CN114514041A - 抗ptcra抗体-药物缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开书提供包含抗‑PTCRA抗体的抗体‑药物缀合物及其使用方法。本公开书的ADCs可用于治疗T‑ALL和其他与PTCRA升高的表达相关的病患。

Description

抗PTCRA抗体-药物缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请作为PCT国际专利申请在2020年9月19日提交，并要求2019年9月19日提交的美国临时专利申请号62/902,674的优先权，将其内容引入文中作为参考。
本公开的领域
本公开涉及特异性结合前T-细胞抗原受体α(PTCRA)的抗体-药物缀合物。
背景
T-细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种侵袭性血液肿瘤，其起因于T-细胞祖细胞的恶性转化(Belver&Ferrando 2016 Nat Rev Cancer 16：494-507；Vadillo等人，2018 Blood Rev 32：36-51)。该病占急性淋巴细胞白血病病例的15-25％，并影响儿童和成人。强化多药化疗方案的实施显著改善疾病预后，特别是在儿科(Pui等人，2008Lancet371：1030-1043)。然而，T-ALL没有靶向治疗，并且其疾病抵抗化疗或复发的患者仍然有主要的未满足的医疗需求(Ferrando 2015 Blood 126：833-841；Marks&Rowntree 2017Blood129：1134-1142)。缺乏靶向治疗需要在T-ALL中发现额外的治疗靶点，并更好地了解疾病生物学。
前T-细胞抗原受体α(PTCRA)蛋白是一种在未成熟(未成熟)T细胞中发现的单通道I型膜蛋白(single-pass type I membrane protein)。与T细胞受体β(TCRB)和簇或分化3(CD3)复合物一起，形成前T细胞受体复合物，调节早期T细胞的发育。
简述
本文提供的是结合前T细胞抗原受体α(PTCRA)的抗体及其抗原结合片段，其中抗体和抗原结合片段与治疗部分(moiety)缀合。本文公开的抗体-药物缀合物(ADCs)尤其可用于靶向表达PTCRA的肿瘤细胞。
在另一方面，本公开书提供包含特异性结合PTCRA的抗体-药物缀合物和药学上可接受载体的药物组合物。在一相关方面，本公开书提供一种组合物，该组合物是抗PTCRA抗体-药物-缀合物和第二种治疗物质的组合。在一实施方案中，第二治疗物质是可有利地与抗PTCRA抗体-药物缀合物组合的任何物质。本文在其他地方公开示例性组合疗法、共制剂和抗体-药物缀合物。
还在另一方面，本公开书提供利用抗体-药物缀合物杀死肿瘤细胞或者抑制或减弱肿瘤细胞生长的治疗方法，所述缀合物包含抗-PTCRA抗体或其抗原结合部分和治疗部分。根据本公开书这一方面的治疗方法包含将治疗有效量的包含本文公开的抗体-药物缀合物的药物组合物施用至需要其的受试者。治疗的疾病是通过靶向PTCRA和/或通过PTCRA抑制细胞信号而得到改善、缓和、抑制或预防的任何疾病或疾患。
从随后详述中，其他实施方案将变得显而易见。
详述
应该理解：本公开书不限于所述的具体方法和实验条件，因为所述方法和条件可以变化。还应该理解：本文所用的术语仅用于描述特定实施方案，而不是旨在限制，因为本公开书的范围将仅受所附权利要求书的限制。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开书所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。如本文所用，当用于特定的所述数值时，术语“约”意指该值与所述数值的变化不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101，以及介于两者之间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。术语“图”和“附图”在整个说明书中可互换使用。
尽管与本文所述的方法和材料相似或相同的任何方法和材料可用于抗体-药物缀合物和组合物以及方法和用途的实践或测试中，现在描述优选的方法和材料。将本说明书中提到的所有专利、申请和非专利出版物以其全部引入文中作为参考。
附图简述
图1A-1G显示在T-ALL胸腺移植模型中，上调与β-选择和DN向DP转换相关的基因。图1A显示T-ALL肿瘤vs.对照脾脏中选择β-选择因子的热图。相对于对照脾脏，在T-ALL样本中，Cxcr4、Myc、Notch1、Notch3、Ptcra、Rag1、Rag2和Dntt均强烈上调；Robust CenterScale标准化。图1B-1D显示Ptcra(1B)、Notch3(1C)和Notch1(1D)在不同对照组织和原发性T-ALL肿瘤中的表达。图1E-1G显示典型T-ALL病例中Ptcra(1E)、Notch3(1F)和Notch1(1G)的细胞表面表达。
图2显示一个表格，其列出T-ALL胸腺移植模型中最大差异表达的基因(与C57B15小鼠的外周T细胞相比，T-ALL肿瘤中差异表达最大的基因)。
图3A-3D显示Ptcra KO导致胸腺发育不良和胸腺细胞停滞在DN3检查点。图3A显示源自Ptcra KO动物的胸腺在大小(顶部)、质量(中部，条形图)和细胞(底部，条形图)方面显著减少。n＝4，误差线表示s.d.。图3B和3C显示免疫分析表明Ptcra KO胸腺大大缺乏DP细胞(3B)，并且大多数胸腺细胞停滞在DN3期(3C)。n＝5+/-s.d.。图3D以条形图的形式显示与它们的免疫表型一致，基因表达分析揭示Ptcra KO胸腺中DN3-相关基因的强烈上调和DP标记的下调。n＝5，误差条表示s.d.。
图4A和4B显示Ptcra KO小鼠的胸腺发育不良随着年龄的增长而改善。图4A显示源自幼年(～1周龄)和成年(～6个月龄)野生型(WT)和Ptcra KO小鼠的胸腺的代表性免疫表型。图4B提供幼年(上面的条形图)和老年(下面的条形图)WT和Ptcra KO胸腺的免疫表型分析定量。Ptcra KO胸腺细胞在DN3的发育停滞于成年后不太明显；不能完成DN向DP转换的能力几乎完全逆转。
图5A和5B显示Notch3的基因消融不会损害胸腺细胞的发育。图5A显示野生型(WT)和Notch3 KO胸腺中胸腺细胞发育的DN阶段Notch3的表达。显示两个不同峰的5A所示的图中，Notch3峰是右侧的峰。不显示两个不同峰的5A所示的图中，Notch3峰和同型对照峰重叠。图5B显示在WT和Notch3 KO胸腺发育的DN1-DN4阶段的胸腺细胞定量，没有观察到统计学显著差异。
图6显示移植后，Ptcra KO胸腺维持T细胞产生的能力。在胸腺移植研究的过程中，通过流式细胞术监测外周T细胞的频率。将单一野生型(WT)、Ptcra KO和多重(4～8个)Ptcra KO供体胸腺的值绘图。
图7A-7C显示Ptcra基因消融导致T-ALL发育受损。图7A显示胸腺移植研究中动物的存活曲线。野生型(WT)胸腺叶移植的动物形成T-ALL，中位发病时间约为25周(蓝线)。移植有两个Ptcra KO胸腺叶(红线)或4～8个Ptcra KO胸腺叶(绿线)的动物显示很强的白血病发生延迟。对于WT胸腺移植，n＝25；对于PTCRA KO移植，n＝35。用log-rank(Mantel-Cox)检验计算的P-值。图7B显示代表性野生型胸腺移植小鼠和Ptcra KO移植小鼠外周原始细胞的监测。图7C显示Ptcra KO与WT肿瘤的基因表达谱。对于Ptcra-靶基因和参与DN向DP转换的基因，下调的基因富集；对于与ETP-ALL相关的基因，上调的基因富集。
图8A和8B显示人T-ALL中NOTCH3的表达和潜在功能。图8A显示相对于对照样本，在人T-ALL患者样本中NOTCH3上调。图8B显示TALL-1人T-ALL细胞株在NOTCH3(Notch3 HDD)中具有功能突变，并表达野生型NOTCH1。用γ-分泌酶抑制剂(GSI)处理该细胞株显著抑制细胞增殖。
图9显示在胸腺移植模型中，Notch3的基因消融不会损害T-ALL的发育。在胸腺移植模型中，Notch3 KO胸腺以与野生型(WT)对照相似频率产生T-ALL。
图10A-10E显示在人T-ALL中，PTCRA选择性上调。图10A显示PTCRA表达于大多数人T-ALL细胞株中，但在癌症细胞株百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia)分析的AML或B-ALL细胞株中却没有。在所述数据集中，对于B-ALL、AML和T-ALL细胞株，将PTCRA RNA基因表达绘图。图10B显示PTCRA在St.Jude儿童研究医院(St.Jude Children’s ResearchHospital)造血系统恶性肿瘤队列中的大多数T-ALL患者中高表达，但在AML和B-ALL样本中却非如此。将PTCRA RNA表达按肿瘤类型作图。图10C显示相对于正常骨髓对照和Haferlach患者队列中非-T-ALL血液肿瘤类型，T-ALL肿瘤中PTCRA上调。在图10D中，相对于同型对照，用流式细胞仪在原发性和化疗抵抗(#150)人T-ALL患者样本、人B-ALL患者样本和人AML患者样本中评估PTCRA细胞表面表达。仅在T-ALL样本中，观察到表面染色。在图10E中，相对于同型对照，通过流式细胞仪在源自PBMCs的原代人T细胞中评估的PTCRA细胞表面表达。正常T细胞是从供体PBMCs中分离到的活CD45+CD3+细胞。
图11A和11B显示除了ETP-样亚组，PTCRA在所有主要的T-ALL亚型中表达，而且Notch1突变与人T-ALL中PTCRA表达水平较高有关。在来自St.Jude’s Pediatric CancerPatient队列的T-ALL患者中，PTCRA表达。图11A：根据基因组重排和基因表达分析，在St.Jude儿童研究医院血液病肿瘤队列中，T-ALL肿瘤的分子亚型分型强调PTCRA在大多数T-ALL亚型中广泛表达，除了发育最原始的ETP样亚型。T-ALL中PTCRA的表达与NOTCH1功能获得(GoF)突变呈正相关。在图11B中，PTCRA表达是基于St.Jude’s Pediatric CancerPatient队列中NOTCH1突变状态的分层。通过单向方差分析计算P-值。
图12证明mAb克隆2F5结合人PTCRA的有效性。将小鼠成纤维细胞与编码人PTCRA的质粒和重排的小鼠Tcrb基因共转染。根据生产商的方案，通过流式细胞术，利用2F5 mAb靶向的Ptcra，评价PTCRA细胞表面表达。
图13显示列出图10A-10E中所述原发性人恶性肿瘤样本特征的表。
图14提供Western blot分析，证实在人PTCRA KO T-ALL细胞株SupT1、HPB-ALL和Jurkat中PTCRA表达的有效消融。将PTCRA用两个独立的CRISPR/Cas9指导RNA(KO1，KO2)和对照(C)指导RNA靶向。将微管蛋白的表达用作内参对照(loading control)。
图15A-15D显示人T-ALL细胞株中PTCRA的缺失显著损害细胞增殖。对于图15A，将SupT1(左)，HPB-ALL(中)和Jurkat(右)细胞株用Cas9稳定转染，然后用指定的gRNA转导。用gRNA转导后定量增殖。n＝3，误差线表示s.d.。在图15B中，在NSG小鼠中，皮下植入的野生型SupT1细胞形成肿瘤，而带有PTCRA KO细胞的SupT1细胞则没有。n＝3，误差线表示s.d.。在图15C中，用SRC-家族激酶抑制剂PP1处理SupT1细胞，诱导剂量依赖性抗增殖反应。n＝5，误差线表示+/-s.d.。在图15D中，CRISPR/Cas9-介导的SupT1细胞中LCK的缺失强烈抑制体外增殖。n＝3，误差线表示+/-s.d.。
图16A-16I显示PTCRA靶向抗体-药物缀合物在体内和体外驱动T-ALL细胞的特异性杀伤。对于图16A，将mTALL细胞接种在OP9-DLL1的饲养层上，并用PTCRA mAb或同型对照mAb在所示浓度下处理，然后用20nM抗-小鼠IgG Fc MMAE处理。处理后96小时，用CellTiterGlo测定法定量细胞活力。n＝4。在图16B中，PTCRA mAB和同型对照mAb直接与有效的微管抑制剂缀合。将mTALL细胞接种于OP9-DLL1的饲养层，并用指定剂量的对照-ADC或PTCRA-ADC处理。n＝4。对于图16C，将各种恶性的和正常的人细胞用10nM PTCRA-ADC或10nM对照-ADC处理。细胞活力用CellTiterGlo定量。n＝3。每对条形(对于T-ALL(SupT1)、B-ALL(NALM6)、AML(K562)和正常T细胞各1对)的左侧条对应于对照-ADC，并且右侧条相应于PTCRA-ADC。在图16D中，将100,000个原代mTALL细胞静脉注射至NSG小鼠。第2天，将小鼠按肿瘤负荷(FACS，外周血)随机分组，并用PTCRA-ADC或同种型对照-ADC处理。治疗在第2天、第6天和第12天进行。在14天的终点，通过脾脏质量(splenic mass)评价肿瘤负荷。对于图16E，在治疗期间，通过流式细胞术监测外周血中的肿瘤负荷。每一对“列”点(第0天、第5天、第12天和第14天各1对)的左侧“列”点相应于对照-ADC，右边的“列”点相应于PTCRA-ADC。图16F以表格形式提供图16B的结果与数值。图16G以表格形式提供图16C的结果与数值。图16H以表格形式提供图16D的结果与数值。图16I以表格形式提供图16E的结果与数值。
图17描述用PTCRA-ADC治疗的小鼠的体重随时间的变化。
图18A和18B显示pre-TCR的内化动力学。在图18A中，将内源性表达PTCRA的SupT1细胞用抗PTCRA抗体在4℃染色(红色)30分钟后，将细胞温度升至37℃，并在温度变化后的指定时间用二抗(绿色)染色。然后，固定细胞，并将免疫荧光共聚焦显微镜用于使PTCRA定位可视化。在0分钟时，在SupT1细胞的细胞表面检测到PTCRA，但随着检测时间的推移，迅速而强有力地内化。在图18B中，将SupT1细胞用翻译抑制剂放线菌酮处理指定的时间段，此时将细胞收集、裂解，并将提取物用于免疫印迹。PTCRA在实验的8小时内迅速降解。
图19A-19H显示用细胞毒性抗体-药物缀合物靶向PTCRA可促进体外和体内T-ALL细胞的特异性杀伤。图19A以线图的形式显示增加ADC浓度的相对活力。图19B以条形图形式显示T-ALL(SupT1)、B-ALL(NALM6)、AML(K562)和正常T细胞中不同连接子-有效载荷的相对活力。图19C以线图的形式显示植入后至多约35天，对照-MAYTL4PADC与PTCRA-MAYTL4PADC的肿瘤体积。图19D以绘图(plot)形式显示PBS vs.对照-MAYTL4PADC vs.PTCRA-MAYTL4PADC在第3周时的脾脏重量。图19E以绘图形式显示，对于PBS vs.对照-MAYTL4PADCvs.PTCRA-MAYTL4PADC在第1、2和3周时，PB中白血病原始细胞(％)。图19F以条形图形式显示，在第1、2和3周时，PBS与对照-MAYTL4PADC和PTCRA-MAYTL4PADC的正常T细胞计数。图19G以表格形式提供图19A的值。图19H以表格形式显示图19B的数值。
定义
如本文所用的表达前T细胞抗原受体α(PTCRA)等是指人前T细胞抗原受体α(PreT-Cell Antigen Receptor Alpha)，包括例如如SEQ ID NOs:1和2所示的氨基酸序列。表述“PTCRA”包括单体和多聚体PTCRA分子。如本文所用，表述“单体人PTCRA”是指PTCRA蛋白或其部分，它不包含或不具有任何多聚化结构域，并且在正常条件下作为单个PTCRA分子存在，而与另一个PTCRA分子没有直接的物理联系。如本文所用，表述“二聚体人PTCRA”意指包含通过连接子、共价键、非共价键或通过多聚化域如抗体Fc域相互连接的两个PTCRA分子的构建体。
人PCTRA同种型X1(NCBI XP_024302110.1)的氨基酸序列如下：
Figure BDA0003553133530000071
人PCTRA同种型2前体(NCBI NP_612153.2)的氨基酸序列如下：
Figure BDA0003553133530000081
该较短同种型缺乏大部分的细胞外结构域。
本文中所有对蛋白质、多肽和蛋白质片段的提及都旨在指人类版本的各蛋白质、多肽或蛋白质片段，除非明确指定为来自非人类物种。因此，表述“PTCRA”是指人PTCRA，除非指定为来自非人类物种，例如“小鼠PTCRA”、“猴PTCRA”等。
如本文所用，表述“细胞表面表达的PTCRA”是指体外或体内表达于细胞表面的一个或多个PTCRA蛋白或其胞外结构域，使得PTCRA蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的胞外侧，并可接触到抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的PTCRA”可以包括在正常表达PTCRA蛋白的细胞的表面上表达的PTCRA蛋白或由其组成。或者，“细胞表面表达的PTCRA”可以包含在细胞表面表达的PTCRA蛋白或由其组成，所述细胞正常地在其表面不表达人PTCRA，但已将其人工工程改造，以在其表面表达PTCRA。
如本文所用，表述“抗-PTCRA抗体”包括具有单一特异性的单价抗体，以及包含结合PTCRA的第一臂和结合第二(靶)抗原的第二臂的双特异性抗体。表述“抗-PTCRA抗体”包括抗体-药物缀合物(ADCs)，该缀合物包含缀合至治疗物质(例如一种药物或毒素，即细胞毒性物质)的抗PTCRA抗体或其抗原结合部分。表述“抗-PTCRA抗体”还包括抗体-放射性核素缀合物(ARCs)，其包含与放射性核素缀合的抗PTCRA抗体或其抗原结合部分。
如本文所用，术语“抗体”意指任何抗原-结合分子或分子复合物，其包含至少一个互补决定区(CDR)，该互补决定区与特定抗原(例如PTCRA)特异性结合或相互作用。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链，通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链，及其多聚体(例如IgM)。每个重链包含重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区域可以进一步细分为高变异性区域，称为互补决定区域(CDRs)，其穿插于称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基端到羧基端以下面顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本公开书的不同实施方案中，抗-PTCRA抗体(或其抗原-结合部分)的FRs可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。可将氨基酸共有序列基于两个或多个CDRs的并列分析来定义。
如本文所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原-结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原-结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、可酶解得到的、合成的或基因工程多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原，以形成复合物。抗体的抗原-结合片段可以衍生得到，例如利用任何合适的标准技术诸如蛋白水解消化或重组基因工程技术(涉及编码抗体可变和任选的恒定域的DNA操作和表达的)从完全抗体分子得到。所述DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得或者可以合成。可以将DNA用化学方法或通过分子生物学技术进行测序和操作，例如，将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成适当的构型或者引入密码子，创建半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原-结合片段的非限制性示例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如孤立的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽)，或受限制的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程分子例如结构域-特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双抗体、三体、四体、微体、纳米体(例如单价纳米体、二价纳米体等)、小型模块化免疫药物(SMIPs)和鲨鱼可变IgNAR域也包含在本文所用的表述“抗原-结合片段”范围里。
抗体的抗原-结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包含与一个或多个框架序列相邻或在框架内的至少一个CDR。在具有与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以以任何适当的排列彼此坐落。例如，可变区可以是二聚体并包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原-结合片段可包含单体VH或VL域。
在某些实施方案中，抗体的抗原-结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。在本公开书中所述的抗体的抗原-结合片段中可以发现的可变和恒定结构域的非限制性、示范性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变域和恒定域的任何构型中，包括上文列出的任何示例性构型，可变和恒定区域可以直接相互连接或者可以通过完全或部分的铰链或连接区域连接。铰链区可由至少2个(例如5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变域和/或恒定域之间的柔性或半柔性连接。此外，本公开书中所述的抗体的抗原-结合片段可包含上文列出的可变和恒定结构域构型中任何一种的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)，彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如通过二硫键)非共价结合。
与全抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合到不同的抗原或同一抗原上的不同表位。利用本领域可用的常规技术，任何多特异性抗体形式包括本文所述的双特异性抗体形式，可适于用于本公开书的抗体的抗原结合片段的内容中。
本文提到的抗体可通过补体-依赖性细胞毒性(CDC)或抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)发挥功能。“补体-依赖性细胞毒性”(CDC)是指在补体存在的情况下，通过本公开书的抗体裂解抗原表达细胞。“抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性”(ADCC)是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，从而导致靶细胞溶解。可以利用本领域已知和可用的分析方法测量CDC和ADCC(参见例如美国专利号5,500,362和5,821,337，以及Clynes等人(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗体的恒定区对抗体固定补体和介导细胞-依赖性细胞毒性的能力很重要。因此，可以根据是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同种型。
在某些实施方案中，ADCs的抗-PTCRA抗体是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域的抗体。本公开书的ADCs的人抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点-特异性突变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDRs特别是CDR3中。然而，如本文所用的术语“人抗体”并不预期包括其中来源于另一哺乳动物(如小鼠)种系的CDR序列已移植到人类框架序列上的抗体。
在一些实施方案中，本公开书的ADCs的抗体可以是重组人抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如利用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)，从重组体、组合人类抗体库分离的抗体(下文进一步描述)，从人类免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或者通过涉及人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域。然而，在某些实施方案中，所述重组人抗体经受体外诱变(或者当利用人类Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是虽然来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可能并不天然存在于人抗体种系库中。
人抗体可以以两种形式存在，这两种形式与铰链的异质性有关。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150～160kDa的稳定四链结构，其中二聚体通过链间重链二硫键结合在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成由共价偶联的轻链和重链组成大约75～80kDa的分子(半抗体)。即使在亲和纯化后，所述形式也很难分离。
在各种完整的IgG同种型中出现第二种形式的频率是由于但不限于与抗体铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区的单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现显著减少至(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)用人IgG1铰链观察到的典型水平。本公开书包含在铰链、CH2或CH3区域具有一个或多个突变的抗体，这些抗体可能是需要的，例如，在生产中，以提高所需抗体形式的产量。
本文公开的ADCs的抗体可以是分离抗体。本文所用的“分离抗体”是指从其自然环境的至少一种组分中鉴定且分离和/或回收的抗体。例如，已从生物体的至少一种成分中分离或移出的抗体或者从天然存在抗体或自然产生抗体的组织或细胞中分离或移出的抗体是用于本公开书目的的“分离抗体”。分离抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离抗体是经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
与抗体来源的相应种系序列相比，本文公开的ADCs的抗-PTCRA抗体可以包含重链和轻链可变域的框架和/或CDR区域一个或多个氨基酸的置换、插入和/或缺失。通过比较本文公开的氨基酸序列和例如公共抗体序列数据库中获得的种系序列，可以很容易地确定所述突变。本公开书的ADCs包括抗体及其抗原结合片段，其来源于本文所述抗体的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区域内的一个或多个氨基酸突变为抗体来源的种系序列的相应残基或另一人类种系序列的相应残基，或相应种系残基的保守氨基酸置换(所述序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文所用的抗体的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地生产许多抗体和抗原-结合片段，其包含一个或多个个体种系突变或其组合。在某些实施方案中，将VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回抗体来源的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，只有某些残基突变回原来的种系序列，例如只有FR1前8个氨基酸内或FR4后8个氨基酸内的突变残基，或只有CDR1、CDR2或CDR3内的突变残基。在其他实施方案中，将一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列的相应残基(即不同于抗体最初来源的种系序列的种系序列)。此外，本公开书的ADCs的抗体可以包含框架和/或CDR区域内两个或更多个种系突变的任何组合，例如其中某些单个残基突变为特定种系序列的相应残基，而与原始种系序列不同的某些其他残基保持不变或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，可以很容易地检测包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一个或多个所需特性，例如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物学性质(视情况而定)，降低的免疫原性等。将以所述通用方式获得的抗体和抗原结合片段用于本公开书中。
本公开书还包括包含抗-PTCRA抗体的ADCs，所述抗体包含本文提到的具有一个或多个保守置换的抗体的任何全氨基酸序列、HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本公开书包括包含具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗-PTCRA抗体的ADCs，相对于本文所述抗体的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任何一个，其具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸置换。
术语“表位”指的是抗原决定簇，它与称为抗体决定簇(paratope)的抗体分子可变区中的特异性抗原结合位点相互作用。单个抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原上的不同区域结合，并可具有不同的生物学效应。表位可以是有构象的或线性的。一个构象表位是由线性多肽链不同片段的空间上并列而排的氨基酸产生的。线性表位是多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖部分、磷酰基基团或磺酰基基团。
当指核酸或其片段时，术语“基本同一的”或“基本上一致的”表示，当适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳对齐时，根据下文所述，如通过任何已知的序列同一性算法例如FASTA、BLAST或Gap测量的，至少大约95％，并更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子基本同一的核酸分子可以编码具有与参考核酸分子编码的多肽相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本相似的”意指当最佳对齐时，例如利用使用缺省间隙权重(default gap weights)的程序GAP或BESTFIT，两个肽序列共享至少95％序列同一性，甚至更优选至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置通过保守氨基酸置换而不同。“保守氨基酸置换”是指一个氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基置换。一般来说，保守氨基酸置换不会实质性地改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列通过保守置换而彼此不同的情况下，序列百分比同一性或相似程度可向上调整，以校正置换的保守性。进行所述调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，将其引入文中作为参考。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的示例包括：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；(7)含硫侧链是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守置换是在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化，将该文献引入文中作为参考。“中度保守”置换是指PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常用序列分析软件测量多肽的序列相似性，也称为序列同一性。蛋白质分析软件利用对不同置换、缺失和其他修饰包括保守氨基酸置换的相似性度量，来匹配相似序列。例如，GCG软件包含程序例如Gap和Bestfit，所述程序可以采用默认参数使用，以确定密切相关多肽例如来自不同生物体种类或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的同源多肽之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。也可以利用使用默认或推荐参数的FASTA，GCG版本6.1的程序，比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(2000)supra)。当将本公开书的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一个优选的算法是计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，利用默认参数。参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402，将其各自引入文中作为参考。
抗-PTCRA抗体-药物缀合物
本文提供的是包含特异性结合前-T-细胞抗原受体α(PTCRA)的抗体或其抗原-结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)，其中抗体或其抗原结合片段与治疗部(therapeuticmoiety)缀合，所述治疗部分例如但不限于细胞毒性物质、化疗药物、免疫调节药物或者放射性同位素。
在一些实施方案中，抗体-药物-缀合物具有下述结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段；
L是连接体(linker)；
Pay(或有效载荷)是治疗部分；且
n是1-10的整数。
抗体
本文提供的抗体-药物缀合物包含抗-PTCRA抗体或其抗原-结合片段。
在一些实施方案中，抗-PTCRA抗体可以是完全人抗体。产生单克隆抗体包括完全人单克隆抗体的方法是本领域已知的。任何所述已知方法可用于本公开书上下文中，以制备与人PTCRA特异性结合的人抗体。
包含在本文公开的ADCs中的抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)或可以仅包含抗原-结合部分(例如Fab、F(ab')2或scFv片段)，并可将其修饰，以影响功能，例如以消除残余效应器功能(Reddy等人200，J.Immunol.164：1925-1933)。
本文公开的ADCs中所用的抗体靶向PTCRA。
在一些实施方案中，本文公开的ADCs中所包括的抗-PTCRA抗体是2F5(BDBiosciences，目录项编号552407)。
公共数据库也可用于识别抗体中的CDR序列。
本公开书包括抗体-药物缀合物，其包含具有修饰的糖基化模式的抗-PTCRA抗体。在一些实施方案中，修饰以除去不期望的糖基化位点可能是有用的，或者缺乏寡糖链上存在的岩藻糖基团的抗体，例如以增加抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人2002JBC 277：26733)。在其他申请中，可以进行半乳糖基化修饰，以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
pH-依赖性结合
本文公开的抗体-药物缀合物可使用具有pH-依赖性结合特性的抗-PTCRA抗体。可以例如通过筛选与中性pH相比，在酸性pH下与特定抗原结合减弱(或增强)的抗体群体而获得具有pH-依赖性结合特性的抗体。此外，氨基酸水平的抗原结合域的修饰可产生具有pH-依赖性特性的抗体。例如，通过用组氨酸残基置换抗原结合域(例如CDR内的)的一个或多个氨基酸，可以获得相对于中性pH，在酸性pH下抗原结合减弱的抗体。
包含Fc变体的抗-PTCRA抗体
根据某些实施方案，本文公开的ADCs中包括的抗PTCRA抗体包含Fc结构域，该Fc结构域包含与中性pH相比，例如在酸性pH下增强或减少与FcRn受体结合的抗体的一个或多个突变。例如，本公开书包括包含Fc结构域的CH2或CH3区域中突变的抗-PTCRA抗体，其中所述突变在酸性环境中(例如在pH值约为5.5～6.0的内体中)增加Fc结构域对FcRn的亲和力。当施用至动物时，所述突变可能导致抗体的血清半衰期增加。所述Fc修饰的非限制性示例包括例如在位置250的修饰(例如E或Q)；250和428的修饰(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或者位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或位置250和/或428的修饰；或者位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一实施方案中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如308F或308P)。
例如，本公开书包括含有Fc结构域的抗-PTCRA抗体，Fc结构域包括一个或多个突变对或组，其选自：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。认为前述Fc结构域突变的所有可能组合，以及本文公开的抗体可变结构域内的其他突变在本公开书的范围内。
抗体的生物学特性
本公开书包括含有特异性结合人PTCRA的抗体及其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)。可以通过表面等离子体共振或基本相似的测定法测量结合。
本公开书包括含有以高亲和力结合单体人PTCRA的抗体及其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)。本公开书还包括含有以高亲和力结合二聚体/多聚体人PTCRA的抗体及其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)。
本公开书进一步包括含有结合PTCRA并在表达人PTCRA的细胞中阻断Notch信号传导(signaling)的抗体及其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)。例如，本公开书包括含有抗-PTCRA抗体的抗体-药物缀合物(ADCs)，如利用Notch信号传导阻断测定法测量的，所述抗-PTCRA抗体阻断表达人PTCRA的细胞中的Notch信号传导。因此，本公开书包括在表达人PTCRA的细胞中阻断Notch信号传导的抗体-药物缀合物(ADCs)。
本公开书包括含有结合PTCRA但不阻断表达人PTCRA的细胞中的Notch信号传导的抗体及其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)。如本文所用，抗体或其抗原结合片段“不阻断”Notch信号传导，如果在Notch信号传导阻断测定或基本相似的测定中进行测试时，该抗体没有或只有微不足道的阻断活性。根据某些实施方案，当在Notch信号阻断测定中测试时，如果抗体表现出大于约10nM或大于约100nM的IC50值，则抗体或抗原结合片段“不阻断”Notch信号传导。因此，在一些实施方案中，本公开书包括抗体-药物缀合物(ADCs)不阻断表达人PTCRA的细胞中的Notch信号转导。
本公开书包括含有结合PTCRA且在表达人PTCRA的细胞中阻断pre-TCR信号传导的抗体及其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)。例如，本公开书包括含有抗-PTCRA抗体的抗体-药物缀合物(ADCs)，如用pre-TCR信号阻断测定法测量的，所述抗-PTCRA抗体阻断表达人PTCRA的细胞中的pre-TCR信号传导。因此，本公开书包括在表达人PTCRA的细胞中阻断pre-TCR信号传导的抗体-药物缀合物(ADCs)。
本公开书还包括含有结合PTCRA但不阻断表达人PTCRA的细胞中pre-TCR信号传导的抗体及其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)。如本文所用，抗体或其抗原结合片段“不阻断”pre-TCR信号传导，如果在pre-TCR信号传导阻断测定或基本相似的测定中进行测试，该抗体没有或只有微不足道的阻断活性。根据某些实施方案，当在pre-TCR信号传导阻断测定中测试时，如果抗体表现出大于约10nM或大于约100nM的IC50值，则抗体或抗原结合片段“不阻断”pre-TCR信号传导。因此，在一些实施方案中，本公开书包括抗体-药物缀合物(ADCs)，其不阻断表达人PTCRA的细胞中的pre-TCR信号传导。
包含在本文公开的ADCs中的抗体可以具有一种或多种上述生物学特性或其任何组合。因此，本文公开的ADCs可具有一种或多种上述生物学特性或其任何组合。抗体的上述生物学特性并不预期是详尽无遗的。对于本领域的普通技术人员来说，参考包括本文工作实施例的本公开书，抗体的其他生物学特性将是显而易见的。
表位作图及相关技术
本公开书的ADCs的抗体结合表位可以由PTCRA蛋白的3个或更多个(例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)氨基酸的单个相邻序列组成。或者，表位可以由PTCRA的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。
本领域普通技术人员已知的各种技术可用于测定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或多个氨基酸相互作用”。典型的技术包括例如常规的交叉-阻断测定法诸如所描述的抗体、Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb.，NY)、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke，2004，Methods Mol Biol248：443-463)和肽裂解分析。此外，可以采用抗原表位切除、表位提取和化学修饰等方法(Tomer，2000，Protein Science9：487-496)。可用于鉴定多肽内氨基酸与其抗体相互作用的另一种方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换方法涉及用氘标记感兴趣的蛋白质，然后让抗体与氘标记的蛋白质结合。随后，将蛋白/抗体复合物转移至水中，以使除受抗体保护的残基(其保留氘标记)外的所有残基都发生氢-氘交换。抗体解离后，目标蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示与抗体相互作用的特定氨基酸对应的氘标记残基。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
本公开书进一步包括含有抗-PTCRA抗体的ADCs，所述抗-PTCRA抗体与本文所述的任何特异性示范抗体结合相同的表位。同样地，本公开书还包括含有抗-PTCRA抗体的ADCs，所述抗-PTCRA抗体与本文所述的任何特异性示范抗体竞争结合PTCRA。
利用本领域已知和文中示例的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参照抗-PTCRA抗体结合相同的表位，或与参照抗-PTCRA抗体竞争结合。例如，为了确定受试抗体是否与本文所述的参照抗-PTCRA抗体结合相同的表位，让参考抗体与PTCRA蛋白结合。然后，评价受试抗体结合至PTCRA分子的能力。如果用参照抗-PTCRA抗体结合饱和后，受试抗体能与PTCRA结合，可以得出结论：受试抗体与参照抗-PTCRA抗体结合不同的表位。另一方面，如果用参照抗-PTCRA抗体结合饱和后，受试抗体不能与PTCRA分子结合，那么受试抗体可以结合至与本文所述的参照抗-PTCRA抗体结合表位的相同表位。然后，可以进行其他常规实验(例如肽突变和结合分析)，以确证是否观察到的受试抗体结合缺失是由于与参考抗体结合到相同的表位，或者是否由于空间阻断(或其他现象)导致观察到的结合缺失。所述类型的实验可以利用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或任何其他本领域可用的定量或定性抗体-结合测定法完成。根据本公开书的某些实施方案，如竞争性结合测定法(参见例如Junghans等人，Cancer Res.1990：50：1495-1502)中测量的，如果例如1-、5-、10-、20-或100-倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合至少50％，但最好是75％、90％或者甚至99％，那么两个抗体结合到相同(或重叠)表位。或者，如果减少或消除一种抗体结合的抗原上的所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体结合，则认为两种抗体结合至相同表位。如果减少或消除一种抗体结合的仅一个子集的氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。
为了确定是否抗体与参考抗-PTCRA抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，上述结合方法从两个方向进行：在第一个方向，参考抗体在饱和条件下与PTCRA蛋白结合，然后评价受试抗体与PTCRA分子的结合。在第二个方向上，受试抗体在饱和条件下与PTCRA分子结合，然后评价参考抗体与PTCRA分子的结合。如果在两个方向上，只有第一个(饱和)抗体能与PTCRA分子结合，那么就得出结论：受试抗体和参考抗体与PTCRA竞争结合。本领域普通技术人员应该理解：与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合到相同的表位，而可通过结合重叠或相邻的表位而立体阻断参照抗体的结合。
生物等效性
抗体-药物缀合物包含抗-PTCRA抗体和抗体片段，其包含具有与所述抗体不同的氨基酸序列但保留结合人PTCRA能力的蛋白质。当与亲本序列相比时，所述变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸添加、缺失或置换，但显示与所述抗体基本相当的生物活性。同样地，当与公开序列相比时，本文所述的抗-PTCRA抗体-编码DNA序列包含含有一个或多个核苷酸添加、缺失或置换的序列，但其编码抗-PTCRA抗体或抗体片段，其与本文公开的ADC中包括的抗-PTCRA抗体或抗体片段基本上生物等效。所述变体氨基酸和DNA序列是上文讨论的。
根据本公开书的ADCs中包括的抗-PTCRA抗体的生物等效变体可以通过例如对残基或序列进行各种置换或者删除生物活性不需要的末端或内部残基或序列而构建。例如，可以将对生物活性不是必需的半胱氨酸残基删除或用其他氨基酸置换，以防止在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫键。在其他情况下，生物等效抗体可包括抗-PTCRA抗体变体，其包含修饰抗体糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或除去糖基化的突变。
物种选择性与物种交叉反应性
根据某些实施方案，本公开书提供包含抗-PTCRA抗体的抗体-药物缀合物，所述抗-PTCRA抗体与人PTCRA结合，但不与来自其他物种的PTCRA结合。本公开书还包括含抗-PTCRA抗体的抗体-药物缀合物，所述抗-PTCRA抗体结合人PTCRA和来自一种或多种非人类物种的PTCRA。例如，本文公开的ADCs可包含抗-PTCRA抗体，其结合人PTCRA，并可结合或不结合(视情况而定)一种或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩PTCRA。根据某些示例性实施方案，本文公开的ADCs可包含特异性结合人PTCRA和猕猴(例如食蟹猴(Macaca fascicularis))PTCRA的抗-PTCRA抗体。本文公开的其他ADCs可包含抗-PTCRA抗体，其结合人PTCRA但不结合或仅弱结合猕猴PTCRA。
治疗部分
本文提供的抗体-药物缀合物(ADCs)包含与治疗部分缀合的抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述治疗部分是细胞毒性物质、化疗药物、免疫调节药物或放射性同位素。
细胞毒性物质包括对细胞生长、存活或繁殖有害的任何物质，包括但不限于微管蛋白-相互作用物质和DNA-损伤物质。根据本公开书的这一方面，可以缀合至抗-PTCRA抗体的适当的细胞毒性物质和化疗物质的示例包括例如1-(2-氯乙基)-1,2-二甲烷磺酰肼、1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D、鹅膏蕈碱(amanitins)、氨喋呤、蛇形菌素(anguidine)、蒽环霉素、氨茴霉素(AMC)、奥瑞他汀类(auristatins)、博莱霉素、白消安、丁酸、卡奇霉素类(calicheamicins)(例如卡奇霉素γ1)、喜树碱、洋红霉素、卡莫司汀、西马多丁(cemadotins)、顺铂、秋水仙碱、考布他汀(combretastatins)、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素、氮烯咪胺(decarbazine)、二乙酰氧基戊基阿霉素(diacetoxypentyldoxorubicin)、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、disorazoles、海兔毒素(dolastatin)(例如海兔毒素10)、阿霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、棘霉素、软珊瑚醇(eleutherobins)、依米丁(emetine)、埃博霉素、埃斯培拉霉素(esperamicin)、雌氮芥、溴乙锭(ethidium bromide)、依托泊苷、氟尿嘧啶、格尔德霉素类(geldanamycins)、短杆菌肽D、糖皮质激素类、伊立替康类(irinotecans)、驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、来普霉素类(leptomycins)、环氧长春碱类(leurosines)、利多卡因、洛莫司汀(lomustine；CCNU)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、氮芥、美法仑、mercatopurines、甲氨蝶呤类(methopterins)、甲氨蝶呤(methotrexate)、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素、米托蒽醌、N8-乙酰基亚精胺、鬼臼毒素类、普鲁卡因、普萘洛尔、蝶啶类、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003553133530000221
类(PBDs)、根霉素类(rhizoxins)、链脲霉素(streptozotocin)、他利霉素(tallysomycins)、紫杉醇、tenoposide、丁卡因、噻替哌苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、托马霉素类(tomaymycins)、拓扑替康类(topotecans)、tubulysin、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和任何前述化合物的衍生物。根据某些实施方案，与抗-PTCRA抗体缀合的细胞毒性物质是美登木素生物碱。根据进一步的实施方案，美登木素生物碱是DM1或DM4、托马霉素衍生物或海兔毒素衍生物。根据更进一步的实施方案，所述美登木素生物碱是DM1。根据某些实施方案，与抗-PTCRA抗体缀合的细胞毒性物质是奥瑞他汀(auristatin)。根据进一步实施方案，所述奥瑞他汀是MMAE、MMAF或其衍生物。根据更进一步的实施方案，所述奥瑞他汀是MMAE。认为本领域中已知的其他细胞毒性物质在本公开书范围内，包括例如蛋白质毒素诸如蓖麻毒素、艰难梭菌(C.difficile)毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、异株腹泻毒蛋白(bryodin)、皂草素(saporin)、商陆(pokeweed)毒素类(即商陆毒素(phytolaccatoxin)和商陆皂甙元(phytolaccigenin))，以及其他的，例如Sapra等人，Pharmacol.&Therapeutics，2013，138：452-469中所述那些。在另一实施方案中，细胞毒性物质是tubulysin。在另一实施方案中，细胞毒性物质是PBD。
在一些实施方案中，细胞毒物质是奥瑞他汀。
在另一实施方案中，细胞毒物质是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。
在另一实施方案中，细胞毒物质是单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
在一些实施方案中，细胞毒物质是：
Figure BDA0003553133530000231
在某些实施方案中，细胞毒物质是美登木素生物碱，例如美登素(maytansine)衍生物。适当的美登木素生物碱类包括DM1、DM4或其衍生物、立体异构体或同位素体。适当的美登木素生物碱类还包括但不限于WO 2014/145090A1、WO 2015/031396A1、US 2016/0375147A1和US 2017/0209591A1中公开的那些，将其以其全部引入文中作为参考。
在一些实施方案中，美登木素生物碱类具有下述结构：
Figure BDA0003553133530000232
其中A为任选取代的亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，美登木素生物碱具有下述结构：
Figure BDA0003553133530000233
其中A为任选取代的亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，美登木素生物碱具有下述结构：
Figure BDA0003553133530000241
其中n是1-12的整数，并且R1是烷基。
在一些实施方案中，美登木素生物碱是：
Figure BDA0003553133530000242
Figure BDA0003553133530000252
Figure BDA0003553133530000251
(MATY4),
Figure BDA0003553133530000261
Figure BDA0003553133530000271
在一些实施方案中，美登木素生物碱是
Figure BDA0003553133530000272
(“MAYT2”)。
在一些实施方案中，美登木素生物碱是：
Figure BDA0003553133530000273
在一些实施方案中，美登木素生物碱是：
Figure BDA0003553133530000281
(MAYT3”)。制备MAYT3的方法包括美国专利号US 10,570,151B2中所述的那些。
在一些实施方案中，美登木素生物碱是：
Figure BDA0003553133530000282
(MATY4)。
本公开书还包括抗体-放射性核素缀合物(ARCs)，其包含与一种或多种放射性核素缀合的抗-PTCRA抗体。可用于本公开书所述方面内容中的示例性放射性核素包括但不限于例如225Ac、212Bi、213Bi、131I、186Re、227Th、222Rn、223Ra、224Ra和90Y。
在一些实施方案中，治疗部分是<3000、<2000、<1000或<900道尔顿。
在某些实施方案中，本文提供包含通过连接体与治疗部分(例如上述任何细胞毒性物质)缀合的抗-PTCRA抗体的ADCs。连接体是连接、结合或键合本文所述的抗体或抗原-结合蛋白与治疗部分(例如细胞毒性物质)的任何基团或部分。适当的连接体可参见例如Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins；Phillips,G.L.编；Springer Verlag：纽约，2013；Antibody-Drug Conjugates；Ducry,L.编；Humana Press，2013；Antibody-DrugConjugates；Wang,J.，Shen,W.-C.和Zaro,J.L.编；Springer International Publishing，2015，将其内容各自以其全部引入文中作为参考。通常，用于本文所述抗体缀合物的适当连接体是那些足够稳定，以利用抗体的循环半衰期的连接体，并且同时，抗原介导的缀合物内化后能够释放其有效载荷。连接体可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解连接体包括内化后细胞内代谢裂解(例如通过水解、还原或酶反应裂解)的连接体。不可裂解的连接体包括内化后通过抗体的溶酶体降解而释放附着的有效载荷的连接体。适当的连接体包括但不限于酸敏性连接体、易水解(hydrolysis-labile)连接体、酶可裂解的连接体、易还原连接体、自消除(self-immolative)连接体和不可裂解连接体。适当的连接体还包括但不限于是或包含肽、葡糖苷酸、琥珀酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(PEG)单元、腙、mal-己酰基单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元和对-氨基苄基(PAB)单元的那些连接体。
连接体
本领域已知的任何连接体或连接体技术可用于创建或构造本公开书的ADC。在某些实施方案中，连接体是可裂解的连接体。根据其他实施方案，连接体是不可裂解的连接体。可用于本公开书上下文中的示例性连接体包括包含下述部分或由下述部分构成的连接体：包括例如MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、蛋白酶可裂解连接体的二肽位点、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、蛋白酶可裂解连接体的二肽位点、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(4-(2-吡啶硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯)、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸N-琥珀酰亚胺酯)、SIAB((4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)及其变体和组合。可用于本公开书上下文中的连接体的其他示例提供于例如US 7,754,681和Ducry，Bioconjugate Chem.，2010，21：5-13，以及文中引用的文献中，将其内容以其全部引入文中作为参考。在某些实施方案中，连接体是MC。
在某些实施方案中，连接体在生理条件下是稳定的。在某些实施方案中，连接体是可裂解的，例如，能够在酶存在的情况下或在特定pH范围或值下至少释放有效载荷部分。在一些实施方案中，连接体包含酶可裂解部分。说明性的酶可裂解部分包括但不限于肽键、酯键、腙和二硫键。在一些实施方案中，连接体包含组织蛋白酶可裂解的连接体。
在一些实施方案中，连接体包含不可裂解部分。
适当的连接体包括但不限于与单一结合物质例如抗体的两个半胱氨酸残基化学键合的连接体。所述连接体可用于模拟由于缀合过程而被破坏的抗体的二硫键。
在一些实施方案中，连接体包含一个或多个氨基酸。适当的氨基酸包括天然的、非天然的、标准的、非标准的、蛋白质的(proteinogenic)、非蛋白质的和L-或D-α-氨基酸。在一些实施方案中，连接体包含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或瓜氨酸，其衍生物或其组合。在某些实施方案中，氨基酸的一个或多个侧链连接至下述的侧链基团。在一些实施方案中，连接体包含缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案中，连接体包含赖氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案中，连接体包含赖氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，连接体包含缬氨酸和丙氨酸。
在一些实施方案中，连接体包含自消除基团。自消除基团可以是技术人员所知的任何所述基团。在具体实施方案中，自消除基团是对-氨基苄基(PAB)或其衍生物。有用的衍生物包括对氨基苯氧基羰基(PABC)。技术人员应知道自消除基团能够进行化学反应，从有效载荷中释放连接体的剩余原子。
本公开书包括ADCs，其中连接体通过抗体或抗原-结合分子内的特定氨基酸处的连接，将抗-PTCRA抗体连接到药物或细胞毒素。可用于这方面上下文中的示范性氨基酸连接例如赖氨酸(参见例如US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等人，BioconjugateChem.，2008，19:358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)，半胱氨酸(参见例如US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；和US 7,750,116)，硒代半胱氨酸(参见例如WO 2008/122039；和Hofer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2008，105：12451-12456)，甲酰甘氨酸(参见例如Carrico等人，Nat.Chem.Biol.，2007，3：321-322；Agarwal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2013，110:46-51和Rabuka等人，Nat.Protocols，2012，10：1052-1067)，非天然氨基酸(参见例如WO 2013/068874和WO2012/166559)，以及酸性氨基酸(参见例如WO 2012/05982)。还可将连接体通过连接至碳水化合物(参见例如US 2008/0305497、WO 2014/065661和Ryan等人，Food&AgricultureImmunol.，2001，13：127-130)和二硫键连接体(参见例如WO 2013/085925，WO 2010/010324，WO 2011/018611和Shaunak等人，Nat.Chem.Biol.，2006，2：312-313)而缀合至抗原-结合蛋白。位点-特异性缀合技术也可用于直接缀合到抗体或抗原结合蛋白的特定残基(参见例如Schumacher等人，J Clin Immunol(2016)36(Suppl 1)：100)。位点-特异性缀合技术包括但不限于通过谷氨酰胺转氨酶的谷氨酰胺缀合(参见例如Schibli，Angew ChemieInter Ed.2010，49，9995)。
根据某些实施方案，本公开书提供ADCs，其中将本文所述的抗-PTCRA抗体缀合至国际专利公开WO2014/145090中所述的连接体-药物组合物(例如下文所述的化合物)，将其公开书以其全部引入文中作为参考：
Figure BDA0003553133530000311
因此，在一些实施方案中，抗体-药物-缀合物具有下述结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是抗-PTCRA抗体；
L是连接体；
Pay是治疗部分；和
n是1-10的整数。
在某些实施方案中，L是不可裂解的连接体。
在某些实施方案中，Pay是美登木素生物碱。在某些实施方案中，Pay是DM1或其衍生物。在某些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0003553133530000321
在某些实施方案中，Pay是奥瑞他汀。在某些实施方案中，Pay是MMAE。在某些实施方案中，Pay是MMAF。
在某些实施方案中，连接体-有效载荷(L-Pay)是：
Figure BDA0003553133530000322
MAYT2LP。
在某些实施方案中，连接体-有效载荷(L-Pay)是：
Figure BDA0003553133530000323
MAYT3LP。
在某些实施方案中，连接体-有效载荷(L-Pay)是：
Figure BDA0003553133530000324
MAYT4LP。
在一些实施方案中，n为1-6。在一些实施方案中，n为1-5。在一些实施例中，n为1，在一些实施例中，n为2，在一些实施方案中，n为3，在一些实施方案中，n为4，在一些实施方案中，n为5。
在一些实施方案中，包含MAYT2LP的抗体-药物缀合物是通过使抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段与具有下述结构的化合物接触而制备的：
Figure BDA0003553133530000331
(MAYT2INT)。
在一些实施方案中，包含MAYT3LP的抗体-药物缀合物是通过使抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段与具有下述结构的化合物接触而制备的：
Figure BDA0003553133530000332
(MAYT3LPINT)，包括例如US公开号2018/0134794A1中所述的方法，将其以其全部引入文中作为参考。
在一些实施方案中，包含MAYT4LP的抗体-药物缀合物是通过使抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段与具有下述结构的化合物接触而制备的：
Figure BDA0003553133530000333
本文所述的抗体-药物缀合物可以利用本领域技术人员已知的缀合条件制备(参见例如Doronina等人，Nature Biotechnology，2003，21，7，778，将其以其全部引入文中作为参考)。在一些实施方案中，包含抗-PTCRA抗体的ADC通过使抗-PTCRA抗体与包含所需连接体和细胞毒性物质的化合物接触而制备，其中所述连接体具有与抗体或抗原结合蛋白反应的部分(例如在抗体或抗原-结合蛋白的所需残基处)。
根据某些实施方案，本公开书提供ADCs，其中如本文所述的抗-PTCRA抗体与2014年3月14日提交的国际专利申请号PCT/US14/29757中所述的连接体-药物组合物(例如化合物“7，”)缀合，由此，将其公开书以其全部引入文中作为参考。
本领域已知的用于将化学部分缀合到肽、多肽或者其他大分子的任何方法可用于本公开书的上下文中，以制备本文所述的抗-PTCRA ADC。本文实施例7中提出通过连接体将抗体-药物缀合的一种示范方法。本领域的普通技术人员应该理解该示例性方法的变体，并预期将其包括在本公开书的范围内。
液相色谱-质谱法表征缀合物
表征抗体-药物-缀合物(ADC)并确定其疗效的参数包括但不限于其结构、稳定性、药物与抗体比率(DAR)和有效载荷分布。DAR是ADC的一个重要的质量参数，并表示缀合至抗体的药物分子的平均数量。DAR值会影响药物的疗效，因为低载药量会降低药效，而高载药量会对药代动力学(PK)1和毒性产生负面影响。例如，可利用紫外-可见(UV/Vis)光谱、疏水相互作用色谱(HIC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI-MS)和LC-MS测定DAR。
在某些实施方案中，为了测定连接体-有效载荷在抗体上的负载量，将缀合物去糖基化并通过LC-MS分析。
对于该测定，将50μg缀合物用milli-Q水稀释至1mg/mL的最终浓度。将10μLPNGase F溶液[通过加入150μL PNGase F贮备液(New England Biolabs，Cat#P0704L)和850μL milli-Q水，并混匀制备PNGase F溶液]加入稀释的缀合物溶液中，然后在37℃下孵育过夜。将5μL各样品进样至LC-MS(Waters Synat G2-Si)，并用0.1mL/min的梯度流动相20-40％洗脱25分钟(流动相A：0.1％v/vFA的H2O溶液；流动相B：0.1％v/v FA的乙腈溶液)。LC分离是在80℃的Waters Acquity BEH C4色谱柱(1.0X50 mM，1.7μm)上实现的。
质谱法谱图用Masslynx软件执行去卷积运算，并用下述公式计算药物-抗体比率(DAR)：
1.根据分布峰值强度(PI)计算的药物(Dn)的相对百分比(％)：
Dn％＝PIn/∑(PI0+PI1+PI2……+PIi)×100
(n＝0,1,2,3,…,i)
2.平均DAR计算：
DAR＝∑(1×D1％+2×D2％+3×D3％+……+i×Di％)
在某些实施方案中，本公开书的ADCs的药物-抗体比率(DAR)是大约1至大约30。在另一实施方案中，本公开书的ADCs的DAR是大约1至大约8。在另一实施方案中，本公开书的ADCs的DAR是大约1至大约6。在另一实施方案中，本公开书的ADCs的DAR是大约1至大约5。在另一实施方案中，本公开书的ADCs的DAR是大约1至大约4。在另一实施方案中，本公开书的ADCs的DAR是大约2至大约4。在另一实施方案中，本公开书的ADCs的DAR是大约1或大约2或大约3或大约4或大约5或大约6或大约7或大约8或大约9或大约10或大约11或大约12或大约13或大约14或大约15或大约16或大约17或大约18或大约19或大约20或大约21或大约22或大约23或大约24或大约25或大约26或大约27或大约28或大约29或大约30。
将ADCs靶向表达PTCRA的细胞
在一些实施方案中，本文所述的包含与细胞毒物质缀合的抗-PTCRA抗体的ADCs能够特异性靶向和杀死表达PTCRA的细胞。尤其是，包含与细胞毒性物质缀合的抗-PTCRA抗体的ADCs能够特异性靶向和杀死T-ALL细胞。在一些实施方案中，ADC杀死T-ALL细胞，具有大约1pM至大约10nM的IC50值。在另外的实施方案中，ADC杀死T-ALL细胞，具有大约1nM至大约10nM的IC50值。
在一些实施方案中，通过流式细胞术，可在白血病T细胞上检测到PTCRA的表达。在另外的实施方案中，在正常成熟T细胞上不能检测到PTCRA的表达。
在本文实施例7中，显示用i)PTCRA-靶向小鼠mAb处理初级PTCRA+鼠T-ALL(mTALL)细胞，然后用通过不可裂解连接体与微管抑制剂单甲基奥瑞他汀E(MMAE)连接的抗-小鼠IgG-Fc处理，导致mTALL细胞强烈杀伤，但在对照-处理的细胞中没有杀伤作用(图16A)；或者ii)用通过不可裂解连接体直接与微管抑制剂(MAYT2)缀合的PTCRA靶向mAb(PTCRA-ADC，而非对照-ADC)处理初级PTCRA+鼠T-ALL(mTALL)细胞，促进剂量依赖性杀伤白血病细胞，具有低的纳摩尔范围的IC50值(图16B)。值得注意的是，PTCRA-ADC选择性诱导人SupT1 T-ALL细胞杀伤，但不影响B-ALL(NALM6)和AML(K562)细胞株的活力(viability)(图16C)。此外，PTCRA-ADC处理对正常外周血T细胞的活力没有影响，这与其选择性表达模式一致。
在一个高度侵袭性弥散性T-ALL体内模型中，与对照-ADC对照组比，PTCRA-ADC处理的T-ALL-负载小鼠在外周血和脾脏都表现出统计学显著减少的肿瘤负荷(图16D和16E)。因此，发明人惊奇地发现，用含有抗-PTCRA抗体的细胞毒性ADC靶向T-ALL细胞能特异性地清除肿瘤细胞，同时保留正常T细胞。
在本文中，显示相对低剂量(约1nM至10nM)的包含与细胞毒性物质缀合的抗-PTCRA抗体的ADCs足以特异性靶向和杀死T-ALL细胞(图16B)。
因此，本公开书提供含有与细胞毒性物质缀合的特异性结合人PTCRA的抗体或其抗原-结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)，其中ADCs有效杀死T-ALL细胞。根据本公开书的该方面的方法包含使细胞与抗体-药物缀合物(ADC)接触，ADC包含与细胞毒性物质缀合的抗-PTCRA抗体。“接触细胞”可以在体外进行，也可以在体内进行，例如通过将抗-PTCRA ADC给药至需要其的受试者，其中给药使ADC接触表达PTCRA的细胞，特别是T-ALL细胞。
如本文所用，“有效杀伤”意指在肿瘤细胞杀伤测定例如在本文实施例7中所述的测定或基本上类似的测定中，ADC显示小于约20nM或者小于或等于约10nM(例如小于或等于约9nM，小于或等于约8nM，小于或等于约7nM，小于或等于约6nM，小于或等于约5nM或者小于或等于约4nM)的IC50值。根据本公开书的该方面，ADC的抗-PTCRA抗体组分可以是任何抗-PTCRA抗体，包括本文所述的那些。此外，ADC的细胞毒性物质组分可以是任何细胞毒性物质例如DM1或本文提到的任何其他细胞毒性物质。
本公开书的ADCs能够抑制肿瘤生长和/或减少PTCRA+荷瘤动物的肿瘤大小。例如，如本文实施例7所示，抗-PTCRA ADCs可显著减少T-ALL肿瘤小鼠的肿瘤。因此，本公开书包括含有所述抗-PTCRA抗体的ADCs，其中当给药至PTCRA+荷瘤动物时，给药后第12天或更早，ADCs抑制肿瘤生长和/或减小肿瘤大小(例如100％或更高的肿瘤生长抑制)。
治疗制剂和给药
本公开书提供药物组合物，其包含含有抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADCs)，如本文公开的。本公开书的药物组合物由适当的载体、赋形剂以及提供改善的转移、递送、耐受性等的其他物质配制而成。许多合适的制剂可以在所有药物化学家都知道的处方集中找到：雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，Mack Publishing Company，伊斯顿，PA。例如，所述制剂包括粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油剂、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡剂(例如LIPOFECTINTM，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(carbowax)(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂，以及含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人，"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)JPharm Sci Technol 52：238-311。
给药至患者的ADC剂量可根据患者的年龄和大小、目标疾病、情况、给药途径等而变化。优选剂量通常根据体重或体表面积计算。在成年患者中，通常以大约0.01mg/kg体重-大约20mg/kg体重的剂量，更优选大约0.02mg/kg体重-大约7mg/kg体重的剂量、大约0.03mg/kg体重-大约5mg/kg或者大约0.05mg/kg体重-大约3mg/kg体重的单一剂量，静脉给药本发明的ADC可能是有利的。根据病情的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。给药ADCs的有效剂量和时间表可以根据经验确定；例如，可以通过定期评估监测患者的进展，并相应地调整剂量。此外，剂量的种间缩放比例可以利用本领域众所周知的方法完成(例如Mordenti等人，1991，Pharmaceut.Res.8：1351)。
各种递送系统是已知的，并可用于给药本公开书的药物组合物，例如脂质体中的包囊、微粒、微囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu等人，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。该组合物可以通过任何方便的途径给药，例如通过输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其他生物活性物质一起给药。给药可以是全身的或局部的。
可以将包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物或本公开书的药物组合物包含在选自但不限于下述的容器中：注射器、小瓶、笔式递送装置、自动注射器或微注射器。在某些实施方案中，可以将注射器或笔式递送装置预填充。在其他实施方案中，小瓶可以是玻璃小瓶。可以将包含抗体或其抗原结合片段的ADC或本公开书的药物组合物用标准针和注射器皮下或静脉递送。此外，关于皮下递送，可将笔式递送装置容易地应用于递送包含抗体或其抗原结合片段的ADC或本公开书的药物组合物。所述笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性使用的。一种可重复使用的笔式递送装置通常使用包含药物组合物的可替换的药筒。一旦已将药筒内的所有药物组合物给药并且药筒是空的，可以很容易地将空药筒丢弃，并用包含药物组合物的新药筒代替。然后，可以重复使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可更换的药筒。更确切地说，一次性笔式递送装置预先填充有保持在装置贮库中的药物组合物。一旦贮库排空药物组合物，就丢弃整个装置。
许多可重复使用的笔式和自动注射器递送装置可用于皮下输送本公开书的药物组合物。示例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.，Woodstock，UK)，DISETRONICTMpen(Disetronic Medical Systems，Bergdorf，瑞士)，HUMALOG MIX 75/25TM pen，HUMALOGTM pen，HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)，NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk，Copenhagen，丹麦)，NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen，丹麦)，BDTM pen(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，OPTIPENTM，OPTIPEN PROTM，OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis，Frankfurt，德国)，仅举几个例子。用于本公开书的药物组合物皮下递送的一次性笔式输送装置的示例包括但不限于SOLOSTARTM pen(Sanofi-Aventis)，FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)，SURECLICKTM Autoinjector(Amgen，Thousand Oaks，CA)，PENLETTM(Haselmeier，Stuttgart，德国)，EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM Pen(Abbott Labs，Abbott Park IL)，仅举几个例子。
在某些情况下，包含抗体或其抗原结合片段的ADC或本公开书的药物组合物可以在控释系统中递送。在一实施方案中，可以使用泵(参见Langer，supra；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一实施方案中，可以使用聚合物材料；参见控释的医学应用(Medical Applications of Controlled Release)，Langer and Wise(编)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，佛罗里达。还在另一实施方案中，可以将控释系统放置在组合物的靶标附近，因此只需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，1984，in MedicalApplications of Controlled Release，supra,第2卷，115-138页)。其他控释系统在Langer，1990，Science 249：1527-1533的综述中讨论。
可注射制剂可包括用于静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌内注射、滴注等的剂型。所述可注射制剂可通过已知的方法制备。例如，可注射制剂可以例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中制备。作为注射用水性介质，例如有生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，其可与适当的增溶剂例如醇(例如乙醇)，多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨酯80，HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等联用。作为油性介质，可用的例如芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等联用。优选将由此制备的注射剂填充在适当的安瓿中。
在一些实施方案中，将上述用于口服或胃肠外使用的药物组合物制备成适于适应活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的所述剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。包含的上述ADC的量一般为每单位剂量剂型大约5mg至大约500mg；尤其是在注射剂型中，对于其他剂型，优选的是以大约5mg至大约100mg和大约10mg至大约250mg包含上述抗体。
治疗用途
本公开书包括向需要其的受试者给药治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含含有抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物。治疗组合物可包含本文公开的任何ADCs和药学上可接受的载体或稀释剂。
本公开书的ADCs可特别用于治疗、预防和/或改善与PTCRA表达或活性相关的或PTCRA表达或活性介导的或者通过阻断PTCRA和另一分子之间的相互作用或以其他方式抑制PTCRA活性和/或信号传导和/或促进受体内化和/或减少细胞表面受体数量可治疗的任何疾病或病患。在一实施方案中，本公开书的ADCs尤其用于治疗、预防和/或改善T-ALL。例如，本公开书的ADCs可用于治疗表达PTCRA和/或对Notch-或pre-TCR-介导的信号传导反应的肿瘤，例如T-ALL肿瘤。本公开书的ADCs也可用于治疗发生在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附件、结缔组织、脾脏、免疫系统、血液形成细胞和骨髓、肝脏和泌尿道，以及特殊感觉器官例如眼睛的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本公开书的ADCs用于治疗下述癌症中的一种或多种：肾细胞癌、胰腺癌、头颈部癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌或黑色素瘤。
在本文所述治疗方法的上下文中，包含抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段的ADC可以作为单一疗法给药(即作为唯一的治疗物质)或者与一种或多种其他治疗物质(其实例在本文别处描述)联合给药。
本公开书包括通过测定患者一个或多个组织例如肿瘤组织中的高水平PTCRA表达来确定可用本文公开的ADC治疗患者的方法。在相关实施方案中，本公开书包括治疗以PTCRA高水平表达为特征的癌症例如T-ALL的方法。例如，本公开书包括治疗方法，其包含将含有抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段的ADC给药至患肿瘤的受试者，其中已确定肿瘤表达PTCRA。在某些实施方案中，通过活检样品的免疫组化或其他成像技术(例如免疫-PET成像等)确定肿瘤表达PTCRA。在某些实施方案中，将FACS(阳性或阴性)和RNA测序的组合用于确定是否表达PTCRA。在进一步的实施方案中，阳性表达的细胞显示>5RPKM。
联合疗法和制剂
本公开书包括组合物和治疗制剂，其包含与一种或多种其他治疗活性成分联合的本文所述的任何ADCs，以及治疗方法，其包含向需要其的受试者给药所述组合。
本公开书的ADCs可以与选自下述的一种或多种其他治疗活性组分共同配制和/或联合给药：EGFR拮抗剂(例如抗EGFR抗体[例如西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR小分子抑制剂[例如吉非替尼或厄洛替尼(erlotinib)])，另一种EGFR家族成员例如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如抗-ErbB2[例如曲妥珠单抗或T-DM1
Figure BDA0003553133530000411
]，抗-ErbB3或抗-ErbB4抗体或者ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)，EGFRvIII拮抗剂(例如特异性结合EGFRvIII的抗体)，PTCRA拮抗剂(例如另一种抗-PTCRA抗体)，IGF1R拮抗剂(例如抗-IGF1R抗体)，B-raf抑制剂(例如威罗菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)，PDGFR-α抑制剂(例如抗-PDGFR-α抗体)，PDGFR-β抑制剂(例如抗-PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼或苹果酸舒尼替尼)，PDGF配体抑制剂(例如抗PDGF-A、-B、-C或-D抗体、适配体、siRNA等)，VEGF拮抗剂(例如VEGF-Trap，诸如阿柏西普(aflibercept)，参见例如US 7,087,411(本文也称为“VEGF-抑制融合蛋白”)，抗-VEGF抗体(例如贝伐单抗)，VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼(pazopanib))，DLL4拮抗剂(例如US 2009/0142354中公开的抗-DLL4抗体，诸如REGN421)，Ang2拮抗剂(例如US 2011/0027286中公开的抗-Ang2抗体，诸如H1H685P)，FOLH1拮抗剂(例如抗-FOLH1抗体)，STEAP1或STEAP2拮抗剂(诸如抗-STEAP1抗体或抗-STEAP2抗体)，TMPRSS2拮抗剂(例如抗-TMPRSS2抗体)，MSLN拮抗剂(例如抗-MSLN抗体)，CA9拮抗剂(例如抗-CA9抗体)，uroplakin拮抗剂(例如抗-uroplakin[诸如抗-UPK3A]抗体)，MUC16拮抗剂(例如抗-MUC16抗体)，Tn抗原拮抗剂(例如抗-Tn抗体)，CLEC12A拮抗剂(例如抗-CLEC12A抗体)，TNFRSF17拮抗剂(例如抗-TNFRSF17抗体)，LGR5拮抗剂(例如抗-LGR5抗体)，单价CD20拮抗剂(例如单价抗-CD20抗体，诸如利妥昔单抗)等。可以与本公开书的ADCs有益地联合给药的其他物质包括例如他莫昔芬、芳香酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和结合至细胞因子例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其各自的受体的抗体。
本公开书包括组合物和治疗制剂，其包含与一种或多种化学治疗物质联合的本文所述的任何ADCs。化学治疗物质的示例包括烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CytoxanTM)；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，例如benzodopa、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和uredopa；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，例如阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖孢苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；diaziquone；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼代宁(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSKTM；雷佐生；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2〃-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉烷类，例如紫杉醇(TaxolTM，Bristol-MyersSquibb Oncology，普林斯顿，N.J.)和多西他塞(TaxotereTM；Aventis Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸(retinoic acid)；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。所述定义还包括调节或抑制肿瘤激素作用的抗激素物质，例如抗-雌激素类，包括他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；以及抗-雄激素类，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林，戈舍瑞林；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
本公开书的ADCs也可以与抗病毒药物、抗生素、镇痛药、皮质类固醇、甾类、氧、抗氧化剂、COX抑制剂、心脏保护剂、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAIDs联合给药和/或共同配制。
可以将其他治疗活性成分例如上文列出的任何一种物质或其衍生物在本公开书的ADC给药之前、同时或之后不久给药；(对于本公开书的目的，认为所述给药方案是将含有抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段的ADC与其他治疗活性成分“联合”给药)。本公开书包括药物组合物，其中将本公开书的ADC与本文别处所述的一种或多种其他治疗活性成分共同配制。
给药方案
根据本公开书的某些实施方案，可在规定的时间内，将多剂量的含有抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)(或包含所述ADC的药物组合物)给药至受试者。根据本公开书的该方面，所述方法包括将多剂量的本公开书的ADC或组合物依次给药至受试者。如本文所用，“依次给药”是指在不同的时间点例如在预定间隔(例如数小时、数天、数周或数月)隔开的不同日子，将每一剂量的ADC或组合物给药至受试者。本公开书包括包含向患者依次给予单个初始剂量的ADC或组合物，随后给药一个或多个第二剂量的ADC或组合物，任选地，然后给药一个或多个第三剂量的ADC或组合物的方法。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本公开书的ADC或组合物按时间顺序的给药。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时给药的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是指在初始剂量之后给药的剂量；“第三剂量”是第二剂量后给药的剂量。初始、第二和第三剂量可含有相同量的ADC或组合物，但通常可在给药频率方面彼此不同。然而，在某些实施方案中，治疗过程中，包含在初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中的ADC或组合物的量彼此不同(例如根据需要，向上或向下调整)。在某些实施方案中，将两个或更多个(例如2个、3个、4个或5个)剂量在治疗方案开始时作为“负荷剂量”给药，然后在不太频繁的基础上给药随后的剂量(例如“维持剂量”)。
在本公开书的某些示例性实施方案中，紧接前剂量，将各第二和/或第三剂量给药1周～26周(例如1周、11/2周、2周、21/2周、3周、31/2周、4周、41/2周、5周、51/2周、6周、61/2周、7周、71/2周、8周、81/2周、9周、91/2周、10周、101/2周、11周、111/2周、12周、121/2周、13周、131/2周、14周、141/2周、15周、151/2周、16周、161/2周、17周、171/2周、18周、181/2周、19周、191/2周、20周、201/2周、21周、211/2周、22周、221/2周、23周、231/2周、24周、241/2周、25周、251/2周、26周、261/2周或更长)。如本文所用，短语“紧接前剂量”是指多次给药序列中，在没有干预剂量的情况下，在连续给药下一个剂量之前，给予患者的ADC或组合物剂量。
根据本公开书的该方面的方法可以包括向患者给药任何数量的第二和/或第三剂量的包含抗-PTCRA抗体或其抗原结合片段的ADC或包含该ADC的组合物。例如，在某些实施方案中，仅向患者给药一个第二剂量。在其他实施方案中，向患者给药两个或更多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第二剂量。同样地，在某些实施方案中，仅将一个第三剂量给药至患者。在其他实施方案中，将两个或更多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第三剂量给药至患者。给药方案可以在特定受试者的一生中无限期地进行，或者直到该治疗在治疗上不再需要或不再有利为止。
在涉及多个第二剂量的实施方案中，可以将每个第二剂量以与其他第二剂量相同的频次给药。例如，可将每个第二剂量在紧接前剂量之后1-2周或1-2个月给药至患者。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，可以将每个第三剂量以与其他第三剂量相同的频次给药。例如，可将每个第三剂量在紧接前剂量后2-12周给药至患者。在本公开书的某些实施方案中，将第二和/或第三剂量给药至患者的频率可随治疗方案的进程而变化。在治疗过程中，医生也可根据个体患者临床检查后的需要而调整给药频次。
本公开书包括给药方案，其中将2-6个负荷剂量以第一频率(例如一周一次、两周一次、三周一次、一个月一次、两个月一次等)给药至患者，随后将两个或更多个维持剂量以更低频率给药至患者。例如，根据本公开书的该方面，如果将负荷剂量以每月一次的频率给药，那么可将维持剂量以每六周一次、每两个月一次，每三个月一次等给药至患者。
实施例
下面的实施例是为了向本领域的普通技术人员提供关于如何制造和使用本公开书的方法和组合物的完整公开和描述，并不旨在限制发明人认为的本公开书的范围。已经作出努力以确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外说明，份为重量份数，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例中所用的材料和方法如下：
胸腺移植手术及接受者分析
如前所述，将新生供体小鼠的单个胸腺叶手术嫁接在宿主小鼠的左肾极处。简言之，在麻醉的宿主动物的腹腔内做一个小切口，暴露左肾。利用显微解剖钳和立体显微镜，将供体动物的单个胸腺叶置于肾包膜下。然后，用外科缝线和钉缝合伤口；常规监测小鼠的健康状况。所有小鼠实验均在Regeneron Pharmaceuticals动物护理和研究咨询委员会(Institutional Animal Care and Research Advisory Committee)的批准下进行。
小鼠
6-8周龄的Rag2-/-γc-/-BALB/c(BRG)小鼠购自Taconic，并用作胸腺移植实验的接受者宿主。供体胸腺叶是从购自Taconic的C57BL6/6NTac小鼠中分离出来的，或从利用
Figure BDA0003553133530000461
技术在Regeneron产生的Ptcra-/-或Notch3-/-小鼠中分离出来的。
流式细胞术分析
收集组织，并在含3％胎牛血清的PBS中制备单细胞悬液。按照标准方案完成抗体染色和FACS分析。使用购自Biolegend或BD Biosciences的下述单克隆抗体(mAbs)：抗-mCD45(30-F11)、抗-mCD4(RM4-5)、抗-mCD8a(53-6.7)、抗-mCD44(IM7)、抗-mCD25(PC61)、抗-mPTCRA(2F5)、抗-mNOTCH1(mN1A和HMN1-12)和抗-mNOTCH3(HMN3-133)。将抗体直接与FITC、PE、PerCPCy5.5、PECy7、APC、APC-Alexa Fluor 700和太平洋蓝(Pacific blue)偶联。数据是在BD Fortessa上获得的，并通过FlowJo进行分析。
外显子组-测序和数据分析
利用Agilent Sure-Select Mouse All Exon 50Mb试剂盒完成全外显子捕获，然后在Illumina HiSeq 2000平台上进行100bp配对-末端测序。利用嵌入ArrayStudio中的OSA aligner进行读取比对和处理。平均而言，每个样本产生大约8000万个读长，并且将超过65％映射在目标上，这就给出具有多于20x读数覆盖深度的80％目标。使用的突变(包括小插入和缺失)导致的临界值(calling cutoffs)是：至少10％变异等位基因频率和至少5个来自两条链的变体读数。可在www.arrayserver.com/wiki/，在线找到pipeline的完整细节。利用全外显子组测序(WES)数据，在arm-水平估计体细胞拷贝数变异模式。根据肿瘤样本和匹配的正常样本的DNA读取比对输入(BAM文件)，将嵌入ArrayStudio(www.omicsoft.com；www.arrayserver.com)的VarScan2函数用于计算读取测序深度比(log2Ratio)，并总结拷贝数状态。将每个染色体每100kb滑动窗口的平均log2Ratio值用ArrayStudio的染色体片段视图(Segment Chromosome View)显示。来自DKO脾脏的一个正常样本作为DKO株背景上产生的所有肿瘤的对照。
细胞株和生长条件
SupT1、HPB-ALL和Jurkat是购自ATCC和DSMZ的人T-ALL细胞株。将细胞在根据供应商的建议配制的基础RPMI-1640培养基中培养。将细胞以3x105细胞/mL的密度接种，并定期传代，以保持小于2x106细胞/mL的密度。在CRISPR实验中，利用表达Cas9的慢病毒(Sigma-Aldrich)，用Cas9稳定转导细胞株。然后，用对照或靶向PTCRA的gRNAs(Sigma-Aldrich)转导细胞。根据供应商建议的方案进行转导。通过Western blot证实敲除。
RNA测序和数据分析
根据生产商的协议，利用购自KAPA Biosystems的KAPA Stranded mRNA-Seq试剂盒，将总RNA转换为mRNA文库。在Illumina HiSeq 2000上通过100bp配对-末端读数对文库进行测序。用ArrayStudio软件计算序列比对(Read mapping)、基因表达定量和融合转录的鉴定。为每个样本生成7500万个读数，平均唯一比对率为85％。
公开数据集分析
在两个独立的数据集中检测人T-ALL中PTCRA的表达，因为其RNA表达数据是可公开获得的。第一个数据集，St.Jude儿童癌症造血系统恶性肿瘤数据集(the St.JudePediatric Cancer hematopoietic malignancies dataset)，是一个基因组数据库，包含来自B-ALL、AML、T-ALL和MLL适应症的2,224个儿童和年轻成人患者样本的肿瘤细胞和其他分子表型的RNA-测序。样本来自St.Jude–WashU儿科癌症基因组计划(the St.Jude–WashUPediatric Cancer Genome Project)、Therapeutically Applicable Research toGenerate Effective Treatments(TARGET)项目和上海儿童医学中心儿科ALL项目。这是应用综合基因组方法来确定驱动儿童癌症的分子变化的努力的一部分。数据可访问自：www.stjude.cloud/data.html。来自该数据集的RNA-seq数据通过Omicsoft Array StudioLand数据分析管道处理，用Ensembl基因模型将OSA(Omicsoft Aligner)与Human GenomeBuild B38对齐，然后用基于RSEM的EM算法导出计数。将计数转换为RPKM(每百万定位读数的每千基区转录读数)。产生基因水平和外显子连接定量。根据Liu等人(2017Nat Genet49：1211-1218)所述的RNA-seq基因表达数据、基因组改变和转录因子表达的层次聚类，按亚型对T-ALL样本进行分类。
用于检测人T-ALL中PTCRA表达特异性的第二个公开可用的数据集是一个探索性的、回顾性I期研究，其通过微阵列分析，检测2,096例白血病和淋巴瘤儿童和成人患者的全基因组表达谱(Haferlach等2010J Clin Oncol 28：2529-2537)。在Human Genome U133Plus 2.0Array上定量表达，测量19,574个基因在54,675报告基因中的表达。从Oncomine下载PTCRA的表达数据(Reporter IS:211252_x_at)，并在Prism 7中处理和分析。
人细胞系中PTCRA的表达来自癌症细胞系百科全书(Cancer Cell LineEncyclopedia)，访问自：portals.broadinstitute.org/ccle。该数据集包含多种肿瘤类型的1,457个细胞株的RNA测序数据。测序是由Broad Institute for the Cancer Cell LineEncyclopedia完成的。在数据集中，PTCRA在所有细胞株内的表达数据是从CCLE下载，并在Prism 7中进行处理和分析。
患者样本分析
通过合同研究机构前瞻性收集急性白血病患者的骨髓和外周血样本。根据国际协调理事会(International Council for Harmonization)良好临床实践指南(GoodClinical Practice guidelines)中规定的监管要求，所有样本均获得每位患者的书面知情同意。
实施例1.自发T-ALL模型中β-选择检查点因子的上调
小鼠T-ALL是通过在免疫缺陷成年Rag2-/-IL2Rγc-/-宿主的肾囊下移植新生野生型小鼠的单个胸腺叶而产生的。小鼠以高外显率形成肿瘤，肿瘤发生的中位时间约为25周，与发表的结果一致(Martins等人，2014Nature 509：465-470)。用所述模型产生的白血病疾病广泛概括人T-ALL的关键特征，包括脾肿大、原始细胞浸润到骨髓和高频率的功能获得Notch1突变(“在T细胞急性淋巴细胞白血病的自发性遗传异质性小鼠模型中，治疗靶向Notch信号转导和免疫检查点阻断”(“Therapeutic targeting of Notch signaling andimmune checkpoint blockade in a spontaneous,genetically-heterogeneous mousemodel of T-cell acute lymphoblastic leukemia”)，Gao等人，2019Disease Models andMechanisms)。通过RNA测序、比较T-ALL肿瘤浸润的脾脏和非荷瘤小鼠脾脏，分析所述自发性肿瘤的转录组。与对照组脾脏组织或纯化的外周CD4+和CD8+T细胞相比，观察到胸腺细胞发育的多个标记物的强差异表达，包括T-ALL病例中的Dntt，Rag1和Rag2(图1A；图2)。也观察到与β-选择检查点相关的基因的强上调，包括：Ptcra(369倍)、Notch3(46倍)和Notch1(3.3倍)(图1A-1D)。流式细胞术证实所述三个基因在T-ALL原始细胞的细胞表面的表达(图1E-1G)。因为β-选择检查点是胸腺细胞发育的关键步骤，通过检查点所需因子的上调可有助于即时动物T-ALL模型的白血病发生。
实施例2.Ptcra KO小鼠胸腺细胞发育受阻
Notch1是一个经典的T-ALL癌基因(Grapher等人，2006Nat Rev Cancer 6:347-359)；转基因小鼠模型也已提示Ptcra和Notch3在T-ALL中的作用(Bellavia等人，2002PNAS99：3788-3793；Bellavia等人，2000EMBO J 19：3337-3348；dos Santos等人，2007Blood109：3972-3981)。为了阐明这些后面的基因是否有助于一个更相关的生理模型中的白血病发生，建立Ptcra-/-和Notch3-/-基因靶向小鼠，并将所述动物的胸腺叶用于移植研究。Ptcra-/-和Notch3-/-小鼠是通过在每个基因的第一个编码外显子中插入框架中的半乳糖苷酶基因来产生的。新生Ptcra-/-小鼠形成胸腺发育不良(图3A)(Fehling等人，1995Nature375：795-798；Mancini等人，1999J Immunol 163：6053-6059)。所述小鼠的免疫分析显示胸腺细胞隔室大大缺乏CD4+CD8+DP细胞，大多数胸腺细胞停滞在DN3期(图3B和3C)。RT-PCR分析显示与野生型对照相比，Ptcra-/-胸腺中典型的DN3基因强表达，包括Notch3、Hes1、Dtx1、Hes5和Notch1。同样，观察到DP标记物(包括Cd4和Cd8)的强烈下调(图3D)。Ptcra-/-小鼠的所述胸腺表型在成年期得到部分逆转(图4A和4B)。未观察到Notch3-/-小鼠显著的胸腺表型(图5)。因此，pre-TCR(关键的DN3到DN4转换因子)在T-ALL白血病发生中的作用得到验证。
实施例3.Ptcra的基因消融导致T-ALL发育显著受损
为了评价前-T细胞受体信号传导缺失对白血病发生的影响，从新生Ptcra-/-小鼠移植胸腺。为了解释Ptcra-/-新生小鼠胸腺细胞减少，每次移植使用两个叶。将Ptcra-/-胸腺有效移植于Rag2-/-IL2Rγ-/-宿主，这通过外周T细胞水平的纵向监测进行评价(图6)。与野生型对照相比，Ptcra-缺陷的胸腺显示诱导白血病发生的能力显著降低。整体疾病外显率显著降低，并且在52周内未达到肿瘤发生的中位时间(野生型对照为25周，HR＝0.249)(图7A)。在所述移植中作为供体的Ptcra-/-胸腺叶的数量增加(至多8叶)并没有改变白血病发生的效率，表明野生型和Ptcra-/-供体胸腺的细胞差异并不导致T-ALL发展中的所述差异(图7A)。
偶尔发生的Ptcra-/-白血病具有与野生型肿瘤可比的免疫表型，并呈现相似但不太明显的急性发作性质(图7B；数据未显示)。所述肿瘤的分子分析显示突变谱与野生型肿瘤基本一致，包括典型的T-ALL癌基因Notch1的复发性突变(表1，下面)。
Figure BDA0003553133530000511
表1
此外，观察到一系列与T-ALL相关的复发性但很少报道的突变，包括：Fat1、Ddx3x、Ptpn11和Ikzf1(表1)(Liu等人，2017Nat Genet 49：1211-1218；Molteni等人，2010Leukemia 24：232-235)。相对于野生型T-ALL肿瘤，Ptcra-缺陷肿瘤的基因表达谱显示60个不同表达的基因。对于DN到DP转变相关的基因的强烈下调，以及早期T细胞祖细胞-样(ETP)ALL富含的多个基因的上调(Zhang等人，2012Nature 481：157-163)，包括Ppbp，Cd93，Lyl1，Dhrs和Pim1，以及胸腺细胞发育的早期阶段，例如Ikzf2和Id3，提示Ptcra-缺陷肿瘤的早期发育表型(图7C)，这一基因表达标签(signature)是显著的。
文献已报道人T-ALL的NOTCH3突变(Martins等人，2014Nature 509：465-470)，并且NOTCH3在大部分人T-ALL病例中过表达(图8A)。此外，用γ-分泌酶抑制剂处理含有功能获得的NOTCH3突变(但野生型为NOTCH1)的人T-ALL细胞株可损害细胞增殖(图8B)。然而，与Ptcra缺失相反，移植Notch3-/-胸腺并没有导致白血病发生减少，并且事实上，以与野生型对照胸腺相似的效率产生T-ALL(图9)。小鼠系统发展为Notch1功能获得突变的倾向可掩盖致癌Notch3信号传导的任何潜在作用(Ashworth等人，2010Blood 116：5455-5464)。在Notch3-/-肿瘤中，观察到多个不依赖配体的Notch1突变，其足以驱动T-ALL白血病发生(数据未显示)。
因此，Ptcra缺乏导致诱导白血病发生的能力显著降低，整体疾病外显率显著降低，并且在研究过程中没有达到肿瘤发生的中位时间。
实施例4.人T-ALL中的PTCRA表达
提示前-TCR信号传导可能在人T-ALL中发挥作用，PTCRA在大多数人T-ALL细胞株中表达，但在癌症细胞株百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)中，代表其他类型白血病的细胞株或任何其他非白血病细胞株中却没有表达(图10A，且数据未显示)(Barretina等人，2012Nature 483：603-607；Cancer Cell Line Encyclopedia2015Nature 528：84-87)。在两个独立的患者组中，PTCRA在人T-ALL中的特异性表达得到进一步验证。在St.Jude Children’s Research Hospital组中，包括有2,224例患有造血系统恶性肿瘤的儿童和年轻成人患者(1,333例B-ALL病例，497例AML病例，373例T-ALL病例和24例混合系白血病病例)，其可获自RNA-seq数据，相对于非-T细胞来源的白血病，PTCRA在T-ALL患者样本中强而有差异的表达(图10B)(Zhou等人，2016Nat Genet 48：4-6)。同样，在2,096名患有白血病和骨髓增生异常综合征的儿童和成人患者的Haferlach组中(576例B-ALL病例，542例AML病例，206例MDS病例，174例T-ALL病例，448例CLL病例、76例CML病例和74例非白血病和健康骨髓对照病例)，PTCRA在T-ALL患者样本中选择性表达(图10C)(Haferlach等人，2010J Clin Oncol 28：2529-2537)。根据T-ALL亚型对St.Jude Children’sResearch Hospital组进行分层(Liu等人，2017Nat Genet 49：1211-1218)，表明PTCRA在大多数分子T-ALL亚群中高表达，占所有人T-ALL病例的大多数(图11A)(Zhou等人，2016NatGenet 48：4-6)。
与小鼠T-ALL模型的特征一致，PTCRA在ETP和ETP-样(LMO2/LYL1)人T-ALL样本中的表达水平较低(图11A)。不受特定理论的约束，但与Notch信号传导的分子生物学一致，T-ALL中PTCRA的表达与NOTCH1功能获得(GoF)突变呈正相关；尽管PTCRA的表达在具有野生型NOTCH1状态的患者亚群中保留(图11B)。在一系列前瞻性收集的急性白血病患者样本中，仅在T-ALL样本细胞中检测到PTCRA细胞表面表达，而在B-ALL或AML样本中未检测到(图10D、图12、图13)。不受特定理论的约束，但与前-TCR的发育功能一致，正常供体的成熟T细胞不表达PTCRA(图10E)。因此，显示人T-ALLs经常表达高水平的PTCRA。
实施例5.T-ALL细胞株中通过CRISPR/Cas9的PTCRA缺失在体内外损害肿瘤生长
为了评价前-TCR在人T-ALL中的功能，用靶向PTCRA的或对照的gRNAs产生和转导稳定表达Cas9的SupT1、HPB-ALL和Jurkat细胞株。通过Western blot分析证实PTCRA的成功靶向和所述细胞株中蛋白表达的减少(图14)。表达最高水平PTCRA(补充表3)的SupT1和HPB-ALL细胞中，PTCRA的缺失导致细胞增殖显著减少(图15A)。Jurkat细胞表达低水平的PTCRA，并比SupT1或HPB-ALL细胞发育成熟(Aarnoudse等人，2002Int J Cancer 99：7-13)，相比之下，Jurkat细胞对经CRISPR/Cas9的PTCRA缺失不敏感(图15A，图13)。当皮下植入NSG小鼠胁腹时，野生型SupT1细胞发展肿瘤，而SupT1PTCRA-KO细胞没有(图15B)。
在人T-ALL细胞株的一个亚群中，观察到PTCRA是增殖所必需的，这表明通过前TCR信号传导能够驱动所述细胞的增殖。胸腺细胞前TCR信号传导是由SRC-家族蛋白酪氨酸激酶介导的，在淋巴细胞-特异性蛋白酪氨酸激酶LCK中起关键作用(Lin等人，2000J Exp Med191：703-716)。不受特定理论的约束，但与通过pre-TCR信号传导本身是PTCRA依赖的T-ALL细胞株增殖所需要的观点是一致的，用SRC-家族激酶抑制剂PP1处理所述细胞株，诱导剂量依赖的抗增殖反应(图15C)。另外，CRISPR/Cas9-介导的SupT1细胞中的LCK缺失强烈抑制体外增殖(图15D)。总的来说，以胸腺移植为基础的T-ALL小鼠模型和人T-ALL细胞株的结果揭示前-TCR信号转导在驱动和维持T-ALL白血病发生中的关键作用。因此，发现人T-ALL亚群对PTCRA缺失敏感。
实施例6.前-TCR的内化动力学
在某些实施方案中，ADC靶标是细胞表面表达的，并且在结合时用有效载荷内化。因此，旁观者效应的风险较小。
将内源性表达PTCRA的SupT1细胞用抗-PTCRA抗体在4℃染色30分钟，于是将细胞温度升至37℃，并在温度转换后的指定时间用二抗染色。然后，固定细胞，并用免疫荧光共聚焦显微镜使PTCRA定位可视化。在0分钟时，在SupT1细胞的细胞表面检测到PTCRA，但随着时间的推移，检查到PTCRA迅速且强烈内化(图18A)。将SupT1细胞用翻译抑制剂环己酰亚胺处理0小时、1小时、2小时、4小时或8小时，然后收集，裂解，并将提取物用于免疫印迹。PTCRA在实验的8小时内迅速降解(图18B)。有效内化表明ADC是可望成功的。
实施例7.靶向PTCRA的细胞毒性抗体-药物缀合物在体外和体内促进T-ALL细胞的特异性杀伤
考虑到PTCRA在白血病细胞而不是正常成熟T细胞中的选择性表达，以及其快速的组成性内化，有理由认为，用细胞毒性抗体-药物缀合物靶向pre-TCR可能是T-ALL的一种可行性治疗策略。为此，将通过所述胸腺移植产生的初始PTCRA+鼠T-ALL(mTALL)细胞，用靶向PTCRA的小鼠mAb或同种型对照mAb处理，然后用通过不可裂解连接体连接到微管抑制剂单甲基奥瑞他汀E(MMAE)的抗-小鼠IgG-Fc处理。观察到用靶向PTCRA的mAb处理，强烈杀伤mTALL细胞，但在对照处理的细胞中没有杀伤(图16A)。然后，将靶向PTCRA的mAb与连接体有效载荷MAYT2LP(本文提供的结构)缀合，从而将靶向PTCRA的mAb通过不可裂解连接体与有效的微管抑制剂(MAYT2)连接。为此，将靶向PTCRA的mAb与MAYT2INT缀合。由此产生的药物-抗体比率(DAR)是～3.5，并在下文中将该化合物称为PTCRA-ADC。PTCRA-ADC，而不是对照ADC，促进剂量依赖性白血病细胞的杀伤，具有低的纳摩尔范围的IC50值(图16B，图16F所示表格形式的数值)。
由于本文所用的PTCRA mAb克隆也与人PTCRA结合(图12)，在一组人白血病细胞株上测试PTCRA-ADC的活性。PTCRA-ADC选择性诱导人SupT1T-ALL细胞的杀伤，但不影响B-ALL(NALM6)和AML(K562)细胞株的活力(图16C，表格形式的数值见图16G)。在RNA水平，AML和B-ALL细胞具有非常低水平的PTCRA(大多数数据集的中位数和平均值接近<1)。重要的是，PTCRA-ADC处理对正常外周血T细胞的活力也没有影响，这与其选择性表达模式一致。PTCRA-ADC的体外效力促使在一个高度侵袭性、弥散性T-ALL模型中评估体内活性。将NSG小鼠静脉注射100,000PTCRA+mTALL细胞，根据植入后第2天的肿瘤负荷随机分组，并在第2天、6天和12天分别用PTCRA-ADC或对照-ADC治疗。在整个研究过程中，通过量化外周血中原始细胞的数量以及通过在研究结束14天时量化脾脏质量，对肿瘤负荷进行纵向评估。与对照-ADC对照相比，用PTCRA-ADC治疗的T-ALL-荷瘤小鼠外周血和脾脏肿瘤负荷统计学显著地降低(图16D，表格形式的数值见图16H，和图16E，表格形式的数值见图16I)。与对照小鼠相比，PTCRA-ADC治疗表现出良好的耐受性，该治疗组没有明显的痛苦或体重差异(图17)。总的来说，所述结果表明，用细胞毒性ADC靶向T-ALL的pre-TCR代表一种有希望的方法，可特异性地根除肿瘤细胞，同时保留正常T细胞，并支持进一步发展靶向PTCRA的药物，用于临床转化。
T-ALL的生物学受到其发育起源的强烈影响。例如，NOTCH1突变(胸腺细胞发育的关键调节因子)发现于大约60％患者肿瘤中。然而，关于胸腺细胞发育的其他决定因素在多大程度上参与T-ALL白血病发生，目前还知之甚少。因此，为了阐明在T-ALL发病机制中，除Notch1以外的胸腺细胞发育因子的作用，使用一种基于胸腺移植的模型，该模型自发地产生遗传上不同的T-ALL病例，并概括人类疾病的许多关键遗传和组织病理学特征(Martins等人，2014Nature 509：465-470)。从所述模型获得的肿瘤RNA测序显示，通过β-选择检查点，与进展相关的因素有很强的上调，β-选择检查点是胸腺细胞发育的一个关键步骤，它针对未成功重排TCRβ基因座的胸腺细胞进行选择。通过这个检查点成功完成DN3到DN4转变的胸腺细胞启动一组快速的增殖和存活信号转导。β-选择检查点是胸腺细胞发育的关键步骤。在这个模型中，假设通过β-选择检查点所需因子的上调可有助于白血病的发生。利用Ptcra KO胸腺移植验证关键的DN3到DN4转换因子pre-TCR在T-ALL白血病发生中的作用，并在所述系统中观察到白血病发生效率的显著降低。此外，结果表明，人T-ALLs经常表达高水平的PTCRA，而人T-ALL细胞系的一个亚群对PTCRA缺失或介导pre-TCR信号转导的SRC-家族激酶的化学抑制敏感。
所述结果支持T细胞前体的发育生物学提示T-ALL白血病发生和临床进程的范式。所述最具特点的是T-ALL中致癌的NOTCH1信号转导的关键作用。
数篇报告已描述pre-TCR在T-ALL发病机制中的可能作用，表明它与其他白血病基因改变包括TEL-JAK2融合协作(dos Santos等人，2007Blood 109：3972-3981)，激活NOTCH突变(Bellavia等人，2002PNAS USA 99：3788-3793)和Ikaros缺乏(Winandy等人，1999JExp Med 190：1039-1048)。这是第一个描述pre-TCR信号传导在T-ALL白血病发生中的重要作用(超越特定的基因工程驱动突变)的报告，并且是第一个证明在人T-ALL细胞株需要pre-TCR信号转导的报道。
pre-TCR调节伴随DN3向DN4转变的增殖爆发，并通过β-选择帮助细胞避免死亡(von Boehmer 2005Nat Rev Immunol 5：571-577)。在本文描述的模型中，Ptcra KO胸腺不能有效地形成白血病，这可以用T-ALL白血病发生所需的pre-TCR信号转导来解释，即这一信号转导在T-ALL发病机制中起着积极作用。首先，Ptcra KO胸腺确实含有αβ-系胸腺细胞，并且能够支持成熟T细胞的产生，这表明在缺乏Ptcra的情况下，进展到超过DN3阶段是可能的。此外，增加移植的Ptcra胸腺叶数量并没有增加白血病发生的效率，这表明DN4或超过的(DN4 or beyond)胸腺细胞不是转化的限制因素。最后，在已建立的人T-ALL细胞株中敲除PTCRA导致细胞增殖缺陷的观察结果强烈表明，pre-TCR的信号传导在T-ALL中是重要的。
PTCRA是胸腺细胞限制性Notch1靶点的事实提示靶向PTCRA可提供一个比抑制Notch1更有利的治疗窗口，抑制Notch1导致肠祖细胞中Notch1功能引起的胃肠道毒性(Takebe等人，2014Pharmacol Ther 141：140-149；Wei等人，2010Mol Cancer Ther 9：1618-1628)。此外，在白血病T细胞中PTCRA的升高的表达，但在正常成人T细胞中PTCRA的缺失，这与其发育功能一致，保证选择性靶向T-ALL不影响正常T细胞隔室。重要的是，正常T细胞免疫的损伤已经成为针对T细胞源性恶性肿瘤的下一代治疗的主要障碍(Martin等人，2006Clin Infect Dis 43：16-24)。
并非所有的T-ALL基因工程小鼠模型都需要pre-TCR信号转导，包括Trp53或ATM缺陷小鼠(Liao等人，1998Mol Cell Biol 18：3495-3901；Petiniot等人，2000PNAS USA)。在所述病例中，在胸腺细胞开始在DN3表达pre-TCR之前，恶性肿瘤似乎已启动。不受特定理论束缚，这与人类文献是一致的，在超过一半的T-ALL病例中，特别是皮质下降病例中，pre-TCR上调。另外，观察到PTCRA在ETP-ALL中低水平表达。在St Jude’s Pediatric Cancer数据集中，组中PTCRA的差异表达数据(图10B，图11B)是特别引人注目的，因为测序是在分选的白血病细胞群上完成的，减少由于肿瘤微环境中细胞异质性引起的混淆。
总的来说，本文强调pre-TCR信号传导在T-ALL发病机制中的重要作用。鉴于缺乏针对该疾病的靶向治疗，pre-TCR可能是该适应症的可行性治疗靶点。
利用基于胸腺移植的T-ALL自发小鼠模型，发现白血病T细胞中多种β-选择检查点因子上调，包括Ptcra，其是前T细胞受体(pre-TCR)复合物的一个亚单位。在小鼠模型中，Ptcra的基因消融显著减少T-ALL的发生。在人T-ALL细胞株中，PTCRA的CRISPR/Cas9敲除降低体外增殖能力和体内形成肿瘤的能力。临床T-ALL数据集和患者样本的分析表明，PTCRA在白血病T细胞中高度特异性表达，而在正常成熟T细胞中并非如此，为T-ALL靶向治疗(PTCRA-导向)提供合适的治疗窗口。总的来说，实施例表明pre-TCR信号传导在驱动和维持T-ALL中的重要作用。
实施例8.其他连接体有效载荷的合成
在Varian Inova 300或500MHz NMR仪器上获得质子NMR光谱。色谱纯度在安捷伦1200系列或1100系列LC/MS系统上测定，该系统配有电喷雾离子化源和triple-quad离子阱分析仪，利用Merck Chromolith RP-18e分析型HPLC柱(monolithic，50×2mm)和下述分析HPLC方法：进样量5μL；流速1mL/min；5→95％乙腈的水溶液，含0.05％AcOH，历经5分钟；安捷伦二极管阵列检测器，λ＝254，220或195nm；室温。除非另外说明，所有的原料和溶剂都是商业购买的，并未经纯化而使用。
根据下述，由化合物1合成连接体有效载荷10。
Figure BDA0003553133530000581
美登素-N-甲基-L-丙氨酸-3-甲氧基苯甲酰胺-4-氨基-苯甲酰氨基氨基甲酸酯-Ala-Val-Cap-NH2(10)
4-氨基-3-甲氧基苯甲酸烯丙酯的合成(3)
步骤1：在室温、氩气气氛下，将3-甲氧基-4-硝基苯甲酸1(500mg，2.53mmol)溶于3.0mL无水DMF中。依次加入Cs2CO3(1.66g，5.10mmol)和烯丙基溴(330μL，3.80mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。然后，将反应混合物在水(10mL)和DCM(10mL)之间分配；然后，分离各层；将有机层用Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发。将残余物溶解在1mL DMF中，并装载在24g硅胶柱上。洗脱剂：EtOAc和己烷(0％至100％EtOAc，历经25分钟)。将含有产物的级分合并，并真空蒸发。得到为白色固体的产物(500mg，产率83％)。MS(ESI,pos.):C11H12NO5,计算值238.1；实测值(M+H)238.1.
步骤2：将化合物2(142mg，0.60mmol)溶解在7mL CH3CN/H2O 4:3中。依次加入AcOH(1.30mL，24.0mmol)和Zn粉(783mg，12.0mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时后，通过LC/MS确定反应完全。将反应混合物通过硅藻土过滤并真空部分蒸发。然后，将反应混合物在水(10mL)和DCM(10ml)之间分配；然后，分离各层。将有机层用饱和NaHCO3水溶液(1x10mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发。得到为深黄色油状物的粗产物(120mg，产率97％)。未经纯化，将其用于下一步。MS(ESI,pos.)：C11H14NO3计算值208.1(M+H)；实测值208.1；MS(ESI,neg.)C11H12NO3计算值206.1(M-H)；实测值206.1.
化合物5的合成：
在室温、氩气气氛下，将化合物3(250mg，1.21mmol)溶于8.0mL DCM中。将溶液冷却至0℃，并依次加入Et3N(504μL，3.62mmol)和三光气(717mg，1.21mmol)。将所得混合物在0℃搅拌30min，并在室温下搅拌2小时。真空蒸发溶剂。将残留物真空干燥1小时。滴加FmocValAlaPAB乙醇(622mg，1.21mmol)的无水DMF溶液(1.0mL)。将混合物在70℃下加热1小时。将混合物冷却至室温。然后，将混合物直接加载到100g C18 Aq Isco柱上。洗脱剂：CH3CN和H2O(两者都含0.05％AcOH)，用10％至90％CH3CN洗脱，历经30min。将含有产物的级分合并，并真空下部分蒸发，冷冻，冻干。得到为白色固体的产物(180mg，产率20％)。MS(ESI,pos.)：C42H44N4O9Na计算值771.3(M+Na)；实测值771.2.
化合物6的合成：
在室温、氩气气氛下，将化合物5(114mg，0.15mmol)溶于2mL无水THF中。依次加入吗啉(27.0μL，0.30mmol)和Pd(PPh3)4(176mg，0.15mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌2小时后，通过LC/MS确定反应完全。真空蒸发溶剂。将残留物溶于1mL DMF中，并装载到30gC18 Aq Isco柱上。洗脱剂：CH3CN和H2O(两者都含0.05％AcOH)，用0％至70％CH3CN洗脱，历经30min。将含有产物的级分合并，并真空下部分蒸发，冷冻，冻干。得到为白色固体的产物(5.0mg，产率33％)。MS(ESI,pos.)：C39H40N4O9Na,计算值731.3；实测值(M+Na)731.3。MS(ESI,neg.)C39H39N4O9计算值707.3；实测值(M-H)707.3。
化合物7的合成：
在室温、氩气气氛下，将化合物6(50.0mg，0.07mmol)溶于1.5mL无水DMF中。加入哌啶(27.0μL，0.28mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌1小时后，通过LC/MS确定反应完全。将溶液直接装载到30g C18 Aq Isco柱上。洗脱剂：CH3CN和H2O(两者都含0.05％AcOH)，用0％至40％CH3CN洗脱，历经25min。将含有产物的级分合并，并真空下部分蒸发，冷冻，并冻干。得到为白色固体的产物(25mg，产率73％)。MS(ESI,pos.)：C24H31N4O7,计算值487.2；实测值(M+H),487.2。MS(ESI,neg.)C24H29N4O7,计算值485.2；实测值(M-H)485.2。
化合物8的合成：
在室温、氩气气氛下，将化合物7(22.0mg，0.04mmol)溶于1.0mL无水DMF中。加入FmocNHCapOSu(22.0mg，0.05mmol)和DIPEA(15.0μL，0.09mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将溶液直接装载到50g C18 Aq Isco柱上。洗脱剂：CH3CN和H2O(0％-70％CH3CN，历经25min)。将含有产物的级分合并，并真空下部分蒸发，冷冻，并冻干。得到为白色固体的产物(27mg，产率73％)。MS(ESI,pos.):C45H51N5O10Na,计算值844.4；实测值(M+Na)844.3。MS(ESI,neg.)C45H50N5O10,计算值820.4；实测值(M-H)820.3。
化合物9的合成：
在室温、氩气气氛下，将化合物8(40.0mg，0.05mmol)溶于1.5mL无水DMF中。加入Maytan-NMA(38.0mg，0.06mmol)、HATU(0.08mmol)和NMM(11.0μL，0.10mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将溶液直接装载到30g C18 Aq Isco柱上。洗脱剂：CH3CN和H2O(两者都含0.05％AcOH)，0％-40％CH3CN，历经25min。将含有产物的级分合并，并真空下部分蒸发，冷冻，并冻干。得到为白色固体的产物(46mg，产率65％)。MS(ESI,pos.)：C77H94ClN8O18,计算值1453.6；实测值(M+H)1453.8。
化合物10的合成：
在室温、氩气气氛下，将化合物9(40mg，0.03mmol)溶于1.5mL无水DMF中。加入哌啶(8.0μL，0.08mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌。20分钟后，LC/MS检测反应完全。将混合物直接装载到30g C18 Aq Isco柱上。洗脱剂：CH3CN和H2O(两者都含0.05％AcOH)，0％-50％CH3CN，历经25min。将含有产物的级分合并，并真空下部分蒸发，冷冻，并冻干。得到为白色固体的产物(20.0mg，产率59％)。MS(ESI,pos.)：C62H84ClN8O16,计算值1231.6；实测值(M+H)1231.7。MS(ESI,neg.)：C62H82ClN8O16,计算值1229.6；实测值(M-H)1229.5。1H NMR(500MHz):δ9.93(bs,1H),8.69-8.68(m,1H),8.15(d,J＝7.0Hz,1H),7.81(d,J＝8.5Hz,1H),7.70-7.68(m,1H),7.59-7.58(m,2H),7.33(d,J＝9.0Hz,2H),7.22-7.21(m,1H),6.93-6.86(m,4H),6.65-6.56(m,2H),5.96(bs,1H),5.65-5.60(m,1H),5.46-5.42(m,1H),5.05(s,2H),4.60-4.58(m,1H),4.38-4.36(m,1H),4.17-4.14(m,1H),4.12-4.07(m,1H),3.94(s,3H),3.56-3.50(m,3H),3.44(d,J＝13.0Hz,1H),3.24-3.26(m,6H),2.89(bs,3H),2.81-2.79(m,1H),2.73(bs,3H),2.63-2.62(m,2H),2.36-2.35(m,1H),2.16-2.11(m,3H),1.98-1.94(m,1H),1.72-1.71(m,1H),1.61(bs,3H),1.49-1.45(m,4H),1.34-1.12(m,11H),1.13(d,J＝6.0Hz,3H),0.87-0.82(m,9H).
根据下述，由化合物6合成连接体有效载荷14。
Figure BDA0003553133530000611
美登素-N-甲基-L-丙氨酸-3-甲氧基苯甲酰氨-4-氨基苯甲酰氨基氨基甲酸酯-Ala-Val-Peg8-Prop-Mal(14)
化合物11的合成：
向污染有DIEA的May-NMA(190mg，0.292mmol)的无水DMF(1.6mL)溶液中，加入化合物6(85.2mg，0.120mmol)、HATU(112mg，0.295mmol)和NMM(65μL，0.591mmol)。用氩气吹扫得到的反应混合物，并将其在环境温度下搅拌。20h后，加入另外的化合物6(27mg，0.0381mmol)的DMF(1mL)溶液，并将混合物再搅拌8h，LC/MS观察到化合物6完全消耗。然后，用DMSO稀释溶液，直接加载到C18 Aq Isco柱(150g)上。洗脱剂：CH3CN和H2O，各含0.05％AcOH(5％-95％CH3CN)。将含有产物的级分合并，并冷冻干燥，得到为白色固体的化合物11(43.3mg，20％产率，基于化合物6)。MS(ESI,pos.)：C71H82ClN7O17Na,计算值1362；实测值(M+Na)1362。
化合物12的合成：
将化合物11(40.2mg，0.0300mmol)溶于20％二乙胺的DMF溶液(v/v)(1.0mL，1.93mmol DEA)中，然后，将得到的反应混合物在环境温度搅拌。20min后，通过LC/MS确定反应完成。然后，用DMSO稀释溶液，并直接加载到C18Aq Isco柱(30g)上。洗脱剂：CH3CN和H2O，各含0.05％AcOH(0％-100％CH3CN)。将含有产物的级分合并，并冷冻干燥，以得到为白色固体的化合物12(22.6mg，产率67％)。MS(ESI,pos.)：C56H73ClN7O15,计算值1118；实测值(M+H)1118；MS(ESI,neg.)：C56H71ClN7O15,计算值1116；实测值(M-H)1116。
化合物14的合成：
向化合物12(11.6mg，0.0104mmol)中，加入MalPeg8NHS酯13(14.3mg，0.0207mmol)的无水DMF(0.1mL)溶液，随后加入另外的DMF(0.1mL)和DIEA(5.5μL，0.311mmol)。用氩气吹扫得到的反应混合物，并将混合物在环境温度下搅拌。50min后，LC/MS确定反应完全。然后，用DMSO稀释溶液，并将溶液直接加载到C18 Aq Isco柱(15.5g)上。洗脱剂：CH3CN和H2O，各含0.05％AcOH(20％-100％CH3CN)。将含有产物的级份合并并冻干，得到为白色固体的化合物14(6.0mg，产率34％)。MS(ESI,pos.)：C82H114ClN9O27Na,计算值1714；实测值(M+H)1714。1HNMR(500MHz；CDCl3):δ8.72(bs,1H),8.04(dtd,J＝5.3,2.0,0.9Hz,1H),7.75(dd,J＝7.8,0.6Hz,2H),7.37-7.34(m,3H),6.99-6.95(m,3H),6.84(s,1H),6.75-6.71(m,3H),6.50-6.40(m,2H),6.25(s,1H),5.83-5.77(m,1H),5.50-5.46(m,1H),5.14(s,2H),4.94-4.91(m,1H),4.69-4.66(m,1H),4.34-4.30(m,1H),4.22(t,J＝6.0Hz,1H),4.01(s,3H),3.86(t,J＝7.2Hz,3H),3.75(s,3H),3.66-3.61(m,32H),3.54-3.53(m,4H),3.44-3.41(m,3H),3.38(s,3H),3.13-3.05(m,5H),2.93(s,3H),2.76-2.67(m,2H),2.55-2.50(m,3H),2.31-2.22(m,2H),1.74-1.64(m,5H),1.52-1.45(m,7H),1.33-1.27(m,4H),1.02(dd,J＝11.6,6.8Hz,6H),0.88(s,3H).
实施例9.用细胞毒性抗体-药物缀合物靶向PTCRA在体外和体内促进T-ALL细胞的特异性杀伤
根据实施例7中描述的PTCRA-ADC的抗白血病作用，探讨是否另外的连接体有效载荷形式也应具有抗白血病活性。为此，将靶向PTCRA的mAb与另外的连接体有效载荷MAYT3LP(本文提供的结构)缀合，从而将靶向PTCRA的mAb与有效的微管抑制剂(MAYT3)通过不可裂解连接体连接起来。为此，靶向PTCRA的mAb与MAYT3LPINT反应。由此产生的药物-抗体比率(DAR)是～3.5，并将该化合物在下文中称为PTCRA-MAYT3LP。此外，将靶向PTCRA的mAb与另外的连接体有效载荷MAYT4LP(本文提供的结构)缀合，从而通过可裂解的连接体将靶向PTCRA的mAb与有效的微管抑制剂(MAYT4)连接。为此，靶向PTCRA的mAb与实施例8中描述的化合物14反应。由此产生的药物-抗体比率(DAR)为～3.5，并将该化合物在下文中称为PTCRA-MAYT4LP。ADCs PTCRA-MAYT3LP和PTCRA-MAYT4LP，而不是适当的对照-ADCs，促进人PTCRA+白血病细胞的剂量依赖性杀伤，具有低的纳摩尔范围的IC50值(图19A，表格形式的数值见图19G)。
在一组人白血病细胞株上测试PTCRA-MAYT3LP和PTCRA-MAYT4LP的活性。PTCRA-ADC选择性诱导人SupT1 T-ALL细胞的杀伤，但不影响B-ALL(NALM6)和AML(K562)细胞株的活力(图19B，表格形式的数值见图19H)。AML和B-ALL细胞在RNA水平具有非常低的PTCRA水平(大多数数据集的中位数和平均值接近<1)。此外，PTCRA-MAYT3LP和PTCRA-MAYT4LP治疗对正常外周血T细胞的活力也没有影响，与其选择性表达模式一致。
这些分子的体外效力促使评价其在各种T-ALL体内模型的抗白血病活性。为此，将NSG小鼠皮下注射(s.c.)5,000,000个PTCRA+SupT1细胞，并且一旦肿瘤可触及，随机用单剂量PTCRA-MAYT4LP或对照-MAYT4LP治疗。在整个研究中，通过测量植入肿瘤的肿瘤体积，对肿瘤负荷进行纵向量化。与对照-2921治疗的小鼠相比，用PTCRA-MAYT4LP处理的T-ALL荷瘤小鼠显示显著降低的肿瘤负荷(图19C)。在一个单独的实验中，植入后第1天，将C57BL/6小鼠静脉注射(i.v.)注射PTCRA+mTALL细胞，并根据肿瘤负荷随机分组，并用PTCRA-MAYT4LP或对照-2921 2qw治疗。在整个研究过程中，通过量化外周血中原始细胞的数量以及在研究结束时在第21天量化脾脏质量，纵向评估肿瘤负荷。与对照-2921对照组相比，用PTCRA-MAYT4LP处理的T-ALL荷瘤小鼠在外周血和脾脏中的肿瘤负荷统计学显著地降低(图19D和图19E)。PTCRA-MAYT4LP治疗也与T细胞发育不全无关，这突出靶向PTCRA分子对白血病T细胞相对于非恶性T细胞的特异性(图19F)。
总的来说，所述结果证实，用细胞毒性ADC靶向T-ALL的pre-TCR代表一种有希望的方法，该方法可特异性根除肿瘤细胞，同时保留正常T细胞，并支持将靶向PTCRA的物质进一步发展，用于临床转化。
本公开书不受本文所述的具体实施方案的范围限制。事实上，除了本文描述的实施方案之外，对于本领域的技术人员，根据前文描述和附图，本公开书的各种修改将变得显而易见。所述修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
Figure IDA0003553133570000011
Figure IDA0003553133570000021
Figure IDA0003553133570000031

Claims (47)

1.包含特异性结合前T细胞抗原受体α(PTCRA)的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体或其抗原结合片段缀合至治疗部分。
2.权利要求1的ADC，其中治疗部分选自细胞毒性物质、化疗药物和放射性同位素。
3.权利要求2的ADC，其中治疗部分是细胞毒性物质。
4.权利要求3的ADC，其中细胞毒性物质是奥瑞他汀。
5.权利要求4的ADC，其中奥瑞他汀是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)或其衍生物。
6.权利要求3的ADC，其中细胞毒性物质是美登木素生物碱。
7.权利要求6的ADC，其中美登木素生物碱是
Figure FDA0003553133520000011
8.权利要求1-7中任何一项的ADC，其中将抗体或其抗原结合片段通过不可裂解连接体缀合至治疗部分。
9.权利要求1-8中任何一项的ADC，其中将抗体或其抗原结合片段通过连接体缀合至治疗部分，其中连接体键合至抗体或其抗原结合片段的赖氨酸残基。
10.权利要求1-9中任何一项的ADC，其中ADC杀死表达PTCRA的细胞。
11.权利要求1-10中任何一项的ADC，其中ADC杀死T-细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞。
12.权利要求11的ADC，其中ADC杀死T-ALL细胞，具有大约1pM至大约10nM的IC50值。
13.权利要求11或12的ADC，其中相对于正常外周T细胞，ADC选择性杀死T-ALL细胞。
14.权利要求1-13中任何一项的ADC，其中抗体或其抗原结合片段是2F5。
15.药物组合物，其包含权利要求1至14中任何一项的ADC和药学上可接受的载体。
16.一种在荷瘤受试者中抑制或减少肿瘤生长的方法，该方法包括向受试者给药包含特异性结合前T细胞抗原受体α(PTCRA)的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与治疗部分缀合。
17.权利要求16的方法，其中所述肿瘤是血液肿瘤。
18.权利要求16或17的方法，其中所述肿瘤起因于T细胞祖细胞的恶性转化。
19.一种在受试者中治疗T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的方法，该方法包括向受试者给药包含特异性结合前T细胞抗原受体α(PTCRA)的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与治疗部分缀合。
20.权利要求19的方法，其中受试者患有化疗难治性和/或复发的T-ALL。
21.权利要求19或20的方法，其中白血病发生的诱导减少，整体疾病外显率降低，和/或直到52周没有达到形成肿瘤疾病的中位时间。
22.权利要求16-21中任何一项的方法，其中将ADC以至少大约1nM的剂量给药。
23.权利要求16-21中任何一项的方法，其中将ADC以至少大约10nM的剂量给药。
24.权利要求16-23中任何一项的方法，其中将多于一个剂量的ADC给药至受试者。
25.权利要求16-24中任何一项的方法，其中到治疗的第14天，受试者的肿瘤负荷减少约50％。
26.一种杀死表达前T细胞抗原受体α(PTCRA)的细胞的方法，该方法包括将细胞与含特异性结合PTCRA的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)接触，其中所述抗体或其抗原结合片段与治疗部分缀合。
27.权利要求26的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
28.权利要求16-27中任何一项的方法，其中ADC包含于药物组合物中。
29.权利要求28的方法，其中药物组合物还包含药学上可接受的载体。
30.权利要求16-29中任何一项的方法，其中治疗部分选自细胞毒性物质、化疗药物和放射性同位素。
31.权利要求30的方法，其中治疗部分是细胞毒性物质。
32.权利要求31的方法，其中细胞毒性物质是奥瑞他汀。
33.权利要求32的方法，其中奥瑞他汀是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)或其衍生物。
34.权利要求31的方法，其中细胞毒性物质是美登木素生物碱。
35.权利要求34的方法，其中美登木素生物碱是
Figure FDA0003553133520000041
36.权利要求16-35中任何一项的方法，其中将抗体或其抗原结合片段通过不可裂解连接体缀合至治疗部分。
37.权利要求16-36中任何一项的方法，其中将抗体或其抗原结合片段通过连接体缀合至治疗部分，其中连接体键合至抗体或其抗原结合片段的赖氨酸残基。
38.权利要求16-37中任何一项的方法，其中该方法导致杀死T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞。
39.权利要求38的方法，其中该方法不导致杀死正常的外周T细胞。
40.权利要求1-14中任一项的ADC在制备用于治疗受试者T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的药物中的用途。
41.权利要求1-14中任何一项的ADC或权利要求15的组合物在治疗受试者的T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中的用途。
42.一种包含权利要求1-14中任何一项的ADC或权利要求15的组合物、以及使用说明书的套盒。
43.权利要求6或8的ADC或者权利要求34或36的方法，其中美登木素生物碱是
Figure FDA0003553133520000042
44.权利要求6或8的ADC或者权利要求34或36的方法，其中美登木素生物碱是
Figure FDA0003553133520000051
45.权利要求1的ADC或权利要求26的方法，其中抗体或其抗原结合片段缀合至：
Figure FDA0003553133520000052
46.权利要求1的ADC或权利要求26的方法，其中抗体或其抗原结合片段缀合至：
Figure FDA0003553133520000053
47.权利要求1的ADC或权利要求26的方法，其中抗体或其抗原结合片段缀合至：
Figure FDA0003553133520000054
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