CN112020519A - 抗her2双互补位抗体-药物偶联物及使用方法 - Google Patents

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J·R·里彻
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    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Abstract

描述了抗HER2双互补位抗体‑药物偶联物(ADC)，其中所述药物是澳瑞他汀类似物并以低的平均药物:抗体比(DAR)与所述抗体偶联，并且描述了使用所述ADC治疗表达HER2的癌症的方法。当以相同的毒素剂量施用时，与具有DAR≥3.9的相应ADC相比，如本文所述的低平均DAR(<3.9)ADC具有改善的耐受性和降低的毒性。

Description

抗HER2双互补位抗体-药物偶联物及使用方法
技术领域
本公开涉及癌症治疗剂领域，尤其涉及包含双互补位抗HER2抗体和澳瑞他汀(auristatin)类似物的抗体-药物偶联物。
背景技术
HER2 (ErbB2)是一种跨膜表面结合的受体酪氨酸激酶，是受体酪氨酸激酶ErbB家族的成员，并且通常参与导致细胞生长和分化的信号转导途径。HER2是治疗乳腺癌的有希望的靶标，因为发现它在约四分之一的乳腺癌患者中过表达(Bange等人, NatureMedicine 7:548 (2001))。
Figure BDA0002736406090000011
(曲妥珠单抗(trastuzumab)，美国专利号5,821,337)是开发用于治疗HER2阳性乳腺癌的首个单克隆抗体，并且增加了患者的存活时间，使得他们现在与HER2阴性乳腺癌患者相同。帕妥珠单抗(Pertuzumab)(
Figure BDA0002736406090000012
美国专利号7,862,817)是一种人源化单克隆抗体，专门设计用于防止HER2受体与细胞表面上的其它HER受体(EGFR/HER1、HER3和HER4)配对(二聚化)，据信这一过程在肿瘤生长和存活中起作用。认为Perjeta、Herceptin和化学疗法的组合会提供对HER信号传导途径更全面的阻断。帕妥珠单抗与HER2的结构域II结合，这对于二聚化是必不可少的，而曲妥珠单抗与HER2的细胞外结构域IV结合。
Li等人(Cancer Res., 73:6471-6483 (2013))描述了基于天然曲妥珠单抗和帕妥珠单抗序列并且克服了曲妥珠单抗抗性的针对HER2的双特异性二价抗体。已经描述了其它双特异性抗HER2抗体(国际专利申请公布号WO 2015/077891和WO 2016/179707；美国专利申请公布号2014/0170148、2015/0284463、2017/0029529和2017/0291955；美国专利号9,745,382)。还已经描述了一种抗体-药物偶联物，其包含与微管溶素(tubulysin)衍生物位点特异性偶联的靶向HER2的双互补位抗体(Li等人, Cancer Cell, 29:117-129(2016))。
澳瑞他汀是尾海兔素(dolastatin)10的合成类似物，尾海兔素10是一种具有抗癌活性的高效微管抑制剂。已经描述了包含澳瑞他汀有效载荷，诸如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)的抗体-药物偶联物(美国专利号7,498,298和7,659,241；国际专利申请公布号WO 2002/088172和WO 2016/041082)。国际专利申请公布号WO 2106/041082描述了N-酰基磺酰胺修饰的澳瑞他汀及其作为抗体-药物偶联物有效载荷的用途。
提供该背景信息是为了使申请人认为已知的信息与本公开可能相关。不一定要承认也不应解释为承认任何前述信息构成了针对所要求保护的发明的现有技术。
发明内容
本文描述了抗HER2双互补位抗体-药物偶联物和使用方法。一方面，本公开涉及一种抗体-药物偶联物，其包含经由接头(L)以低的平均药物:抗体比(DAR)与澳瑞他汀类似物偶联的抗HER2双互补位抗体，其中所述抗HER2双互补位抗体包含结合第一HER2表位的第一抗原结合多肽构建体和结合第二HER2表位的第二抗原结合多肽构建体，所述第一和第二HER2表位是不同的表位，并且其中低平均DAR是小于3.9的平均DAR。
在所述抗体-药物偶联物的某些实施方案中，所述澳瑞他汀类似物-接头具有通式(II)：
Figure BDA0002736406090000021
其中：
X为-C(O)NHCH(CH2R2)-，或X不存在；
R1选自：
Figure BDA0002736406090000031
L为接头，并且
Figure BDA0002736406090000032
表示接头-毒素与抗HER2双互补位抗体的附接点；
其中所述抗HER2双互补位抗体包含结合第一HER2表位的第一抗原结合多肽构建体和结合第二HER2表位的第二抗原结合多肽构建体，所述第一和第二HER2表位是不同的表位，并且
其中所述低平均DAR是小于3.9的平均DAR。
在某些实施方案中，所述抗体-药物偶联物的低平均DAR在0.5至3.5之间，或在0.5至2.5之间。
在某些实施方案中，所述抗体-药物偶联物包含5％或更多的DAR0种类或15％或更多的DAR0种类。在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物包含约5％至约50％的DAR0种类，或约10％至约30％的DAR0种类，或约10％至约25％的DAR0种类，或约15％至约25％的DAR0种类。
在某些实施方案中，所述抗体-药物偶联物包含25％或更少的DAR6或更高的种类，或15％或更少的DAR6或更高的种类。在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物包含0％至约15％的DAR6或更高的种类，或约0％至约10％的DAR6或更高的种类。
本公开的另一方面涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的抗HER2双互补位抗体-药物偶联物和药学上可接受的载体或稀释剂。
另一方面涉及一种抑制表达HER2的癌细胞生长的方法，该方法包括使癌细胞与有效量的如本文所述的抗HER2双互补位抗体-药物偶联物接触。
另一个方面涉及一种治疗表达HER2的癌症的方法，其包括向患有表达HER2的癌症的受试者施用有效量的如本文所述的抗HER2双互补位抗体-药物偶联物。
另一个方面涉及用于治疗的如本文所述的抗体-药物偶联物。
另一方面涉及用于治疗有需要的受试者中的表达HER2的癌症的如本文所述的抗体-药物偶联物。
另一个方面涉及如本文所述的抗体-药物偶联物在制造用于治疗表达HER2的癌症的药剂中的用途。
另一个方面涉及一种抗体-药物偶联物组合物，其包含经由接头(L)与澳瑞他汀类似物偶联的抗HER2双互补位抗体，所述澳瑞他汀类似物-接头具有通式(II)：
Figure BDA0002736406090000041
其中：
X不存在；
R1选自：
Figure BDA0002736406090000042
L为接头，并且
Figure BDA0002736406090000043
表示所述澳瑞他汀类似物-接头与所述抗HER2双互补位抗体的附接点；
其中所述抗HER2双互补位抗体包含结合HER2的ECD4上的第一HER2表位的第一抗原结合多肽构建体和结合HER2的ECD2上的第二HER2表位的第二抗原结合多肽构建体，并且
其中所述抗体-药物偶联物组合物的平均DAR在0.5至2.5之间，并且包含约10％至约30％的DAR0种类，以及0％至约15％的DAR6或更高的种类。
附图说明
图1示出了(A)v17597(与接头-毒素001以DAR4偶联的抗HER2双互补位抗体)和(B)v21252(与接头-毒素001以DAR2偶联的抗HER2双互补位抗体)的非还原性和还原性SDS-PAGE，各自与亲本抗HER2双互补位抗体(v10000)进行比较。
图2示出了(A)亲本抗HER2双互补位抗体v10000、(B)v17597(与接头-毒素001偶联的抗HER2双互补位抗体，显示出平均DAR为3.92)和(C)v21252(与接头-毒素001偶联的抗HER2双互补位抗体，显示出平均DAR为2.07的疏水相互作用色谱(HIC)轨迹)。在(D)和(E)中示出了DAR0、DAR2、DAR4和DAR6种类对纯化ADC的平均DAR的单独贡献。
图3示出了(A)亲本抗HER2双互补位抗体v10000、(B)v17597(与接头-毒素001以DAR4偶联的抗HER2双互补位抗体)和(C)v21252(与接头-毒素001以DAR2偶联的抗-HER2双互补位抗体)的疏水相互作用色谱(SEC)轨迹。
图4示出了对抗原阳性细胞进行的流式细胞术结合测定的结果，与(A)JIMT-1乳腺癌细胞和(B)RT-112膀胱癌细胞结合的v17597(与接头-毒素001以DAR4偶联的抗HER2双互补位抗体)和v10000(亲本双互补位抗HER2抗体)的比较，以及(C)与JIMT-1乳腺癌细胞结合的v21252(与接头-毒素001以DAR2偶联的抗-HER2双互补位抗体)和v10000(亲本抗HER2双互补位抗体)的比较。
图5示出了用v17597(与接头-毒素001以DAR4偶联的抗HER2双互补位抗体)和v21252(与接头-毒素001以DAR2偶联的抗HER2双互补位抗体)处理表达HER2的乳腺癌细胞系BT-474(A)、SK-BR-3(B)、HCC1954(C)、JIMT-1(D)和ZR-75-1(E)以及HER2阴性细胞系MDA-MB-468(F)的结果。
图6示出了用包含与接头-毒素001以各种平均DAR偶联的v10000的抗体-药物偶联物处理表达HER2的卵巢癌细胞系SK-OV-3(A)，以及乳腺癌细胞系ZR-75-1(B)和JIMT-1(C)的结果。(D)中示出了DAR0、DAR2、DAR4和DAR6种类对平均DAR为0.7、2.2和3.9的ADC的平均DAR的单独贡献。
图7示出了q14d x2以指定剂量的(A)v17597(与接头-毒素001以DAR4偶联的抗HER2双互补位抗体)和(B)v21252(与接头-毒素001以DAR2偶联的抗HER2双互补位抗体)处理HBCx-13b乳腺癌患者来源的异种移植小鼠的结果。v15496＝媒介物。
图8示出了用指定剂量的(A)v17597(与接头-毒素001以DAR4偶联的抗HER2双互补位抗体)和(B)v21252(与接头-毒素001以DAR2偶联的抗HER2双互补位抗体)处理ST-910乳腺癌患者来源的异种移植小鼠qdx1的结果。v15496＝媒介物。
图9示出了在以9mg/kg或12mg/kg向雌性食蟹猴(n＝3)施用单剂量的v21252后，(A)平均(+SD)v21252血清浓度-时间曲线，和(B)平均(±SD)总抗体血清浓度-时间曲线。
图10示出了每两周以12mg/kg或9mg/kg向食蟹猴(n＝6)输注v21252后第1天(A)和第29天(B)的平均(±SD)v21252血清浓度-时间曲线。
图11示出了每两周以12mg/kg或9mg/kg向食蟹猴(n＝6)输注v21252后第1天(A)和第29天(B)的平均(±SD)总抗体血清浓度-时间曲线。
图12示出了每两周以12mg/kg或9mg/kg向食蟹猴(n＝6)输注v21252后，v21252和总抗体(偶联的和未偶联的抗体)的平均(±SD)血清浓度-时间曲线。
图13示出了与pHAb偶联的曲妥珠单抗-接头-毒素001和阴性对照相比，pHAb偶联的v21252向(A)SKBR3细胞和(B)JIMT-1细胞的内化。
图14示出了与pHAb偶联的曲妥珠单抗-接头-毒素001(B)相比，pHAb偶联的v21252(A)在所示各个时间点向SKBR3细胞的内化。细胞核示为灰色，pHAb示为白色。
图15示出了用指定剂量的v21252处理的食蟹猴和小鼠中的对比暴露量：(A)皮下植入了高HER2患者来源的肿瘤(HBCx-13b)的食蟹猴和小鼠中的暴露量，(B)皮下植入了低HER2患者来源的肿瘤(ST-910)的食蟹猴和小鼠中的暴露量。
图16示出了qwk x4用3mg/kg的媒介物或v21252处理LTL-654卵巢癌患者来源的异种移植小鼠的结果。
图17提供了在每周一次静脉内施用媒介物、对照偶联物(与接头-毒素001偶联的抗呼吸道合胞病毒的人源化抗体)、v21252、v7155(T-DM1，DAR3.5)和v24029(以DAR8与依喜替康(exatecan)衍生物拓扑异构酶I抑制剂(DXd)偶联的曲妥珠单抗)(每周一次，每次6mg/kg，总共注射12次)后，颅内植入了BT-474乳腺肿瘤细胞的小鼠的存活结果。
图18提供了在静脉内施用媒介物、对照偶联物(与接头-毒素001偶联的抗呼吸道合胞病毒的人源化抗体)或v7155(T-DM1，DAR3.5)(每周一次6mg/kg，总共注射12次)或v21252和v24029(以DAR8与依喜替康衍生物拓扑异构酶I抑制剂(DXd)偶联的曲妥珠单抗)(每两周一次，每次6mg/kg，总共注射6次)后，颅内植入了BT-474乳腺肿瘤细胞的小鼠的存活结果。
具体实施方式
本公开涉及抗HER2双互补位抗体-药物偶联物(ADC)，其中所述药物是澳瑞他汀类似物并以低的平均药物:抗体比(DAR)与所述抗体偶联。当以相同的毒素(奥瑞他汀类似物)剂量施用时，与具有DAR≥3.9的相应ADC相比，如本文所述的低平均DAR(<3.9)ADC具有改善的耐受性和降低的毒性。特别令人感兴趣的是具有约2.5或更小，诸如约1.8至2.5之间的平均DAR的ADC。
本公开还涉及使用本文所述的ADC治疗表达HER2的癌症的方法。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，在一些实施方案中是指哺乳动物，其是治疗、观察或实验的对象。所述动物可以是人、非人灵长类动物、伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)或实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物等)。在某些实施方案中，受试者是人。
如本文所用，术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫、鼠、牛、马和猪。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人。
如本文所用，术语“约”是指与给定值相差大约+/-10％的变化。应当理解，无论是否特别提及，此类变化总是包括在本文提供的任何给定值中。
当在本文中结合术语“包含”一起使用时，词“一(a或an)”可以意指“一个(one)”，但在某些实施方案中它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素和/或方法步骤。当在本文中结合组合物、用途或方法一起使用时，术语“基本上由……组成”表示可以存在附加的要素和/或方法步骤，但是这些附加不会实质性影响所列举的组合物、方法或用途起作用的方式。当在本文中结合组合物、用途或方法一起使用时，术语“由......组成”排除了附加的要素和/或方法步骤的存在。本文描述为包含某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法，在某些实施方案中也可以基本上由那些要素和/或步骤组成，而在其它实施方案中由那些要素和/或步骤组成，无论是否特别提及了这些实施方案。
预计就本文公开的任何方法、用途或组合物而论，本文讨论的任何实施方案均可实施。
结合本文公开的一个实施方案描述的特定特征、结构和/或特性可以与结合本文公开的另一个实施方案描述的特征、结构和/或特性以任何合适的方式组合以提供一个或多个其它实施方案。
还应理解的是，在一个实施方案中对特征的肯定陈述是在另一个实施方案中排除该特征的基础。例如，在对于给定实施方案或权利要求提出选项列表的情况下，应当理解，可以从该列表中删除一个或多个选项，并且缩短的列表可以形成替代实施方案，而不管是否特别提及此类替代实施方案。
抗HER2双互补位抗体-药物偶联物
本公开的抗体-药物偶联物(ADC)包含经由接头以低的平均药物:抗体比(DAR)与毒素偶联的抗HER2双互补位抗体，该毒素是基于澳瑞他汀的毒素(或“澳瑞他汀类似物”)。基于澳瑞他汀的毒素的实例是本领域已知的。
在某些实施方案中，澳瑞他汀类似物是通式(I)的化合物：
Figure BDA0002736406090000091
其中：
X为-C(O)NHCH(CH2R2)-，或X不存在；
R1选自：
Figure BDA0002736406090000092
并且
R2为苯基。
如本文所用，“低DAR”定义为小于3.9但大于0.5的平均DAR。在一些实施方案中，ADC的平均DAR小于3.5。在一些实施方案中，ADC的平均DAR小于3.4，例如小于3.3，小于3.2或小于3.1。在一些实施方案中，ADC的平均DAR为3.0或更小。在一些实施方案中，ADC的平均DAR为2.9或更小，例如2.8或更小，2.7或更小，或2.6或更小。在一些实施方案中，ADC的平均DAR为2.5或更小，例如2.4或更小，2.3或更小，或2.2或更小。在一些实施方案中，ADC的平均DAR为约2.0。
在一些实施方案中，ADC的平均DAR在0.5至3.8之间，例如在0.5至3.5之间，或在0.5至2.5之间。在一些实施方案中，ADC的平均DAR在0.7至3.8之间，例如在0.7至3.5之间，在0.7至3.0之间，或在0.7至2.5之间。在一些实施方案中，ADC的平均DAR在1.0至3.8之间，例如，在1.0至3.5之间，在1.0至3.0之间，或在1.0至2.5之间。在一些实施方案中，ADC的平均DAR在1.5至3.8之间，例如在1.5至3.5之间，在1.5至3.0之间，或在1.5至2.5之间。在一些实施方案中，ADC的平均DAR在1.6至3.8之间，例如在1.6至3.5之间，在1.6至3.0之间，或在1.6至2.5之间。在一些实施方案中，ADC的平均DAR在1.8至2.8之间，例如在1.8至2.5之间。
如上所述，当以相同的毒素剂量施用时，与具有DAR≥3.9的相应ADC相比，如本文所述的低平均DAR(<3.9)ADC具有改善的耐受性和降低的毒性。如本领域中已知的，大多数偶联方法产生包括各种DAR种类的ADC组合物，其中报告的DAR是各个DAR种类的平均值。不受任何特定理论的限制，低DAR ADC的较高耐受性和降低的毒性可能是由于以下的一种或两种情况所致：ADC组合物中高DAR(6或更高)种类减少和/或ADC组合物中DAR0种类增加。
在某些实施方案中，包括高于某一阈值的比例的DAR0种类的ADC组合物可能是有利的。因此，在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可包括5％或更多的DAR0种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括10％或更多的DAR0种类。在一些实施方案中，低DARADC组合物可以包括15％或更多的DAR0种类，例如20％或更多的DAR0种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括约5％至约50％的DAR0种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括约10％至约50％的DAR0种类，例如约10％至约40％、约10％至约30％的DAR0种类，或约10％至约25％的DAR0种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括约12％至约28％的DAR0种类，例如约12％至约28％的DAR0种类，或约15％至约25％的DAR0种类。
在某些实施方案中，包括低于某一阈值的比例的DAR6或更高的种类的ADC组合物可能是有利的。因此，在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括小于约35％的DAR6或更高的种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括30％或更少的DAR6或更高的种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括25％或更少的DAR6或更高的种类，例如20％或更少、15％或更少或10％或更少的DAR6或更高的种类。在一些实施方案中，低DARADC组合物可以包括9％或更少的DAR6或更高的种类，例如8％或更少、7％或更少、6％或更少或5％或更少的DAR6或更高的种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括0％至约35％的DAR6或更高的种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括0％至约30％的DAR6或更高的种类，例如0％至约25％或0％至约20％的DAR6或更高的种类。在一些实施方案中，低DAR ADC组合物可以包括0％至约15％的DAR6或更高的种类，例如约0％至约10％、约0％至约8％或0％至约5％的DAR6或更高的种类。
某些实施方案涉及ADC，其包含经由接头(L)以低的平均药物:抗体比(DAR)与澳瑞他汀类似物偶联的抗HER2双互补位抗体，该澳瑞他汀类似物具有通式(II)：
Figure BDA0002736406090000111
其中X和R1如通式(I)所定义；
L为接头，并且
Figure BDA0002736406090000112
表示所述澳瑞他汀类似物-接头与所述抗HER2双互补位抗体的附接点。
某些实施方案涉及具有通式(III)的ADC：
Figure BDA0002736406090000121
其中X和R1如通式(I)所定义；
L是接头；
n是平均药物:抗体比(DAR)且小于3.9，并且
Ab是抗HER2双互补位抗体。
抗HER2双互补位抗体
本文所述的ADC包含与HER2的两个不同表位结合的抗HER2双互补位抗体。
如本文所用，术语“抗体”通常是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白性结合分子。抗体的典型实例是免疫球蛋白以及其仍保持结合特异性的衍生物或功能片段。产生抗体的技术是本领域熟知的。术语“抗体”还可以包括不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的免疫球蛋白。抗体的说明性实例是完整抗体及其抗原结合片段，诸如Fab片段、F(ab')2、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双抗体、结构域抗体及其组合。结构域抗体可以是单结构域抗体、单可变结构域抗体或仅有一个可变结构域的免疫球蛋白单可变结构域，该可变结构域可以是重链可变结构域或轻链可变结构域，所述单结构域抗体、单可变结构域抗体或仅有一个可变结构域的免疫球蛋白单可变结构域独立于其它可变区或结构域特异性结合抗原或表位。术语“抗体”还包括诸如嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体的实施方案。
典型的完整抗体包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。每条轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区仅包含一个结构域：CL。轻链分为κ或λ。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FW)。每个VH和VL由三个CDR和四个FW组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域(互补位)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的组分C1q。
在某些实施方案中，包含在本文所述的ADC中的抗HER2双互补位抗体包含两个抗原结合多肽构建体，其各自与HER2的不同表位结合。如本文所用，“抗原结合多肽构建体”可以是基于免疫球蛋白的构建体，例如抗体片段，或者它可以是非基于免疫球蛋白的抗体模拟形式，诸如安替卡林(anticalin)、fynomer、affimer、alphabody、DARPin或avimer。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体可以是基于免疫球蛋白的构建体。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体可以是抗体片段。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体可以各自独立地是Fab片段、Fab'片段、scFv或sdAb。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体可以各自独立地是Fab片段或scFv。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的一个抗原结合多肽构建体可以是Fab片段，而另一个抗原结合多肽构建体可以是scFv。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的至少一个抗原结合多肽构建体可以是Fab片段或Fab'片段。“Fab片段”含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及轻链和重链的可变结构域(分别为VL和VH)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于其在重链CH1结构域的C端添加了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab片段也可以是单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接形成单一肽链的Fab分子。例如，Fab轻链的C端可以与单链Fab分子中Fab重链的N端连接。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的至少一个抗原结合多肽构建体可以是单链Fv(scFv)。“scFv”在单一多肽链中包括抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。scFv可以任选地在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，从而使scFv能够形成抗原结合所需的结构。例如，scFv可以包括通过多肽接头从C端连接至VH的N端的VL。可替代地，scFv可以包含通过多肽链或接头，通过C端连接至VL的N端的VH(参见Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)中的综述)。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的至少一个可以是单结构域抗体(sdAb)形式。sdAb形式是指单免疫球蛋白结构域。sdAb可以是例如骆驼来源的。骆驼抗体缺乏轻链并且其抗原结合位点由单个结构域组成，称为“VHH”。sdAb包含三个形成抗原结合位点的CDR/高变环：CDR1、CDR2和CDR3。sdAb相当稳定且易于表达，例如表达为与抗体Fc链的融合物(参见，例如，Harmsen和De Haard,Appl.MicrobiolBiotechnol.77(1):13-22(2007))。
抗体形式
在本文所述的ADC中包含的抗HER2双互补位抗体可以具有各种形式。抗HER2双互补位抗体的最小组分是与第一HER2表位结合的第一抗原结合多肽构建体和与第二HER2表位结合的第二抗原结合多肽构建体，其中第一和第二HER2表位不同。包含两个结合不同HER2表位的抗原结合多肽构建体的抗体可以被认为是二价、双互补位抗体。某些实施方案涉及二价抗HER2双互补位抗体。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含一个或多个附加的抗原结合多肽构建体，其每一个与第一或第二HER2表位结合。例如，在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以是三价或四价的。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体还包含连接第一和第二抗原结合多肽构建体的接头。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体还包含支架，并且第一和第二抗原结合多肽构建体与支架可操作地连接。如本文所用，术语“可操作地连接”意指所描述的组分处于容许以其预期方式起作用的关系。
因此，抗HER2双互补位抗体可以被认为具有模块化结构，该结构包括两个抗原结合多肽构建体模块，以及任选地接头模块和支架模块中的一个或两个。本领域技术人员将理解，可以以各种方式组合这些模块以提供具有不同形式的抗HER2双互补位抗体。这些形式通常基于本领域已知的抗体形式(参见，例如Brinkmann和Kontermann,MABS,9(2):182-212(2017)，以及Müller和Kontermann,“Bispecific Antibodies”在Handbook ofTherapeutic Antibodies中,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.(2014)的综述)。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体包含两个与支架可操作地连接的抗原结合多肽构建体。下面描述了合适的支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体包含两个与支架可操作地连接的抗原结合多肽构建体，并且至少一个抗原结合多肽构建体是scFv。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体包含两个与支架可操作地连接的抗原结合多肽构建体，并且至少一个抗原结合多肽构建体是Fab。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含三个或四个抗原结合多肽构建体和一个支架。以这种形式，至少第一和第二抗原结合构建体与支架可操作地连接。第三和任选的第四抗原结合多肽构建体可以各自独立地与支架或第一抗原结合多肽构建体或第二抗原结合多肽构建体可操作地连接。
缺少支架的抗HER2双互补位抗体通常包含通过一个或多个接头可操作地连接的两个抗原结合多肽构建体。抗原结合多肽构建体可以是scFv、Fab、sdAb或其组合的形式。例如，使用scFv作为抗原结合多肽构建体，可以构建诸如串联scFv((scFv)2或taFv)的形式，其中scFv通过柔性接头连接在一起。scFv也可用于构建双抗体形式，所述双抗体形式包含通过短接头(通常长度为约5个氨基酸)连接的两个scFv。受限制的接头长度导致scFv以头尾方式二聚化。在任何前述形式中，scFv可通过包含结构域间二硫键而进一步稳定化。例如，可以通过在每条链中引入附加的半胱氨酸残基(例如，在VH的位置44和VL的位置100处)而在VL和VH之间引入二硫键(参见，例如，Fitzgerald等人，Protein Engineering,10:1221-1225(1997))，或者可以在两个VH之间引入二硫键，以提供具有DART形式的构建体(参见，例如，Johnson等人，J Mol.Biol.,399:436-449(2010))。
类似地，在一些实施方案中，可以采用包含两个通过合适的接头连接在一起的sdAb(诸如VH或VHH)的形式。
缺少支架的抗HER2双互补位抗体形式的其它实例包括基于Fab片段的抗HER2双互补位抗体形式，例如Fab2和F(ab')2形式，其中Fab片段通过接头或IgG铰链区连接。
也可以采用不同形式的抗原结合多肽构建体的组合来产生替代的无支架形式。例如，scFv或sdAb可以与Fab片段的轻链和重链中的一者或两者的C端融合，从而产生二价(Fab-scFv/sdAb)构建体。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含两个抗原结合多肽构建体和一个或多个接头，不包括支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体包含两个抗原结合多肽构建体(所述构建体是scFv、Fab、sdAb或其组合)和一个或多个接头，不包括支架。
支架
可以通过将两个抗原结合多肽构建体连接至合适的支架来构建包含支架的抗HER2双互补位抗体。抗原结合多肽构建体可以是上述形式(例如，scFv、Fab和/或sdAb)的一种或组合。合适的支架的实例在下面有更详细的描述，并且包括但不限于免疫球蛋白Fc区、白蛋白、白蛋白类似物和衍生物、异二聚肽(诸如亮氨酸拉链、源自Jun和Fos的形成异二聚体的“拉链”肽)、IgG CH1和CL结构域或barnase-barstar毒素)、细胞因子、趋化因子或生长因子。其它实例包括基于由IBC Pharmaceuticals,Inc.和Immunomedics,Inc.开发的DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)技术的抗体(参见，例如，Chang等人,Clin Cancer Res 13:5586s-5591s(2007))。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体包含两个或更多个抗原结合多肽构建体和一个支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体包含两个与支架可操作地连接的抗原结合多肽构建体。
支架可以是肽、多肽、聚合物、纳米颗粒或其它化学实体。在支架是多肽的情况下，抗HER2双互补位抗体的每个抗原结合多肽构建体可以与多肽支架的N端或C端连接。在某些实施方案中也考虑了包含多肽支架的抗HER2双互补位抗体，其中一个或多个抗原结合多肽构建体例如在有或没有接头的情况下经由氨基酸的侧链与除N端或C端以外的区域连接。
在支架是肽或多肽的实施方案中，抗原结合多肽构建体可以通过基因融合或化学偶联与支架连接。通常，当支架是肽或多肽时，抗原结合多肽构建体通过基因融合与支架连接。在一些实施方案中，在支架是聚合物或纳米颗粒的情况下，抗原结合多肽构建体可以通过化学偶联与支架连接。
在本领域中已知许多蛋白质结构域，其包含两个不同多肽的选择性配对，并且可用于形成支架。实例是选择性配对在一起的亮氨酸拉链结构域，诸如Fos和Jun(Kostelny等人,J Immunol,148:1547-53(1992)；Wranik等人,J.Biol.Chem.,287:43331-43339(2012))。其它选择性配对的分子对包括，例如，barnase barstar对(Deyev等人,NatBiotechnol,21:1486-1492(2003))、DNA链对(Chaudri等人,FEBS Letters,450(1–2):23-26(1999))和分开的荧光蛋白对(国际专利申请公布号WO 2011/135040)。
蛋白质支架的其它实例包括免疫球蛋白Fc区、白蛋白、白蛋白类似物和衍生物、毒素、细胞因子、趋化因子和生长因子。已经描述了蛋白质支架与抗原结合部分的组合使用(参见，例如，Müller等人,J Biol Chem,282:12650-12660(2007)；McDonaugh等人,MolCancer Ther,11:582-593(2012)；Vallera等人,Clin Cancer Res,11:3879-3888(2005)；Song等人,Biotech Appl Biochem,45:147-154(2006)和美国专利申请公布号2009/0285816)。
例如，已经证实将诸如scFv、双抗体或单链双抗体之类的抗原结合部分与白蛋白融合可以改善抗原结合部分的血清半衰期(Müller等人，同上)。抗原结合部分可以任选地经由接头融合在白蛋白的N端和/或C端。
已经描述了异源多聚体形式的白蛋白衍生物，其包含通过白蛋白分段而获得的两种转运蛋白多肽，使得转运蛋白多肽自组装形成似天然白蛋白(参见国际专利申请公布号WO 2012/116453和WO 2014/012082)。由于白蛋白分段，异源多聚体包括四个末端，因此可以任选地经由接头与多达四个不同的抗原结合部分融合。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含蛋白质支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于免疫球蛋白Fc区、白蛋白或白蛋白类似物或衍生物的蛋白质支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于免疫球蛋白Fc区(例如IgG Fc区)的蛋白质支架。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA))或白蛋白类似物或衍生物的蛋白质支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含如国际专利申请公布号WO 2012/116453或WO 2014/012082中所述的基于白蛋白衍生物的蛋白质支架。
Fc区
如本文所用的术语“Fc区”、“Fc”或“Fc结构域”是指含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于免疫球蛋白Fc区的支架。在一些实施方案中，Fc区可以是二聚体并且由两个Fc多肽组成。在一些实施方案中，Fc区可以由单个多肽组成。
二聚体Fc的“Fc多肽”是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽中的一个，即包含能够稳定地自我缔合的免疫球蛋白重链的一个或多个C端恒定区的多肽。术语“第一Fc多肽”和“第二Fc多肽”可以互换使用，条件是Fc区包含一个第一Fc多肽和一个第二Fc多肽。
Fc区包含CH3结构域或CH3结构域和CH2结构域两者。例如，二聚体IgG Fc区的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域序列。CH3结构域包含两个CH3序列，来自于二聚体Fc区的两个Fc多肽中的每一个各一个。CH2结构域包含两个CH2序列，来自于二聚体Fc区的两个Fc多肽中的每一个各一个。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于IgG Fc区的支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于人Fc区的支架。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于人IgG Fc区(例如人IgG1 Fc区)的支架。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于IgG Fc区的支架，该IgGFc区是异二聚体Fc区，其包含各自包含CH3序列和任选地CH2序列的第一Fc多肽和第二Fc多肽。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于包含第一和第二Fc多肽的Fc区的支架，并且第一抗原结合多肽构建体与第一Fc多肽可操作地连接并且第二抗原结合多肽构建体与第二Fc多肽可操作地连接。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于包含第一和第二Fc多肽的Fc区的支架，其中第一抗原结合多肽构建体与第一Fc多肽可操作地连接并且第二抗原结合多肽构建体与第二Fc多肽可操作地连接，并且其中第一和第二抗原结合多肽构建体独立地为Fab片段或scFv。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于包含两个CH3序列的Fc区的支架，至少一个CH3序列包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含基于包含两个CH3序列和两个CH2序列的Fc区的支架，至少一个CH2序列包含一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体包含异二聚体Fc区，该异二聚体Fc区包含经修饰的CH3结构域，其中所述经修饰的CH3结构域是不对称修饰的CH3结构域。通常，异二聚体Fc的第一Fc多肽包含第一CH3序列并且第二Fc多肽包含第二CH3序列。
如本文所用，“不对称氨基酸修饰”是指其中第一CH3序列上特定位置的氨基酸与第二CH3序列上相同位置的氨基酸不同的修饰。对于包含不对称氨基酸修饰的CH3序列，第一和第二CH3序列通常将优先配对形成异二聚体而不是同型二聚体。这些不对称氨基酸修饰可以是每个序列上各相同氨基酸位置的两个氨基酸中仅一个修饰的结果，或者是第一和第二CH3序列中的每一个，每个序列上各相同氨基酸位置的两个氨基酸不同修饰的结果。异二聚体Fc的第一和第二CH3序列中的每一个均可包含一个或多于一个不对称氨基酸修饰。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含如国际专利申请公布号WO2012/058768或WO 2013/063702中所述的基于经修饰的Fc区的支架。
表1提供了人IgG1 Fc序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含异二聚体Fc支架，其包含经修饰的CH3结构域，经修饰的CH3结构域包含促进异二聚体Fc而不是同型二聚体Fc形成的不对称氨基酸修饰。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含异二聚体Fc支架，其包括以下一个或多个位置的修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390，使用EU编号。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含异二聚体Fc，其包含具有第一多肽序列和第二多肽序列的经修饰的CH3结构域，第一多肽序列包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且第二多肽序列包含在位置T366和T394处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置K392处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第一多肽序列可以包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且经修饰的CH3结构域的第二多肽序列包含在位置T366和T394处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置K392处的氨基酸修饰，在位置F405处的氨基酸修饰为F405A、F405I、F405M、F405S、F405T或F405V；在位置Y407处的氨基酸修饰为Y407I或Y407V；在位置T366处的氨基酸修饰为T366I、T366L或T366M；在位置T394处的氨基酸修饰为T394W；在位置L351处的氨基酸修饰为L351Y；并且在位置K392处的氨基酸修饰为K392F、K392L或K392M。在一些实施方案中，在位置F405处的氨基酸修饰是F405A、F405S、F405T或F405V。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含异二聚体Fc，其包含具有第一Fc多肽序列和第二Fc多肽序列的经修饰的CH3结构域，第一Fc多肽序列可以包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且第二Fc多肽序列包含在位置T366和T394处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置K392处的氨基酸修饰，并且在位置F405处的氨基酸修饰为F405A、F405I、F405M、F405S、F405T或F405V；在位置Y407处的氨基酸修饰为Y407I或Y407V；在位置T366处的氨基酸修饰为T366I、T366L或T366M；在位置T394处的氨基酸修饰为T394W；在位置L351处的氨基酸修饰为L351Y，并且在位置K392处的氨基酸修饰为K392F、K392L或K392M，并且第一和第二Fc多肽序列中的一者或两者还包含氨基酸修饰T350V。在一些实施方案中，在位置F405处的氨基酸修饰是F405A、F405S、F405T或F405V。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含异二聚体Fc，其包含如上所述的经修饰的CH3结构域，其中第一Fc多肽序列包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且第二Fc多肽序列包含在位置T366和T394处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置K392处的氨基酸修饰，并且其中第一Fc多肽序列还包含在位置S400或Q347中的一处或两处的氨基酸修饰和/或第二Fc多肽序列还包含在位置K360或N390中的一处或两处的氨基酸修饰，其中在位置S400处的氨基酸修饰为S400E、S400D、S400R或S400K；在位置Q347处的氨基酸修饰为Q347R、Q347E或Q347K；在位置K360处的氨基酸修饰为K360D或K360E，并且在位置N390处的氨基酸修饰为N390R、N390K或N390D。在一些实施方案中，在位置F405处的氨基酸修饰是F405A、F405S、F405T或F405V。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含具有经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc支架，所述经修饰的CH3结构域包含变体1、变体2、变体3、变体4或变体5中任一个的修饰，如表1所示。
表1：IgG1 Fc序列
Figure BDA0002736406090000221
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含具有经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc支架，所述经修饰的CH3结构域具有包含选自L351Y、F405A和Y407V的一个或多个氨基酸修饰的第一CH3序列，和包含氨基酸修饰T366L或T366I；K392L或K392M和T394W的第二CH3序列，并且第一和第二CH3序列中的一者或两者可以任选地还包含氨基酸修饰T350V。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含具有经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc支架，所述经修饰的CH3结构域包含促进异二聚体Fc形成的如上所述的不对称氨基酸修饰，其中异二聚体CH3结构域具有与野生型同型二聚体CH3结构域同等的稳定性。可以通过测量CH3结构域的熔解温度(Tm)，例如通过差示扫描量热法(DSC)测量来评估CH3结构域的稳定性。在一些实施方案中，所述一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域形成，其中CH3结构域具有如差示扫描量热法研究中经由溶解温度(Tm)所观测到的稳定性，所述熔解温度在针对相应的对称野生型同型二聚体CH3结构域所观测到的熔解温度的约8℃以内，例如约7℃、约6℃、约5℃或约4℃以内。
与表达的产物中的同型二聚体Fc相比，可以形成纯度为至少约75％的包含经修饰的CH3序列的异二聚体Fc。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含具有经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc支架，所述经修饰的CH3结构域包含促进形成纯度大于约80％、大于约85％、大于约90％、大于约95％或大于约97％的异二聚体Fc的不对称氨基酸修饰。
本领域已知修饰单体Fc多肽以促进异二聚体Fc形成的其它方法，并且包括例如以下描述的那些：国际专利申请公布号WO 96/027011(杵臼结构)；Gunasekaran等人J BiolChem,285,19637-46(2010)(实现选择性异二聚化的静电设计)；Davis等人,Prot Eng DesSel,23(4):195-202(2010)(链交换工程化结构域(SEED)技术)和Labrijn等人,Proc NatlAcad Sci USA,110(13):5145-50(2013)(Fab臂交换)。
在一些抗HER2双互补位抗体包含异二聚体Fc支架的实施方案中，该异二聚体Fc还包含CH2结构域。在一些实施方案中，该CH2结构域是经修饰的CH2结构域。Fc的CH2结构域的一个实例是表1所示序列的氨基酸231-340。几种效应子功能由与抗体的Fc结合的Fc受体(FcR)介导。
Fc受体(FcR)包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。在某些实施方案中，术语FcR还可以包括新生儿受体FcRn。
CH2结构域中的修饰可影响FcR与Fc的结合。Fc区中的许多氨基酸修饰在本领域中是已知的，用于选择性改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力。在抗HER2双互补位抗体包含具有经修饰的CH2结构域的异二聚体Fc支架的一些实施方案中，所述经修饰的CH2结构域可以包含一个或多个促进Fcγ受体的选择性结合的修饰。
改变FcR对Fc的结合的修饰的非限制性实例包括S298A/E333A/K334A和S298A/E333A/K334A/K326A(Lu等人, J Immunol Methods, 365(1-2):132-41(2011))；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen等人,Cancer Res,67(18):8882-90 (2007)和Nordstrom JL等人, Breast Cancer Res, 13(6):R123(2011))；F243L (Stewart等人, Protein Eng Des Sel. 24(9):671-8 (2011))；S298A/E333A/K334A(Shields等人, J Biol Chem, 276(9):6591-604 (2001))；S239D/I332E/A330L和S239D/I332E (Lazar等人, Proc Natl Acad Sci USA,103(11): 4005-10(2006))；S239D/S267E以及S267E/L328F (Chu等人, Mol Immunol, 45(15): 3926-33(2008))。在Therapeutic Antibody Engineering(Strohl和Strohl, WoodheadPublishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9,2012年10月, 第283页)中描述了影响FcR对Fc的结合的其它修饰。在国际专利公布号WO 2014/190441中描述了包含影响被FcR结合的不对称修饰的Fc区。
可以对Fc区进行其它修饰以提高其介导效应子功能的能力。此类修饰是本领域已知的并且包括无岩藻糖基化，或者工程改造Fc对活化受体，主要是ADCC的FcγRIIIa以及对CDC的C1q的亲和力。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含经修饰以改善其介导效应子功能的能力的Fc区。
不改变氨基酸序列而产生在Fc糖基化位点(Asn 297，EU编号)上几乎没有岩藻糖的抗体的方法是本领域熟知的。例如，
Figure BDA0002736406090000241
技术(ProBioGen AG)(参见von Horsten等人, Glycobiology, 20(12):1607-18 (2010)和美国专利号8,409,572)。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含无糖基化的Fc区。在这种情况下，抗HER2双互补位抗体可以完全无岩藻糖基化(即不含可检测到的岩藻糖)或部分无岩藻糖基化，使得抗HER2双互补位抗体含有通常对于哺乳动物表达系统产生的类似构建体而言所检测到的岩藻糖的量的少于95％、少于85％、少于75％、少于65％、少于55％、少于45％、少于35％、少于25％、少于15％或少于5％或介于之间的任何量。
降低FcγR和/或补体结合和/或效应子功能的Fc修饰是本领域已知的，包括上述那些Fc修饰。各种出版物描述了用于工程改造效应子活性降低或沉默的抗体的策略(参见，例如，Strohl,Curr Opin Biotech 20:685-691(2009)，以及Strohl和Strohl,“AntibodyFc engineering for optimal antibody performance”,Therapeutic AntibodyEngineering,Cambridge:Woodhead Publishing(2012)，第225-249页)。这些策略包括通过糖基化修饰、使用IgG2/IgG4支架，或在Fc的铰链或CH2区中引入突变来降低效应子功能(还请参见美国专利公布号2011/0212087、国际专利公布号WO 2006/105338、美国专利公布号2012/0225058、美国专利公布号2012/0251531和Strop等人,J.Mol.Biol.420:204-219(2012))。
会减少FcγR或补体与Fc结合的已知氨基酸修饰的具体非限制性实例包括表2中确定的那些已知氨基酸修饰。
表2：会减少FcγR或补体与Fc结合的修饰
Figure BDA0002736406090000251
Figure BDA0002736406090000261
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含Fc区，该Fc区包含具有表2中确定的一个或多个突变的经修饰的CH2结构域。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可以包含Fc区，该Fc区包含在位置L234、L235和/或D265处具有氨基酸修饰的经修饰的CH2结构域。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体可包含Fc区，该Fc区包含具有氨基酸修饰L234A、L235A和D265S的经修饰的CH2结构域。
HER2表位
抗HER2双互补位抗体所包含的两个抗原结合多肽构建体各自与HER2的不同表位结合，即，第一抗原结合多肽构建体与第一HER2表位结合，并且第二抗原结合多肽构建体与第二HER2表位结合。在本公开的上下文中，每个抗原结合多肽构建体与其靶表位特异性地结合。
“特异性地结合”或“特异性结合”意指结合对抗原是有选择性的，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合多肽构建体与特定表位结合的能力可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上进行分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))或传统结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))进行测量。在一些实施方案中，当例如通过SPR测量，抗原结合多肽构建体与无关蛋白的结合程度小于抗原结合多肽构建体与其靶表位结合的约10％时，认为抗原结合多肽构建体与其靶表位特异性结合。
“HER2”(也称为ErbB2)是指例如在Semba等人PNAS(USA),82:6497-6501(1985)和Yamamoto等人,Nature,319:230-234(1986)中描述的人HER2蛋白(GenBank登录号X03363)。术语“erbB2”和“neu”是指编码人HER2蛋白的基因。术语p185或p185neu也可以用于指neu基因的蛋白产物。
HER2包含通常结合HER配体的细胞外结构域、亲脂性跨膜结构域、保守性细胞内酪氨酸激酶结构域和带有几个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传导结构域。HER2的细胞外(外)结构域包含四个结构域，结构域I-IV。表3中提供了HER2的序列(SEQ ID NO:2)。细胞外结构域(ECD)的边界是：结构域I-大约为氨基酸1-165；结构域II-大约为氨基酸166-322；结构域III-大约为氨基酸323-488，及结构域IV-大约为氨基酸489-607。
表3：人HER2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0002736406090000271
“表位2C4”是HER2的细胞外结构域中与抗体2C4结合的区域，并且包含来自HER2的细胞外结构域中的结构域II(也称为ECD2)的残基。2C4和帕妥珠单抗与HER2的细胞外结构域在结构域I、II和III的交界处结合(Franklin等人Cancer Cell 5:317-328(2004))。
“表位4D5”是HER2的细胞外结构域中与抗体4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥珠单抗结合的区域。该表位靠近HER2的跨膜结构域，并且处于HER2的结构域IV(也称为ECD4)内。
一般而言，本公开的抗HER2双互补位抗体将与HER2的细胞外结构域内的表位结合。在一些实施方案中，由抗HER2双互补位抗体的第一和第二抗原结合多肽构建体结合的第一和第二HER2表位是非重叠的表位。在一些实施方案中，由抗HER2双互补位抗体的第一和第二抗原结合多肽构建体结合的第一和第二HER2表位处于HER2的不同细胞外结构域上。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的第一抗原结合多肽构建体与HER2的第一结构域上的第一HER2表位结合，并且第二抗原结合多肽构建体与HER2的第二结构域上的第二HER2表位结合。在一些实施方案中，HER2的第一结构域是ECD2，HER2的第二结构域是ECD4。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个与曲妥珠单抗竞争结合HER2。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个与帕妥珠单抗竞争结合HER2。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个与曲妥珠单抗竞争结合HER2，并且另一个抗原结合多肽构建体与帕妥珠单抗竞争结合HER2。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个是Fab或scFv形式并且与曲妥珠单抗竞争结合HER2，并且另一个抗原结合多肽构建体是Fab或scFv形式并且与帕妥珠单抗竞争结合HER2。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个是Fab形式并且与曲妥珠单抗竞争结合HER2，并且另一个抗原结合多肽构建体是scFv形式并且与帕妥珠单抗竞争结合HER2。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个与曲妥珠单抗结合HER2上的相同表位。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个与帕妥珠单抗结合HER2上的相同表位。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个与曲妥珠单抗结合HER2上的相同表位，并且另一个抗原结合多肽构建体与帕妥珠单抗结合HER2上的相同表位。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体所包含的抗原结合多肽构建体中的一个包含曲妥珠单抗的CDR序列或其变体，所述CDR序列或其变体包含一种或多种已知会增加HER2结合的突变，并且另一个抗原结合多肽构建体包含帕妥珠单抗的CDR或其变体，所述CDR或其变体包含一种或多种已知会增加HER2结合的突变。已知会增强曲妥珠单抗或帕妥珠单抗对HER2的结合的文献突变包括下面表4和表5中列出的那些突变(HC＝重链；LC＝轻链)。还考虑了这些突变的组合。
表4：增加与HER2的结合的曲妥珠单抗突变
Figure BDA0002736406090000281
Figure BDA0002736406090000291
表5：增加与HER2的结合的帕妥珠单抗突变
Figure BDA0002736406090000292
各种抗HER2双互补位抗体是本领域已知的，并且可以是适合包含在本文所述的ADC中的候选抗体。实例包括在美国专利申请公布号2014/0170148；2015/0284463；2016/0289335；2017/0029529；2017/0291955和2018/0022820，以及国际专利申请公布号WO2016/179707中描述的抗体。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体是美国专利申请公布号2016/0289335中描述的双互补位抗体中的一种。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体是v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种(参见表6、表6A和表6B以及序列表)。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD2结合臂的VH序列和VL序列。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD2结合臂的VH序列和VL序列，并且另一个抗原结合多肽构建体包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD4结合臂的VH序列和VL序列。
在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD2结合臂的CDR序列。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD2结合臂的CDR序列，并且另一个抗原结合多肽构建体包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD4结合臂的CDR序列。
本领域技术人员将认识到，可以将有限数量的氨基酸取代引入已知抗体的CDR序列或VH序列或VL序列中，而抗体不会失去结合其靶标的能力。可以通过计算机建模或通过本领域已知的技术诸如丙氨酸扫描来鉴定候选氨基酸取代，并通过标准技术测试所得变体的结合活性。因此，在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包括一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3，和轻链CDR1、CDR2和CDR3)，该组CDR与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD2结合臂的一组CDR具有90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的序列同一性，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD2的能力。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含这些CDR序列的变体，所述变体在六个CDR之间包含1至10个氨基酸取代(即，CDR可以通过包括多达10个氨基酸取代而得以修饰，并且CDR的任何组合得以修饰)，例如，在CDR中有1至7个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代、1至4个氨基酸取代、1至3个氨基酸取代、1至2个氨基酸取代，或1个氨基酸取代，其中所述变体保持结合ECD2的能力。通常，此类氨基酸取代将是保守性氨基酸取代。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3，和轻链CDR1、CDR2和CDR3)，该组CDR与来自v10000的ECD2结合臂的一组CDR具有90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的序列同一性，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD2的能力。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD2结合臂的VH序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VH序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD2的能力。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD2结合臂的VL序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VL序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD2的能力。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v10000的ECD2结合臂的VH序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VH序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD2的能力。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v10000的ECD2结合臂的VL序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VL序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD2的能力。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包括一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3，和轻链CDR1、CDR2和CDR3)，该组CDR与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD4结合臂的一组CDR具有90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的序列同一性，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD4的能力。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含这些CDR序列的变体，所述变体在六个CDR之间包含1至10个氨基酸取代(即，CDR可以通过包括多达10个氨基酸取代而得以修饰，并且CDR的任何组合得以修饰)，例如，在CDR中有1至7个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代、1至4个氨基酸取代、1至3个氨基酸取代、1至2个氨基酸取代，或1个氨基酸取代，其中所述变体保持结合ECD4的能力。通常，此类氨基酸取代将是保守性氨基酸取代。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3，和轻链CDR1、CDR2和CDR3)，该组CDR与来自v10000的ECD4结合臂的一组CDR序列具有90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的同一性，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD4的能力。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD4结合臂的VH序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VH序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD4的能力。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中的一种的ECD4结合臂的VL序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VL序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD4的能力。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v10000的ECD4结合臂的VH序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VH序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD4的能力。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含与来自v10000的ECD4结合臂的VL序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的VL序列，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD4的能力。
表6：例示性抗HER2双互补位抗体
Figure BDA0002736406090000331
Figure BDA0002736406090000341
*Fab或可变结构域编号根据Kabat(Kabat等人,Sequences of proteins ofimmunological interest，第5版,US Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242,第647页,1991)
§CH3编号如同Kabat一样根据EU索引(Edelman等人，1969,PNAS USA,63:78-85)
表6A：变体v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903和v6717的ECD2结合臂的CDR序列
Figure BDA0002736406090000342
Figure BDA0002736406090000351
表6B：v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903和v6717变体的ECD4结合臂的CDR序列
Figure BDA0002736406090000352
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体是国际专利申请公布号WO2016/179707中描述的双互补位抗体之一。本申请描述了抗HER2抗体帕妥珠单抗的高亲和力变体，包括包含来自高亲和力变体的序列作为一个抗原结合结构域的双互补位抗体。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体是v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085中的一种(参见表7和表7A以及序列表)。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085中的一种的ECD2结合臂的VH序列和VL序列。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085中的一种的ECD2结合臂的CDR序列。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085中的一种的ECD2结合臂的VH序列和VL序列，并且另一个抗原结合多肽构建体包含来自曲妥珠单抗的VH序列和VL序列。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体的抗原结合多肽构建体中的一个包含来自v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085中的一种的ECD2结合臂的CDR序列，并且另一个抗原结合多肽构建体包含来自曲妥珠单抗的CDR序列。
表7：其它例示性抗HER2双互补位抗体
Figure BDA0002736406090000353
Figure BDA0002736406090000361
Figure BDA0002736406090000371
*Fab或可变结构域编号根据Kabat(Kabat等人,Sequences of proteins ofimmunological interest，第5版,US Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242,第647页,1991)
§CH3编号如同Kabat一样根据EU索引(Edelman等人，1969,PNAS USA,63:78-85)
表7A：变体v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084和v15085的ECD2结合臂的CDR序列
Figure BDA0002736406090000372
Figure BDA0002736406090000381
抗HER2双互补位抗体的特性
毒素以低DAR偶联对抗HER2双互补位抗体特别有益，所述抗HER2双互补位抗体与相应的二价单特异性抗体相比显示出与HER2的结合增加和/或向表达HER2的细胞的内化更高。相应的二价单特异性抗体可以包含双互补位抗体所包含的两个第一抗原结合多肽构建体，或两个第二抗原结合多肽构建体。
在某些实施方案中，与相应的二价单特异性抗体相比，抗HER2双互补位抗体显示出与HER2的结合增加(即以更高的亲和力结合)。结合增加可以例如通过解离常数的减小和/或最大结合力的增加而显示出来。
解离常数或(KD)是指特定配体-蛋白质相互作用，诸如抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。KD衡量两种蛋白质(例如AB)可逆性地解离成较小组分(A+B)的倾向，并且定义为解离速率(也称为“分离速率”或koff)与缔合速率(也称为“结合速率”或kon)的比率。因此，KD等于koff/kon，并且表示为摩尔浓度(M)。由此断定KD越小，结合亲和力越强。抗体的KD值可以使用本领域熟知的方法测定。此类方法的实例包括通常使用生物传感器系统诸如
Figure BDA0002736406090000391
系统的表面等离子体共振(SPR)和等温滴定量热法(ITC)。
表观KD或表观平衡解离常数表示观察到最大半数细胞结合时的抗体浓度。表观KD取决于细胞结合实验的条件，诸如在细胞上表达的不同受体水平和孵育条件，因此表观KD通常不同于从无细胞分子实验诸如SPR和ITC测定的KD值。但是，不同方法之间通常有很好的一致性。
最大结合(或“Bmax”)是指在饱和抗体浓度下细胞上的最大抗体结合水平。可以任意单位MFI报告该参数以进行相对比较，也可以使用标准曲线将其转换为与细胞结合的抗体数量相对应的绝对值。
Bmax和表观KD可以通过各种技术测定。一个实例是通过流式细胞术测量与表达靶抗原的细胞的结合。通常，在此类实验中，将表达靶抗原的细胞与不同浓度的抗体一起孵育，洗涤，与用于检测抗体的第二试剂孵育，洗涤并在流式细胞仪中进行分析以测量平均荧光强度(MFI)，平均荧光强度表示细胞上检测信号的强度，而该强度又与细胞结合的抗体数量有关。然后将抗体浓度对MFI数据拟合到饱和结合方程中，以得出Bmax和表观KD。
在某些实施方案中，与相应参考抗体相比，所述抗HER2双互补位抗体显示出对展示HER2的靶细胞的Bmax增加。对于包含如本文所述的第一抗原结合多肽构建体和第二抗原结合多肽构建体的抗HER2双互补位抗体，相应参考抗体将是包含两个第一抗原结合多肽构建体，或两个第二抗原结合多肽构建体的二价单特异性抗体。在某些实施方案中，针对抗HER2双互补位抗体测定的Bmax是相应参考抗体的Bmax的至少约110％。在一些实施方案中，针对抗HER2双互补位抗体测定的Bmax是相应参考抗体的Bmax的至少约125％，例如相应参考抗体的Bmax的约150％，或相应参考抗体的Bmax的至少约200％。
在一些实施方案中，针对抗HER2双互补位抗体测定的Bmax是参考抗体的Bmax的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0倍。
在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体显示出比相应的参考二价单特异性抗体更多内化到表达HER2的细胞中。抗HER2双互补位抗体通过与受体HER2结合而在HER2+细胞中内化。因此可以认为抗HER2双互补位抗体能够在HER2+细胞中诱导受体内化。
抗体内化可以使用本领域已知的方法测量，例如，根据Schmidt,M.等人,CancerImmunol Immunother,57:1879-1890(2008)中详述的方案通过直接内化方法测量。如本领域中已知的，癌细胞可以各种水平表达HER2。将表达HER2的细胞分类的一种方法是分类为HER2 1+、2+或3+(分别为低、中和高)。在某些实施方案中，抗HER2双互补位抗体在以3+水平表达HER2的细胞中显示出比相应的参考二价单特异性抗体更高的内化。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体在以2+水平表达HER2的细胞中显示出比相应的参考二价单特异性抗体更高的内化。在一些实施方案中，抗HER2双互补位抗体在以1+水平表达HER2的细胞中显示出比相应的参考二价单特异性抗体更高的内化。表达不同水平的HER2的细胞系的实例在下面有更详细的描述。
在本公开的上下文中，当内化到表达HER2的细胞中的抗HER2双互补位抗体的量是内化到相同的表达HER2的细胞中的参考二价单特异性抗体的量的至少1.2倍时，认为抗HER2双互补位抗体展现出比相应的参考二价单特异性抗体更高的内化到表达HER2的细胞中。在某些实施方案中，根据Schmidt,M.等人,Cancer Immunol Immunother,57:1879-1890(2008)中详述的方案，通过直接内化方法测定内化抗体的量。在一些实施方案中，在以2+水平表达HER2的表达HER2的细胞中测定内化抗体的量。
在一些实施方案中，当内化到表达HER2的细胞中的抗HER2双互补位抗体的量是内化到相同的表达HER2的细胞中的参考二价单特异性抗体的量的至少1.3倍时，认为抗HER2双互补位抗体展现出比相应的参考二价单特异性抗体更高的内化到表达HER2的细胞中。在一些实施方案中，当内化到表达HER2的细胞中的抗HER2双互补位抗体的量是内化到相同的表达HER2的细胞中的参考二价单特异性抗体的量的至少1.4倍，例如至少1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2.0倍时，认为抗HER2双互补位抗体展现出比相应的参考二价单特异性抗体更高的内化到表达HER2的细胞中。在某些实施方案中，根据Schmidt,M.等人,CancerImmunol Immunother,57:1879-1890(2008)中详述的方案，通过直接内化方法测定内化抗体的量。在一些实施方案中，在以2+水平表达HER2的表达HER2的细胞中测定内化抗体的量。
澳瑞他汀类似物
本文所述的ADC包含基于澳瑞他汀的毒素(或“澳瑞他汀类似物”)。各种澳瑞他汀类似物是本领域已知的。实例包括但不限于单甲基奥他汀F(MMAF)、单甲基奥他汀E(MMAE)、澳瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EVB(AEVB)和澳瑞他汀F苯二胺(AFP)。各种澳瑞他汀类似物的合成和结构在美国专利号6,884,869；7,098,308；7,256,257和7,498,298中进行了描述。
在某些实施方案中，本文所述的ADC中包括的澳瑞他汀类似物可以是如国际专利申请公布号WO 2016/041082中描述的澳瑞他汀类似物。在某些实施方案中，本文所述的ADC中包括的澳瑞他汀类似物是通式(I)的化合物：
Figure BDA0002736406090000411
其中：
X为-C(O)NHCH(CH2R2)-，或X不存在；
R1选自：
Figure BDA0002736406090000412
并且
R2为苯基。
在某些实施方案中，在通式(I)的化合物中，R1选自：
Figure BDA0002736406090000421
在某些实施方案中，在通式(I)的化合物中，X不存在。
在某些实施方案中，通式(I)的化合物具有通式(IV)：
Figure BDA0002736406090000422
其中R1如同对于通式(I)所定义的。
在某些实施方案中，在式(IV)的化合物中，R1选自：
Figure BDA0002736406090000423
在某些实施方案中，在式(IV)的化合物中，R1为：
Figure BDA0002736406090000424
在某些实施方案中，在式(IV)的化合物中，R1为：
Figure BDA0002736406090000425
在某些实施方案中，通式(I)的化合物具有通式(V)：
Figure BDA0002736406090000431
其中R1如同对于通式(I)所定义的。
在某些实施方案中，在式(V)的化合物中，R1选自：
Figure BDA0002736406090000432
在某些实施方案中，在式(V)的化合物中，R1为：
Figure BDA0002736406090000433
在某些实施方案中，在式(V)的化合物中，R1为：
Figure BDA0002736406090000434
通式(I)的化合物可以通过标准的合成有机化学方案由市售的原材料制备。国际专利申请公布号WO 2016/041082和下面的实施例部分中提供了例示性方法。
应当理解的是，在整个本公开的其余部分中，对通式(I)的化合物的提及在各个实施方案中包括通式(IV)和(V)的化合物，其程度如同具体叙述了单独叙述这些化学式中的每一个的实施方案一样。
在某些实施方案中，本公开的ADC包含经由接头(L)与澳瑞他汀类似物(毒素)偶联的抗HER2双互补位抗体，其中所述接头-毒素具有通式(II)：
Figure BDA0002736406090000441
其中：
X为-C(O)NHCH(CH2R2)-，或X不存在；
R1选自：
Figure BDA0002736406090000442
R2为苯基；
L为接头；并且
Figure BDA0002736406090000443
表示接头-毒素与抗HER2双互补位抗体的附接点。
在一些实施方案中，在通式(II)的接头-毒素中，R1选自：
Figure BDA0002736406090000444
在一些实施方案中，在通式(II)的接头-毒素中，X不存在。
在一些实施方案中，在通式(II)的接头-毒素中，L是可裂解接头。
在一些实施方案中，在通式(II)的接头-毒素中，L是含肽接头。
在某些实施方案中，通式(II)的接头-毒素具有通式(X)：
Figure BDA0002736406090000451
其中R1、L和
Figure BDA0002736406090000452
如以上对于通式(II)所定义的。
在一些实施方案中，在通式(X)的接头-毒素中，R1选自：
Figure BDA0002736406090000453
在一些实施方案中，在通式(X)的接头-毒素中，R1为：
Figure BDA0002736406090000454
在一些实施方案中，在式(X)的化合物中，R1为：
Figure BDA0002736406090000455
在一些实施方案中，在通式(X)的接头-毒素中，L是可裂解接头。
在一些实施方案中，在通式(X)的接头-毒素中，L是含肽接头。
在一些实施方案中，在通式(X)的接头-毒素中，L是蛋白酶可裂解的接头。
在某些实施方案中，通式(II)的接头-毒素具有通式(XI)：
Figure BDA0002736406090000456
Figure BDA0002736406090000461
其中R1、L和
Figure BDA0002736406090000462
如以上对于通式(II)所定义的。
在一些实施方案中，在通式(XI)的接头-毒素中，R1选自：
Figure BDA0002736406090000463
在一些实施方案中，在通式(XI)的接头-毒素中，R1为：
Figure BDA0002736406090000464
在一些实施方案中，在通式(XI)的接头-毒素中，R1为：
Figure BDA0002736406090000465
在一些实施方案中，在通式(XI)的接头-毒素中，L是可裂解接头。
在一些实施方案中，在通式(XI)的接头-毒素中，L是含肽接头。
在一些实施方案中，在通式(XI)的接头-毒素中，L是蛋白酶可裂解的接头。
本文还考虑了包含与通式(II)、通式(X)或通式(XI)的接头-毒素偶联的抗HER2双互补位抗体的ADC，其中所述接头具有如下所示的通式(VIII)或(IX)。
在某些实施方案中，ADC包含具有以下结构的接头-毒素：
Figure BDA0002736406090000466
其中A-S-是与所述抗HER2双互补位抗体的附接点。
在某些实施方案中，包含经由接头(L)与澳瑞他汀类似物(毒素)偶联的抗HER2双互补位抗体的本公开的ADC具有通式(III)：
Figure BDA0002736406090000471
其中X和R1如对于通式(II)所定义的；
L是接头；
n是平均药物:抗体比(DAR)且小于3.9，并且
Ab是抗HER2双互补位抗体。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，R1选自：
Figure BDA0002736406090000472
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，X不存在。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，R1为：
Figure BDA0002736406090000473
并且
X不存在。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，R1为：
Figure BDA0002736406090000474
并且
X不存在。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，X为-C(O)NHCH(CH2R2)-
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，R1为：
Figure BDA0002736406090000481
并且
X为-C(O)NHCH(CH2R2)-。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，R1为：
Figure BDA0002736406090000482
并且
X为-C(O)NHCH(CH2R2)-。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，L是可裂解接头。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，L是含肽接头。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，L是蛋白酶可裂解的接头。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，n为0.5至3.8。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，n为0.7至3.8、0.7至3.5、0.7至3.0或0.7至2.5。
在一些实施方式中，在通式(III)的ADC中，n为1.0至3.8、1.0至3.5、1.0至3.0或1.0至2.5。
在一些实施方式中，在通式(III)的ADC中，n为1.5至3.8、1.5至3.5、1.5至3.0或1.5至2.5。
在一些实施方式中，在通式(III)的ADC中，n为1.6至3.8、1.6至3.5、1.6至3.0或1.6至2.5。
在一些实施方案中，在通式(III)的ADC中，n为1.8至2.8或1.8至2.5。
还考虑了通式(III)的化合物的任何前述实施方案的组合，并且每种组合形成用于本公开目的的单独实施方案。
接头
在本文所述的ADC中，抗HER2双互补位抗体通过接头与澳瑞他汀类似物(毒素)连接。接头是能够将一个或多个毒素分子连接至抗体的双官能或多官能部分。接头可以是双官能的(或单价的)，使其将单个药物连接至抗体上的单个位点，或者它可以是多官能的(或多价的)，使其将一个以上的毒素分子连接至抗体上的单个位点。能够将一个毒素分子连接至抗体上一个以上的位点的接头也被认为是多官能的。
接头与抗体的附接可以多种方式实现，诸如通过抗体上的表面赖氨酸，与抗体上氧化的碳水化合物的还原偶合，或通过抗体上通过还原链间二硫连键而释放的半胱氨酸残基。另选地，可以通过以下方式实现接头与抗体的附接：将抗体修饰为包括其它半胱氨酸残基(参见，例如，美国专利号7,521,541；8,455,622和9,000,130)或提供反应性把手的非天然氨基酸，诸如硒代蛋氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、甲酰甘氨酸或对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(参见，例如，Hofer等人,Biochemistry,48:12047-12057(2009)；Axup等人,PNAS,109:16101-16106(2012)；Wu等人,PNAS,106:3000-3005(2009)；Zimmerman等人,Bioconj.Chem.,25:351-361(2014))，以允许位点特异性偶联。
接头包括能够与抗体上的一个或多个靶基反应的官能团，和一个或多个能够与毒素上的靶基反应的官能团。合适的官能团是本领域已知的并且包括例如BioconjugateTechniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)中描述的那些官能团。
与游离半胱氨酸或硫醇反应的官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、卤代乙酰基、活化酯(诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在这种情况下，如Lyon等人,Nat.Biotechnol.,32:1059-1062(2014)中描述的“自稳定型”马来酰亚胺也是有用的。
与抗体上的表面赖氨酸和毒素上的游离胺反应的官能团的非限制性实例包括活化酯(诸如N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯、磺基-NHS酯、亚氨基酯(诸如Traut试剂)、异硫氰酸酯)、醛和酸酐(诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA))。其它实例包括琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)和苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。
能够与抗体或毒素上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)反应的官能团的非限制性实例包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳酰肼。
其它接头包括那些具有允许桥接抗体上的两个链间半胱氨酸的官能团的接头，诸如ThioBridgeTM接头(Badescu等人,Bioconjug.Chem.,25:1124–1136(2014))、二硫代马来酰亚胺(DTM)接头(Behrens等人,Mol.Pharm.,12:3986–3998(2015))、基于二硫代芳基(TCEP)哒嗪二酮的接头(Lee等人,Chem.Sci.,7:799-802(2016))、基于二溴哒嗪二酮的接头(Maruani等人,Nat.Commun.,6:6645(2015))以及本领域已知的其它接头。
接头可以包含一个或多个接头组分。通常，接头将包含两个或更多个接头组分。例示性的接头组分包括用于与抗体反应的官能团、用于与毒素反应的官能团、延伸段、肽组分、自分解基团、自消除基团、亲水部分等。各种接头组分是本领域已知的，下面描述了其中一些。
某些有用的接头组分可从各种商业来源获得，诸如Pierce Biotechnology,Inc.(现Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)和Molecular Biosciences Inc.(Boulder,Colo.)，或者可以根据本领域中描述的程序合成(参见，例如，Toki等人,J.Org.Chem.,67:1866-1872(2002)；Dubowchik等人,Tetrahedron Letters,38:5257-60(1997)；Walker,M.A.,J.Org.Chem.,60:5352-5355(1995)；Frisch等人,Bioconjugate Chem.,7:180-186(1996)；美国专利号6,214,345和7,553,816，及国际专利申请公布号WO 02/088172)。
接头组分的实例包括但不限于N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ–马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双乙烯砜(HBVS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(STAB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基6-[(β–马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯](SMPH)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯(SVSB)。
其它实例包括双马来酰亚胺试剂，诸如二硫代双马来酰亚胺乙烷(DTME)、双马来酰亚胺基三氧基乙二醇(BMPEO)、1,4-双马来酰亚胺丁烷(BMB)、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、双马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2和BM(PEG)3；亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
合适的接头通常对细胞外的条件比对细胞内的条件在化学上更稳定，但是在某些情形下也可以考虑不太稳定的接头，诸如当毒素具有选择性或被靶向并且对正常细胞具有低毒性时。接头可以是“可裂解接头”或“非可裂解接头”。可裂解接头通常易于在细胞内条件下裂解，例如通过溶酶体过程裂解。实例包括蛋白酶敏感型、酸敏感型、还原敏感型或光不稳定型接头。相反，非可裂解接头依赖于细胞中抗体的降解，抗体的降解通常会导致氨基酸-接头-毒素部分的释放。
合适的可裂解接头包括，例如，包含肽组分的接头，所述肽组分包括两个或更多个氨基酸并且可被细胞内蛋白酶诸如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶裂解。肽组分可以包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。肽组分可以设计和优化以供特定酶进行酶促裂解，所述特定酶例如，肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C或D或纤维蛋白溶酶蛋白酶。
在某些实施方案中，ADC中包括的接头可以是含二肽的接头，诸如含有缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)的接头。包含在接头中的合适二肽的其它实例包括Val-Lys、Ala-Lys、Me-Val-Cit、Phe-homoLys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys和Met-(D)Lys。可裂解接头也可以包括更长的肽组分，诸如三肽、四肽或五肽。实例包括但不限于三肽Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys和(D)Ala-Phe-Lys，以及四肽Gly-Phe-Leu-Gly和Ala-Leu-Ala-Leu。
可裂解接头的其它实例包括含二硫键的接头，例如，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPBD)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPBD)。含二硫键的接头可任选地包括另外的基团，以在二硫键附近提供空间位阻，以便改善接头的细胞外稳定性，例如，包含偕二甲基。其它合适的接头包括在特定pH下或在某一pH范围内可水解的接头，诸如腙接头。包含具有这些官能性的组合的接头也可能有用，例如，包含腙和二硫化物两者的接头是本领域已知的。
可裂解接头的另一个实例是包含β-葡糖苷酸的接头，该接头可被β-葡糖苷酸酶(一种存在于溶酶体和肿瘤间质中的酶)裂解(参见，例如，De Graaf等人,Curr.Pharm.Des.,8:1391–1403(2002))。
可裂解接头可任选地进一步包含一种或多种附加组分，例如自分解基团和自消除基团、延伸段或亲水部分。
可用于接头中的自分解基团和自消除基团包括，例如，对氨基苄氧基羰基(PABC)和对氨基苄基醚(PABE)基团，以及甲基化乙二胺(MED)。自分解基团的其它实例包括但不限于：在电子特性上类似于PABC或PABE基团的芳族化合物，诸如杂环衍生物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物，如美国专利号7,375,078中所述。其它实例包括在酰胺键水解后会发生环化的基团，诸如经取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人,ChemistryBiology,2:223-227(1995))和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人,J.Org.Chem.,55:5867-5877(1990))。
可用于ADC的接头中的延伸段包括例如亚烷基和基于脂族酸、二酸、胺或二胺的延伸段，诸如二甘醇酸酯、丙二酸酯、己酸酯和己酰胺。其它延伸段包括，例如，基于甘氨酸的延伸段、聚乙二醇(PEG)延伸段和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)延伸段。PEG和mPEG延伸段也起亲水部分的作用。
在一些实施方案中通常在可用于本公开的ADC中的可裂解接头中发现的组分的实例包括但不限于SPBD、磺基-SPBD、腙、Val-Cit、马来酰亚胺基己酰基(maleidocaproyl)(MC或mc)、mc-Val-Cit、mc-Val-Cit-PABC、Phe-Lys、mc-Phe-Lys、mc-Phe-Lys-PABC、马来酰亚胺三乙烯甘醇酸酯(MT)、MT-Val-Cit、MT-Phe-Lys和己二酸酯(AD)。
在某些实施方案中，本公开的ADC中包括的接头是具有通式(VI)的基于肽的接头：
Figure BDA0002736406090000531
其中：
Z是能够与抗体上的靶基反应的官能团；
Str为延伸段；
AA1和AA2各自独立地为氨基酸，其中AA1-[AA2]m形成蛋白酶裂解位点；
X为自分解基团；
D是与所述澳瑞他汀类似物的附接点；
s为0或1；
m为1至4之间的整数，并且
o为0、1或2。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，Z为：
Figure BDA0002736406090000541
在一些实施方案中，在通式(VI)中，Str选自：
Figure BDA0002736406090000542
其中：
R为H或C1-C6烷基；
p为2至10之间的整数，并且
q为1至10之间的整数。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，Str为：
Figure BDA0002736406090000543
其中p和q如上定义。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，Str为：
Figure BDA0002736406090000544
其中p为2至6之间的整数，并且
其中q为2至8之间的整数。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，AA1-[AA2]m选自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys、(D)Ala-Phe-Lys、Gly-Phe-Leu-Gly和Ala-Leu-Ala-Leu。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，m为1(即AA1-[AA2]m是二肽)。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，AA1-[AA2]m是选自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit和Trp-Cit的二肽。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，每个X独立地选自对氨基苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基醚(PABE)和甲基化乙二胺(MED)。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，m为1、2或3。
在一些实施方式中，在通式(VI)中，s为1。
在一些实施方案中，在通式(VI)中，o为0。
在一些实施方案中，在通式(VI)中：
Z为
Figure BDA0002736406090000551
Str为
Figure BDA0002736406090000552
或
Figure BDA0002736406090000553
其中p是2至6之间的整数，q是2至8之间的整数；
m为1并且AA1-[AA2]m是选自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit和Trp-Cit的二肽；
s为1，并且
o为0。
在一些实施方案中，所述接头是含二硫化物的接头，并且所述ADC具有通式(VII)：
Figure BDA0002736406090000561
其中：
A为抗体；
D为澳瑞他汀类似物；
Y为–(CH2)p-或–(CH2CH2O)q-，其中p和q各自独立地为1至10之间的整数；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
r为1、2或3，并且
其中
Figure BDA0002736406090000562
表示在接头和抗体上表面赖氨酸的ε-氨基之间形成的酰胺键。
在通式(VII)的一些实施方案中，p和q各自独立地为1至4之间的整数。
在通式(VII)的一些实施方案中，Y为–(CH2)p-并且p为1至4之间的整数。
在通式(VII)的一些实施方案中，每个R独立地为H或Me。
在通式(VII)的一些实施方案中，r为1或2。
各种非可裂解接头在本领域中是已知的，用于将药物与抗体连接，并且在某些实施方案中可用于本公开的ADC中。非可裂解接头的实例包括具有用于与抗体反应的N-琥珀酰亚胺酯或N-磺基琥珀酰亚胺酯部分，以及用于与毒素反应的基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分(或反之亦然)的接头。此类非可裂解接头的实例是基于磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯(磺基SMCC)。此类接头的其它非限制性实例包括基于N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(“长链”SMCC或LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)和N-(对马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)的那些接头。其它实例包括那些包含基于卤代乙酰基的官能团，诸如N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)的接头。
非可裂解接头的其它实例包括马来酰亚胺羧酸，诸如马来酰亚胺己酰基(MC)。
本领域技术人员，通过考虑相关因素，诸如与抗体的附接位点、毒素的任何结构限制和毒素的疏水性，可以很容易地为给定ADC选择适当的接头(参见，例如，在Nolting,第5章,Antibody-Drug Conjugates:Methods in Molecular Biology,2013,Ducry(编辑),Springer中的综述)。
在某些实施方案中，本公开的ADC中包括的接头具有通式(VIII)：
Figure BDA0002736406090000571
其中：
A-S-是与抗HER2双互补位抗体的附接点；
Y是一个或多个附加接头组分，或者不存在，并且
D是与澳瑞他汀类似物的附接点。
在某些实施方案中，本公开的ADC中包括的接头具有通式(IX)：
Figure BDA0002736406090000581
其中：
A-S-是与抗HER2双互补位抗体的附接点；
Y是一个或多个附加接头组分，或者不存在，并且
D是与澳瑞他汀类似物的附接点。
抗体药物偶联物的制备
可以通过本领域已知的几种途径之一，采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂来制备本公开的ADC(参见，例如，Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press，以及本文提供的实施例)。例如，可以通过以下方式实现偶联：(1)抗体的亲核基团或亲电子基团与双官能接头反应，经由共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，然后与活化的澳瑞他汀类似物(D)反应，或(2)澳瑞他汀类似物的亲核基团或亲电子基团与接头反应，经由共价键形成接头-毒素D-L，然后与抗体的亲核基团或亲电子基团反应。偶联方法(1)和(2)可与多种抗体、澳瑞他汀类似物和接头一起用于制备本文所述的ADC。
如上所述，澳瑞他汀类似物可以经由适当的接头与抗体上的各个基团偶联以提供ADC。例如，偶联可以通过表面赖氨酸，通过氧化的碳水化合物或通过已经通过还原一个或多个链间二硫连键而释放的半胱氨酸残基来进行。另选地，可以将抗体修饰为包括其它半胱氨酸残基或提供反应性把手的非天然氨基酸，诸如硒代蛋氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、甲酰甘氨酸或对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸。此类修饰是本领域熟知的(参见，例如，美国专利号7,521,541；8,455,622和9,000,130；Hofer等人，Biochemistry,48:12047-12057(2009)；Axup等人，PNAS,109:16101-16106(2012)；Wu等人，PNAS,106:3000-3005(2009)；Zimmerman等人，Bioconj.Chem.,25:351-361(2014))。
在某些实施方案中，本公开的ADC包含经由适当的接头偶联至已通过还原一个或多个链间二硫连键而释放的半胱氨酸残基的澳瑞他汀类似物。
在本文所述的ADC中，抗HER2双互补位抗体经由接头以低的平均药物:抗体比(DAR)，特别是小于3.9但大于0.5，例如在某些实施方案中为约1.5至约2.5的平均DAR与毒素偶联。
在本领域中已知各种方法来制备具有低平均DAR的ADC(参见，例如McCombs和Owen,The AAPS Journal,17(2):339-351(2015)的综述以及其中的参考文献；Boutureira和Bernardes,Chem.Rev.,115:2174-2195(2015))。
例如，为了与半胱氨酸残基偶联，可以进行抗体链间二硫键的部分还原，然后与接头-毒素偶联。可通过限制还原反应中使用的还原剂的量来实现部分还原(参见，例如，Lyon等人，Methods in Enzymology,502:123-138(2012)及其中的实施例，以及本文提供的实施例)。合适的还原剂是本领域已知的，并且包括例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、2-巯基乙醇、半胱胺和许多水溶性膦。另选地，或另外，为了获得低的平均DAR，可以采用更少当量的接头-毒素。
另选地，可以采用工程化抗体，其中构成链间二硫键的一个或多个半胱氨酸残基被丝氨酸残基置换，从而导致更少的可用半胱氨酸残基用于偶联(参见McDonagh等人,Protein Eng.Des.Sel.PEDS,19(7):299-307)。然后可以用还原剂处理工程化抗体，并使其与接头-毒素偶联。
另一种方法是采用双硫醇接头，该双硫醇接头桥接通常构成链间二硫键的两个半胱氨酸。如果所有四个链间二硫键均被还原并且置换为双硫醇接头，则使用仅携带一个毒素分子的双硫醇接头将对于全尺寸抗体而言产生具有最大DAR4的ADC。可以将链间二硫键的部分还原和/或较少当量的接头连同双硫醇接头一起使用，以进一步降低DAR。各种双硫醇接头是本领域已知的(参见，例如Badescu等人,Bioconjug.Chem.,25(6):1124-1136(2014)；Behrens等人,Mol.Pharm.,12:3986–3998(2015)；Lee等人,Chem.Sci.,7:799-802(2016)；Maruani等人,Nat.Commun.,6:6645(2015))。
也可以采用半胱氨酸工程化方法来生成具有低平均DAR的ADC。此类方法涉及将溶剂可及的半胱氨酸工程化到抗体中，以便提供用于偶联的位点特异性把手。已经用IgG结构鉴定了许多适于引入半胱氨酸残基的位点，包括Junutula等人,J.Immunol Methods,332(1-2):41-52(2008)；Junutula等人,Nat.Biotechnol.,26(8),925-932(2008)，以及美国专利号9,315,581；9,000,130；8,455,622；8,507,654和7,521,541中描述的那些位点。
还可以通过采用有限量的活化接头-毒素，通过赖氨酸偶联来制备低平均DARADC。也可以采用抗体N端氨基酸的选择性反应。例如，可以用高碘酸盐将N端丝氨酸氧化成醛，然后使其与接头-毒素反应(参见，例如，Thompson等人,Bioconjug.Chem.,26(10):2085-2096(2015))。类似地，N端半胱氨酸残基可以与醛选择性反应生成噻唑烷酮(参见，例如Bernardes等人，Nature Protocols,8:2079-2089)。
其它方法包括将抗体工程化为包括一种或多种非天然氨基酸，诸如对乙酰基苯丙氨酸(pAcPhe)或硒代半胱氨酸(Sec)。pAcPhe中的酮基能与包含末端烷氧基胺或酰肼的接头-毒素反应形成肟或腙键(参见，例如Axup等人,PNAS USA,109:16101-16106(2012))。含Sec的抗体能与含有马来酰亚胺或碘乙酰胺的接头-毒素反应形成硒醚偶联物(参见，例如Hofer等人,Biochemistry,48:12047-12057(2009))。
抗体也可以工程化为包括被某些酶识别的肽标签，以允许进行酶催化的偶联。例如，分选酶-A(SortA)识别序列LPXTG。该五肽可以工程化到抗体的N端或C端以允许SortA介导的偶联(参见，例如，美国专利申请公布号2016/0136298；Kornberger和Skerra,mAbs,6(2):354-366(2014))。转谷氨酰胺酶也已用于通过使用已在位置N297处去糖基化的抗体(其暴露出Q295以进行酶促偶联)或通过将抗体工程化为包括“谷氨酰胺标签”(LLQG)来生成DAR2 ADC(Jeger等人,Angew.Chem.,49:9995-9997(2010)；Strop等人,Chem.Biol.,20(2):161-167(2013))。在另一种方法中，可以通过将适当的共有序列工程化到抗体中并且使工程化抗体与产生甲酰甘氨酸的酶(FGE)共表达来将甲酰甘氨酸残基引入抗体中。然后引入的甲酰甘氨酸的醛官能团可以用作毒素偶联的把手(参见，例如Drake等人,Bioconjug.Chem.,25(7):1331-1341(2014))。
用于生成DAR2 ADC的另一种方法是将接头-毒素与糖基化抗体上发现的天然糖偶联。与糖基化抗体的偶联可以通过以下方式实现：例如，通过高碘酸盐氧化末端糖残基产生醛，然后醛可以与适当的接头-毒素偶联，或者通过糖工程学方法，其中将天然糖用末端唾液酸残基进行修饰，然后可以将其氧化产生醛以与接头-毒素偶联(Zhou等人,Bioconjug.Chem.,25(3):510-520(2014))。
还已经报道了使用UV交联将活性部分与抗体偶联。这种方法使用核苷酸结合位点(NBS)以使反应性硫醇部分对抗体进行位点特异性共价官能化。使用半胱氨酸的吲哚-3-丁酸(IBA)偶联形式使反应性硫醇部分与抗体在NBS处进行位点特异性光致交联。然后该硫醇部分可以用于偶联具有硫醇反应性基团的接头-毒素(Alves等人,Bioconjug.Chem.,25(7):1198-1202(2014))。
另选地，可以使用色谱分离技术，诸如疏水相互作用色谱法，从含有DAR种类混合物的ADC制剂中分离出具有低平均DAR的ADC(参见，例如，Hamblett等人,Clin.CancerRes.,10:7063-7070(2004)；Sun等人,Bioconj Chem.,28:1371-81(2017)；美国专利申请公布号2014/0286968)。
也可以通过向平均DAR≥3.9的ADC制剂中添加未偶联(即DAR0)的抗体，生成具有低平均DAR的ADC制剂。如本领域中已知的，大多数偶联方法产生包括各种DAR种类的ADC制剂，所报告的DAR是各个DAR种类的平均值。在某些实施方案中，包括一定比例的DAR0种类的ADC制剂可能是有利的。在一些实施方案中，平均DAR小于3.9的ADC制剂可以包括至少5％的DAR0种类。在一些实施方案中，ADC制剂可以包括至少10％的DAR0种类，例如至少15％的DAR0种类或至少20％的DAR0种类。在一些实施方案中，ADC制剂可以包括约5％至约50％的DAR0种类。在一些实施方案中，ADC制剂可以包括约10％至约50％的DAR0种类，例如约10％至约40％的DAR0种类，或约10％至约30％的DAR0种类。
ADC的平均DAR可以通过标准技术，诸如UV/VIS光谱分析、基于ELISA的技术、色谱技术(诸如疏水相互作用色谱法(HIC))、UV-MALDI质谱法(MS)和MALDI-TOF MS来测定。另外，还可以通过本领域已知的各种技术来分析药物连接形式的分布(例如，DAR0、DAR1、DAR2等种类的百分率)，所述技术包括MS(有或无伴随的色谱分离步骤)、疏水相互作用色谱法、反相HPLC或等电聚焦凝胶电泳(IEF)(参见，例如，Sun等人,Bioconj Chem.,28:1371-81(2017)；Wakankar等人,mAbs,3:161-172(2011))。
在某些实施方案中，通过疏水相互作用色谱法(HIC)技术测定ADC的平均DAR。
偶联后，可通过本领域已知的纯化方法将ADC纯化并与未偶联的反应物和/或任何偶联物聚集体分离。此类方法包括但不限于尺寸排阻色谱法(SEC)、疏水相互作用色谱法(HIC)、离子交换色谱法、色谱聚焦、超滤、离心超滤及其组合。
测试
可以在体外和/或在体内使用标准技术测试ADC在表达HER2的癌细胞中的抗癌活性。
例如，可以通过将表达HER2的癌细胞暴露于细胞培养基中的ADC，将细胞培养适当的时间段(例如，约6小时至约7天)，然后测量细胞活力来测量ADC的细胞毒活性。可以包括非表达HER2的细胞作为对照。
可用于测试ADC的以不同水平表达HER2的多种癌细胞系是本领域已知的，并且许多是可商购的(例如，从American Type Culture Collection,Manassas,VA；AddexbioTechnologies,San Diego,CA；DSMZ,Braunschweig,Germany商购)。实例包括BT-474(3+)、SK-BR-3(3+)、HCC1954(3+)、JIMT-1(2+)和ZR-75-1(1+)细胞系。这些和其它实例汇总在表8中。
表8：HER2在所关注细胞系中的相对表达水平
Figure BDA0002736406090000631
可以在恰当的动物模型中，使用本领域已知的标准技术测定ADC抑制体内肿瘤生长的能力(参见，例如，Enna等人,Current Protocols in Pharmacology,J.Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。一般而言，目前用于筛选抗肿瘤化合物的动物模型是异种移植模型，其中已将人类肿瘤植入动物(通常为啮齿动物)中。
例如，可以在第0天使用皮下移植了肿瘤片段或植入了适当数量的癌细胞的小鼠，在体内对表达HER2的肿瘤测试ADC。允许肿瘤发展到所需大小，消除肿瘤发展不足的动物。ADC处理通常从移植后的3至22天开始，这具体取决于肿瘤的类型。ADC可以例如通过静脉内(i.v.)注射施用于动物。在预定时间段之后测量肿瘤或连续地测量肿瘤(例如，每周2次或3次)直到研究的预定终点，例如当肿瘤达到预定大小或重量时。在异种移植模型中可以使用以各种水平表达HER2的肿瘤。患者来源的异种移植物(PDX)特别有用。
ADC的体内毒性作用最初可以在啮齿动物(例如小鼠或大鼠)中，通过测量在处理期间它们对动物体重的影响来进行评价。还可以对从取自动物的血样进行血液细胞学分析和肝酶分析。
可以在适当的动物模型(例如大鼠或非人灵长类动物)中，按照标准方案进一步分析体内毒性和药代动力学。食蟹猴在这方面特别有用，因为人和食蟹猴HER2具有98％的序列同源性。
本文所述ADC与DAR≥3.9的相应ADC相比，当以相同毒素剂量施用时，具有改善的耐受性和更低的毒性。在某些实施方案中，当以相同毒素剂量施用时，ADC显示出耐受性改善，是DAR≥3.9的相应ADC的耐受性的2倍。在一些实施方案中，当以相同毒素剂量施用时，ADC显示出耐受性改善，是DAR≥3.9的相应ADC的耐受性的2.2倍，例如2.3倍、2.4倍或2.5倍。耐受性的改善可以例如通过比较本公开的ADC和DAR≥3.9的相应ADC的最大耐受剂量(MTD)、无可见不良事件水平(NOAEL)或最高非严重毒性剂量(HNSTD)而确定。MTD、NOAEL和/或HNSTD可以通过标准技术在适当的动物模型例如啮齿动物或非人灵长类动物中测量。
药物组合物
对于治疗用途，ADC可以以包含ADC和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物的形式提供。所述组合物可以使用熟知且容易获得的成分通过已知程序制备。
可将药物组合物配制成用于通过例如口服(包括例如经颊或舌下)、局部、肠胃外、直肠或阴道途径，或通过吸入或喷雾施用于受试者。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下注射，以及皮内、关节内、静脉内、肌肉内、血管内、胸骨内、鞘内注射或输注。药物组合物通常将配制成适于施用于受试者的形式，例如糖浆剂、酏剂、片剂、糖锭剂、菱形锭剂、硬胶囊或软胶囊、丸剂、栓剂、油性或水性悬浮液、可分散性粉剂或粒剂、乳液、注射剂或溶液。药物组合物可以作为单位剂量制剂提供。
在某些实施方案中，将包含ADC的药物组合物配制成用于以单位剂量注射形式，例如作为冻干制剂或水溶液进行肠胃外施用。
药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对受者无毒。此类载体的实例包括但不限于：缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质诸如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠离子；金属络合物诸如Zn-蛋白质络合物；和非离子型表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方案中，包含ADC的组合物可以是无菌可注射水性或油性溶液或悬浮液的形式。可以使用本领域已知的合适的分散剂或润湿剂和/或助悬剂配制此类悬浮液。无菌注射溶液或悬浮液可以在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载体中包含ADC。可以采用的可接受的稀释剂和载体包括例如1,3-丁二醇、水、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液。另外，可以将无菌的不挥发性油用作载体。为此，可以采用各种温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，诸如油酸的脂肪酸可用于制备注射剂。佐剂，诸如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂也可以包含在可注射溶液或悬浮液中。
在某些实施方案中，可以将包含ADC的组合物配制成用于向人静脉内施用。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和/或局部麻醉剂，诸如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，将成分分开提供或以单位剂型混合在一起，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物在指示活性剂的量的密闭容器(诸如安瓿或小药囊)中提供。当组合物要通过输注施用时，可以用装有无菌药物级水或盐水的输液瓶进行分配。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用之前将成分混合。
其它药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域已知的，并且例如在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(原名“RemingtonsPharmaceutical Sciences”)；Gennaro,A.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2000)中有描述。
使用方法
本文所述的ADC可用于抑制表达HER2的肿瘤细胞生长的方法中。所述细胞可以是在体外或在体内。在某些实施方案中，ADC可用于治疗受试者中表达HER2的癌症或肿瘤的方法中。
表达HER2的癌症的治疗可引起以下的一种或多种：缓解症状，缩小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少所述疾病的一种或多种直接或间接的病理后果，防止转移，降低疾病进展速率，改进或减轻疾病状态，改善存活期，增加无进展存活期，缓解和/或改善预后。
在某些实施方案中，用本文所述的ADC治疗表达HER2的癌症减缓了疾病的进展。在一些实施方案中，用本文所述的ADC治疗表达HER2的癌症引起肿瘤消退。在一些实施方案中，用本文所述的ADC治疗表达HER2的癌症引起肿瘤生长的抑制。
表达HER2的癌症通常是实体瘤。表达HER2的实体瘤的实例包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、尿路上皮癌、胰腺癌、唾液腺癌和脑癌。表达HER2的乳腺癌包括雌激素受体阴性(ER-)和/或孕激素受体阴性(PR-)乳腺癌和三阴性(ER-、PR-、低HER2)乳腺癌。表达HER2的肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌。
在某些实施方案中，本文所述的ADC可用于治疗表达HER2的乳腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。在一些实施方案中，本文所述的ADC可用于治疗表达HER2的乳腺癌。在一些实施方案中，本文所述的ADC可用于治疗也是雌激素受体和孕激素受体阴性的表达HER2的乳腺癌。在一些实施方案中，本文所述的ADC可用于治疗表达HER2的三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，本文所述的ADC可用于治疗已转移至脑部的表达HER2的乳腺癌。在一些实施方案中，本文所述的ADC可用于治疗表达HER2的卵巢癌。
如本领域中已知的，表达HER2的癌症可以通过它们所表达的HER2的水平(即，通过“HER2状态”)来表征。HER2的状态可以例如通过免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和显色原位杂交(CISH)进行评估。
IHC鉴定细胞膜上的HER2蛋白表达。来自肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片可以进行IHC测定，并且符合HER2染色强度标准，如下所示：
评分0：未观察到染色或在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色；通常<20,000个受体/细胞。
评分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/几乎没有可感知的膜染色。细胞仅在其部分膜上染色。通常约100,000个受体/细胞。
评分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到弱到中度的完整膜染色；通常约500,000个受体/细胞。
评分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中度至强烈的完整膜染色；通常约2,000,000个受体/细胞。
对于HER2表达评分为0或1+的肿瘤表征为HER2阴性，而那些评分为2+或3+的肿瘤表征为HER2阳性。
FDA批准的可用于使用IHC进行HER2检测的商业试剂盒的实例包括HercepTestTM(Dako Denmark A/S)；PATHWAY(Ventana Medical Systems,Inc.)；InSiteTMHER2/NEU试剂盒(Biogenex Laboratories,Inc.)和Bond Oracle HER2 IHC系统(Leica Biosystems。
如本文所述的ADC可用于治疗以各种水平表达HER2的癌症。在某些实施方案中，ADC可用于治疗表达高水平的HER2(IHC 3+)的癌症。在一些实施方案中，ADC可用于治疗表达高水平的HER2(3+IHC)或中等水平的HER2(2+IHC或2+/3+IHC)的癌症。在一些实施方案中，ADC可用于治疗表达高水平的HER2(3+IHC)、中等水平的HER2(2+IHC或2+/3+IHC)或低水平的HER2(1+IHC或1+/2+IHC)的癌症。在一些实施方案中，本文所述的ADC可用于治疗通过IHC评分为HER2阴性的癌症。
在某些实施方案中，待用ADC治疗的癌症的HER2水平通过IHC测定。在一些实施方案中，待用ADC治疗的癌症的HER2水平通过使用HerceptestTM测定法进行的IHC测定。
表达HER2的癌症在性质上可以是同种的(即大多数肿瘤细胞都表达相似量的HER2)，或者它们在性质上可以是异种的(即包含表达不同水平的HER2的不同肿瘤细胞群)。考虑到ADC可以用于治疗就HER2水平而言是同种或异种的表达HER2的癌症。
在某些实施方案中，ADC可用于治疗患有表达HER2的癌症的受试者的方法中，所述癌症对其它标准护理疗法具有抗性或变得有抗性。在一些实施方案中，ADC可用于治疗患有表达HER2的癌症的受试者的方法中，所述受试者对一种或多种当前疗法无反应，当前疗法诸如曲妥珠单抗
Figure BDA0002736406090000681
帕妥珠单抗
Figure BDA0002736406090000682
T-DM1(
Figure BDA0002736406090000683
或曲妥珠单抗艾坦辛(trastuzumab emtansine))或紫杉烷类(诸如紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)等)。在一些实施方案中，ADC可用于治疗患有对曲妥珠单抗有抗性的表达HER2的癌症的受试者的方法中。在一些实施方案中，ADC可用于治疗患有对帕妥珠单抗有抗性的表达HER2的癌症的受试者的方法中。在一些实施方案中，ADC可用于治疗患有对T-DM1有抗性的表达HER2的癌症的受试者的方法中。在一些实施方案中，当患者进行先前的抗HER2疗法已有进展时，ADC可用于治疗转移癌。
当ADC用于治疗患有对用另一种治疗剂治疗有抗性，用另一种治疗剂治疗难治和/或从用另一种治疗剂治疗复发的表达HER2的癌症的受试者时，ADC可以是二线疗法、三线或四线疗法的一部分，取决于受试者接受过的先前治疗的次数。
在某些实施方案中，本文所述的ADC可连同附加抗肿瘤剂一起用于治疗患有表达HER2的癌症的受试者。所述附加抗肿瘤剂可以是治疗性抗体，诸如以上所述的那些，或者是化学治疗剂。通常用于治疗表达HER2的癌症的化学治疗剂包括，例如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、紫杉醇、白蛋白结合的紫杉醇
Figure BDA0002736406090000684
)、多西他赛、吉西他滨(gemcitabine)、长春瑞滨(vinorelbine)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)、长春花碱、培美曲塞(pemetrexed)、5-氟尿嘧啶(含或不含亚叶酸)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、表柔比星(epirubicin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、folfirinox、环磷酰胺和本领域已知的这些剂的各种组合。所述附加药剂可以与ADC同时或依序地向受试者施用。
在某些实施方案中，考虑到本文所述的ADC可以用于治疗尚未进行任何先前的抗癌治疗(即，ADC可以用作一线疗法)的患有表达HER2的癌症的受试者。
在某些实施方案中，在上述方法中用ADC治疗的受试者可以是人、非人灵长类动物或其它哺乳动物。在一些实施方案中，在上述方法中用ADC治疗的受试者是人类受试者。
待施用于受试者的ADC的量将根据相关情况而变化，包括待治疾患、所选择的施用途径、实际施用的化合物、个体受试者的年龄、体重和反应以及受试者症状的严重程度，但是是治疗有效量。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指为了实现所叙述的方法的目的，例如改进所治疾病的一种或多种症状而需要施用的ADC的量。可以通过标准临床技术测定将有效治疗表达HER2的癌症的本文所述的ADC的量。另外，可任选地采用体外测定法以帮助鉴定最佳剂量范围。可由源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线来外推有效剂量。
药物试剂盒
某些实施方案提供了包含如本文所述的ADC的药物试剂盒。
该试剂盒通常将包括容器和在所述容器上或与所述容器相关联的标签和/或包装说明书。标签或包装说明书含有通常在治疗产品的商业包装中包括的说明，提供了关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。标签或包装说明书还可包括政府机构规定形式的管制药品或生物制品的制造、使用或销售的公告，该公告反映了该制造机构对人或动物施用的使用或销售的批准。标签或包装说明书还指示ADC用于治疗表达HER2的癌症。该容器装有包含ADC的组合物并且在一些实施方案中可以具有无菌入口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。
除了装有包含ADC的组合物的容器之外，试剂盒还可包含一个或多个另外的包含试剂盒其它组分的容器。例如，药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液；其它缓冲液或稀释剂。
合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和静脉内溶液袋等。所述容器可由各种材料诸如玻璃或塑料制成。在适当的情况下，试剂盒的一种或多种组分可以是冻干的或以干燥形式(诸如粉末或颗粒)提供，并且试剂盒可以另外含有用于重构冻干或干燥的组分的合适溶剂。
试剂盒还可以包括在商业和使用者看来所需的其它材料，诸如过滤器、针头和注射器。
提供以下实施例是为了说明的目的而非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:接头-毒素的合成
以下实施例描述了包含以下澳瑞他汀类似物(化合物9)的例示性接头-毒素(接头-毒素001)的制备：
Figure BDA0002736406090000701
可以采用类似的方案制备包含其它澳瑞他汀类似物的接头-毒素，所述澳瑞他汀类似物包括以下例示性化合物(还请参见国际专利申请公布号WO2016/041082)：
Figure BDA0002736406090000702
Figure BDA0002736406090000711
1.1(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酸乙酯(化合物1)
Figure BDA0002736406090000712
在0℃下向(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(Boc-Dap-OH，4.31g，15.0mmol)在无水乙醇(27.0mL)中的搅拌溶液中以逐滴方式添加亚硫酰氯(3.0mL)。使所得溶液温热至室温，并通过HPLC-MS监测进展。18小时后，未检测到残留的原材料，将溶液减压浓缩至干。将所得的油状物悬浮在甲苯(10mL)中并减压浓缩两次，然后悬浮在乙醚(5mL)中并减压浓缩两次，得到白色固体泡沫状物(3.78g，定量收率％)。MSm/z观测值＝216.5(M+1)。
1.2(3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(化合物3)
Figure BDA0002736406090000713
如国际专利申请公布号WO 2016/041082中所述制备化合物2。
向化合物2(6.965g，14.14mmol)在二氯甲烷(20mL)中的搅拌溶液中添加三氟乙酸(5.0mL)。通过HPLC-MS监测反应的完成，并且在40小时后，没有剩余原材料。将反应物减压浓缩，与甲苯(2x 10mL)和二氯甲烷(2x 10mL)共蒸发，获得泡沫状白色固体(6.2g，定量收率，有残留TFA)。将这种物质溶于200mL热的1:3EtOAc:己烷中并使其冷却至室温。在冷却期间，形成沉淀物以及一些小晶体。添加5mL EtOAc，并将悬浮液再次加热以完全溶解沉淀物。冷却至室温时形成更多的晶体，并将烧瓶置于-30℃下过夜。第二天早上，倾析出母液并用2x50mL己烷冲洗晶体，并在高真空下干燥。回收到5.67g结晶产物。MS m/z观测值＝405.7(M+1)。
1.3(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸乙酯(化合物4)
Figure BDA0002736406090000721
在室温下向化合物3(6.711g，15.37mmol，1.025当量)在二氯甲烷(5.0mL)和N,N-二甲基甲酰胺(5.0mL)的混合物中的搅拌溶液中添加HATU(5.732g，15.07mmol，1.005当量)和N,N-二异丙基乙胺(7.84mL，3当量)。在室温下搅拌30分钟后，滴加化合物1(3.776g，15.00mmol，1.0当量)在二氯甲烷(1.0mL)和N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)的混合物中的溶液，在残留化合物1与另外3mL的1:1二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺中冲洗。通过HPLC-MS监测反应，并且15分钟后未观察到剩余的化合物1。将反应物减压浓缩，用乙酸乙酯(～125mL)稀释，并且用1M HCl(2x 50mL)、1x dH2O(1x 50mL)、饱和NaHCO3(3x 50mL)、盐水(25mL)萃取有机相。酸性和碱性水层均用25mL EtOAc洗涤。然后合并所有有机物，并且经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到红色油状物。将残留物溶解在最少量的二氯甲烷(～10mL)中，上样到
Figure BDA0002736406090000722
SNAP Ultra 360g硅胶柱(IsoleraTMFlash System；Biotage AB,Sweden)进行纯化(20-100％EtOAc的己烷溶液，超过10倍柱体积)。合并含有纯产物的级分回收7.9 g泡沫状白色固体。不纯的级分在
Figure BDA0002736406090000723
SNAP Ultra 100g硅胶柱上进行二次纯化并与纯产物合并回收白色泡沫状固体(8.390g，88.3％)。MS m/z观测值＝634.7(M+1)。
1.4(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(化合物5)
Figure BDA0002736406090000731
向化合物4(8.390g，13.24mmol)在1,4-二噁烷(158mL)中的搅拌溶液中添加dH2O(39.7ml)和氢氧化锂一水合物(1M的H2O溶液，39.7mL，3当量)。将反应物在4℃下搅拌并通过HPLC-MS监测原材料的消耗，到仅剩余痕量化合物4为止花费了3天。在反应过程中，除所需的材料外，还形成了小百分比的新产物，相当于甲醇的损失(β-消除，<2％)。添加1M HCl水溶液(50mL)酸化反应物，并减压浓缩以去除二噁烷。剩余的反应混合物用乙酸乙酯(4x50mL)萃取，合并有机相，用盐水(15mL+2mL 2M HCl)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，得到浅色油状物。将该油状物重新溶解在乙醚(～50mL)中并减压浓缩(3x)以利于残留二噁烷的去除，获得呈僵硬油状物的标题产物(7.81g，收率97％，有一些残留的二噁烷和化合物4)。MS m/z观测值＝606.7(M+1)。
1.5((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)磺酰胺基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸苄酯(化合物7)
Figure BDA0002736406090000732
如国际专利申请公布号WO 2016/041082)中所述制备化合物6。
向化合物5(7.12g，11.754mmol)在二氯甲烷(20mL)中的搅拌溶液中添加2,2,2-三氟-N-(4-氨磺酰苯基)乙酰胺(化合物6，4.095g，1.3当量，溶于3mL DMF中)、N,N-二甲基吡啶(1.867g，1.3当量)和N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)，产生浅黄色悬浮液。进一步添加5mLDMF并未使溶液澄清。以单份添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(2.817g，1.25当量)，并通过HPLC-MS监测反应物。48小时后，反应不再进展，再添加400mgEDCI。18小时后，未观察到剩余的原材料，并将反应物减压浓缩，得到黄色油状物。将该油状物溶于乙酸乙酯(～150mL)和1M HCl(20mL)中，用冷的2M HCl(2x 10mL)、饱和NaHCO3(1x10mL)、盐水(20mL+5mL 2M HCl)洗涤有机相。用EtOAc(1x 20mL)萃取酸性和碱性水性级分，合并所有有机级分，经MgSO4干燥并减压浓缩，得到油状粗制固体(13g)。将残留物溶于二氯甲烷(～10mL)，上样到
Figure BDA0002736406090000741
SNAP Ultra 360g硅胶柱上并且在10-100％EtOAc(2％AcOH)的己烷溶液梯度下纯化(超过12倍柱体积，在50％EtOAc下3倍柱体积达到稳定水平)。合并含有纯产物的级分，减压浓缩，溶解并且从甲苯(2x 10mL)和乙醚(2x 10mL)中浓缩，得到所需产物，即7.1g白色泡沫状固体。不纯的级分在IsoleraTM仪器上，使用
Figure BDA0002736406090000742
SNAPUltra 100g硅胶柱在较平缓的梯度条件下进行反复纯化。合并所有纯的级分，以回收呈白色泡沫状固体的纯产物(8.60g，86％)。MS m/z观测值＝856.7(M+1)。
1.6(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)磺酰胺基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(化合物7a)
Figure BDA0002736406090000743
将化合物7(3.71g，4.33mmol)溶于装有磁力搅拌器并配备有三通气体管线接头(adapter)的圆底烧瓶中10％在乙酸乙酯(30mL)中的N,N-二甲基甲酰胺中。将该容器减压抽真空两次并充入氮气。以单份添加碳载10％钯(0.461g，0.1当量)，将三通接头安装在烧瓶上，将氢气球安装在接头上，并将该容器减压抽真空两次并充入氮气。允许搅拌反应物2天，在此期间，不时地给氢气球重新充气。大约48小时后，HPLC-MS分析指示没有原材料剩余。将反应物用甲醇(20mL)稀释并通过硅藻土塞过滤。用甲醇(2x 50mL)洗涤硅藻土。合并所有滤液并减压浓缩，并且将所得油状物溶解并从二氯甲烷中浓缩。减压干燥后，分离呈无色粉末的标题化合物(3.10g，99％)。MS m/z观测值＝722.6(M+1)。
1.7(S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)磺酰胺基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(化合物8)
Figure BDA0002736406090000751
向N,N-(L)-二甲基缬氨酸(1.696g，9.35mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中的搅拌溶液中添加HATU(3.216g，8.46mmol)和二异丙基乙胺(3.10mL，17.8mmol)。5分钟后产生澄清黄色溶液。再继续搅拌10分钟，然后以单份添加化合物7a(3.213g，4.45mmol)。再搅拌1小时后，HPLC-MS指示剩余痕量的化合物7a，反应进行16小时。然后将反应物减压浓缩，用乙酸乙酯(120mL)和40mL 1:1NaHCO3(饱和):5％LiCl稀释并转移到分液漏斗中。去除水层，用LiCl(1x 20mL)、NaHCO3(饱和，2x 20mL)洗涤有机相。合并水层并用EtOAc(3x 50mL)萃取水层。合并有机层并用盐水(1x 20mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到充满DMF的油状物，将该油状物通过旋转蒸发仪浓缩以去除残留的DMF，得到7g草黄色的粗制油状物。将该油状物溶于最少量的10％在二氯甲烷(～11mL)中的甲醇中并上样到
Figure BDA0002736406090000752
SNAP Ultra360g硅胶柱上进行纯化(2-20％MeOH的CH2Cl2溶液超过15倍柱体积，产物在10-13％左右洗脱)。合并含有所需产物的级分，并减压浓缩，获得呈无色泡沫的标题化合物。将不纯的级分组合、蒸发并且在IsoleraTM仪器上在
Figure BDA0002736406090000753
SNAP Ultra 100g硅胶柱进行反复纯化，并且与来自第一根柱的纯产物组合，得到无色泡沫状固体(3.78g)。MS m/z观测值＝850.6(M+1)。
1.8(S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氨基苯基)磺酰胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺(化合物9)
Figure BDA0002736406090000754
向化合物8(0.980g，1.154mmol)在1,4-二噁烷(15mL)中的搅拌溶液中添加水(3.5mL)和1M氢氧化锂一水合物(3当量，3.46mL)。允许在4℃下搅拌所得的轻质悬浮液，并通过HPLC-MS监测原材料的消耗。当转化完成时(～5天)，将反应物用3.46mL的1M HCl中和并减压浓缩以去除二噁烷。将所得水相用60mL EtOAc和5mL盐水稀释，然后用乙酸乙酯(2x30mL)萃取。合并有机级分，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到呈棕褐色固体的标题化合物(0.930g)。Rf＝0.5(8％MeOH在CH2Cl2中)。MS m/z观测值＝753.7(M+1)。
1.9 3-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸2,3,5,6-四氟苯基酯(化合物15)
Figure BDA0002736406090000761
在干燥的50mL锥形瓶中，将3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(化合物14，1.000g，4.52mmol)和马来酸酐(0.443g,4.52mmol)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中。将反应物在室温下在N2下搅拌6小时，此时将其冷却至0℃并滴加顺-可力丁(1.263mL，2.1当量)。在一个单独的干燥的50mL锥形瓶中，将四氟苯酚(3.002g，4当量)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中。将烧瓶在冰浴中冷却至0℃，并滴加三氟乙酸酐(2.548mL，4当量)。将该烧瓶搅拌15分钟，此时滴加顺-可力丁(2.407mL，4当量)。使烧瓶再搅拌15分钟，然后经由注射器将内容物滴加到第一个烧瓶中。使反应物温热至室温并继续在N2下搅拌。通过HPLC-MS监测反应物中原材料的消耗。6天后，反应完成，化合物14完全消耗，仅剩下化合物15和少量(～5％)的双-TFP马来酰胺中间体。将反应物转移至分液漏斗，用乙醚(75ml)稀释并用5％LiCl(1x 20mL)、1M HCl(2x 20mL)、饱和NaHCO3(5x 20mL)和盐水(1x 20mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到含残留DMF的褐色粗制油状物。将粗制油状物溶于8mL的1:1DMF:H2O+0.1％TFA中，上样到60g
Figure BDA0002736406090000762
SNAP Ultra C18柱(Biotage AB,Uppsala,Sweden)上并且在30-100％线性梯度的超过8倍柱体积的ACN/H2O+0.1％TFA下进行纯化。将纯级分合并并用盐水(20mL)稀释，然后用3x 50mL Et2O萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并蒸发以回收浅黄色油状物(1.34g，66％收率)。
1.10((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)氨磺酰基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化合物12)
Figure BDA0002736406090000771
如国际专利申请公布号WO 2016/041082中所述，制备化合物11。
向空的25mL梨形烧瓶中添加化合物11(1.342g，3.58mmol，3.0当量)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.664g，3.46mmol，2.9当量)和7-羟基-氮杂苯并三唑(HOAT)(0.472g，3.46mmol，2.9当量)。在室温下搅拌30分钟以上，使这些固体溶解在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)和二氯甲烷(4.5mL)的混合物中。单独地，将化合物9(0.900g，1.20mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)和二氯甲烷(1.8mL)的混合物中并添加到梨形烧瓶中，用二氯甲烷(1.0mL)冲洗。搅拌速度增加到1000rpm，产生涡旋。在添加化合物9的2分钟以内，将一份氯化铜(II)(0.514g，3.83mmol，3.2当量)通过窄的粉末漏斗直接添加到涡旋的中心。最初的浅黄色溶液变为深褐色悬浮液，深褐色悬浮液经10分钟变为深绿色悬浮液。通过HPLC-MS监测反应的完成，并且在30分钟和1小时采集的样品之间未观察到反应进展的变化(～95％完成)。使反应物在室温下搅拌过夜，然后将2-(2-氨基乙基氨基)乙醇(0.483mL，4.781mmol，4当量)、EtOAc(10mL)和dH2O(5mL)添加到经搅拌的悬浮液中，该悬浮液颜色变为深蓝色。随着悬浮的固体逐渐溶解到两相混合物中，将悬浮液剧烈搅拌4小时。将该混合物转移至分液漏斗中并用EtOAc(100mL)和盐水(10mL)稀释，并且用10％IpOH/EtOAc(4x 50mL)萃取水层。合并有机层并用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并蒸发，得到淡蓝色粗制固体。该粗制固体溶解在甲醇(0.5mL)和二氯甲烷(6mL)的混合物中，并在
Figure BDA0002736406090000772
SNAP Ultra 100g硅胶柱上纯化(2-20％MeOH的CH2Cl2溶液超过10倍柱体积，然后在20％MeOH下8倍柱体积达到稳定水平)。在～20％MeOH的CH2Cl2溶液下，在1-2倍柱体积后，产物作为宽峰洗脱。合并含所需物质的级分并减压浓缩，得到呈白色固体的标题化合物(1.105g，83％)。MS m/z观测值＝555.9((M+2)/2),1109.8(M+1)。
1.11(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)氨磺酰基)苯基)-5-脲基戊酰胺(化合物13)
Figure BDA0002736406090000781
向化合物12(0.926g，0.834mmol)的溶液中添加二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(2.0mL)的混合物。通过HPLC-MS监测反应物中原材料的消耗(～45分钟)。将反应物与乙腈(2x 10mL)和二氯甲烷(2x 10mL)减压共蒸发以去除过量的三氟乙酸。将所得残留物溶于少量二氯甲烷和甲醇(3:1，v/v，～2mL)中，并通过移液管将其滴加到乙醚(200mL)和己烷(100mL)的搅拌溶液中，产生浅白色固体的悬浮液。过滤固体并在真空下干燥，获得白色粉末形式的标题化合物，为三氟乙酸盐(1.04g，定量收率，含有一些残留溶剂)。MS m/z观测值＝505.8((M+2)/2)。
1.12(S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)氨磺酰基)苯基)-2-((S)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-14-异丙基-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷酰胺)-5-脲基戊酰胺(接头-毒素001)
Figure BDA0002736406090000791
向化合物13(0.722g，0.584mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中的搅拌溶液中添加化合物15(0.314g，1.2当量)和二异丙基乙胺(0.305mL，3.0当量)。在2小时的HPLC-MS分析指示没有剩余的原材料。将反应物用TFA(300μL)酸化，然后用diH2O+0.1％TFA(9mL)稀释。将所得溶液上样到120g
Figure BDA0002736406090000792
SNAP Ultra C18柱(Biotage,Uppsala,Sweden)上并且在ACN/H2O+0.1％TFA梯度下进行纯化：超过10倍柱体积的20-60％ACN，超过5倍柱体积的60-100％ACN。接近40％ACN时产物洗脱。将通过LCMS鉴定的纯级分合并并冻干。从冻干器中回收白色粉末固体。以更高的浓度(大约50mg/mL在2:1H2O/ACN中)重复冻干到小瓶中，以产生更致密的、更少絮凝的冻干固体(754.2mg，91％)。MS m/z观测值＝647.4((M+2)/2),1292.8(M+1)。
实施例2：接头-毒素与双互补位抗体的偶联
双互补位抗HER2 mAb、v10000和接头-毒素001的抗体-药物偶联物(ADC)是通过以下方式生成的：部分还原抗体链间二硫键，然后通过与接头-毒素的马来酰亚胺组分反应而进行游离半胱氨酸残基封端。通过改变用于还原抗体的TCEP的量，可以获得平均药物:抗体比为0至6的ADC。将ADC纯化以去除污染物小分子，并对其进行表征以展示DAR、纯度、单体含量、内毒素水平以及与抗原阳性肿瘤细胞的结合。
v10000的制备在国际专利申请公布号WO 2015/077891中有描述。在下表9中提供了该抗体的详情。序列表中提供了序列。
表9
Figure BDA0002736406090000801
*Fab或可变结构域编号根据Kabat(Kabat等人,Sequences of proteins ofimmunological interest，第5版,US Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242,第647页,1991)
§CH3编号如同Kabat一样根据EU索引(Edelman等人，1969,PNAS USA,63:78-85)
2.1通过部分还原链间二硫键偶联抗HER2抗体(v17597；DAR 3.9)
将抗体v10000(2.0g)在10mM乙酸钠、9％(w/v)蔗糖(pH 4.5)中的溶液(138.9mL)通过添加200mM Na2HPO4(pH 8.9)(15.4mL)、5mM DTPA溶液(39.5mL在PBS中的溶液，pH 7.4)和10mM TCEP溶液(3.68mL，2.3当量)的新制混合物而还原。在37℃下90分钟后，将反应物在冰上冷却，之后添加来自于20mM DMSO储备溶液的过量的接头-毒素001(6.41mL；8当量)。90分钟后，通过添加过量的20mM N-乙酰基半胱氨酸溶液(4.81mL；6当量)来淬灭偶联反应。
2.2通过部分还原链间二硫键偶联抗HER2抗体(v21252；DAR 2.1)
将抗体v10000(2.0g)在10mM乙酸钠、9％(w/v)蔗糖(pH 4.5)中的溶液(138.9mL)通过添加200mM Na2HPO4(pH 8.9)(15.4mL)进行pH调节。添加DTPA溶液(44mL在PBS中的溶液，pH 7.4，最终浓度1.0mM)后，通过添加10mM TCEP水溶液(1.68mL，1.05当量)引发链间二硫键的还原。在37℃下90分钟后，将反应物在冰上冷却，之后添加来自于20mM DMSO储备溶液的过量的接头-毒素001(4.81mL；6当量)。90分钟后，通过添加过量的20mM N-乙酰基半胱氨酸溶液(4.81mL；6当量)来淬灭偶联反应。
2.3抗体药物偶联物v17597和v21252的纯化
淬灭的抗体药物偶联物(ADC)溶液用9-15渗滤体积的10mM乙酸钠、9％(w/v)蔗糖(pH 4.5)在Millipore LabscaleTM切向流过滤仪器上，使用
Figure BDA0002736406090000811
XL超滤组件(
Figure BDA0002736406090000812
30kDa 0.005m2；Millipore Sigma)纯化。将洗脱的ADC无菌过滤(0.22um)。将小规模生产的ADC通过40KDa MWCO ZebaTM柱(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)进行纯化，该柱用PBS或10mM乙酸钠、9％(w/v)蔗糖(pH 4.5)预处理。
纯化后，参照由v10000生成的标准曲线，通过BCA测定法测定ADC的浓度。另选地，通过测量在280nm下的吸收来估算浓度(ε＝195065M-1cm-1)。
通过非还原和还原SDS-PAGE评估ADC样品(参见图1)。没有观察到无关条带。
2.4疏水相互作用色谱法
通过疏水相互作用色谱法(HIC)分析抗体和ADC，以估计药物:抗体比率(DAR)。色谱法是在
Figure BDA0002736406090000813
HIC乙基色谱柱(7.8x50mm，5μm)(Sepax Technologies Inc.,Newark,DE)上，在13.5分钟时段内采用80％MPA/20％MPB至35％MPA/65％MPB的梯度以1mL/min的流速进行的(MPA＝1.5M(NH4)2SO4、25mM NaxPO4，并且MPB＝75％25mM NaxPO4、25％异丙醇)。
ADC的平均药物:抗体比率(DAR)可以根据抗体还原期间释放的二硫键数量而变化。产生具有特定平均DAR的ADC的单偶联反应包含各种类的混合物。对于v17597和v21252，生成了四个种类的混合物：未偶联的抗体、DAR为2的ADC、DAR为4的ADC和DAR为6的ADC。
HIC的结果示于图2中并且显示v17597的平均DAR为3.92(图2A)，而v21252的平均DAR为2.07(图2B)。
通过HPLC-HIC色谱图的整合来评估DAR0、DAR2、DAR4和DAR6种类对纯化ADC的平均DAR的单独贡献。通过制备色谱法分离HIC色谱图中的每个峰，并通过LC-MS验证峰的身份(identity)。表10和图2D中示出了每种变体中各DAR种类的％含量(通过HIC测定)。正如从表10和图2D中可以看出，v17597含有比v21252明显更多的DAR6种类，v21252含有比v17597明显更多的DAR0种类。
图2E说明了一系列平均DAR值范围为0.5至6的ADC制剂的v10000-接头毒素001内DAR 0、2、4和6种类的相对量的变化。
表10：v17597和v21252的DAR分布
Figure BDA0002736406090000821
2.5尺寸排阻色谱法
在ACQUITY
Figure BDA0002736406090000822
蛋白BEH SEC柱(200埃，1.7μm，4.6x150mm)(WatersCorporation,Milford,MA)上，使用由150mM磷酸盐(pH 6.8)组成的流速为400uL/min的流动相，通过尺寸排阻色谱法(SEC)评估抗体和ADC(～15ug，5uL注射体积)的聚集程度。通过在280nm下的吸光度进行检测。
结果示于图3并汇总于表11中。通过SEC分析，mAb v10000具有高度单体性。与接头-毒素001偶联后未观察到聚集的显著增加。对v21252和v17597的比较表明，DAR从2增加到4不影响聚集程度。
表11：SEC结果汇总
Figure BDA0002736406090000831
2.6通过LC-MS-MS对游离毒素和接头-毒素进行定量
参照每种分析物的标准曲线，通过液相色谱法(LC)分离和质量检测评估ADC制剂中游离毒素(化合物9)、接头-毒素001和淬灭的药物接头N-乙酰半胱氨酸-接头-毒素001的残留浓度。在PolymerXTMRP-1柱(3μm，100埃，50x 4mm)(Phenomenex Inc.,Torrance,CA)上，采用0.4mL/min的流速、30℃的柱温和7.8分钟内75％MPA/25％MPB至60％MPA/40％MPB的梯度(MPA＝0.1％甲酸水溶液，并且MPB＝0.1％甲酸的乙腈溶液)进行分离。在Agilent6470三重四极杆质谱仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上实现正模式ESI-MRM质量检测。
相对于偶联的总有效载荷，所有样品均含有<0.1mol％的分析物。
2.7抗原阳性细胞的流式细胞术结合测定
将ADC与抗原阳性肿瘤细胞系JIMT-1(乳腺癌，Addexbio Technologies,SanDiego,CA)和RT-112/84(膀胱癌，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的结合通过流式细胞术与亲本抗体(v10000)的结合进行比较。按照供应商的说明培养细胞。简言之，将细胞(50,000个细胞/孔)与抗体或ADC连续稀释液在冰上孵育90分钟。该次孵育后，将细胞洗涤两次，然后与
Figure BDA0002736406090000832
647偶联的抗hIgG(Jackson ImmunoResearch Inc.,Westgrove,PA)二级试剂在冰上孵育60分钟。然后将细胞洗涤两次，并通过流式细胞术(LSRFortessaTMX-20流式细胞仪，BD,San Jose,CA)分析荧光。
结果示于图4中并且证明v17597和v21252与抗原阳性细胞的结合不受毒素偶联的影响，两种ADC均显示出与亲本抗体v10000相似的结合。
2.8内毒素测试
使用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)胶凝化终点测定(GenscriptToxinSensorTM单一测试试剂盒；GenScript,Piscataway,NJ)以0.125EU/mL阈值评估配制的ADC的内毒素水平。体内实验(下文)中采用的所有ADC剂量均低于每千克体重5个内毒素单位。
实施例3：双互补位ADC的体外活性
通过对抗原阳性肿瘤细胞BT-474(导管癌，ATCC，Manassas,VA(HTB-20))、SK-BR-3(乳腺癌，ATCC，Manassas,VA(HTB-30))、HCC-1954(乳腺癌，ATCC(CRL-2338))、JIMT-1(乳腺癌，Addexbio Technologies,San Diego,CA,(C0006005))、ZR-75-1(乳腺癌，ATCC(CRL-1500))和抗原阴性肿瘤细胞MDA-MB-468(乳腺癌，Addexbio Technologies(C0006003))进行细胞增殖测定来测量v17597和v21252的体外效力。按照供应商的说明培养细胞。简言之，在添加ADC的前一天，将细胞(50uL/孔，1000个细胞/孔)添加到无菌的、经组织培养物(TC)处理的384孔板(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)中，并在37℃/5％CO2下孵育过夜以使细胞粘附到板表面。在无菌的U型底96孔板中，将ADC在完全生长培养基中稀释为所需最终最大浓度的4.3倍，然后在相同的培养基中1:3滴定，产生10点剂量反应滴定。每张微量滴定96孔板上均包括无ADC的对照孔(仅生长培养基)。将来自10点剂量反应滴定的15uL添加到384孔板含有接种细胞的每个孔中，一式三份，并且将板在37℃/5％CO2下孵育5晚。孵育5晚后，通过添加20uL/孔的
Figure BDA0002736406090000841
(Promega,Madison,WI)并且在室温下孵育30分钟来对细胞活力进行定量。使用微型板光度计测量发光。使用上面提到的仅生长培养基的对照将收集的相对光单位(RLU)转换为细胞毒性％(细胞毒性％＝1-[孔RLU/仅培养基的对照的平均RLU])。使用可与
Figure BDA0002736406090000842
软件(GraphPad Software,La Jolla,CA)一起使用的非线性回归方法将数据拟合为曲线。
结果示于图5并汇总于表12中。结果显示，v17597和v21252均展示出选择性的细胞杀伤作用。表达HER2的细胞系BT-474、SK-BR-3、HCC1954、JIMT-1和ZR-75-1(图5A-E)对v17597和v21252两者均敏感。v17597和v21252两者对来自HER2阴性乳腺癌细胞系的MDA-MB-468细胞无效(图5F)。
表12：v17597和v21252的体外活性
Figure BDA0002736406090000851
实施例4：v10000-接头-毒素001在不同平均DAR下的体外增殖测定
通过改变还原反应中利用的TCEP的量(0.5至10摩尔当量)，制备包括与接头-毒素001偶联的v10000的平均DAR范围为0.7至3.9的ADC。根据实施例2中概述的程序进行偶联反应，并且使用经PBS pH 7.4预先平衡的40kDa ZebaTM柱纯化所得ADC。
通过对抗原阳性肿瘤细胞SK-OV-3(卵巢癌，ATCC，Manassas,VA(HTB-77))、JIMT-1(乳腺癌，DSMZ,Braunschweig,Germany(ACC 589))和ZR-75-1(乳腺癌，ATCC(CRL-1500))的细胞增殖测定来测量ADC的体外效力。按照供应商的说明培养细胞。简言之，在添加ADC的前一天，将细胞(100uL/孔，2500个细胞/孔)添加到无菌的、经TC处理的96孔不透明壁板(Corning 3904)中，并在37℃/5％CO2下孵育过夜以使细胞粘附到板表面。第二天，将ADC在完全生长培养基(96孔U型底板)中稀释至所需最终最大浓度的5倍，然后在相同的培养基中进行1:3滴定，八个步骤(总共9个化合物滴定点)。还包括仅含生长培养基的对照滴定点，总共产生10点剂量反应滴定。将来自10点剂量反应滴定的25uL添加到96孔板含有接种细胞的每个孔中，一式三份，并且将板在37℃/5％CO2下孵育5晚。孵育后，通过添加25uL/孔的
Figure BDA0002736406090000852
(Promega Corporation,Madison,WI)并且在室温下孵育30分钟来对细胞活力进行定量。然后使用微型板光度计测量发光并且将收集的相对光单位(RLU)如实施例3所述转换为细胞毒性％。
结果示于图6。平均DAR在3.9至1.6之间的ADC在三种细胞系中显示出同等效力，但是平均DAR0.7的ADC中显示出效力显著降低。表13和图6D中示出了构成DAR0.7、DAR2.2和DAR3.9 ADC的各DAR种类的近似量。可以看出，DAR0.7 ADC所含的DAR0种类是DAR1.9 ADC的大约三倍(大约65％对大约20％)。DAR2.2 ADC所含的DAR0种类又显著多于DAR3.9种类(大约20％对<3％)，但是DAR2.2 ADC显示出与DAR3.9 ADC同等的体外效力。这些结果表明，在ADC的效力受到影响之前，ADC制剂可含有的DAR0种类的比例可能存在阈值。
表13：ADC的近似DAR分布
Figure BDA0002736406090000861
实施例5：将双互补位ADC内化到表达HER2的细胞中
为了确定v21252的内化，根据制造商推荐的方案，使pHAb染料(PromegaCorporation,Madison,WI)与v21252、曲妥珠单抗-接头-毒素001和阴性对照ADC的胺残基偶合。阴性对照ADC是与接头-毒素001偶联的抗RSV蛋白F抗体。
pHAb偶联的抗体可用于监测受体介导的抗体内化。与细胞膜上的抗原结合的pHAb染料偶联的抗体表现出最小的荧光，但是在受体介导的内化和通过内体和溶酶体系统运输之后，抗体-pHAb偶联物暴露于酸性更强的pH，导致抗体-pHAb偶联物发荧光。
将pHAb偶联的v21252、pHAb偶联的曲妥珠单抗-接头-毒素001和pHAb偶联的对照与表达HER2的细胞系SKBR3和JIMT-1一起孵育。简言之，将SKBR3和JIMT-1HER2+肿瘤细胞以5,000个细胞/孔接种到384孔黑色光学底板(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)中。将板在37℃+5％CO2下孵育过夜。第二天，将pHAb偶联的抗体添加到板中，使得在测定培养基中最终为10ug/ml和1ug/mL。以2uM最终浓度添加含
Figure BDA0002736406090000871
DyeCycleTM紫色染剂(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)的培养基以使细胞核可见。在各时间点之间将板在37℃+5％CO2下孵育。在各个时间点，在CellInsightTMCX5高内涵筛选(HCS)平台(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)上扫描样品孔。在具有2个通道的SpotAnalysisBioapplication上使用20x物镜扫描该板。通道1(385nm，Vybrant Dye Cycle Violet)用作聚焦通道，而通道2(560nm，pHAb)用于获得内化数据。使用参数“平均总斑点强度”测量内化的pHAb偶联抗体的荧光。
结果示于图13和图14中，并且显示v21252内化并向表达HER2的细胞中的溶酶体运输，达到高于单特异性曲妥珠单抗-接头-毒素001的水平。
实施例6：双互补位ADC的体内活性
6.1 ADC v17597和v21252抑制HBCx-13b乳腺癌患者来源的异种移植物生长
为雌性无胸腺小鼠(Envigo,Huntingdon,UK)皮下植入20mm3肿瘤片段(n＝7只/组)。一旦肿瘤大小达到75至200mm3，就将动物分配到处理组，并且如图7所示，在第1天和第15天(q14d x2)通过静脉内注射将v17597、v21252或媒介物给药，总共2剂。每两周用卡尺进行一次肿瘤测量。当肿瘤大小达到1764mm3时，将小鼠人道处死。每组的肿瘤体积报告为平均值±SEM。
图7A提供了在皮下植入了HBCx-13b肿瘤片段的小鼠中在静脉内施用媒介物或v17597后的肿瘤反应结果。图7B提供了在皮下植入了HBCx-13b肿瘤片段的小鼠中在静脉内施用媒介物或v21252后的肿瘤反应结果。这些结果显示，用v17597或v21252处理移植了HBCx-13b的小鼠引起肿瘤体积以剂量依赖性方式减小。
6.2 ADC v17597和v21252抑制ST-910乳腺癌患者来源的异种移植物生长
为雌性无胸腺裸鼠(Charles Rivers Laboratories,Wilmington,MA)皮下植入～70mg肿瘤片段(n＝6只/组)。一旦肿瘤大小达到125至250mm3，就将动物分配到处理组，并且如图8所示通过静脉内单次注射将v17597、v21252或媒介物给药。每两周用数显卡尺进行一次肿瘤测量。当肿瘤大小达到2000mm3时，将小鼠人道处死。每组的肿瘤体积报告为平均值±SEM。
图8A提供了在皮下植入了ST-910肿瘤片段的小鼠中在静脉内施用媒介物或v17597后的肿瘤反应结果。图8B提供了在皮下植入了ST-910肿瘤片段的小鼠中在静脉内施用媒介物或v21252后的肿瘤反应结果。这些结果显示，用v17597或v21252处理移植了ST-910的小鼠引起肿瘤体积以剂量依赖性方式减小。
ST-910是代表HER2 1+乳腺癌的患者来源的异种移植物(PDX)，而HBCx-13b(在实施例6.1中使用的)是代表HER2 3+乳腺癌的PDX。因此，实施例6.1和6.2证明v17597和v21252在HER2 3+和HER2 1+两种肿瘤中均具有活性。
6.3药代动力学分析
对于患者来源的异种移植物HBCx-13b和ST-910，在预先指定的时间点收集总抗体(未偶联的抗体和偶联的抗体)的药代动力学样品，并使用基于ELISA的测定法进行评价以进行总抗体定量。首先用在PBS pH 7.4中的山羊抗人IgG Fc抗体(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)涂布384孔ELISA板并且在4℃下孵育过夜，分析v21252或v17597总抗体的血清浓度。第二天，将板洗涤并使用测定稀释剂封闭，并在室温下孵育1小时。封闭后，将标准曲线样品、对照和稀释的血清样品添加到板中，并在室温下孵育1小时。然后将检测抗体即HRP山羊抗人IgG F(ab')2偶联物(Jackson ImmunoResearch)添加到板中，并且在室温下孵育1小时后，将HRP底物即3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)添加到板中。用HCl淬灭TMB，并使用酶标仪在450nm下测量吸光度。图15示出了HBCx-13b(A)和ST-910(B)的总抗体血清浓度-时间曲线。
实施例7：食蟹猴中v17597和v21252的单剂量药代动力学/耐受性研究
这项研究的目的是表征在食蟹猴中单次静脉内(IV)输注施用后v17597和v21252的药代动力学(PK)和耐受性。根据序列同源性和结合亲和力，选择食蟹猴进行v17597和v21252的非临床安全性评估。人和食蟹猴HER2具有98％的序列同源性，而狗和小鼠/大鼠HER2的序列同源性分别为93％和88％。另外，v17597和v21252以与人HER2相似的亲和力与食蟹猴HER2结合(猴子KD＝0.55x10-9；人KD＝0.83x10-9)，而不与狗、小鼠或大鼠HER2结合。
研究证明，剂量为3、6或9mg/kg的单剂量v17597耐受良好，并且剂量为9或12mg/kg的单剂量v21252耐受良好。
材料和方法
耐受性
在雌性食蟹猴(N＝3)中，在60分钟内通过静脉内输注施用单剂量的v17597(3、6或9mg/kg)或v21252(9mg/kg或12mg/kg)。通过临床观察结果、体重、食物消耗和临床病理(血液学和临床化学)评估总体耐受性。在整个研究过程中收集血液，以对v17597或v21252、总抗体和游离毒素(化合物9)进行生物分析。表14中汇总了研究设计。
表14：食蟹猴中单剂量药代动力学和总体耐受性研究的设计
Figure BDA0002736406090000891
生物分析方法
v17597和v21252：使用电化学发光测定法与Meso Scale Discovery平台(ECL/MSD)(Meso Scale Diagnostics,LLC,Rockville,MD)，以抗毒素小鼠IgG作为捕获剂并且以抗帕妥珠单抗磺基-TAG作为检测剂，分析v17597或v21252(DAR为1或更高)的血清浓度。
总抗体：总抗体生物分析测定法测量的是v17597或v21252的抗体组分，而不管该抗体组分是否与毒素(在所有DAR下)偶联。使用电化学发光测定法与Meso ScaleDiscovery平台(ECL/MSD)，以抗帕妥珠单抗抗体作为捕获剂并且以抗曲妥珠单抗磺基-TAG作为检测剂分析总抗体血清浓度。
毒素(化合物9)：使用LC-MS/MS方法分析毒素的血清浓度。用乙腈/甲醇(50:50，v/v)使血清样品产生沉淀并分析上清液。所用的液相色谱系统是反相色谱柱，其梯度流由水/乙酸(100/0.05，v/v)和乙腈组成。使用配备有以正离子模式工作的电喷雾电离(ESI)源的三重四极杆质谱仪系统检测毒素和内标(毒素d4；氘代化合物9)。
药代动力学分析
使用对血清样品生物分析结果的非房室分析得出PK参数(最大血清浓度[Cmax]、终末半衰期[T1/2]、清除率[CL]和表观分布体积[Vss])。
结果
药代动力学
v17597：在3至9mg/kg之间，v17597的暴露通常与剂量成比例。在60分钟输注结束(中位Tmax)时达到Cmax，并以与剂量成比例的方式增加。全身性暴露(AUC0-∞)以略高于与剂量成比例的方式增加。初步平均终末半衰期(T1/2)通常似乎随剂量增加而增加，清除率(CL)通常似乎随剂量增加而降低，并且表观分布体积(Vss)通常似乎不会随剂量而变化。
v21252：在9至12mg/kg之间v21252的暴露通常与剂量成比例。在60分钟输注结束(中位Tmax)时达到Cmax，并以与剂量成比例的方式增加。V21252血清浓度-时间曲线示于图9A。全身性暴露(AUC0-∞)以略高于与剂量成比例的方式增加。初步平均终末半衰期(T1/2)、清除率(CL)和表观分布体积(Vss)通常似乎不会随剂量而变化。
总抗体(偶联和非偶联的)：总抗体的最大血清浓度(Cmax)在60分钟输注结束(中位Tmax)时达到。v21252的总抗体血清浓度-时间曲线示于图9B。使用非房室模型得出PK参数。对于v17597和v21252两者而言，Cmax以与剂量成比例的方式增加，而AUC0-∞以略高于与剂量成比例的方式增加。v17597的平均终末半衰期随着剂量的增加而增加，而总抗体的血清清除率(CL)和总表观分布体积(Vss)随着剂量的增加而降低。v21252的平均终末半衰期和总表观分布体积(Vss)随着剂量的增加而增加，而总抗体的血清清除率(CL)随着剂量的增加而降低。
毒素(化合物9)：在施用单剂量的v17597(3、6或9mg/kg)或v21252(9mg/kg或12mg/kg)后，所有毒素的血清浓度均低于定量下限(LLOQ，<5.00ng/mL)。
耐受性
单剂量的v17597(3、6或9mg/kg)或v21252(剂量为9或12mg/kg)耐受良好。在研究过程中没有死亡。在临床观察结果、食物消耗或体重方面未注意到与治疗相关的作用。
在一些动物中观察到了被认为与治疗相关的临床病理学参数的最低至轻度变化。在任何处理组中，血液学终点之间均没有与测试制品相关的作用。所有波动均被认为在生物学预期范围之内和/或是与程序相关的波动，尽管各个值之间存在明显差异。
实施例8：v17597在食蟹猴中的非GLP毒性研究
进行了非GLP毒性研究，以研究v17597在食蟹猴中的毒代动力学和毒性。该研究是根据在雌性食蟹猴中的单剂量药代动力学/耐受性研究(实施例6)的结果设计的。
研究证明，每周以2.25和4.5mg/kg的剂量以及每两周以4.5和9mg/kg的剂量施用一次v17597在雄性和雌性食蟹猴中耐受不良。认为每周或每两周一次施用长达6周后，v17597的无不良作用水平(NOAEL)和最高非严重毒性剂量(HNSTD)低于2.25mg/kg(每周施用一次)或4.5mg/kg(每两周施用一次)。
材料和方法
每周一次在第1、8、15、22、29和36天，以0、2.25和4.5mg/kg的剂量，并且每隔一周一次在第1、15和29天，以4.5和9mg/kg的剂量，通过1小时静脉内输注施用媒介物或v17597。评价所有动物的临床体征、食物消耗、体重、血压、ECG、呼吸速率(视觉的)、临床病理(血液学、临床化学、凝血、尿液分析)、器官重量及组织的宏观/微观检查。收集血液进行毒代动力学分析和抗药物抗体(ADA)分析。每周给药一次的动物在第42天终止，每隔一周给药一次的动物在第36天终止。研究设计呈现于表15。
表15：研究设计
分组 剂量(mg/kg) 剂量方案 动物数量
1 0 每周一次 3只雄性/3只雌性
2 2.25 每周一次 3只雄性/3只雌性
3 4.5 每周一次 3只雄性/3只雌性
4 4.5 每隔一周一次 3只雄性/3只雌性
5 9 每隔一周一次 3只雄性/3只雌性
结果
根据体重、临床观察结果和临床病理发现，认为v17597在本研究中测试的所有剂量下均为不利。多只接受9mg/kg/剂(每两周一次)的动物和一只接受4.5mg/kg/剂(每两周一次)的雌性在早期终止，并且仅一只在第1天和第15天接受给药。
根据这项研究的结果，认为在每周或每两周一次施用长达6周后，v17597的无不良作用水平(NOAEL)和最高非严重毒性剂量(HNSTD)低于2.25mg/kg(每周施用一次)或4.5mg/kg(每两周施用一次)。
实施例9：v21252在食蟹猴中的非GLP毒性研究
这项研究的目的是进一步表征v21252的毒代动力学和毒性。
研究证明，在第1、15和29天以高达12mg/kg的剂量施用v21252在雄性和雌性食蟹猴中临床耐受良好。无可见不良事件水平(NOAEL)为12mg/kg且最高非严重毒性剂量(HNSTD)高于12mg/kg。
材料和方法
在这项研究中，每隔一周一次在第1、15和29天，以0、9和12mg/kg的剂量，通过1小时静脉内输注向雄性和雌性食蟹猴施用媒介物或v21252(每个剂量水平每种性别各3只动物)。评价所有动物的临床体征、食物消耗、体重、血压、ECG、呼吸速率(视觉的)、临床病理(血液学、临床化学、凝血、尿液分析)、器官重量及组织的宏观/微观检查。收集血液进行毒代动力学(TK)分析(v21252、总抗体和游离毒素(化合物9))和抗药物抗体(ADA)分析，并且动物在第36天终止。另一组动物在第1天施用单剂量的12mg/kg v21252，并在给药后4、8和15天终止(每个时间点n＝2)。研究设计呈现于表16。
表16：非GLP毒性研究设计
Figure BDA0002736406090000931
结果
药代动力学
v21252：重复施用v21252后计算药代动力学。Cmax在60分钟输注结束时或输注结束后60分钟(中位Tmax)时达到。v21252血清浓度-时间曲线示于图10。第1天，Cmax和全身性暴露(AUC0-168小时)以略高于与剂量成比例的方式增加。第29天，Cmax和AUC0-168小时以大致与剂量成比例的方式增加。重复施用后，全身性暴露和AUC0-168小时似乎没有变化并且未显示出累积。从9mg/kg组到12mg/kg组，平均消除半衰期(T1/2)增加。v21252的饱和清除机制可解释低(9mg/kg)和高(12mg/kg)剂量组之间T1/2和清除率的差异。
总抗体(偶联的和未偶联的)：在重复施用v21252之后，在食蟹猴中测量总抗体。总抗体的Cmax在60分钟输注结束(中位Tmax)时达到。总抗体血清浓度-时间曲线示于图11。第1天，Cmax和全身性暴露(AUC0-168小时)以略高于与剂量成比例的方式增加。第29天，Cmax和AUC0-168小时以大致与剂量成比例的方式增加。重复施用后，全身性暴露AUC0-168小时不变并且未显示出累积。与v21252相似，从9mg/kg组到12mg/kg组，总抗体的平均消除半衰期(T1/2)增加。
如v21252和总抗体的血清浓度-时间曲线所指示的v21252药代动力学表明体内v21252的接头-毒素损失最少(参见图12)。
毒素(化合物9)：重复施用v21252后，在食蟹猴中测量游离毒素。所有有效载荷(化合物9)的血清浓度均低于定量限值(<0.500ng/mL)，除了第1天给药12mg/kg的一只雌性，第29天给药9mg/kg的一只雌性，以及第29天给药12mg/kg的一只雄性以外。
抗药物抗体(ADA)：在重复施用v21252后在食蟹猴中筛选抗v21252抗体。在9mg/kg给药组群中一只雌性的血清中检测到ADA。
毒性
总体而言，在所有测试剂量下，v21252的施用在临床上均耐受良好。未观察到尿液分析、ECG参数或呼吸速率方面与治疗相关的变化。
在接受以12mg/kg/剂重复施用v21252的动物中注意到对个体体重的偶发性最小作用。这些动物到第35天均部分地或全部地恢复。在整个研究过程中，所有其它动物均维持体重或体重增加。
在一些动物中观察到临床体征、临床病理、器官重量或组织的宏观/微观检查方面的最低至轻度变化。认为与v21252相关的宏观观察结果限于在所有动物(包括对照)的输注部位观察到的变红。与测试制品相关的器官重量变化限于脾脏。在3次每两周一次的剂量之后的第36天终止的动物中，与处理相关的微观作用包括胃肠道、肝脏、脾脏、淋巴结、胰腺、皮肤和静脉输液部位的变化。全部分类为最低或轻度。在12mg/kg单次剂量后的各个时间终止的动物中，观察到类似最低至轻度的与测试制品相关的作用。
PK分析证实了经v21252处理的动物的全身性暴露，并且对于v21252和总抗体而言，平均全身性暴露随着剂量的增加以与剂量成比例的方式增加，而仅在少数动物中看到低水平地暴露于游离毒素(化合物9)。
表17-20示出了v17597与v21252的PK/耐受性研究和非GLP重复剂量研究的结果比较。
表17：在食蟹猴中v17597和v21252的单次剂量和重复剂量研究中观察到的死亡率比较
Figure BDA0002736406090000941
Figure BDA0002736406090000951
表18：在食蟹猴v17597和v21252重复剂量研究中测定的NOAEL和HNSTD的比较
Figure BDA0002736406090000952
表19：ADC生物分析
Figure BDA0002736406090000953
#与4.5mg/kg的v17597相比
表20：总体抗体生物分析
Figure BDA0002736406090000961
#与4.5mg/kg的v17597相比
结论
已经证实通式(I)的澳瑞他汀类似物当施用给小鼠时具有良好的体内耐受性。化合物9与单特异性抗HER2抗体曲妥珠单抗以平均DAR4偶联产生在食蟹猴中显示出极好耐受性且最高非严重毒性剂量(HNSTD)为18mg/kg的ADC。相比之下，包含以平均DAR4与抗HER2双互补位抗体v10000偶联的化合物9的ADC(v17597)显示出的耐受性大大降低，HNSTD低于4.5mg/kg(实施例8)。不受任何特定理论的限制，提出针对v17597观察到的耐受性降低可能部分归因于与单特异性曲妥珠单抗相比，双互补位抗体的中靶结合和内化增加，从而导致中靶毒性增加，和/或与平均DAR2(v21252)相比平均DAR4(v17597)中DAR0或裸露种类的比例降低(增加了与较高DAR种类(DAR2、DAR4和DAR6)相关的毒性)，和/或与平均DAR2相比平均DAR4中DAR6种类的比例增加(增加了最高DAR种类相关的毒性)。
然而，令人惊讶的是，包含以平均DAR2与v10000偶联的化合物9的ADC(v21252)显示出大大提高的耐受性并且HNSTD为12mg/kg(实施例9)。该结果是出乎意料的，因为先前已证实包含单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或类美登素(maytansinoid)的ADC的毒性与附接于抗体的药物总量直接相关，即对于ADC而言DAR与最大耐受剂量之间的关系是线性的(Hamblett等人,Clin.Cancer Res.,10:7063-7070(2004)；Sun等人,Bioconj Chem.,28:1371-81(2017))。具体地说，每个抗体8个药物分子的ADC的最大耐受剂量为50mg/kg，每个抗体4个药物分子的ADC的最大耐受剂量(即毒素的量的一半)为100mg/kg(Hamblett等人，同上)。也就是说，毒素的量为DAR8 ADC的一半的ADC，当以相同的抗体剂量施用时，显示出的MTD是DAR8 ADC的两倍。
v21252的DAR为2，因此以相同的抗体剂量施用时，毒素的量为v17597的一半。因此，根据先前对v17597的研究，可以耐受的v21252的量预计低于9mg/kg(即v17597的最大耐受剂量的2倍)。但是，如实施例9所示，每两周一次以9或12mg/kg的剂量向食蟹猴施用的v21252(共三个剂量)是耐受的，并且将12mg/kg指定为无可见不良事件水平(NOAEL)。
重要的是，应注意，v21252与v17597相比，在每两周给药一次时，即使它具有更高的暴露，但是也具有更低的毒性和更高的耐受性。基于在食蟹猴中的非GLP毒理学研究(实施例8)，认为v17597在每两周一次4.5和9mg/kg的剂量下都具有不良发现。然而，在类似的非GLP研究(实施例9)中，认为v21252在每两周一次9mg/kg和12mg/kg的剂量下均无不良发现，尽管与4.5mg/kg的v17597相比暴露(第一剂后的AUC0-336小时或最后一剂AUC0-168小时)增加大约1.8至4.6倍(汇总在表19和表20中)。
另外，v21252在经证实在食蟹猴中耐受的暴露水平下展示出体内功效。具体地，在食蟹猴耐受的暴露下，在高HER2和低HER2肿瘤的患者来源的异种移植模型中实现了完全应答，如图15中概括的(还请参见实施例6)。
实施例10：v21252在食蟹猴中的GLP毒性研究
在随后的GLP毒性研究中，每两周以0、6、12和18mg/kg向食蟹猴施用v21252，共4个剂量，恢复期为6周。经测定最高非严重毒性剂量(HNSTD)为18mg/kg。v21252在所有剂量下均耐受良好。在该GLP研究中，没有临床观察结果被认为是不良的，也没有观察到死亡。唯一一致的临床观察结果是腹泻增加。在所有剂量下均未观察到体重变化，也没有临床病理发现(肝功能–天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶以及血液学–中性粒细胞、血小板、血红蛋白和淋巴细胞)被认为是不良的。v21252的暴露(Cmax和AUC0-168小时)实际上与v10000(仅抗体)相同。下面提供了该研究的详情。
这项GLP研究的目的是进一步表征向食蟹猴静脉内施用4次的v21252的毒代动力学和毒性。
在GLP毒性研究中，在第1、15、29和43天以0、6、12和18mg/kg的剂量向雄性和雌性食蟹猴施用v21252，恢复期为6周。无可见不良事件水平(NOAEL)为12mg/kg且最高非严重毒性剂量(HNSTD)为18mg/kg。
材料和方法
在这项研究中，每隔一周一次在第1、15、29和43天，以0、6、12和18mg/kg的剂量，通过1小时静脉内输注向雄性和雌性食蟹猴施用媒介物或v21252(每个剂量水平每种性别各4只动物并且在0、12和18mg/k下每种性别含另外2只动物用于恢复评价)。评价所有动物的临床体征、食物消耗、体重、血压、ECG、呼吸速率(视觉的)、临床病理(血液学、临床化学、凝血、尿液分析)、器官重量及组织的宏观/微观检查。收集血液进行毒代动力学(TK)分析(v21252、总抗体和游离毒素(化合物9))和抗药物抗体(ADA)分析，并且动物在第50天以及在6周恢复后第92天终止。研究设计呈现于表21。
表21：GLP毒性研究设计
Figure BDA0002736406090000981
结果
药代动力学
v21252：在第1天和第43天开始输注(SOI)后1小时，观察到v21252血清中位峰值浓度。每两周一次施用v21252后，v21252的平均Cmax和AUC值随剂量增加而增加。Cmax的增加与第1天的剂量大致成比例。第1天，v21252剂量的1:2:3成倍增加导致Cmax值大约1:2.3:3.3成倍增加，AUC0-168小时平均值大约1:2.6:3.8成倍增加，以及AUC0-336小时值1:2.9:4.5成倍增加。第43天，Cmax和AUC0-168小时与剂量大致成比例。第43天，v21252剂量的1:2:3成倍增加导致Cmax值大约1:2.5:3.5成倍增加以及AUC0-168小时值大约1:3.2:4.7成倍增加。以6mg/kg每两周一次重复静脉内输注后，对v21252的全身性暴露似乎没有变化，但是以12和18mg/kg每两周一次重复静脉内输注后，暴露通常似乎会增加。在6、12和18mg/kg下时，平均AUC0-168小时累积率分别为1.20、1.47和1.50。各AUC0-168小时累积率范围在6mg/kg下为1.01至1.64，在12mg/kg下为1.17至1.95，并且在18mg/kg下为0.983至2.08。
总抗体(偶联的和未偶联的)：在第1天和第43天，在v21252的SOI后1小时，观察中位峰值总抗体血清浓度。在每两周一次服用v21252之后，总抗体的平均Cmax和AUC0-168小时值随剂量增加而增加。第1天，v21252剂量的1:2:3成倍增加导致Cmax值大约1:2.1:3.3成倍增加，AUC0-168小时值大约1:2.4:3.8成倍增加，以及AUC0-336小时平均值1:2.8:4.5成倍增加。第43天，v21252剂量的1:2:3成倍增加导致Cmax值大约1:2.6:3.9成倍增加以及AUC0-168小时值大约1:3.1:4.8成倍增加。对总抗体的全身性暴露在以6mg/kg每两周一次重复静脉内输注v21252后似乎没有变化，但是在以12和18mg/kg每两周一次重复静脉内输注后似乎的确会增加。在6、12和18mg/kg下时，平均AUC0-168小时累积率分别为1.20、1.47和1.50。
毒素(化合物9)：重复施用v21252后测量游离毒素。大多数毒素(化合物9)的血清浓度均低于定量限值(<0.500ng/mL)。注意到以下例外情况：第43天给药12mg/kg的一只雌性具有单个可定量毒素(化合物9)浓度(给药后72小时为0.513ng/ml)；第29天给药18mg/kg的一只雄性具有单个可定量毒素(化合物9)浓度(SOI后1小时为0.532ng/ml)；第43天给药18mg/kg的两只雄性和两只雌性各自具有单个可定量毒素(化合物9)浓度(SOI后24小时分别为0.555、0.505、0.556和0.653ng/mL)；以及第43天给药18mg/kg的一只雄性具有四个连续的可定量毒素(化合物9)浓度，AUC0-168小时值为125小时*ng/mL。
抗药物抗体(ADA)：从所有给药群组的总共144个样品中筛选ADA。七个样品在确认/免疫耗竭测定中经确认为阳性，所述测定包括一只对照动物和来自经处理的动物的预测试样品。这后两个样品被视为是由于预先存在的反应性抗体，与v21252暴露无关。对于剩下的五个阳性样品，以18mg/kg给药的一只雌性在第43天具有可检测的滴度，其余4只动物(以12mg/kg给药的2只雌性和以18mg/kg给药的一只雄性和一只雌性)在第92天的恢复点具有可检测的滴度。尽管实际的抗v21252抗体结果并未表明在大多数动物中具有强烈的免疫原性应答，但循环的v21252可以与抗v21252抗体结合，从而限制了该测定形式下对抗体的检测。然而，不可能的是ADA显著影响v21252的PK，因为与给药第1天相比，在给药第43天没有观察到血清浓度时间数据变化。
毒性
v21252的重复剂量施用(每隔一周x4)通常耐受良好。没有发生与v21252相关的死亡，并且在眼科和心电图评价、视觉呼吸速率、尿液分析或肌钙蛋白I评估方面未注意到作用。在施用v21252之后的处理或恢复期间，没有注意到与v21252相关的体重参数变化。
在以≥6mg/kg施用重复剂量的v21252的动物中注意到软/水样粪便的发生率增加。另外，在以18mg/kg给药的雄性和雌性动物中注意到偶发性食欲不振并且在以18mg/kg给药的雌性动物中偶发性地注意到驼背姿势。恢复期后，不存在食欲不振和驼背姿势，同时软/水样粪便发生率降低少或消失，表明v21252相关作用逆转。在研究期间，由于反复观察到软/水样粪便，向动物提供了流体/营养补充物(冷冻的Gatorade和
Figure BDA0002736406090001001
饮食)。接受重复施用v21252的雌性从第4天(6和18mg/kg)或第8天(12mg/kg)开始接受流体和/或营养补充物直到处理期结束。类似地，接受重复施用v21252的雄性从第8天(12mg/kg)或第7天(18mg/kg)开始接受流体和/或营养补充物直到处理期结束。恢复期间未提供流体或补充物。
由于发现结果的严重程度有限和可逆性，认为临床病理发现结果并非是不良的。与制品相关的血液学变化包括：单核细胞计数增加，中性粒细胞形态改变，网状细胞计数和红细胞质量(RBC、血红蛋白和血细胞比容)降低以及红细胞分布宽度增加。在以18mg/kg给药的雄性和以≥12mg/kg给药的雌性中，在第8至50天，平均纤维蛋白原浓度相对于基线平均值存在最小至轻度增加。这些变化与测试制品相关，并指示免疫或炎性刺激。这些变化在第92天消失。在AST、磷、总蛋白、白蛋白、球蛋白和瓜氨酸方面观察到与处理相关的变化。
表22-25示出了v17597和v21252的非GLP重复剂量研究与v21252的GLP研究的结果比较。
表22：在食蟹猴中v17597和v21252的每隔一周重复剂量研究中观察到的死亡率比较
Figure BDA0002736406090001011
表23：在食蟹猴中v17597和v21252每隔一周重复剂量研究中测定的NOAEL和HNSTD的比较
Figure BDA0002736406090001012
表24：v17597 DAR4和v21252 DAR2(毒素剂量匹配)的ADC PK参数比较
Figure BDA0002736406090001013
Figure BDA0002736406090001021
#与4.5和9mg/kg的v17597 DAR4相比
表25：v17597 DAR4和v21252 DAR2(毒素剂量匹配)的总抗体PK参数比较
Figure BDA0002736406090001022
#与4.5和9mg/kg的v17597相比
结论
经测定v21252的最高非严重毒性剂量(HNSTD)为18mg/kg。v21252在所有剂量下均耐受良好。在该GLP研究中，没有临床观察结果被认为是不良的，也没有观察到死亡。唯一一致的临床观察结果是腹泻增加。在所有剂量下均未观察到体重变化，也没有临床病理发现(肝功能–天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶以及血液学–中性粒细胞、血小板、血红蛋白和淋巴细胞)被认为是不良的。这些GLP毒理学结果支持在人体内超过预期有效剂量的临床给药剂量。
令人惊讶的是，包含以平均DAR2与v10000偶联的化合物9的ADC(v21252)显示出与具有平均DAR4的ADC(v17597)相比改善的耐受性，HNSTD为18mg/kg。该结果是出乎意料的，因为先前已经证实，以平均DAR4与v10000偶联的毒素化合物9(v17597)当以0.36mg/kg的毒素剂量给药时，与急性给药(9mg/kg的单次剂量)或亚慢性给药(两次4.5mg/kg的剂量相隔两周)时的死亡率相关(实施例8)。相反，当v21252(DAR2)以0.36mg/kg毒素(化合物9)的剂量施用四个剂量(累积毒素剂量为1.44mg/kg)时，与v17597相比没有发生死亡并且毒性大大降低。例如，以0.96mg/kg毒素(化合物9)的累积剂量施用的v21252与无不良发现相关，并将其指定为无可见不良事件水平(NOAEL)。此外，施用1.44mg/kg累积剂量的毒素(化合物9)，4个剂量含18mg/kg的v21252，并且耐受。这是死亡相关的v17597剂量(0.36mg/kg)的四倍的剂量。
重要的是，与v17597相比，每两周给药一次时，v21252的毒性更低而耐受性要高，尽管在毒素匹配的剂量下(4.5mg/kg的v17597与9mg/kg的v21252和9mg/kg的v17597与18mg/kg的v21252)(汇总在表24和表25中)相比较时，在第一剂后它的暴露量为大约两倍(第一剂后的AUC0-336小时)并且半衰期为两倍。
实施例11：v21252抑制低HER2患者来源的异种移植物在体内生长
LTL-654源自卵巢浆液性癌患者转移，并通过免疫组化(IHC)评分为HER2阴性。早期活检通过IHC评分为HER2不明确的。
雌性NOD Ragγ(NRG)小鼠经肾囊皮下植入两个LTL-654肿瘤片段，每个片段大约15mm3。当平均肿瘤体积达到70.3-77.8mm3时，将动物随机分配到两个盲处理组之一，每组各六只动物。
用赋形剂或3mg/kg的v21252处理动物，每周静脉内施用一次，总共注射四次(qwx4)(表21)。使用
Figure BDA0002736406090001031
3100成像系统(FUJIFILM VisualSonics,Inc.,Toronto,Canada)，使用三维(3D)模式测量肿瘤大小。使用
Figure BDA0002736406090001032
LAB软件v2.1.0(FUJIFILMVisualSonics,Inc.)记录并分析整个肿瘤的多个图像(每个肿瘤70到100个)。随机分组后每周测量一次肿瘤大小直到第24天。当单个肿瘤的大小达到1500mm3时，将小鼠人道处死。每组的肿瘤体积报告为平均值+SEM。
图16提供了在皮下植入了LTL-654肿瘤片段的小鼠中在静脉内施用媒介物或v21252后的肿瘤反应结果，其证明用v21252处理移植了LTL-654的小鼠抑制LTL-654肿瘤异种移植物的生长速率。
该实施例证明v21252在患者来源的异种移植物中是有效的，其中HER2表达足够低以至于通过IHC评分为HER2阴性。
表21：LTL-654卵巢癌PDX模型研究设计
Figure BDA0002736406090001041
N/A＝不适用
实施例12：v21252延长体内带有颅内植入的人乳腺肿瘤的小鼠的存活期
该实施例中使用的构建体是：对照偶联物(与接头-毒素001偶联的抗呼吸道合胞病毒的人源化抗体)、v21252、v7155(T-DM1，DAR3.5)和v24029(以DAR8与依喜替康衍生物拓扑异构酶I抑制剂(DXd)偶联的曲妥珠单抗)。在该实施例中利用的颅内植入的BT-474人乳腺肿瘤作为HER2阳性乳腺癌脑转移模型。
用γ源(2Gy,60Co,BioMep,Bretenières,France)辐照雌性Balb/c裸鼠(CByJ.Cg-Foxn1nu/J)。向经过麻醉的小鼠立体定向注射1x105个在2微升不含酚红的RPMI 1640培养基中的BT-474细胞。将动物随机分组到处理组，从第8天开始，每周以6mg/kg静脉内施用媒介物、对照偶联物、v21252、v7155或v24029，总共注射十二次(表26)。每周记录体重两次，直到第18天，然后每天记录一次。当体重损失连续三天达到或超过20％时，将小鼠人道处死。
图17提供了颅内植入BT-474肿瘤细胞的小鼠在静脉内施用媒介物、对照偶联物、v21252、v7155或v24029后的存活结果。
也将另外两个群组的颅内植入BT-474细胞的动物随机分组到处理组，并从第8天开始，每两周以6mg/kg静脉内施用v21252或v24029，总共注射六次。每周记录体重两次，直到第18天，然后每天记录一次。当体重损失连续三天达到或超过20％时，将小鼠人道处死。
图18提供了颅内植入BT-474肿瘤细胞的小鼠在每周(qw)静脉内施用媒介物、对照偶联物或v7155，或每两周(q2w)静脉内施用v21252或v24029后的存活结果。
该实施例证明v21252在延长颅内植入BT-474乳腺肿瘤细胞的小鼠的存活期方面是有效的。
表26：颅内植入的BT-474人乳腺癌模型研究设计
Figure BDA0002736406090001051
N/A＝不适用
本说明书中提及的所有专利、专利申请、出版物和数据库条目的公开内容特此明确地通过引用整体并入，其并入程度就如同明确单独地指出每个单独的专利、专利申请、出版物和数据库条目通过引用并入一样。
意图将对于本领域技术人员而言将显而易见的本文描述的特定实施方案的修改包括在所附权利要求的范围内。
序列表
表A：变体v5019、v5020、v7091、v10000、v6903、v6902和v6717的克隆编号
Figure BDA0002736406090001052
Figure BDA0002736406090001061
表B：按克隆编号列出的变体v5019、v5020、v7091、v10000、v6903、v6902和v6717的序列
Figure BDA0002736406090001062
Figure BDA0002736406090001071
Figure BDA0002736406090001081
Figure BDA0002736406090001091
Figure BDA0002736406090001101
Figure BDA0002736406090001111
Figure BDA0002736406090001121
Figure BDA0002736406090001131
Figure BDA0002736406090001141
Figure BDA0002736406090001151
Figure BDA0002736406090001161
Figure BDA0002736406090001171
Figure BDA0002736406090001181
Figure BDA0002736406090001191
Figure BDA0002736406090001201
Figure BDA0002736406090001211
Figure BDA0002736406090001221
Figure BDA0002736406090001231
Figure BDA0002736406090001241
Figure BDA0002736406090001251
Figure BDA0002736406090001261
Figure BDA0002736406090001271
Figure BDA0002736406090001281
表C：变体v7133、v15082、v15085、v15083、v15080、v15079、v15084和v15081的VH和VL区的序列
Figure BDA0002736406090001282
Figure BDA0002736406090001291
Figure BDA0002736406090001301
Figure IDA0002736406150000011
Figure IDA0002736406150000021
Figure IDA0002736406150000031
Figure IDA0002736406150000041
Figure IDA0002736406150000051
Figure IDA0002736406150000061
Figure IDA0002736406150000071
Figure IDA0002736406150000081
Figure IDA0002736406150000091
Figure IDA0002736406150000101
Figure IDA0002736406150000111
Figure IDA0002736406150000121
Figure IDA0002736406150000131
Figure IDA0002736406150000141
Figure IDA0002736406150000151
Figure IDA0002736406150000161
Figure IDA0002736406150000171
Figure IDA0002736406150000181
Figure IDA0002736406150000191
Figure IDA0002736406150000201
Figure IDA0002736406150000211
Figure IDA0002736406150000221
Figure IDA0002736406150000231
Figure IDA0002736406150000241
Figure IDA0002736406150000251
Figure IDA0002736406150000261
Figure IDA0002736406150000271
Figure IDA0002736406150000281
Figure IDA0002736406150000291
Figure IDA0002736406150000301
Figure IDA0002736406150000311
Figure IDA0002736406150000321
Figure IDA0002736406150000331
Figure IDA0002736406150000341
Figure IDA0002736406150000351
Figure IDA0002736406150000361
Figure IDA0002736406150000371
Figure IDA0002736406150000381
Figure IDA0002736406150000391
Figure IDA0002736406150000401
Figure IDA0002736406150000411
Figure IDA0002736406150000421
Figure IDA0002736406150000431
Figure IDA0002736406150000441
Figure IDA0002736406150000451
Figure IDA0002736406150000461
Figure IDA0002736406150000471
Figure IDA0002736406150000481
Figure IDA0002736406150000491
Figure IDA0002736406150000501
Figure IDA0002736406150000511
Figure IDA0002736406150000521
Figure IDA0002736406150000531
Figure IDA0002736406150000541
Figure IDA0002736406150000551
Figure IDA0002736406150000561
Figure IDA0002736406150000571
Figure IDA0002736406150000581
Figure IDA0002736406150000591
Figure IDA0002736406150000601
Figure IDA0002736406150000611
Figure IDA0002736406150000621
Figure IDA0002736406150000631
Figure IDA0002736406150000641
Figure IDA0002736406150000651
Figure IDA0002736406150000661
Figure IDA0002736406150000671
Figure IDA0002736406150000681
Figure IDA0002736406150000691
Figure IDA0002736406150000701
Figure IDA0002736406150000711
Figure IDA0002736406150000721
Figure IDA0002736406150000731
Figure IDA0002736406150000741
Figure IDA0002736406150000751
Figure IDA0002736406150000761
Figure IDA0002736406150000771
Figure IDA0002736406150000781
Figure IDA0002736406150000791
Figure IDA0002736406150000801
Figure IDA0002736406150000811
Figure IDA0002736406150000821
Figure IDA0002736406150000831
Figure IDA0002736406150000841
Figure IDA0002736406150000851
Figure IDA0002736406150000861
Figure IDA0002736406150000871
Figure IDA0002736406150000881
Figure IDA0002736406150000891
Figure IDA0002736406150000901
Figure IDA0002736406150000911
Figure IDA0002736406150000921

Claims (71)

1.一种抗体-药物偶联物，其包含经由接头(L)以低的平均药物:抗体比(DAR)与澳瑞他汀类似物偶联的抗HER2双互补位抗体，
其中所述抗HER2双互补位抗体包含结合第一HER2表位的第一抗原结合多肽构建体和结合第二HER2表位的第二抗原结合多肽构建体，所述第一和第二HER2表位是不同的表位，并且
其中所述低平均DAR是小于3.9的平均DAR。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其中所述澳瑞他汀类似物-接头具有通式(II)：
Figure FDA0002736406080000011
其中：
X为-C(O)NHCH(CH2R2)-，或X不存在；
R1选自：
Figure FDA0002736406080000012
L为接头，并且
Figure FDA0002736406080000013
表示所述澳瑞他汀类似物-接头与所述抗HER2双互补位抗体的附接点。
3.根据权利要求2所述的抗体-药物偶联物，其中R1为：
Figure FDA0002736406080000021
4.根据权利要求2所述的抗体-药物偶联物，其中X不存在。
5.根据权利要求4所述的抗体-药物偶联物，其中R1为：
Figure FDA0002736406080000022
6.根据权利要求2所述的抗体-药物偶联物，其中X为-C(O)NHCH(CH2R2)-。
7.根据权利要求6所述的抗体-药物偶联物，其中R1为：
Figure FDA0002736406080000023
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述平均DAR在0.5至3.5之间。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述平均DAR在0.5至2.5之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含5％或更多的DAR0种类。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含15％或更多的DAR0种类。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含约5％至约50％的DAR0种类。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含约10％至约30％的DAR0种类。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含约10％至约25％的DAR0种类。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含约15％至约25％的DAR0种类。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含25％或更少的DAR6或更高的种类。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含15％或更少的DAR6或更高的种类。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含0％至约15％的DAR6或更高的种类。
19.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含约0％至约10％的DAR6或更高的种类。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中L是可裂解接头。
21.根据权利要求20所述的抗体-药物偶联物，其中L是蛋白酶可裂解接头。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中L具有通式(VI)：
Figure FDA0002736406080000031
其中：
Z是能够与所述抗HER2双互补位抗体上的靶基反应的官能团；
Str为延伸段；
AA1和AA2各自独立地为氨基酸，其中AA1-[AA2]m形成蛋白酶裂解位点；
X为自分解基团；
D是与所述澳瑞他汀类似物的附接点；
s为0或1；
m为1至4之间的整数，并且
o为0、1或2。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中L具有通式(VIII)：
Figure FDA0002736406080000041
其中：
A-S-是与所述抗HER2双互补位抗体的附接点；
Y是一个或多个附加接头组分，或者不存在，并且
D是与所述澳瑞他汀类似物的附接点。
24.根据权利要求1至21中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中L具有通式(IX)：
Figure FDA0002736406080000042
其中：
A-S-是与所述抗HER2双互补位抗体的附接点；
Y是一个或多个附加接头组分，或者不存在，并且
D是与所述澳瑞他汀类似物的附接点。
25.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其中所述澳瑞他汀类似物-接头具有以下结构：
Figure FDA0002736406080000051
其中A-S-是与所述抗HER2双互补位抗体的附接点。
26.根据权利要求25所述的抗体-药物偶联物，其中所述平均DAR在0.5至2.5之间。
27.根据权利要求25或26所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含5％或更多的DAR0种类。
28.根据权利要求25或26所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含约5％至约50％的DAR0种类。
29.根据权利要求25或26所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含25％或更少的DAR6或更高的种类。
30.根据权利要求25或26所述的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物包含0％至约15％的DAR6或更高的种类。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗HER2双互补位抗体以比相应的二价单特异性抗体更高的亲和力与HER2结合。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗HER2双互补位抗体与相应的二价单特异性抗体相比显示出更高内化到表达HER2的细胞中。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体独立地为scFv、Fab、Fab’或sdAb。
34.根据权利要求33所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体独立地为scFv或Fab。
35.根据权利要求34所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一抗原结合多肽构建体为scFv，并且所述第二抗原结合多肽构建体为Fab。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一和第二HER2表位是非重叠表位。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一和第二HER2表位处于HER2的不同结构域上。
38.根据权利要求37所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一HER2表位处于HER2的ECD4上，并且所述第二HER2表位处于HER2的ECD2上。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一抗原结合多肽构建体与曲妥珠单抗竞争结合HER2。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第二抗原结合多肽构建体与帕妥珠单抗竞争结合HER2。
41.根据权利要求1至38中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含来自于v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717中任一个的ECD4结合臂的CDR序列。
42.根据权利要求1至38和41中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第二抗原结合多肽构建体包含来自于v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903、v6717、v7133、v15079、v15080、v15081、v15082、v15083、v15084或v15085中任一个的ECD2结合臂的CDR序列。
43.根据权利要求1至38和41中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第二抗原结合多肽构建体包含来自于所述v10000的ECD2结合臂的CDR序列。
44.根据权利要求1至38中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含来自于所述v10000的ECD4结合臂的CDR序列，并且所述第二抗原结合多肽构建体包含来自于所述v10000的ECD2结合臂的CDR序列。
45.根据权利要求1至38中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一抗原结合多肽构建体包括一组六个CDR，所述CDR与来自于所述v10000的ECD4结合臂的一组CDR具有90％或更高的序列同一性，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD4的能力。
46.根据权利要求1至38和45中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第二抗原结合多肽构建体包括一组六个CDR，所述CDR与来自于所述v10000的ECD2结合臂的一组CDR具有90％或更高的序列同一性，其中所述抗原结合多肽构建体保持结合ECD2的能力。
47.根据权利要求1至38中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含SEQ ID NO:27、28、29、39、40和41中列出的CDR序列，并且所述第二种抗原结合多肽构建体包含SEQ ID NO:67、68、69、70、71和72中列出的CDR序列。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗HER2双互补位抗体还包含支架，并且其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体与所述支架可操作地连接。
49.根据权利要求48所述的抗体-药物偶联物，其中所述支架是IgG Fc区。
50.根据权利要求49所述的抗体-药物偶联物，其中所述IgG Fc区是包含经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc区。
51.根据权利要求49所述的抗体-药物偶联物，其中所述IgG Fc区是包含具有第一多肽序列和第二多肽序列的经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc区，所述第一多肽序列包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且所述第二多肽序列包含在位置T366和T394处的氨基酸修饰，并且任选地还包含在位置K392处的氨基酸修饰，其中在位置F405处的氨基酸修饰为F405A、F405S、F405T或F405V；在位置Y407处的氨基酸修饰为Y407I或Y407V；在位置T366处的氨基酸修饰为T366I、T366L或T366M；在位置T394处的氨基酸修饰为T394W；在位置L351处的氨基酸修饰为L351Y；并且在位置K392处的氨基酸修饰为K392F、K392L或K392M。
52.根据权利要求51所述的抗体-药物偶联物，其中：
(a)所述经修饰的CH3结构域的第一多肽序列包含所述氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述经修饰的CH3结构域的第二多肽序列包含所述氨基酸修饰T366L、K392M和T394W；或
(b)所述经修饰的CH3结构域的第一多肽序列包含所述氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述经修饰的CH3结构域的第二多肽序列包含所述氨基酸修饰T366L、K392L和T394W；或
(c)所述经修饰的CH3结构域的第一多肽序列包含所述氨基酸修饰T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且所述经修饰的CH3结构域的第二多肽序列包含所述氨基酸修饰T350V、T366L、K392M和T394W；或
(d)所述经修饰的CH3结构域的第一多肽序列包含所述氨基酸修饰T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且所述经修饰的CH3结构域的第二多肽序列包含所述氨基酸修饰T350V、T366L、K392L和T394W；或
(e)所述经修饰的CH3结构域的第一多肽序列包含所述氨基酸修饰T350V、L351Y、S400E、F405A和Y407V，并且所述修饰的CH3结构域的第二多肽序列包含所述氨基酸修饰T350V、T366L、N390R、K392M和T394W。
53.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至52中任一项所述的抗体-药物偶联物和药学上可接受的载体或稀释剂。
54.一种抑制表达HER2的癌细胞生长的方法，所述方法包括使所述癌细胞与有效量的根据权利要求1至52中任一项所述的抗体-药物偶联物接触。
55.一种治疗表达HER2的癌症的方法，其包括向患有表达HER2的癌症的受试者施用有效量的根据权利要求1至52中任一项所述的抗体-药物偶联物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述表达HER2的癌症是乳腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述表达HER2的癌症是乳腺癌。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述表达HER2的癌症是卵巢癌。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述表达HER2的癌症通过免疫组织化学评分为HER2阴性。
60.根据权利要求1至52中任一项所述的抗体-药物偶联物，所述抗体-药物偶联物用于疗法中。
61.根据权利要求1至52中任一项所述的抗体-药物偶联物，所述抗体-药物偶联物用于治疗有需要的受试者中的表达HER2的癌症。
62.根据权利要求61所使用的抗体-药物偶联物，其中所述表达HER2的癌症是乳腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。
63.根据权利要求61所使用的抗体-药物偶联物，其中所述表达HER2的癌症是乳腺癌。
64.根据权利要求61所使用的抗体-药物偶联物，其中所述表达HER2的癌症是卵巢癌。
65.根据权利要求61至64中任一项所使用的抗体-药物偶联物，其中所述表达HER2的癌症通过免疫组织化学评分为HER2阴性。
66.根据权利要求1至52中任一项所述的抗体-药物偶联物在制造用于治疗表达HER2的癌症的药剂中的用途。
67.根据权利要求66所述的用途，其中所述表达HER2的癌症是乳腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。
68.根据权利要求66所述的用途，其中所述表达HER2的癌症是乳腺癌。
69.根据权利要求66所述的用途，其中所述表达HER2的癌症是卵巢癌。
70.根据权利要求66至69中任一项所述的用途，其中所述表达HER2的癌症通过免疫组织化学评分为HER2阴性。
71.一种抗体-药物偶联物组合物，其包含经由接头(L)与澳瑞他汀类似物偶联的抗HER2双互补位抗体，所述澳瑞他汀类似物-接头具有通式(II)：
Figure FDA0002736406080000101
其中：
X不存在；
R1选自：
Figure FDA0002736406080000102
L为接头，并且
Figure FDA0002736406080000103
表示所述澳瑞他汀类似物-接头与所述抗HER2双互补位抗体的附接点；
其中所述抗HER2双互补位抗体包含结合HER2的ECD4上的第一HER2表位的第一抗原结合多肽构建体和结合HER2的ECD2上的第二HER2表位的第二抗原结合多肽构建体，并且
其中所述抗体-药物偶联物组合物的平均DAR在0.5至2.5之间，并且包含约10％至约30％的DAR0种类，以及0％至约15％的DAR6或更高的种类。
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