KR20220069037A - 항-ptcra 항체-약물 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

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antigen
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미터 마이클 반
토마스 니톨리
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본원 개시내용은 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본원 개시내용의 ADC는 T-ALL 및 PTCRA의 상승된 발현에 관련된 다른 장애의 치료에 유용하다.

Description

항-PTCRA 항체-약물 접합체 및 이의 용도
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 PCT 국제 특허 출원으로서 2020년 9월 19일에 출원되고, 2019년 9월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/902,674에 대한 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
개시내용의 분야
본원 개시내용은 프리 T-세포 항원 수용체 알파 (Pre T-Cell Antigen Receptor Alpha; PTCRA)에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
배경
T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-cell acute lymphoblastic leukemia; T-ALL)은 T-세포 전구체의 악성 형질전환으로부터 발생하는 공격적인 혈액 종양이다 (참조: Belver & Ferrando 2016 Nat Rev Cancer 16:494-507; Vadillo, et al. 2018 Blood Rev 32:36-51). 상기 질환은 급성 림프모구 백혈병 사례의 15-25%를 차지하고, 소아 및 성인 둘 다에서 발병한다. 집중적인, 다중-제제 화학요법 용법의 실행은 특히 소아과에서 질환 결과를 극적으로 향상시킨다 (참조: Pui, et al. 2008 Lancet 371:1030-1043). 그러나, T-ALL에 대한 표적화된 요법이 없고, 질환이 화학요법-불응성이거나 재발되는 환자는 충족되지 않는 주요 의학적 요구로 남아있다 (참조: Ferrando 2015 Blood 126: 833-841; Marks & Rowntree 2017 Blood 129:1134-1142). 표적화된 요법이 없는 것은 T-ALL에서 추가 치료학적 표적의 발견이 필요하고, 질환 생물학에 대해 더 잘 이해할 필요성이 있다.
프리 T-세포 항원 수용체 알파 (PTCRA) 단백질은 미숙 (성숙되지 않은) T-세포에서 발견되는 단일-통과(single-pass) I형 막 단백질이다. T 세포 수용체 베타 (T cell receptor beta; TCRB) 및 집락 또는 분화 3 (cluster or differentiation 3; CD3) 복합물와 함께, 조기 T-세포 발달을 조절하는 프리-T 세포 수용체 복합물을 형성한다.
간단한 요지
프리 T-세포 항원 수용체 알파 (PTCRA)에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공되고, 여기서, 항체 및 항원-결합 단편은 치료학적 모이어티에 접합된다. 본원에 개시된 항체-약물 접합체 (ADCs)는, 그 중에서도, PTCRA를 발현하는 종양 세포를 표적화하는데 유용하다.
또다른 양상에서, 본원 개시내용은 PTCRA에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 관련 양상에서, 본원 개시내용은 항-PTCRA 항체-약물-접합체 및 두번째 치료제의 병용물인 조성물을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 두번째 치료제는 항-PTCRA 항체-약물 접합체와 유리하게 병용하는 임의의 제제이다. 예시적인 병용 요법, 공동-제형(co-formulations), 및 항체-약물 접합체가 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
또한 또다른 양상에서, 본원 개시내용은 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 치료학적 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체를 사용하여 종양 세포를 사멸시키거나 종양 세포 성장을 억제 또는 감쇠시키는 치료학적 방법을 제공한다. 본원 개시내용의 이러한 양상에 따른 치료학적 방법은 본원에 개시된 항체-약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여함을 포함한다. 치료되는 장애는 PTCRA를 표적화하고/하거나 PTCRA를 통해 세포 신호전달을 억제하여 향상, 개선, 억제, 또는 예방되는 임의의 질환 또는 상태이다.
다른 실시형태는 다음의 상세한 설명을 검토하면 명백해질 것이다.
상세한 설명
방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문에 본원 개시내용이 기재된 특정한 방법 및 실험 조건에 제한되지 않는 것을 이해하여야 한다. 또한 본원 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 본원에 사용된 용어는 특정 실시형태 만을 기술하기 위한 목적인 것을 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원 개시내용이 속하는 당해 기술분야의 숙련가가 공통으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 용어 "약"은, 특정하게 인용된 수치 값에 관하여 사용하는 경우, 상기 값은 인용된 값에서 1% 이하까지 변할 수 있다. 예를 들면, 본원에 사용된 표현 "약 100"은 99 및 101 및 그 사이의 모든 값 (예를 들면, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다. 용어 "도면" 및 "도"는 명세서 전반에 걸쳐서 상호교환하여 사용한다.
본원에 기재된 것들과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 항체-약물 접합체 및 조성물 및 방법 및 사용의 실시 및 시험에서 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 간행물은 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
도 1A-1G는 베타-선택 DN에서 DP로의 전이와 관련된 유전자가 T-ALL의 가슴샘 이식 모델에서 상향조절됨을 예시한다. 도 1A는 T-ALL 종양 대 대조군 비장에서 β-선택 인자 선택의 히트 맵(heat map)을 나타낸다. Cxcr4, Myc, Notch1, Notch3, Ptcra, Rag1, Rag2, 및 Dntt는 모두 대조군 비장에 비해 T-ALL 샘플에서 강력하게 상향조절된다; 정규화된 강건한 센터 스케일. 도 1B-1D는 다양한 대조군 조직에 걸쳐서 및 일차 T-ALL 종양에서 Ptcra의 발현 (1B), Notch3 (1C), 및 Notch1 (1D)을 나타낸다. 도 1E-1G는 대표적인 T-ALL 사례에서 Ptcra (1E), Notch3 (1F), 및 Notch1 (1G)의 세포 표면 발현을 나타낸다.
도 2는 T-ALL의 가슴샘 이식 모델에서 상위 차등 발현된 유전자를 열거한 표를 나타낸다 (C57B15 마우스로부터의 말초 T-세포와 비교하여 T-ALL 종양에서 차등 발현된 상위 유전자).
도 3A-3D는 Ptcra KO가 가슴샘 형성저하증을 야기하고, DN3 체크포인트에서 가슴샘세포의 저지함을 예시한다. 도 3A는 Ptcra KO 동물에서 유래된 가슴샘의 크기 (상단), 질량 (중간, 막대 그래프), 및 세포질 (하단, 막대 그래프)이 현저하게 감소됨을 나타낸다. n=4, 오차 막대는 s.d.을 나타낸다. 도 3B 및 3C는 Ptcra KO 가슴샘에 대체로 DP 세포가 없고 (3B), 대부분 가슴샘세포가 DN3 기 (3C)에서 저지되는 것을 나타내는 면역프로파일링을 나타낸다. n=5 +/- s.d. 도 3D는 이들의 면역표현형과 일치하는 막대 그래프 형태로 나타내고, 유전자 발현 분석은 Ptcra KO 가슴샘에서 DN3-회합된 유전자의 강력한 상향조절 및 DP 마커의 하향조절을 나타낸다. n=5, 오차 막대는 s.d.를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 Ptcra KO 마우스에서 가슴샘 형성저하증이 연령에 따라 개선됨을 예시한다. 도 4A는 새끼 (~1 주령) 및 성인 (~6 개월령) 야생형 (WT) 및 Ptcra KO 마우스에서 유래된 가슴샘의 대표적인 면역표현형을 나타낸다. 도 4B는 새끼 (상부 막대 그래프) 및 노령 (하부 막대 그래프) WT 및 Ptcra KO 가슴샘의 면역표현형 분석의 정량화를 제공한다. DN3에서 Ptcra KO 가슴샘세포의 발달 지체는 성인기에 덜 확연하다; DN에서 DP로의 전이 완료 불능이 거의 완전히 역전된다.
도 5A 및 5B는 Notch3의 유전적 절제가 가슴샘세포 발달을 손상시키지 않음을 예시한다. 도 5A는 야생형 (WT) 및 Notch3 KO 가슴샘에서 가슴샘세포 발달의 DN 기에서 Notch3의 발현을 나타낸다. 2개의 뚜렷한 피크를 나타내는 도 5A에 나타낸 도표 중에서, Notch3 피크는 오른쪽 피크이다. 2개의 뚜렷한 피크를 나타내지 않는 도 5A에 나타낸 도표 중에서, Notch3 및 이소형 대조군 피크는 오버랩된다. 도 5B는 WT 및 Notch3 KO 가슴샘에서 발달의 DN1-DN4 기에서 가슴샘세포의 정량화를 나타낸다; 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.
도 6은 Ptcra KO 가슴샘이 이식 후 T-세포 생산 능력이 유지됨을 예시한다. 말초 T-세포 빈도를 가슴샘 이식 연구 과정 동안 유세포분석법으로 모니터링하였다. 단일 야생형 (WT), Ptcra KO, 및 다중 (4-8) Ptcra KO 공여자 가슴샘의 값을 도표로 작성한다.
도 7A-7C는 Ptcra의 유전적 절제가 손상된 T-ALL 발달을 야기함을 예시한다. 도 7A는 가슴샘 이식 연구에서 동물의 생존 곡선을 나타낸다. 야생형 (WT) 가슴샘 엽이 생착된 동물은 T-ALL을 대략 25 주의 질환까지 중앙값 시간으로 발달시켰다 (청색 선). 2개의 Ptcra KO 가슴샘 엽 (적색 선) 또는 4 내지 8개의 Ptcra KO 가슴샘 엽 (녹색 선)으로 생착된 동물은 백혈병유발의 강력한 지연을 나타내었다. WT 가슴샘 이식의 경우 n=25, PTCRA KO 이식의 경우 n=35. P-값을 로그-등급 (Mantel-Cox) 시험으로 계산하였다. 도 7B는 생착된 대표적인 WT 가슴샘의 주변부 및 Ptcra KO 생착된 마우스에서 말초 모세포의 모니터링을 나타낸다. 도 7C는 Ptcra KO 대 WT 종양의 유전자 발현 프로파일링을 나타낸다. 하향조절된 유전자는 Ptcra-표적 유전자 및 DN에서 DP로의 전이에 관련된 유전자에서 풍부하다; 상향조절된 유전자는 ETP-ALL와 회합된 유전자에서 풍부하였다.
도 8A 및 8B는 사람 T-ALL에서 NOTCH3 발현 및 잠재적 기능을 예시한다. 도 8A는 환자 샘플에서, 대조군 샘플에 비해, 사람 T-ALL에서 NOTCH3가 상향조절되는 것을 나타낸다. 도 8B는 TALL-1 사람 T-ALL 세포주가 NOTCH3 (NOTCH3 HDD)에서 기능 돌연변이의 획득을 보유하고, 야생형 NOTCH1를 발현함을 나타낸다. 이러한 세포주의 감마-세크레타제 억제제 (GSI)로의 처리는 세포 증식을 현저하게 억제한다.
도 9는 NOTCH3의 유전적 절제가 가슴샘 이식 모델에서 T-ALL 발달을 손상시키지 않음을 예시한다. NOTCH3 KO 가슴샘은 가슴샘 이식 모델에서 야생형 (WT) 대조군과 유사한 빈도로 T-ALL을 일으킨다.
도 10A-10E는 PTCRA가 사람 T-ALL에서 선택적으로 상향조절됨을 예시한다. 도 10A는 PTCRA가 Cancer Cell Line Encyclopedia에서 분석된 대다수의 사람 T-ALL 세포주에서 발현되지만, AML 또는 B-ALL 세포주에서 그렇지 않다는 것을 나타낸다. PTCRA RNA 유전자 발현을 이러한 데이터세트에서 B-ALL, AML, 및 T-ALL 세포주에 대해 도표로 작성한다. 도 10B는 세인트 주드 소아 연구 병원(St. Jude Children's Research Hospital) 조혈 악성종양 코호트에서 대다수의 T-ALL 환자에서 PTCRA가 고도로 발혐되지만, AML 및 B-ALL 샘플에서 그렇지 않음을 나타낸다. PTCRA RNA 발현을 종양 유형에 의해 도표로 작성한다. 도 10C는 PTCRA가, 정상 골수 대조군 및 Haferlach 환자 코호트 내에 포함된 비-T-ALL 혈액 종양 유형에 비해, T-ALL 종양에서 상향조절됨을 나타낸다. 도 10D에서, PTCRA 세포 표면 발현을, 이소형 대조군에 비해, 사람 T-ALL 환자 샘플, 사람 B-ALL 환자 샘플 및 사람 AML 환자 샘플에서 일차 및 화학요법 불응성(chemotherapy refractory) (#150)에서 유세포분석법으로 검정하였다. 표면 염색을 단지 T-ALL 샘플에서 발견하였다. 도 10E에서 PTCRA 세포 표면 발현을, 이소형 대조군에 비해, PBMC에서 유래된 일차 사람 T-세포에서 유세포분석법으로 검정하였다. 정상 T-세포를 공여자 PBMC로부터 실행가능한 CD45+CD3+ 세포 상에서 분류한다.
도 11A 및 11B는 PTCRA가 ETP-유사 하위그룹을 제외하고는 T-ALL의 모든 주요 아형에 걸쳐서 발현되고, NOTCH1 돌연변이가 사람 T-ALL에서 더 높은 수준의 PTCRA 발현으로 회합된다는 것을 예시한다. PTCRA의 발현은 세인트 주드 소아과 암 환자 코호트로부터의 T-ALL 환자에서 있었다. 도 11A: 게놈 재배열 및 유전자 발현 분석에 따른 세인트 주드 소아 연구 병원 혈액 암 코호트 내의 T-ALL 종양의 분자 아형분류는, PTCRA가 발달적으로 가장 원시적인, ETP-유사 아형을 제외하고는 대부분 T-ALL 아형에 걸쳐서 광범위하게 발현됨을 강조한다. T-ALL에서 PTCRA 발현은 NOTCH1 기능-획득 (gain-of-function; GoF) 돌연변이와 양성으로 회합되었다. 도 11B에서, PTCRA 발현을 세인트 주드 소아과 암 환자 코호트에 걸쳐서 NOTCH1 돌연변이 상태를 기준으로 하여 계층화한다. P-값을 원-웨이 분산 분석으로 계산하였다.
도 12는 사람 PTCRA에 mAb 클론 2F5 결합의 입증을 예시한다. 뮤린 섬유모세포 세포를 사람 PTCRA 및 재배열된 뮤린 Tcrb 유전자를 암호화하는 플라스미드로 공-형질감염시켰다. PTCRA 세포 표면 발현을 제조자의 프로토콜 후 Ptcra 표적화 2F5 mAb를 사용하여 유세포분석법으로 검정하였다.
도 13은 도 10A-10E에 기재된 일차 사람 악성 종양 샘플의 특징을 나열하는 표를 나타낸다.
도 14는 사람 PTCRA KO T-ALL 세포주 SupT1, HPB-ALL 및 Jurkat에서 PTCRA 발현의 효율적인 절제를 확인하는 웨스턴 블롯 분석을 제공한다. PTCRA를 2개의 별개의 CRISPR/Cas9 가이드 RNA (KO1, KO2) 및 대조군 (C) 가이드 RNA로 표적화하였다. 튜불린 발현을 로딩 대조군으로서 사용하였다.
도 15A-15D는 사람 T-ALL 세포주에서 PTCRA의 결실이 세포 증식을 상당히 손상시시킴을 예시한다. 도 15A의 경우, SupT1 (왼쪽), HPB-ALL (중간), 및 Jurkat (오른쪽) 세포주를 Cas9로 안정하게 형질도입하고, 이어서, 지시된 gRNA로 형질도입하였다. gRNA로 형질도입 후 증식을 정량화하였다. n=3, 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. 도 15B에서, 피하 이식된 야생형 SupT1 세포는 NSG 마우스에서 종양을 발달시킨 반면, PTCRA KO 세포를 갖는 SupT1 세포는 그렇지 않았다. n=3, 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. 도 15C에서, SRC-부류 키나제 억제제, PP1를 사용한 SupT1 세포 처리는, 용량-의존성 항-증식 반응을 유도하였다. n=5, 오차 막대 +/- s.d. 도 15D에서, SupT1 세포에서 LCK의 CRISPR/Cas9-매개 결실은 시험관내 증식을 강력하게 억제하였다 . n=3, 오차 막대는 +/- s.d.를 나타낸다.
도 16A-16I는 PTCRA-표적화 항체-약물 접합체가 생체내 및 시험관내에서 T-ALL 세포의 특이적 사멸을 유도함을 예시한다. 도 16A의 경우, mTALL 세포를 OP9-DLL1 영양세포층 상에 플레이팅하고, PTCRA mAb 또는 이소형 대조군 mAb으로 지시된 농도에서 처리하고, 이어서, 20nM 항-마우스 IgG Fc MMAE로 처리하였다. 세포 생존력을 처리 후 96h에 CellTiterGlo 검정으로 정량화하였다. n=4. 도 16B에서, PTCRA mAB 및 이소형 대조군 mAb는 강력한 미세관 억제제에 직접적으로 접합되었다. mTALL 세포를 OP9-DLL1 영양세포층 상에 플레이팅하고, 지시된 용량(dose)의 대조군-ADC 또는 PTCRA-ADC로 처리하였다. n=4. 도 16C의 경우, 다양한 악성 및 정상 사람 세포를 10nM PTCRA-ADC 또는 10nM 대조군-ADC로 처리하였다. 세포 생존력을 CellTiterGlo로 정량화하였다. n=3. 막대의 각각의 쌍의 왼쪽 막대 (T-ALL (SupT1), B-ALL (NALM6), AML (K562), 및 정상 T-세포에 대해 각각 1 쌍)는 대조군-ADC에 상응하고, 오른쪽 막대는 PTCRA-ADC에 상응한다. 도 16D에서, 100,000 일차 mTALL 세포를 NSG 마우스 내로 i.v. 주사하였다. 2일차에, 마우스를 종양 부하 (FACS, 말초 혈액)에 의해 무작위배정하고, PTCRA-ADC 또는 이소형 대조군-ADC로 처리하였다. 처리를 2일차, 6일차, 및 12일차에 수행하였다. 종양 부하를 14-일 종점에서 비장 질량으로 검정하였다. 도 16E의 경우, 치료 동안, 말초 혈액에서 종양 부하를 유세포분석법으로 모니터링하였다. 도트의 "컬럼" 각각의 쌍의 도트의 왼쪽 "컬럼" (0일차, 5일차, 12일차, 및 14일차에 대해 각각 1 쌍)은 대조군-ADC에 상응하고, 도트의 오른쪽 "컬럼"은 PTCRA-ADC에 상응한다. 도 16F는 도 16B의 결과를 수치 값과 함께 표 형식으로 제공한다. 도 16G는 도 16C의 결과를 수치 값과 함께 표 형식으로 제공한다. 도 16H는 도 16D의 결과를 수치 값과 함께 표 형식으로 제공한다. 도 16I는 16E의 결과를 수치 값과 함께 표 형식으로 제공한다.
도 17은 PTCRA-ADC로 처리된 마우스의 시간에 따른 체중을 도시한다.
도 18A 및 18B는 프리-TCR의 내재화 동역학을 예시한다. 도 18A에서, PTCRA를 내인성 발현하는 SupT1 세포를, 4℃에서 30 분 동안 항-PTCRA 항체 (적색)로 염색하고, 그 결과 세포는 37℃로 온도 이동하고, 온도 이동-후 지시된 시간에 이차적인 항체 (녹색)로 염색하였다. 이어서, 세포를 고정하고, 면역형광 공초점 현미경검사를 사용하여 PTCRA 국소화를 가시화하였다. PTCRA를 SupT1 세포의 세포 표면에서 0 분에 검출하지만, 신속하고 강건하게 내재화하여 경시적으로 시험하였다. 도 18B에서, SupT1 세포를 지시된 시간 기간 동안 번역 억제제, 사이클로헥스이미드로 처리하고, 이 시점에 당해 세포를 수거하고, 용해하고, 추출물을 면역블롯팅에 사용하였다. PTCRA는 신속하게 실험의 8h 시간 과정에 따라 신속하게 분해된다.
도 19A-19H는 PTCRA를 세포독성 항체-약물 접합체로 표적화하는 것이 시험관내 및 생체내 T-ALL 세포의 특이적 사멸을 촉진함을 나타낸다. 도 19A는 ADC 농도 증가에 대해 상대적 생존력을 선 그래프 형태로 나타낸다. 도 19B는 T-ALL (SupT1), B-ALL (NALM6), AML (K562), 및 정상 T-세포에서 가변적인 링커-페이로드에 대한 상대적 생존력을 막대 그래프 형태로 나타낸다. 도 19C는 대조군-MAYTL4PADC 대 PTCRA-MAYTL4PADC에 대해 이식-후 약 35 일 이하 동안 종양 용적을 선 그래프 형태로 나타낸다. 도 19D는 PBS 대 대조군-MAYTL4PADC 대 PTCRA-MAYTL4PADC에 대해 3 주차에 비장 중량을 도표 형태로 나타낸다. 도 19E는, PBS 대 대조군-MAYTL4PADC 대 PTCRA-MAYTL4PADC에 대해 1, 2, 및 3 주차에서 PB 중 백혈병 모세포 (%)를 도표 형태로 나타낸다. 도 19F는 1, 2, 및 3 주차에서 PBS 대 대조군-MAYTL4PADC 대 PTCRA-MAYTL4PADC에 대해 정상 T-세포 계수를 막대 그래프 형태로 나타낸다. 도 19G는 도 19A의 값을 표 형식으로 제공한다. 도 19H는 도 19B의 값을 표 형식으로 나타낸다.
정의
본원에 사용된 표현 프리 T-세포 항원 수용체 알파 (PTCRA) 등은, , 예를 들면, 서열번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 사람 프리 T-세포 항원 수용체 알파를 언급한다. 표현 "PTCRA"는 단량체성 및 다량체성 PTCRA 분자 둘 다를 포함한다. 본원에 사용된 표현 "단량체성 사람 PTCRA"는 임의의 다량체화 도메인을 포함하지 않거나 갖지 않고 정상 조건하에 또다른 PTCRA 분자에 직접적인 물리적 연결 없이 단일 PTCRA 분자로서 존재하는 PTCRA 단백질 또는 이의 부분을 의미한다. 본원에 사용된 표현 "이량체성 사람 PTCRA"는 링커, 공유 결합, 비-공유 결합을 통해, 또는 다량체화 도메인, 예를 들면, 항체 Fc 도메인을 통해 서로 연결된 2개의 PTCRA 분자를 포함하는 작제물을 포함한다.
사람 PCTRA 이소형 X1 (NCBI XP_024302110.1)의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
사람 PCTRA 이소형 2 전구물 (NCBI NP_612153.2)의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00002
더 짧은 이소형은 대부분의 세포외 도메인이 결핍되어 있다.
본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은, 달리 명시적으로 기술하지 않는 한, 비-사람 종에서 유래된 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 사람 버젼을 언급함을 의도한다. 따라서, 표현 "PTCRA"는, 달리 기술하지 않는 한, 비-사람 종에서 유래된 사람 PTCRA, 예를 들면, "마우스 PTCRA", "원숭이 PTCRA" 등을 의미한다.
본원에 사용된 표현 "세포 표면-발현된 PTCRA"는, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 표면 상에서 발현되어, 적어도 일부의 PTCRA 단백질이 세포 막의 세포외 면에 노출되고, 항체의 항원-결합 부분에 접근가능하게 되는, 하나 이상의 PTCRA 단백질(들), 또는 이의 세포외 도메인을 의미한다. "세포 표면-발현된 PTCRA"는 보통 PTCRA 단백질을 발현하는 세포의 표면 상에 발현되는 PTCRA 단백질을 포함하거나 이로서 이루어진다. 대안적으로, "세포 표면-발현된 PTCRA"는, 보통 이의 표면 상에 사람 PTCRA를 발현하지 않지만 합성으로 조작되어 이의 표면 상에 PTCRA를 발현하는, 세포의 표면 상에 발현되는 PTCRA 단백질을 포함하거나 이로서 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 표현 "항-PTCRA 항체"는 둘 다의 단일 특이성을 갖는 1가 항체, 뿐만 아니라 PTCRA에 결합된 첫번째 암(arm) 및 두번째 (표적) 항원에 결합된 두번째 암을 포함하는 이중특이적 항체 둘 다를 포함한다. 표현 "항-PTCRA 항체"는 치료제 (예를 들면, 약물 또는 독소, 즉, 세포독성제)에 접합된 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 표현 "항-PTCRA 항체"는 또한 방사성핵종에 접합된 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-방사성핵종 접합체 (ARCs)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 특정 항원 (예를 들면, PTCRA)에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합물을 의미한다. 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중 (H) 쇄 및 2개의 경 (L) 쇄, 뿐만 아니라 이의 다량체 (예를 들면, IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에 HCVR 또는 VH로서 축약됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에 LCVR 또는 VL로서 축약됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDRs)으로 칭명되는, 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있고, 프레임워크 영역 (FR)으로 칭명되는 더 보존적인 영역과 함께 배치될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되고, 하기 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단까지 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원 개시내용의 상이한 실시형태에서, 항-PTCRA 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 사람 생식세포계열 서열과 동일할 수 있거나, 천연으로 또는 합성적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 이상의 CDR의 사이드-바이-사이드 분석을 기반으로 하여 정의될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 또한 완전 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 항원에 특이적으로 결합하여 복합물을 형성하는 임의의 자연 발생, 효소에 의해 수득가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 임의의 적합한 표준 기술, 예를 들면, 단백질분해 소화 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현에 관련된 재조합 유전 공학 기술을 사용하는 완전 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되고/되거나, 예를 들면, 시판 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들면, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 용이하게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는 서열분석될 수 있고, 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 조작되어, 예를 들면, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인 적합한 배치로 배열하거나, 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 만들고, 아미노산 등을 변형, 추가 또는 결실시킬 수 있다.
항원-결합 단편의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단-쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역 (예를 들면, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예를 들면, CDR3 펩타이드), 또는 제약된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위. 다른 조작된 분자, 예를 들면, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-삭제 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아비디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예를 들면, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈 면역약제 (SMIPs), 및 샤크 가변 IgNAR 도메인도, 또한 본원에 사용된 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성물일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열과 인접하거나 이를 갖는 프레임인 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 서로에 대해 임의의 적합한 배열로 위치할 수 있다. 예를 들면, 가변 영역은 이량체성일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 포함한다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 링크된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본원 개시내용에 기재된 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는, 가변 및 불변 도메인의 비-제한적인, 예시적인 배치는 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 상기 열거된 예시적인 배치 중 어느 것을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 배치에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접적으로 링크될 수 있거나, 완전 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 링크될 수 있다. 힌지 영역은, 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 유연성 또는 세미-유연성 링크를 야기하는 적어도 2 (예를 들면, 5, 10, 15, 20, 40, 60 이상) 개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 게다가, 본원 개시내용에 기재된 항체의 항원-결합 단편은 서로와 및/또는 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 도메인과 (예를 들면, 디설파이드 결합(들)에 의한) 비-공유 회합에서 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 배치 중 어느 것의 호모-이량체 또는 헤테로-이량체 (또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
완전 항체 분자와 같이, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들면, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인를 포함할 것이고, 여기서, 각각의 가변 도메인은 별개의 항원에 또는 동일한 항원 상 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 기재된 이중특이적 항체 형식을 포함하는, 임의의 다중특이적 항체 형식은, 당해 기술분야에서 이용가능한 통상의 기술을 사용하여 본원 개시내용에서 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용을 위해 개조될 수 있다.
본원에 언급된 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 통해 기능할 수 있다. "보체-의존성 세포독성" (CDC)은 보체의 존재하에 본원 개시내용의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 언급한다. "항체-의존성 세포-매개 세포독성" (ADCC)은 세포-매개 반응을 언급하고, 여기서, Fc 수용체 (FcRs)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들면, 자연 킬러 (NK) 세포, 중성구, 및 대식세포)는 표적 세포 상 결합 항체를 인식하고, 이에 의해 표적 세포의 용해를 야기한다. CDC 및 ADCC를 당해 기술분야에 잘 공지되어 있고 이용가능한 검정을 사용하여 측정할 수 있다. (예를 들면, 문헌을 참조함: U.S. 특허 번호 5,500,362 및 5,821,337, 및 Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). 항체의 불변 영역은 항체가 보체를 고정하고, 세포-의존성 세포독성을 매개하는 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 이소형은 항체가 세포독성을 매개하는 것이 바람직한지 여부에 기초하여 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, ADC의 항-PTCRA 항체는 사람 항체이다. 본원에 사용된 용어 "사람 항체"는, 사람 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것을 의도한다. 본원 개시내용의 ADC의 사람 항체는 예를 들면 CDR 및 특히 CDR3에서 사람 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 위치-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이). 그러나, 본원에 사용된 용어 "사람 항체"는, 마우스와 같은 또다른 포유류 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이, 사람 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것을 의도하지 않는다.
본원 개시내용의 ADC의 항체는, 일부 실시형태에서, 재조합 사람 항체일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "재조합 사람 항체"는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 모든 사람 항체, 예를 들면, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체 (하기에 추가로 기재됨), 재조합, 조합 사람 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 (하기에 추가로 기재됨), 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자삽입된 동물 (예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체 (참조: 예를 들면, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 항체를 포함함을 의도한다. 이러한 재조합 사람 항체는 사람 생식세포계열 면역글로불린 서열에서 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 특정 실시형태에서, 그러나, 이러한 재조합 사람 항체를 시험관내 돌연변이유발에 적용하고 (또는, 사람 Ig 서열에 대한 유전자삽입 동물을 사용하는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발), 이에 따라, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식세포계열 VH 및 VL 서열에서 유래되고 이에 관련되지만, 사람 항체 생식세포계열 레퍼토리 생체내 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
사람 항체는 힌지 이질성(heterogeneity)과 회합되는 2개의 형태로 존재할 수 있다. 하나의 형태에서, 면역글로불린 분자는 대략 150-160 kDa의 안정한 4개-쇄 작제물을 포함하고, 여기서, 이량체는 쇄간 중쇄 디설파이드 결합에 의해 함께 유지된다. 두번째 형태에서, 이량체는 쇄-간 디설파이드 결합을 통해 링크되지 않고, 공유 커플링된 경쇄 및 중쇄 (반-항체)로 이루어진 약 75-80 kDa의 분자가 형성된다. 이들 형태는 친화도 정제 후조차도 분리하기가 극도로 어렵다.
다양한 무손상 IgG 이소형에서 두번째 형태의 출현 빈도는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 항체의 힌지 영역 이소형과 회합된 구조 차이에 기인한다. 사람 IgG4 힌지의 힌지 영역에서 단일 아미노산 치환은 두번째 형태의 출현을 사람 IgG1 힌지를 사용하여 전형적으로 관찰되는 수준까지 상당히 감소시킬 수 있다 (참조: Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105). 당해 개시내용은, 예를 들면, 목적하는 항체 형태의 수율을 향상시키기 위해 생산에서 바람직할 수 있는 힌지, CH2 또는 CH3 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함한다.
본원에 개시된 ADC의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에 사용된 "단리된 항체"는, 확인되고, 이의 천연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들면, 유기체의 적어도 하나의 성분으로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생성된 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체는, 본원 개시내용의 목적을 위한 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는 또한 재조합 세포 내에 동일계내 항체를 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계에 적용되는 항체이다. 특정 실시형태에 따라서, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는다.
본원에 개시된 ADC의 항-PTCRA 항체는, 항체가 유래되는 상응하는 생식세포계열 서열와 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들면, 공공 항체 서열 데이터베이스에서 이용가능한 생식세포계열 서열과 비교하여, 용이하게 확인할 수 있다. 본원 개시내용의 ADC는 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 중 어느 것에서 유래되는 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래되는 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 또다른 사람 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식세포계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다 (이러한 서열 변화는 본원에서 집합적으로 "생식세포계열 돌연변이"로 언급됨). 당해 기술분야의 숙련가는, 본원에 사용된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 이상의 개별적인 생식세포계열 돌연변이 또는 이의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 생산할 수 있다. 특정 실시형태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내 프레임워크 및/또는 CDR 잔기 모두는 항체가 유래되는 원래의 생식세포계열 서열에서 발견되는 잔기로 역-돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 단지 특정 잔기가 원래의 생식세포계열 서열로 역-돌연변이되고, 예를 들면, FR1의 첫번째 8개의 아미노산 내에 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에 발견되는 돌연변이된 잔기만이, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에 발견되는 돌연변이된 잔기 만이 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상이 상이한 생식세포계열 서열 (즉, 항체가 원래 유래되는 생식세포계열 서열과 상이한 생식세포계열 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 추가로, 본원 개시내용의 ADC의 항체는 예를 들면, 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식세포계열 돌연변이의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 여기서, 특정 개별적인 잔기는 특정 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 반면, 원래의 생식세포계열 서열과 상이한 특정 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 한번 수득되면, 하나 이상의 생식세포계열 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편은 하나 이상의 바람직한 성질, 향상된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 향상된 또는 개선된 길항적 또는 작용적 생물학적 성질 (경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편을 본원 개시내용에서 이용한다.
본원 개시내용은 또한 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 언급된 항체의 완전, HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것의 변종을 포함하는 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC를 포함한다. 예를 들면, 본원 개시내용은, 본원에 언급된 항체의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것에 비하여, 예를 들면, 10 이하, 8 이하, 6 이하, 4 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC를 포함한다.
용어 "에피토프"는 파라토프로서 공지된 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정인자를 언급한다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체형태 또는 선형일 수 있다. 입체형태 에피토프는 선형 폴리펩타이드 쇄의 상이한 세그먼트와 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 쇄에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생산되는 것이다. 특정 정황에서, 에피토프는 항원 상 삭카라이드의 모이어티, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹을 포함할 수 있다.
용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 핵산 또는 이의 단편을 언급하는 경우, 또다른 핵산 (또는 이의 상보적 가닥)와 함께 적합한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 갖고 최적으로 정렬되는 경우, 하기 논의된 바와 같이 잘 공지되어 있는 임의의 서열 동일성 알고리즘, 예를 들면, FASTA, 모세포 또는 Gap으로 측정하여, 적어도 약 95%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오티드 염기에서 뉴클레오티드 서열 동일성으로 존재함을 나타낸다. 참조 핵산 분자와 실질적으로 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정한 경우에, 참조 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일한 또는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용되는 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 2개의 펩타이드 서열이, 예를 들면, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 디폴트 갭 가중치(default gap weights)를 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 적어도 95% 서열 동일성, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않는 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 따라 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 그룹)를 갖는 또다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 실질적으로 단백질의 관능적 성질이 변화하지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 따라 서로 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성 또는 유사 정도는 치환의 보존적 성질을 바로 잡기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 생성하기 위한 수단은 당해 기술분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 참조로서 포함된 문헌을 참조한다 [참조: Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파라테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄는 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 다음과 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파라테이트, 및 아스파라긴-글루타민. 대안적으로, 보존적 치환은 본원에 참조로서 포함된 문헌[참조: Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445]에 기재된 PAM250 로그-공산 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간정도로 보존적인" 치환은 PAM250 로그-공산 매트릭스에서 비-음의 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로도 언급되는, 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은, 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 결실 및 다른 변형으로 배치된 유사성의 측정치를 사용하여 유사한 서열을 매칭한다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 디폴트 매개변수와 함께 사용하여 유기체의 상이한 종으로부터의 상동성 폴리펩타이드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩타이드 사이에 또는 야생형 단백질 및 이의 뮤테인 사이에 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정할 수 있는 Gap 및 Bestfit와 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들면, GCG 버젼 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한 디폴트 또는 추천되는 매개변수를 사용하는 FASTA, GCG 버젼 6.1에서의 프로그램을 사용하여 비교할 수 있다. FASTA (예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는 문의 서열 및 검색 서열 사이의 최고 오버랩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다 (참조: Pearson (2000) 상기함). 본원 개시내용의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스와 비교하는 경우 또다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 모세포, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들면, 문헌을 참조하고 [참조: Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402], 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
항-PTCRA 항체-약물 접합체
프리-T-세포 항원 수용체 알파 (PTCRA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)가 본원에 제공되고, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제한 없이, 세포독성제, 화학요법 약물, 면역조절 약물, 또는 방사성동위원소와 같은 치료학적 모이어티에 접합된다. .
일부 실시형태에서, 항체-약물-접합체는 하기 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
L은 링커이고;
Pay (또는, 페이로드)는 치료학적 모이어티이고;
n은 1 내지 10의 정수이다.
항체
본원에 제공된 항체-약물 접합체는 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
항-PTCRA 항체는, 일부 실시형태에서, 완전 사람 항체일 수 있다. 완전 사람 모노클로날 항체를 포함하는 모노클로날 항체를 생성하기 위한 방법이, 당해 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 이러한 공지된 방법을 본원 개시내용의 맥락에서 사용하여 사람 PTCRA에 특이적으로 결합하는 사람 항체를 만들 수 있다.
본원에 개시된 ADC에 포함된 항체는 전체-길이일 수 있거나 (예를 들면, IgG1 또는 IgG4 항체), 오직 하나의 항원-결합 부분 (예를 들면, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)을 포함할 수 있고, 관능성에 영향을 주도록 변형되어, 예를 들면, 잔류 이펙터 관능기를 제거할 수 있다 (참조: Reddy, et al. 200, J. Immunol. 164:1925-1933).
본원에 개시된 ADC에 사용된 항체는 PTCRA를 표적화한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC에 포함된 항-PTCRA 항체는 2F5 (BD Biosciences, 카탈로그 항목 번호 552407)이다.
공개 데이터베이스는 또한 항체 내의 CDR 서열을 확인하기 위해 이용가능하다.
본원 개시내용은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-약물 접합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않는 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형이 유용할 수 있거나, 예를 들면, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고삭카라이드 쇄 상에 존재하는 푸코스 모이어티 결핍 항체가 유용할 수 있다 (참조: Shield, et al. 2002 JBC 277:26733). 다른 적용에서, 갈락토실화의 변형은 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 변형시키기 위해 실행될 수 있다.
pH-의존성 결합
본원에 개시된 항체-약물 접합체는 pH-의존성 결합 특징을 갖는 항-PTCRA 항체를 이용할 수 있다. pH-의존성 결합 특징을 갖는 항체를, 예를 들면, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 특정 항원에 대해 감소된 (또는 향산된) 결합에 대해 항체의 집단을 스크리닝하여 수득할 수 있다. 게다가, 아미노산 수준에서 항원-결합 도메인의 변형은 pH-의존성 특징을 갖는 항체를 수득할 수 있다. 예를 들면, (예를 들면, CDR 내) 항원-결합 도메인의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환하여, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 항원 결합을 갖는 항체를 수득할 수 있다.
Fc 변종을 포함하는 항-PTCRA 항체
특정 실시형태에 따라서, 본원에 개시된 ADC에 포함된 항-PTCRA 항체는, 예를 들면, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 향상 또는 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 예를 들면, 본원 개시내용은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-PTCRA 항체를 포함하고, 여기서, 돌연변이(들)은 산성 환경 (예를 들면, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜에서)에서 FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기의 증가를 야기할 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비-제한적인 예는, 예를 들면, 위치 250 (예를 들면, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들면, L 또는 F); 252 (예를 들면, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들면, S 또는 T), 및 256 (예를 들면, S/R/Q/E/D 또는 T)에서 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (예를 들면, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들면, H/F 또는 Y)에서 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서 변형; 또는 위치 307 또는 308 (예를 들면, 308F, V308F), 및 434에서 변형을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형은 428L (예를 들면, M428L) 및 434S (예를 들면, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들면, V259I), 및 308F (예를 들면, V308F) 변형; 433K (예를 들면, H433K) 및 434 (예를 들면, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들면, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들면, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형 (예를 들면, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들면, 본원 개시내용은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PTCRA 항체를 포함한다: 250Q 및 248L (예를 들면, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (예를 들면, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (예를 들면, M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F (예를 들면, H433K 및 N434F). 상기한 Fc 도메인 돌연변이, 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합을 본원 개시내용의 범위 내인 것으로 고려한다.
항체의 생물학적 특징
본원 개시내용은 사람 PTCRA에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 결합은 표면 플라즈몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정으로 측정할 수 있다.
본원 개시내용은 높은 친화도로 단량체성 사람 PTCRA에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 본원 개시내용은 또한 높은 친화도로 이량체성/다량체성 사람 PTCRA에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다.
본원 개시내용은 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 PTCRA에 결합하고 Notch 신호전달을 차단하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 추가로 포함한다. 예를 들면, 본원 개시내용은, Notch 신호전달 차단 검정을 사용하여 측정하여, 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 Notch 신호전달을 차단하는 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 따라서, 본원 개시내용은 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 Notch 신호전달을 차단하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다.
본원 개시내용은, 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 PTCRA에 결합하지만 Notch 신호전달을 차단하지 않는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. Notch 신호전달 차단 검정 또는 실질적으로 유사한 검정에서 시험되었을 때, 항체가 차단 활성이 없거나 단지 무시할 수 있는 차단 활성을 나타내는 경우, 본원에 사용된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Notch 신호전달을 "차단하지 않는다". 특정 실시형태에 따라서, Notch 신호전달 차단 검정을 시험하였을 때, 항체가 약 10 nM 초과, 또는 약 100 nM 초과의 IC50 값을 나타내는 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은 Notch 신호전달을 "차단하지 않는다". 따라서, 일부 실시형태에서, 본원 개시내용은 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 Notch 신호전달을 차단하지 않는 항체-약물 접합체 (ADC)를 포함한다.
본원 개시내용은 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 PTCRA에 결합하고 프리-TCR 신호전달을 차단하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 예를 들면, 본원 개시내용은 프리-TCR 신호전달 차단 검정을 사용하여 측정되는 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 프리-TCR 신호전달을 차단하는 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 따라서, 본원 개시내용은 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 프리-TCR 신호전달을 차단하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다.
본원 개시내용은 또한 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 PTCRA에 결합하지만 프리-TCR 신호전달을 차단하지 않는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 프리-TCR 신호전달 차단 검정 또는 실질적으로 유사한 검정에서 시험되었을 때, 항체가 차단 활성이 없거나 단지 무시할 수 있는 차단 활성을 나타내는 경우, 본원에 사용된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 프리-TCR 신호전달을 "차단하지 않는다". 특정 실시형태에 따라서, 프리-TCR 신호전달 차단 검정에서 시험되었을 때 항체가 약 10 nM, 또는 약 100 nM 초과의 IC50 값을 나타내는 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은 프리-TCR 신호전달을 "차단하지 않는다". 따라서, 일부 실시형태에서, 본원 개시내용은 사람 PTCRA를 발현하는 세포에서 프리-TCR 신호전달을 차단하지 않는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함한다.
본원에 개시된 ADC에 포함되는 항체는 상기 언급된 생물학적 특징 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합을 가질 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 ADC는 상기 언급된 생물학적 특징 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합을 가질 수 있다. 상기된 목록의 항체의 생물학적 특징은 완전한 것으로 의도되지 않는다. 항체의 다른 생물학적 특징은 본원의 수행 실시예를 포함하는 본원 개시내용을 검토함에 따라 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
에피토프 맵핑 및 관련 기술
본원 개시내용의 ADC의 항체가 결합되는 에피토프는 PTCRA 단백질의 3개 이상 (예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 아미노산의 단일 연속 서열로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 PTCRA의 다수의 비-연속 아미노산 (또는 아미노산 서열)으로 이루어 질 수 있다.
당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지" 여부를 결정할 수 있다. 예시적인 기술은, 예를 들면, 통상의 교차-차단 검정, 예를 들면, 문헌 [참조: Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에 기재된 것, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석 (참조: Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), 및 펩타이드 절단 분석을 포함한다. 추가로, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법을 이용할 수 있다 (참조: Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있는 또다른 방법은 질량 분광에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적인 용어에서, 수소/중수소 교환 방법은 관심 대상 단백질을 중수소-표지화하고, 이어서, 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합함을 수반한다. 다음에, 단백질/항체 복합물은 물로 이동되어 수소-중수소 교환되는데 이는 항체에 의해 보호된 잔기 (이는 표지된-중수소이 남아있음)를 제외하고는 모든 잔기에서 발생한다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분광 분석에 적용되고, 이에 의해 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 드러낸다. 예를 들면, 문헌을 참조한다 [참조: Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A].
본원 개시내용은 본원에 기재된 특이적 예시적인 항체 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC를 추가로 포함한다. 또한, 본원 개시내용은 또한 PTCRA에 대한 결합에 대해 본원에 기재된 특이적 예시적인 항체 중 어느 것과 경쟁하는 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC를 포함한다.
당해 기술분야에 공지되고 본원에 예시된 통상의 방법을 사용하여 항체가 참조 항-PTCRA 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 이와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 시험 항체가 본원에 기재된 참조 항-PTCRA 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 참조 항체를 PTCRA 단백질에 결합시킨다. 다음에, 시험 항체가 PTCRA 분자에 결합하는 능력을 평가한다. 시험 항체가 참조 항-PTCRA 항체와의 포화 결합 후 PTCRA에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체가 참조 항-PTCRA 항체와 상이한 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 반면, 시험 항체가 참조 항-PTCRA 항체와 PTCRA 분자에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 본원에 기재된 참조 항-PTCRA 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합될 수 있다. 이어서, 추가 통상의 실험 (예를 들면, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 관찰된 시험 항체의 결합 결핍이 사실상 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지 여부 또는 입체 차단 (또는 또다른 현상)이 관찰된 결합 결핍의 원인이 되는지 여부를 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험을 ELISA, RIA, Biacore, 유세포분석법 또는 당해 기술분야에서 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행할 수 있다. 본원 개시내용의 특정 실시형태에 따라서, 경쟁 결합 검정 (예를 들면, 문헌을 참조함: Junghans, et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502)에서 측정되어, 예를 들면, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 초과의 하나의 항체가 다른 것의 결합을 적어도 50% 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일한 (또는 오버랩핑) 에피토프에 결합한다. 대안적으로, 2개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 2개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 단지 하나의 아집단이 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, "오버랩핑 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.
항체가 참조 항-PTCRA 항체와 결합에 대해 경쟁(또는 결합에 대해 교차-경쟁)하는지 여부를 결정하기 위해, 상기한 결합 방법론을 2개의 방향에서 수행한다: 첫번째 방향에서, 참조 항체는 포화 조건하에 PTCRA 단백질에 결합되고, 이어서, PTCRA 분자에 대한 시험 항체의 결합 검정. 두번째 방향에서, 시험 항체를 포화 조건하에 PTCRA 분자에 결합하게 하고, 이어서, PTCRA 분자에 대한 참조 항체의 결합 검정. 둘 다의 방향에서, 단지 첫번째 (포화) 항체만이 PTCRA 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체 및 참조 항체가 PTCRA에 대한 결합에 대해 경쟁한다는 결론을 짓는다. 당해 기술분야의 숙련가가 인식하고 있는 바와 같이, 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체가 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수 있지만, 오버랩핑 또는 인접한 에피토프에 결합하여 참조 항체의 결합을 입체 차단할 수 있다.
생물학적 등가물
항체-약물 접합체는 기재된 항체의 것과 다르지만 사람 PTCRA에 결합하는 능력을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 항-PTCRA 항체 및 항체 단편을 포함한다. 이러한 변종 항체 및 항체 단편은 모 서열과 비교하였을 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 기재된 항체와 본질적으로 등가인 생물학적 활성을 나타낸다. 또한, DNA 서열을 암호화하는-본원에 기재된 항-PTCRA 항체는, 개시된 서열과 비교하였을 때, 뉴클레오티드의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본원에 개시된 ADC에 포함되는 항-PTCRA 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적 등가물인 항-PTCRA 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변종 아미노산 및 DNA 서열은 상기에 논의되어 있다.
본원 개시내용에 따른 ADC에 포함되는 항-PTCRA 항체의 생물학적 등가물 변종은, 예를 들면, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 수행하여, 또는 생물학적 활성에 필요하지 않는 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시켜 작제될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산으로 대체되어 복원시 불필요한 또는 부정확한 분자내 디설파이드 브릿지의 형성을 예방할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적 등가물 항체는 항체의 글리코실화 특징을 변형하는 아미노산 변경을 포함하는 항-PTCRA 항체 변종, 예를 들면, 글리코실화를 제거하거나 없애는 돌연변이를 포함할 수 있다.
종 선택도 및 종 교차-반응성
본원 개시내용은, 특정 실시형태에 따라서, 사람 PTCRA에 결합하지만, 다른 종으로부터의 PTCRA에는 결합하지 않는 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다. 본원 개시내용은 또한 사람 PTCRA에 결합하고 하나 이상의 비-사람 종으로부터의 PTCRA에 결합하는 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-약물 접합체를 포함한다. 예를 들면, 본원에 개시된 ADC는 사람 PTCRA에 결합하는 항-PTCRA 항체를 포함할 수 있고, 사례가 존재하는 경우, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시노몰구스, 마모셋, 붉은털원숭이 또는 침팬지 PTCRA 중 하나 이상에 결합될 수 있거나 결합될 수 없다. 특정한 예시적인 실시형태에 따라서, 본원에 개시된 ADC는 사람 PTCRA 및 시노몰구스 원숭이 (예를 들면, Macaca fascicularis) PTCRA에 특이적으로 결합하는 항-PTCRA 항체를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 다른 ADC는 사람 PTCRA에 결합하지만, 시노몰구스 원숭이 PTCRA에 결합하지 않거나 단지 약하게 결합하는 항-PTCRA 항체를 포함할 수 있다.
치료학적 모이어티
본원에 제공된 항체-약물 접합체 (ADCs)는 치료학적 모이어티에 접합된 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료학적 모이어티는 세포독성제, 화학요법 약물, 면역조절 약물, 또는 방사성동위원소이다.
세포독성제는 세포의 성장, 생존력 또는 증식에 해로운 임의의 제제를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 튜불린-상호작용제 및 DNA-손상제를 포함한다. 본원 개시내용의 이러한 양상에 따른 항-PTCRA 항체에 접합될 수 있는 적합한 세포독성제 및 화학요법제의 예는, 예를 들면, 1-(2클로로에틸)-1,2-디메탄설포닐 하이드라지드, 1,8-디하이드록시-바이사이클로[7.3.1]트리데카-4,9-디엔-2,6-디인-13-온, 1-디하이드로테스토스테론, 5-플루오로우라실, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 9-아미노 캄프토테신, 악티노마이신 D, 아마니틴, 아미노프테린, 안구이딘, 안트라사이클린, 안트라마이신 (AMC), 아우리스타틴, 블레오마이신, 부설판, 부티르산, 칼리케아미신 (예를 들면, 칼리케아미신 γ1), 캄프토테신, 카미노마이신, 카르무스틴, 세마도틴, 시스플라틴, 콜키신, 콤브레타스타틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시토칼라신 B, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데카바진, 디아세톡시펜틸독소루비신, 디브로모만니톨, 디하이드록시 안트라신 디온, 디소라졸, 돌라스타틴 (예를 들면, 돌라스타틴 10), 독소루비신, 두오카르마이신, 에키노마이신, 엘류테로빈, 에메틴, 에포틸론, 에스페라미신, 에스트라무스틴, 에티듐 브로마이드, 에토포사이드, 플루오로우라실, 겔다나마이신, 그라미시딘 D, 글루코코르티코이드, 이리노테칸, 키네신 방추 단백질 (KSP) 억제제, 렙토마이신, 류로신, 리도카인, 로무스틴 (CCNU), 메이탄시노이드, 메클로르에타민, 멜팔란, 머캅토푸린, 메토프테린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, N8-아세틸 스페르미딘, 포도필로톡신, 프로카인, 프로프라놀롤, 프테리딘, 푸로마이신, 피롤로벤조디아제핀 (PBDs), 리족신, 스트렙토조토신, 탈리소마이신, 탁솔, 테노포사이드, 테트라카인, 티오에파 클로르암부실, 토메이마이신, 토포테칸, 투불리신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈노렐빈, 및 상기한 것 중 어느 것의 유도체를 포함한다. 특정 실시형태에 따라서, 항-PTCRA 항체에 접합된 세포독성제는 메이탄시노이드이다. 추가 실시형태에 따라서, 메이탄시노이드는 DM1 또는 DM4, 토메이마이신 유도체, 또는 돌라스타틴 유도체이다. 또한 추가 실시형태에 따라서, 메이탄시노이드는 DM1이다. 특정 실시형태에 따라서, 항-PTCRA 항체에 접합된 세포독성제는 아우리스타틴이다. 추가 실시형태에 따라서, 아우리스타틴은 MMAE, MMAF, 또는 이의 유도체이다. 또한 추가 실시형태에 따라서, 아우리스타틴은 MMAE이다. 당해 기술분야에 공지된 다른 세포독성제는 본원 개시내용의 범위 내인 것으로 고려되고, 예를 들면, 단백질 독소, 예를 들면, 리신, C. 디피실 독소, 슈도모나스 외독소, 리신, 디프테리아 독소, 보툴리눔 독소, 브리오딘, 사포린, 포크위드 독소 (즉, 피토라카톡신 및 피토라시제닌), 및 다른 것들, 예를 들면, 문헌 [참조: Sapra, et al., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138:452-469]에 기재된 것들을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 세포독성제는 투불리신이다. 또다른 실시형태에서, 세포독성제는 PBD이다.
일부 실시형태에서, 세포독성제는 아우리스타틴이다.
일부 실시형태에서, 세포독성제는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이다.
일부 실시형태에서, 세포독성제는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)이다.
일부 실시형태에서, 세포독성제는 하기와 같다:
Figure pct00003
특정 실시형태에서, 세포독성제는 메이탄시노이드, 예를 들면, 메이탄신의 유도체이다. 적합한 메이탄시노이드는 DM1, DM4, 또는 이의 유도체, 입체이성체s, 또는 동위원소를 포함한다. 적합한 메이탄시노이드는 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만, 이의 전문이 본원에 참조로서 포함되는 WO 2014/145090A1, WO 2015/031396A1, US 2016/0375147A1, 및 US 2017/0209591A1에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00004
여기서, A는 임의로 치환된 아릴렌 또는 헤테로아릴렌이다.
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00005
여기서, A는 임의로 치환된 아릴렌 또는 헤테로아릴렌이다.
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00006
여기서, n은 1-12의 정수이고, R1은 알킬이다.
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
Figure pct00012
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
Figure pct00013
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
Figure pct00014
(MAYT3").
MAYT3의 제조 방법은 US 특허 번호 US 10,570,151 B2에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
Figure pct00015
본원 개시내용은 또한 하나 이상의 방사성핵종에 접합된 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-방사성핵종 접합체 (ARCs)를 포함한다. 본원 개시내용의 이러한 양상의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 방사성핵종은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 225 Ac, 212 Bi, 213Bi, 131I, 186Re, 227Th, 222Rn, 223Ra, 224Ra, 및 90Y를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료학적 모이어티는 <3000, <2000, <1000, 또는 <900 달톤이다.
특정 실시형태에서, 링커를 통해 치료학적 모이어티 (예를 들면, 상기 개시된 세포독성제 중 어느 것)에 접합된 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC가 본원에 제공된다. 링커는 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단백질과 치료학적 모이어티, 예를 들면, 세포독성제를 링크하거나, 연결하거나, 결합하는 임의의 그룹 또는 모이어티이다. 적합한 링커는, 예를 들면, 문헌 [참조: Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins; Phillips, G. L., Ed.; Springer Verlag: New York, 2013; Antibody-Drug Conjugates; Ducry, L., Ed.; Humana Press, 2013; Antibody-Drug Conjugates; Wang, J., Shen, W.-C., and Zaro, J. L., Eds.; Springer International Publishing, 2015]에서 발견할 수 있고, 이들 각각의 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 일반적으로, 본원에 기재된 항체 접합체를 위해 적합한 링커는 항체의 순환하는 반감기를 이용하기 위해 충분히 안정하고, 동시에 접합체의 항원-매개 내재화 후 이의 페이로드를 방출할 수 있는 것들이다. 링커는 절단성 또는 비-절단성일 수 있다. 절단성 링커는 내재화 후 세포내 대사에 의해, 예를 들면, 가수분해, 환원, 또는 효소 반응을 통한 절단에 의해 절단되는 링커를 포함한다. 비-절단성 링커는 내재화 후 항체의 리소좀 분해를 통해 부착된 페이로드를 방출하는 링커를 포함한다. 적합한 링커는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 산-불안정성 링커, 가수분해-불안정성 링커, 효소 절단성 링커, 환원 불안정성 링커, 자가-희생(self-immolative) 링커, 및 비-절단성 링커를 포함한다. 적합한 링커는 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만, 펩타이드, 글루쿠로나이드, 석신이미드-티오에테르, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 단위, 하이드라존, mal-카프로일 단위, 디펩타이드 단위, 발린-시트룰린 단위, 및 파라-아미노벤조일 (PAB) 단위이거나 이를 포함하는 것들을 포함한다.
링커
당해 기술분야에 공지된 임의의 링커 또는 링커 기술을 사용하여 본원 개시내용의 ADC를 만들거나 작제할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 절단성 링커이다. 다른 실시형태에 따라서, 링커는 비-절단성 링커이다. 본원 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 링커는, 예를 들면, MC (6-말레이미도카프로일), MP (말레이미도프로파노일), val-cit (발린-시트룰린), val-ala (발린-알라닌), 프로테아제-절단성 링커에서 디펩타이드 위치, ala-phe (알라닌-페닐알라닌), 프로테아제-절단성 링커에서 디펩타이드 위치, PAB (p-아미노벤조일옥시카보닐), SPP (N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트), SMCC (N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카복실레이트), SIAB (N-석신이미딜 (4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트), 및 이의 변종 및 조합을 포함하거나 이로서 이루어진 링커를 포함한다. 본원 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 링커의 추가 예는, 예를 들면, US 7,754,681 및 문헌[참조: Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21:5-13], 및 본원에 인용된 참조문헌에 제공되고, 이들의 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 특정 실시형태에서, 링커는 MC이다.
특정 실시형태에서, 링커는 생리학적 조건하에서 안정하다. 특정 실시형태에서, 링커는 절단성이고, 예를 들어, 적어도 페이로드 부분을 효소의 존재하에 또는 특정 pH 범위 또는 값에서 방출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 효소-절단성 모이어티를 포함한다. 예시적인 효소-절단성 모이어티는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 펩타이드 결합, 에스테르 링크, 하이드라존, 및 디설파이드 링크를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 카텝신-절단성 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 비-절단성 모이어티를 포함한다.
적합한 링커는 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만, 단일 결합제, 예를 들면, 항체의 2개의 시스테인 잔기에 화학적으로 결합된 것들을 포함한다. 이러한 링커는 접합 과정의 결과로서 붕괴된 항체의 디설파이드 결합을 모방하는 역할을 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 적합한 아미노산은 천연, 비-천연, 표준, 비-표준, 단백질생성, 비-단백질생성, 및 L- 또는 D- α-아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 알라닌, 발린, 글리신, 류신, 이소류신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 또는 시트룰린, 이의 유도체, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산의 하나 이상의 측쇄는 하기한 바와 같이 측쇄 그룹에 링크된다. 일부 실시형태에서, 링커는 발린 및 시트룰린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 라이신, 발린, 및 시트룰린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 라이신, 발린, 및 알라닌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 발린 및 알라닌을 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 자가-희생 그룹을 포함한다. 자가-희생 그룹은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 그룹일 수 있다. 특정 실시형태에서, 자가-희생 그룹은 p-아미노벤조일 (PAB), 또는 이의 유도체이다. 유용한 유도체는 p-아미노벤조일옥시카보닐 (PABC)을 포함한다. 당해 기술분야의 숙련가는 자가-희생 그룹이 페이로드로부터 링커의 잔류 원자를 방출하는 화학 반응을 수행할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본원 개시내용은 ADC를 포함하고, 여기서, 링커는 항-PTCRA 항체를 약물 또는 세포독소에 항체 또는 항원-결합 분자 내에 특정 아미노산에서 부착을 통해 연결된다. 이러한 양상의 맥락에서 사용할 수 있는 예시적인 아미노산 부착, 예를 들면, 라이신 (예를 들면, 문헌을 참조함: US 5,208,020; US 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; US 5,714,586; US 2013/0101546; 및 US 2012/0585592), 시스테인 (예를 들면, 문헌을 참조함: US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; 및 US 7,750,116), 셀레노시스테인 (예를 들면, 문헌을 참조함: WO 2008/122039; 및 Hofer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456), 포밀 글리신 (예를 들면, 문헌을 참조함: Carrico, et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51, 및 Rabuka, et al., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067), 비-천연 아미노산 (예를 들면, 문헌을 참조함: WO 2013/068874, 및 WO 2012/166559), 및 산성 아미노산 (예를 들면, 문헌을 참조함: WO 2012/05982). 링커는 또한 탄수화물 (예를 들면, 문헌을 참조함: US 2008/0305497, WO 2014/065661, 및 Ryan, et al., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13:127-130) 및 디설파이드 링커 (예를 들면, 문헌을 참조함: WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, 및 Shaunak, et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313)로의 부착을 통해 항원-결합 단백질에 접합될 수 있다. 위치-특이적 접합 기술을 또한 항체 또는 항원 결합 단백질의 특정 잔기로의 직접 접합에 이용할 수 있다 (예를 들면, 문헌을 참조함: Schumacher, et al. J Clin Immunol (2016) 36(Suppl 1): 100). 위치-특이적 접합 기술은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 트랜스글루타미나제를 통한 글루타민 접합 (예를 들면, 문헌을 참조함: Schibli, Angew Chemie Inter Ed. 2010, 49 ,9995)을 포함한다.
특정 실시형태에 따라서, 본원 개시내용은 ADC를 제공하고, 여기서, 본원에 기재된 항-PTCRA 항체는 이의 전문이 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공보 WO2014/145090 (예를 들면, 하기 도시된 화합물)에 기재된 링커-약물 조성물에 접합된다:
Figure pct00016
따라서, 일부 실시형태에서, 항체-약물-접합체는 하기 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 항-PTCRA 항체이고;
L은 링커이고;
Pay는 치료학적 모이어티이고;
n은 1 내지 10의 정수이다.
특정 실시형태에서, L는 비-절단성 링커이다.
특정 실시형태에서, Pay는 메이탄시노이드이다. 특정 실시형태에서, Pay는 DM1 또는 이의 유도체이다. 특정 실시형태에서, Pay는 다음과 같다:
Figure pct00017
특정 실시형태에서, Pay는 아우리스타틴이다. 특정 실시형태에서, Pay는 MMAE이다. 특정 실시형태에서, Pay는 MMAF이다.
특정 실시형태에서, 링커-페이로드 (L-Pay)는 다음과 같다:
Figure pct00018
일부 실시형태에서, 링커-페이로드 (L-Pay)는 다음과 같다:
Figure pct00019
일부 실시형태에서, 링커-페이로드 (LPay)는 다음과 같다:
Figure pct00020
일부 실시형태에서, n은 1-6이다. 일부 실시형태에서, n은 1-5이다. 일부 실시형태에서, n은 1이다. 일부 실시형태에서, n은 2이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다. 일부 실시형태에서, n은 4이다. 일부 실시형태에서, n은 5이다.
일부 실시형태에서, MAYT2LP를 포함하는 항체-약물 접합체를 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하기 구조를 갖는 화합물에 접촉시켜 제조한다:
Figure pct00021
일부 실시형태에서, MAYT3LP를 포함하는 항체-약물 접합체를 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하기 구조를 갖는 화합물에 접촉시켜 제조하고, 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로서 포함되는, US 공보 번호 2018/0134794 A1에 기재된 방법을 포함한다:
Figure pct00022
(MAYT3LPINT).
일부 실시형태에서, MAYT4LP를 포함하는 항체-약물 접합체를 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하기 구조를 갖는 화합물에 접촉시켜 제조한다:
Figure pct00023
본원에 기재된 항체-약물 접합체를 당해 기술분야의 숙련가에 공지된 접합 조건을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들면, 문헌을 참조함: Doronina, et al., Nature Biotechnology, 2003, 21, 7, 778, 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다). 일부 실시형태에서, 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC를 항-PTCRA 항체를 목적하는 링커 및 세포독성제를 포함하는 화합물과 접촉하여 제조하고, 여기서, 상기 링커는, 예를 들면, 항체 또는 항원-결합 단백질의 목적하는 잔기에서 항체 또는 항원-결합 단백질과 반응성인 모이어티를 갖는다.
특정 실시형태에 따라서, 본원 개시내용은 ADC를 제공하고, 여기서, 본원에 기재된 항-PTCRA 항체는 2014년 3월 14일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US14/29757에 기재된 링커-약물 조성물 (예를 들면, 화합물 "7")에 접합되고, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
화학적 모이어티를 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 다른 거대분자에 접합시키기 위한 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법은 본원에 기재된 항-PTCRA ADC를 제조하기 위해 본원 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다. 링커를 통한 항체-약물 접합을 위한 예시적인 방법은 본원 실시예 7에 기재된다. 이러한 예시적인 방법의 변형은 당해 기술분야의 숙련가가 인식할 수 있고, 본원 개시내용의 범위 내인 것으로 고려된다.
액체 크로마토그래피-질량 분광에 의한 접합체의 특성화
항체-약물-접합체 (ADC)를 특성화하고, 이의 효능을 측정하는 매개변수는, 제한 없이, 이의 구조, 안정성, 약물 대 항체 비 (DAR), 및 페이로드 분포를 포함한다. DAR은 ADC의 유의한 품질 매개변수이고, 항체에 접합된 약물 분자의 평균 수로서 제시된다. 낮은 약물 로딩이 효능을 감소시키는 반면, 높은 약물 로딩이 약동학 (PK)1 및 독성에 부정적으로 영향을 줄 수 있기 때문에, DAR 값은 약물의 효능에 영향을 준다. DAR을, 예를 들면, 자외선-가시광선 (UV/Vis) 분광계, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 역상 고-성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC), 전기분무 이온화 질량 분광과 커플링된 액체 크로마토그래피 (LC-ESI-MS), 및 LC-MS를 사용하여 측정할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체 상 링커-페이로드의 로딩을 측정하기 위해, 접합체를 탈글리코실화하고, LC-MS로 분석한다.
검정을 위해, 50 μg의 접합체를 milli-Q 물을 사용하여 1 mg/mL의 최종 농도로 희석한다. 10 μL의 PNGase F 용액 [PNGase F 용액은 150 μL의 PNGase F 스톡 (New England Biolabs, Cat#P0704L) 및 850 μL의 milli-Q 물을 첨가하고 웰을 혼합하여 제조한다]을 희석된 접합체 용액에 첨가하고, 이어서, 37℃에서 밤새 인큐베이팅한다. 5 μL의 각각의 샘플의 주사를 LC-MS (Waters Synat G2-Si) 상에서 제조하고, 0.1 mL/분의 구배 이동상 20-40%으로 25 분에 걸쳐서 용리하였다 (이동상 A: H2O 중 0.1%v/v FA; 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% v/v FA). LC 분리를 Waters Acquity BEH C4 컬럼 (1.0 X 50 mM, 1.7 μM) 상에서 80℃에서 성취한다.
질량 분광 스펙트럼을 Masslynx 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션하고(deconvoluted), 약물 대 항체 비 (DAR)를 하기 식을 사용하여 계산한다:
1. 분포 피크 강도 (PI)에 의한 약물 (Dn)의 상대적 퍼센트 (%):
Dn% = PIn /∑(PI0+PI1+PI2……+PIi)×100
(n= 0,1,2,3,…,i)
2. 평균 DAR 계산:
DAR=∑(1×D1%+2×D2%+3×D3%+……+i×Di%)
특정 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC의 약물-항체 비 (DAR)는 약 1 내지 약 30이다. 또다른 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC의 DAR은 약 1 내지 약 8이다. 또다른 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC의 DAR은 약 1 내지 약 6이다. 또다른 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC의 DAR은 약 1 내지 약 5이다. 또다른 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC의 DAR은 약 1 내지 약 4이다. 또다른 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC의 DAR은 약 2 내지 약 4이다. 또다른 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC의 DAR 약 1 또는 약 2 또는 약 3 또는 약 4 또는 약 5 또는 약 6 또는 약 7 또는 약 8 또는 약 9 또는 약 10 또는 약 11 또는 약 12 또는 약 13 또는 약 14 또는 약 15 또는 약 16 또는 약 17 또는 약 18 또는 약 19 또는 약 20 또는 약 21 또는 약 22 또는 약 23 또는 약 24 또는 약 25 또는 약 26 또는 약 27 또는 약 28 또는 약 29 또는 약 30이다.
ADC를 PTCRA를 발현하는 세포에 표적화함
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 세포독성제에 접합된 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC는 PTCRA를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화 할 수 있고, 사멸시킬 수 있다. 특이적으로, 세포독성제에 접합된 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC는 T-ALL 세포를 특이적으로 표적화 할 수 있고, 사멸시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC는 약 1 pM 내지 약 10 nM의 IC50으로 T-ALL 세포를 사멸시킨다. 추가 실시형태에서, ADC는 약 1 nM 내지 약 10 nM의 IC50으로 T-ALL 세포를 사멸시킨다.
일부 실시형태에서, PTCRA 발현을 유세포분석법을 통해 백혈병 T 세포 상에서 검출할 수 있다. 추가 실시형태에서, PTCRA 발현은 정상, 성숙 T-세포 상에서 검출할 수 없다.
본원 실시예 7에서, 다음을 나타낸다: i) PTCRA-표적화 마우스 mAb로 일차 PTCRA+ 뮤린 T-ALL (mTALL) 세포의 처리, 이어서, 비-절단성 링커를 통한 미세관 억제제 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)로 링크된 항-마우스 IgG-Fc로 처리는, mTALL 세포의 강건한 사멸을 야기하지만, 대조군-처리된 세포에서는 사멸을 야기하지 않는다 (도 16A); 또는 ii) 미세관 억제제 (MAYT2)에 비-절단성 링커 (PTCRA-ADC, 그러나 대조군-ADC는 아님)를 통해 직접적으로 접합된 PTCRA-표적화 mAb는 낮은 나노몰 범위로 IC50을 갖는 백혈병 세포의 용량-의존성 사멸을 촉진시킨다 (도 16B). PTCRA-ADC는 사람 SupT1 T-ALL 세포의 사멸을 선택적으로 유도하지만, B-ALL (NALM6) 및 AML (K562) 세포주의 생존력에 영향을 주지 않았음을 주의한다 (도 16C). 추가로, PTCRA-ADC 처리는 정상, 말초 T 세포의 생존력에 영향이 없고, 이의 선택적 발현 패턴과 일치하였다.
매우-공격적인, 파종성 T-ALL 생체내 모델에서, PTCRA-ADC로 처리된 T-ALL-을 갖는 마우스는 말초 혈액 및 비장 둘 다에서 대조군-ADC 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 감소된 종양 부하를 나타내었다 (도 16D 및 16E). 따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 항-PTCRA 항체를 포함하는 세포독성 ADC로 T-ALL 세포를 표적화하는 것이 정상 T 세포를 피하게 해주면서 종양 세포를 특이적으로 근절할 수 있다는 것을 발견하였다.
비교적 낮은 용량 (약 1 nM 내지 약 10 nM)의 세포독성제에 접합된 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC는 T-ALL 세포를 특이적으로 표적화하고 사멸시키는데 충분한 것으로 본원에 나타났다 (도 16B).
따라서, 본원 개시내용은 세포독성제에 접합된 사람 PTCRA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 제공하고, 여기서, ADC는 효과적으로 T-ALL 세포를 사멸시킨다. 본원 개시내용의 이러한 양상에 따른 방법은, 세포를 세포독성제에 접합된 항-PTCRA 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)와 접촉시킴을 포함한다. "세포를 접촉함"은, 예를 들면, 항-PTCRA ADC를 이를 필요로 하는 대상자에게 투여하여 시험관내, 또는 생체내에서 수행될 수 있고, 여기서, 투여는 ADC를 PTCRA를 발현하는 세포, 특이적으로, T-ALL 세포와 접촉하도록 한다.
본원에 사용된 "효과적인 사멸(effective killing)"은 종양 세포 사멸 검정, 예를 들면, 본원 실시예 7에 정의된 검정, 또는 실질적으로 유사한 검정에서 ADC가 약 20 nM 미만, 또는 약 10 nM 이하 (예를 들면, 약 9 nM 이하, 약 8 nM 이하, 약 7 nM 이하, 약 6 nM 이하, 약 5 nM 이하, 또는 약 4 nM 이하)의 IC50을 나타낸다는 것을 의미한다. 본원 개시내용의 이러한 양상에 따라서, ADC의 항-PTCRA 항체 성분은 본원에 기재된 것들을 포함하는 임의의 항-PTCRA 항체일 수 있다. 게다가, ADC의 세포독성제 성분은 임의의 세포독성제, 예를 들면, DM1, 또는 임의의 본원에 언급된 다른 세포독성제일 수 있다.
본원 개시내용의 ADC는 PTCRA+ 종양-을 갖는 동물에서 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 크기를 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 본원 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 항-PTCRA ADC는 T-ALL 종양을 갖는 마우스에서 종양을 상당히 감소시키는 것을 나타났다. 따라서, 본원 개시내용은 이러한 항-PTCRA 항체를 포함하는 ADC를 포함하고, 여기서, ADC는, PTCRA+ 종양-을 갖는 동물에게 투여하는 경우, 투여-후 12일차까지 또는 더 이르게 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 크기를 감소시킨다 (예를 들면, 100% 이상의 종양 성장 억제).
치료학적 제형 및 투여
본원 개시내용은 본원에 개시된 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCs)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 향상된 이동, 전달, 내성 등을 제공하는 적합한 담체, 부형제, 및 다른 제제와 함께 제형화한다. 다수의 적합한 제형을 모든 약제학 화학자에게 공지된 의약품집에서 발견할 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이들 제형은, 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포 함유 지질 (양이온성 또는 음이온성) (예를 들면, LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스 (다양한 분자 중량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카보왁스 함유 반-고체 혼합물을 포함한다. 또한 문헌을 참조한다 [참조: Powell, et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311].
환자에게 투여되는 ADC의 용량은 환자의 연령 및 사이즈, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 좌우되어 변할 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라서 계산한다. 성인 환자에서, 본원 개시내용의 ADC를 보통 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내 투여하는 것이 유리하다. 상태의 중증도에 좌우되어, 치료 빈도 및 기간을 조정할 수 있다. ADC를 투여하기 위한 효과적인 투여량(dosages) 및 일정은 실험적으로 측정할 수 있고; 예를 들면, 환자 진행을 주기적인 검정으로 모니터링할 수 있고, 이에 따라 용량을 조정할 수 있다. 게다가, 투여량의 종간 비례축소를 당해 기술분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들면, 참조: Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용할 수 있고, 예를 들면, 리포좀 중 피막형성, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 엔도시토시스 (예를 들면, 문헌을 참조함: Wu, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). 도입 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 및 경구 경로를 포함한다. 조성물을 임의의 통상의 경로로, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사로, 상피 또는 점막피부 내막 (예를 들면, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)를 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다.
본원 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 약제학적 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 시린지, 바이알, 펜 전달 장치, 자기주사기, 또는 마이크로인퓨저로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용기에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서, 시린지 또는 펜 전달 장치는 예비-충전될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이알은 유리 바이알일 수 있다. 본원 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 ADC 또는 약제학적 조성물은 피하 또는 정맥내로 표준 니들 및 시린지를 사용하여 전달될 수 있다. 추가로, 피하 전달에 대하여, 펜 전달 장치는 용이하게 본원 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 ADC 또는 약제학적 조성물의 전달에서 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용할 수 있거나 일회용일 수 있다. 재사용할 수 있는 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 포함하는 교체가능한 카트리지를 이용한다. 카트리지 내 약제학적 조성물 전부가 투여되고, 카트리지가 비게 되면, 빈 카트리지를 용이하게 폐기할 수 있고, 약제학적 조성물을 포함하는 새로운 카트리지로 교체할 수 있다. 이어서, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에서, 교체가능한 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내 저장소에 유지되는 약제학적 조성물로 예비충전되어 있다. 저장소에 약제학적 조성물가 비게 되면, 전체 장치를 폐기한다.
다수의 재사용할 수 있는 펜 및 자기주사기 전달 장치를 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 피하 전달에서 적용한다. 이의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 몇가지만 언급하자면, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜 (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II 및 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany)을 포함한다. 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만. 몇가지만 언급하자면, SOLOSTAR™ 펜 (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICKTM 자기주사기 (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), 및 HUMIRATM 펜 (Abbott Labs, Abbott Park IL)을 포함한다.
특정 상황에서, 본원 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 ADC 또는 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 펌프를 사용할 수 있다 (참조: Langer, 상기함; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). 또다른 실시형태에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다 (참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida). 또한 또다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 조성물의 표적 근처에 위치할 수 있고, 이에 따라서, 단지 전신 용량의 일부가 필요하다 (예를 들면, 참조: Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, 상기함, vol. 2, pp. 115-138). 다른 제어 방출 시스템은 문헌 (참조: Langer, 1990, Science 249:1527-1533)의 검토에서 논의된다.
주사가능한 제제는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 투여량 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사가능한 제제를 공개적으로 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 주사가능한 제제를, 예를 들면, 상기한 항체 또는 이의 염을 주사용으로 통상 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들면, 생리식염수, 글루코스 함유 등장성 용액 및 다른 보조제 등이 있고, 이는 적합한 가용화제, 예를 들면, 알콜 (예를 들면, 에탄올), 폴리알콜 (예를 들면, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 [예를 들면, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소화 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 mol) 부가물)] 등과 함께 조합하여 사용할 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들면, 참기름, 대두유 등이 사용되고, 벤조일 벤조에이트, 벤조일 알콜 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용될 수 있다. 이에 따라 제조된 주사는 바람직하게는 적합한 앰풀에 채운다.
일부 실시형태에서, 상기한 경구 또는 비경구 사용을 위한 약제학적 조성물을 활성 성분의 용량을 맞추는데 적절한 단위 용량의 투여량 형태로 제조한다. 이러한 단일 용량의 투여량 형태는, 예를 들면, 정제, 알약, 캡슐, 주사 (앰풀), 좌제 등을 포함한다. 포함되는 상기한 ADC의 양은 일반적으로 단위 용량에서 투여량 형태당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사의 형태에서, 상기한 항체는 다른 투여량 형태의 경우 약 5 내지 약 100 mg 및 약 10 내지 약 250 mg으로 포함되는 것이 바람직하다.
치료학적 용도
본원 개시내용은 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 포함하는 치료학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여함을 포함한다. 치료학적 조성물은 본원에 개시된 ADC 중 어느 것 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본원 개시내용의 ADC는 그 중에서도, PTCRA 발현 또는 활성과 연관되거나 이에 의해 매개되거나, PTCRA 및 또다른 분자 간의 상호작용을 차단하거나 그렇지 않으면 PTCRA 활성 및/또는 신호전달을 억제하고/하거나 수용체 내재화를 촉진시키고/시키거나 세포 표면 수용체 수를 저하시켜 치료가능한 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선에 유용하다. 하나의 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC는 그 중에서도, T-ALL의 치료, 예방 및/또는 개선에 유용하다. 예를 들면, 본원 개시내용의 ADC는 PTCRA를 발현하고/하거나 Notch- 또는 프리-TCR-매개 신호전달에 반응하는 종양, 예를 들면, T-ALL 종양의 치료에 유용하다. 본원 개시내용의 ADC는 또한 뇌 및 뇌척수막, 입인두, 폐 및 기관지나무, 위장관, 남성 및 여성 생식수관, 근육, 뼈, 피부 및 부속기관, 결합 조직, 비장, 면역체계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 요로, 및 특수 감각 기관, 예를 들면, 눈에서 발생하는 일차 및/또는 전이성 종양을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 개시내용의 ADC는 하기한 암 중 하나 이상을 치료하기 위해 사용한다: 신장 세포 암종, 췌장 암종, 두경부 암, 전립선 암, 악성 신경아교종, 골육종, 결장직장 암, 위 암, 악성 중피종, 다발 골수종, 난소 암, 소 세포 폐 암, 비-소 세포 폐 암, 윤활막 육종, 갑상선 암, 유방 암, 또는 흑색종.
본원에 기재된 치료 방법의 맥락에서, 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 ADC는 단일요법으로서 (즉, 단독 치료제로서) 또는 하나 이상의 추가 치료제 (이의 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다)와 병용하여 투여할 수 있다.
본원 개시내용은 환자의 하나 이상의 조직, 예를 들면, 종양 조직에서 높은 수준의 PTCRA 발현에 대해 검정하여 본원에 개시된 ADC로 치료가능한 환자를 확인하는 방법을 포함한다. 관련된 실시형태에서, 본원 개시내용은 PTCRA, 예를 들면, T-ALL의 고-수준 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법을 포함한다. 예를 들면, 본원 개시내용은 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 ADC를 종양을 갖는 대상자에게 투여함을 포함하는 치료 방법을 포함하고, 여기서, 종양은 PTCRA를 발현하는 것으로 확인되었다. 특정 실시형태에서, 종양은 생검 샘플의 면역조직화학 또는 다른 영상화 기술, 예를 들면, 면역-PET 영상화 등에 의해 PTCRA를 발현하는 것으로 확인된다. 특정 실시형태에서, FACS (양성 또는 음성) 및 RNA 서열분석의 조합을 사용하여 PTCRA가 발현되는지 아닌지를 측정한다. 추가 실시형태에서, 발현에 대한 양성 세포는 >5 RPKM을 나타낸다.
병용 요법 및 제형
본원 개시내용은 본원에 기재된 ADC 중 어느 것을 하나 이상의 추가 치료학적 활성 성분과 병용하여 포함하는 조성물 및 치료학적 제형, 및 이러한 병용물을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여함을 포함하는 치료 방법을 포함한다.
본원 개시내용의 ADC는: EGFR 길항제 (예를 들면, 항-EGFR 항체 [예를 들면, 세툭시맙 또는 파니투무맙] 또는 EGFR의 소 분자 억제제 [예를 들면, 게피티닙 또는 에를로티닙]), 또다른 EGFR 부류 구성원, 예를 들면, Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4의 길항제 (예를 들면, 항-ErbB2 [예를 들면, 트라스투주맙 또는 T-DM1 {KADCYLA®}], 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 소 분자 억제제), EGFRvIII의 길항제 (예를 들면, EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체), PTCRA 길항제 (예를 들면, 또다른 항-PTCRA 항체), IGF1R 길항제 (예를 들면, 항-IGF1R 항체), B-raf 억제제 (예를 들면, 베무라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α 억제제 (예를 들면, 항-PDGFR-α 항체), PDGFR-β 억제제 (예를 들면, 항-PDGFR-β 항체 또는 소 분자 키나제 억제제, 예를 들면, 이마티닙 메실레이트 또는 수니티닙 말레이트), PDGF 리간드 억제제 (예를 들면, 항-PDGF-A, -B, -C, 또는 -D 항체, 압타머, siRNA 등), VEGF 길항제 (예를 들면, VEGF-Trap, 예를 들면, 아플리베르셉트, 예를 들면, US 7,087,411을 참조함 (또한 본원에 "VEGF-억제 융합 단백질"로서 언급됨), 항-VEGF 항체 (예를 들면, 베바시주맙), VEGF 수용체의 소 분자 키나제 억제제 (예를 들면, 수니티닙, 소라페닙 또는 파조파닙)), DLL4 길항제 (예를 들면, US 2009/0142354에 개시된 항-DLL4 항체, 예를 들면, REGN421), Ang2 길항제 (예를 들면, US 2011/0027286에 개시된 항-Ang2 항체, 예를 들면, H1H685P), FOLH1 길항제 (예를 들면, 항-FOLH1 항체), STEAP1 또는 STEAP2 길항제 (예를 들면, 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP2 항체), TMPRSS2 길항제 (예를 들면, 항-TMPRSS2 항체), MSLN 길항제 (예를 들면, 항-MSLN 항체), CA9 길항제 (예를 들면, 항-CA9 항체), 우로플라킨 길항제 (예를 들면, 항-우로플라킨 [예를 들면, 항-UPK3A] 항체), MUC16 길항제 (예를 들면, 항-MUC16 항체), Tn 항원 길항제 (예를 들면, 항-Tn 항체), CLEC12A 길항제 (예를 들면, 항-CLEC12A 항체), TNFRSF17 길항제 (예를 들면, 항-TNFRSF17 항체), LGR5 길항제 (예를 들면, 항-LGR5 항체), 1가 CD20 길항제 (예를 들면, 1가 항-CD20 항체, 예를 들면, 리툭시맙) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가 치료학적 활성 성분(들)과 조합하여 공-제형화 및/또는 투여될 수 있다. 본원 개시내용의 ADC과 병용하여 유리하게 투여할 수 있는 다른 제제는, 예를 들면, 타목시펜, 아로마타제 억제제, 및 사이토킨 억제제, 사이토킨, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, 또는 이들의 각각의 수용체에 결합된 소-분자 사이토킨 억제제 및 항체를 포함한다.
본원 개시내용은 본원에 기재된 ADC 중 어느 것을 포함하는 조성물 및 치료학적 제형을 하나 이상의 화학요법제와 병용하여 포함한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 사이클로스포스파미드 (Cytoxan™); 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카보퀸, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로르암부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들면, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀄라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충물, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀸; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK™; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀸; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들면, 파클리탁셀 (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (Taxotere™; Aventis Antony, France); 클로르암부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 빈노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기한 것 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 예를 들면 타목시펜, 랄록시펜, 4(5)-이미다졸을 억제하는 아로마타제, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (Fareston)을 포함하는 항-에스트로겐; 및 항-안드로겐, 예를 들면, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드, 및 고세렐린; 및 상기한 것 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 항-호르몬제가 또한 이러한 정의에 포함된다.
본원 개시내용의 ADC는 또한 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 산소, 항산화제, COX 억제제, 심장보호제, 금속 킬레이트제, IFN-감마, 및/또는 NSAID와 병용하여 투여되고/되거나 공동-제형화될 수 있다.
추가 치료학적 활성 성분(들), 예를 들면, 상기 열거된 제제 중 어느 것 또는 이의 유도체는, 본원 개시내용의 ADC의 투여 직전에, 동시에, 또는 직후에 투여할 수 있고; (본원 개시내용의 목적을 위해, 이러한 투여 용법은 추가 치료학적 활성 성분"과 병용된" 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 ADC의 투여를 고려한다). 본원 개시내용은 본원 개시내용의 ADC이 본원의 다른 곳에 기재되어 있는 추가 치료학적 활성 성분(들) 중 하나 이상과 공동-제형화되는 약제학적 조성물을 포함한다.
투여 용법
본원 개시내용의 특정 실시형태에 따라서, 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)의 다중 용량 (또는 ADC를 포함하는 약제학적 조성물)를 대상자에게 한정된 시간 과정에 걸쳐서 투여할 수 있다. 본원 개시내용의 이러한 양상에 따른 방법은 본원 개시내용의 다중 용량의 ADC 또는 조성물을 대상자에게 연속하여 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 "연속하여 투여함"은 ADC 또는 조성물의 각각의 용량을 대상자에게 상이한 시점에서, 예를 들면, 미리 결정된 간격 (예를 들면, 시간, 일, 주 또는 개월)으로 분리되는 다른 날에 투여함을 의미한다. 본원 개시내용은 ADC 또는 조성물의 단일 초기 용량, 이어서, ADC 또는 조성물의 하나 이상의 이차 용량, 및 임의로 이어서, ADC 또는 조성물의 하나 이상의 삼차 용량을 환자에게 연속하여 투여함을 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "초기 용량", "이차 용량", 및 "삼차 용량"은, 본원 개시내용의 ADC 또는 조성물의 투여의 시간 순서를 언급한다. 따라서, "초기 용량"은 치료 용법 시작에서 투여되는 용량이고 (또한 "기준선 용량"으로 언급됨); "이차 용량"은 초기 용량 후 투여되는 용량이고; "삼차 용량"은 이차 용량 후 투여되는 용량이다. 초기, 이차, 및 삼차 용량은 모두 동일한 양의 ADC 또는 조성물을 포함할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도의 면에서 서로 다를 수 있다. 특정 실시형태에서, 그러나, 초기, 이차 및/또는 삼차 용량에 포함되는 ADC 또는 조성물의 양은 치료 과정 동안 서로 다르다 (예를 들면, 적합하게 상향 또는 하향 조정됨). 특정 실시형태에서, 2회 이상의 (예를 들면, 2, 3, 4, 또는 5회) 용량을 치료 용법 시작에서 "로딩 용량"으로 투여하고, 이어서, 더 적은 빈도 기준으로 투여되는 후속 용량 (예를 들면, "유지 용량")을 투여한다.
본원 개시내용의 특정한 예시적인 실시형태에서, 각각의 이차 및/또는 삼차 용량을 바로 앞 선행 용량 후 1 내지 26 (예를 들면, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ 이상) 주에 투여한다. 본원에 사용된 구절 "바로 앞 선행 용량"은, 개재 용량 없이 순서로 바로 다음 용량의 투여 전에 환자에게 투여되는, 다중 투여의 순서의, ADC 또는 조성물의 용량을 의미한다.
본원 개시내용의 이러한 양상에 따른 방법은 항-PTCRA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 ADC 또는 ADC를 포함하는 조성물의 임의의 횟수의 이차 및/또는 삼차 용량을 환자에게 투여함을 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 오직 하나의 단일 이차 용량이 환자에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 2회 이상 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상)의 이차 용량이 환자에게 투여된다. 또한, 특정 실시형태에서, 오직 하나의 단일 삼차 용량이 환자에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 2회 이상 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상)의 삼차 용량이 환자에게 투여된다. 투여 용법을 특정 대상자의 수명 동안, 또는 이러한 치료가 더 이상 치료학적으로 필요하지 않거나 유리하지 않을 때까지 무기한적으로 수행할 수 있다.
다중 이차 용량에 관한 실시형태에서, 각각의 이차 용량을 다른 이차 용량과 동일한 빈도로 투여할 수 있다. 예를 들면, 각각의 이차 용량을 바로 앞 선행 용량 후 1 내지 2 주 또는 1 내지 2 개월에 환자에게 투여할 수 있다. 유사하게, 다중 삼차 용량에 관한 실시형태에서, 각각의 삼차 용량을 다른 삼차 용량과 동일한 빈도로 투여할 수 있다. 예를 들면, 각각의 삼차 용량을 바로 앞 선행 용량 후 2 내지 12 주에 환자에게 투여할 수 있다. 본원 개시내용의 특정 실시형태에서, 이차 및/또는 삼차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 용법의 과정에 걸쳐서 변할 수 있다. 투여 빈도는 또한 치료 과정 동안 의사에 의해 임상 시험 후 개별적인 환자의 필요에 따라 조정될 수 있다.
본원 개시내용은, 2 내지 6회의 로딩 용량을 첫번째 빈도 (예를 들면, 1주 1회, 2 주마다 1회, 3 주마다 1회, 1개월 1회, 2 개월마다 1회 등)로 환자에게 투여하고, 이어서, 2개 이상의 유지 용량을 덜 빈번한 기준으로 환자에게 투여하는, 투여 용법을 포함한다. 예를 들면, 본원 개시내용의 이러한 양상에 따라서, 로딩 용량이 1개월 1회의 빈도로 투여되는 경우, 유지 용량을 6 주마다 1회, 2 개월마다 1회, 3 개월마다 1회 등으로 환자에게 투여할 수 있다.
실시예
당해 기술분야의 숙련가에게 본원 개시내용의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시내용 및 기술을 제공하기 위해 하기 실시예를 제시하고, 본 발명의 발명자가 이들의 개시내용으로 고려한 것의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다. 사용되는 수치 (예를 들면, 양, 온도 등)에 대한 정확도를 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차를 감안하여야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자 중량은 평균 분자 중량이고, 온도는 섭씨온도이고, 압력은 대기압 또는 대략 대기압이다.
실시예에 사용되는 물질 및 방법은 하기와 같다:
가슴샘 이식 수술 및 수령자 분석
신생아 공여자 마우스로부터 단일 가슴샘 엽을 상기 기술된 바와 같이 숙주 마우스의 왼쪽 신장의 끝(poles)에 수술로 생착하였다. 간단하게, 작은 절개를 마취된 숙주 동물의 복막 강에서 수행하고, 왼쪽 신장을 노출시켰다. 미세해부 겸자 및 입체현미경을 사용하여, 공여자 동물로부터의 단일 가슴샘 엽을 신장 캡슐하에 위치시켰다. 이어서, 상처를 수술 봉합사 및 봉합기를 사용하여 닫고; 마우스를 건강 상태에 대해 통상적으로 모니터링하였다. 모든 마우스 실험을 Institutional Animal Care and Research Advisory Committee의 승인하에 Regeneron Pharmaceuticals에서 수행하였다.
마우스
6- 내지 8-주령 Rag2-/- γc-/- BALB/c (BRG) 마우스를 Taconic로부터 구입하고, 가슴샘 이식 실험에서 수령자 숙주로서 사용하였다. 공여자 가슴샘 엽을 Taconic로부터 구입한 C57BL6/6NTac 마우스로부터 또는 Velocigene® Technology를 사용하여 Regeneron에서 생성한 Ptcra-/- 또는 Notch3-/- 마우스로부터 단리하였다.
유세포분석법 분석
조직을 수거하고, 단일 세포 현탁액을 PBS 중에서 3% 소태아 혈청과 함께 제조하였다. 항체 염색 및 FACS 분석을 표준 프로토콜에 따라서 수행하였다. Biolegend 또는 BD Biosciences로부터의 하기한 모노클로날 항체 (mAbs)를 사용하였다: 항-mCD45 (30-F11), 항-mCD4 (RM4-5), 항-mCD8a (53-6.7), 항-mCD44 (IM7), 항-mCD25 (PC61), 항-mPTCRA (2F5), 항-mNOTCH1 (mN1A 및 HMN1-12) 및 항-mNotch3 (HMN3-133). 항체를 FITC, PE, PerCPCy5.5, PECy7, APC, APC-Alexa Fluor 700, 및 Pacific blue로 직접적으로 커플링하였다. 데이터를 BD Fortessa 상에서 획득하고, FlowJo로 분석하였다.
엑솜-서열분석 및 데이터 분석
전체 엑솜 포획을 Agilent Sure-Select Mouse All Exon 50 Mb 키트, 이어서, Illumina HiSeq 2000 플랫폼 상 100 bp 쌍대-말단 서열분석을 사용하여 수행하였다. 판독 정렬 및 프로세싱을 ArrayStudio에 내장된 OSA 얼라이너를 사용하여 수행하였다. 평균적으로, 대략 8 천만 판독을 각각의 샘플에 대해 수행하고, 65% 넘게 표적 상에 맵핑하고, 이는 더 많은 20x 판독 적용범위 깊이를 갖는 80%의 표적을 제공한다. 사용되는 컷오프(cutoffs)로 불리는 돌연변이 (작은 삽입 및 결실을 포함함)는 다음과 같았다: 둘 다의 가닥으로부터 적어도 10% 변종 대립유전자 빈도 및 적어도 5 변종 판독. 파이프라인의 완벽한 세부사항을 www.arrayserver.com/wiki/에서 온라인에서 발견할 수 있다. 체세포 카피 수 변이 패턴을 전체 엑솜 서열분석 (WES) 데이터로 암(arm)-수준에서 평가하였다. DNA가 종양 샘플 및 매칭된 정상에 대한 정렬 인풋 (BAM 파일)을 판독하면, ArrayStudio (www.omicsoft.com; www.arrayserver.com)에 내장된 VarScan2 기능을 이용하여 판독 적용범위 깊이 비 (log2Ratio)를 계산하고 카피 수 상태를 요약하였다. 염색체당 모든 100kb 슬라이딩 윈도우에 대한 평균 log2Ratio 값을 ArrayStudio에서 Segment Chromosome View를 사용하여 표시하였다. DKO 비장으로부터 하나의 정상 샘플은 DKO 균주 배경 상 생성된 모든 종양에 대해 대조군으로서 역할을 하였다.
세포주 및 성장 조건
SupT1, HPB-ALL, 및 Jurkat는 ATCC 및 DSMZ로부터 입수한 사람 T-ALL 세포주이다. 세포를 공급자의 추천에 따라 제형화된 기본 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 세포를 3 x 105 세포/mL의 밀도로 시딩하고, 2 x 106 세포/mL 미만의 밀도를 유지하기 위해 정기적으로 계대접종하였다. CRISPR 실험을 위해, 세포주를 Cas9-발현 렌티바이러스 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 Cas9로 안정하게 형질도입하였다. 이어서, 세포를 대조군 또는 PTCRA-표적화 gRNAs (Sigma-Aldrich)를 사용하여 형질도입하였다. 형질도입을 제조자의 제시된 프로토콜에 따라 수행하였다. 녹아웃을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
RNA-서열분석 및 데이터 분석
총 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라서 KAPA Biosystems의 KAPA Stranded mRNA-Seq 키트를 사용하여 mRNA 라이브러리로 전환시켰다. 라이브러리를 Illumina HiSeq 2000 상 100 bp 쌍대-말단 판독으로 서열분석하였다. 판독 맵핑, 유전자 발현 정량화, 및 융합 전사의 확인을 ArrayStudio 소프트웨어에서 계산한다. 7천5백만 판독을 평균적으로 85%의 고유한 맵핑 속도로 각각의 샘플에 대해 생성하였다.
공개 데이터세트의 분석
사람 T-ALL에서 PTCRA의 발현을 RNA 발현 데이터가 공개적으로 이용가능한 2개의 독립적인 데이터세트에서 시험하였다. 첫번째 데이터세트, 세인트 주드 소아암 조혈 악성종양 데이터세트는, 2,224 소아과로부터 종양 세포 및 다른 분자 표현형의 및 B-ALL, AML, T-ALL 및 MLL 징후로부터 청소년 환자 샘플의 RNA-서열분석으로 구성된 게놈 데이터베이스이다. 샘플은 세인트 주드 - WashU 소아과 암 게놈 프로젝트, 효과적인 치료를 생성하기 위한 치료학적으로 이용가능한 조사 (Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments; TARGET) 프로젝트 및 상하이 아동 의료 센터 소아과 ALL 프로젝트로부터 유래된다. 소아 암을 유발하는 분자 변화를 측정하기 위해 포괄적(comprehensive) 게놈 접근을 적용하려는 노력의 일부이다. 데이터는 다음에서 접급한다: www.stjude.cloud/data.html. 이러한 데이터세트로부터 RNA-seq 데이터를 OSA (Omicsoft Aligner)와 함께 정렬된 Omicsoft Array Studio Land 데이터 분석 파이프라인을 통해, Ensembl 유전자 모델을 갖는 Human Genome Build B38로 처리하고, 이어서, RSEM 기반 EM 알고리즘을 기반으로 계수를 유도하였다. 계수를 RPKM (백만 맵핑된 판독당 전사의 킬로베이스당 판독)으로 전환하였다. 유전자-수준 및 엑손 연접부 정량화 둘 다를 생성하였다. T-ALL 샘플의 하위유형에 의한 분류는, 문헌 [참조: Liu, et al. (2017 Nat Genet 49:1211-1218)]에 기재된 RNA-seq 유전자 발현 데이터의 계층적 클러스터화, 게놈 변경 및 전사 인자의 발현에 따른다.
사람 T-ALL에서 PTCRA 발현의 특이성을 시험하기 위해 사용되는 두번째 공개적으로 이용가능한 데이터세트는 마이크로어레이 분석으로 백혈병 및 림프종을 갖는 2,096명의 환자 소아과 및 성인 환자의 전체-게놈 발현 프로파일을 시험한 탐색의, 후향 I기 연구이었다 (참조: Haferlach, et al. 2010 J Clin Oncol 28:2529-2537). 발현을 54,675 리포터에 걸쳐서 19,574 유전자의 발현을 측정한 Human Genome U133 Plus 2.0 Array 상에서 정량화하였다. PTCRA에 대한 발현 데이터 (Reporter IS: 211252_x_at)를 Oncomine에서 다운로드하고, Prism 7에서 처리하고, 분석하였다.
사람 세포주에서 PTCRA의 발현을 하기에 접근하여 Cancer Cell Line Encyclopedia으로부터 입수하였다: portals.broadinstitute.org/ccle. 데이터세트는 다중 종양 유형에 걸쳐서 1,457 세포주에 대한 RNA-서열분석 데이터로 구성되어 있다. 서열분석은 Broad Institute for the Cancer Cell Line Encyclopedia에 의해 수행되었다. 데이터 세트에서 모든 세포주에 걸친 PTCRA에 대한 발현 데이터를 CCLE로부터 다운로드하고, Prism 7에서 처리하고, 분석하였다.
환자 샘플의 분석
골수 및 말초 혈액 샘플을 임상시험수탁기관을 통해 급성 백혈병을 갖는 환자로부터 전향적으로 수집하였다. 모든 샘플을 일치를 위한 국제 협회의 양호한 임상적 실행 가이드라인(Good Clinical Practice guidelines of the International Council for Harmonization)에 기재된 정규 요구사항에 따라서 각각의 환자의 서면, 동의서로 수득하였다.
실시예 1. 자발적인 T-ALL 모델에서β-선택 체크포인트 인자의 상향조절
뮤린 T-ALL을 면역결핍, 성인 Rag2-/-IL2Rγc-/- 숙주의 신장 캡슐하에 신생아 야생형 마우스에서 유래된 단일 가슴샘 엽을 이식하여 생성하였다. 마우스는 높은 침투율 및 대략 25 주의 신생물 질환까지 중앙값 시간을 갖는 종양을 발병하고, 이는 공개된 결과와 일치하였다 (참조: Martins, et al. 2014 Nature 509:465-470). 이러한 모델에서 발생된 백혈병 질환을 비장비대, 모세포 세포의 골수로의 침윤 및 높은 빈도의 기능-획득 Notch1 돌연변이를 포함하는 사람 T-ALL의 주요 특징을 광범위하게 개괄한다 ("Therapeutic targeting of Notch signaling and immune checkpoint blockade in a spontaneous, genetically-heterogeneous mouse model of T-cell acute lymphoblastic leukemia," Gao, et al., 2019 Disease Models and Mechanisms). 이들 자발적인 종양의 전사체를 T-ALL 종양-침윤된 비장을 갖는 마우스를 비-종양의 비장을 갖는 마우스와 비교하여 RNA-서열분석으로 분석하였다. T-ALL 사례에서 Dntt, Rag1 및 Rag2를 포함하는 가슴샘세포 발달의 다중 마커의 강력한 차등 발현을 관찰하였고, 대조군 비장 조직 또는 정제된 말초 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 비교하였다 (도 1A; 도 2). 다음을 포함하는 β-선택 체크포인트와 연관된 유전자의 강력한 상향조절이 또한 관찰되었다: Ptcra (369-배), Notch3 (46-배) 및 Notch1 (3.3-배) (도 1A-1D). T-ALL 모세포에서 이들 3개의 유전자의 세포 표면 발현을 유세포분석법으로 확인하였다 (도 1E-1G). β-선택 체크포인트가 가슴샘세포 발달에서 주요 단계이기 때문에, 체크포인트를 교차하기 위해 요구되는 인자의 상향조절은 당해 동물 T-ALL 모델에서 백혈병유발에 기여할 수 있다.
실시예 2. Ptcra KO 마우스에서 저지된 가슴샘세포 발달
Notch1은 정준 T-ALL 종양유전자이고 (참조: Grabher, et al. 2006 Nat Rev Cancer 6:347-359); 유전자삽입 마우스 모델은 또한 T-ALL에서 Ptcra 및 Notch3에 대한 역할을 제시하였다 (참조: Bellavia, et al. 2002 PNAS 99:3788-3793; Bellavia, et al. 2000 EMBO J 19:3337-3348; dos Santos, et al. 2007 Blood 109:3972-3981). 보다 생리학적으로 관련된 모델에서 이들 후자 유전자가 백혈병유발에 기여하는지 여부를 설명하기 위해, Ptcra-/- 및 Notch3-/- 유전자-표적화된 마우스를 제작하고, 이들 동물로부터의 가슴샘 엽을 이식 연구에서 사용하였다. Ptcra-/- 및 Notch3-/- 마우스를 프레임 내의 β-갈락토시다제 유전자를 각각의 유전자의 첫번째 코딩 엑손 내로 삽입하여 생성하였다. 신생아 Ptcra-/- 마우스는 가슴샘 형성저하증을 발달시켰다 (도 3A) (참조: Fehling, et al. 1995 Nature 375:795-798; Mancini, et al. 1999 J Immunol 163:6053-6059). 이들 마우스의 면역프로파일링은 대체로 CD4+CD8+ DP 세포가 없는 가슴샘세포 구획을 나타내고, 대부분 가슴샘세포는 DN3 기에서 저지되었다 (도 3B 및 3C). RT-PCR 분석은, Notch3, Hes1, Dtx1, Hes5 및 Notch1을 포함하는 야생형 대조군에 비해, Ptcra-/- 가슴샘에서 정준 DN3 유전자의 강력한 발현을 나타내었다. 유사하게, Cd4 및 Cd8을 포함하는 DP 마커의 강력한 하향조절을 관찰하였다 (도 3D). Ptcra-/- 마우스에서 이러한 가슴샘 표현형은 성인기까지 부분적으로 역전되었다 (도 4A 및 4B). Notch3-/- 마우스에 대해 두드러지는 가슴샘 표현형이 관찰되지 않았다 (도 5). 따라서, T-ALL의 백혈병유발에서 프리-TCR (주요 DN3에서 DN4로의 전이 인자)의 역할은 입증되었다.
실시예 3. Ptcra의 유전적 절제는 현저하게 손상된 T-ALL 발달을 야기한다
백혈병유발에 미치는 프리-T 세포 수용체 신호전달의 손실의 효과를 평가하기 위해, 신생아 Ptcra-/- 마우스의 가슴샘을 이식하였다. Ptcra-/- 신생아에서 감소된 가슴샘 세포질을 차지하기 위해, 2개의 엽을 각각의 이식에서 사용하였다. Ptcra-/- 가슴샘을 Rag2-/- IL2Rγ-/- 숙주에서 효율적으로 이식하고, 말초 T 세포 수준의 종적인 모니터링으로 평가하였다 (도 6). 야생형 대조군과 비교하여, Ptcra-결핍 가슴샘은 백혈병유발을 유도하는 현저하게 감소된 능력을 나타내었다. 전반적인 질환 침투는 상당히 저하되고, 신생물 질환까지 중앙값 시간은 52-주 내에 도달하지 않았다 (야생형 대조군의 경우 25 주에 비해, HR = 0.249) (도 7A). 이들 이식에서 공여자로서 사용된 Ptcra-/- 가슴샘 엽의 수 (8개 이하의 엽)의 증가는 백혈병유발의 효율을 변화시키지 않고, 이는 야생형 및 Ptcra-/- 공여자 가슴샘 사이의 세포질의 차이가 T-ALL 발달에서 이들 차이를 유도하지 않았음을 나타낸다 (도 7A).
가끔 발생하는 Ptcra-/- 백혈병 질환은 야생형 종양과 면역표현형이 비슷하고, 유사하지만, 약간 덜 확연한 성질의 급성 개시를 나타내었다 (도 7B; 데이터는 나타내지 않음). 이들 종양의 분자 프로파일링은, 정준 T-ALL 종양유전자, Notch1에서 재발되는 돌연변이를 포함하는, 야생형 종양과 대체로 일치하는 돌연변이 스펙트럼을 나타내었다 (하기 표 1).
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게다가, 일련의 재발되지만, 드물게 보고되는, T-ALL 관련 돌연변이를 관찰하고, 다음을 포함한다: Fat1, Ddx3x, Ptpn11 및 Ikzf1 (표 1) (참조: Liu, et al. 2017 Nat Genet 49:1211-1218; Molteni, et al. 2010 Leukemia 24:232-235). Ptcra-결핍 종양의 유전자 발현 프로파일링은, 야생형 T-ALL 종양에 대해, 60개의 차등 발현된 유전자를 나타내었다. 이러한 유전자 발현 시그니처는, DN에서 DP로의 전이에 연루된 유전자의 강력한 하향-조절 및 조기 T 세포 전구체-유사 (ETP) ALL에서 풍부한 다중 유전자의 상향조절에서 주목할만하였고 (참조: Zhang, et al. 2012 Nature 481:157-163), Ppbp, Cd93, Lyl1, Dhrs 및 Pim1을 포함하고, 가슴샘세포 발달의 초기 단계, 예를 들면, Ikzf2 및 Id3는, Ptcra-결핍 종양에 대한 조기 발달 표현형을 나타내었다 (도 7C).
Notch3 돌연변이는 사람 T-ALL에 대한 문헌에서 보고되었고 (참조: Martins, et al. 2014 Nature 509:465-470), Notch3은 많은 부분의 사람 T-ALL 사례에서 과발현된다 (도 8A). 게다가, 기능-획득 Notch3 돌연변이를 보유하지만 Notch1에 대해 야생형을 보유하는 사람 T-ALL 세포주를 감마-세크레타제 억제제로 처리하는 것은 세포 증식을 손상시킨다는 것을 발견하였다 (도 8B). 그러나, Ptcra의 결실에 대조적으로, Notch3-/- 가슴샘 이식은 저하된 백혈병유발을 야기하지 않았고, 사실상, 야생형 대조군 가슴샘과 유사한 효율로 T-ALL을 발생시켰다 (도 9). 종양발생 Notch3 신호전달에 대한 임의의 잠재적 역할은 Notch1 기능-획득 돌연변이를 발달시키는 뮤린 시스템의 경향에 의해 감춰질 수 있다 (참조: Ashworth, et al. 2010 Blood 116:5455-5464). Notch3-/- 종양에서, 다중 리간드-비의존성 Notch1 돌연변이는 T-ALL의 백혈병유발을 유도하는데 충분한 것으로 관찰하였다 (데이터는 나타내지 않음).
따라서, Ptcra 결핍은 백혈병유발을 유도하는 현저하게 감소된 능력을 야기하고, 전반적인 질환 침투를 상당히 저하시키고, 연구 과정 동안 신생물 질환에 대한 중앙값 시간에 도달하지 못하였다.
실시예 4. 사람 T-ALL에서 PTCRA 발현
사람 T-ALL에서 프리-TCR 신호전달의 가능한 역할을 나타내면서, PTCRA는 대부분 사람 T-ALL 세포주에서 발현되지만, Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) 내에 다른 부류의 백혈병 또는 임의의 다른 비-백혈병 암 세포주를 나타내는 세포주에서는 그렇지 않았다 (도 10A 및 데이터는 나타내지 않음) (참조: Barretina, et al. 2012 Nature 483:603-607; Cancer Cell Line Encyclopedia 2015 Nature 528:84-87). PTCRA의 특이적 발현을 2개의 독립적인 환자 코호트에서 사람 T-ALL에서 추가로 입증하였다. RNA-seq 데이터가 이용가능한, 조혈 악성종양 (1,333 B-ALL 사례, 497 AML 사례, 373 T-ALL 사례 및 24 혼합된 계통 백혈병 사례)을 갖는 2,224명의 소아과 및 청소년 환자로 이루어진 세인트 주드 소아 연구 병원 코호트에서, PTCRA는 비-T 세포 유래된 백혈병에 비해 T-ALL 환자 샘플에서 강력하고 차등적으로 발현된다 (도 10B) (참조: Zhou, et al. 2016 Nat Genet 48:4-6). 유사하게, 백혈병 및 골수형성이상 증후군을 갖는 2,096명의 소아과 및 성인 환자 (576 B-ALL 사례, 542 AML 사례, 206 MDS 사례, 174 T-ALL 사례, 448 CLL 사례, 76 CML 사례 및 74 비-백혈병 및 건강한 골수 대조군 사례)의 Haferlach 코호트에서, PTCRA는 T-ALL 환자 샘플에서 선택적으로 발현되었다 (도 10C) (참조: Haferlach, et al. 2010 J Clin Oncol 28:2529-2537). T-ALL 하위유형에 따른 세인트 주드 소아 연구 병원 코호트의 계층화 (참조: Liu, et al. 2017 Nat Genet 49:1211-1218)는 PTCRA가 대부분의 분자 T-ALL 아집단에 걸쳐서 높게 발현되는 것을 예시하고, 대다수의 모든 사람 T-ALL 사례를 나타낸다 (도 11A) (참조: Zhou, et al. 2016 Nat Genet 48:4-6).
뮤린 T-ALL 모델의 특징에 연결되어, PTCRA는 ETP 및 ETP-유사 (LMO2/LYL1) 사람 T-ALL 샘플에서 하부 수준으로 발현된다 (도 11A). 특정 이론에 결부시키지 않지만, NOTCH 신호전달의 분자 생물학과 일치하게, T-ALL에서 PTCRA 발현은 NOTCH1 기능-획득 (GoF) 돌연변이와 양성으로 연관되지만; PTCRA 발현은 야생형 NOTCH1 상태를 갖는 환자의 아집단에서 유지되었다. (도 11B). 일련의 전향적으로 수집된 급성 백혈병 환자 샘플에서 PTCRA 세포 표면 발현은 단지 T-ALL 샘플에서의 세포에서 검출되고, B-ALL 또는 AML 샘플에서는 그렇지 않았다. (도 10D, 도 12, 도 13). 특정 이론에 결부시키지 않지만, 프리-TCR의 발달 기능과 일치하게, 정상 공여자로부터의 성숙 T-세포가 PTCRA를 발현하지 않았다 (도 10E). 따라서, 사람 T-ALL은 높은 수준의 PTCRA를 빈번하게 발현시키는 것으로 나타났다.
실시예 5. CRISPR/Cas9를 통한 T-ALL 세포주에서 PTCRA의 결실은 시험관내 및 생체내 종양 성장을 손상시킨다
사람 T-ALL에서 프리-TCR의 기능을 평가하기 위해, Cas9를 안정하게 발현하는 SupT1, HPB-ALL, 및 Jurkat 세포주를 생성하고, PTCRA-표적화 또는 대조군 gRNAs 중 어느 하나로 형질도입하였다. 이들 세포주에서 PTCRA의 성공적인 표적화 및 단백질 발현의 감소는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다 (도 14). 최고 수준의 PTCRA를 발현하는 (보충되는 표 3), SupT1 및 HPB-ALL 세포에서 PTCRA의 결실은, 세포 증식의 상당한 감소를 야기하였다 (도 15A). 비교적으로, 하부 수준의 PTCRA를 발현하고 SupT1 또는 HPB-ALL 세포보다 더 발달적으로 성숙하는 Jurkat 세포 (참조: Aarnoudse, et al. 2002 Int J Cancer 99:7-13)는, CRISPR/Cas9에 의한 PTCRA의 결실에 민감성이 아니다 (도 15A, 도 13). NSG 마우스의 옆구리에 피하 이식되는 경우, 야생형 SupT1 세포는 종양을 발달시킨 반면, SupT1PTCRA-KO 세포는 그렇지 않았다 (도 15B).
PTCRA가 사람 T-ALL 세포주의 아집단의 증식을 위해 필요하다는 관찰은, 프리-TCR을 통한 신호전달이 이들 세포에서 증식을 유발할 수 있음을 나타낸다. 가슴샘세포 프리-TCR 신호전달은 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제, LCK에 대해 중추 역할을 하는 SRC-부류 단백질 티로신 키나제에 의해 매개된다 (참조: Lin, et al. 2000 J Exp Med 191:703-716). 특정 이론에 결부시키지 않지만, 프리-TCR을 통해 자체 신호전달이, PTCRA-의존성 T-ALL 세포주에서 증식을 위해 필요하다는 견해와 일치하게, 이들 세포주를 SRC-부류 키나제 억제제, PP1로 치료하는 것은, 용량-의존성 항-증식 반응을 유도하였다 (도 15C). 게다가, SupT1 세포에서 LCK의 CRISPR/Cas9-매개 결실은 시험관내 증식을 강력하게 억제하였다 (도 15D). 집합적으로, T-ALL 및 사람 T-ALL 세포주의 가슴샘 이식-기반 마우스 모델로부터의 결과는 T-ALL의 백혈병유발을 유도하고 지속하는데 있어서 프리-TCR 신호전달의 중요한 역할을 나타낸다. 따라서, 사람 T-ALL의 아집단은 PTCRA의 결실에 대해 민감성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 6. 프리-TCR의 내재화 동역학
특정 실시형태에서, ADC 표적은 세포 표면-발현되고, 결합시 페이로드로 내재화된다. 결과적으로, 방관자(bystander) 효과에 처할 위험이 적다.
PTCRA를 내인성으로 발현하는 SupT1 세포를, 항-PTCRA 항체로 4℃에서 30 분 동안 염색하고, 그 결과 세포는 37℃로 온도 이동되었고, 온도 이동-후 지시된 시간에서 이차적인 항체로 염색하였다. 이어서, 세포를 고정하고, 면역형광 공초점 현미경검사를 사용하여 PTCRA 국소화를 가시화하였다. PTCRA를 0 분에 SupT1 세포의 세포 표면에서 검출하였지만, 검사되는 시간 경과에 따라 신속하고 강건하게 내재화되었다 (도 18A). SupT1 세포를 번역 억제제, 사이클로헥스이미드로, 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 또는 8 시간 동안 처리하고, 그 시점에 당해 세포를 수거하고, 용해하고, 추출물을 면역블롯팅을 위해 사용하였다. PTCRA는 실험의 8-시간 시간 과정 동안 신속하게 분해되었다 (도 18B). 효과적인 내재화는 ADC가 실행가능함을 제시한다.
실시예 7. 세포독성 항체-약물 접합체로의 PTCRA의 표적화는 시험관내 및 생체내에서 T-ALL 세포의 특이적 사멸을 촉진한다
정상, 성숙 T 세포에서는 선택적 발현이 아니지만, 백혈병 세포에서 PTCRA의 선택적 발현, 및 이의 신속한, 구성적 내재화를 고려하면, 프리-TCR을 세포독성 항체-약물 접합체로 표적화하는 것이 T-ALL에서 실행가능한 치료학적 전략을 나타낼 수 있다는 것이 추론되었다. 이러한 목적을 위해, 기재된 바와 같이 가슴샘 이식을 통해 생성된 일차 PTCRA+ 뮤린 T-ALL (mTALL) 세포를, PTCRA-표적화 마우스 mAb 또는 이소형 대조군 mAb 중 어느 하나로 처리하고, 이어서, 미세관 억제제 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)에 비-절단성 링커를 통해 링크된 항-마우스 IgG-Fc로 처리하였다. PTCRA-표적화 mAb로 처리된 mTALL 세포의 강건한 사멸을 관찰하고, 그러나, 대조군-처리된 세포는 어떠한 사멸도 관찰되지 않았다 (도 16A). 다음에, PTCRA-표적화 mAb를 링커 페이로드 MAYT2LP (본원에 제공된 구조)에 접합하고, 이에 의해 PTCRA-표적화 mAb를 강력한 미세관 억제제 (MAYT2)에 비-절단성 링커를 통해 링크하였다. 이러한 목적을 위해, PTCRA-표적화 mAb를 MAYT2INT에 접합하였다. 수득한 약물-항체 비 (DAR)는 ~3.5이고, 화합물은 하기에서 PTCRA-ADC로 언급된다. PTCRA-ADC는, 백혈병 세포의 용량-의존성 사멸을 나노몰 범위에서의 IC50으로 촉진하지만, 대조군-ADC은 그렇지 않았다 (도 16B, 도 16F에 나타낸 값의 표 형식).
본원에 사용된 PTCRA mAb 클론이 또한 사람 PTCRA에 결합하기 때문에 (도 12), PTCRA-ADC의 활성을 사람 백혈병 세포주의 패널 상에서 시험하였다. PTCRA-ADC는 선택적으로 사람 SupT1 T-ALL 세포의 사멸을 유도하지만, B-ALL (NALM6) 및 AML (K562) 세포주의 생존력에는 영향을 주지 않았다 (도 16C, 도 16G에 나타낸 값의 표 형식). AML 및 B-ALL 세포는 RNA 수준에서 매우 낮은 수준의 PTCRA를 갖는다 (대부분 데이터세트의 경우 중앙값 및 평균 접근 <1). 중요한 것은, PTCRA-ADC 처리는 또한 정상, 말초 T 세포의 생존력에 영향이 없고, 이는 이의 선택적 발현 패턴과 일치하였다. 시험관내 PTCRA-ADC의 효능은 매우 공격적인, 파종성 T-ALL 모델에서 생체내 활성의 평가를 촉발하였다. NSG 마우스에게 100,000 PTCRA+ mTALL 세포로 i.v. 주사하고, 종양 부하에 따라서 이식-후 2일차에 무작위배정하고, PTCRA-ADC 또는 대조군-ADC로 2, 6 및 12일차에 처리하였다. 종양 부하를 말초 혈액 중 모세포 세포의 수를 정량화하여 및 비장 질량을 연구 말기 14일차에 정량화하여 연구 내내 종적으로 평가하였다. PTCRA-ADC로 처리된 T-ALL-을 갖는 마우스는 말초 혈액 및 비장 둘 다에서 대조군-ADC 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 감소된 종양 부하를 나타내었다 (도 16D, 도 16H에 나타낸 값의 표 형식, 및 도 16E, 도 16I에 나타낸 값의 표 형식). PTCRA-ADC 처리는 대조군 마우스에 비해 처리 그룹에서 명백한 고통의 징후 또는 체중 차이 없이 잘 허용되는 것으로 나타났다 (도 17). 집합적으로, 이들 결과는 세포독성 ADC를 갖는 T-ALL에서 프리-TCR을 표적화하는 것이 정상 T 세포를 피하게 해주면서 종양 세포를 특이적으로 근절하기 위한 및 임상적 번역에 대한 PTCRA-표적화 제제의 추가 개발을 지지하기 위한 전도유망한 접근을 나타냄을 지시한다.
T-ALL의 생물학은 이의 발달 기원에 의해 강하게 영향을 받는다. 예를 들면, NOTCH1에서 돌연변이, 가슴샘세포 발달의 중요한 조절인자는, 환자 종양의 대략 60%에서 발견된다. 그러나, 가슴샘세포 발달의 다른 결정인자가 T-ALL의 백혈병유발에 참여하는 정도에 대해서는 덜 알려져 있다. 따라서, T-ALL의 발병기전에서 NOTCH1을 넘어서는 가슴샘세포 발달 인자에 대한 역할을 설명하기 위해, 유전자적으로 뚜렷한 T-ALL 사례를 자발적으로 일으키고, 사람 질환의 다수의 주요 유전적 및 조직병리학적 특징을 개괄하는 가슴샘 이식-기반 모델을 사용하였다 (참조: Martins, et al. 2014 Nature 509:465-470). 이러한 모델에서 유래된 종양의 RNA 서열분석은 TCRβ 유전자자리 재배열에 실패한 가슴샘세포에 대항하여 선택하는 가슴샘세포 발달에서 주요 단계인, β-선택 체크포인트를 통한 진행과 연관된 인자의 강력한 상향조절을 나타내었다. 이러한 체크포인트를 통과하여 DN3에서 DN4로의 전이를 성공적으로 완료하는 가슴샘세포는 증식 및 생존 신호전달의 신속한 발작을 개시한다. β-선택 체크포인트는 가슴샘세포 발달에서 주요 단계이다. 이러한 모델에서 β-선택 체크포인트를 횡단하기 위해 요구되는 인자의 상향조절이 백혈병유발의 원인이 될 수 있다고 가설을 세웠다. T-ALL의 백혈병유발에서 주요 DN3에서 DN4로의 전이 인자, 프리-TCR의 역할을, Ptcra KO 가슴샘 이식을 사용하여 입증하고, 백혈병유발의 효율의 현저한 감소를 이러한 시스템에서 관찰하였다. 추가로, 사람 T-ALL이 빈번하게 높은 수준의 PTCRA를 발현하고, 사람 T-ALL 세포주의 아집단이 PTCRA의 결실 또는 프리-TCR 신호전달을 매개하는 SRC-부류 키나제의 화학적 억제에 민감성인 것을 예시한다.
이들 결과는 T-세포 전구물의 발생 생물학이 T-ALL의 백혈병유발 및 임상적 과정을 알려준다는 전형적인 예를 지지한다. 이는 T-ALL에서 종양발생 NOTCH1 신호전달의 중추 역할으로 가장 잘 특성화된다.
수개의 보고서는 T-ALL의 발병기전에서 프리-TCR의 가능한 역할을 기술하고, 이는 TEL-JAK2 융합 (참조: dos Santos, et al. 2007 Blood 109:3972-3981), 활성화 NOTCH 돌연변이 (참조: Bellavia, et al. 2002 PNAS USA 99:3788-3793), 및 Ikaros 결핍 (참조: Winandy, et al. 1999 J Exp Med 190:1039-1048)을 포함하는 다른 백혈병유발성 게놈 변경과 협력함을 제시한다. 이는 특이적, 유전자 조작된 조정자 돌연변이의 맥락을 넘어서는 T-ALL의 백혈병유발에서 프리-TCR 신호전달에 대한 중요한 역할을 기술하는 첫번째 보고이고, 사람 T-ALL 세포주에서 프리-TCR 신호전달에 대한 필요성을 예시하는 첫번째 보고이다.
프리-TCR은 DN3에서 DN4로의 전이를 동반하고, 세포가 β-선택에 의해 사멸을 피하는 것을 돕는 증식 돌파(burst)를 조절한다 (참조: von Boehmer 2005 Nat Rev Immunol 5:571-577). 본원에 기재된 모델에서 Ptcra KO 가슴샘이 백혈병을 효율적으로 생성할 수 없음을 T-ALL의 백혈병유발을 필요로 하는 프리-TCR를 통한 신호전달에 의해 설명할 수 있고, 즉, 신호전달은 T-ALL의 발병기전에 적극적으로 기여한다. 먼저, Ptcra KO 가슴샘은 αβ-계통 가슴샘세포를 포함하고, 성숙 T-세포의 세대를 지지할 수 있고, 이는 DN3 기를 넘어서는 진행은 Ptcra의 부재하에 가능함을 지시한다. 추가로, 이식된 Ptcra 가슴샘 엽의 수의 증가는 백혈병유발의 효율을 증가시키지 않는데, 이는 DN4 또는 그 이상의 가슴샘세포가 형질전환에 대한 제한 인자가 아님을 제시한다. 최종적으로, 확립된 사람 T-ALL 세포주에서 PTCRA를 녹아웃시키는 것은 세포 증식 결함을 야기한다는 관찰은 T-ALL의 맥락에서 중요한 것으로 프리-TCR을 통한 신호전달을 강력하게 지적한다.
PTCRA가 가슴샘세포-제한된 Notch1 표적이라는 사실은, PTCRA를 표적화하는 것은 장 전구체 세포에서 Notch1 기능 때문에 위장관 독성을 야기하는 Notch1의 억제에 비해 보다 유리한 치료학적 기회를 수득할 수 있음을 암시한다 (참조: Takebe, et al. 2014 Pharmacol Ther 141:140-149; Wei, et al. 2010 Mol Cancer Ther 9:1618-1628). 게다가, 백혈병 T 세포에서 PTCRA의 상승된 발현 그러나 정상 성인 T 세포에서 이의 부재(이의 발달 기능과 일치함)는, 정상 T 세포 구획에 영향을 주지 않고 T-ALL의 선택적 표적화를 가능하게 한다. 중요한 것은, 정상 T 세포 면역의 손상은 T 세포-유래된 악성종양을 표적화하는 차-세대 치료법의 개발에 주요한 장애물이었다 (참조: Martin, et al. 2006 Clin Infect Dis 43:16-24).
모든 T-ALL의 유전자 조작된 마우스 모델이 Trp53 또는 ATM 결핍 마우스를 포함하는 프리-TCR 신호전달에 대한 요구를 나타내는 것은 아니다 (참조: Liao, et al. 1998 Mol Cell Biol 18:3495-3901; Petiniot, et al. 2000 PNAS USA. 이들 사례에서, 가슴샘세포가 DN3에서 프리-TCR을 발현하기 시작하기 전에 악성 종양이 개시되었음을 나타낸다. 특정 이론에 결부시키지 않고, 이는 사람 문헌과 일치하고, 또한, 여기서, 프리-TCR은 반이 넘는 T-ALL 사례, 특히 피질 하강(cortical descent)의 것들에서 상향조절된다. 게다가 PTCRA가 ETP-ALL에서 낮은 수준으로 발현되는 것이 관찰되었다. 세인트 주드 소아과 암 데이터세트에서 코호트에 걸친 PTCRA의 차등 발현에 대한 데이터 (도 10B, 도 11B)를 특히 주목하지 않을 수 없는데, 그 이유는 서열분석이 분류된 백혈병 세포 집단 상에서 수행되어, 종양 미세환경 내 세포 이질성 때문에 교란(confounding)이 감소하였기 때문이다.
점증적으로, T-ALL의 발병기전에서 프리-TCR 신호전달의 중요한 역할은 본원에서 강조된다. 질환을 위한 표적화된 용법의 부족을 고려하여, 프리-TCR은 이러한 징후에서 실행가능한 치료학적 표적일 수 있다.
T-ALL의 가슴샘 이식-기반, 자발적인 마우스 모델을 사용하여, 다중 β-선택 체크포인트 인자가 백혈병 T 세포에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌고, Ptcra, 프리-T 세포 수용체 (프리-TCR) 복합물의 하위단위를 포함한다. 마우스 모델에서 Ptcra의 유전적 절제는 T-ALL의 발생을 극적으로 감소시켰다. 사람 T-ALL 세포주에서, PTCRA의 CRISPR/Cas9 녹아웃은 시험관내 증식 능력 및 생체내 종양을 형성할 수 있는 능력을 감소시켰다. 임상적 T-ALL 데이터세트 및 환자 샘플의 분석은, PTCRA이 백혈병 T 세포에서 매우 특이적으로 발현되지만, 정상, 성숙 T 세포에서 그렇지 않았음을 예시하고, 이는 T-ALL에서 표적화된 (PTCRA-지시된) 요법에 대한 적합한 치료학적 윈도우를 지지한다. 점증적으로, 실시예는 T-ALL을 유발하고 지속하는 프리-TCR 신호전달에 대한 중요한 역할을 강조한다.
실시예 8. 추가 링커 페이로드의 합성
양성자 NMR 스펙트럼을 Varian Inova 300 또는 500 MHz NMR 기기 상에서 획득하였다. 크로마토그래피 순도를, Merck Chromolith RP-18e 분석 HPLC 컬럼 (monolithic, 50 × 2 mm) 및 하기 분석 HPLC 방법을 사용하여, 전기분무 이온화 공급원 및 삼중-쿼드 이온 트랩 분석기를 갖는 Agilent 1200 Series 또는 1100 Series LC/MS 시스템 상에서 측정하였다: 주사 용적 5 μL; 유속 1 mL/min; 0.05% AcOH를 갖는 물 중 아세토니트릴 5→95% 5 min 동안; Agilent 다이오드 어레이 검출기 λ = 254, 220 또는 195 nm에서; 실온. 모든 출발 물질 및 용매는 시판되고, 달리 기재되지 않는 한 정제 없이 사용하였다.
링커 페이로드 10을 화합물 1로부터 하기한 바와 같이 합성하였다.
Figure pct00025
메이탄신-N-메틸-L-알라닌-3-메톡실벤즈아미드-4-아미노-벤즈아미도카바메이트-Ala-Val-Cap-NH2 (10)
알릴 4-아미노-3-메톡시 벤조에이트 (3)의 합성
단계 1: 3-메톡시-4-니트로벤조산 1 (500 mg, 2.53 mmol)을 3.0 mL 무수 DMF 중에, 실온에서, 아르곤 분위기 하에 용해시켰다. Cs2CO3 (1.66 g, 5.10 mmol) 및 알릴 브로마이드 (330 μL, 3.80 mmol)를 연속하여 첨가하였다. 수득한 혼합물을 정치하여 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (10 mL) 및 DCM (10 mL) 사이에 분획화하고; 이어서 층을 분리하고; 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 1 mL의 DMF에 용해시키고, 24 g 실리카 겔 컬럼 상에 로딩하였다. 용리액: EtOAc 및 헥산 (0% 내지 100% EtOAc 25 분에 걸쳐서). 생성물 함유 분획을 합하고, 진공하에 증발시켰다. 생성물을 백색 고체 (500 mg, 83% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C11H12NO5에 대한 계산치, 238.1; 실측치 (M+H) 238.1.
단계 2: 화합물 2 (142 mg, 0.60 mmol)를 7 mL CH3CN/H2O 4:3 중에 용해시켰다. AcOH (1.30 mL, 24.0 mmol) 및 Zn 분진 (783 mg, 12.0 mmol)을 연속하여 첨가하였다. 반응이 LC/MS에 의해 완료되었음을 측정한 경우, 수득한 혼합물을 정치하여 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 진공하에 부분적으로 증발시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 물 (10 mL) 및 DCM (10 mL) 사이에서 분획화하고; 이어서 층을 분리하였다. 유기 층을 포화 (aq) NaHCO3 (1 x 10 mL)로 세척하고, 이어서, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 증발시켰다. 조 생성물을 어두운 황색 오일 (120 mg, 97% 수율)로서 수득하였다. 이를 다음 단계에서 정제 없이 사용하였다. MS (ESI, pos.): C11H14NO3에 대한 계산치 208.1 (M+H); 실측치 208.1; MS (ESI, neg.) C11H12NO3에 대한 계산치 206.1 (M-H); 실측치 206.1.
화합물 5의 합성:
화합물 3 (250 mg, 1.21 mmol)을 8.0 mL DCM 중에, 실온에서, 아르곤 분위기하에 용해시켰다. 용액을 0 ℃로 냉각하고, Et3N (504 μL, 3.62 mmol) 및 트리포스겐 (717 mg, 1.21 mmol)을 연속하여 첨가하였다. 수득한 혼합물을 정치하여 0 ℃에서 30 분 동안 및 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 진공하에 1시간 동안 건조시켰다. FmocValAlaPAB 알콜 (622 mg, 1.21 mmol)의 무수 DMF (1.0 mL) 중 용액을 적가하였다. 혼합물을 70 ℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혼합물을 정치하여 실온으로 냉각하였다. 이어서, 이를 100 g C18 Aq Isco 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O (둘 다 0.05% AcOH) 10% 내지 90% CH3CN 30 분에 걸쳐서 용리함. 생성물 함유 분획을 합하고, 진공하에 부분적으로 증발시키고, 냉동시키고, 동결건조하였다. 생성물을 백색 고체 (180 mg, 20% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C42H44N4O9Na에 대한 계산치 771.3 (M+Na); 실측치 771.2.
화합물 6의 합성:
화합물 5 (114 mg, 0.15 mmol)를 2 mL 무수 THF 중에, 실온에서, 아르곤 분위기하에 용해시켰다. 모르폴린 (27.0 μL, 0.30 mmol) 및 Pd(PPh3)4 (176 mg, 0.15 mmol)를 연속하여 첨가하였다. 반응이 LC/MS에 의해 완료되었음을 측정한 경우, 수득한 혼합물을 정치하여 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 1 mL DMF에 용해시키고, 30 g C18 Aq Isco 컬럼 상에 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O (둘 다 0.05% AcOH) 0% 내지 70% CH3CN 30 분에 걸쳐서. 생성물 함유 분획을 합하고, 진공하에 부분적으로 증발시키고, 냉동시키고, 동결건조하였다. 생성물을 백색 고체 (5.0 mg, 33% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C39H40N4O9Na에 대한 계산치, 731.3; 실측치 (M+Na) 731.3. MS (ESI, neg.) C39H39N4O9에 대한 계산치 707.3; 실측치 (M-H) 707.3.
화합물 7의 합성:
화합물 6 (50.0 mg, 0.07 mmol)을 1.5 mL 무수 DMF 중에, 실온에서, 아르곤 분위기 하에 용해시켰다. 피페리딘 (27.0 μL, 0.28 mmol)을 첨가하였다. 반응이 LC/MS에 의해 완료되었음을 측정한 경우, 수득한 혼합물을 정치하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 30 g C18 Aq Isco 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O (둘 다 0.05% AcOH) 0% 내지 40% CH3CN 25 분에 걸쳐서. 생성물 함유 분획을 합하고, 진공하에 부분적으로 증발시키고, 냉동시키고, 동결건조하였다. 생성물을 백색 고체 (25 mg, 73% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C24H31N4O7에 대한 계산치, 487.2; 실측치 (M+H), 487.2. MS (ESI, neg.) C24H29N4O7에 대한 계산치, 485.2; 실측치 (M-H) 485.2.
화합물 8의 합성:
화합물 7 (22.0 mg, 0.04 mmol)을 1.0 mL 무수 DMF 중에, 실온에서, 아르곤 분위기 하에 용해시켰다. FmocNHCapOSu (22.0 mg, 0.05 mmol) 및 DIPEA (15.0 μL, 0.09 mmol)를 첨가하였다. 수득한 혼합물을 정치하여 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 50 g C18 Aq Isco 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O (0% 내지 70% CH3CN, 25 분에 걸쳐서). 생성물 함유 분획을 합하고, 진공하에 부분적으로 증발시키고, 냉동시키고, 동결건조하였다. 생성물을 백색 고체 (27 mg, 73% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C45H51N5O10Na에 대한 계산치, 844.4; 실측치 (M+Na) 844.3. MS (ESI, neg.) C45H50N5O10에 대한 계산치, 820.4; 실측치 (M-H) 820.3.
화합물 9의 합성:
화합물 8 (40.0 mg, 0.05 mmol)을 1.5 mL 무수 DMF에, 실온에서, 아르곤 분위기 하에 용해시켰다. Maytan-NMA (38.0 mg, 0.06 mmol), HATU (0.08 mmol) 및 NMM (11.0 μL, 0.10 mmol)을 첨가하였다. 수득한 혼합물을 정치하여 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 30 g C18 Aq Isco 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O (둘 다 0.05% AcOH) 0% 내지 40% CH3CN 25 분에 걸쳐서. 생성물 함유 분획을 합하고, 진공하에 부분적으로 증발시키고, 냉동시키고, 동결건조하였다. 생성물을 백색 고체 (46 mg, 65% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C77H94ClN8O18에 대한 계산치, 1453.6; 실측치 (M+H) 1453.8.
화합물 10의 합성:
화합물 9 (40 mg, 0.03 mmol)를 1.5 mL 무수 DMF 실온에서, 아르곤 분위기하에 용해시켰다. 피페리딘 (8.0 μL, 0.08 mmol)을 첨가하였다. 수득한 혼합물을 정치하여 실온에서 교반하였다. 20 분 후, 반응이 LC/MS에 의해 완료되었음을 측정하였다. 혼합물을 30 g C18 Aq Isco 컬럼 상으로 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O (둘 다 0.05% AcOH) 0% 내지 50% CH3CN 25 분에 걸쳐서. 생성물 함유 분획을 합하고, 진공하에 부분적으로 증발시키고, 냉동시키고, 동결건조하였다. 생성물을 백색 고체 (20.0 mg, 59% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C62H84ClN8O16에 대한 계산치, 1231.6; 실측치 (M+H) 1231.7. MS (ESI, neg.): C62H82ClN8O16에 대한 계산치, 1229.6; 실측치 (M-H) 1229.5.
Figure pct00026
링커 페이로드 14를 하기한 바와 같이 화합물 6으로부터 합성하였다.
Figure pct00027
메이탄신-N-메틸-L-알라닌-3-메톡시벤즈아미드-4-아미노벤즈아미도카바메이트-Ala-Val-Peg8-Prop-Mal (14)
화합물 11의 합성:
무수 DMF (1.6 mL) 중 DIEA로 오염된 May-NMA의 용액 (190 mg, 0.292 mmol)에, 화합물 6 (85.2 mg, 0.120 mmol), HATU (112 mg, 0.295 mmol) 및 NMM (65 μL, 0.591 mmol)을 첨가하였다. 수득한 반응 혼합물을 아르곤으로 퍼징하고, 주위 온도에서 교반되게 하였다. 20 시간 후, DMF (1 mL) 중 추가 화합물 6 (27 mg, 0.0381 mmol)을 첨가하고, 화합물 6의 완전한 소모가 LC/MS로 관찰된 경우, 혼합물을 추가 8 시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 DMSO로 희석하고, C18 Aq Isco 컬럼 (150 g) 상에 직접 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O, 각각 0.05%의 AcOH를 함유함 (5% 내지 95% CH3CN). 생성물 함유 분획을 합하고, 동결건조하여 화합물 11을 백색 고체 (43.3 mg, 20% 수율, 화합물 6을 기준으로 함)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C71H82ClN7O17Na에 대한 계산치, 1362; 실측치 (M+Na) 1362.
화합물 12의 합성:
화합물 11 (40.2 mg, 0.0300 mmol)을 DMF (v/v) 중 20% 디에틸아민 (1.0 mL, 1.93 mmol DEA)에 용해시키고, 이어서, 수득한 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반되게 하였다. 20 분 후, 반응이 LC/MS에 의해 완료되었음을 측정하였다. 이어서, 용액을 DMSO로 희석하고, C18 Aq Isco 컬럼 (30 g) 상에 직접 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O, 각각 0.05%의 AcOH를 함유함 (0% 내지 100% CH3CN). 생성물 함유 분획을 합하고, 동결건조하여 화합물 12를 백색 고체 (22.6 mg, 67% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C56H73ClN7O15에 대한 계산치, 1118; 실측치 (M+H) 1118; MS (ESI, neg.): C56H71ClN7O15에 대한 계산치, 1116; 실측치 (M-H) 1116.
화합물 14의 합성:
화합물 12 (11.6 mg, 0.0104 mmol)에 무수 DMF (0.1 mL) 중 MalPeg8NHS 에스테르 13 (14.3 mg, 0.0207 mmol)를 첨가하고, 이어서, 추가 DMF (0.1 mL) 및 DIEA (5.5 μL, 0.311 mmol)를 첨가하였다. 수득한 반응 혼합물을 아르곤으로 퍼징하고, 주위 온도에서 교반되게 하였다. 50 분 후, 반응이 LC/MS에 의해 완료되었음을 측정하였다. 이어서, 용액을 DMSO로 희석하고, C18 Aq Isco 컬럼 (15.5 g) 상에 직접 로딩하였다. 용리액: CH3CN 및 H2O, 각각 0.05%의 AcOH를 함유함 (20% 내지 100% CH3CN). 생성물 함유 분획을 합하고, 동결건조하여 화합물 14를 백색 고체 (6.0 mg, 34% 수율)로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C82H114ClN9O27Na에 대한 계산치, 1714; 실측치 (M+H) 1714.
Figure pct00028
실시예 9. 세포독성 항체-약물 접합체로 PTCRA를 표적화시키는 것은 시험관내 및 생체내 T-ALL 세포의 특이적 사멸을 촉진한다
실시예 7에 기재된 PTCRA-ADC의 항-백혈병 효과를 고려하여, 추가 링커 페이로드 형식이 또한 항-백혈병 활성을 갖는지 여부를 탐구하였다. 이러한 목적을 위해, PTCRA-표적화 mAb를 추가 링커 페이로드 MAYT3LP (본원에 제공된 구조)에 접합하고, 이에 의해 PTCRA-표적화 mAb를 강력한 미세관 억제제 (MAYT3)에 비-절단성 링커를 통해 링크하였다. 이러한 목표를 위해, PTCRA-표적화 mAb를 MAYT3LPINT와 반응시켰다. 수득한 약물-항체 비 (DAR)는 ~3.5이고, 화합물은 PTCRA-MAYT3LP로서 하기에 언급한다. 게다가, PTCRA-표적화 mAb를 추가 링커 페이로드 MAYT4LP (본원에 제공된 구조)에 접합하고, 이에 의해 PTCRA-표적화 mAb를 강력한 미세관 억제제 (MAYT4)에 절단성 링커를 통해 링크하였다. 이러한 목적을 위해, PTCRA-표적화 mAb를 실시예 8에 기재된 화합물 14과 반응시켰다. 수득한 약물-항체 비 (DAR)는 ~3.5이고, 화합물은 PTCRA-MAYT4LP로서 하기에 언급된다. ADC PTCRA-MAYT3LP 및 PTCRA-MAYT4LP는, 낮은 나노몰 범위에서 IC50을 갖는 사람 PTCRA+ 백혈병 세포의 용량-의존성 사멸을 촉진하였지만, 적합한 대조군-ADC에서는 그렇지 않았다 (도 19A, 도 19G에 나타낸 값의 표 형식).
PTCRA-MAYT3LP 및 PTCRA-MAYT4LP의 활성을 사람 백혈병 세포주의 패널 상에서 시험하였다. PTCRA-ADC는 선택적으로 사람 SupT1 T-ALL 세포의 사멸을 유도하지만, B-ALL (NALM6) 및 AML (K562) 세포주의 생존력에 영향을 주지 않았다 (도 19B, 도 19H에 나타낸 값의 표 형식). AML 및 B-ALL 세포는 RNA 수준에서 매우 낮은 수준의 PTCRA를 갖는다 (대부분 데이터세트에서 중앙값 및 평균 접근 <1). 추가로, PTCRA-MAYT3LP 및 PTCRA-MAYT4LP 처리는 또한 정상, 말초 T 세포의 생존력에 영향이 없고, 이는 이의 선택적 발현 패턴과 일치하였다.
이들 분자의 시험관내 효능은 T-ALL의 다양한 생체내 모델에서 이들의 항-백혈병 활성의 평가를 촉발하였다. 이러한 목적을 위해, NSG 마우스에게 5,000,000 PTCRA+ SupT1 세포로 피하 (s.c.) 주사하고, 종양이 감지할 수 있게 되면, 단일 용량의 PTCRA-MAYT4LP 또는 대조군-MAYT4LP로 처리로 무작위배정하였다. 종양 부하를 이식된 종양의 종양 용적을 측정하여 연구 내내 종적으로 정량화하였다. PTCRA-MAYT4LP로 처리된 T-ALL-을 갖는 마우스는 대조군-2921 처리된 마우스에 비해 통계적으로 유의하게 감소된 종양 부하를 나타내었다 (도 19C). 별개의 실험에서, C57BL/6 마우스에게 PTCRA+ mTALL 세포로 정맥내 (i.v.) 주사하고, 이식 후 1일차에 종양 부하에 따라 무작위배정하고, PTCRA-MAYT4LP 또는 대조군-2921 2qw로 처리하였다. 종양 부하를 말초 혈액 중 모세포 세포의 수를 정량화하여 그리고 21일차 연구 말기에 비장 질량을 정량화하여 연구 내내 종적으로 평가하였다. PTCRA-MAYT4LP로 처리된 T-ALL-을 갖는 마우스는 말초 혈액 및 비장 둘 다에서 대조군-2921 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 감소된 종양 부하를 나타내었다 (도 19D 및 도 19E). PTCRA-MAYT4LP 처리는 또한 T-세포 무형성과 연관되지 않고, 백혈병 T-세포 대 비-악성 T-세포에 대한 PTCRA-표적화 분자의 특이성을 강조하였다 (도 19F).
집합적으로, 이들 결과는 세포독성 ADC을 갖는 T-ALL에서 프리-TCR의 표적화가 정상 T 세포를 피하게 해주면서 종양 세포를 특이적으로 근절하기 위해 및 임상적 번역에 대한 PTCRA-표적화 제제의 추가 개발을 지지하기 위해 전도유망한 접근을 나타낸다는 것을 확인한다.
본원 개시내용은 본원에 기재된 특이적 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 사실상, 본원에 기재된 것들 이외에 본원 개시내용의 다양한 변형은 상기한 명세서 수반되는 도로부터 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 수 있다. 이러한 변형이 첨부된 청구범위범위 내에 속하는 것을 의도한다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-PTCRA ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND USES THEREOF <130> 40848.0096WOU1 <140> PCT/US2020/051688 <141> 2020-09-19 <150> 62/902,674 <151> 2019-09-19 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu Val 1 5 10 15 Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser Ala 20 25 30 Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro Ala 35 40 45 Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser Glu 50 55 60 Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly Ala 65 70 75 80 Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu Ala 85 90 95 Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro Gly 100 105 110 Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu Leu 115 120 125 Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala Gly 130 135 140 Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly Ser 145 150 155 160 His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr Ser 165 170 175 Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro Pro 180 185 190 Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu Ser 195 200 205 Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala Leu 210 215 220 Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu Pro 225 230 235 240 Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala 245 <210> 2 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu 225 230 235 240 Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala 245 250 255 Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu 260 265 270 Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala 275 280

Claims (47)

  1. 프리-T 세포 항원 수용체 알파 (pre-T cell antigen receptor alpha; PTCRA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate; ADC)로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료학적 모이어티(moiety)에 접합되는, 항체-약물 접합체 (ADC).
  2. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 모이어티가 세포독성제, 화학요법 약물, 및 방사성동위원소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, ADC.
  3. 제2항에 있어서, 상기 치료학적 모이어티가 세포독성제인, ADC.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포독성제가 아우리스타틴인, ADC.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 E (monomethyl auristatin E; MMAE) 또는 이의 유도체인, ADC.
  6. 제3항에 있어서, 상기 세포독성제가 메이탄시노이드인, ADC.
  7. 제6항에 있어서, 상기 메이탄시노이드가 다음과 같은, ADC:
    Figure pct00029
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 비-절단성 링커를 통해 상기 치료학적 모이어티에 접합되는, ADC.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 링커를 통해 상기 치료학적 모이어티에 접합되고, 상기 링커가 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 라이신 잔기에 결합되는, ADC.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC가 PTCRA를 발현하는 세포를 사멸시키는, ADC.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC가 T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-cell acute lymphoblastic leukemia; T-ALL) 세포를 사멸시키는, ADC.
  12. 제11항에 있어서, 상기 ADC가 T-ALL 세포를 약 1 pM 내지 약 10 nM의 IC50으로 사멸시키는, ADC.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 ADC가 정상 말초 T-세포보다 T-ALL 세포를 선택적으로 사멸시키는, ADC.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 2F5인, ADC.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 ADC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 종양을 갖는 대상자에서 종양 성장을 억제 또는 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이 프리-T 세포 항원 수용체 알파 (PTCRA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)를 상기 대상자에게 투여함을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료학적 모이어티에 접합되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 종양이 혈액 종양인, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 종양이 T-세포 전구체(progenitors)의 악성 형질전환으로부터 발생하는, 방법.
  19. 대상자에서 T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-ALL)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 프리-T 세포 항원 수용체 알파 (PTCRA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)를 상기 대상자에게 투여함을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료학적 모이어티에 접합되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 대상자가 화학요법-불응성(chemo-refractory)이고/이거나 재발된 T-ALL을 갖는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 백혈병유발 유도가 감소되고, 전반적인 질환 침투(overall disease penetrance)가 저하되고/되거나, 신생물 질환까지의 중앙값 시간(median time)이 52 주까지 도달하지 않는, 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC가 적어도 약 1 nM의 용량으로 투여되는, 방법.
  23. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC가 적어도 약 10 nM의 용량으로 투여되는, 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, ADC의 1회 초과의 용량이 상기 대상자에게 투여되는, 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자에서 종양 부하(burden)가 치료 14일까지 약 50%까지 감소하는, 방법.
  26. 프리-T 세포 항원 수용체 알파 (PTCRA)를 발현하는 세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 방법이 PTCRA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)와 상기 세포를 접촉시킴을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료학적 모이어티에 접합되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포가 종양 세포인, 방법.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC가 약제학적 조성물에 포함되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적 모이어티가 세포독성제, 화학요법 약물, 및 방사성동위원소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 치료학적 모이어티가 세포독성제인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포독성제가 아우리스타틴인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 또는 이의 유도체인, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 세포독성제가 메이탄시노이드인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 메이탄시노이드가 다음과 같은, 방법:
    Figure pct00030
  36. 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 비-절단성 링커를 통해 상기 치료학적 모이어티에 접합되는, 방법.
  37. 제16항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 링커를 통해 상기 치료학적 모이어티에 접합되고, 상기 링커가 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 라이신 잔기에 결합되는, 방법.
  38. 제16항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-ALL) 세포의 사멸을 야기하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법이 정상 말초 T-세포의 사멸을 야기하지 않는, 방법.
  40. 대상자에서 T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-ALL)을 치료하기 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 ADC의 용도.
  41. 대상자에서의 T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-ALL)의 치료에서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 ADC 또는 제15항의 조성물의 용도.
  42. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 ADC 또는 제15항의 조성물 및 사용 지시서를 포함하는 키트.
  43. 상기 메이탄시노이드가 다음과 같은, 제6항 또는 제8항의 ADC 또는 제34항 또는 제36항의 방법:
    Figure pct00031
  44. 상기 메이탄시노이드가 다음과 같은, 제6항 또는 제8항의 ADC 또는 제34항 또는 제36항의 방법.
    Figure pct00032
  45. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기에 접합되는, 제1항의 ADC 또는 제26항의 방법:
    Figure pct00033
  46. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기에 접합되는, 제1항의 ADC 또는 제26항의 방법:
    Figure pct00034
  47. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기에 접합되는, 제1항의 ADC 또는 제26항의 방법:
    Figure pct00035
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