使用此項技術中已知之標準技術來測定(參見例如Enna等人, Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc., New York, NY)。一般而言，用於篩選抗腫瘤化合物之目前動物模型為異種移植物模型，其中人類腫瘤已經植入至動物(典型地，齧齒動物)中。
例如，ADC可使用在第0天經皮下移植腫瘤片段或植入適當數目之癌細胞的小鼠在HER2表現腫瘤上活體內測試。使該等腫瘤發展至所需尺寸，其中具有不充分發展腫瘤之動物經消除。ADC處理一般地在移植之後3天至22天開始，視腫瘤之類型而定。ADC可例如藉由靜脈內(i.v.)注射投與至動物。腫瘤在預定時期之後或連續地(例如，一週2或3次)經量測，直至該研究之預定終點，例如當腫瘤達到預定尺寸或重量時。以多種水準表現HER2之腫瘤可用於異種移植物模型中。患者源性異種移植物(PDX)尤其適用。
ADC之活體內毒性效應最初可在齧齒動物(例如，小鼠或大鼠)中藉由量測處理期間其對動物體重之影響來評估。亦可對取自動物之血樣執行血液學型態及肝酶分析。
可在適當動物模型(例如，大鼠或非人類靈長類動物)中遵循標準方案進一步分析活體內毒性及藥物動力學。食蟹獼猴在此方面尤其適用，因為人類及食蟹獼猴HER2共享98%序列同源性。
當以相同毒素劑量投與時，如與DAR ≥3.9之相應ADC相比，本文所述之ADC具有經改良耐受性及較低毒性。在某些實施例中，當以相同毒素劑量投與時，ADC顯示比DAR ≥3.9之相應ADC的耐受性大2倍之耐受性的改良。在一些實施例中，當以相同毒素劑量投與時，ADC顯示比DAR ≥3.9之相應ADC的耐受性大2.2倍(例如，2.3倍、2.4倍或2.5倍)之耐受性的改良。耐受性之改良可例如藉由針對本發明之ADC及DAR ≥3.9之相應ADC的最大耐受劑量(MTD)、未觀察到不良事件水準(NOAEL)或最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)之比較來測定。MTD、NOAEL及/或HNSTD可在適當動物模型(例如，齧齒動物或非人類靈長類動物)中藉由標準技術來量測。 醫藥組合物
關於治療用途，ADC可以包含ADC及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑的組合物形式經提供。該等組合物可藉由已知程序使用熟知且容易獲得之成分來製備。
醫藥組合物可經調配用於藉由例如經口(包括例如頰或舌下)、經表面、非經腸、直腸或陰道途徑或藉由吸入或噴霧投與至個體。如本文所用，術語「非經腸」包括皮下注射及皮內、關節內、靜脈內、肌肉內、血管內、胸骨內、鞘內注射或輸注。醫藥組合物將典型地以適用於投與至個體之形式經調配，例如呈糖漿、酏劑、錠劑、糖錠、口含錠、硬或軟膠囊、丸劑、栓劑、油性或水性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳液、可注射或溶液。醫藥組合物可經提供為單位劑量調配物。
在某些實施例中，包含ADC之醫藥組合物經調配用於以單位劑量可注射形式用於非經腸投與，例如呈凍乾調配物或水溶液。
醫藥學上可接受之載劑一般在所用的劑量及濃度下對接受者無毒。該等載劑之實例包括但不限於緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，諸如抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯化六烴季銨、苯紮氯銨、苄索氯銨、苯酚、丁醇、苯甲基醇、對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間-甲酚；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白或明膠；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(諸如Zn-蛋白錯合物)，及非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。
在某些實施例中，包含ADC之組合物可呈無菌可注射水性或油性溶液或懸浮液之形式。該等懸浮液可使用此項技術中已知之合適分散或濕潤劑及/或懸浮劑來調配。該無菌可注射溶液或懸浮液可包含在無毒非經腸可接受之稀釋劑或載劑中之ADC。可使用之可接受之稀釋劑及載劑包括例如1,3-丁二醇、水、林格氏溶液或等張氯化鈉溶液。另外，無菌、固定油亦可用作載劑。出於此目的，可使用多種溫和固定油，包括合成單酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，諸如油酸之脂肪酸亦可用於可注射劑之製備。諸如局部麻醉劑、防腐劑及/或緩衝劑之佐劑亦可包括於可注射溶液或懸浮液中。
在某些實施例中，包含ADC之組合物可經調配用於靜脈內投與至人類。典型地，用於靜脈內投與之組合物為無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，該組合物亦可包括增溶劑及/或諸如利多卡因之局部麻醉劑以減輕注射位點處之疼痛。一般而言，該等成分獨立地或在單位劑型中混合在一起經供應，例如作為在指示活性劑之量的密封容器(諸如安瓿或小藥囊)中之乾燥凍乾粉末或無水濃縮物。在該組合物欲藉由輸注投與之情況下，其可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸注瓶分配。在該組合物藉由注射投與之情況下，可提供一安瓿之無菌注射用水或生理食鹽水，使得該等成分可在投與之前混合。
其他醫藥組合物及製備醫藥組合物之方法為此項技術中已知的且描述於例如「Remington: The Science and Practice of Pharmacy 」 (先前為「Remingtons Pharmaceutical Sciences 」); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)中。 使用方法
本文所述之ADC可用於抑制HER2表現性腫瘤細胞之生長的方法中。該等細胞可為活體外或活體內的。在某些實施例中，該等ADC可用於治療個體中之HER2表現性癌症或腫瘤之方法中。
HER2表現性癌症之治療可引起以下一或多者：症狀減輕、縮小腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、削弱該疾病之一或多種直接或間接病理後果、預防轉移、減少疾病進展之速率、疾病狀態之改善或緩和、改良生存、增加無進展生存、緩解及/或改良預後。
在某些實施例中，用如本文所述之ADC治療HER2表現性癌症會減慢該疾病之進展。在一些實施例中，用如本文所述之ADC治療HER2表現性癌症會引起腫瘤衰退。在一些實施例中，用如本文所述之ADC治療HER2表現性癌症會引起腫瘤生長之抑制。
HER2表現性癌症典型地為實體腫瘤。HER2表現性實體腫瘤之實例包括但不限於乳癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、尿道上皮癌、胰臟癌、唾液腺癌及腦癌。HER2表現性乳癌包括雌激素受體陰性(ER-)及/或孕酮受體陰性(PR-)乳癌及三陰性(ER-、PR-、低HER2)乳癌。HER2表現性肺癌包括非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌。
在某些實施例中，本文所述之ADC可用於HER2表現性乳癌、卵巢癌、肺癌或胃癌之治療。在一些實施例中，本文所述之ADC可用於HER2表現性乳癌之治療。在一些實施例中，本文所述之ADC可用於亦為雌激素受體及孕酮受體陰性之HER2表現性乳癌之治療。在一些實施例中，本文所述之ADC可用於HER2表現性三陰性乳癌(TNBC)之治療。在一些實施例中，本文所述之ADC可用於已轉移至腦之HER2表現性乳癌之治療。在一些實施例中，本文所述之ADC可用於HER2表現性卵巢癌之治療。
如此項技術中已知，HER2表現性癌症之特徵可在與其表現之HER2的水準(亦即，「HER2狀態」)。HER2狀態可例如藉由免疫組織化學(IHC)、螢光原位雜交(FISH)及顯色原位雜交(CISH)來評估。
IHC鑑別細胞膜上之HER2蛋白表現。來自腫瘤生檢之石蠟包埋組織切片可經受IHC分析且如下記錄HER2染色強度準則： 分數0：未觀察到染色或在小於10%之腫瘤細胞中觀察到膜染色，典型地＜20,000個受體/細胞。 分數1+：在超過10%之腫瘤細胞中偵測到暗淡/幾乎不能感知之膜染色。該等細胞僅在其膜之部分中經染色。典型地，約100,000個受體/細胞。 分數2+：在超過10%之腫瘤細胞中觀察到微弱至中度完全膜染色；典型地約500,000個受體/細胞。 分數3+：在超過10%之腫瘤細胞中觀察到中度至強烈完全膜染色；典型地約2,000,000個受體/細胞。
針對HER2表現具有0或1+分數之腫瘤經表徵為HER2陰性，而具有2+或3+分數之彼等腫瘤經表徵為HER2陽性。
可用於使用IHC進行HER2偵測之FDA批准之商業套組的實例包括HercepTest™ (Dako Denmark A/S)；PATHWAY (Ventana Medical Systems, Inc.)；InSite™HER2/NEU套組(Biogenex Laboratories, Inc.)及Bond Oracle HER2 IHC System (Leica Biosystems。
如本文所述之ADC可用於以多種水準表現HER2之癌症的治療。在某些實施例中，該等ADC可用於表現高水準之HER2 (IHC 3+)的癌症之治療。在一些實施例中，該等ADC可用於表現高水準之HER2 (3+ IHC)或中等水準之HER2 (2+ IHC或2+/3+ IHC)的癌症之治療。在一些實施例中，該等ADC可用於表現高水準之HER2 (3+ IHC)、中等水準之HER2 (2+ IHC或2+/3+ IHC)或低水準之HER2 (1+ IHC或1+/2+ IHC)的癌症之治療。在一些實施例中，本文所述之ADC可用於藉由IHC經評分為HER2陰性之癌症之治療。
在某些實施例中，欲用該等ADC治療之癌症之HER2水準藉由IHC測定。在一些實施例中，欲用該等ADC治療之癌症之HER2水準藉由使用Herceptest™分析執行的IHC測定。
HER2表現性癌症實際上可為均質的(亦即，大多數腫瘤細胞表現相似量之HER2)，或其實際上可為異質的(亦即，包含表現不同水準之HER2的不同腫瘤細胞群體)。預期該等ADC可用於治療HER2表現性癌症，該等HER2表現性癌症關於HER2水準為均質的或異質的。
在某些實施例中，該等ADC可用於治療具有HER2表現性癌症之個體之方法中，該HER2表現性癌症抵抗或變得抵抗其他護理標準療法。在一些實施例中，該等ADC可用於治療具有HER2表現性癌症之個體之方法中，該個體對諸如曲妥珠單抗(Herceptin®)、帕妥珠單抗(Perjeta®)、T-DM1 (Kadcyla®或曲妥珠單抗emtansine)或紫杉烷(諸如太平洋紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽及其類似物)之一或多種目前療法無反應。在一些實施例中，該等ADC可用於治療具有HER2表現性癌症之個體之方法中，該HER2表現性癌症抵抗曲妥珠單抗。在一些實施例中，該等ADC可用於治療具有HER2表現性癌症之個體之方法中，該HER2表現性癌症抵抗帕妥珠單抗。在一些實施例中，該等ADC可用於治療具有HER2表現性癌症之個體之方法中，該HER2表現性癌症抵抗T-DM1。在一些實施例中，當患者關於先前抗HER2療法已具有進展時，該等ADC可用於治療轉移性癌症。
當該等ADC用於治療具有HER2表現性癌症之個體，而該HER2表現性癌症對使用另一治療劑之治療具抵抗性、難治性及/或自該治療復發時，該等ADC可為第二線療法或第三或第四線療法的部分，視個體經歷之先前治療之數目而定。
在某些實施例中，本文所述之ADC可聯合額外抗腫瘤劑用於具有HER2表現性癌症之個體的治療。該額外抗腫瘤劑可為治療抗體(諸如上文所述之彼等)或化學治療劑。通常用於HER2表現性癌症之治療之化學治療劑包括例如順鉑、卡鉑、太平洋紫杉醇、白蛋白結合之太平洋紫杉醇Abraxane®)、多西他賽、吉西他濱、溫諾平、依立替康、依託泊苷、長春花鹼、培美曲塞、5-氟尿嘧啶(具有或不具有亞葉酸)、卡培他濱、卡鉑、表阿黴素、奧沙利鉑、folfirinox、環磷醯胺及如此項技術中已知的此等試劑之多種組合。該(等)額外試劑可與ADC並行地或依序地投與至個體。
在某些實施例中，預期本文所述之ADC可用於治療具有HER2表現性癌症之個體，該個體尚未經歷任何先前抗癌治療(亦即，該等ADC可用作第一線療法)。
在某些實施例中，在上述方法中經該ADC治療之個體可為人類、非人類靈長類動物或其他哺乳動物。在一些實施例中，在上述方法中經該ADC治療之個體為人類個體。
欲投與至個體之ADC的量將根據相關情況，包括欲治療之病狀、所選投與途徑、實際投與之化合物、個別個體的年齡、重量及反應及個體之症狀之嚴重程度而變化，但為治療有效量。
如本文所用，術語「治療有效量」係指為了實現所陳述方法之目標(例如，所治療之疾病的一或多種症狀之改善)而需要投與之ADC之量。將有效治療HER2表現性癌症之本文所述之ADC的量可藉由標準臨床技術來測定。另外，可視情況使用活體外分析以幫助鑑別最佳劑量範圍。有效劑量自源於活體外或動物模型測試系統之劑量-反應曲線推斷。 醫藥套組
某些實施例提供包含如本文所述之ADC之醫藥套組。
該套組將典型地包含容器及在該容器上或與該容器締合之標籤及/或包裝插頁。該標籤或包裝插頁含有治療產品之商業包裝中慣常包括的說明書，其提供關於適應症、用法、劑量、投與、禁忌症及/或有關該等治療產品的用途之警告之資訊。該標籤或包裝插頁可進一步包括由管理醫藥劑或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構規定之形式之通知，該通知反映了製造機構批准針對人類或動物投與之使用或銷售。該標籤或包裝插頁亦指示了該ADC用於治療HER2表現性癌症。該容器容納包含該ADC之組合物且在一些實施例中可具有無菌存取口(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。
除了含有包含該ADC之組合物之容器，該套組亦可包含一或多個額外容器，其包含該套組之其他組分。例如，醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液；其他緩衝液或稀釋劑。
合適容器包括例如瓶、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋及其類似物。該等容器可由多種材料，諸如玻璃或塑膠形成。適當時，該套組之一或多種組分可以諸如粉末或顆粒之乾燥形式經凍乾或提供，且該套組可另外含有用於經凍乾或經乾燥組分的復原之合適溶劑。
該套組可進一步包括自商業或使用者觀點來看可需要之其他材料，諸如過濾器、針及注射器。
以下實例出於說明性目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範圍。實例 實例 1 ：合成連接體 - 毒素
以下實例描述了包含以下澳瑞他汀類似物(化合物9 )之例示性連接體-毒素(連接體-毒素001)的製備：
可使用相似方案來製備包含包括以下例示性化合物之其他澳瑞他汀類似物之連接體-毒素(亦參見國際專利申請公開案第WO 2016/041082號)： 1.1 (2R,3R)-3- 甲氧基 -2- 甲基 -3-((S)- 吡咯啶 -2- 基 ) 丙酸乙酯 ( 化合物 1)
在0℃下以逐滴方式向(2R,3R)-3-((S)-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(Boc-Dap-OH，4.31 g，15.0 mmol)於無水乙醇(27.0 mL)中之經攪拌溶液中添加亞硫醯二氯(3.0 mL)。使所得溶液溫至室溫且藉由HPLC-MS監測進展。18 h之後，未偵測到剩餘起始材料且在減壓下將該溶液濃縮至乾。所得油狀物懸浮於甲苯(10 mL)中且在減壓下濃縮兩次，接著懸浮於乙醚(5 mL)中且在減壓下濃縮兩次以提供白色固體泡沫(3.78 g，定量產率%)。MSm/z 觀察值= 216.5 (M+1)。 1.2 (3R,4S,5S)-4-((S)-2-((( 苯甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-N,3- 二甲基丁醯胺基 )-3- 甲氧基 -5- 甲基庚酸 ( 化合物 3)
如國際專利申請公開案第WO 2016/041082號中所述製備化合物2 。
向化合物2 (6.965 g，14.14 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之經攪拌溶液中添加三氟乙酸(5.0 mL)。藉由HPLC-MS監測反應之完成且40 h之後未剩餘起始材料。該反應在減壓下濃縮，與甲苯(2 × 10 mL)及二氯甲烷(2 × 10 mL)共蒸發以獲得泡沫狀白色固體(6.2 g，用殘餘TFA定量產率)。此材料溶解於200 mL熱1:3 EtOAc:己烷中且使其冷卻至室溫。在冷卻期間，形成沉澱物以及一些小晶體。添加5 mL EtOAc且再次加熱懸浮液以充分地溶解沉澱物。在冷卻至室溫時形成更多晶體且將燒瓶置於-30℃下隔夜。次日早上，傾析母液且用2 × 50 mL己烷沖洗晶體且在高真空下乾燥。回收5.67 g結晶產物。MSm/z 觀察值= 405.7 (M+1)。 1.3 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((( 苯甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-N,3- 二甲基丁醯胺基 )-3- 甲氧基 -5- 甲基庚醯基 ) 吡咯啶 -2- 基 )-3- 甲氧基 -2- 甲基丙酸乙酯 ( 化合物 4)
在室溫下向化合物3 (6.711 g，15.37 mmol，1.025當量)於二氯甲烷(5.0 mL)及N,N -二甲基甲醯胺(5.0 mL)之混合物中之經攪拌溶液中添加HATU (5.732 g，15.07 mmol，1.005當量)及N,N -二異丙基乙胺(7.84 mL，3當量)。在室溫下攪拌持續30分鐘之後，逐滴添加化合物1 (3.776 g，15.00 mmol，1.0當量)於二氯甲烷(1.0 mL)及N,N -二甲基甲醯胺(1.0 mL)之混合物中之溶液，用額外3 mL 1:1二氯甲烷:N,N -二甲基甲醯胺沖洗殘餘化合物1 。藉由HPLC-MS監測反應且15分鐘之後未觀察到剩餘化合物1 。該反應在減壓下濃縮，用乙酸乙酯(約125 mL)稀釋且用1 M HCl (2 × 50 mL)、1 x dH2 O (1 × 50 mL)、飽和NaHCO3 (3 × 50 mL)、鹽水(25 mL)萃取有機相。用25 mL EtOAc洗滌酸性及鹼性水層兩者。接著彙集所有有機物且經MgSO4 乾燥，過濾且濃縮以生成紅色油狀物。該殘餘物溶解於微量二氯甲烷(約10 mL)中，裝載於Biotage® SNAP Ultra 360 g矽膠管柱(IsoleraÔ Flash System; Biotage AB, Sweden)上用於純化(含20-100% EtOAc之己烷，經10個管柱體積)。彙集含有純產物之部分以回收7.9 g泡沫狀白色固體。使不純部分在Biotage® SNAP Ultra 100 g矽膠管柱上經受第二次純化且與純產物彙集以回收白色泡沫狀固體(8.390 g，88.3 %)。MSm/z 觀察值= 634.7 (M+1)。 1.4 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((( 苯甲氧基 ) 羰基 ) 胺基 )-N,3- 二甲基丁醯胺基 )-3- 甲氧基 -5- 甲基庚醯基 ) 吡咯啶 -2- 基 )-3- 甲氧基 -2- 甲基丙酸 ( 化合物 5)
向化合物4 (8.390 g，13.24mmol)於1,4-二噁烷(158 mL)中之經攪拌溶液中添加dH2 O (39.7 ml)及氫氧化鋰單水合物(1 M於H2 O中，39.7 mL，3當量)。該反應在4℃下經攪拌且藉由HPLC-MS監測起始材料之消耗，其耗時3天直至僅剩餘痕量化合物4 。在反應過程期間，除了所需材料以外亦形成小百分率之新產物，其對應於甲醇之損失(β-消除，＜ 2%)。該反應藉由1 M HCl水溶液(50 mL)之添加來酸化且在減壓下濃縮以移除二噁烷。剩餘反應混合物用乙酸乙酯(4 × 50 mL)萃取且彙集有機相，用鹽水(15 mL + 2 mL 2 M HCl)洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮以生成淺色油狀物。該油狀物再溶解於乙醚(約50 mL)中且在減壓下濃縮(3x)以促進殘餘二噁烷之移除，從而提供呈黏稠油狀物之標題產物(7.81 g 97%產率，具有一些殘餘二噁烷及化合物4 )。MSm/z 觀察值= 606.7 (M+1)。 1.5 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3- 甲氧基 -1-((S)-2-((1R,2R)-1- 甲氧基 -2- 甲基 -3- 側氧基 -3-((4-(2,2,2- 三氟乙醯胺基 ) 苯基 ) 磺醯胺基 ) 丙基 ) 吡咯啶 -1- 基 )-5- 甲基 -1- 側氧基庚 -4- 基 )( 甲基 ) 胺基 )-3- 甲基 -1- 側氧基丁 -2- 基 ) 胺基甲酸苯甲酯 ( 化合物 7)
如國際專利申請公開案第WO 2016/041082)號中所述製備化合物6 。
向化合物5 (7.12 g，11.754 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之經攪拌溶液中添加2,2,2-三氟-N-(4-胺磺醯基苯基)乙醯胺(化合物6 ，4.095 g，1.3當量，溶解於3 mL DMF中)、N,N -二甲基吡啶(1.867 g，1.3當量)及N,N -二甲基甲醯胺(1.5 mL)。5 mL DMF之進一步添加不會使溶液澄清。以單一部分添加N -(3-二甲基胺基丙基)-N ′-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCI) (2.817 g，1.25當量)且藉由HPLC-MS監測反應。48 h之後，反應不再進展且添加額外400 mg EDCI。18 h之後，未觀察到剩餘起始材料且反應在減壓下濃縮以生成黃色油狀物。該油狀物溶解於乙酸乙酯(約150 mL)及1 M HCl (20 mL)中，且用冷2 M HCl (2 × 10 mL)、飽和NaHCO3 (1 × 10 mL)、鹽水(20 mL + 5 mL 2 M HCl)洗滌有機相。用EtOAc (1 × 20 mL)萃取酸性及鹼性水性部分，彙集所有有機部分，經MgSO4 乾燥且在減壓下濃縮以生成油性粗固體(13 g)。該殘餘物溶解於二氯甲烷(約10 mL)中，裝載於Biotage® SNAP Ultra 360 g矽膠管柱上且在10-100% EtOAc (2% AcOH)/己烷梯度下經12個管柱體積純化，其中在50% EtOAc下為3-管柱體積平台。彙集含有純產物之部分，在減壓下濃縮，溶解於甲苯(2 × 10 mL)及乙醚(2 × 10 mL)中且濃縮以提供所需產物(7.1 g白色泡沫狀固體)。使用Isolera™儀器上之Biotage® SNAP Ultra 100 g矽膠管柱使不純部分在較窄梯度條件下經受重複純化。彙集所有純部分以回收呈白色泡沫狀固體之純產物(8.60 g，86%)。MSm/z 觀察值= 856.7 (M+1)。 1.6 (S)-2- 胺基 -N-((3R,4S,5S)-3- 甲氧基 -1-((S)-2-((1R,2R)-1- 甲氧基 -2- 甲基 -3- 側氧基 -3-((4-(2,2,2- 三氟乙醯胺基 ) 苯基 ) 磺醯胺基 ) 丙基 ) 吡咯啶 -1- 基 )-5- 甲基 -1- 側氧基庚 -4- 基 )-N,3- 二甲基丁醯胺 ( 化合物 7a)
化合物7 (3.71 g，4.33 mmol)溶解於含有磁性攪拌器且配備有三通氣體管線適配器之圓底燒瓶中的含10%N,N -二甲基甲醯胺之乙酸乙酯(30 mL)中。該容器在減壓下抽真空兩次且饋入氮氣。以單一部分添加10%鈀/碳(0.461 g，0.1當量)，將該三通適配器配備至該燒瓶，將氫氣球配備至該適配器且該容器在減壓下抽真空兩次且饋入氫氣。使該反應攪拌持續2天，期間偶爾再饋入氫氣球。大約48 h之後，HPLC-MS分析指示未剩餘起始材料。該反應用甲醇(20 mL)稀釋且經矽藻土插塞過濾。矽藻土用甲醇(2 × 50 mL)洗滌。彙集所有濾液且在減壓下濃縮且使剩餘油狀物溶解於二氯甲烷中且濃縮。在減壓下乾燥之後，分離成無色粉末狀之標題化合物(3.10 g，99%)。MSm/z 觀察值= 722.6 (M+1)。 1.7 (S)-2-((S)-2-( 二甲基胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 )-N-((3R,4S,5S)-3- 甲氧基 -1-((S)-2-((1R,2R)-1- 甲氧基 -2- 甲基 -3- 側氧基 -3-((4-(2,2,2- 三氟乙醯胺基 ) 苯基 ) 磺醯胺基 ) 丙基 ) 吡咯啶 -1- 基 )-5- 甲基 -1- 側氧基庚 -4- 基 )-N,3- 二甲基丁醯胺 ( 化合物 8)
向N,N -(L )-二甲基纈胺酸(1.696 g，9.35 mmol)於N,N -二甲基甲醯胺(10 mL)中之經攪拌溶液中添加HATU (3.216 g，8.46 mmol)及二異丙基乙胺(3.10 mL，17.8 mmol)。5分鐘之後產生透明黃色溶液。再繼續攪拌持續10分鐘，接著以單一部分添加化合物7a (3.213 g，4.45 mmol)。再攪拌1 h之後，HPLC-MS指示剩餘痕量化合物7a 且該反應持續16 h。該反應接著在減壓下濃縮，用乙酸乙酯(120 mL)及40 mL 1:1 NaHCO3 (飽和): 5% LiCl稀釋且轉移至分液漏斗。移出水層且有機相用LiCl (1 × 20 mL)、NaHCO3 (飽和，2 × 20 mL)洗滌。彙集水層且用EtOAC (3 × 50 mL)萃取。彙集有機層且用鹽水(1 × 20 mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮以生成裝載DMF之油狀物，該油狀物經由旋轉蒸發儀濃縮以移除殘餘DMF，從而生成7 g粗稻草色油狀物。該油狀物溶解於微量含10%甲醇之二氯甲烷(約11mL)中且裝載於Biotage® SNAP Ultra 360 g矽膠管柱上用於純化(含2-20% MeOH之CH2 Cl2 ，經15個管柱體積，產物溶離約10-13%)。彙集含有所需產物之部分且在減壓下濃縮以提供呈無色泡沫狀之標題化合物。組合不純部分，蒸發且在Isolera™儀器上之Biotage® SNAP Ultra 100 g矽膠管柱上經受重複純化且與來自第一管柱之純產物組合以生成無色泡沫狀固體(3.78 g)。MSm/z 觀察值= 850.6 (M+1)。 1.8 (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4- 胺基苯基 ) 磺醯胺基 )-1- 甲氧基 -2- 甲基 -3- 側氧基丙基 ) 吡咯啶 -1- 基 )-3- 甲氧基 -5- 甲基 -1- 側氧基庚 -4- 基 )-2-((S)-2-( 二甲基胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 )-N,3- 二甲基丁醯胺 ( 化合物 9)
向化合物8 (0.980 g，1.154 mmol)於1,4-二噁烷(15 mL)中之經攪拌溶液中添加水(3.5 mL)及1 M氫氧化鋰單水合物(3當量，3.46 mL)。使所得淺色懸浮液在4℃下攪拌且藉由HPLC-MS監測起始材料之消耗。當該轉化完成時(約5天)，該反應用3.46 mL 1 M HCl中和且在減壓下濃縮以移除二噁烷。所得水相用60 mL EtOAc及5 mL鹽水稀釋，接著用乙酸乙酯(2 × 30 mL)萃取。彙集有機部分，經Na2 SO4 乾燥，過濾且蒸發以生成呈褐色固體狀之標題化合物(0.930 g)。Rf = 0.5 (含8% MeOH之CH2 Cl2 )。MSm/z 觀察值= 753.7 (M+1)。 1.9 3-(2-(2-(2-(2,5- 二側氧基 -2,5- 二氫 -1H- 吡咯 -1- 基 ) 乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙氧基 ) 丙酸 2,3,5,6- 四氟苯酯 ( 化合物 15)
在經乾燥50 mL錐形燒瓶中，3-(2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(化合物14 ，1.000 g，4.52 mmol)及順丁烯二酸酐(0.443 g，4.52 mmol)溶解於無水N,N -二甲基甲醯胺(5 mL)中。該反應在室溫下在N2 下攪拌持續6 h，此時將其冷卻至0℃且逐滴添加順式 -三甲基吡啶(1.263 mL，2.1 eq)。在另一經乾燥50 mL錐形燒瓶中，四氟苯酚(3.002 g，4 eq)溶解於無水N,N -二甲基甲醯胺(10 mL)中。該燒瓶在冰浴中冷卻至0℃且逐滴添加三氟乙酸酐(2.548 mL，4 eq)。此燒瓶攪拌持續15分鐘，此時逐滴添加順式 -三甲基吡啶(2.407 mL，4 eq)。使該燒瓶再攪拌持續15分鐘，且接著經由注射器將內含物逐滴添加至第一燒瓶中。使該反應溫至室溫且在N2 下繼續攪拌。藉由HPLC-MS監測該反應中起始材料之消耗。6天之後，該反應以化合物14 之全部消耗完成，僅留下化合物15 及少量(約5%)雙-TFP順丁烯二醯胺中間物。該反應轉移至分液漏斗，用乙醚(75 ml)稀釋且用5% LiCl (1 × 20 mL)、1 M HCl (2 × 20 mL)、飽和NaHCO3 (5 × 20 mL)及鹽水(1 × 20 mL)洗滌。有機層經Na2 SO4 乾燥，過濾且蒸發以生成具有殘餘DMF之棕色粗油狀物。粗油狀物溶解於8 mL 1:1 DMF:H2 O + 0.1% TFA中，裝載於60 g Biotage® SNAP Ultra C18管柱(Biotage AB, Uppsala, Sweden)上且在經8個管柱體積ACN/H2 O + 0.1% TFA之線性30-100%梯度下純化。彙集純部分且用鹽水(20 mL)稀釋，接著用3 × 50 mL Et2 O萃取。經彙集之有機物經MgSO4 乾燥，過濾且蒸發以回收淺黃色油狀物(1.34 g，66%產率)。 1.10 ((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-( 二甲基胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 )-N,3- 二甲基丁醯胺基 )-3- 甲氧基 -5- 甲基庚醯基 ) 吡咯啶 -2- 基 )-3- 甲氧基 -2- 甲基丙醯基 ) 胺磺醯基 ) 苯基 ) 胺基 )-1- 側氧基 -5- 脲基戊 -2- 基 ) 胺基 )-3- 甲基 -1- 側氧基丁 -2- 基 ) 胺基甲酸第三丁酯 ( 化合物 12)
如國際專利申請公開案第WO 2016/041082號中所述製備化合物11 。
向空的25 mL梨形燒瓶中添加化合物11 (1.342 g，3.58 mmol，3.0當量)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.664 g，3.46 mmol，2.9當量)及7-羥基-氮雜苯并三唑(HOAT) (0.472 g，3.46 mmol，2.9當量)。此等固體在室溫下在攪拌下經30分鐘溶解於N,N -二甲基甲醯胺(0.5 mL)及二氯甲烷(4.5 mL)之混合物中。單獨地，化合物9 (0.900 g，1.20 mmol)溶解於N,N -二甲基甲醯胺(0.2 mL)及二氯甲烷(1.8 mL)之混合物中且添加至該梨形燒瓶中，用二氯甲烷(1.0 mL)沖洗。攪拌速率增加至1000 rpm，從而產生渦旋。在添加化合物9 之2分鐘內，氯化銅(II) (0.514 g，3.83 mmol，3.2當量)直接地經由狹窄漏粉鬥一次性添加至該渦旋之中心中。最初淺黃色溶液變為暗棕色懸浮液，該懸浮液經10分鐘改變為暗綠色懸浮液。藉由HPLC-MS監測該反應之完成且在30分鐘及1 h時取得之樣品之間未觀察到反應進展之改變(約95%完成)。使該反應在室溫下攪拌隔夜，接著將2-(2-胺基乙基胺基)乙醇(0.483 mL，4.781 mmol，4當量)、EtOAc (10 mL)及dH2 O (5 mL)添加至經攪拌懸浮液中，該懸浮液經歷顏色改變為深藍色。該懸浮液劇烈地攪拌持續4 h，因為經懸浮固體逐漸地溶解於兩相混合物中。此混合物轉移至分液漏斗且用EtOAc (100 mL)及鹽水(10 mL)稀釋，且用10% IpOH/ EtOAc (4 × 50 mL)萃取水層。彙集有機層且用鹽水(10 mL)洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且蒸發以生成淡藍色粗固體。此粗固體溶解於甲醇(0.5 mL)及二氯甲烷(6 mL)之混合物中且在Biotage® SNAP Ultra 100 g矽膠管柱上純化(含2-20% MeOH之CH2 Cl2 ，經10個管柱體積，隨後在20% MeOH下8-管柱體積平台)。產物在1-2個管柱體積之後在含約20% MeOH之CH2 Cl2 下溶離為寬峰。彙集含有所需材料之部分且在減壓下濃縮以生成呈白色固體狀之標題化合物(1.105 g，83%)。MSm/z 觀察值= 555.9 ((M+2)/2), 1109.8 (M+1)。 1.11 (S)-2-((S)-2- 胺基 -3- 甲基丁醯胺基 )-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-( 二甲基胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 )-N,3- 二甲基丁醯胺基 )-3- 甲氧基 -5- 甲基庚醯基 ) 吡咯啶 -2- 基 )-3- 甲氧基 -2- 甲基丙醯基 ) 胺磺醯基 ) 苯基 )-5- 脲基戊醯胺 ( 化合物 13)
向化合物12 (0.926 g，0.834mmol)之溶液中添加二氯甲烷(10 mL)及三氟乙酸(2.0 mL)之混合物。藉由HPLC-MS監測該反應中起始材料之消耗(約45分鐘)。該反應在減壓下用乙腈(2 × 10 mL)及二氯甲烷(2 × 10 mL)共蒸發以移除過量三氟乙酸。所得殘餘物溶解於微量二氯甲烷及甲醇(3:1，v/v，約2 mL)中，且經由移液管逐滴添加至乙醚(200 mL)及己烷(100 mL)之經攪拌溶液中，產生淺白色固體之懸浮液。過濾該等固體且在真空下乾燥以提供呈白色粉末形式之標題化合物，呈三氟乙酸鹽形式(1.04 g，定量產率，具有一些殘餘溶劑)。MSm/z 觀察值= 505.8 ((M+2)/2)。 1.12 (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-( 二甲基胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 )-N,3- 二甲基丁醯胺基 )-3- 甲氧基 -5- 甲基庚醯基 ) 吡咯啶 -2- 基 )-3- 甲氧基 -2- 甲基丙醯基 ) 胺磺醯基 ) 苯基 )-2-((S)-1-(2,5- 二側氧基 -2,5- 二氫 -1H- 吡咯 -1- 基 )-14- 異丙基 -12- 側氧基 -3,6,9- 三氧雜 -13- 氮雜十五烷醯胺基 )-5- 脲基戊醯胺 ( 連接體 - 毒素 001)
向化合物13 (0.722 g，0.584 mmol)於N,N -二甲基甲醯胺(4 mL)中之經攪拌溶液中添加化合物15 (0.314 g，1.2當量)及二異丙基乙胺(0.305 mL，3.0當量)。2 h時之HPLC-MS分析指示無剩餘起始材料。該反應用TFA (300 μL)酸化且接著用diH2 O + 0.1% TFA (9 mL)稀釋。所得溶液裝載於120 g Biotage® SNAP Ultra C18管柱(Biotage, Uppsala, Sweden)上且在ACN/H2 O + 0.1% TFA梯度下純化：經10個管柱體積20-60% ACN，經5個管柱體積60-100% ACN。產物在40% ACN附近溶離。彙集如藉由LCMS鑑別之純部分且凍乾。自凍乾儀回收白色粉末固體。在較高濃度(大約50 mg/mL於2:1 H2 O/ACN中)下重複凍乾至小瓶中以產生更緻密、較少絮凝劑凍乾固體(754.2 mg，91%)。MSm/z 觀察值= 647.4 ((M+2)/2), 1292.8 (M+1)。實例 2 ：連接體 - 毒素結合於雙互補位抗體
藉由抗體鏈間二硫鍵之部分還原、隨後藉由與連接體-毒素之順丁烯二醯亞胺組分反應對游離半胱胺酸殘基進行封端來產生雙互補位抗HER2 mAb、v10000及連接體-毒素001之抗體-藥物結合物(ADC)。經由用於還原該抗體之TCEP之量的變化，可獲得具有0與6之間之平均藥物:抗體比率之ADC。ADC經純化以移除污染物小分子且經表徵以證明DAR、純度、單體含量、內毒素水準及與抗原陽性腫瘤細胞之結合。
v10000之製備描述於國際專利申請公開案第WO 2015/077891號中。此抗體之詳情提供於下表9中。序列提供於序列表中。表 9 * 根據Kabat之Fab或可變域編號(Kabat等人, Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, US Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號, 第647頁, 1991) § 根據EU指數之CH3編號，如在Kabat中(Edelman等人, 1969, PNAS USA, 63:78-85) 2.1 藉由鏈間二硫鍵之部分還原實現的抗 HER2 抗體之結合 (v17597 ； DAR 3.9)
藉由添加新鮮製備之200 mM Na2 HPO4 (pH 8.9) (15.4 mL)、5 mM DTPA溶液(39.5 mL於PBS中，pH 7.4)及10 mM TCEP溶液(3.68 mL，2.3 eq.)的混合物來還原抗體v10000 (2.0 g)於10 mM乙酸鈉、9% (w/v)蔗糖(pH 4.5)中之溶液(138.9 mL)。在37℃下90分鐘之後，該反應在冰上冷卻，接著添加來自20 mM DMSO儲備溶液之過量連接體-毒素001 (6.41 mL；8 eq)。90分鐘之後，藉由添加過量20 mMN -乙醯基半胱胺酸溶液(4.81 mL；6 eq.)來淬滅該結合反應。 2.2 藉由鏈間二硫鍵之部分還原實現的抗 HER2 抗體之結合 (v21252 ； DAR 2.1)
藉由添加200 mM Na2 HPO4 (pH 8.9) (15.4 mL)對抗體v10000 (2.0 g)於10 mM乙酸鈉、9% (w/v)蔗糖(pH 4.5)中之溶液(138.9 mL)進行pH調節。在添加DTPA溶液(44 mL於PBS中，pH 7.4，最終濃度1.0 mM)之後，藉由添加10 mM TCEP水溶液(1.68 mL，1.05 eq.)來起始鏈間二硫化物之還原。在37℃下90分鐘之後，該反應在冰上冷卻，接著添加來自20 mM DMSO儲備溶液之過量連接體-毒素001 (4.81 mL；6 eq)。90分鐘之後，藉由添加過量20 mMN -乙醯基半胱胺酸溶液(4.81 mL；6 eq.)來淬滅該結合反應。 2.3 純化抗體藥物結合物 v17597 及 v21252
經淬滅抗體藥物結合物(ADC)溶液在使用Pellicon® XL超濾模塊(Ultracel® 30 kDa 0.005 m2 ; Millipore Sigma)之Millipore Labscale™切向流過濾儀器上用9-15置換體積之10 mM乙酸鈉、9% (w/v)蔗糖(pH 4.5)純化。對經溶離ADC進行無菌過濾(0.22 um)。小規模產生之ADC經用PBS或10 mM乙酸鈉、9% (w/v)蔗糖(pH 4.5)預處理之40 KDa MWCO Zeba™管柱(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)純化。
在純化之後，藉由BCA分析參考自v10000產生之標準曲線測定ADC之濃度。或者，藉由量測在280 nm下之吸收(ε = 195065 M-1 cm-1 )來估算濃度。
藉由非還原及還原SDS-PAGE評估ADC之樣品(參見圖1)。未觀察到外來色帶。 2.4 疏水性相互作用層析
藉由疏水性相互作用層析(HIC)來分析抗體及ADC以估算藥物:抗體比率(DAR)。在以1 mL/min之流動速率經13.5分鐘時期使用80% MPA/20% MPB至35% MPA/65% MPB梯度之Proteomix® HIC Ethyl管柱(7.8×50 mm, 5 µm) (Sepax Technologies Inc., Newark, DE)上執行層析(MPA = 1.5 M (NH4 )2 SO4 、25 mM Nax PO4 ，且MPB = 75% 25 mM Nax PO4 、25%異丙醇)。
ADC之平均藥物:抗體比率(DAR)可視在抗體還原期間所釋放之二硫鍵的數目而變化。產生具有特定平均DAR之ADC的單一結合反應包含物質之混合物。關於v17597及v21252，產生四種物質之混合物：未結合抗體、DAR為2之ADC、DAR為4之ADC及DAR為6之ADC。
HIC之結果顯示於圖2中且顯示出v17597具有平均DAR 3.92 (圖2A)，且v21252具有平均DAR 2.07 (圖2B)。
DAR0、DAR2、DAR4及DAR6物質對經純化ADC之平均DAR之個別作用藉由HPLC-HIC層析圖的整合來評估。HIC層析圖中之各峰藉由製備型層析來分離且峰之強度藉由LC-MS來驗證。針對各變異體之個別DAR物質之%含量(如藉由HIC所測定)顯示於表10中及圖2D中。如自表10及圖2D可見，v17597含有顯著多於v21252之DAR6物質，且v21252含有顯著多於v17597之DAR0物質。
圖2E說明了v10000-連接體毒素001內之DAR 0、2、4及6物質的相對量針對具有介於0.5至6範圍內之平均DAR值的一系列ADC製劑之改變。表 10 ：針對 v17597 及 v21252 之 DAR 分佈 2.5 尺寸排阻層析
抗體及ADC之聚集程度(約15 ug，5 uL注射體積)在使用由150 mM磷酸鹽(pH 6.8)組成之移動相及400 uL/min之流動速率的ACQUITY UPLC® Protein BEH SEC管柱(200埃，1.7 µm，4.6×150 mm) (Waters Corporation, Milford, MA)上藉由尺寸排阻層析(SEC)來評估。藉由在280 nm下之吸光度進行偵測。
結果顯示於圖3中且概述於表11中。藉由SEC分析發現mAb v10000為高度單體的。在結合於連接體-毒素001時未觀察到聚集之顯著增加。v21252及v17597之比較指示出聚集程度未受DAR自2增加至4影響。表 11 ： SEC 結果之概述 2.6 藉由 LC-MS-MS 定量游離毒素及連接體 - 毒素
ADC調配物中之游離毒素(化合物9 )、連接體-毒素001及經淬滅藥物連接體N -乙醯基半胱胺酸-連接體-毒素001的殘餘濃度藉由液相層析(LC)分離及質量偵測，參考針對各分析物之標準曲線來評估。在使用0.4 mL/min之流動速率、30℃管柱溫度及經7.8分鐘75% MPA/25% MPB至60% MPA/40% MPB之梯度(MPA = 0.1%甲酸水溶液，且MPB =含0.1%甲酸之乙腈)的PolymerX™ RP-1管柱(3 µm，100埃，50× 4 mm) (Phenomenex Inc., Torrance, CA)上執行分離。在Agilent 6470三重四極質譜儀(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)上實現陽性模式ESI-MRM質量偵測。
相對於全部結合有效載荷，所有樣品均含有＜ 0.1 mol%分析物。 2.7 對抗原陽性細胞進行之流式細胞術結合分析
藉由流式細胞術使ADC與抗原陽性腫瘤細胞株JIMT-1 (乳癌，Addexbio Technologies, San Diego, CA)及RT-112/84 (膀胱癌，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)之結合與親本抗體(v10000)結合進行比較。細胞根據供應商說明書進行培養。簡言之，細胞(50,000個細胞/孔)在冰上用抗體或ADC連續稀釋液培育持續90分鐘。在此培育之後，細胞洗滌兩次且接著在冰上用AlexaFluor® 647結合之抗hIgG (Jackson ImmunoResearch Inc., Westgrove, PA)第二試劑培育持續60分鐘。細胞接著洗滌兩次且藉由流式細胞術(LSRFortessa™ X-20流式細胞儀，BD, San Jose, CA)分析螢光。
結果顯示於圖4中且證明了v17597及v21252與抗原陽性細胞之結合不受與毒素之結合影響，其中兩種ADC顯示與親本抗體v10000相似之結合。 2.8 內毒素測試
使用具有0.125 EU/mL閾值之鱟阿米巴樣細胞溶解產物(Limulus Amebocyte Lysate；LAL)膠凝終點分析(Genscript ToxinSensor™單一測試套組；GenScript, Piscataway, NJ)來評估經調配ADC之內毒素水準。用於活體內實驗(以下)之所有ADC均低於5個內毒素單位/公斤體重給藥。實例 3 ：雙互補位 ADC 之活體外活性
在抗原陽性腫瘤細胞BT-474 (導管癌，ATCC, Manassas, VA (HTB-20))、SK-BR-3 (乳癌，ATCC, Manassas, VA (HTB-30))、HCC-1954 (乳癌，ATCC (CRL-2338))、JIMT-1 (乳癌，Addexbio Technologies, San Diego, CA, (C0006005))、ZR-75-1 (乳癌，ATCC (CRL-1500))及抗原陰性腫瘤細胞MDA-MB-468 (乳癌，Addexbio Technologies (C0006003))上藉由細胞增生分析來量測v17597及v21252之活體外效能。細胞根據供應商說明書進行培養。簡言之，在添加ADC之前一天，細胞(50 uL/孔，1000個細胞/孔)添加至無菌、經組織培養物(TC)處理、384孔板(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)中且在37℃/5% CO2 下培育隔夜以允許細胞黏附於板表面。在無菌、U型底、96孔板中，ADC以所需最終最大濃度之4.3倍稀釋於完全生長培養基中且1:3滴定於相同培養基中，產生10點劑量反應滴定。不具有ADC之對照孔(單獨生長培養基)包括於各微量滴定96孔板上。來自10點劑量反應滴定之15 uL添加至384孔板中含有接種之細胞的各孔中，一式三份，且板在37℃/5% CO2 下培育持續5晚。在5晚培育之後，藉由添加20 uL/孔之CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI)且在室溫下培育持續30 min來定量細胞活力。使用微板光度計量測發光。使用上文所提及之單獨生長培養基對照物將所收集之相對光單位(RLU)轉化為%細胞毒性(%細胞毒性= 1− [孔RLU/平均單獨培養基對照物RLU])。使用可用Prism® 軟體(GraphPad Software, La Jolla, CA)獲得之非線性迴歸方法將數據擬合為曲線。
結果顯示於圖5中且概述於表12中。結果顯示v17597及v21252均證明選擇性細胞殺死。HER2表現細胞株BT-474、SK-BR-3、HCC1954、JIMT-1及ZR-75-1 (圖5A-E)對v17597及v21252兩者敏感。v17597及v21252均對於抵抗MDA-MB-468細胞無效(圖5F)，該等細胞來自HER2陰性乳癌細胞株。表 12 ： v17597 及 v21252 之活體外活性 實例 4 ： 在不同平均 DAR 下 v10000- 連接體 - 毒素 001 之活體外增生分析
藉由改變用於還原反應之TCEP的量(0.5至10莫耳當量)來製備具有介於0.7至3.9範圍內之平均DAR的包含結合於連接體-毒素001之v10000的ADC。根據概述於實例2中之程序進行結合反應且所得ADC使用以PBS pH 7.4預平衡之40 kDa Zeba™管柱純化。
在抗原陽性腫瘤細胞SK-OV-3 (卵巢癌，ATCC, Manassas, VA (HTB-77))、JIMT-1 (乳癌，DSMZ, Braunschweig, Germany (ACC 589))及ZR-75-1 (乳癌，ATCC (CRL-1500))上藉由細胞增生分析來量測ADC之活體外效能。細胞根據供應商說明書進行培養。簡言之，在添加ADC之前一天，細胞(100 uL/孔，2500個細胞/孔)添加至無菌、經TC處理、96孔不透明壁板(Corning 3904)中且在37℃/5% CO2 下培育隔夜以允許細胞黏附於板表面。次日，ADC以所需最終最大濃度之5倍稀釋於完全生長培養基(96孔U型底板)中且1:3滴定於相同培養基中，八個步驟(總計9個化合物滴定點)。亦包括含有單獨生長培養基之對照滴定點，產生總計10點劑量反應滴定。來自10點劑量反應滴定之25 uL添加至96孔板中含有接種之細胞的各孔中，一式三份，且板在37℃/5% CO2 下培育持續5晚。在培育之後，藉由添加25 uL/孔之CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI)且在室溫下培育持續30 min來定量細胞活力。接著使用微板光度計量測發光且如實例3中所述將所收集之相對光單位(RLU)轉化為%細胞毒性。
結果顯示於圖6中。具有在3.9與1.6之間之平均DAR的ADC在三種細胞株中顯示可相當效能，然而，具有平均DAR0.7之ADC顯示效能之顯著減少。構成DAR0.7、DAR2.2及DAR3.9 ADC之個別DAR物質的近似量顯示於表13及圖6D中。可見，DAR0.7 ADC含有大約為DAR1.9 ADC三倍多之DAR0物質(大約65%對大約20%)。DAR2.2 ADC又含有顯著多於DAR3.9物質之DAR0物質(大約20%對＜3%)，然而，DAR2.2 ADC顯示與DAR3.9 ADC可相當之活體外效能。此等結果表明，在ADC之效能受影響之前，關於ADC製劑可含有之DAR0物質的比例可存在閾值。表 13 ：針對 ADC 之近似 DAR 分佈 實例 5 ： 雙互補位 ADC 內化至 HER2 表現細胞中
為了測定v21252之內化，根據製造商之推薦方案使pHAb染料(Promega Corporation, Madison, WI)偶合至v21252、曲妥珠單抗-連接體-毒素001及陰性對照ADC之胺殘基。該陰性對照ADC為結合於連接體-毒素001之抗RSV蛋白F抗體。
pHAb結合之抗體可用於監測受體介導之抗體內化。與結合於細胞膜上之抗原的pHAb染料結合之抗體展現最小螢光，但在受體介導之內化及通過內體及溶酶體系統的轉運之後，抗體-pHAb結合物暴露於更具酸性pH，從而使抗體-pHAb結合物發螢光。
pHAb結合之v21252、pHAb結合之曲妥珠單抗-連接體-毒素001及pHAb結合之對照物用HER2表現細胞株SKBR3及JIMT-1培育。簡言之，SKBR3及JIMT-1 HER2+腫瘤細胞在分析培養基中以5,000個細胞/孔接種於384孔黑色光學底板(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)中。該板在37℃+ 5% CO2 下培育隔夜。次日，pHAb結合之抗體在分析培養基中以最終10 ug/ml及1 ug/mL添加至板中。添加2 uM最終濃度之含有Vybrant® DyeCycle™ Violet染色劑(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)之培養基以使細胞核顯現。該板在37℃+ 5% CO2下在時間點之間培育。在CellInsight™ CX5高內涵篩選(HCS)平台(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)上在多個時間點掃描樣品孔。在具有2個通道之SpotAnalysis Bioapplication上使用20x物鏡掃描該板。通道1 (385 nm，Vybrant Dye Cycle Violet)用作聚焦通道且通道2 (560 nm，pHAb)用於獲得內化數據。經內化pHAb結合之抗體的螢光使用參數「平均總斑點強度」來量度。
結果顯示於圖13及14中且顯示出v21252內化且轉運至HER2表現細胞中之溶酶體中至大於單特異性曲妥珠單抗-連接體-毒素001之水準。實例 6 ：雙互補位 ADC 之活體內活性 6.1 ADC v17597 及 v21252 抑制 HBCx-13b 乳癌患者源性異種移植物生長
雌性無胸腺小鼠(Envigo, Huntingdon, UK)經皮下植入20 mm3 腫瘤片段(每組n=7)。一旦腫瘤尺寸達到75至200 mm3 ，動物經指派治療組且如圖7所指示在第1天及第15天(q14d ×2)藉由靜脈內注射給予v17597、v21252或媒劑持續總計2個劑量。兩週一次用測徑規執行腫瘤量測。當腫瘤達到1764 mm3 尺寸時，對小鼠進行安樂死。腫瘤體積針對各組經報告為平均值± SEM。
圖7A提供了在i.v.投與媒劑或v17597之後經皮下植入HBCx-13b腫瘤片段之小鼠中的腫瘤反應之結果。圖7B提供了在i.v.投與媒劑或v21252之後經皮下植入HBCx-13b腫瘤片段之小鼠中的腫瘤反應之結果。此等結果顯示出，用v17597或v21252治療HBCx-13b移植小鼠會以劑量依賴性方式引起腫瘤體積降低。 6.2 ADC v17597 及 v21252 抑制 ST-910 乳癌患者源性異種移植物生長
雌性無胸腺裸小鼠(Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA)經皮下植入約70 mg腫瘤片段(每組n=6)。一旦腫瘤尺寸達到125至250 mm3 ，動物經指派治療組且如圖8所指示藉由靜脈內單一注射給予v17597、v21252或媒劑。兩週一次用數位測徑規執行腫瘤量測。當腫瘤達到2000 mm3 尺寸時，對小鼠進行安樂死。腫瘤體積針對各組經報告為平均值± SEM。
圖8A提供了在i.v.投與媒劑或v17597之後經皮下植入ST-910腫瘤片段之小鼠中的腫瘤反應之結果。圖8B提供了在i.v.投與媒劑或v21252之後經皮下植入ST-910腫瘤片段之小鼠中的腫瘤反應之結果。此等結果顯示出，用v17597或v21252治療ST-910移植小鼠會以劑量依賴性方式引起腫瘤體積降低。
ST-910為表示HER2 1+乳癌之患者源性異種移植物(PDX)，而HBCx-13b (用於實例6.1)為表示HER2 3+乳癌之PDX。實例6.1及6.2因此證明了v17597及v21252在HER2 3+及HER2 1+腫瘤中均具活性。 6.3 藥物動力學分析
關於患者源性異種移植物HBCx-13b及ST-910，在預規定時間點處收集針對總抗體(未結合及結合抗體)之藥物動力學樣品且使用基於ELISA之分析來評估總抗體定量。藉由首先用PBS pH 7.4中之山羊抗人類IgG Fc抗體(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)塗佈384孔ELISA板且在4℃下培育隔夜來分析針對v21252或v17597之總抗體之血清濃度。次日，洗滌板且使用分析稀釋劑阻斷且在RT下培育持續1 h。在阻斷之後，標準曲線樣品、對照物及經稀釋血清樣品添加至板中且在RT下培育持續1 h。偵測抗體HRP-山羊抗人類IgG F(ab')2 結合物(Jackson ImmunoResearch)接著添加至板中且在RT下培育1-h之後，HRP受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)添加至板中。使用HCl淬滅TMB且使用板式讀取器在450 nm下量測吸光度。圖15顯示針對HBCx-13b (A )及ST-910 (B )之總抗體血清濃度-時間型態。實例 7 ：食蟹獼猴中 v17597 及 v21252 之單一劑量藥物動力學 / 耐受性研究
此研究之目標係表徵在單一靜脈內(IV)輸注投與之後食蟹獼猴中v17597及v21252之藥物動力學(PK)及耐受性。基於序列同源性及結合親和力選擇食蟹獼猴用於v17597及v21252兩者之非臨床安全性評估。人類及食蟹獼猴HER2共享98%序列同源性，而針對犬及小鼠/大鼠HER2之序列同源性分別為93%及88%。另外，v17597及v21252以與人類HER2相似之親和力結合於食蟹獼猴HER2 (猴KD = 0.55×10-9 ；人類KD = 0.83×10-9 )且不結合於犬、小鼠或大鼠HER2。
該研究證明了在3、6或9 mg/kg劑量下之單一劑量v17597經充分耐受，且在9或12 mg/kg劑量下之單一劑量v21252經充分耐受。 材料及方法 耐受性
在雌性食蟹獼猴(N=3)中藉由IV輸注經60分鐘投與單一劑量之v17597 (3、6或9 mg/kg)或v21252 (9 mg/kg或12 mg/kg)。一般耐受性用臨床觀察結果、體重、食物消耗及臨床病理學(血液學及臨床化學)評估。在該研究中收集血液用於v17597或v21252、總抗體及游離毒素(化合物9 )之生物分析。研究設計概述於表14中。表 14 ： 食蟹獼猴中單一劑量藥物動力學及一般耐受性研究之設計 生物分析方法
v17597 及 v21252 ： v17597或v21252 (1或更大DAR)之血清濃度使用電化學發光分析用Meso Scale Discovery平台(ECL/MSD) (Meso Scale Diagnostics, LLC, Rockville, MD)來分析，其中抗毒素小鼠IgG作為捕捉劑且抗帕妥珠單抗磺基-TAG作為偵測劑。
總抗體： 總抗體生物分析量測抗體組分v17597或v21252，無論該抗體組分是否與毒素結合(在所有DAR下)。總抗體之血清濃度使用電化學發光分析用Meso Scale Discovery平台(ECL/MSD)來分析，其中抗帕妥珠單抗抗體作為捕捉劑且抗曲妥珠單抗磺基-TAG作為偵測劑。
毒素 ( 化合物 9) ： 毒素之血清濃度使用LC-MS/MS方法來分析。血清樣品用乙腈/甲醇(50:50，v/v)沉澱且分析上清液。所用之液相層析系統為具有由水/乙酸(100/0.05，v/v)及乙腈組成之梯度流的逆相管柱。毒素及內部標準(毒素-d4；氘化化合物9 )使用配備有以正離子模式操作之電噴霧電離(ESI)來源的三重四極質譜儀系統來偵測。藥物動力學分析
使用血清樣品生物分析結果之非房室分析來推導PK參數(最大血清濃度[Cmax ]、終末半衰期[T1/2 ]、清除[CL]及表觀分佈體積[Vss ])。 結果 藥物動力學
v17597 ： v17597暴露在3至9 mg/kg之間一般與劑量成比例。Cmax 在60-分鐘輸注結束時實現(中值Tmax)且以劑量比例方式增加。全身性暴露(AUC0-∞ )略微大於劑量比例方式增加。初步平均終末半衰期(T1/2 )一般看來隨增加之劑量增加，清除(CL)一般看來隨增加之劑量減少且表觀分佈體積(Vss)一般不會看來隨劑量改變。
v21252 ： v21252暴露在9至12 mg/kg之間一般與劑量成比例。Cmax 在60-分鐘輸注結束時實現(中值Tmax)且以劑量比例方式增加。v21252血清濃度-時間型態顯示於圖9A中。全身性暴露(AUC0-∞ )略微大於劑量比例方式增加。初步平均終末半衰期(T1/2 )、清除(CL)及表觀分佈體積(Vss)一般不會看來隨劑量改變。
總抗體 ( 結合及未結合 ) ： 總抗體之最大血清濃度(Cmax )在60-分鐘輸注結束時實現(中值Tmax )。v21252之總抗體血清濃度-時間型態顯示於圖9B中。使用非房室模型來推導PK參數。Cmax 以劑量比例方式增加，而AUC0-∞ 針對v17597及v21252兩者略微大於劑量比例方式增加。v17597之平均終末半衰期隨增加之劑量增加，而總抗體的血清清除(CL)及總表觀分佈體積(Vss)隨增加之劑量減少。v21252之平均終末半衰期及總表觀分佈體積(Vss)隨增加之劑量增加，而總抗體的血清清除(CL)隨增加之劑量減少。
毒素 ( 化合物 9) ： 在投與單一劑量之v17597 (3、6或9 mg/kg)或v21252 (9 mg/kg或12 mg/kg)之後，所有毒素血清濃度均低於定量下限(LLOQ，＜ 5.00 ng/mL)。耐受性
單一劑量v17597 (3、6或9 mg/kg)或在9或12 mg/kg劑量下之v21252經充分耐受。在研究過程期間無死亡率。在臨床觀察結果、食物消耗或體重方面未注意到治療相關效應。
在一些動物中觀察到臨床病理學參數之最小至輕微改變，其被視為治療相關。在任何治療組中之血液學終點中均無測試物件相關效應。所有波動均被視為在生物學及/或程序相關波動之預期範圍內，即使個別值之中存在任何表觀差異。實例 8 ：食蟹獼猴中 v17597 之非 GLP 毒性研究
進行非GLP毒性研究以調查食蟹獼猴中v17597之毒物動力學及毒性。該研究基於來自雌性食蟹獼猴中之單一劑量藥物動力學/耐受性研究(實例6)之結果進行設計。
該研究證明了每週一次2.25及4.5 mg/kg劑量及兩週一次4.5及9 mg/kg劑量之v17597的投與在雄性及雌性食蟹獼猴中未經充分耐受。在每週一次或兩週一次投與持續長達6週之後針對v17597之無不良效應水準(NOAEL)及最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)被視為小於每週一次投與之2.25 mg/kg或兩週一次投與之4.5 mg/kg。 材料及方法
媒劑或v17597在第1、8、15、22、29及36天以劑量0、2.25及4.5 mg/kg每週一次藉由1-h IV輸注投與，且在第1、15及29天以4.5及9 mg/kg劑量每隔一週投與一次。評估所有動物之臨床病徵、食物消耗、體重、血壓、ECG、呼吸率(視覺)、臨床病理學(血液學、臨床化學、凝固、尿分析)、器官重量及組織宏觀/微觀檢查之改變。收集血液用於毒物動力學分析及抗-藥物抗體(ADA)分析。每週一次給藥之動物在第42天終止且每隔一週給藥之動物在第36天終止。研究設計呈遞於表15中。表 15 ：研究設計 結果
基於體重、臨床觀察結果及臨床病理學發現，v17597被視為在此研究中測試之所有劑量下均不良。在9 mg/kg/劑量(兩週一次)下之動物及在4.5 mg/kg/劑量(兩週一次)下之一只雌性在早期終止且僅在第1及15天接受劑量。
基於此研究之結果，在每週一次或兩週一次投與持續長達6週之後針對v17597之無不良效應水準(NOAEL)及最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)被視為小於每週一次投與之2.25 mg/kg或兩週一次投與之4.5 mg/kg。實例 9 ：食蟹獼猴中 v21252 之非 GLP 毒性研究
此研究之目標係進一步表徵v21252之毒物動力學及毒性。
該研究證明了在第1、15及29天以高達12 mg/kg之劑量投與之v21252在雄性及雌性食蟹獼猴中在臨床上經充分耐受。未觀察到不良事件水準(NOAEL)為12 mg/kg且最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)大於12 mg/kg。 材料及方法
在此研究中，媒劑或v21252在第1、15及29天以0、9及12 mg/kg之劑量每隔一週藉由1-h IV輸注投與至雄性及雌性食蟹獼猴一次(在各劑量水準下，每種性別3只動物)。評估所有動物之臨床病徵、食物消耗、體重、血壓、ECG、呼吸率(視覺)、臨床病理學(血液學、臨床化學、凝固、尿分析)、器官重量及組織宏觀/微觀檢查之改變。收集血液用於毒物動力學(TK)分析(v21252、總抗體及游離毒素(化合物9 ))及抗-藥物抗體(ADA)分析，且該等動物在第36天終止。另一組動物在第1天投與單一劑量12 mg/kg v21252且在給藥後4、8及15天終止(每個時間點n=2)。研究設計呈遞於表16中。表 16 ：非 GLP 毒性研究設計 結果 藥物動力學
v21252 ： 在重複投與v21252之後計算藥物動力學。Cmax 在60-分鐘輸注結束時或在輸注結束之後60分鐘實現(中值Tmax )。v21252血清濃度-時間型態顯示於圖10中。在第1天，Cmax 及全身性暴露(AUC0-168h )略微大於劑量比例方式增加。在第29天，Cmax 及AUC0-168h 以近似劑量比例方式增加。全身性暴露及AUC0-168h 看來不會改變且在重複投與之後未顯示積聚。平均消除半衰期(T1/2 )自9 mg/kg組至12 mg/kg組增加。針對v21252之可飽和清除機制可說明低(9 mg/kg)與高(12 mg/kg)劑量組之間的T1/2 及清除差異。
總抗體 ( 結合及未結合 ) ： 總抗體在重複投與v21252之後在食蟹獼猴中量測。針對總抗體之Cmax 在60-分鐘輸注結束時實現(中值Tmax )。總抗體血清濃度-時間型態顯示於圖11中。在第1天，Cmax 及全身性暴露(AUC0-168h )略微大於劑量比例方式增加。在第29天，Cmax 及AUC0-168h 以近似劑量比例方式增加。全身性暴露AUC0-168h 未改變且在重複投與之後未顯示積聚。與v21252相似，針對總抗體之平均消除半衰期(T1/2 )自9 mg/kg組至12 mg/kg組增加。
如藉由v21252及總抗體之血清濃度-時間型態所指示的v21252之藥物動力學可指示活體內v21252之最小連接體-毒素損失(參見圖12)。
毒素 ( 化合物 9) ： 游離毒素在重複投與v21252之後在食蟹獼猴中量測。所有有效載荷(化合物9 )血清濃度均低於定量極限(＜ 0.500 ng/mL)，其中例外為在第1天在12 mg/kg下之一只雌性、在第29天在9 mg/kg下之一只雌性及在第29天在12 mg/kg下之一只雄性。
抗 - 藥物抗體 (ADA) ： 抗v21252抗體在重複投與v21252之後在食蟹獼猴中經篩選。ADA在9 mg/kg給藥群中之單一雌性的血清中經偵測。毒性
總之，v21252之投與在所有測試之劑量下均在臨床上經充分耐受。未觀察到尿分析、ECG參數或呼吸率之治療相關改變。
在接受12 mg/kg/劑量之v21252的重複投與之動物中注意到對個體體重之偶發、最小影響。此等動物截至第35天均部分地或完全地恢復。所有其他動物在該研究中維持或增加重量。
在一些動物中觀察到臨床病徵、臨床病理學、器官重量或組織宏觀/微觀檢查之最小至輕微改變。被視為與v21252相關之宏觀觀察結果限於在包括對照物之所有動物中之輸注位點處觀察到的變紅。測試物件相關器官重量改變限於脾。在3個兩週一次劑量之後在第36天終止之動物中，微觀治療相關效應包括胃腸道、脾、淋巴結、胰臟、皮膚及IV輸注位點之改變。均經分類為最小或輕微。在12 mg/kg之單一劑量之後的多個時間處終止之動物中，觀察到相似的最小至輕微測試物件相關效應。
PK分析確認了經v21252治療動物中之全身性暴露且針對v21252及總抗體之平均全身性暴露以劑量比例方式隨增加之劑量增加，而暴露於游離毒素(化合物9 )僅在數隻動物中以低水準可見。
表17-20顯示了針對v17597及v21252之PK/耐受性研究及非GLP重複劑量研究之結果的比較。表 17 ：食蟹獼猴中針對 v17597 及 v21252 之單一劑量及重複劑量研究中觀察到的死亡率之比較 表 18 ： 食蟹獼猴中針對 v17597 及 v21252 之重複劑量研究中測定的 NOAEL 及 HNSTD 之比較 表 19 ： ADC 生物分析 # 在4.5 mg/kg下與v17597相比表 20 ：總抗體生物分析 # 在4.5 mg/kg下與v17597相比 結論
當投與至小鼠時，通式(I )之澳瑞他汀類似物已顯示具有良好活體內耐受性。在平均DAR4下化合物9 結合於單特異性抗HER2抗體曲妥珠單抗會產生如下ADC，該ADC在食蟹獼猴中以18 mg/kg之最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)顯示極佳耐受性。相比之下，包含在平均DAR4下結合於抗HER2雙互補位抗體v10000之化合物9 的ADC (v17597)以小於4.5 mg/kg之HNSTD顯示極大減少之耐受性(實例8)。不限於任何特定理論，主張針對v17597觀察到的減少之耐受性可部分地歸因於與單特異性曲妥珠單抗相比該雙互補位抗體之增加之中靶結合及內化，導致與增加與較高DAR物質(DAR2、DAR4及DAR6)相關的毒性之平均DAR2 (v21252)相比在平均DAR4 (v17597)中減少比例之DAR0或裸物質，及/或與增加與最高DAR物質相關的毒性之平均DAR2相比在平均DAR4中增加比例之DAR6物質。
然而，意外的是，包含在平均DAR2下結合於v10000之化合物9的ADC (v21252)以12 mg/kg之HNSTD顯示極大改良之耐受性(實例9)。此結果為意外的，因為先前已顯示包含單甲基澳瑞他汀E (MMAE)或美登素類之ADC的毒性與附接於抗體之藥物的總量相關，亦即DAR與最大耐受劑量之間的關係對於ADC而言為線性的(Hamblett等人, Clin. Cancer Res., 10:7063-7070 (2004)；Sun等人, Bioconj Chem., 28:1371-81 (2017))。特定言之，每個抗體具有8個藥物分子之ADC的最大耐受劑量為50 mg/kg，且每個抗體具有4個藥物分子(亦即，毒素之量的一半)之ADC的最大耐受劑量為100 mg/kg (Hamblett等人, 同上)。亦即，當以相同抗體劑量投與時，具有DAR8 ADC之毒素之量的一半之ADC顯示如下MTD，其為DAR8 ADC之MTD的兩倍。
v21252具有DAR 2且因此當以相同抗體劑量投與時，具有v17597之毒素之量的一半。基於使用v17597之先前研究，因此預期將耐受之v21252的量小於9 mg/kg (亦即，針對v17597所耐受之最大劑量的2倍)。然而，如實例9所示，針對三種劑量每隔兩週以9或12 mg/kg之劑量投與至食蟹獼猴之v21252經耐受且12 mg/kg經指定為未觀察到不良事件水準(NOAEL)。
重要的是，應注意當兩週一次給藥時，與v17597相比，v21252具有較少毒性及較大耐受性，即使其具有較大暴露。基於食蟹獼猴中之非GLP毒物學研究(實例8)，v17597被視為在兩種兩週一次劑量4.5及9 mg/kg下具有不良發現。然而，在相似非GLP研究(實例9)中，v21252未被視為在兩週一次劑量9 mg/kg及12 mg/kg兩者下具有不良發現，即使與4.5 mg/kg v17597相比具有大約1.8至4.6倍暴露增加(在第一劑量之後的AUC0-336h 或AUC0-168h 最後一次劑量) (概述於表19及20中)。
另外，v21252以在食蟹獼猴中顯示經耐受之暴露水準證明了活體內功效。特定言之，在高HER2及低HER2腫瘤之患者源性異種移植物模型中在食蟹獼猴中經耐受之暴露下實現完全反應，如圖15中所概述(亦參見實例6)。實例 10 ：食蟹獼猴中 v21252 之 GLP 毒性研究
在後續GLP毒性研究中，v21252針對4種劑量每隔兩週以0、6、12及18 mg/kg投與至食蟹獼猴，具有6週恢復期。最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)經測定為18 mg/kg。v21252在所有劑量下均經充分耐受。在此GLP研究中，臨床觀察結果均未被視為不良且未觀察到死亡率。唯一一致之臨床觀察結果為增加之腹瀉。在所有劑量下均未觀察到體重改變且臨床病理學發現(肝功能-天冬胺酸轉胺酶及丙胺酸轉胺酶，及血液學-嗜中性粒細胞、血小板、血紅素及淋巴細胞)均未被視為不良。v21252之暴露(Cmax 及AUC0-168h )實際上與v10000 (單獨抗體)之暴露一致。該研究之詳情提供於下文中。
此GLP研究之目標係進一步表徵4次經靜脈內投與至食蟹獼猴之v21252之毒物動力學及毒性。
在該GLP毒性研究中，v21252在第1、15、29及43天以0、6、12及18 mg/kg之劑量投與至雄性及雌性食蟹獼猴，具有6週恢復期。未觀察到不良事件水準(NOAEL)為12 mg/kg且最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)為18 mg/kg。 材料及方法
在此研究中，媒劑或v21252在第1、15、29及43天以0、6、12及18 mg/kg之劑量每隔一週藉由1-h IV輸注投與至雄性及雌性食蟹獼猴一次(在各劑量水準下，每種性別4只動物，且在用於恢復評估之0、12及18 mg/kg下，每種性別額外2只動物)。評估所有動物之臨床病徵、食物消耗、體重、血壓、ECG、呼吸率(視覺)、臨床病理學(血液學、臨床化學、凝固、尿分析)、器官重量及組織宏觀/微觀檢查之改變。收集血液用於毒物動力學(TK)分析(v21252、總抗體及游離毒素(化合物9 ))及抗-藥物抗體(ADA)分析，且該等動物在第50天且在6週恢復之後在第92天終止。研究設計呈遞於表21中。表 21 ： GLP 毒性研究設計 結果 藥物動力學
v21252 ： 在第1及43天截至輸注開始(SOI)之後1 h觀察到中值峰值v21252血清濃度。在兩週一次投與v21252之後，針對v21252之平均Cmax 及AUC值隨增加之劑量增加。Cmax 增加在第1天近似與劑量成比例。在第1天，v21252劑量之1:2:3倍增加導致Cmax 值之近似1:2.3:3.3倍增加、平均AUC0-168h 值之近似1:2.6:3.8倍增加及AUC0-336h 值之近似1:2.9:4.5倍增加。在第43天，Cmax 及AUC0-168h 近似與劑量成比例。在第43天，v21252劑量之1:2:3倍增加導致Cmax 值之近似1:2.5:3.5倍增加及AUC0-168h 值之近似1:3.2:4.7倍增加。全身性暴露於v21252看來不會在以6 mg/kg重複兩週一次IV輸注之後發生改變，然而，該暴露一般看來會在以12及18 mg/kg重複兩週一次IV輸注之後增加。平均AUC0-168h 積聚比率在6、12及18 mg/kg下分別為1.20、1.47及1.50。個別AUC0-168h 積聚比率在6 mg/kg下介於1.01至1.64範圍內，在12 mg/kg下介於1.17至1.95範圍內，且在18 mg/kg下介於0.983至2.08範圍內。
總抗體 ( 結合及未結合 ) ： 在第1及43天截至v21252 SOI之後1 h觀察到中值峰值總抗體血清濃度。在兩週一次投與v21252之後，針對總抗體之平均Cmax 及AUC0-168h 值隨增加之劑量增加。在第1天，v21252劑量之1:2:3倍增加導致Cmax 值之近似1:2.1:3.3倍增加、AUC0-168h 值之近似1:2.4:3.8倍增加及平均AUC0-336h 值之近似1:2.8:4.5倍增加。在第43天，v21252劑量之1:2:3倍增加導致Cmax 值之近似1:2.6:3.9倍增加及AUC0-168h 值之近似1:3.1:4.8倍增加。全身性暴露於總抗體看來不會在以6 mg/kg重複兩週一次IV輸注v21252之後發生改變，然而，看來會在以12及18 mg/kg重複兩週一次IV輸注v21252之後增加。平均AUC0-168h 積聚比率在6、12及18 mg/kg下分別為1.20、1.47及1.50。
毒素 ( 化合物 9) ： 游離毒素在重複投與v21252之後經量測。大多數毒素(化合物9 )血清濃度低於定量極限(＜ 0.500 ng/mL)。注意到以下例外：在第43天在12 mg/kg下之一只雌性具有單一可定量毒素(化合物9 )濃度(在給藥後72 h為0.513 ng/ml)；在第29天在18 mg/kg下之一只雄性具有單一可定量毒素(化合物9 )濃度(在SOI之後1 h為0.532 ng/mL)；在第43天在18 mg/kg下之兩隻雄性及兩隻雌性具有單一可定量毒素(化合物9 )濃度(在SOI之後24 h分別為0.555、0.505、0.556及0.653 ng/mL)；且在第43天在18 mg/kg下之一只雄性具有四個連續可定量毒素(化合物9 )濃度，其中AUC0-168h 值為125 h*ng/mL。
抗 - 藥物抗體 (ADA) ： 針對ADA篩選來自所有給藥群之總計144個樣品。七個樣品在確認/免疫耗盡分析中經確認為陽性，包括一隻對照動物及來自經治療動物之預測試樣品。這後兩種樣品被視為歸因於預存在之反應性抗體且不與v21252暴露相關。關於五種剩餘陽性樣品，以18 mg/kg給藥之一只雌性在第43天具有可偵測效價，且剩餘4只動物(以12 mg/kg給藥之2只雌性及以18 mg/kg給藥之一只雄性及一隻雌性)在第92天恢複點處具有可偵測效價。儘管實際抗v21252抗體結果未表明大多數動物中之強烈免疫原反應，循環v21252可能與抗v21252抗體結合，從而限制此分析形式內該等抗體之偵測。然而，ADA不太可能顯著地影響v21252之PK，因為與給藥第1天相比，在給藥第43天未觀察到血清濃度時間數據之改變。毒性
v21252之重複劑量投與(每隔一週×4)一般經充分耐受。不存在v21252相關死亡且在眼科及心電圖評估、視覺呼吸率、尿分析或肌鈣蛋白I評估中未注意到效應。在v21252投與之後之治療或恢復期期間未注意到體重參數之v21252相關改變。
在≥ 6 mg/kg下在投與重複劑量之v21252的動物中注意到增加之軟/水樣糞便發生率。另外，在18 mg/kg下在雄性及雌性動物中注意到偶發性食欲不振，且在18 mg/kg下在雌性動物中偶發地注意到弓背姿勢。在恢復期之後，食欲不振及弓背姿勢不存在，而軟/水樣糞便之發生率減少或經解決，表明v21252相關效應的逆轉。在該研究期間，歸因於軟/液體糞便之重複觀察結果，對動物提供流體/營養補充(冷凍Gatorade及PeptoPro® 膳食)。接受v21252之重複投與的雌性自第4天(6及18 mg/kg)或第8天(12 mg/kg)接受流體及/或營養補充，直至治療期結束。同樣，接受v21252之重複投與的雄性自第8天(12 mg/kg)或第7天(18 mg/kg)接受流體及/或營養補充，直至治療期結束。在恢復期間未提供流體或補充。
該等臨床病理學發現由於該等發現之有限嚴重程度及可逆性而未被視為不良。測試物件相關血液學改變包括：單核細胞計數之增加、嗜中性粒細胞之形態改變、網狀細胞計數及紅血球質量(RBC、血紅素及血球密度)的減少以及紅血球分佈寬度之伴隨增加。在18 mg/kg下在雄性中且在≥ 12 mg/kg下在雌性中，在第8天至第50天相對於基線平均值存在平均纖維蛋白原濃度之最小至輕微增加。此等改變為測試物件相關的且可指示免疫或發炎刺激。此等改變已在第92天經解決。觀察到AST、磷、總蛋白質、白蛋白、球蛋白及瓜胺酸之治療相關改變。
表22-25顯示針對v17597及v21252之非GLP重複劑量研究及針對v21252之GLP研究的結果之比較。表 22 ：食蟹獼猴中針對 v17597 及 v21252 之每隔一 週重複劑量研究中觀察到的死亡率之比較 表 23 ： 食蟹獼猴中針對 v17597 及 v21252 之每隔一 週重複劑量研究中測定的 NOAEL 及 HNSTD 之比較 表 24 ： 針對 v17597 DAR4 及 v21252 DAR2 之 ADC PK 參數的比較 ( 匹配之毒素劑量 ) # 在4.5及9 mg/kg下與v17597 DAR4相比表 25 ： 針對 v17597 DAR4 及 v21252 DAR2 之總抗體 PK 參數的比較 ( 匹配之毒素劑量 ) # 在4.5及9 mg/kg下與v17597相比 結論
v21252之最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)經測定為18 mg/kg。v21252在所有劑量下均經充分耐受。在此GLP研究中，臨床觀察結果均未被視為不良且未觀察到死亡率。唯一一致之臨床觀察結果為增加之腹瀉。在所有劑量下均未觀察到體重改變且臨床病理學發現(肝功能-天冬胺酸轉胺酶及丙胺酸轉胺酶，及血液學-嗜中性粒細胞、血小板、血紅素及淋巴細胞)均未被視為不良。此等GLP毒物學結果支持人類中超過預知有效劑量之臨床給藥。
意外地，包含以平均DAR2結合於v10000之化合物9 的ADC (v21252)顯示與具有平均DAR4之ADC (v17597)相比經改良之耐受性，其中HNSTD為18 mg/kg。此結果為意外的，因為先前已顯示當以0.36 mg/kg之毒素劑量投與時，以平均DAR4結合於v10000之毒素化合物9 (v17597)與急性(使用9 mg/kg之單一劑量)或亞慢性(使用相隔兩週之兩個4.5 mg/kg劑量)給藥時之死亡率相關。相比之下，當v21252 (DAR2)以0.36 mg/kg毒素(化合物9 )劑量投與持續四個劑量時(1.44 mg/kg之累積毒素劑量)，不存在死亡率及與v17597相比實質上降低之毒性。例如，以0.96 mg/kg毒素(化合物9 )累積劑量投與之v21252未與不良發現相關且經指定為未觀察到不良事件水準(NOAEL)。此外，1.44 mg/kg累積毒素(化合物9 )劑量經4個劑量以18 mg/kg v21252投與且經耐受。此為與死亡率相關之v17597劑量(0.36 mg/kg)的四倍高劑量。
重要的是，當每兩週給藥時，與v17597相比，v21252具有較少毒性及較大耐受性，即使當在毒素匹配劑量下比較時(4.5 mg/kg v17597對9 mg/kg v21252及9 mg/kg v17597對18 mg/kg v21252)，其具有大約兩倍大暴露(第一劑量之後的AUC0-336h )及在第一劑量之後兩倍長半衰期(概述於表24及25中)。實例 11 ： v21252 活體內抑制低 HERW 患者源性異種移植物生長
LTL-654來源於卵巢漿液性癌患者轉移且藉由免疫組織化學(IHC)評分為HER2陰性。較早生檢藉由IHC評分為HER2不明確。
雌性NOD Rag γ (NRG)小鼠經由腎小囊經皮下植入兩個LTL-654腫瘤片段(各自大約15 mm3 )。當平均腫瘤體積達到70.3-77.8 mm3 時，動物經隨機指派為各六隻動物之兩個盲治療組之一。
動物每週一次經靜脈內投與之媒劑或3 mg/kg v21252治療持續總計四次注射(qw×4) (表21)。腫瘤尺寸使用Vevo®3100成像系統(FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Canada)使用三維(3D)模式來量測。使用Vevo® LAB軟體v2.1.0 (FUJIFILM VisualSonics, Inc.)記錄且分析整個腫瘤中之多個圖像(每個腫瘤70至100個)。腫瘤尺寸在隨機化之後每週一次經量測，直至第24天。當個別腫瘤達到1500 mm3 尺寸時，對小鼠進行安樂死。腫瘤體積針對各組經報告為平均值+ SEM。
圖16提供了在i.v.投與媒劑或v21252之後經皮下植入LTL-654腫瘤片段之小鼠中的腫瘤反應之結果，其證明了用v21252治療LTL-654移植小鼠會抑制LTL-654腫瘤異種移植物之生長速率。
此實例證明了v21252在其中HER2表現足夠低以藉由IHC評分為HER2陰性之患者源性異種移植物中有效。表 21 ： LTL-654 卵巢癌 PDX 模型研究設計 實例 12 ： v21252 活體內延長攜帶經顱內植入之人類乳房腫瘤之小鼠的生存
用於此實例之構築體為：對照結合物(結合於連接體-毒素001之針對呼吸道融合病毒的人類化抗體)、v21252、v7155 (T-DM1，DAR3.5)及v24029 (以DAR8結合於依沙替康衍生物拓撲異構酶I抑制劑(DXd)之曲妥珠單抗)。用於此實例中之經顱內植入之BT-474人類乳房腫瘤充當HER2陽性乳癌腦轉移模型。
雌性Balb/c裸小鼠(CByJ.Cg-Foxn1nu/J)小鼠經γ-源(2 Gy，60 Co，BioMep, Bretenières, France)照射。經麻醉小鼠以立體定向方式注射2微升無酚紅之RPMI 1640培養基中之1×105 個BT-474細胞。動物經隨機化至治療組中且在第8天開始，每週以6 mg/kg經靜脈內投與媒劑、對照結合物、v21252、v7155或v24029持續總計十二次注射(表26)。每週兩次記錄體重直至第18天，且接著其後每日記錄。當體重損失滿足或超過20%持續連續3天時，對小鼠進行安樂死。
圖17提供了在i.v.投與媒劑、對照結合物、v21252、v7155或v24029之後經顱內植入BT-474腫瘤細胞之小鼠的生存結果。
經顱內植入BT-474細胞之另外兩個動物群亦經隨機化至治療組中且在第8天開始，每兩週以6 mg/kg經靜脈內投與v21252或v24029持續總計六次注射。每週兩次記錄體重直至第18天，且接著其後每日記錄。當體重損失滿足或超過20%持續連續3天時，對小鼠進行安樂死。
圖18提供了在每週(qw) i.v.投與媒劑、對照結合物或v7155或每兩週(q2w) i.v.投與v21252或v24029之後經顱內植入BT-474腫瘤細胞之小鼠的生存結果。
此實例證明了v21252有效延長經顱內植入BT-474乳房腫瘤細胞之小鼠的生存。表 26 ：經顱內植入 BT-474 人類乳癌模型研究設計
本說明書中引用之所有專利、專利申請案、公開案及數據庫入口的揭示內容由此特定地以引用之方式整體倂入，其倂入程度就如同各該個別專利、專利申請案、公開案及數據庫入口特定地且個別地經指示以引用之方式倂入一般。
熟習此項技術者將顯而易知之對本文所述之特定實施例的修改意欲包括於以下申請專利範圍之範圍內。序列表 表 A ： 針對變異體 v5019 、 v5020 、 v7091 、 v10000 、 v6903 、 v6902 及 v6717 之純系編號 表 B ： 藉由純系編號提及之針對變異體 v5019 、 v5020 、 v7091 、 v10000 、 v6903 、 v6902 及 v6717 之序列 表 C ： 針對變異體 v7133 、 v15082 、 v15085 、 v15083 、 v15080 、 v15079 、 v15084 及 v15081 之 VH 及 VL 區之序列
圖 1 顯示(A ) v17597 (以DAR4結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)及(B ) v21252 (以DAR2結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)之非還原及還原SDS-PAGE，各自與親本抗HER2雙互補位抗體(v10000)相比。
圖 2 顯示(A )親本抗HER2雙互補位抗體v10000、(B ) v17597 (結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體，顯示平均DAR 3.92)及(C ) v21252 (結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體，顯示平均DAR 2.07)之疏水性相互作用層析(HIC)跡線。DAR0、DAR2、DAR4及DAR6物質對經純化ADC之平均DAR之個別作用顯示於(D )及(E )中。
圖 3 顯示(A )親本抗HER2雙互補位抗體v10000、(B ) v17597 (以DAR4結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)及(C ) v21252 (以DAR2結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)之尺寸排阻層析(SEC)跡線。
圖 4 顯示對抗原陽性細胞進行之流式細胞術結合分析的結果，結合於(A ) JIMT-1乳癌細胞及(B ) RT-112膀胱癌細胞之v17597 (以DAR4結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)及v10000 (親本抗HER2雙互補位抗體)的比較，及(C )結合於JIMT-1乳癌細胞之v21252 (以DAR2結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)及v10000 (親本抗HER2雙互補位抗體)的比較。
圖 5 顯示用v17597 (以DAR4結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)及v21252 (以DAR2結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)處理HER2表現性乳癌細胞株BT-474 (A )、SK-BR-3 (B )、HCC1954 (C )、JIMT-1 (D )及ZR-75-1 (E )及HER2陰性細胞株MDA-MB-468 (F )之結果。
圖 6 顯示用包含以多種平均DAR結合於連接體-毒素001之v10000的抗體-藥物結合物處理HER2表現性卵巢癌細胞株SK-OV-3 (A )及乳癌細胞株ZR-75-1 (B )及JIMT-1 (C )之結果。DAR0、DAR2、DAR4及DAR6物質對具有平均DAR 0.7、2.2及3.9之ADC之平均DAR的個別作用顯示於(D )中。
圖 7 顯示用所記錄劑量之(A ) v17597 (以DAR4結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)及(B )v21252 (以DAR2結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)處理HBCx-13b乳癌患者源性異種移植小鼠q14d × 2之結果。v15496 =媒劑。
圖 8 顯示用所記錄劑量之(A ) v17597 (以DAR4結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)及(B )v21252 (以DAR2結合於連接體-毒素001之抗HER2雙互補位抗體)處理ST-910乳癌患者源性異種移植小鼠qd × 1之結果。v15496 =媒劑。
圖 9 顯示在將9 mg/kg或12 mg/kg之單一劑量的v21252投與至雌性食蟹獼猴(n=3)之後，(A )平均(+SD) v21252血清濃度-時間曲線及(B )平均(±SD)總抗體血清濃度-時間曲線。
圖 10 顯示在兩週一次對食蟹獼猴(n=6)輸注12 mg/kg或9 mg/kg之v21252之後第1天(A )及第29天(B )的平均(±SD) v21252血清濃度-時間曲線。
圖 11 顯示在兩週一次對食蟹獼猴(n=6)輸注12 mg/kg或9 mg/kg之v21252之後第1天(A )及第29天(B )的平均(±SD)總抗體血清濃度-時間曲線。
圖 12 顯示在兩週一次對食蟹獼猴(n=6)輸注12 mg/kg或9 mg/kg之v21252之後，針對v21252及總抗體(結合及未結合)之平均(±SD)血清濃度-時間曲線。
圖 13 顯示與pHAb結合之曲妥珠單抗-連接體-毒素001及陰性對照物相比，(A ) SKBR3細胞及(B ) JIMT-1細胞中pHAb結合之v21252的內化。
圖 14 顯示與pHAb結合之曲妥珠單抗-連接體-毒素001 (B )相比，在所指示之多個時間點處，SKBR3細胞中pHAb結合之v21252 (A )的內化。細胞核以灰色顯示，且pHAb以白色顯示。
圖 15 顯示經所指示之劑量的v21252處理之食蟹獼猴及小鼠中之比較性暴露：(A )經皮下植入高HER2患者源性腫瘤(HBCx-13b)之食蟹獼猴及小鼠中的暴露，(B )經皮下植入低HER2患者源性腫瘤(ST-910)之食蟹獼猴及小鼠中的暴露。
圖 16 顯示用3 mg/kg之媒劑或v21252處理LTL-654卵巢癌患者源性異種移植小鼠qwk × 4之結果。
圖 17 提供在每週一次i.v.投與媒劑、對照結合物(結合於連接體-毒素001之針對呼吸道融合病毒的人類化抗體)、v21252、v7155 (T-DM1，DAR3.5)及v24029 (以DAR8結合於依沙替康衍生物拓撲異構酶I抑制劑(DXd)之曲妥珠單抗)之後，經顱內植入BT-474乳房腫瘤細胞之小鼠的生存結果，每一者每週一次以6 mg/kg投與持續總計12次注射。
圖 18 提供在每週一次以6 mg/kg i.v.投與媒劑、對照結合物(結合於連接體-毒素001之針對呼吸道融合病毒的人類化抗體)或v7155 (T-DM1，DAR3.5)持續總計12次注射，或i.v.投與v21252或v24029 (以DAR8結合於依沙替康衍生物拓撲異構酶I抑制劑(DXd)之曲妥珠單抗)之後，經顱內植入BT-474乳房腫瘤細胞之小鼠的生存結果，v21252及v24029中每一者每兩周以6 mg/kg投與持續總計6次注射。
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Claims (26)

  1. 一種抗體-藥物結合物，其包含經由連接體(L)以低平均藥物：抗體比率(DAR)結合於澳瑞他汀類似物之抗HER2雙互補位抗體，其中該抗HER2雙互補位抗體包含包括以SEQ ID NO：67、68、69、70、71及72陳述之CDR序列之第一抗原結合多肽構築體及包括以SEQ ID NO：27、28、29、39、40及41陳述之CDR序列之第二抗原結合多肽構築體，其中該澳瑞他汀類似物及連接體(L)具有通式(X)：
    Figure 108108455-A0305-02-0269-3
     其中： R1係
    Figure 108108455-A0305-02-0269-1
    ； L為蛋白酶可裂解連接體，且
    Figure 108108455-A0305-02-0269-2
    表示該澳瑞他汀類似物及連接體與該抗HER2雙互補位抗體之附接點， 且其中該低平均DAR為在1.5與2.5之間之平均DAR。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該平均DAR係在1.8與2.5之間。
  3. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該平均DAR為1.8與2.2之間。
  4. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該結合物包含10%與25%之間DAR0物質。
  5. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該結合物包含15%與25%之間DAR0物質。
  6. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該結合物包含0%與10%之間DAR6或更高物質。
  7. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中L具有通式(VI)：
    Figure 108108455-A0305-02-0270-4
     其中：Z為能夠與該抗HER2雙互補位抗體上之標靶基團反應的官能基；Str為延伸體；AA1及AA2各自獨立地為胺基酸，其中AA1-[AA2]m形成蛋白酶裂解位點；X為自降解基團；D為與該澳瑞他汀類似物之附接點；s為0或1；m為1與4之間的整數，且o為0、1或2。
  8. 如請求項7之抗體-藥物結合物，其中s為1且o為0。
  9. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中L具有通式(IX)：
    Figure 108108455-A0305-02-0271-5
     其中：A-S-為與該抗HER2雙互補位抗體之附接點；Y不存在，且D為與該澳瑞他汀類似物之附接點。
  10. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該澳瑞他汀類似物及連接體具有如下結構：
    Figure 108108455-A0305-02-0271-7
     其中A-S-為與該抗HER2雙互補位抗體之附接點。
  11. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合多肽構築體為scFv，且該第二抗原結合多肽構築體為Fab。
  12. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合多肽構築體包含如SEQ ID NO：38所載之VH序列與如SEQ ID NO：26所載之VL序列，且該第二抗原結合多肽構築體包含如SEQ ID NO：66所載之VH序列與如SEQ ID NO：65所載之VL序列。
  13. 如請求項11之抗體-藥物結合物，其中該抗HER2雙互補位抗體包含一第一鏈(H1)、一第二鏈(H2)及一第三鏈(L1)， 其中H1包含該第一抗原結合多肽構築體，且H2與L1包含該第二抗原結合多肽構築體，以及其中H1包含如SEQ ID NO：36所載之序列，H2包含如SEQ ID NO：63所載之序列，且L1包含如SEQ ID NO：24所載之序列。
  14. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該抗HER2雙互補位抗體進一步包含基於免疫球蛋白Fc區(IgG Fc區)之骨架，且其中該第一及該第二抗原結合多肽構築體可操作性連接至該骨架。
  15. 如請求項14之抗體-藥物結合物，其中該IgG Fc區為包含經修飾CH3域之雜二聚體Fc區且該經修飾CH3域包含第一多肽序列與第二多肽序列，且其中：(a)該經修飾CH3域之該第一多肽序列包含胺基酸修飾L351Y、F405A及Y407V，且該經修飾CH3域之該第二多肽序列包含胺基酸修飾T366L、K392M及T394W；或(b)該經修飾CH3域之該第一多肽序列包含胺基酸修飾L351Y、F405A及Y407V，且該經修飾CH3域之該第二多肽序列包含胺基酸修飾T366L、K392L及T394W；或(c)該經修飾CH3域之該第一多肽序列包含胺基酸修飾T350V、L351Y、F405A及Y407V，且該經修飾CH3域之該第二多肽序列包含胺基酸修飾T350V、T366L、K392M及T394W；或(d)該經修飾CH3域之該第一多肽序列包含胺基酸修飾T350V、L351Y、F405A及Y407V，且該經修飾CH3域之該第二多肽序列包含胺基酸修飾T350V、T366L、K392L及T394W；或 (e)該經修飾CH3域之該第一多肽序列包含胺基酸修飾T350V、L351Y、S400E、F405A及Y407V，且該經修飾CH3域之該第二多肽序列包含胺基酸修飾T350V、T366L、N390R、K392M及T394W。
  16. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中該平均DAR係在1.8與2.5之間。
  17. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中該結合物包含10%與25%之間DAR0物質。
  18. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中L具有通式(VI)：
    Figure 108108455-A0305-02-0273-8
     其中：Z為能夠與該抗HER2雙互補位抗體上之標靶基團反應的官能基；Str為延伸體；AA1及AA2各自獨立地為胺基酸，其中AA1-[AA2]m形成蛋白酶裂解位點；X為自降解基團；D為與該澳瑞他汀類似物之附接點；s為0或1；m為1與4之間的整數，且o為0、1或2。
  19. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中s為1且o為0。
  20. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中該澳瑞他汀類似物及連接體(L)具有如下的結構：
    Figure 108108455-A0305-02-0274-9
     其中A-S-為與該抗HER2雙互補位抗體之附接點。
  21. 一種抗體-藥物結合物包含經由連接體(L)以低平均藥物：抗體比率(DAR)結合於澳瑞他汀類似物之一抗HER2雙互補位抗體，其中該抗HER2雙互補位抗體包含如SEQ ID NO：36所載之序列之一第一鏈(H1)、包含如SEQ ID NO：63所載之序列之一第二鏈(H2)及包含如SEQ ID NO：24所載之序列之一第三鏈(L1)，其中該澳瑞他汀類似物及連接體(L)具有如下的結構：
    Figure 108108455-A0305-02-0274-10
     其中A-S-為與該抗HER2雙互補位抗體之附接點，且其中該低平均DAR為在1.8與2.5之間之平均DAR。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1或請求項21之抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  23. 一種如請求項1或請求項21之抗體-藥物結合物用於製造用於治療HER2表現性癌症之藥劑的用途。
  24. 如請求項23之用途，其中該HER2表現性癌症為乳癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。
  25. 如請求項23之用途，其中該HER2表現性癌症為乳癌。
  26. 如請求項23之用途，其中該HER2表現性癌症為卵巢癌。
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