TW202345907A - 抗gd2抗體、其免疫結合物及治療用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供結合人類GD2蛋白質的抗體,以及包含編碼該等抗體之序列的分離核酸及宿主細胞。本發明亦提供包含連接至生長抑制劑之該等抗體的免疫結合物,以及包含本發明之抗體或免疫結合物的醫藥組成物。本發明亦提供本發明之抗體、免疫結合物及醫藥組成物用於治療癌症或用於診斷目的的用途。
Description
本發明係關於結合人類GD2(雙唾液酸神經節苷脂(disialoganglioside)GD2)的抗體,以及包含編碼該等抗體之序列的分離核酸及宿主細胞。本發明亦關於包含連接至生長抑制劑之該等抗體的免疫結合物,以及包含本發明之免疫結合物的醫藥組成物。本發明亦關於本發明之抗體、免疫結合物及醫藥組成物用於治療癌症及/或用於診斷目的的用途。
抗體-藥物結合物(ADC)係一類結合單株抗體(mAb)的特異性與細胞毒性分子之功效的治療劑。使用ADC藉由結合的細胞毒性劑賦予抗體的殺癌活性,同時標靶特異性遞送降低經由暴露於游離毒性劑所引起的全身毒性。目前,總共有12種ADC已經FDA批准用於治療人類癌症,其中大多數係在過去2-3年內獲得批准。前兩種獲得批准的ADC係ADCETRIS® (Brentuximab vedotin或SGN-35),其係一種與細胞毒性劑MMAE結合的抗CD30抗體,經設計用來治療CD30陽性復發性淋巴瘤;及KADCYLA® (T-DM1),其係一種與細胞毒性劑DM1結合的抗HER2抗體,經設計用來治療HER2陽性轉移性乳癌。在此等最初批准之後尚有至少八個批准。
連接子技術對ADC的功效、特異性及安全性有深遠的影響。酶可裂解連接子利用細胞內外蛋白酶的差異活性來達成對藥物釋放的控制。藥物可藉由許多不同連接子與抗體結合,並且僅可藉由細胞內存在的溶酶體蛋白酶的作用特異性地裂解,並且在某些腫瘤類型中處於升高的水平(Koblinsk等人,2000)。此將確保連接子在血流中的穩定性,從而限制對健康組織的損害。然而,一些酶不穩定連接子的相關疏水性增加可導致ADC聚集,特別係對於強疏水性藥物。因此,需要能夠提供血清穩定性、以及增加溶解度的連接子,從而容許疏水性藥物的有效結合及細胞內遞送。
文獻提供抗GD2單株抗體於治療神經母細胞瘤及其他腫瘤適應症中的實例。目前已有三種抗GD2裸抗體藥物經批准用於人類使用:美國的那西妥單抗(naxitamab)(Danyelza®)及達妥昔單抗(dinutuximab)(Unituxin®),以及歐洲的達妥昔單抗β(dinutuximab beta)(Qarziba®)。雖然達妥昔單抗及達妥昔單抗β分別係在命名為SP2/0及CHO(中國倉鼠卵巢)細胞之小鼠骨髓瘤細胞株中產生的小鼠 - 人類嵌合抗體(ch14.18),但那西妥單抗係由CHO細胞產生的人源化抗體(hu3F8)。
所有兒科癌症患者中有大約12%死於神經母細胞瘤,其係兒童時期最常見的顱外實性瘤。大多數患者經診斷為高風險神經母細胞瘤,死亡率為50%。高風險神經母細胞瘤療法係由伴隨嚴重短期及長期毒性的多模態治療所組成。其復發率高,並且進一步的治療選項有限。加強習知的療法並未改善結果,且甚至涉及毒性增加。
如前所述,針對神經節苷脂GD2(一種在神經母細胞瘤、神經外胚層起源的癌症類型及神經組織上均勻表現之含碳水化合物的神經脂質抗原)的抗體達妥昔單抗經FDA批准用於神經母細胞瘤治療。此抗體的應用、結合細胞介素及分化因子,改善了患者的預後,並證實神經母細胞瘤對免疫療法易感(Yu等人,2010;New Engl. J. Med,第363卷:第1324-34頁;及Suzuki及Cheung.,2015;Expert Opin Ther Targets第19卷:第349-62頁)。與先前的標準化療治療相比,達妥昔單抗改良無事件存活期。然而,單獨投與抗GD2抗體所觀察到的正面臨床結果有時伴隨嚴重的毒性。雖然迄今為止已記錄了許多毒性(例如,心動過速、高血壓、低血壓、發熱及蕁麻疹),但最使人衰弱的毒性係神經性疼痛。事實上,儘管共同投與強效鎮痛藥(包括鴉片類藥物),但此神經性疼痛通常會限制劑量,從而限制抗GD2抗體的療效。此神經性疼痛可能係由補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)所介導。
此外,向罹患高風險神經母細胞瘤(12個月以上)或難治性/復發性神經母細胞瘤的患者引入雙唾液酸神經節苷脂(GD)2免疫療法已獲得進展(Ahmed等人,2014,Nazha等人,2020)。然而,神經性疼痛係一種常見且關鍵的劑量限制不良事件,其阻礙利用目前市售之GD2抗體(達妥昔單抗、那西妥單抗)對患者的完全治療潛力。似乎抗GD2 Ab與在周圍體感及內臟神經上表現之GD2的結合介導各種身體區域中的強烈急性疼痛及/或觸摸痛(allodynia),並與患者(Yuki等人,1997)及猴子(EMA/263814/2017,2017)的周圍神經損傷相關聯。儘管GD2在周圍神經上的表現相對較低(Slart等人,1997,Lammie等人,1993,Yuki等人,1997,Vriesendorp等人,1997),但很可能係亦應殺死腫瘤細胞之Ab的Fc部分效用功能,諸如抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC),觸發體液及細胞介質對周圍神經的免疫攻擊,其表現為神經病變及急性神經性疼痛(Sorkin 2002,Dobrenkov及Cheung 2014;Mastrangelo等人,2020,Nazha等人,2020)。
誘導周圍神經病變之ADC的另一實例係單甲基奧瑞他汀E (monomethyl auristatin E,MMAE),其係一種強效的抗癌微管靶向劑(MTA),使用作為三種經批准之含MMAE之ADC(及目前正在臨床開發的多種ADC)的有效載荷(payload),用來治療不同類型的癌症。MMAE-ADC經常誘發周圍神經病變,此係一種導致治療劑量降低或停止及隨後臨床終止許多MMAE-ADC之常見的不良事件。MMAE-ADC誘發的周圍神經病變係歸因於周圍神經中ADC的非特異性攝取及MMAE的釋放,從而破壞微管(MT)並引起神經退化。
因此,需要一種抗GD2 ADC,其抗體較佳地降低CDC及ADCC,結合至非神經毒性細胞毒性有效載荷(部分歸因於其化學組態及配方),可更選擇性地將其細胞毒性有效載荷遞送至惡性細胞而不觸發毒性,及尤其係原本會限制投藥及療效的周圍神經病變。
人源化抗GD2抗體hu14.18結合至存在於腫瘤(包括神經母細胞瘤、黑色素瘤、肉瘤等等)之細胞表面上、及正常組織(主要局限於人類中樞及周圍神經系統)上的雙唾液酸神經節苷脂GD2。雙唾液酸神經節苷脂GD2在正常組織中的表現基本上受限於中樞神經系統、周圍感覺神經纖維、真皮黑色素細胞、淋巴細胞及間質幹細胞。利用抗GD2抗體治療可誘發周圍神經病變及疼痛,據認為其與影響周圍神經的抗體效用功能諸如補體固定及補體依賴性細胞毒性(CDC)有關。先前開發出具有在免疫球蛋白IgG1恆定域中之點突變K322A(Kabat EU索引編號)的hu14.18抗體,命名為「hu14.18-IgG1(K322A)」(描述於美國專利8,835,606 B2,以引用的方式併入本文)。hu14.18抗體中的此K322A點突變係經設計來防止補體級聯及CDC效用功能的活化,同時仍維持對於抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)效用功能的潛力。此外,產生具有低岩藻糖基化的hu14.18-IgG1(K322A)以增強ADCC活性(如美國專利8,835,606 B2中所述,將所有胺基酸及核酸序列以引用的方式併入本文)。ADCC增強型hu14.18-IgG1(K322A)可能誘發較少補體固定/CDC介導的疼痛,同時通過ADCC作用機制殺死腫瘤細胞。ADCC增強型hu14.18-IgG1(K322A)處於臨床開發(第2期),但尚未獲得批准。具有野生型IgG1同型的嵌合抗GD2抗體(達妥昔單抗)經批准用於一組確定的小兒神經母細胞瘤患者,並且已知會發生與此治療相關聯的神經性疼痛而可能需要共同投與止痛藥。
在一些具體例中,本發明描述作為ADCC及CDC抗體效用功能兩者經降低或不存在之ADC的抗GD2 hu14.18抗體,藉此提供用來治療未被滿足之醫療需求之更大治療範圍的效益。設計不具有顯著ADCC或CDC效用功能的hu14.18抗體可降低經由投與抗GD2 hu14.18抗體所引起之神經性疼痛的風險,同時藥物與抗體的結合為此一抗GD2-ADC消除腫瘤細胞提供不同的作用機制。提供作為ADC之強效結合藥物之缺少顯著ADCC及CDC效用功能之抗GD2 hu14.18的組合改良現有的治療,並可能填補(迄今為止)患者未被滿足的醫療需求。在選定具體例中,所選擇的細胞毒性藥物應不含神經毒性特性。
抗體與特異性抗原標靶的結合係包括特定輕鏈及重鏈可變區互補決定區(CDR)胺基酸序列之抗原結合片段(Fab)結構域的特性。抗體效用功能及與Fcγ受體(FcγR)及新生兒Fc受體(FcRn)的結合係免疫球蛋白(Ig)恆定域的特性。存在不同的免疫球蛋白恆定域基因,且與Fab結構域序列融合在一起的此等恆定域基因決定抗體的同型(IgM、IgG1、IgG2等)。在天然存在的抗體或重組抗體中,相同的抗原結合域胺基酸序列可表現融合至不同的恆定域同型,以產生具有相同抗原標靶結合特異性但具有不同效用功能特性的抗體。抗體介導免疫系統組分活化的能力被稱為抗體的「效用功能」,並且重要的效用功能係通過與免疫細胞上的FcγR及血液及細胞外液中之補體蛋白(諸如補體組分1q (C1q))結合來介導。取決於同型,抗體將細胞上的特異性抗原標靶連接至免疫系統,並可通過免疫功能(諸如抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC))誘導對靶細胞的定向攻擊。Ig恆定域與FcRn的結合通過在抗體經內部化至細胞中後增加再循環回至循環而在抗體的體內半衰期中起著重要作用。已經有大量研究來測試抗體恆定域中之特定胺基酸殘基對抗體效用功能以及抗體與FcγR及補體蛋白結合的作用。可使用人類Ig恆定域之胺基酸序列中的一些變化來產生具有針對抗體效用功能及抗體與FcγR及補體蛋白結合之經改變特性的重組抗體。在選定具體例中,本發明係要提供ADC蛋白,其結合標靶GD2以將ADC分子遞送至細胞並且沒有顯著的抗體效用功能。
在本發明的一些具體例中,描述結合至來自依喜替康(Exatecan)拓撲異構酶-I 類抑制劑的小分子毒性有效載荷,用於治療不同腫瘤適應症(例如,肉瘤、神經母細胞瘤及SCLC)之抗GD2 hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK抗體的製造及用途。與已在臨床上使用的其他GD2抗體療法相比,此新穎的ADC提供較佳的治療範圍。
在本發明的較佳具體例中,由ADC設計出Fc部分效用功能性,並且替代地使用非神經毒性有效載荷依喜替康來殺死腫瘤細胞,結果在重複輸注分子1後,在大鼠及猴子中未出現PNS損傷及明顯的臨床疼痛信號。
定義
「GD2」係一種在神經外胚層起源的腫瘤(包括人類神經母細胞瘤及黑色素瘤)上表現的雙唾液酸神經節苷脂,其在正常組織(主要係針對人類的中樞及周圍神經系統)上的表現高度受限。GD2由以下化學結構定義:
其對應於以下IUPAC名稱:
(2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二羥基-6-(羥甲基)㗁烷-2-基]氧基-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-二羥基-2-(羥甲基)-6-[(E)-3-羥基-2-(十八烷醯基胺基)十八碳-4-烯氧基]㗁烷-3-基]氧基-3-羥基-6-(羥甲基)㗁烷-4-基]氧基-3-胺基-6-羧基-4-羥基㗁烷-2-基]-2,3-二羥基丙氧基]-5-胺基-4-羥基-6-(1,2,3-三羥丙基)㗁烷-2-羧酸。
「(結構)域」或「區(域)」可係蛋白質的任何區域,一般係根據序列同源性來定義,並且通常與特定的結構或功能實體相關。已知GD2家族成員由Ig樣結構域組成。術語(結構)域在本文件中係用來指示個別的Ig樣結構域,諸如「N-域」或連續域組,諸如「A2-B2域」。
「編碼序列」或「編碼」表現產物(諸如多肽、蛋白質或酶)的序列係一種核苷酸序列,其當經表現時,導致產生該多肽、蛋白質或酶,即該核苷酸序列編碼該多肽、蛋白質或酶的胺基酸序列。蛋白質的編碼序列可包括起始密碼子(通常係ATG)及終止密碼子。
如本文所用,提及特定蛋白質(例如抗體)可包括具有天然胺基酸序列的多肽,以及無論其來源或製備方式為何的變體及修飾形式。具有天然胺基酸序列的蛋白質係具有與從自然界獲得者相同之胺基酸序列的蛋白質。此種天然序列蛋白質可從自然界中分離出來或可使用標準的重組及/或合成方法來製備。天然序列蛋白質特異性地涵蓋天然存在的截短或可溶形式、天然存在的變體形式(例如選擇性剪接形式)、天然存在的等位基因變體及包括轉譯後修飾的形式。天然序列蛋白質包括攜帶轉譯後修飾(諸如糖基化、或磷酸化、或一些胺基酸殘基的其他修飾)的蛋白質。
術語「基因」意指編碼或對應於包含一或多種蛋白質或酶的全部或部分之特定胺基酸序列的DNA序列,並且可包括或可不包括例如決定基因表現條件的調節DNA序列,諸如啟動子序列。一些不是結構基因的基因可自DNA轉錄至RNA,但未轉譯成胺基酸序列。其他基因可作為結構基因的調節子或作為DNA轉錄的調節子。特定而言,術語基因可意欲用於編碼蛋白質的基因組序列,即包括調節子、啟動子、內含子及外顯子序列的序列。
本文中,與參考序列「至少85%相同」的序列係在其整個長度上與參考序列的整個長度具有85%或更多,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。因此,「序列一致性」的百分比可通過使用Needleman及Wunsch的演算法(J. Mol. Biol. 48:443 (1970))通過整體成對比對比較兩個此等序列的全長度來確定,例如使用具有BLOSUM62矩陣及以下參數的程式Needle (EMBOSS):起始空位(gap open)=10,延伸空位(gap extend)=0.5,末端空位罰分(end gap penalty)=錯誤(false),末端空位起始(end gap open)=10,末端空位延伸(end gap extend)=0.5(此係標準設定)。
「保留胺基酸取代」係指其中一個胺基酸殘基經另一個包括具有相似化學性質(例如,電荷、尺寸或疏水性)之側鏈的胺基酸殘基取代。一般而言,保留胺基酸取代將不會實質性地改變蛋白質的功能性質。包括具有相似化學性質之側鏈之胺基酸群組的實例包括 1)脂族側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸;2)脂族羥基側鏈:絲胺酸及蘇胺酸;3)含醯胺側鏈:天冬醯胺酸及麩醯胺酸;4)芳族側鏈:苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸;5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸及組胺酸;6)酸性側鏈:天冬胺酸及麩胺酸;及7)含硫側鏈:半胱胺酸及甲硫胺酸。保留胺基酸取代群組亦可根據胺基酸大小來定義。
「抗體」(亦稱為「免疫球蛋白」)可例如係天然或習知類型的抗體,其中兩個重鏈通過二硫鍵相互連接,並且每個重鏈通過二硫鍵與輕鏈連接。存在兩種類型的輕鏈,即λ(l)及κ(k)。存在五種主要的重鏈類別(或同型),其決定抗體分子之功能活性的態樣:IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。每個抗體鏈包含不同的序列結構域(或區)。典型IgG抗體的輕鏈包括兩個區 - 可變區(VL)及恆定區(CL)。典型IgG抗體的重鏈包括四個區,即可變區(VH)及恆定區(CH),後者由三個恆定域(CH1、CH2及CH3)構成。輕鏈及重鏈兩者的可變區決定與抗原的結合及特異性。輕鏈及重鏈的恆定區可賦予重要的生物性質,諸如抗體鏈締合、分泌、經胎盤活動性(trans-placental mobility)、補體結合及與Fc受體(FcR)的結合。Fv片段係抗體之Fab片段的N-端部分,並且由一個輕鏈及一個重鏈的可變部分組成。
抗體的特異性在於抗體結合位點與抗原決定位之間的結構互補性。抗體結合位點係由主要來自所謂高度變異或互補決定區(CDR)的殘基組成。因此,互補決定區(CDR)係指胺基酸序列,其共同界定抗體之Fv區的結合親和力及特異性。抗體的輕鏈(L)及重鏈(H)各具有三個CDR,分別命名為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L及CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此,習知之抗體的抗原結合位點包括六個CDR,包括來自重鏈及輕鏈可變區之各者的CDR組。
「框架區」(FR)係指在CDR之間插入的胺基酸序列,即在單一物種中在不同免疫球蛋白之間相對保留之免疫球蛋白輕鏈及重鏈可變區的彼等部分。免疫球蛋白的輕鏈及重鏈各具有四個FR,分別命名為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L、及FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。如本文所使用,「人類框架區」係與天然存在的人類抗體的框架區實質上相同(約85%或更多,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的框架區。
如本文所使用的術語「單株抗體」或「mAb」係指單一胺基酸序列的抗體分子,其係針對特定抗原,並且不被解釋為需要通過任何特定方法來製造抗體。單株抗體可例如通過B細胞或融合瘤的單殖株(single clone)來產生,但亦可係重組的,例如通過涉及基因或蛋白質工程的方法來產生。
術語「嵌合抗體」係指工程抗體,在其最廣泛的意義上,其包含來自一種抗體的一或多個區及來自一或多種其他抗體的一或多個區。在一具體例中,嵌合抗體包括來源於非人類動物之抗體的VH及VL,與另一抗體(在一些具體例中,其係人類抗體)的CH及CL締合。關於非人類動物,可使用任何動物諸如小鼠、大鼠、倉鼠、兔子等等。嵌合抗體亦可指示對至少兩種不同抗原具有特異性的多特異性抗體。
術語「人源化抗體」係指全部或部分非人源的抗體,且其已經修飾來置換某些胺基酸,例如在VH及VL的框架區中,以避免或最小化人類的免疫反應。人源化抗體的恆定區通常係人類CH及CL區。
抗體(例如習知抗體)的「片段」包含完整抗體諸如IgG的一部分,特定而言完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、雙功能抗體、以及由抗體片段形成的雙特異性及多特異性抗體。習知抗體的片段亦可係單域抗體,諸如重鏈抗體或VHH。
術語「Fab」指示具有約50,000 Da分子量及抗原結合活性的抗體片段,其中大約一半的N端側重鏈及整個輕鏈通過二硫鍵結合在一起。其通常係通過用蛋白酶(木瓜酶)處理IgG而在片段間獲得。
術語「F(ab')2」係指具有約100,000 Da之分子量及抗原結合活性的抗體片段,其略大於通過鉸鏈區之二硫鍵結合之2個相同的Fab片段。其通常通過用蛋白酶(胃蛋白酶)處理IgG而在片段間獲得。
術語「Fab'」係指具有約50,000 Da之分子量及抗原結合活性的抗體片段,其係通過切割F(ab')2之鉸鏈區的二硫鍵而獲得。
單鏈Fv(「scFv」)係共價連接的VH::VL異二聚體,其通常由包括經肽編碼連接子連接之VH及VL編碼基因的基因融合表現。本發明的人類scFv片段包括例如經由使用基因重組技術而保持適當構形的CDR。二價及多價抗體片段可通過締合單價scFv自發地形成,或可通過經肽連接子偶合單價scFv而產生,諸如二價sc(Fv)2。「dsFv」係經二硫鍵穩定的VH::VL異二聚體。「(dsFv)2」指示經肽連接子偶合的兩個dsFv。
「抗體-藥物結合物」或「ADC」係各通過連接子與一或多種細胞毒素結合的抗體。該抗體通常係對抗原具特異性的單株抗體。在本發明的某些較佳具體例中,ADC係經設計為用於治療癌症的標靶療法。不同於單獨的化療,此等較佳具體例組合單株抗體的標靶能力與細胞毒性藥物的殺癌能力,並且可以區分健康組織與惡性組織。
如本文所用,「分子1」係指以下ADC:
其中:該抗體結合至GD2,該抗體包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列及SEQ ID NO:1的胺基酸序列,該連接子係β-葡萄糖醛酸苷,及該生長抑制劑係依喜替康。
術語「融合瘤」指示一種細胞,其係通過使利用抗原使非人類哺乳動物免疫而製備得的B細胞與來源於小鼠等的骨髓瘤細胞進行細胞融合而獲得,其產生具有抗原特異性的所需單株抗體。在一些實例中,名稱「M3554」係分子1的同義詞。
「經純化」或「經分離」當指稱多肽(例如抗體)或核苷酸序列時,意指所指示的分子係在實質上不存在其他相同類型之生物大分子的情況下存在。本文所用的術語「經純化」意指存在至少75重量%、85重量%、95重量%、96重量%、97重量%或98重量%之相同類型的生物大分子。編碼特定多肽的「經分離」核酸分子係指實質上不含其他不編碼相關多肽之核酸分子的核酸分子;然而,該分子可包括一些不會不利地影響組成物之基本特性的額外鹼基或部分。
如本文所用,術語「受試者」指示哺乳動物,諸如嚙齒動物、貓科動物、犬科動物、靈長類動物或人類。在本發明的具體例中,受試者(或患者)係人類。
如本文所用,術語「周圍神經病變」指示位於腦及脊髓外之神經(周圍神經)的損傷,臨床表現為虛弱、麻木及/或疼痛。
如本文所用,「神經性疼痛」係指由在腦及脊髓與皮膚、肌肉及其他身體部位之間傳遞資訊之神經之損傷或傷害所引起的疼痛,臨床表現為受影響區域通常對觸覺敏感的燒灼感。
本發明抗體的製造方法
本發明的抗體可通過技藝中已知的任何技術產生,諸如,但不限於,任何單獨的化學、生物、基因或酶技術或其組合。
如知曉期望抗體的胺基酸序列,則熟悉技藝人士可使用多肽的標準製造技術來輕易地製造該等抗體或免疫球蛋白鏈。例如,其可使用熟知的固相方法使用市售的肽合成設備(諸如由Applied Biosystems (Foster City, California)所製造者)並按照製造商的說明來合成。或者,本發明的抗體及免疫球蛋白鏈可通過如技藝中所熟知的重組DNA技術來製造。例如,此等多肽(例如抗體)可在將編碼期望多肽的DNA序列併入至表現載體中並將此等載體引入至將表現期望多肽之合適的真核或原核宿主中,稍後可使用熟知的技術將其分離之後作為DNA表現產物獲得。
使用抗體鏈的胺基酸序列來產生抗GD2-ADC分子的蛋白質前體。顯示成熟的抗GD2 hu14.18輕鏈及重鏈胺基酸序列。hu14.18重鏈的C端可如由G446 (Kabat EU索引編號)或K447 (Kabat EU索引編號)所示來結束。將恆定域與野生型人類IgG1序列的變化加上底線。
hu14.18成熟輕鏈胺基酸序列:
hu14.18-IgG1-delK成熟重鏈胺基酸序列:
hu14.18-IgG1.4-delK成熟重鏈胺基酸序列:
hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK重鏈胺基酸序列
提供用來測試抗GD2抗體蛋白前體蛋白之候選表徵級聯的流程圖:
本發明進一步係關於一種製造本發明抗體的方法,該方法包括由以下組成的步驟:(i)培養根據本發明的轉形宿主細胞;(ii)表現抗體;及(iii)回收經表現的抗體。
本發明的抗體可通過習知的免疫球蛋白純化程序諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和力層析從培養基中適當地分離出來。
在一些具體例中,本發明的人源化嵌合抗體可通過以下程序來製造:獲得編碼如前所述之人源化VL及VH區的核酸序列,經由將其插入至具有編碼人類抗體CH及人類抗體CL之基因之動物細胞的表現載體中來建構人類嵌合抗體表現載體,及經由將表現載體引入至動物細胞中來表現編碼序列。
作為人類嵌合抗體的CH結構域,可使用屬於人類免疫球蛋白重鏈的任何區,例如IgG類別的彼等係合適的,並且可使用屬於IgG類別之亞類中的任一者,諸如IgG1、IgG2、lgG3及IgG4。此外,作為人類嵌合抗體的CL,可使用屬於人類免疫球蛋白輕鏈的任何區,並且可使用κ類別或λ類別的彼等。
製造人源化或嵌合抗體的方法可涉及習知的重組DNA並且基因轉染技術係技藝中熟知的(參見例如Morrison SL.等人(1984)及專利文件US 5,202,238;及US 5,204,244)。
技藝中熟知基於習知之重組DNA及基因轉染技術之製造人源化抗體的方法(參見,例如,Riechmann L.等人 1988;Neuberger MS.等人 1985)。抗體可使用技藝中已知的各種技術進行人源化,包括例如在以下申請案中揭示的技術:WO2009/032661,CDR移植(EP 239,400;PCT公開案WO91/09967;美國專利案號 5,225,539;5,530,101;及5,585,089);貼面(veneering)或重鋪(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan EA (1991);Studnicka GM等人(1994);Roguska MA.等人(1994))及鏈改組(chain shuffling)(美國專利第5,565,332號)。亦知曉用於製備此等抗體的一般重組DNA技術(參見歐洲專利申請案EP 125023及國際專利申請案WO 96/02576)。
本發明的Fab可通過用蛋白酶(諸如木瓜酶)處理本發明之抗體(例如IgG)來獲得。此外,可通過將編碼抗體Fab兩個鏈的DNA序列插入至用於原核表現或用於真核表現的載體中,並將載體引入至原核或真核細胞(視情況而定)中以表現Fab,來產生Fab。
本發明的F(ab')2可用蛋白酶(胃蛋白酶)處理本發明的抗體(例如IgG)來獲得。此外,F(ab')2可經由通過硫醚鍵或二硫鍵結合下文所述的Fab'來製造。
本發明的Fab'可通過用還原劑(諸如二硫蘇糖醇)處理本發明的F(ab')2來獲得。此外,Fab'可通過將編碼抗體Fab'鏈的DNA序列插入至用於原核表現之載體或用於真核表現之載體中,並將載體引入至原核或真核細胞(視情況而定)中以執行其表現來產生。
本發明的scFv可通過以下程序來產生:獲取如先前針對本發明抗體所述之CDR或VH及VL結構域的序列,然後建構編碼scFv片段的DNA,將該DNA插入至原核或真核表現載體中,及接著將表現載體引入至原核或真核細胞(視情況而定)中以表現scFv。為生成人源化scFv片段,可使用稱為CDR移植的熟知技術,其涉及根據本發明選擇互補決定區(CDR),並將其移植至已知三維結構的人類scFv片段框架上(參見,例如,W098/45322;WO 87/02671;US 5,859,205;US 5,585,089;US 4,816,567;EP0173494)。
經修飾的抗GD2抗體
考慮本文所述抗體的胺基酸序列修飾。例如,可能希望改良抗體的結合親和力及/或其他生物性質。
可在本發明抗體的結構中及在編碼其等的DNA序列中進行修飾及改變,而仍然產生具有期望特性的功能性抗體或多肽。
在對多肽的胺基序列進行改變時,可考慮胺基酸的水性指數(hydropathic index)。水性胺基酸指數對蛋白質之相互作用生物學功能的重要性在本技藝中係普遍理解的。據認為,胺基酸的相對水性特性有助於所得蛋白質的二級結構,其繼而界定蛋白質與其他分子(例如,酶、基質、受體、DNA、抗體、抗原等)的相互作用。每種胺基酸都根據其疏水性及電荷特性被指定一水性指數,其等係:異白胺酸(+4.5);纈胺酸(+4.2);白胺酸(+3.8);苯丙胺酸(+2.8);半胱胺酸(+2.5);甲硫胺酸(+1.9);丙胺酸(+1.8);甘胺酸(-0.4);蘇胺酸(-0.7);絲胺酸(-0.8);色胺酸(-0.9);酪胺酸(-1.3);脯胺酸(-1.6);組胺酸(-3.2);麩胺酸鹽(-3.5);麩醯胺酸(-3.5);天冬胺酸鹽(-3.5);天冬醯胺酸(-3.5);離胺酸(-3.9);及精胺酸(-4.5)。
本發明的再一態樣亦涵蓋本發明多肽的功能保留性變體。
舉例來說,某些胺基酸可在蛋白質結構中經其他胺基酸取代而不會明顯喪失活性。由於蛋白質的相互作用能力及性質界定其生物功能活性,因此可在蛋白質序列中,及當然在其編碼DNA序列中進行某些胺基酸取代,同時仍獲得具有相似性質的蛋白質。因此,考慮可在本發明的抗體序列或編碼該等多肽的相應DNA序列中進行各種改變,而不會明顯地損失其生物活性。
技藝中知曉某些胺基酸可經具有相似水性指數或分數的其他胺基酸取代,並且仍然產生具有相似生物活性的蛋白質,即仍然獲得生物功能性等效蛋白質。亦可使用成熟的技術,諸如丙胺酸掃描方法,來在本發明的抗體或多肽中鑑別所有可經取代而不會顯著失去與抗原之結合的胺基酸。此等殘基可經定性為中性,乃因其未參與抗原結合或維持抗體的結構。此等中性位置中的一或多者可經丙胺酸或另一不會改變本發明之抗體或多肽之主要特性的胺基酸取代。
中性位置可被視作可併入任何胺基酸取代的位置。實際上,在丙胺酸掃描的原理中,選擇丙胺酸係因為此殘基不具有特定結構或化學特徵。一般認為,如丙胺酸可取代特定胺基酸而不改變蛋白質的性質,則許多其他(若非全部)胺基酸取代亦可能係中性的。在丙胺酸係野生型胺基酸的相反情況下,如特定取代可經顯示為中性,則其他取代亦可能係中性的。
如前所述,胺基酸取代一般係基於胺基酸側鏈取代基的相對相似性,例如,其等的疏水性、親水性、電荷、大小等。熟悉技藝人士熟知考慮上述任何特性的例示性取代,並且包括:精胺酸及離胺酸;麩胺酸鹽及天冬胺酸鹽;絲胺酸及蘇胺酸;麩醯胺酸及天冬醯胺酸;及纈胺酸,白胺酸及異白胺酸。
亦可能希望針對效用功能修飾本發明的抗體,例如為了增強抗體的抗原依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC),或者例如為了改變與Fc受體的結合。此可通過在抗體的Fc區中引入一或多個胺基酸取代來達成。替代地或另外地,可在Fc區中引入半胱胺酸殘基,從而允許在此區中形成鏈間二硫鍵。如此產生的同二聚體抗體可能具有經改良的內化能力及/或增加的補體介導殺死細胞及/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(Caron PC.等人1992;及Shopes B. 1992)。在一些具體例中,本發明的抗體可係具有導致減少或消除與大多數Fcγ受體之結合的經修飾胺基酸序列的抗體,其可減少於表現該等受體之正常細胞及組織(例如巨噬細胞、肝竇細胞等)中的攝取及毒性。
本發明抗體之另一類型的胺基酸修飾可有用於改變抗體的原始糖基化模式,即通過刪除存在於抗體中的一或多個碳水化合物部分,及/或添加一或多個不存在於抗體中的糖基化位點。存在三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外的任何胺基酸)中的任一者產生潛在的糖基化位點。向抗體添加或刪除糖基化位點可方便地通過改變胺基酸序列,使得其包含一或多個上述三肽序列(針對N-連接的糖基化位點)來完成。
另一類型的修飾涉及移除經電腦模擬或實驗鑑別為可能導致降解產物或抗體製劑不均勻的序列。舉例來說,可取決於諸如pH及表面暴露的因素而發生天冬醯胺酸及麩醯胺酸殘基的脫醯胺。天冬醯胺酸殘基尤其易於脫醯胺,主要係當存在於Asn-Gly序列中時,並且在較小程度上當存在於其他二肽序列諸如Asn-Ala中時。當抗體或多肽中存在此一脫醯胺位點,特定而言Asn-Gly時,可因此考慮移除該位點(通常藉由保留取代),從而移除其中一個牽連的殘基。此種在序列中移除一或多個牽連殘基的取代亦意欲由本發明所涵蓋。
另一類型的共價修飾涉及將糖苷化學或酶偶合至抗體。此等程序的優點在於其不需要在針對N-或O-連接之糖基化具有糖基化能力的宿主細胞中產生抗體。取決於所使用的偶合模式,糖可連接至(a)精胺酸及組胺酸,(b)游離羧基,(c)游離巰基諸如半胱胺酸的彼等,(d)游離羥基諸如絲胺酸、蘇胺酸、或羥脯胺酸的彼等,(e)芳族殘基諸如苯丙胺酸、酪胺酸、或色胺酸的彼等,或(f)麩醯胺酸的醯胺基。舉例來說,WO87/05330中描述該等方法。
抗體上存在的碳水化合物部分的移除可通過化學或酶法完成。化學去糖基化需要將抗體暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯葡萄糖胺或N-乙醯半乳糖胺)外的大部分或所有糖的裂解,同時保持抗體完整。化學去糖基化由Sojahr H.等人(1987)及Edge, AS.等人(1981)描述。抗體上之碳水化合物部分的酶裂解可通過使用如由Thotakura, NR.等人(1987)所描述的各種內切及外切糖苷酶來達成。
抗體之另一類型的共價修飾包括將抗體連接至多種非蛋白質聚合物之一者,例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧伸烷基,例如以美國專利案號4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192及4,179,337中陳述的方式。
技藝中已知的其他胺基酸序列修飾亦可應用於本發明的抗體。
抗GD2 ADC
本發明提供免疫結合物,本文亦稱為ADC或更簡單地稱為結合物。如本文所用,所有此等術語具有相同的含義並且可以互換。本發明的免疫結合物可根據本文所述的體外方法來製備。
本發明提供一種ADC,其包含通過連接子共價連接至至少一種生長抑制劑之本發明的抗體(諸如mAb1,或具有與mAb1相似的CDR的抗體)。
術語「生長抑制劑」(亦稱為「抗增殖劑」)係指在體外及/或體內抑制細胞(諸如腫瘤細胞)生長的分子或化合物或組成物。
在一些具體例中,生長抑制劑係細胞毒性藥物(亦稱為細胞毒性劑)。本發明亦考慮使用作為細胞毒性藥物的放射性部分。
本文所用的術語「細胞毒性藥物」係指直接或間接抑制或阻止細胞功能及/或導致細胞破壞的物質。術語「細胞毒性藥物」包括,例如,化療劑、酶、抗生素、毒素諸如小分子毒素或酶活性毒素、類毒素、長春花、紫杉烷類、美登素類(maytansinoid)或美登素類類似物、托梅黴素(tomaymycin)或吡咯并苯二氮平類(pyrrolobenzodiazepine)衍生物、念珠藻素(cryptophycin)衍生物、萊普黴素(leptomycin)衍生物、奧瑞他汀(auristatin)或尾海兔素(dolastatin)類似物、前藥、拓樸異構酶 I 抑制劑、拓撲異構酶 II 抑制劑、DNA烷化劑、抗微管蛋白劑、CC-1065及CC-1065類似物。
拓撲異構酶 I 抑制劑係抑制人類酶拓撲異構酶 I 的分子或化合物,其通過催化單鏈DNA的暫態斷裂及重新連接來參與改變DNA的拓撲構形。拓撲異構酶 I 抑制劑對分裂細胞(例如哺乳動物細胞)具高度毒性。合適拓撲異構酶 I 抑制劑的實例包括喜樹鹼(CPT)及其類似物諸如托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、西拉替康(silatecan)、科西替康(cositecan)、依喜替康、魯托替康(lurtotecan)、吉馬替康(gimatecan)、貝洛替康(belotecan)及魯比替康(rubitecan)。
在一些具體例中,本發明的免疫結合物包含作為生長抑制劑的細胞毒性藥物依喜替康。依喜替康的IUPAC化學名稱為:
(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮。
依喜替康由以下結構式(I)表示:
(I)
依喜替康係喜樹鹼的改性衍生物,其具有與帶有增溶一級胺(相當於喜樹鹼上的7-CH2NH2取代基)之環A及B稠合的額外脂環族環。在環A上的位置10及11處亦存在增強膜滲透性的親脂性取代基。
在本發明的進一步具體例中,可使用其他CPT類似物及其他細胞毒性藥物,例如如上所列。一些細胞毒性藥物及結合方法的實例在以引用方式併入的申請案WO2008/010101中進一步給出。
術語「放射性部分」係指包含或由適於治療癌症的放射性同位素(諸如At
211、Bi
212、Er
169、I
131、I
125、Y
90、In
111、P
32、Re
186、Re
188、Sm
153、Sr
89或Lu的放射性同位素)組成的化學實體(諸如分子、化合物或組成物)。此等放射性同位素通常主要發射β輻射。在一些具體例中,放射性同位素係α發射體同位素,例如發射α輻射的釷227。免疫結合物可例如如申請案WO2004/091668中所述來製備。
在本發明的免疫結合物中,本發明的抗體通過連接子共價連接至至少一種生長抑制劑。本文所用的「連接子」意指包含共價鍵及/或任何將生長抑制劑共價連接至抗體之原子鏈的化學部分。連接子係技藝中熟知的,並且包括例如二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。本發明抗體與細胞毒性藥物或其他生長抑制劑的結合可例如使用多種雙功能蛋白質偶合劑來進行,其包括,但不限於,N-琥珀醯亞胺基吡啶基二硫基丁酸酯(SPDB)、丁酸4-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫基]-2,5-二側氧基-1-吡咯啶基酯(硝基-SPDB)、4-(吡啶-2-基二硫基)-2-磺基丁酸(磺基-SPDB)、N-琥珀醯亞胺基(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸己二甲胺二甲酯)、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺基辛酸酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鎓衍生物(諸如雙-(對重氮鎓苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人(1987)中所述來製備。碳標記 1-異硫氰酸基苄基甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係使放射性核種與抗體結合的例示性螯合劑(WO 94/11026)。
在本發明的具體例中,連接子可係「可裂解連接子」,其可促進細胞毒性藥物或其他生長抑制劑在細胞(例如腫瘤細胞)內或附近的釋放。在一些具體例中,連接子係可在哺乳動物細胞的內體中裂解的連接子。例如,可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、酯酶不穩定連接子、光不穩定連接子或含二硫化物的連接子(參見例如美國專利第5,208,020號)。
當提及代表免疫結合物的結構式時,本文亦使用以下命名法:生長抑制劑及連接子亦一起稱為[(連接子)-(生長抑制劑)]部分;例如,依喜替康分子及連接子亦一起稱為[(連接子)-(依喜替康)]部分。
在本發明的一些特定具體例中,連接子係可由人類酶葡萄糖醛酸苷酶裂解的連接子。例如,本發明的免疫結合物可因此具有以下式(II),其包括可由葡萄糖醛酸苷酶裂解的連接子:
(II),
其中該抗體係本發明的抗體,其中S係抗體的硫原子,且其中n係與抗體共價連接之[(連接子)–(生長抑制劑)]部分的數目。例如,數目n可係介於1與10 之間;在更特定具體例中,n係介於7與8 之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。在一些具體例中,S係抗體之半胱胺酸的硫原子。在一些具體例中,該抗體係mAb1。
數目n亦被稱為「藥物抗體比」(或「DAR」);此數目n始終應理解為免疫結合物之任何給定(製劑)的平均數目。
在本發明的其他特定具體例中,連接子係可由人類酶天冬胺酸内肽酶(legumain)裂解的連接子。例如,本發明的免疫結合物可因此具有以下式(III),其包括可由天冬胺酸内肽酶裂解的連接子:
(III),
其中該抗體係本發明的抗體,其中S係抗體的硫原子,且其中n係與抗體共價連接之[(連接子)–(生長抑制劑)]部分的數目。例如,數目n(亦稱為DAR)可係介於1與10之間;在更特定具體例中,n係介於7與8之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。在一些具體例中,S係抗體之半胱胺酸的硫原子。在一些具體例中,該抗體係mAb1。
在上述式(II)及(III)之各者中,抗體之硫原子與生長抑制劑之間的化學結構係連接子。此等連接子之一者亦包含在下文進一步描述的每個式(IV)至(IX)中。
在具有可由葡萄糖醛酸苷酶或天冬胺酸内肽酶裂解之連接子的任何一個具體例中,如前所述,生長抑制劑可例如係依喜替康。
因此,在一些具體例中,本發明提供一種免疫結合物,其包含通過連接子共價連接至依喜替康之根據本發明的抗體,其中該結合物具有以下式(IV):
(IV),
其中S係抗體的硫原子,且其中n係與抗體共價連接之[(連接子)–(依喜替康)]部分的數目。例如,數目n(亦稱為DAR)可係介於1與10之間;在更特定具體例中,n係介於7與8之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。在一些具體例中,該抗體係mAb1。
在其他具體例中,本發明提供一種免疫結合物,其包含通過連接子共價連接至依喜替康之根據本發明的抗體,其中該結合物具有以下式(V):
(V),
其中S係抗體的硫原子,且其中n係與抗體共價連接之[(連接子)–(依喜替康)]部分的數目。例如,數目n(亦稱為DAR)可係介於1與10之間;在更特定具體例中,n係介於7與8之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。在一些具體例中,該抗體係mAb1。
在一些具體例中,在本發明的免疫結合物諸如具有如前所述之葡萄糖醛酸苷酶或天冬胺酸内肽酶可裂解連接子之依喜替康結合物中,連接子係在抗體之半胱胺酸殘基的硫原子處共價連接至抗體。例如,此抗體的半胱胺酸殘基可係能夠形成鏈間二硫鍵(本文亦稱為鏈間二硫橋)之半胱胺酸殘基之一。由於IgG1抗體中存在四個鏈間二硫鍵,總共涉及八個半胱胺酸殘基,因此在此等半胱胺酸殘基的硫原子處將連接子連接至抗體使得DAR可高達8,且在此等情況下,DAR通常在7與8之間,諸如在7.5與8.0之間(即約8),限制條件係抗體係IgG1或具有與IgG1相同數目的鏈間二硫鍵。
因此,在一些具體例中,本發明提供一種免疫結合物,其包含通過連接子共價連接至依喜替康之根據本發明的抗體,其中該結合物具有以下式(VI):
(VI),
其中S係抗體之半胱胺酸的硫原子,且其中n係與抗體共價連接之[(連接子)–(依喜替康)]部分的數目。例如,數目n(亦稱為DAR)可係介於1與10之間;在更特定具體例中,n係介於7與8之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。
在其他具體例中,本發明提供一種免疫結合物,其包含通過連接子共價連接至依喜替康之根據本發明的抗體,其中該結合物具有以下式(VII):
(VII),
其中S係抗體之半胱胺酸的硫原子,且其中n係與抗體共價連接之[(連接子)–(依喜替康)]部分的數目。例如,數目n(亦稱為DAR)可係介於1與10之間;在更特定具體例中,n係介於7與8之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。
在上述任何免疫結合物中,可使用任何本發明的抗體(如上文及下文所述)。在一些具體例中,本發明的免疫結合物包含mAb1作為抗體。
因此,在一些具體例中,本發明提供一種免疫結合物,其包含通過連接子共價連接至依喜替康的mAb1,其中該結合物具有以下式(VIII):
(VIII),
其中S係抗體mAb1之半胱胺酸的硫原子,且其中n係共價連接至mAb1之[(連接子)–(依喜替康)]部分的數目。例如,數目n(亦稱為DAR)可係介於1與10之間;在更特定具體例中,n係介於7與8之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。在一些具體例中,S係能夠形成鏈間二硫橋之mAb1之半胱胺酸的硫原子,並且DAR係約8。此一免疫結合物(即「ADC1」)的一實例進一步描述於實施例中。
在其他具體例中,本發明提供一種免疫結合物,其包含通過連接子共價鍵連接至依喜替康的mAb1,其中該結合物具有以下式(IX):
(IX),
其中S係抗體mAb1之半胱胺酸的硫原子,且其中n係共價連接至mAb1之[(連接子)–(依喜替康)]部分的數目。例如,數目n(亦稱為DAR)可係介於1與10之間;在更特定具體例中,n係介於7與8之間;在再更特定具體例中,n係介於7.5與8.0之間(即約 8)。在一些具體例中,S係能夠形成鏈間二硫橋之mAb1之半胱胺酸的硫原子,並且DAR係約8。與抗huLRRC15 ADC之抗原結合部分連接之細胞毒性及/或細胞生長抑制劑的數目可變化(稱為「藥物抗體比」或「DAR」),並且將僅受抗原結合部分上之可用連接位點的數目及與單個連接子連接之試劑的數目限制。只要抗GD2 ADC在使用及/或儲存條件下未展現不可接受的聚集程度,則可考慮DAR為20或再更高的抗GD2 ADC。
在本發明的其他具體例中,連接子可係「不可裂解的連接子」(例如SMCC連接子)。在抗體的溶酶體降解時可發生生長抑制劑自抗體的釋放。
在本發明的其他具體例中,免疫結合物可係包含本發明抗體及細胞毒性或生長抑制性多肽(作為生長抑制劑)的融合蛋白;此等融合蛋白可通過重組技術或通過肽合成(即技藝中熟知的方法)來製備。編碼DNA的分子可包含編碼結合物之彼此相鄰或由編碼連接子肽之區域隔開之兩個部分(分別為抗體及細胞毒性或生長抑制性多肽)的各別區域。
在本發明的一些具體例中,在保持足夠的ADCC活性以攻擊腫瘤細胞的同時,經由避免CDC通過hu14.18 Ab中的Fc點突變(K322A)來降低疼痛,如由指示機械性觸摸痛之部分緩解之來自大鼠觸摸痛模型的實驗數據所證實(Slart等人,1997,Sorkin等人,2010)。
為此,通過將人源化ch14.18衍生Ab與依喜替康(一種強效的DNA拓撲異構酶 I 抑制劑)結合來設計ADC(分子1),以於ADC內化及細胞內酶釋放溶酶體中之有效載荷後誘導腫瘤細胞凋亡。此外,ADCC及CDC活性皆係自Ab的Fc部分設計出,以通過此等機制減輕神經損傷。由於拓撲異構酶 I 抑制劑本身(Verschraegen等人,2000;Rowinsky 2005)或作為ADC 的一部分(Ogitani等人,2016)與微管抑制劑(Stagg等人,2016)相比不會誘導周圍神經病變,因此通過有效載荷,達成相對較高GD2表現腫瘤的細胞殺死,同時保留具低GD2表現的周圍神經系統(PNS),從而減輕疼痛效應。
本發明的抗體亦可通過將抗體結合至將前藥(例如肽基化療劑,參見WO81/01145)轉化為活性細胞毒性藥物(參見,例如,WO 88/07378及美國專利第4,975,278號)的前藥活化酶而用於定向酶前藥療法諸如抗體定向酶前藥療法。有用於ADEPT之免疫結合物的酶組分可包括任何能夠作用於前藥以將其轉化為其更具活性之細胞毒性形式的酶。在此情況下有用的酶包括,但不限於,有用於將含磷酸鹽之前藥轉化為游離藥物的鹼性磷酸酶;有用於將含硫酸鹽之前藥轉化為游離藥物的芳基硫酸酯酶;有用於將無毒性氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫胺酶;蛋白酶,諸如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L),其等可用於將含肽前藥轉化為游離藥物;D-丙胺醯羧肽酶,其有用於轉化含有D-胺基酸取代基的前藥;有用於將糖基化前藥轉化為游離藥物的碳水化合物裂解酶諸如O-半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶;有用於將用P-內醯胺衍生化之藥物轉化為游離藥物的P-內醯胺酶;及青黴素醯胺酶,諸如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶,其有用於將分別利用苯氧乙醯基或苯乙醯基在其胺氮處衍生化之藥物轉化為游離藥物。酶可通過技藝中熟知的技術,諸如使用以上論述的連接子,共價結合至本發明的抗體。
技藝中熟知用於製備本發明之免疫結合物的合適方法(參見例如Hermanson G. T.,生物結合物技術(Bioconjugate Techniques),第三版,2013,Academic Press)。例如,熟知通過共價連接至抗體之鏈間二硫橋之半胱胺酸殘基的連接子將細胞毒性藥物結合至抗體的方法。
一般而言,本發明的免疫結合物可例如通過包括以下步驟的製程來獲得:
(i) 製備包含連接子及生長抑制劑(例如細胞毒性藥物)的化合物,本文亦稱為「藥物-連接子化合物」;
(ii) 使根據本發明之抗體之視情況經緩衝的水溶液與藥物-連接子化合物的溶液接觸;
(iii) 然後視情況將於(ii)中形成的結合物與未反應的抗體及/或藥物-連接子化合物分離。
抗體的水溶液可用諸如,比方說,組胺酸、磷酸鉀、乙酸鹽、檸檬酸鹽或N-2-羥乙基哌-N'-2-乙磺酸(Hepes緩衝液)的緩衝液來緩衝。緩衝液可根據抗體的性質來選擇。藥物-連接子化合物可例如溶解於有機極性溶劑諸如二甲亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMA)中。
為結合至抗體的半胱胺酸殘基,使抗體在步驟(ii)之前進行還原(例如使用TCEP)。技藝中知曉僅還原鏈間二硫鍵的合適還原條件。
用於結合的反應溫度通常在20至40℃之間。反應時間可變化且通常為1至24小時。抗體與藥物-連接子化合物之間的反應可通過粒徑篩析層析法(SEC)使用折射及/或UV偵測器來監測。如結合物產率過低,則可延長反應時間。
熟悉技藝人士可使用許多不同的層析方法來進行步驟(iii)的分離:結合物可例如通過SEC、吸附層析(諸如離子交換層析,IEC)、疏水性交互作用層析(HIC)、親和力層析、混合載體(mixed-support)層析諸如羥基磷灰石層析、或高效液相層析(HPLC)諸如反相HPLC來純化。亦可使用藉由透析或過濾或透析過濾來純化。
在步驟(ii)及/或(iii)之後,可使含結合物的溶液進行額外的純化步驟(iv),例如通過層析、超濾及/或透析過濾。在於結合之前進行還原的情況中,此一額外的純化步驟(例如通過層析、超濾及/或透析過濾)亦可在還原反應後使用含抗體的溶液來進行。
在此一製程結束時,在水溶液中回收結合物。藥物抗體比(DAR)係可隨抗體及所用藥物-連接子化合物的性質以及用於結合的實驗條件(諸如比值(藥物-連接子化合物)/(抗體)、反應時間、溶劑及若使用之共溶劑的性質)而變化的數目。 因此,抗體與藥物-連接子化合物之間的接觸可導致包含若干種彼此間之藥物抗體比不同之結合物的混合物。因此,所確定的DAR係平均值。
使用具有四個鏈間二硫橋之抗體(例如mAb1或任何IgG1抗體)在鏈間二硫橋的半胱胺酸殘基處進行結合 - 此係技藝中熟知的方法 - 提供以下優點:可通過選擇容許結合進行完成(或至少接近完成)的反應條件來達成約8之相對均勻的DAR。
可用於確定DAR的例示性方法係由以分光光度法測量經純化結合物之溶液在λ
D及280 nm處之吸光度之比所組成。280 nm係一般用於測量蛋白質濃度(諸如抗體濃度)的波長。選擇波長λ
D以容許區分藥物與抗體,即如熟悉技藝人士容易知曉,λ
D係藥物具有高吸光度之波長,且λ
D足夠遠離280 nm以避免藥物與抗體的吸收峰實質重疊。例如,針對依喜替康(或針對喜樹鹼或其他喜樹鹼類似物)可將λ
D選擇為370 nm,或針對美登素類分子選擇為252 nm。
DAR計算方法可例如得自Antony S. Dimitrov(編),LLC,2009,Therapeutic Antibodies and Protocols,第525卷,445,Springer Science:結合物在 λ
D(A
λD)及280 nm(A
280)處的吸光度係在粒徑篩析層析法(SEC)分析的單體峰上(容許計算「DAR(SEC)」參數)或使用典型分光光度計設備(容許計算「DAR(UV)」參數)來測量。吸光度可表示如下:
A
λD= (C
D× ε
DλD) + (C
A× ε
AλD)
A
280= (C
D× ε
D280) + (C
A× ε
A280)
其中:
C
D及C
A分別係藥物及抗體之溶液中的濃度
ε
DλD及ε
D280分別係藥物在λ
D及280 nm處的莫耳消光係數
ε
AλD及ε
A280分別係抗體在λ
D及280 nm處的莫耳消光係數。
求解具有兩個未知數的此兩方程式得到以下方程式:
C
D= [(ε
A280× A
λD) - (ε
AλD× A
280)] / [(ε
DλD× ε
A280) - (ε
AλD× ε
D280)]
C
A= [A
280- (C
D× ε
D280)] / ε
A280然後自藥物濃度與抗體濃度的比計算平均DAR:DAR = C
D/ C
A。
實施例中描述用於製備本發明之免疫結合物的例示性方法。
藥物-連接子化合物
本發明亦提供包含連接子及生長抑制劑(例如細胞毒性藥物)的化合物,本文亦稱為「藥物-連接子化合物」。例如,本發明提供下式(X)的化合物:
(X)
或其生理上可接受的鹽;此化合物在本文中亦稱為「藥物-連接子化合物1」、「化合物DL1」或「DL1」。
本發明亦提供下式(XI)的化合物:
(XI)
或其生理上可接受的鹽;此化合物在本文中亦稱為「藥物-連接子化合物2」、「化合物DL2」或「DL2」。
此等藥物-連接子化合物可用於製備如上文及下文所述的本發明之免疫結合物。
本發明的藥物-連接子化合物(例如上文描述之式(X)或(XI)的彼等)可通過化學合成來製備,例如如下文實施例中進一步描述。
醫藥組成物
本發明的抗體或免疫結合物可與醫藥學上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑,及視情況與緩釋基質(包括但不限於可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物、脂質或糖類)組合,以形成醫藥組成物。
因此,本發明的另一態樣係關於一種包含本發明之抗體或免疫結合物及藥學上可接受之載體、稀釋劑及/或賦形劑的醫藥組成物。
「醫藥」或「醫藥學上可接受的」係指在適當地投與哺乳動物,尤其人類時,不會產生不利、過敏性或其他不期望反應的分子實體及組成物。醫藥學上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑係指任何類型的無毒性固體、半固體或液體填料、稀釋劑、包封材料或調配助劑。
如本文所用,「醫藥學上可接受的載體」包括生理學上相容的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌及抗真菌劑等。合適的載體、稀釋劑及/或賦形劑的實例包括,但不限於,水、胺基酸、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽中的一或多者;胺基酸及衍生物諸如組胺酸、精胺酸、甘胺酸、脯胺酸、甘胺醯甘胺酸;無機鹽諸如NaCl或氯化鈣;糖或多元醇諸如葡萄糖、甘油、乙醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇;表面活性劑諸如聚山梨醇酯(polysorbate)80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆(poloxamer)188;及諸如此類,以及其等的組合。在許多情況下,在醫藥組成物中包括等滲劑,諸如糖、多元醇或氯化鈉將係有用的,並且調配物亦可含有抗氧化劑諸如色胺及/或穩定劑諸如吐溫(Tween)20。
醫藥組成物的形式、給藥途徑、劑量及方案自然取決於待治療的病況、疾病的嚴重程度、患者的年齡、體重及性別等而定。
本發明的醫藥組成物可經調配用於局部、經口、腸胃外、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下或眼內給藥等等。
在一具體例中,醫藥組成物含有對於注射用調配物而言在醫藥學上可接受的媒劑。此等可係等滲、無菌鹽水溶液(磷酸單鈉或二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或此等鹽的混合物),或乾燥、尤其冷凍乾燥的組成物,其在視情況而定添加滅菌水或生理食鹽水時,容許形成可注射溶液。
醫藥組成物可通過藥物組合裝置來給藥。
用於給藥的劑量可隨各種參數而變來調適,及例如隨所用給藥方式、相關病理學或者期望的治療持續時間而變來調適。
為製備醫藥組成物,可將有效量的本發明抗體或免疫結合物溶解或分散於醫藥學上可接受的載體或水性介質中。
適合注射使用的醫藥形式包括無菌水性溶液或分散液;包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的調配物;及用於即時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末;在所有此等情況下,該形式必須係無菌的並且可使用適當的遞送裝置或系統注射而不降解,且其必須在製造及儲存條件下穩定並且必須保持防止微生物(諸如細菌及真菌)的污染作用。
可在與表面活性劑適當混合的水中製備作為游離鹼或藥理學上可接受鹽之活性化合物的溶液。亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物及於油中製備分散液。在一般儲存及使用條件下,此等製劑可含有防腐劑以防止微生物生長。
本發明的抗體或免疫結合物可經調配成呈中性或鹽形式的醫藥組成物。醫藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離胺基共同形成),其係利用無機酸諸如,比方說,鹽酸或磷酸,或諸如乙酸、草酸、酒石酸或苯乙醇酸等等的有機酸形成。與游離羧基共同形成的鹽亦可衍生自無機鹼諸如,比方說,鈉、鉀、銨、鈣或鐵之氫氧化物,及諸如異丙胺、三甲胺、甘胺酸、組胺酸、普魯卡因(procaine)等等之有機鹼。
載體亦可係含有例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇及液體聚乙二醇等等)、其合適的混合物、及植物油的溶劑或分散介質。可例如,通過使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液的情況中通過維持所需粒度及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。可通過各種抗菌及抗真菌劑(例如,對羥基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等等)來產生預防微生物的作用。在一些情況中,可能需要包括等滲劑,例如,糖或氯化鈉。可通過在組成物中使用延遲吸收的試劑(例如,單硬脂酸鋁及明膠)來達成可注射組成物的延長吸收。
無菌可注射溶液可通過將所需量的活性化合物併入至視需要含有任何以上列舉之其他成分的適當溶劑中,然後過濾滅菌來製備。一般而言,分散液可通過將各種經滅菌活性成分併入至包含基礎分散介質及所需之來自彼等以上列舉者之其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況中,製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥技術,其產生活性成分以及來自其先前經無菌過濾溶液之任何額外期望成分的粉末。
亦考慮製備用於直接注射之更濃縮或高度濃縮的溶液,其中設想使用DMSO作為溶劑以導致極快速的滲透,從而將高濃度的活性劑遞送至小腫瘤區域。
經調配之溶液即可以與劑量調配物相容的方式並且以治療有效的量投與。調配物可容易地以各種劑型投與,諸如上述可注射溶液的類型,但亦可使用藥物釋放膠囊及其類似物。
對於水溶液中的腸胃外給藥,例如,若需要可將該溶液適當地緩衝,並且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。此等水溶液特別適用於靜脈內、肌肉內、皮下及腹膜內給藥。在此方面,可使用的無菌水性介質將係熟悉技藝人士鑒於本揭示所知曉的。例如,可將一個劑量溶解在1 ml等滲NaCl溶液中,並添加至1000 ml的皮下注射液中或在建議的輸注部位注射(參見例如,「雷明頓醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)」第15版,第1035-1038頁及第1570-1580頁)。取決於所治療受試者的狀況,必然會發生劑量的一些變化。在任何情況下,負責給藥的人將確定個別受試者的適當劑量。
本發明的抗體或免疫結合物可調配在治療混合物內,以包含例如每劑量約0.01至100毫克左右。
除了針對腸胃外給藥(諸如靜脈內或肌肉內注射)調配的抗體或免疫結合物外,其他醫藥上可接受的形式包括例如錠劑或其他用於經口給藥的固體、緩釋膠囊及目前使用的任何其他形式。
在一些具體例中,考慮使用脂質體及/或奈米顆粒來將多肽引入至宿主細胞中。脂質體及/或奈米顆粒的形成及使用係熟悉技藝人士已知的。
奈米膠囊一般可以穩定及可再現的方式捕獲化合物。為避免由於細胞內聚合物過載所引起的副作用,此種超細顆粒(尺寸約為0.1μm)一般使用能夠在體內降解的聚合物進行設計。考慮將滿足此等要求的可生物降解的聚烷基氰基丙烯酸酯奈米顆粒、或可生物降解的聚乳酸或聚乳酸共乙交酯奈米顆粒用於本發明,並且此種顆粒可由熟悉技藝人士容易地製造。
脂質體可由分散在水性介質中並自發形成多層同心雙層囊泡(亦稱為多層囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV的直徑一般為25 nm至4μm。MLV的超音波處理導致形成直徑在200至500 A範圍內,核心中含有水溶液的小單層囊泡(SUV)。脂質體的物理特性取決於pH、離子強度及二價陽離子的存在。
除上述實例外,亦考慮其他醫藥形式諸如奈米顆粒、微粒及膠囊、植入物(例如脂質植入物)、或自凝固或自乳化系統。
治療方法及用途
本發明人發現本發明的抗體(例如mAb1)在結合後能夠內化為GD2抗體複合物的一部分。此外,與各別的對照ADC或靶陰性細胞相比,與細胞毒性藥物(在一較佳具體例中為依喜替康)結合之此一抗體的標靶介導攝取經顯示轉變為在GD2-表現腫瘤細胞中體外細胞毒性效力的增加。本發明人亦證實,本發明的此等免疫結合物當藉由單次注射或多次注射以0.25 mg/kg至10 mg/kg之劑量範圍使用時,在體內誘導顯著的抗腫瘤活性。事實上,本發明的免疫結合物在衍生自不同腫瘤類型的大量體外及體內模型中顯示廣泛的活性。此外,本發明的免疫結合物在非人靈長類動物劑量範圍探索研究中具有良好的耐受性。此等臨床前數據為以後的臨床試驗指示良好的治療範圍。因此,本發明的抗體、免疫結合物及醫藥組成物有用於治療表現GD2的癌症。
因此,本發明提供用作藥物的本發明抗體、免疫結合物或醫藥組成物。例如,本發明提供用於治療癌症的本發明抗體、免疫結合物或醫藥組成物。本發明進一步提供一種治療癌症的方法,其包括將本發明的抗體、免疫結合物或醫藥組成物投與有需要的受試者。
利用本發明之抗體、免疫結合物或醫藥組成物治療的癌症較佳係表現GD2的癌症,更佳係與相同組織來源之正常(即非腫瘤)細胞相比,過度表現GD2的癌症。細胞對GD2的表現可容易地進行分析,例如藉由使用根據本發明的抗體(或市售的抗GD2抗體),例如如下一節「診斷用途」中所述,及例如藉由免疫組織化學方法。
取決於腫瘤類型而定,GD2通過增強細胞增殖、運動、遷移、黏附及侵襲而與腫瘤發展及惡性表型有關。此為在癌症療法中針對任何過度表現GD2的腫瘤類型靶向雙唾液酸神經節苷脂GD2提供理論基礎。 雖然本發明不欲受限於任何特定的作用機制,但已知抗GD2單株抗體靶向GD2-表現腫瘤細胞,藉由抗體依賴性細胞介導細胞毒性導致吞噬作用及破壞,藉由補體依賴性細胞毒性導致溶解,以及通過直接誘導細胞死亡而導致凋亡及壞死。此外,抗GD2單株抗體亦可阻止循環惡性細胞歸巢(homing)及黏附至細胞外基質。
在一些具體例中,待利用本發明之抗體、免疫結合物或醫藥組成物治療的癌症係神經母細胞瘤、黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcomas)、小細胞肺癌、乳癌、神經膠瘤、骨肉瘤及軟組織肉瘤。在選定的具體例中,待利用本發明之抗體、免疫結合物或醫藥組成物治療的癌症係神經母細胞瘤及骨肉瘤。
本發明的抗體或免疫結合物可單獨地或與任何合適的生長抑制劑組合使用於癌症療法。
本發明的抗體可結合(連接)至如前所述的生長抑制劑。因此,本發明的抗體可有用於將該生長抑制劑靶向至在其表面上表現或過度表現GD2的癌細胞。
亦熟知治療性單株抗體可導致消耗帶有經抗體特異性識別之抗原的細胞。此消耗可通過至少三種機制來介導:抗體介導的細胞毒性(ADCC),補體依賴性溶解,及通過由抗體靶向之抗原所介導之信號定向抑制腫瘤生長。
「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式,其中與存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)結合的抗體使此等細胞毒性效應細胞能夠特異性地結合至帶有抗原的靶細胞並隨後殺死靶細胞。為評估相關分子的ADCC活性,可進行體外ADCC分析,諸如美國專利第5,500,362或5,821,337號中描述的彼等。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體存在下的溶解。典型補體途徑的活化係通過補體系統之第一組分與結合至其同源抗原之抗體的結合來起始。為評估補體活化,可進行CDC分析,例如,如Gazzano-Santoro等人(Journal of Immunological Methods. 1997年3月;202(2):163-171)中所描述。
在一些具體例中,本發明的抗體可係具有導致減少或消除與大多數Fcγ受體之結合之經修飾胺基酸序列的抗體,其可降低於表現此等受體之正常細胞及組織(例如巨噬細胞、肝竇細胞等)中的攝取及毒性。
本發明的一態樣係關於一種治療癌症的方法,其包括向有需要的受試者投與治療有效量的本發明之抗體、免疫結合物或醫藥組成物。
在本發明的內文中,本文中所使用的術語「治療(treating 或treatment)」意指逆轉、緩解、抑制該術語所應用之病症或病況或該病症或病況之一或多個症狀的進展,或預防該病症或病況。本文所用的術語「治療癌症」意指抑制腫瘤惡性細胞的生長及/或來自該腫瘤之轉移的進展。此種治療亦可導致腫瘤生長消退,即可測量腫瘤大小的減小。例如,此種治療可導致腫瘤或轉移完全消退。
在本發明之治療應用的內文中,術語「受試者」或「患者」或「有需要的受試者」或「有需要的患者」係指受腫瘤影響或可能受腫瘤影響的受試者(例如人類或非人類哺乳動物)。例如,該患者可係例如根據如下文所述之方法已經確定對靶向GD2之治療劑易感,特定而言對根據本發明之抗體或免疫結合物易感的患者。
「治療有效量」意指足以在適用於任何醫學治療之合理效益/風險比下治療該癌症疾病的量。然而,當理解,本發明之抗體、免疫結合物及醫藥組成物(統稱為「治療劑」)的每日總使用量將由主治醫師在審慎醫學判斷範圍內決定。任何特定患者的特定治療有效劑量值將取決於多種因素,包括接受治療的病症及病症的嚴重程度;所採用之特定治療劑的活性;患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食;給藥時間、給藥途徑及所採用之特定治療劑的排泄率;治療的持續時間;與所使用之特定治療劑組合或併用的藥物;及醫學技藝中熟知的類似因素。舉例來說,技藝中熟知以低於達到期望治療效果所需的值開始化合物的劑量,並逐漸增加劑量直至達到期望效果。
本發明的抗體、免疫結合物或醫藥組成物亦可用於抑制癌症轉移的進展。
本發明的抗體、免疫結合物或醫藥組成物亦可與任何其他用於治療癌症(例如輔助療法)及/或用於降低轉移性癌症生長的治療干預組合使用。例如,用於此種組合的其他治療干預可係用於待治療癌症的標準護理(SOC)治療劑。
利用根據本發明之抗體或免疫結合物或醫藥組成物治療的功效可容易地在體內測定,例如在小鼠癌症模型中,及經由測量例如治療組與對照組間之腫瘤體積的變化、腫瘤消退百分比、部分消退或完全消退。
診斷用途
GD2已經報告為在諸如下列之癌細胞的表面上高度表現:神經母細胞瘤、黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、尤文氏肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、神經膠瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤或其他表現GD2的實性瘤。
因此,GD2可被視為癌症標誌物,並且具有用來指示抗癌療法之有效性或用來偵測疾病復發的潛力。
在一具體例中,本發明的抗體可用作靶向GD2表現腫瘤之療法之文中之分析的組分,以便確定患者對治療劑的易感性,監測抗癌療法的有效性或偵測治療後疾病的復發。在一些具體例中,本發明的相同抗體可同時使用作為治療劑的組分及診斷分析的組分。
因此,本發明的再一態樣係關於根據本發明之抗體用於離體偵測來自受試者之生物樣本中之GD2表現的用途。本發明的另一態樣係關於本發明之抗體用於偵測受試者體內之GD2表現的用途。當用於偵測GD2時,抗體可用可偵測的分子(諸如,比方說,螢光團或酶)來標記。
GD2的偵測可用於:
通過偵測腫瘤細胞上之表面GD2的表現來
a) 診斷受試者中癌症的存在,或
b) 確定罹癌患者對靶向GD2之治療劑(特定而言根據本發明之抗體或免疫結合物)的易感性,或
c) 監測抗GD2癌症療法的有效性或偵測抗GD2癌症療法後的癌症復發,特定而言,其中該療法係利用根據本發明之抗體或免疫結合物的療法。
在一些具體例中,本發明的抗體意欲用於體外或離體診斷用途。舉例來說,GD2可使用本發明的抗體在獲自受試者的生物樣本中體外或離體偵測。根據本發明的用途亦可係體內用途。舉例來說,可將根據本發明的抗體投與受試者,並且可偵測及/或定量抗體-細胞複合物,藉此該等複合物的偵測指示癌症。
本發明進一步關於一種偵測受試者中癌症之存在的體外或離體方法,其包括以下步驟:
(a) 使來自受試者的生物樣本與根據本發明的抗體,特定而言在適合抗體與該生物樣本形成複合物的條件下接觸;
(b) 測量與該生物樣本結合的抗體量值;及
(c) 通過將經結合抗體的測得量值與對照進行比較來偵測癌症的存在,與對照相比增加的結合抗體量值指示癌症。
本發明亦係關於一種確定罹癌患者對靶向GD2之治療劑,特定而言根據本發明之抗體或免疫結合物之易感性的體外或離體方法,該方法包括以下步驟:
(a) 使來自罹癌患者的生物樣本與根據本發明的抗體,特定而言在適合抗體與該生物樣本形成複合物的條件下接觸;
(b) 測量與該生物樣本結合的抗體量值;及
(c) 將測得的與該生物樣本結合的抗體量值與結合至對照的抗體量值進行比較;
其中與對照相比,與該生物樣本結合之抗體的增加量值指示患者對靶向GD2的治療劑易感。
在上述方法中,該對照可係相同類型的正常、非癌性生物樣本,或經確定為代表相同類型之正常生物樣本中之抗體結合量值的參考值。
在一具體例中,本發明的抗體有用於診斷表現GD2的癌症,諸如大腸直腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、食道癌、前列腺癌或其他表現GD2的實性瘤。
本發明進一步係關於一種體外或離體監測抗GD2癌症療法之有效性的方法,其包括以下步驟:
(a) 使來自經歷抗GD2癌症療法之受試者的生物樣本與根據本發明的抗體,特定而言在適合抗體與該生物樣本形成複合物的條件下接觸;
(b) 測量與該生物樣本結合的抗體量值;及
(c) 將經結合抗體的測得量值與結合至對照的抗體量值進行比較;
其中與對照相比,與該生物樣本結合之抗體的減小量值指示該抗GD2癌症療法的有效性。在該方法中,與對照相比,與該生物樣本結合之抗體的增加量值將係指示該抗GD2癌症療法的無效性。在此監測有效性之方法的一具體例中,該對照係與提交分析之生物樣本相同類型的生物樣本,但其係在抗GD2癌症療法過程期間的較早時間點自受試者獲得。
本發明進一步係關於一種體外或離體偵測抗GD2癌症療法後之癌症復發的方法,其包括以下步驟:
(a) 使來自受試者(該受試者已完成抗GD2癌症療法)的生物樣本與根據本發明的抗體,特定而言在適合抗體與該生物樣本形成複合物的條件下接觸;
(b) 測量與該生物樣本結合的抗體量值;及
(c) 將經結合抗體的測得量值與結合至對照的抗體量值進行比較,
其中與對照相比,與該生物樣本結合之抗體的增加量值指示於抗GD2癌症療法後之癌症復發。該對照特定而言可係與提交分析之生物樣本相同類型的生物樣本,但其係在先前,即在抗GD2癌症療法完成之時或之後,從受試者獲得。
該抗GD2癌症療法係使用根據本發明之抗體或免疫結合物的療法。該抗GD2癌症療法靶向表現GD2的癌症,諸如神經母細胞瘤、黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、尤文氏肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、神經膠瘤、骨肉瘤及軟組織肉瘤或其他表現GD2的實性瘤。
在一些具體例中,本發明的抗體可用可偵測的分子或物質(諸如螢光分子或螢光團、放射性分子、酶或技藝中已知之(直接或間接)提供信號的任何其他標記)進行標記。
如本文所用,關於根據本發明之抗體的術語「經標記」意欲涵蓋經由將可偵測物質(諸如放射性試劑或螢光團(例如螢光素異硫氰酸酯(FITC)或藻紅素(PE)或靛青(Cy5)))偶合(即物理連接)至多肽來直接標記抗體,以及通過與可偵測物質的反應性來間接標記多肽。
本發明的抗體可通過技藝中已知的任何方法用放射性分子標記。舉例來說,放射性分子包括,但不限於,用於閃爍掃描研究的放射性原子諸如I
123、I
124、In
111、Re
186、Re
188、Tc
99。本發明的抗體亦可用用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像,MRI)的自旋標記物標記,諸如碘-123、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
「生物樣本」涵蓋從受試者獲得之可用於診斷或監測分析的各種樣本類型。生物樣本包括,但不限於,血液及其他生物來源的液體樣本、固體組織樣本諸如生檢試樣或組織培養物或來源於其等的細胞、及其後代。因此,生物樣本涵蓋臨床樣本、培養細胞、細胞上清液、細胞溶解物、血清、血漿、生物流體及組織樣本諸如腫瘤樣本。
在一些具體例中,生物樣本可係福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)或冷凍組織樣本。
本發明亦關於一種體內偵測受試者癌症之存在的方法,其包括以下步驟:
a) 向患者投與根據本發明之抗體,其中該抗體經可偵測分子標記;
b) 通過成像,例如通過偵測可偵測的分子,偵測該抗體於患者中的定位。
在該方法中,癌症可係表現GD2的癌症,諸如神經母細胞瘤、黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、尤文氏肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、神經膠瘤、骨肉瘤及軟組織肉瘤或其他表現GD2的實性瘤。
本發明的抗體亦可用於癌症的分期(例如,在放射性成像(radio imaging)中)。其等可單獨使用或與其他癌症標誌物組合使用。
本文中使用的術語「偵測」或「經偵測」包括參照或不參照對照的定性及/或定量偵測(即測量量值)。
在本發明的內文中,如本文中使用的術語「診斷」意指基於大量收集資料來確定醫療狀況的性質,其意欲識別影響受試者的病理。
套組
最後, 本發明亦提供包含至少一種本發明之抗體或免疫結合物的套組。包含本發明之抗體的套組可用於偵測表面蛋白GD2,或用於治療或診斷分析。本發明的套組可包含偶合至固體載體(例如,組織培養盤或珠粒(例如瓊脂糖珠粒))的抗體。可提供包含用於體外(例如於ELISA或西方墨點法(Western blot)中)偵測及定量表面蛋白GD2之抗體的套組。此種有用於偵測的抗體可具有諸如螢光或放射性標記的標記物。
序列的簡要說明
胺基酸序列:
hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK抗體的一級結構:
重鏈序列(SEQ ID NO:4):
輕鏈序列(SEQ ID NO:1):
抗GD2 ADC的較佳具體例
在一較佳具體例中,本發明描述一種根據以下概述完全最佳化的新型ADC藥物:
選擇具有合適親和力、良好細胞結合能力及有效內化的抗體,從而確保於抗體結合至癌細胞後的足夠有效載荷處置。所選擇的抗體hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK係基於達妥昔單抗的已知CDR序列(ch14.18),但通過人源化進一步最佳化,以降低患者的免疫原性風險。
抗體部分含有消除補體活化的HC K322A突變。如由人源化抗GD2單株抗體(hu14.18K322A)與其他藥物(包括化療)組合的前導試驗所證實,此突變降低疼痛副作用。
抗體部分經序列修飾(IgG1.4格式),其幾乎消除與大多數Fcγ受體的結合。非人類靈長類動物的臨床前耐受性研究(詳見下文)證實,此修飾與K322A 突變一起主要負責疼痛效應及神經組織損傷的幾乎完全降低。因此,作為前瞻性的治療,ADC中的此種IgG1.4修飾可減少其他表現Fcγ受體之正常細胞及組織(例如巨噬細胞及肝竇細胞)的攝取及相關毒性。
在一較佳具體例中,抗體部分與高效的拓撲異構酶-I 抑制劑依喜替康結合,以與裸抗GD2抗體療法相比,改善抗腫瘤活性。相對於其他ADC有效載荷諸如微管蛋白毒素(例如奧瑞他汀及美登素),此較佳ADC具有較低相關神經毒性的風險。在ADC標靶存在於周圍神經表面上的情況中,此尤其有利。
(5) 連接藥物及抗體的連接子係經設計成最大化腸胃外使用後的全身穩定性。此外,基於葡萄糖醛酸苷鍵連系統的有效載荷-連接子部分確保良好的可結合、有利的PK特性及於靶陰性細胞及組織中的少量非特異性攝取。
(6) 用於本發明之ADC的依喜替康有效載荷顯示與DNA損傷及反應抑制劑(例如ATR/ATM抑制劑及免疫檢查點抑制劑)的組合效應,其可能會在後來的臨床研究中為患者帶來額外的益處。
[實施例]
實施例1A:用基於葡萄糖醛酸苷之連接子合成藥物-連接子化合物:藥物-連接子化合物1 (DL1)
化合物9 (本文亦稱為藥物-連接子化合物1 (DL1))的合成途徑。
化學製備方案
步驟6:化合物6
將化合物5 (1.369 g;1.00當量)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(15.00 ml)中,添加依喜替康甲磺酸鹽(679.7 mg;1.00當量)、用於合成的4-甲基嗎啉(0.422 ml;3.00當量)及1-羥基苯并三唑(172.8 mg;1.00當量)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。於攪拌時間後,反應懸浮液變為棕色溶液。通過LC-MS監測反應,其顯示起始材料完全轉化。通過RP急速層析純化反應混合物。將含有產物的溶離份合併,於真空中濃縮並凍乾過夜,得到化合物6的黃色固體。
產量:1.59 g
產率百分比:87.5%
分析數據:
LCMS:管柱:Chromolith HR RP-18e (50-4.6 mm);流動相A:0.05% HCOOH的H
2O溶液;B:0.04% HCOOH及1% H
2O的ACN溶液;T:40 ℃;流量:3.3 ml/min;MS:100-2000,amu 陽性;1% ->100% B:0 - > 2.0min;100% B:2.0 ->2.5 min
RT (min):1.95;M+H:1196.40,純度:84.4%。
步驟7:化合物7
將化合物6 (1.586 g;1.00當量)溶解於四氫呋喃(50.00 ml)中及在0℃下逐滴添加LiOH(包含氫氧化鋰水合物(281.77 mg;6.00當量)於水(67.100 ml)中的溶液(0.1M)。在添加過程中檢查pH值。pH不應超過10。於1.5小時後完成LiOH溶液的添加。通過LC-MS監測反應,其顯示起始材料完全轉化。將反應用檸檬酸溶液淬滅,將pH調整至5。將反應混合物於減壓下濃縮。將粗產物通過製備型HPLC純化。將含有產物的溶離份合併並凍乾,得到化合物7的深黃色固體。
產量:728 mg
產率百分比:54.8%
分析數據:
LCMS:管柱:Chromolith HR RP-18e (50-4.6 mm);流動相A:0.05% HCOOH的H
2O溶液;B:0.04% HCOOH及1% H
2O的ACN溶液;T:40 ℃;流量:3.3 ml/min; MS: 100-2000, amu 陽性;1% ->100% B:0 ->2.0min;100% B:2.0 ->2.5 min
RT (min):1.68;M+H:1056.30,純度:98.5%。
步驟8:化合物8
將化合物7 (728,000 mg;1.00當量)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(20.00 ml)中。添加哌啶(136.513μl;2.00當量),並將溶液在室溫下攪拌總共4小時。通過LC-MS監測反應,其顯示起始材料完全轉化。將反應混合物於減壓下濃縮,及將粗產物用RP急速層析純化。將含有產物的溶離份合併,將溶劑部分移除並將其凍乾過夜,得到化合物8的黃色固體。
產量:706 mg
產率百分比:100%
分析數據:
LCMS:管柱:Chromolith HR RP-18e (50-4.6 mm);流動相A:0.05% HCOOH的H
2O溶液;B:0.04% HCOOH及1% H
2O的ACN溶液;T:40 ℃;流量:3.3 ml/min;MS:100-2000,amu陽性;1% ->100% B:0 ->2.0min;100% B:2.0 ->2.5 min
RT (min):1.22;M+H:834.30,純度: 97.6%。
步驟9:化合物9
向化合物8 (854 mg;1.00當量)於二甲基甲醯胺(30.00 ml)中的溶液中加入N-乙基二異丙胺(149,234μl;1.00當量)及3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫吡咯-1-基)-丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(233.61 mg;1.00當量)。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。通過LC-MS監測反應,其顯示起始材料的完全轉化。將反應混合物於減壓下濃縮,並使粗產物進行RP急速層析。將含有產物的溶離份合併、濃縮及凍乾,得到純度91%的期望產物。此材料再次通過RP層析純化,得到化合物9的黃色固體。
產量:580 mg
產率百分比:60.1%
分析數據:
LCMS:管柱:Chromolith HR RP-18e (50-4.6 mm);流動相A:0.05% HCOOH的H
2O溶液;B:0.04% HCOOH及1% H
2O的ACN溶液;T:40 ℃;流量:3.3 ml/min;MS:100-2000,amu陽性;1% ->100% B:0 ->2.0min;100% B:2.0 ->2.5 min RT (min):1.38; M+H:985.30,純度:90%(另外10%的異構體可通過HPLC移除)
1H NMR (500 MHz, DMSO-
d
6 ) δ 13.10 –12.44 (m, 1H), 9.08 (s, 1H), 8.32 (t,
J= 5.8 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.02 (d,
J= 8.8 Hz, 1H), 7.76 (d,
J= 10.9 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.15 – 7.09 (m, 2H), 6.98 (s, 2H), 5.48–5.38 (m, 2H), 5.32 –5.22 (m, 3H), 5.11–5.01 (m, 2H), 4.87 (d,
J= 7.6 Hz, 1H), 3.92–3.88 (m, 1H), 3.89–3.84 (m, 2H), 3.65–3.61 (m, 2H), 3.46–3.41 (m, 1H), 3.42–3.37 (m, 1H), 3.38–3.31 (m, 1H), 3.28–3.20 (m, 1H), 3.15–3.07 (m, 1H), 2.48–2.44 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.24–2.13 (m, 2H), 1.94–1.80 (m, 2H), 0.88 (t,
J= 7.3 Hz, 3H)。
實施例1B:具有天冬胺酸内肽酶可裂解連接子之藥物-連接子化合物的合成:藥物-連接子化合物2 (DL2)
步驟1
將{4-[(2S)-3-胺甲醯基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)丙醯胺基]丙醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲基 4-硝基苯基碳酸酯(400 mg;0.52 mmol;1.00當量)[可從Levena Biopharma US購得]溶解於N,N-二甲基甲醯胺(5.00 ml)中。添加(10S,23S)-23-胺基-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0²,¹4.04,¹³.06,¹¹.0²°,²4]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-5,9-二酮;甲磺酸(277.30 mg;0.52 mmol;1.00當量)、N-乙基二異丙胺(0.27 ml;1.57 mmol;3.00 當量)及1-羥基苯并三唑(HOBT)(3.52 mg;0.03 mmol;0.05當量)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。LC/MS指示完全轉換。
使粗反應混合物通過製備型HPLC純化並凍乾,得到365mg (0.343 mmol)的{4-[(2S)-3-胺甲醯基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)丙醯胺基]丙醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲基 N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0²,¹4.04,¹³.06,¹¹.0²°,²4]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸酯。
LC/MS:[M+H] = 1064.2
製備型HPLC:
管柱:sunfire prep c18 obd - 75.0 g (250 bar)
溶劑A:Wasser 0.1% TFA 溶劑 C:
溶劑B:乙腈0.1% TFA
步驟2
將{4-[(2S)-3-胺甲醯基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)丙醯胺基]丙醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲基 N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0²,¹4.04,¹³.06,¹¹.0²°,²4]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸酯(365mg;0.34 mmol;1.00當量)溶解於N,N-(4.00 ml)中。加入用於合成的哌啶(0.07 ml;0.69 mmol;2.00當量),並將反應溶液在室溫下攪拌1小時。
通過製備型HPLC純化反應混合物,得到300 mg (0.314 mmol)的三氟乙酸;{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基丙醯胺基]丙醯胺基]-3-胺甲醯基丙醯胺基]苯基}甲基 N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0²,¹4.04,¹³.06,¹¹.0²°,²4]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸酯。
LC/MS:[M+H]:841.3
用於純化的製備型HPLC:
RediSep Säule:C18 130g
SN:E0410A0D24BE1 Lot:262118923W
流速:75 ml/min
條件 - 體積:390.0 ml
溶離劑:A1水 0.1%TFA
溶離劑:B1乙腈 0.1%TFA
步驟3
向三氟乙酸;{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基丙醯胺基]丙醯胺基]-3-胺甲醯基丙醯胺基]苯基}甲基 N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0²,¹4.04,¹³.06,¹¹.0²°,²4]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸酯(571mg;0.60 mmol;1.00當量)於N,N-二甲基甲醯胺(20ml)中之溶液中添加N-乙基二異丙胺(203μl;1.20 mmol;2.00當量)及N-琥珀醯亞胺基 3-馬來醯亞胺基丙酸酯(162 mg;0.60 mmol;1.00當量)。然後將反應混合物攪拌10min並通過LC/MS監測。
通過製備型HPLC純化反應混合物,產生378mg (0.35 mmol)之DL2。
LC/MS:[M+H]:992.4
用於純化的製備型HPLC:
RediSep管柱:C18 86g
SN:E0410A8B46130 Lot:281729189W
流速:60 ml/min
條件 - 體積:264.0 ml
溶離劑1:A1 水 0.1%TFA
溶離劑2:B1乙腈0.1%TFA
序列分析:
方法資訊:A:H2O + 0.05% HCOOH | B:MeCN + 0.04% HCOOH + 1% H2O
T:40 ℃ | 流量:3.3 ml/min | MS:100-2000 amu 陽性
管柱:Chromolith HR RP-18e 50-4.6 mm
0% -> 100% B:0 -> 2.0 min | 100% B:2.0 -> 2.5 min
實施例2:免疫結合物的製備:mAb1的葡萄糖醛酸苷基結合物 (稱為ADC1)
抗體製備及結合
在結合前將單株抗體(mAb)在2-8℃下解凍至3天,並在2-8℃下儲存至使用。在結合當天在使用前使mAb在室溫下平衡。藉由添加4% v/v之0.5 M Tris、0.025 EDTA、pH 8.5將含於25 mM乙酸鈉pH 5.5中之mAb溶液(25.3 mg/mL)調節pH。隨後,還原鏈間二硫化物,將經調節pH之mAb溶液用5莫耳當量(相對於mAb)之TCEP在20℃下培養2小時。然後,將溶液用10莫耳當量(相對於mAb)的藥物-連接子(DL)在20℃下培養1小時,以使DL與抗體結合。經由在20℃下添加10莫耳當量(相對於mAb)的20 mM N-乙醯基半胱胺酸(NAC)持續20 min來停止反應。再次通過添加5% v/v之0.15 M乙酸來調節pH並使用0.22μm PES過濾單元進行真空過濾。反應混合物通過TFF使用具有Ultracel® Membrane, C Screen, 0.1 m²的Pellicon®膠囊來進行透析過濾。使用pH 5.5的10 mM組胺酸、40 mM NaCl作為透析過濾緩衝液,並且需要流速為5L/min/m² 的15個透析過濾體積(DV)。於TFF後,再次使用0.22μm PES過濾單元來過濾樣本並將其稀釋至15 mg/ml的濃度。ADC的最終調配物為10mM組胺酸、40mM NaCl、6%海藻糖、pH 5.5於10 mg/ml。
品質屬性:
原料藥表徵
粒徑篩析層析(SEC)方法
通過粒徑篩析層析法來評估單體含量及純度,其係於具有安全防護管柱的TOSOH TSKgel G3000SWXL 7.8 mm × 30 cm, 5μm上以0.5 ml/min運行,在10% IPA、0.2M磷酸鉀、0.25M氯化鉀、pH 6.95中等度運行30 min。注射體積範圍為1–10μl(至20μg蛋白質)。
SEC方法參數
波長 280 nm
管柱 TOSOH TSKgel G3000SWXL 7.8 mm × 30 cm,5μm
流動相 10% IPA,0.2M 磷酸鉀,0.25M氯化鉀,pH 6.95
注射體積 1-20μL (5-20μg 蛋白質)
管柱溫度 25℃
梯度 等度溶離
流速 0.5 mL/min
運行時間 30 min
顯示原液mAb及最終BDS之純度的典型SEC層析圖:
針對以上顯示的BDS材料,已報告4.6% HMWS及95.4%的單體純度。
反相HPLC (RP HPLC)方法
反相係在Polymer Labs PLRP-S 2.1 mm × 50 mm, 5μm, 1000 Å管柱上進行,利用介於0.1% TFA 25% CH3CN(流動相B)及0.1% TFA 50% CH3CN (A)之間的25分鐘線性梯度於1.0mL/min/80℃下運行。藉由非還原PLRP條件分析還原抗體及完全結合的ADC兩者。用於樣本製備的方法示於下表:
顯示輕鏈及重鏈之分離的典型RP-HPLC層析圖。以下的層析圖顯示mAb及最終BDS的疊加圖:
針對以上的BDS材料,報告7.8的DAR。
疏水性相互作用層析
使用具有梯度溶離及在214 nm下之吸光度偵測的疏水性相互作用層析(HIC)來評估ADC的平均DAR。藉由降低於由1.5 M硫酸銨/20 mM磷酸鈉/pH 6.95組成之流動相中的鹽濃度來依增加DAR的順序描述ADC分子。使用Tosoh TSKgel Butyl-NPR管柱, 4.6 × 35 mm, 2.5 μm作為管柱。抗體/結合物樣本(5-20μg蛋白質)的注射體積範圍為1–10μl。
顯示mAb及ADC之分離的典型HIC層析圖。以下的層析圖顯示輸入mAb及最終BDS的疊加圖:
游離藥物方法
於Phenomenex Kinetex Core Shell 2.6μm C8管柱,100 Å,50 × 4.6 mm管柱上進行反相HPLC,以2 mL/min、60℃與介於95% A (0.05% TFA/H2O)至95% B (0.05% TFA/CH3CN)之間的8 min線性梯度運行。運行毒素連接子標準品作為NAC經淬滅。收集在214nm處及在252、360及280 nm處之光譜分析的數據,以監測樣本中的連接子發色團及任何蛋白質殘基。在HPLC分析之前,通過冷甲醇/鹽萃取對樣本進行脫蛋白:將2μl 5 M NaCl添加至50μl樣本中,然後加入150μl冰冷甲醇。將樣本在-20℃下渦旋並培養30分鐘。沉澱的蛋白質通過於15000 × g,4℃下離心30分鐘形成顆粒。將125μl上清液用125μl Elga 18.2 MΩ水稀釋並混合。注射100μl樣本,並在360 nm下報告所有數據。相對於毒素的標準曲線計算殘留毒素相關物種的含量。觀察到的毒素量報告為相對於樣本之總毒素含量的%莫耳/莫耳值。
粗結合物反應(藍色)、DV0(紅色)、DV6(綠色)、DV10(粉紅色)及BDS PPB-13430 (橄欖綠)的RP-HPLC層析圖疊加(360nm)。
內毒素
內毒素係使用Endosafe PTS內毒素系統(Charles River)經由動力學顯色LAL分析來測定。將緩衝液及抗體在LAL試劑水中稀釋10倍。將ADC在LAL試劑水中稀釋10倍。所有樣本均在0.01–1 EU/mL匣筒上進行分析。經由將EU/mL值除以ADC [P] mg/mL而將其轉換為EU/mg。
GD2-ADC:體外及體內實驗結果
實驗1. 抗GD2 ADC在神經母細胞瘤(CHP134)異種移植模型中的劑量反應功效研究
在CHP134 - 一種表現高量值GD2的人類神經母細胞瘤異種移植腫瘤模型中評價抗GD2 ADC分子1的劑量-反應關係。
將具有已建立CHP134腫瘤(~150 mm3)的雌性無胸腺裸小鼠(nu/nu)以每周時程(qw)自0.25 mg/kg至1.0 mg/kg範圍的劑量靜脈內(IV)注射分子1持續4週來進行治療。
在此研究中,治療的耐受性良好,沒有毒性,且觀察到正常的體重增加(圖1)。治療對CHP134腫瘤生長的影響及在媒劑對照治療腫瘤達到研究終點(> 1,000 mm3)當天的個別腫瘤大小繪示於圖2。在D0(第0天)、D7、D14及D21以0.25、0.5及1.0 mg/kg投與的分子1展現劑量依賴性抗腫瘤活性。所測試的最低劑量0.25顯示59%腫瘤生長抑制(TGI)的功效,其仍係顯著的(p<0.01),(圖2)。0.5 mg/kg及1.0 mg/kg分子1觀察到誘導腫瘤消退的強活性,對於兩種劑量其皆係高度顯著的(p < 0.0001,第18天)(圖2)。在研究結束時(第85天),在所有使用0.5 mg/kg及1.0 mg/kg分子1之劑量治療的動物中(16隻中的16隻)觀察到完全反應(圖3)。
總言之,本研究的結果顯示,分子1的強效抗腫瘤活性導致顯著功效及CHP134腫瘤的腫瘤消退。在CHP134腫瘤模型中,經確定最小有效劑量(MED)(定義為誘導腫瘤體積自基線減小 > 20%的最低劑量(針對治療開始後的任何時間點))大約為0.5 mg/kg之分子1。
圖1
圖2
圖3
實驗2. 抗GD2 ADC在骨肉瘤PDX模型中的功效研究
在表現GD2的CTG-2735骨肉瘤PDX模型中評價抗GD2 ADC分子1的功效。
在第0天以10.0 mg/kg劑量之分子1的單次IV注射來治療具有已建立CTG-2735腫瘤(~250 mm3)的雌性無胸腺裸小鼠(nu/nu)。媒劑組及治療組的群組大小為3隻。
在此研究中,治療的耐受性良好,沒有毒性,且觀察到正常的體重增加(圖4)。利用10 mg/kg分子1的治療引起強烈的腫瘤生長抑制,導致直至第62天,當實驗結束時之持久的腫瘤消退(見圖5及6)。
總言之,本研究的結果展現分子1在骨肉瘤PDX模型CTG-2735中的強效抗腫瘤活性。
圖4
圖5
圖6
實驗3. 抗GD2 ADC在SCLC PDX模型中的功效研究
在表現GD2的CTG-0199 SCLC PDX模型中評價抗GD2 ADC分子1的功效。
在第0天以10.0 mg/kg劑量之分子1的單次IV注射來治療具有已建立CTG-0199腫瘤(~250 mm3)的雌性無胸腺裸小鼠(nu/nu)。媒劑組及治療組的群組大小為5隻。
在此研究中,治療的耐受性良好,沒有毒性,且觀察到正常的體重增加(圖7)。利用10 mg/kg分子1的治療引起強烈的腫瘤生長抑制,導致直至第53天,當實驗結束時之持久的腫瘤消退(圖8、9)。
總言之,本研究的結果展現分子1在SCLC PDX模型CTG-0199中的強效抗腫瘤活性。
圖7
圖8
圖9
實驗4. 抗GD2 ADC及ATR抑制劑在骨肉瘤(CTG-2264)患者來源之異種移植(PDX)模型中的組合功效研究
於CTG-2264骨肉瘤PDX模型中測試本發明之選定ADC的抗腫瘤活性。
在第0天以3.0 mg/kg劑量之分子1的單次IV注射,利用10 mg/kg、經口(p.o.)、每日(qd)劑量的ATR抑制劑;及利用兩種治療的組合來治療具有已建立CTG-2264腫瘤(~250 mm3)的雌性無胸腺裸小鼠(nu/nu)。媒劑對照為鹽水,並在第0天投與(10mL/kg)。各治療組的群組大小為3隻。在治療開始後第23天,當對照組的平均腫瘤體積達到1000 mm3時進行腫瘤生長抑制(TGI)的計算(見圖11、12)。
治療的耐受性良好,未發現毒性或臨床症狀,且針對所有治療組均未觀察到與初始體重相比的平均體重減輕(圖10)。在CTG-2264骨肉瘤PDX模型中,此等ADC單獨及組合引起65%、67%及-72%(消退)的腫瘤生長抑制(TGI)。
總言之,上述組合顯示與兩種單一療法10mg/kg中之任一者相比的效益 (p<0.0001)。
圖10
圖11
圖12
實驗5. 對人類癌細胞株的ADC細胞殺死分析
使用CellTiter Glo
®冷光細胞存活率(Luminescent Cell Viability)分析(#G7573,Promega Corporation,Madison, WI, USA)在抗原陽性人類腫瘤細胞株CHP-134(神經母細胞瘤,#ACC653,DSMZ,Braunschweig, Germany)、NCI-H446(小細胞肺癌(SCLC),#HTB-171,ATCC,Manassas, VA, USA)以及M21(黑色素瘤,Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA)及抗原陰性人類腫瘤細胞株MDA-MB-468(乳癌,#ACC738,DSMZ,Braunschweig, Germany)上測量ADCs hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK-βGluc 依喜替康及利妥昔單抗(rituximab) IgG1 ßGluc依喜替康、未結合抗體hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delk及游離有效載荷依喜替康的體外功效。
將細胞株CHP-134、NCI-H446及MDA-MB-468按照供應商的說明進行培養,並保持在含有GlutaMAX
TM補充劑(#61870-010,Gibco
TM,從Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA購得)、1 mM丙酮酸鈉(#11360-070,Gibco
TM,Thermo Fisher Scientific)及10%胎牛血清(FBS)(#S0615,Sigma Aldrich,St. Louis, MO, USA)的RPMI1640培養基中。黑色素瘤細胞株M21係在含有穩定L-麩醯胺酸(#41965-039,Gibco
TM,Thermo Fisher Scientific)及10% FBS的DMEM中培養。
在處理前一天,將625個細胞/孔(90μl)(CHP-134、M21或MDA-MB-468)或1250個細胞/孔(90μl)(NCI-H446)接種在無菌Falcon
TM96孔、經細胞培養物處理的平底微孔盤(#353219,Corning, NY, USA)中。在37℃及5% CO
2或10% CO
2下培養過夜後,使用細胞培養基或包含上述補充劑的RPMI1640培養基來製備10倍起始濃度的化合物及連續稀釋液(1:4)。每孔添加總共10μl的化合物溶液(技術性三重複)。對照孔用相應量的二甲亞碸(用於游離有效載荷的對照孔)或細胞培養基/RPMI 1640(用於ADC及未結合抗體以及不含細胞之背景孔的對照孔)處理。於培養6天後,向每個孔中加入100μl Cell Titer-Glo
®試劑,並將盤於300 rpm振盪下培養2 min及在室溫下(避光)再培養20 min。之後,在Varioskan Flash或Varioskan Lux讀盤器(Thermo Fisher Scientific)上測量冷光信號以確定細胞存活率。相對光單位(RLU)通過減去背景並通過轉換為%存活率(其中將未經處理對照細胞的RLU定義為100%)或%效應(通過將%存活率減去100%來計算)來進行處理。使用經過處理的數據來利用方程式log(抑制劑) vs. 反應 –變數斜率(四個參數)(Windows版的GraphPad Prism(8.2.0版),GraphPad軟體,La Jolla California USA,www.graphpad.com)通過%效應vs.濃度[M]描述劑量-反應。數據用指示技術性三重複之標準差(SD)的誤差槓顯示。進行數次實驗,並計算所確定之IC
50的幾何平均值(幾何平均 IC
50[nM])。
於標靶陽性及標靶陰性人類癌細胞株上確定抗GD2 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delk-βGluc 依喜替康 ADC(分子1)的細胞毒性活性。使用具有相同連接子-有效載荷及可比DAR(分子2)的利妥昔單抗IgG1 βGluc 依喜替康 ADC及未結合抗體hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK(分子3)作為對照。為確認人類癌細胞株對游離有效載荷的一般敏感性,亦將依喜替康(分子4)包括在測試中。
體外活性的結果概述於表1中,並且代表性的劑量-反應曲線顯示於圖1-圖中。抗GD2 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delk-βGluc 依喜替康 ADC(分子1)對表現GD2+的癌細胞株CHP-134(圖1)、M21(圖)及NCI-H446(圖)展現細胞存活率的有效抑制及特異性次奈莫耳或個位數奈莫耳功效,如相對於非結合對照ADC(分子2)所顯示。就對游離有效載荷依喜替康(分子4)展現相對較高靈敏度的標靶陰性細胞株MDA-MB-468(圖)而言,與非結合對照ADC(分子2)相比,未觀察到分子1的特異性細胞毒性作用。
用未結合抗體hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delk(分子3)處理GD2陽性神經母細胞瘤細胞株CHP-134在所測試的最高濃度下展現殺死細胞活性(圖)。此效應與Horwacik等人發表的數據(Cancer Letters,第341卷,第2期,2013,第248-264頁)一致,報告在用抗GD2小鼠mAb 14G2a處理後對CHP-134細胞存活率的負面影響。在用hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delk (分子3)處理後,對SCLC細胞株NCI-H446及黑色素瘤細胞株M21觀察到對細胞存活率的影響較小,同時未確定對標靶陰性MDA-MB-468細胞株的影響。
NC:由於劑量-反應曲線不完整而無法計算
N:實驗次數
IC
50:半最大抑制濃度;觀察到最大抑制之50%的濃度;表包括由所指示實驗次數之IC
50值計算得的幾何平均IC
50[nM]
Span(%):最高測試濃度下的功效%*。相對於未處理對照細胞之非活總細胞的百分比;表包括由所指示實驗次數之Span(%)值計算的幾何平均Span(%)
最高測試濃度:分子1、2、4為100 nM;分子3為1 μM
表1 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK-βGluc依喜替康、利妥昔單抗IgG1 βGluc依喜替康、hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delk及有效載荷依喜替康於人類癌細胞株中的幾何平均IC
50值 [nM]及幾何平均Span(%)
實驗5的圖式說明
圖13 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK-βGluc依喜替康(分子1)、對照ADC利妥昔單抗 IgG1 βGluc 依喜替康(分子2)及有效載荷依喜替康(分子4)於CHP-134細胞中的體外劑量-反應曲線。一個代表性的劑量-反應曲線顯示為三重複值的平均值±SD。
圖14 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK-βGluc 依喜替康(分子1)、對照ADC利妥昔單抗 IgG1 βGluc依喜替康(分子2)及有效載荷依喜替康(分子4)處理於M21細胞中的體外劑量-反應曲線。一個代表性的劑量-反應曲線顯示為三重複值的平均值±SD。
圖15 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK-βGluc依喜替康(分子1)、對照ADC利妥昔單抗IgG1 βGluc 依喜替康(分子2)及有效載荷依喜替康(分子4)處理於NCI-H446 細胞中的體外劑量-反應曲線。一個代表性的劑量-反應曲線顯示為三重複值的平均值±SD。
圖16 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK-βGluc依喜替康(分子1)、對照ADC利妥昔單抗IgG1 βGluc 依喜替康(分子2)及有效載荷依喜替康(分子4)於MDA-MB-468細胞中的體外劑量-反應曲線。一個代表性的劑量-反應曲線顯示為三重複值的平均值±SD。
圖17 hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delK-βGluc依喜替康(分子1)及hu14.18-IgG1.4 (K322A)-delk(分子3)於CHP-134細胞中的體外劑量-反應曲線。數據以三重複值的平均值±SD呈現。圖中描繪的曲線係來自兩個獨立的實驗。
圖13
圖14
圖15
圖16
圖17
分子編號 | 樣本 | CHP-134 GD2 陽性 N≥4 | NCI-H446 GD2 陽性 N=5 | M21 GD2陽性 N≥6 | MDA-MB-468 GD2陰性 N≥3 | ||||
IC50 [nM] | Span (%)* | IC50 [nM] | Span (%)* | IC50 [nM] | Span (%)* | IC50 [nM] | Span (%)* | ||
1 | Hu14.18- IgG1.4 (K322A)- delK-βGluc 依喜替康, DAR 8 | 0.8 | 100 | 0.7 | 91 | 2.6 | 94 | 28 | 95 |
2 | 利妥昔單抗 IgG1 βGluc 依喜替康, DAR 7.7 或 7.9 | 5.4 | 100 | 24 | 90 | >10 | 74 | 13 | 99 |
3 | Hu14.18- IgG1.4 (K322A)-delk | 110 | 83 | NC | 23 | NC | 36 | 無 效果 | 4 |
4 | 依喜替康 | 0.2 | 100 | 0.07 | 96 | 1.1 | 95 | 0.3 | 100 |
實驗6:ADC1的安全概況:於食蟹猴(cynomolgus monkey)中的前導靜脈注射毒性 -TK研究
為研究安全概況,將ADC1經30-min靜脈內輸注投與食蟹猴,以4、8、16及32 mg/kg之劑量以間隔一週投與三次(於第1、8及15天),並(於第22天)犧牲動物以用於大塊器官及組織(包括周圍神經組織)的大體及組織病理學檢查。此外,將臨床症狀、體重、臨床血液學及生化參數以及毒物動力學(TK)係包括在研究中。ADC1主要在血液淋巴及胃腸道系統中誘導類似於依喜替康毒性的劑量依賴性作用(De Jager 2000, Verschraegen 2000, Rowinsky 2005)。值得注意地,在飼育籠觀察期間或在處置猴子以進行劑量投與期間或當採集血液樣本時,未觀察到疼痛的臨床症狀。在檢查若干周圍神經組織(即腓神經、脛神經及坐骨神經)或中樞腦組織時未觀察到組織病理學改變。經顯示血漿結合抗體的適當暴露量值與未結合(經釋放)依喜替康的極低血漿濃度有關。在此研究中未出現疼痛係非常重要的,乃因疼痛或觸摸痛係利用經批准的GD2(IgG1)抗體諸如達妥昔單抗(ch14.18/SP2/0, Unituxin)、達妥昔單抗β(ch14.18/CHO或APN311)及那西妥單抗(hu3F8)治療腫瘤患者中的劑量限制毒性。如於食蟹猴中測試的達妥昔單抗β展現經解譯為急性疼痛的臨床症狀,如由在周圍神經系統或非神經元組織之神經分佈結構中觀察到的組織病理學變化所證實(EMA/263814/2017評估報告達妥昔單抗β Apeiron)。達妥昔單抗β以及原始達妥昔單抗及那西妥單抗抗體的標籤證實關於急性疼痛(治療)問題的安全資訊。即使GD2抗體通過K322A突變僅針對CDC效用功能進行突變,亦僅部分緩解疼痛(Dobrenkov及Cheung 2014;Navid等人2014)並且仍然需要使用鴉片類藥物(Harman等人2019)。
總體而言,利用新穎ADC的猴子安全性數據及小鼠腫瘤學模型數據顯示腫瘤被標靶依喜替康介導的細胞凋亡(而非被CDC及/或ADCC機制)殺死,而沒有與單獨投與裸抗GD2抗體相關的疼痛。
實驗7:於大鼠及食蟹猴中周圍神經系統保留ADC(分子1)的評價
為研究分子1在表現相同GD2糖位(glycotope)(其可經用於結合的hu14.18 Ab變體(FDA BLA #125516,2014;EMA/263814/2017,2017)靶向)的猴子及大鼠中的初始安全概況,分子1在於猴子及大鼠中每週靜脈內重複給藥後顯示預期的依喜替康毒性概況,但並未引起任何PNS損傷。此外,在動物於其飼育籠內的正常行為諸如運動活動、飼養及探索中,或當處置時,並未觀察到疼痛信號的指示。
方法
一般毒理學計劃包括在韋斯(Wistar)大鼠及食蟹猴中通過靜脈內輸注每週一次投與分子1連續3次(第1、8及15天)的前導重複劑量毒性研究,包括毒物動力學評價ADC的暴露確認(通過液相層析-串聯質譜法(LC-MS/MS)分析結合有效載荷及通過免疫檢定法分析總抗體)及血漿中經釋放的有效載荷(通過超高效LC-MS/MS分析)。在第22天排程進行屍體解剖以進行巨觀及顯微鏡檢查。
靜脈內劑量調配物:將分子1(由EMD Serono, Billerica, USA製造,及由Sterling Deeside Ltd., Flintshire, United Kingdom結合的Ab)調配在含有10 mM組胺酸、40 mM NaCl、6%海藻糖二水合物、0.05%聚山梨醇酯20(pH 5.5)的媒劑溶液(對照組)中,並深度冷凍(-60℃)儲存直至使用為止。在給藥前驗證分子1之原液濃度(10 mg/mL)及稀釋液的穩定性及濃度(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。將測試項目或媒劑通過靜脈內(iv)緩慢推注輸注投與大鼠(尾靜脈)及通過30-分鐘輸注投與食蟹猴(周圍靜脈)。
用於評價毒性的一般參數。毒性指標由每日臨床觀察、體重、食物消耗、臨床病理學、免疫表型、大體病理學、器官重量及組織病理學組成。屍體解剖包括檢查屍體;身體外部孔口;腹腔、胸腔及顱腔;及器官。將屍體解剖時收集的組織保存在10%中性緩衝福馬林、大衛森(Davidson’s)(眼睛及視神經)或改良的大衛森(睾丸)固定劑中,並進行處理以用於例行的組織學檢查(石蠟包埋組織及HE染色)。在固定之前稱重選定的器官。此外,對瀕死的動物進行計劃外的屍體解剖及組織學檢查。
方法論
i. 3週前導大鼠毒性及毒物動力學研究
將分子1連續3週每週通過靜脈內輸注以0(媒劑對照)、10、30及60 mg/kg分子1之劑量投與四組Crl:WI (Han)大鼠(5隻大鼠/性別/組;Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany)。使用3隻大鼠/性別/組的衛星試驗組(satellite group)來對三種分析物進行毒物動力學評價。方法:將大鼠以每籠2-3隻的群組圈養。每天觀察大鼠的身體外觀、行為及臨床症狀。在治療開始前及其後每天記錄體重直至研究結束。通過稱重每個籠子未被消耗的食物來每週記錄每個籠子的食物消耗量,直至研究結束。在最後給藥期後一週(第22天),對5隻大鼠/性別/組進行血液學檢查及臨床化學檢驗。血液學參數係使用ADVIA2120i自動分析儀進行分析,及臨床化學參數係使用ADVIA 1800自動分析儀進行分析(兩者均來自Siemens Healthcare Diagnostics, GmbH)。在第1天及第15天直至此後一週在以下時間點:0(給藥前)、及給藥後0.5、4、24、48、96(僅第1天)及168小時(下一次給藥前),自所有動物採集來自衛星試驗及主要組(稀缺採樣)的血液樣本(0.15 mL含於鋰肝素管中)以進行生物分析及毒物動力學(TK)評價。作為對照,在第1天及第15天(在第一次及最後一次給藥後4小時)對媒劑治療動物進行採樣。
ii. 3週前導猴毒性及毒物動力學研究,包括心血管(CV)參數及呼吸速率的功能評估
自Envigo (Venray,荷蘭)購得專門培育的原始態(naïve)食蟹猴
(Macaca fascicularis)。猴子係在越南出生及繁殖,並在Camarles (Camarney SLU, 西班牙)隔離,然後再運送至Ivrea(義大利)的試驗設施。猴子被圈養在空調室(22±2℃)內,空調室每小時換氣15-20次,相對濕度為55±15%並具有從早上7點至晚上7點之12小時晝夜週期的人工照明。動物被分組圈養在固定至地板的猴子圍欄中。圍欄的前壁及頂部係由不鏽鋼條製成,而側壁及後壁係由彩色塑膠材料組成。在此研究中,實驗組由每組每性別一隻動物組成,但存在額外的未給藥動物,以確保二或三位受試者的社會圈養(social housing)群組。非人類靈長類動物的圈養符合義大利對實驗動物福利的要求,包括環境豐富化計劃。在治療開始時,雄性及雌性動物大約為3-4歲,體重在3.1-3.8 kg之間。分子1每週以試驗項目的三個劑量值(4、8及16 mg/kg)經30分鐘靜脈內輸注投與每組1隻雄性及1隻雌性食蟹猴連續3週。另一隻雄性猴子以第四個更高劑量值(32 mg/kg)輸注以確定最大耐受性。
每天兩次以及在輸注結束時(直至給藥後30-min)記錄死亡率及臨床症狀(身體外觀、行為及一般症狀),並且從治療開始前一週起在整個研究期間每週一次記錄體重。每天(每籠)進行食物及水攝取。在治療前期中、及在第3天(即第一劑後48小時)、第8天(第二劑前168小時)、第15天(第3劑前)、第17天(即第3劑後48小時)及第22天(犧牲前)對所有猴子進行血液學(ADVIA2120i Siemens分析儀)研究。在相同天數進行免疫分型(FACLyric Becton Dickinson流式細胞儀,Becton Dickinson抗體),以測量總B細胞(CD3
-、CD20
+)、總細胞(CD3
+)、輔助細胞(CD3
+、CD4
+)及細胞毒性T細胞(CD3
+、CD8
+)及自然殺手細胞(CD3
-、CD16
+)的絕對及相對計數。在給藥前期中、及在第15天及第22天進行臨床化學(AU480 Beckman Coulter分析儀)。
在第1天及第15天直至此後一週在以下時間點:0(給藥前)、及給藥後0.5(=輸注結束)、2、6、24、48、72、120及168小時(下一次給藥前),自各動物採集血液樣本(0.6 mL含於鋰肝素管中)進行生物分析及TK評價。
iii. 綜合心電圖及動脈血壓評估
在基線(給藥前)及在最後一劑輸注結束時(第15天)的30分鐘內測量所有猴子的心率(HR)、心電圖(ECG)及動脈血壓(收縮及舒張BP)作為前導猴子DRF毒性研究的一綜合部分。訓練動物當坐在椅子上時於神智清醒、暫時受約束的狀況下進行記錄。在呼吸速率及ECG測量時程之前進行收縮及舒張動脈血壓的三次連續測量。對至少10個代表性的ECG複合波進行評價。在動脈血壓測量後立即通過計數一分鐘內的呼吸運動來測量呼吸速率。在給藥前兩次,及在第1、8及15天,在輸注結束時(在給藥後30分鐘內)及給藥後24小時(±30分鐘)記錄所有動物的肛溫。
方法:根據Standard II Leads將ECG電極(一次性發泡電極(foam electrode))放置於各動物身上。一旦心率達到穩定狀態,即使用套裝軟體(Ponemah Physiology Platform 5.20,來自DSI供應商)將信號數位化(A/D轉換器ACQ-7700,DSI,St. Paul, Minnesota, USA)並連續記錄。將用於動脈血壓(BP)測量的壓脈帶(cuff)連接至血壓監測儀(監測生命徵象單元CARESCAPETM V100,GE Healthcare,Milwaukee, Wisconsin, USA)並放置在其中一個前臂上。由於每組的動物數目少,而未進行統計分析。
實驗發現:
在韋斯大鼠中的3週毒理學前導研究
在連續三次每週靜脈內注射分子1的三個劑量值後,以60 mg/kg給藥之16隻大鼠中有3隻由於臨床症狀(側腹凹陷、毛髮豎立、下垂)及在研究結束時(第21天)與對照相比雄性體重下降-25%及雌性體重下降-12%而過早犧牲(圖13)。在每次的每週給藥後,與其每週給藥前的BW值相比,60 mg/kg下之注射後3至4天的短暫BW損失最低值在雄性為至多-7%(與對照相比多達-27%)及在雌性為-10%(與對照相比多達-15%)。在30 mg/kg下,在第21天,兩種性別的體重均降低-10%至-11%(與對照相比)。在21天的觀察期內,與對照相比,兩種性別在60 mg/kg下幾乎未出現體重增加及在30 mg/kg下幾乎降低50%。食物消耗在60 mg/kg下劑量依賴性地減少33-37%及在30 mg/kg下減少16-19%。
在第22天,最後一次給藥(第15天)後一週,臨床病理學測量顯示紅血球、血紅素及血容比中度降低(所有參數在60 mg/kg下多達-29%及在30 mg/kg下多達-9%)且網狀紅血球在中劑量下增加(多達90%),指示再生,且在高劑量下沒有網狀紅血球變化。在60 mg/kg下,白血球、淋巴細胞及嗜酸性白血球似乎下降,並且在30 mg/kg下部分下降(雄性中的嗜酸性白血球及雌性中的淋巴細胞)。在中劑量及高劑量下,血小板增加(多達60%),而嗜中性白血球計數顯示朝向減少的趨勢(非統計學上顯著)。針對血液學分析所選的第22天可能未針對大鼠中的造血再生能力最佳化。於嚙齒動物中針對依喜替康所描述的血液毒性作用,諸如嗜中性白血球、淋巴細胞及血小板減少(Verschraegen等人,2000),可能已在分子1的最終劑量後7天部分恢復。關於臨床血液化學,總蛋白(-14%)及白蛋白(-12%)僅在60 mg/kg下降低。後者的影響最可能與在3週內沒有任何體重增加的一般分解代謝有關。
於第22天採集的器官顯微鏡檢查顯示血液淋巴系統(胸腺、骨髓(BM)及脾臟小動脈周圍淋巴鞘(PALS)及淋巴結中的細胞減少及/或單細胞壞死增加)、胃腸道(隱窩區域的單細胞壞死增加)及生殖器官(卵母細胞、顆粒層細胞及細精管變性)的不良發現,其反映抗有絲分裂細胞毒性劑的模式。在胸腺中,在受影響最嚴重的大鼠中觀察到皮髓質區別之中度至明顯損失。此外,次要發現由以下組成:初級骨小樑減少,骨/骨髓中的編織骨形成或纖維化以及在單隻大鼠,尤其在60 mg/kg給藥組中發生的皮膚潰瘍。編織骨形成及纖維化可被視為嘗試補償受擾亂的骨形成。在60 mg/kg組的四隻雄性大鼠中,或許由於在免疫抑制情況下常見皮膚變化(刮傷或咬傷)的機會性感染(於顯微鏡載玻片中存在球狀菌落)而發生潰瘍性皮膚傷口。從10 mg/kg及更高之低劑量注意到之大多數大鼠淋巴結中生發中心(germinal center)的喪失指示,此特異性B細胞隔室對分子1於大鼠中之抗有絲分裂活性的高易感性。於60 mg/kg下的其他觀察係肝臟及腎上腺中最小的髓外造血,其被認為係由於骨髓抑制所引起的適應性現象。來自主要60 mg/kg組的過早犧牲雌性(第14天於給藥2次後)在盲腸中出現多灶性、中度糜爛可能促成其不良的臨床症狀。此大鼠中的其他發現與此組中的其餘大鼠相當。衛星試驗TK組的兩隻過早犧牲大鼠(第5天雌性,第18天雄性)未進行組織病理學檢查。
大鼠背根神經節(頸神經、胸神經、腰神經)及周圍神經(包括視神經、脛神經、腓神經及坐骨神經)的顯微鏡評價未顯示任何異常。
毒物動力學評價
總抗體、結合(依喜替康)及非結合(經釋放的依喜替康)的總血漿暴露在測試劑量範圍內與增加劑量成比例地增加,其中ADC在10及30 mg/kg治療組中累積,但在60 mg/kg組則不累積。在0.5至4小時之間觀察到極低血漿量值之非結合依喜替康的最大血漿濃度,其具有與ADC相似的半衰期(約2-3天),指示ADC的形成速率限制過程。明顯可見血漿暴露沒有相關的性別差異。
於食蟹猴中具有CV功能評估的3週前導毒理學研究
每週以三個劑量值的分子1向食蟹猴靜脈內給藥連續3次係可耐受的。32 mg/kg分子1輸注給單隻雄性猴子之第四更高劑量在兩次給藥(第1天及第8天)後不可耐受,並需要在第14天犧牲。 因此,在本研究中,將32 mg/kg的劑量視為超過MTD。直至MTD,猴子顯現與體重減輕相關的劑量依賴性胃腸道臨床症狀(即軟便及/或腹瀉發作)。在16 mg/kg之MTD下,在兩動物及在雌性中在8 mg/kg下均注意到輕微的軟便及/或腹瀉發作。此與雌性中在16 mg/kg下-11%(第14天)至-16%(第21天)之BW隨時間的逐漸減少相關聯,但在雄性中則非如此。在兩種性別中在8 mg/kg下及在雄性猴子中在4 mg/kg下注意到輕度BW下降。猴子中隨時間經過的血液學研究(圖14)顯示,在所有劑量值下,紅血球、血紅素及血容比有最小至輕微的下降(在兩種性別中在16 mg/kg下,相對基線值高達-27%),具有有限的劑量關係。在4及8 mg/kg下觀察到再生反應(即網狀紅血球計數增加多達5倍),而對於相同參數,在16 mg/kg下注意到中度至重度下降(在第8天高達約-95%)。在雄性猴子中在第8天及第15天在16 mg/kg下嗜中性白血球計數短暫降低(< 2.0 10
3/μL),但仍高於正常參考值的下限(= 1.10×10
3/μL,平均值5.77 ± 3.57 × 10
3/μL,如Park等人,2016中所報告)。
在16 mg/kg下,組織病理學受限於淋巴系統的變化(淋巴結及胸腺中細胞過少)。以8及4 mg/kg治療之所有猴子之胸腺中的輕度影響可能會受到二次應力相關效應的混淆。在胃腸道中未注意到組織病理學變化。
包括視神經、脛神經、腓神經及坐骨神經之周圍神經的顯微鏡評價在包括於雄性猴子中超過MTD之任何測試劑量下均未顯示任何與測試項目相關的發現(第14天屍體解剖)。
心血管功能
關於心率(HR)、ECG (QT/HR-校正QT)、收縮壓、舒張壓及平均血壓、以及關於呼吸速率及體溫,直至MTD未測得相關變化。
毒物動力學評價
總抗體、結合(依喜替康)及非結合(經釋放的依喜替康)之總血漿暴露在測試劑量範圍內與增加的劑量成比例地增加,而沒有任何分析物累積。僅在一隻猴子(雄性)中,在重複投與4 mg/kg後觀察到暴露下降,指示此受試者中的潛在ADA形成。通常在6小時後觀察到非常低量值之非結合依喜替康的最大血漿濃度,與ADC具有相似的半衰期(約2-3天),指示自ADC的形成速率限制過程。明顯可見血漿暴露沒有相關的性別差異。
實驗發現的討論
儘管生存率經提高,但急性神經性疼痛係與在治療罹患神經母細胞瘤及骨肉瘤患者之當前市售抗GD2抗體(達妥昔單抗、那西妥單抗)之GD2免疫療法所觀察到之周圍神經病變相關聯之常見且關鍵的劑量限制不良事件(AE)。在對大鼠及食蟹猴每週靜脈內投與(3次)基於依喜替康之ADC分子1的前導毒性/TK研究中,在第22天未觀察到PNS的損傷,且未於其等的行為中注意到疼痛的跡象。分子1在表現GD2的異種移植小鼠模型中,即使在單劑量施用後亦導致強效的抗腫瘤活性。此等非臨床數據共同顯示,正效益風險比可能相對當前的GD2免疫療法改善於兒童及成人患者中治療GD2-表現腫瘤的臨床前景。一般而言,在處置期間未注意到可能指示機械性觸摸痛之防禦行為的不尋常跡象諸如過度反應、焦慮或激動不安。此外,在其飼育籠行為中,未觀察到指示疼痛之跡象,諸如運動活動、飼養及探索減少。此外,使坐在椅子上之受過訓練的猴子接受30分鐘的靜脈內輸注,於1小時後沒有問題並隨後測量CV功能其可能對疼痛刺激起反應諸如心動過速或血壓升高,儘管非特異性地,但在猴子中看來保持正常。
相對地,在用達妥昔單抗β對食蟹猴輸注4小時/天連續10天(30及100 mg/m
2/天)的毒性研究中,於第15天在周圍神經及器官的內臟神經分佈中注意到組織病理學變化(EMA/263814/2017,2017)。此等觀察結果與此等猴子中之臨床症狀(例如活動減退)一起被解釋為最可能與針對周圍神經系統內之GD2之測試項目所引起的急性疼痛誘導相關的跡象。於利用抗GD2 mAb(14G2a;ch14.18係來源於此鼠類IgG2a同型)治療黑色素瘤後,一些患者發展為感覺運動脫髓鞘性多發性神經病變(Yuki等人,1997)。未使用那西妥單抗(FDA BLA #761171,2020)或達妥昔單抗(Unituxin®,FDA BLA #125516,2014)對猴子或其他非嚙齒動物進行毒理學研究。
在DRF毒性研究中,在重複分子1施用後未於猴子及大鼠的若干受檢查的周圍神經(坐骨神經、脛神經、腓神經、及視神經,以及於大鼠中不同量值的DRG)中注意到微觀變化,同時確認於血漿中適當地暴露於ADC。猴子中的臨床症狀僅受限於在16 mg/kg之MTD下偶爾發生輕度軟便及腹瀉,以及在雌性中的BW減少(-16%),但在雄性中則沒有。在大鼠中主要觀察到劑量依賴性的BW增加減少及輕度食物攝入減少。由於60 mg/kg下之16隻大鼠中的3隻沒有BW增加的不良狀況,因而認為此DRF大鼠研究中的高劑量超過MTD。從臨床及組織病理學檢查來看,猴子及大鼠表現出類似歸因於一週內自ADC釋放之非結合依喜替康之相對較低血漿量值之依喜替康毒性的血液淋巴及胃腸道效應(Verschraegen等人,2000,Rowinsky 2005)。嗜中性白血球減少症被認為係如於腫瘤患者及動物中針對甲磺酸依喜替康所觀察到以及其他血液毒性效應(諸如貧血、淋巴細胞減少症及血小板減少症)及胃腸道效應的主要劑量限制毒性。
如實驗7中詳述,如由顯示正常劑量比例及規則TK曲線的TK概況所判定,於三週內重複投與分子1後未於大鼠及猴子中觀察到免疫原性的跡象(一隻低劑量猴子除外),且不存在異常的毒性。免疫原性的缺乏可能由分子1之經誘導的強免疫抑制效應(例如,不存在生發中心,主要的B細胞隔室)來解釋。分子1所觀察到的其他非血液毒性效應,諸如雌性及雄性大鼠中生殖器官/組織的抗增殖變化,可歸因於依喜替康的抗有絲分裂作用(Verschraegen等人,2000,Rowinsky 2005)。
經由利用標靶遞送非神經毒性有效載荷置換來改變殺死腫瘤概念,及除去任何Ab Fc效用功能,於兩種測試動物種類中防止PNS損傷。此一致結果的高優點係分子1至少可省略或減少對患者PNS的潛在傷害。
在本發明的一些具體例中,治療方法描述PNS保留分子1的活性,以便可預防眼睛的神經病症(例如,瞳孔散大、視力模糊、瞳孔不等或畏光)。
圖1至圖3顯示實驗1抗GD2 ADC在神經母細胞瘤(CHP134)異
種移植模型中的劑量反應功效研究結果。
圖4至圖6顯示實驗2抗GD2 ADC在骨肉瘤PDX模型中的功效研
究結果。
圖7至圖9顯示實驗3抗GD2 ADC在SCLC PDX模型中的功效研
究結果。
圖10至圖12顯示實驗4抗GD2 ADC及ATR抑制劑在骨肉瘤
(CTG-2264)患者來源之異種移植(PDX)模型中的組合功效研究結果。
圖13至圖17顯示實驗5對人類癌細胞株的ADC細胞殺死分析結
果。
Claims (21)
- 一種抗體藥物結合物(「ADC」),其包含經由連接子與抗體連接的生長抑制劑及/或抗增殖劑,其中該抗體包含SEQ ID NO:1的抗GD2抗體輕鏈可變區、SEQ ID NO:2的抗GD2抗體重鏈可變區、及具有一個相對於抗體依賴性細胞介導細胞毒性降低補體固定之突變的Fc區,其中該一個突變導致補體固定的絕對降低。
- 如請求項1之ADC,其中,該一個突變消除補體固定。
- 如請求項1之ADC,其中,該Fc區係來源於IgG。
- 如請求項3之ADC,其中,該IgG係IgG1。
- 如請求項1之ADC,其進一步包含CH1結構域。
- 如請求項5之ADC,其中,該Fc區係來源於IgG。
- 如請求項5之ADC,其中,該IgG係IgG1。
- 如請求項1之ADC,其進一步包含CL結構域。
- 如請求項8之ADC,其進一步包含CH1結構域。
- 如請求項1之ADC,其中,該連接子可藉由葡萄糖醛酸苷酶裂解。
- 如請求項1之ADC,其中,該連接子可藉由天冬胺酸内肽酶(legumain)裂解。
- 如請求項1之ADC,其中,該生長抑制劑係依喜替康(Exatecan)。
- 如請求項1之ADC,其具有在1至10範圍內的平均藥物抗體比。
- 如請求項1之ADC,其具有在2至4範圍內的平均藥物抗體比。
- 如請求項1之ADC,其中,該抗體或其抗原結合片段包括含有與SEQ ID NO:2中記述之重鏈可變區胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源之胺基酸序列的重鏈可變區及含有與SEQ ID NO:1中記述之輕鏈可變區胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 一種醫藥組成物,其包含請求項1之ADC及醫藥上可接受之賦形劑。
- 一種治療受試者之癌症的方法,其包括向該受試者投與治療有效量的請求項16之醫藥組成物。
- 一種抗體藥物結合物(「ADC」),其包含經由連接子與抗GD2抗體連接的生長抑制劑及/或抗增殖劑,其中該抗GD2抗體包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列及SEQ ID NO:1的胺基酸序列,該連接子係β-葡萄糖醛酸苷,且該生長抑制劑係依喜替康。
- 如請求項18之ADC,其中,該抗體或其抗原結合片段包括含有與SEQ ID NO:4中記述之重鏈可變區胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源之胺基酸序列的重鏈可變區及含有與SEQ ID NO:1中記述之輕鏈可變區胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 一種醫藥組成物,其包含請求項18之ADC及醫藥上可接受之賦形劑。
- 一種治療受試者之癌症的方法,其包括向該受試者投與治療有效量的請求項20之醫藥組成物。
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