CN105793286A - 抗prlr抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合到催乳素受体(PRLR)的抗体和其使用方法。根据某些实施方案，本发明的抗体以高亲和力结合人类PRLR。在某些实施方案中，本发明包括结合PRLR并阻断催乳素介导的细胞信号传导的抗体。在其他实施方案中，本发明包括结合PRLR但不阻断催乳素介导的细胞信号传导的抗体。本发明的抗体可以是完全人抗体。本发明包括缀合至细胞毒性剂、放射性核素、或不利于细胞生长或增殖的其它部分的抗PRLR抗体。本发明的抗体可用于治疗各种癌症以及其他PRLR相关病症。本发明还包括抗体?药物缀合物，所述抗体?药物缀合物包含特异性结合I类细胞因子受体的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒性剂。

Description

抗PRLR抗体及其用途
技术领域
本发明涉及特异性结合催乳素受体(PRLR)的抗体和其抗原结合片段、以及包含这样的抗体的抗体-药物缀合物，以及它们的使用方法。
背景技术
催乳素是通过与催乳素受体(PRLR)相互作用而发挥其活性的多肽生长激素。PRLR是属于I类细胞因子受体超家族的单一跨膜受体。催乳素与PRLR的结合导致受体的二聚化和细胞内信号传导。通过PRLR的信号传导与各种过程相关联，所述过程诸如为乳腺发育、哺乳、生殖和免疫调节有关。此外，已在乳腺、前列腺和其它肿瘤类型中检测到高水平的PRLR表达。
PRLR信号转导的阻断已被建议作为治疗乳腺癌和前列腺癌的手段。(参见，例如，Damiano和Wasserman,2013年4月,Clin.Cancer Res.19(7):1644-1650)。抗PRLR抗体例如在美国专利号7867493和7422899中被提及。尽管如此，本领域需要新的PRLR拮抗剂(如抗PRLR抗体)，用于治疗癌症和与PRLR表达和/或信号传导有关的其它病症。
发明内容
本发明提供结合人催乳素受体(PRLR)的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体特别可用于靶向表达PRLR的肿瘤细胞。本发明的抗PRLR抗体和其抗原结合部分，可以以未修饰的形式单独使用，或者可以作为抗体-药物缀合物或双特异性抗体的部分被包括在其中。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可以仅包括抗原结合部分(例如，是Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并且可以被修饰以实现功能，例如，消除残余效应子功能(Reddy等人，2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明的示例性抗PRLR抗体在本文的表1和表2中列出。表1列出了示例性的抗PRLR抗体的重链可变区(HCVRs)、轻链可变区(LCVRs)、重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性的抗PRLR抗体的HCVRs、LCVRs、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识符。
本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合PRLR，且包含HCVR，所述HCVR包括选自表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合PRLR且包含LCVR，所述LCVR包括选自表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合PRLR，且包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包括与表1中列出的任一LCVR氨基酸序列配对的表1中列出的任一HCVR氨基酸序列。根据某些实施方案，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包括包含在表1中所列出的任一示例性抗PRLR抗体内的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方案中，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由下述所构成的组：18/26；66/74；274/282；290/298；和370/378。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包含重链CDR1(HCDR1)，所述重链CDR1(HCDR1)包括选自表1中列出的HCDR1氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包含重链CDR2(HCDR2)，所述重链CDR2(HCDR2)包括选自表1中列出的HCDR2氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包含重链CDR3(HCDR3)，所述重链CDR3(HCDR3)包括选自表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包含轻链CDR1(LCDR1)，所述轻链CDR1(LCDR1)包括选自表1中列出的LCDR1氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包含轻链CDR2(LCDR2)，所述轻链CDR2(LCDR2)包括选自表1中列出的LCDR2氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包含轻链CDR3(LCDR3)，所述轻链CDR3(LCDR3)包括选自表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合PRLR，且包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包括与表1中列出的任一LCDR3氨基酸序列配对的表1中列出的任一HCDR3氨基酸序列。根据某些实施方案，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包括包含在表1中所列出的任一示例性抗PRLR抗体内的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中，所述HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由下述所构成的组：24/32；72/80；280/288；296/304和376/384。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包括包含在表1中所列出的任一示例性抗PRLR抗体内的六个CDR的组(set)(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施方案中，所述HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列的组选自由下述所构成的组：20-22-24-28-30-32；68-70-72-76-78-80；276-278-280-284-286-288；292-294-296-300-302-304；和372-374-376-380-382-384。
在相关的实施方案中，本发明提供了抗体、或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR，且包含六个CDR的组(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，所述六个CDR的组包含在由表1中所列出的任一示例性的抗PRLR抗体所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内。例如，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PRLR且包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列的组，所述氨基酸序列的组包含在选自由下述所构成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对内：18/26；66/74；274/282；290/298；和370/378。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域内公知的，并可用于鉴定本文所公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内CDR。可用于鉴定CDR的边界的示例性规范包括例如Kabat定义、Chothia定义以及AbM定义。总的来说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基于结构环区的位置，而AbM定义则是Kabat方法与Chothia方法两者之间的折衷。参阅例如Kabat的“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，National Institutesof Health,Bethesda，Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用来鉴定抗体内的CDR序列。
本发明也提供了编码抗PRLR抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中所列出的任一HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的HCVR核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明也提供了编码表1中所列出的任一LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的LCVR核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明也提供了编码表1中所列出的任一HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的HCDR1核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明也提供了编码表1中所列出的任一HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的HCDR2核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明也提供了编码表1中所列出的任一HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的HCDR3核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明也提供了编码表1中所列出的任一LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的LCDR1核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明也提供了编码表1中所列出的任一LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的LCDR2核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明也提供了编码表1中所列出的任一LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的LCDR3核酸序列中的任一种的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中，所述HCVR包含三个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)的组，其中，HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列的组是如通过表1中列出的任一示例性的抗PRLR抗体所限定的。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包括三个CDR的组(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中，LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列的组是如通过表1中列出的任一示例性的抗PRLR抗体所限定的。
本发明还提供了编码HCVR和LCVR的核酸分子，其中，所述HCVR包含表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列，且其中所述LCVR包含表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一种的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中所列的任一HCVR核酸序列的多核苷酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列、和选自表2中所列的任一LCVR核酸序列的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的实质上类似的序列。在根据本发明的这个方面的某些实施方案中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中，所述HCVR和LCVR均来源于表1中所列的相同的抗PRLR抗体。
本发明还提供了能够表达包含抗PRLR抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本发明包括重组表达载体，所述重组表达载体包括任一上述的核酸分子，即，编码如表1中所列出的所述HCVR、LCVR、和/或CDR序列中的任一种的核酸分子。在本发明的范围内还包括已引入载体的宿主细胞、以及通过在允许抗体或抗体片段的生产的条件下培养所述宿主细胞和回收由此产生的抗体和抗体片段而生产所述抗体或其部分的方法。
本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗PRLR抗体。在一些实施方案中，为除去不期望的糖基化位点而进行的修饰可能是有用的，或缺乏存在于寡糖链上的岩藻糖部分的抗体，为了例如增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield et al.(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含特异性结合PRLR的重组人抗体或其片段、和药学上可接受的载体。在相关的方面，本发明的特征在于组合物，所述组合物是抗PRLR抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是与抗PRLR抗体有利结合的任何试剂。本发明还提供了包含缀合至细胞毒性试剂的抗PRLR抗体的抗体-药物缀合物(ADC)。涉及本发明的抗PRLR抗体的示例性组合疗法、联合制剂、和ADC在本文其它部分公开。
在又一方面，本发明提供利用本发明的抗PRLR抗体或抗体的抗原结合部分的用于杀死肿瘤细胞或抑制或衰减肿瘤细胞生长的治疗方法。根据本发明的这个方面的治疗方法包括对需要其的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段。所治疗的疾病是通过靶向PRLR和/或通过抑制催乳激素介导的经由PRLR的细胞信号传导而被改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病症。
在审阅随后的详细描述后，其他实施方案将变得显而易见。
具体实施方式
在描述本发明之前，应理解本发明不限于所述特定方法以及实验条件，因为这些方法以及条件可以改变。也应当理解本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅会受到随附权利要求所限制。
除非另有定义，否则所有本文使用的技术以及科学术语具有与本发明所属领域中技术人员普遍理解的相同意思。如本文所用，术语”约”，当使用在有关特定引用的数值时，表示该数值可自所引用的数值起改变不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99与101以及其间的所有数值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管任何类似或等同于本文所述的方法以及材料可应用于实施或测试本发明，现将描述优选的方法以及材料。
定义
本文使用的催乳素受体、“PRLR”等表述，是指人类催乳素受体，其包含如SEQ IDNO：404所述的氨基酸序列。表述“PRLR”包括单体和多聚体PRLR分子。如本文所用，表述“单体人类PRLR”是指下述的PRLR蛋白质或其部分：其不包含或不具有任何多聚结构域且在正常条件下作为单个PRLR分子存在而与另一PRLR分子没有直接的物理连接。示例性的单体PRLR分子是这里称为“hPRLR.mmh”的分子，其包含SEQ ID NO：401的氨基酸序列(参见，例如，本文的实施例3)。如本文所用，表述“二聚的人类PRLR”是指包含通过连接子、共价键、非共价键或或通过多聚化结构域(例如抗体Fc结构域)而彼此连接的两个PRLR分子的构建体。示例性二聚PRLR分子是本文称为“hPRLR.mFc”的分子，其包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列(参见，例如，本文的实施例3)。
本文对蛋白，多肽和蛋白片段的所有的提及旨在指各蛋白、多肽或蛋白片段的人类版本，除非另外明确说明为来自非人类的物种。因此，表述“PRLR”是指人类的PRLR，除非另外明确说明为来自非人类物种，例如，“鼠的PRLR”、“猴子的PRLR”等。
如本文所用，表述“细胞表面表达的PRLR”是指在体外或体内的细胞的表面上被表达的一个或多个PRLR蛋白(S)或它们的胞外域，使得至少部分的PRLR蛋白暴露于细胞膜的细胞外侧，并且对于抗体的抗原结合部分是可接近的。“细胞表面表达的PRLR”可以包括或由下述PRLR蛋白组成：即在通常表达PRLR蛋白的细胞的表面上所表达的PRLR蛋白。或者，“细胞表面表达的PRLR”可以包括或由下述PRLR蛋白组成：即在通常细胞的表面上不表达人类PRLR但已被人工地工程化成在其表面上表达PRLR的细胞的表面上所表达的PRLR蛋白。
如本文所用，表述“抗PRLR抗体”包括具有单一特异性的单价抗体以及包含结合PRLR的第一臂和结合第二(靶点)抗原的第二臂的双特异性抗体，其中抗PRLR臂包括本文表1中阐述的任一HCVR/LCVR或CDR序列。表述“抗PRLR抗体”还包括抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含缀合至药物或毒素(即，细胞毒性剂)的抗PRLR抗体或其抗原结合部分。表述“抗PRLR抗体”还包括抗体-放射性核素缀合物(ADC)，所述抗体-放射性核素缀合物包含缀合到放射性核素的抗PRLR抗体或其抗原结合部分。
如本文所用，术语”抗体”，意指特异性结合至特定抗原(例如PRLR)或与特定抗原(例如PRLR)相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体，其包含至少一个互补决定区(CDR)。术语”抗体”包括含有4个多肽链(即，通过双硫键相互连接的2个重(H)链以及2个轻(L)链)以及其多聚体(例如IgM)。每个重链含有重链可变区(此处缩写为HCVR或VH)以及重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链含有轻链可变区(此处缩写为LCVR或VL)以及轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域(CL1)。VH与VL区可进一步细分成高变区(称为互补决定区(CDR))，其中散布着较保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施方案中，抗PRLR抗体(或其抗原结合部分)的FR可能与人类种系序列相同，或可能经过天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可根据两个以上CDR的并行分析而定义。
如本文所用，术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。本文所用的抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等术语，包括与抗原特异性结合而形成复合体的任何天然产生的、可以酶促方式获得的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的DNA的操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的DNA是已知的及/或很容易从例如市售来源、DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以被合成。该DNA可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如孤立的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或约束型FR3-CDR3-FR4肽。本文所用的“抗原结合片段”这一表述还包括其它工程化的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodular immunopharmaceuticals)(SMIP)，以及鲨鱼可变IgNAR域。
抗体的抗原-结合片段通常会含有至少一个可变区。可变区可以是任何大小或具有任何氨基酸组成，且通常含有邻近具有一个或多个框架序列的框架或在该框架中的至少一个CDR。在含有与VL区相关联的VH区的抗原结合片段中，该VH区和VL区可以相对于彼此位于任何适宜的排列。例如，该可变区可以是二聚化的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体的VH区或VL区。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定区共价连接的至少一个可变区。在本发明的抗体的抗原结合片段内可发现的可变区和恒定区的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变区和恒定区的任何构型(包括上述所列的任何示例性的构型)中，该可变区和恒定区可直接相互连接或可通过完整或部分的铰链区或连接区连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其在单一肽分子中相邻的可变区和/或恒定区之间形成柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含上述所列的任何可变区和恒定区构型的同型二聚体或异型二聚体(或其它多聚体)，所述可变区和恒定区构型以非共价键相互连接和/或与一个或多个单体VH区或VL区(例如通过二硫键)连接。
如同完整的抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变区，其中每个可变区都能够特异性地与单独的抗原或同一抗原的不同表位结合。任何多特异性抗体形式(包括本文所公开的示例性的双特异性抗体形式)，均可利用本领域内可利用的常规技术，改造成用于本发明的抗体的抗原结合片段的情况中。
本发明抗体可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指通过本发明抗体在补体存在下溶解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞与巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体且从而造成靶细胞溶解。CDC与ADCC可使用本领域中熟知且可取得的分析来测量。(参见，例如美国专利号5,500,362与5,821,337及Clynes等(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区就抗体固定补体与介导细胞依赖性细胞毒性的能力来说是重要的。因此，可以基于抗体介导细胞毒性是否是所要的来选择抗体同种型。
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗PRLR抗体是人源抗体。本文所用的术语“人源抗体”意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人源抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变，或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括上述氨基酸残基。然而，本文所用的术语“人源抗体”并不意图包括这样的抗体，即其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列的抗体被移植到人类框架序列上的抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体可以是重组人源抗体。本文所用的术语“重组人源抗体”意在包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人源抗体，例如用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(将在下文中进一步说明)、从重组的组合人源抗体库分离的抗体(将在下文中进一步说明)、从经人类免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等，(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或者以任何其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人源抗体含有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这类重组人源抗体经受体外诱变(或者，当使用经人类Ig序列转基因的动物时，经受体内体细胞诱变)，因此该重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列：虽然它们衍生自人类种系VH序列和VL序列且与它们相关，但可能并不天然地存在于活体内的人源抗体种系库中。
人源抗体可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键而连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是经由链间二硫键连接在一起，且由共价缀合轻链及重链组成的约75-80kDa分子(半抗体)被形成。这些形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化之后也是如此。
第二种形式在各种完整IgG同型中的出现频率，是由于但不限于与抗体的铰链区同型相关的结构差异。人类IgG4铰链的铰链区内单个氨基酸替换可将第二种形式(Angal等.(1993)Molecular Immunology 30:105)的出现显著地降低到利用人类IgGl铰链时通常观察到的水平。本发明包括在铰链区、CH2区或CH3区中含有一个或多个突变的抗体，所述突变可能是所需要的，例如在生产中用于提高所需抗体形式的产率。
本发明的抗体可以是分离的抗体。本文所用的“分离的抗体”意为从其自然环境的至少一个组成部分中识别、分离和/或回收的抗体。例如，从生物体的至少一个组成部分或从抗体自然存在或自然产生的组织或细胞分离或移除的抗体，就是用于本发明目的的“分离的抗体”。“分离的抗体”也包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。依照某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本文公开的抗PRLR抗体与衍生该抗体的相应种系序列相比，在重链和轻链可变区的框架区和/或CDR区可包含一个或多个氨基酸的置换、插入和/或删除。通过将本文所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可获得的种系序列相比，可以容易地证实这类突变。本发明包括衍生自本文所公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生该抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一人类种系序列的相应残基，或突变为相应的种系序列残基的保守性氨基酸置换(这类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，能够容易地产生许多包含一个或多个单个种系突变或其组合的抗体及抗原结合片段。在某些实施方案中，上述VH和/或VL区内的所有框架和/或CDR残基均突变回为在衍生该抗体的原始种系序列中发现的残基。在其它实施方案中，只有某些残基被突变回为原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸中发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变残基，被突变回为原始种系序列。在其他一些实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即不同于最初衍生该抗体的种系序列的种系序列)的相应残基。此外，本发明的抗体可在框架区和/或CDR区内含有两个或多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的相应残基，而其他某些不同于原始种系序列的残基则保持不变或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段，就很容易测试其一种或多种所需的特性，例如改善的结合特异性、提高的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物学特性(视情况而定)、免疫原性下降等。以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段均包括在本发明的范围内。
本发明还包括含有本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一种的变体的抗PRLR抗体，该变体含有一个或多个保守性氨基酸置换。例如，本发明包括含有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗PRLR抗体，该氨基酸序列相对于本文表1所列出的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一种，具有例如10个以下、8个以下、6个以下、4个以下等保守性氨基酸置换。
术语“表位”是指抗原决定簇，其与抗体分子可变区中称为抗原互补位的特异性抗原结合位点相互作用。单个抗原可以有多于一个的表位。因此，不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可产生不同的生物学效应。表位可为构象的或线性的。构象性表位是从线性多肽链的不同片段上空间并列的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链上邻近的氨基酸残基形成的。在某些情况下，一个表位可包括抗原上的糖基、磷酰基，或磺酰基等基团。
术语“实质同一性”或“实质相同”，当指核酸或其片段时，表示当在有适当的核苷酸插入或删除的情况下与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，如通过下述任何公知的序列同一性算法如FASTA、BLAST或Gap所测量的，具有至少约95％的核苷酸序列同一性，且更优选的是具有至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基同一性。在某些情况下，与参照核酸分子具有实质同一性的核酸分子，可编码具有与该参照核酸分子所编码的多肽相同或实质上类似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“实质相似性”或“实质相似”表示当两个肽序列最佳地比对时(诸如按照程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重)，共有至少95％序列同一性，甚至更佳至少98％或99％序列同一性。较佳地，不同一的残基位置因为保守性氨基酸置换而有所差异。“保守性氨基酸置换”是一种氨基酸残基置换成另一种带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)之侧链(R基团)的氨基酸残基。一般来说，保守性氨基酸置换大体上不会改变蛋白质的官能性质。在2或多个氨基酸序列因为保守性置换而彼此有所不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度百分比可以向上调整而校正置换的保守性质。用来做这个调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见,例如Pearson,MethodsMol.B1l.24:307-331(1994)。带有具类似化学性质的侧链之氨基酸群组的实例包括(I)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链:丝氨酸与苏氨酸；(3)含酰胺的侧链:天冬酰胺与谷氨酰胺；(4)芳族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸；(5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸与组氨酸；(6)酸性侧链:天冬氨酸与谷氨酸；以及(7)含硫侧链为半胱氨酸与甲硫氨酸。较佳的保守性氨基酸置换群组为:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换可以是任何在Gonnet et al.Science256:1443-1445(1992)中揭示的PAM250对数-相似矩阵中具有正值的变化。“中度守恒”置换是任何在PAM250对数-相似矩阵中具有非负值的改变。
关于多肽的序列相似性，其亦可意指为序列同一性，典型是使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分派给各种置换、缺失以及其他修饰(包括保守性氨基酸置换)的相似性的测量法来配对相似序列。例如，GCG软件含有诸如Gap与Bestfit的程序，它们可以与默认参数一起用来决定关系相近之多肽(诸如来自于不同物种之生物的同源性多肽)或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用采默认或建议参数的FASTA(—种在GCG第6.1版中的程序)来比对。FASTA(例如FASTA2与FASTA3)提供查询以及检索序列之间最佳重复区域的比对以及百分比序列同一性(Pearson(2000)上文)。当要将本发明的序列与含有大量来自不同生物之序列的数据库比对时，另一个较佳的算法是计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见，例如Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
pH依赖性结合
本发明包括具有pH依赖性结合特征的抗PRLR抗体。例如，相比于中性pH，在酸性pH本发明的抗PRLR抗体可表现出对PRLR的降低的结合。或者，相比于中性pH，在酸性pH本发明的抗PRLR抗体可以表现出对PRLR的增强的结合。表述“酸性pH”包括的pH值小于6.2，例如，约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0、或更小。如本文所用，表述“中性pH”是指pH为约7.0至约7.4。表述“中性pH”包括约7.0，7.05，7.1，7.15，7.2，7.25，7.3，7.35，和7.4的pH值。
在某些情况下，“相比于中性pH在酸性pH下对PRLR的减小的结合”以在酸性pH下抗体结合PRLR的KD值与在中性pH下抗体结合PRLR的KD值的比率来表示(或者反之亦然)。例如，如果抗体或其抗原结合片段显示为约3.0或更大的酸性/中性KD比率，则出于本发明的目的，抗体或其抗原结合片段可以被认为显示出“相比于中性pH在酸性pH下对PRLR的减小的结合”。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD比率可以是约3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0,11.5,12.0,12.5,13.0,13.5,14.0,14.5,15.0,20.0.25.0,30.0,40.0,50.0,60.0,70.0,100.0或更大。
可以得到具有pH依赖性结合特征的抗体，例如，通过针对相对于中性pH在酸性pH对特定抗原的减小(或增强)的结合，筛选抗体群来实现。此外，在氨基酸水平上的抗原结合结构域的修饰可以得到具有pH依赖性的特性的抗体。例如，通过用组氨酸残基置换抗原结合结构域(例如，CDR内)的一个或多个氨基酸，可以获得具有相对于中性pH在酸性pH下的减小的抗原结合的抗体。
包含Fc变体的抗PRLR抗体
根据本发明的某些实施方案，提供了包含Fc结构域的抗PRLR抗体，所述Fc结构域包含一个或多个突变，所述一个或多个突变例如相比于中性pH，在酸性pH下增强或减弱抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括包含在Fc结构域的CH2或CH3中的突变的抗PRLR抗体，其中在酸性环境(例如，在pH为约5.5至约6.0的核内体)中，所述突变提高了Fc结构域对FcRn的亲和力。当施用给动物时，这样的突变可以使得抗体产生增加的血清半衰期。此类Fc的修饰的非限制性实例包括，例如，在下述位置的修饰:250(例如,E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T),254(例如S或T),和256(例如S/R/Q/E/D或T)；或在下述位置的修饰：428和/或433(例如,H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如,H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如，308F,V308F)和434的修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)的修饰；428L,259I(例如，V259I),和308F(例如，V308F)的修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)的修饰；252,254,和256(例如，252Y,254T,和256E)的修饰；250Q和428L的修饰(例如，T250Q和M428L)；和307和/或308的修饰(例如，308F或308P)。
例如，本发明包括包含Fc结构域的抗PRLR抗体，所述Fc结构域包含一对或多对或一组或多组由选自下述所构成的组的突变：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y，254T和256E(例如，M252Y，S254T和T256E)；428L和434S(例如，M428L和N434S)；和433K和434F(例如，H433K和N434F)。前述Fc结构域的突变的所有可能的组合，以及在本文所公开的抗体可变结构域之内的其它突变，预期在本发明的范围之内。
抗体的生物学特性
本发明包括以高亲和性结合单体人类PRLR的抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括以小于约4.0nM的KD与单体人类PRLR(例如，hPRLR.mmh)结合的抗PRLR抗体，所述KD例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，在25℃或37℃通过表面等离子共振测得。根据某些实施方案，提供抗PRLR抗体，所述抗PRLR抗体在37℃以下述KD与单体人类PRLR结合：小于约4nM,小于约3nM,小于约2nM,小于约1nM,小于约900pM,小于约800pM,小于约700pM,小于约600pM,小于约500pM,小于约400pM,或小于约300pM，所述KD例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，通过表面等离子共振测得。
本发明还包括抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段以大于约5分钟的解离半衰期(t1/2)结合单体人类PRLR(例如，hPRLR.mmh)，所述解离半衰期(t1/2)例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，在25℃或37℃通过表面等离子共振测得。根据某些实施方案，提供抗PRLR抗体，所述抗PRLR抗体在37℃以下述t1/2与单体人类PRLR结合：大于约5分钟，大于约6分钟，大于约8分钟，大于约10分钟，大于约12分钟，大于约14分钟，大于约16分钟，大于约18分钟，大于约20分钟，大于约30分钟，大于约40分钟，或更长的时间，所述t1/2例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，通过表面等离子共振测得。
本发明还包括以高亲和性结合二聚体人类PRLR(例如，hPRLR.mFc)的抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括以小于约250pM的KD与二聚体人类PRLR结合的抗PRLR抗体，所述KD例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，在25℃或37℃通过表面等离子共振测得。根据某些实施方案，提供抗PRLR抗体，所述抗PRLR抗体在37℃以下述KD与二聚体人类PRLR结合：小于约250pM,小于约200pM,小于约180pM,小于约160pM,小于约140pM,小于约120pM,小于约100pM,小于约80pM,小于约70pM,或小于约60pM，所述KD例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，通过表面等离子共振测得。
本发明还包括抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段以大于约55分钟的解离半衰期(t1/2)结合二聚体人类PRLR(例如，hPRLR.mFc)，所述解离半衰期(t1/2)例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，在25℃或37℃通过表面等离子共振测得。根据某些实施方案，提供抗PRLR抗体，所述抗PRLR抗体在37℃以下述t1/2与二聚体人类PRLR结合：大于约55分钟,大于约60分钟,大于约65分钟,大于约70分钟,大于约75分钟,大于约80分钟,大于约85分钟,大于约90分钟,大于约95分钟,大于约100分钟,大于约120分钟,大于约140分钟,大于约160分钟或更长的时间，所述t1/2例如使用本文实施例3中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，通过表面等离子共振测得。
本发明还包括抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段结合PRLR和在表达人PRLR的细胞中阻断催乳素介导的信号转导。例如，本发明包括以小于约1.3nM的IC50阻断表达人PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导的抗PRLR抗体，IC50例如使用本文实施例5中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，使用催乳素信号转导阻断试验测定。根据某些实施方案，提供抗PRLR抗体，所述抗PRLR抗体以下述IC50阻断表达人PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导：小于约1.3nM,小于约1.2nM,小于约1.0nM,小于约900pM,小于约800pM,小于约600pM,小于约400pM,小于约200pM,小于约100pM,小于约80pM,小于约60pM,小于约40pM,小于约20pM，所述IC50例如使用本文实施例5中所限定的测定形式或基本上类似的测定法，使用催乳素信号转导阻断试验测定。
本发明还包括抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段结合PRLR但不阻断表达人PRLR细胞中的催乳素介导的信号转导。如本文中所使用的，如果当抗体或其抗原结合片段在诸如本文实施例5中所限定的测定试验等催乳素信号转导阻断测定试验中或基本上类似的测定试验中进行测试时，显示没有或者只有微不足道的阻断活性，则抗体或其抗原结合片段“不阻断”催乳素介导的信号转导。根据某些实施方案中，当抗体在诸如本文实施例5中所限定的测定试验等催乳素信号转导阻断测定试验中或基本上类似的测定试验中进行测试时，如果抗体表现出大于约10nM或大于约100nM的IC50值，则抗体或其抗原结合片段“不阻断”催乳素介导的信号转导。
本发明的抗体可以具有一个或多个上述生物特性，或者它们的任意组合。本发明的抗体的生物学特性的上述列表并非意图穷尽。根据包括本文的工作实施例的本公开内容的综述，对本领域的普通技术人员而言，本发明的抗体的其它生物学特性将是显而易见的。
抗体-药物缀合物(ADC)
本发明提供了包含缀合至治疗性部分的抗PRLR抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，所述治疗性部分诸如细胞毒性剂、化疗药物或放射性同位素。
细胞毒性剂包括对细胞生长、活力或增殖不利的任何试剂。可以缀合到根据本发明的这个方面的抗PRLR抗体的合适的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例包括，例如，1-(2氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼，1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三烷基-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮，1-去氢睾酮，5-氟尿嘧啶，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，9-氨基喜树碱，放线菌素D，鹅膏蕈碱，氨喋呤,蛇形菌素(anguidine)，蒽环类(anthracycline)，氨茴霉素(AMC)，澳瑞他汀(auristatins)，博莱霉素，白消安，丁酸，刺孢霉素，喜树碱，洋红霉素(carminomycins)，卡莫司汀，西地霉素(cemadotins)，顺铂，秋水仙碱，考布他汀，环磷酰胺，阿糖胞苷，细胞松弛素B，更生霉素，柔红霉素，达卡巴，二乙酰氧基戊基多柔比星(diacetoxypentyldoxorubicin)，二溴甘露醇，二羟基炭疽菌二酮，地索拉唑(disorazoles)，多拉司他汀(例如，多拉司他汀10)，阿霉素，倍癌霉素，棘霉素(echinomycins)，五加素(eleutherobins)，吐根碱，埃坡霉素，埃斯培拉霉素(esperamicin)，雌莫司汀(estramustines)，溴化乙锭，依托泊苷，氟尿嘧啶，格尔德霉素(geldanamycins)，短杆菌肽D，糖皮质激素，伊立替康，驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂，轻肌蛋白(leptomycins)，环氧长春碱(leurosines)，利多卡因，洛莫司汀(CCNU)，美登素，氮芥，美法仑，巯基嘌呤(mercatopurines)，甲喋呤(methopterins)，甲氨蝶呤，光神霉素，丝裂霉素，米托蒽醌，N8乙酰亚精胺，鬼臼毒素类，普鲁卡因，普萘洛尔，蝶啶，嘌呤霉素，吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepines)(PBDs)，根霉素(rhizoxins)，菌素，他利霉素(tallysomycins)，紫杉酚，替尼泊苷，丁卡因，苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)，茅层霉素(tomaymycins)，拓扑替康(topotecans)，tubulysin，长春碱，长春新碱，长春地辛，长春瑞滨(vinorelbines)，以及任何上述物质的衍生物。根据某些实施方案中，缀合至抗PRLR抗体的细胞毒素剂是类美登素(maytansinoid)(例如DM1或DM4)、茅层霉素衍生物或多拉司他汀衍生物。根据某些实施方案中，缀合至抗PRLR抗体的细胞毒性剂是澳瑞司他汀诸如MMAE，MMAF，或它们的衍生物。本领域中已知的其他细胞毒性剂预期在本发明的范围内，包括，例如，蛋白质毒素如蓖麻毒蛋白，艰难梭菌毒素，假单胞菌外毒素，蓖麻毒蛋白，白喉毒素，肉毒杆菌毒素，bryodin，皂草素，美洲商陆毒素(即，商陆毒素(phytolaccatoxin)和phytolaccigenin)，以及其它如在Sapra等,Pharmacol.&Therapeutics,2013,138:452-469中阐述的那些。
本发明还包括抗体-放射性核素缀合物(ARC)，所述抗体-放射性核素缀合物包含缀合至一种或多种放射性核素的抗PRLR抗体。在本发明的这个方面的情况下可以使用的示例性的放射性核素包括但不限于，例如，2225Ac,212Bi,213Bi,131I,186Re,227Th,222Rn,223Ra,224Ra,和90Y。
在本发明的某些实施方案中，提供了ADC，所述ADC包含经由连接子分子缀合至细胞毒性剂(例如，上述所公开的任何细胞毒性剂)的抗PRLR。任何本领域中已知的连接子分子或连接子技术可用于创建或构建本发明的ADC。在某些实施方案中，连接子是可切割的连接子。根据其他实施方案中，连接子是不可切割的连接子。可以在本发明的上下文中使用的示例性的连接子包括，含有或由下述组成的连接子：例如MC(6-马来酰亚胺己酰基)、MP(马来酰亚胺丙酰基)，val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)，val-ala(缬氨酸-丙氨酸)，蛋白酶可切割连接子中的二肽点，ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)，蛋白酶切割连接子中的二肽点，PAB(对-氨基苄氧基羰基)，SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯)，SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)，SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)，及其变体和它们的组合。可以在本发明的上下文中使用的连接子的另外的实例中公开在例如US 7,754,681以及Ducry,Bioconjugate Chem.,2010,21:5-13和其中引用的文献中。
本发明包括ADC，在ADC中，连接子通过在抗PRLR抗体或抗原结合分子内的特定氨基酸处的附接而将所述抗体或抗原结合分子连接到药物或细胞毒素。可以在本发明的该方面的情况内使用的示例性氨基酸附接物(attachments)包括，例如，赖氨酸(见，例如，US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等人，Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361；WO2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)，半胱氨酸(见，例如，US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；和US 7,750,116)，硒代半胱氨酸(参见，例如，WO2008/122039；和Hofer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456)，甲酰基甘氨酸(见，例如，Carrico等,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322；Agarwal等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51,和Rabuka等,Nat.Protocols,2012,10:1052-1067)，非天然氨基酸(见，例如，WO 2013/068874,和WO 2012/166559)，和酸性氨基酸酸(见，例如，WO 2012/05982)。连接子也可以通过附接至碳水化合物而缀合至结合抗原的蛋白(见，例如，US 2008/0305497,WO 2014/065661,和Ryan等,Food&Agriculture Immunol.,2001,13:127-130)和二硫化物连接子(见，例如，WO 2013/085925,WO 2010/010324,WO2011/018611,和Shaunak等,Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313)。
根据某些实施方案，本发明提供ADC，其中，如本文所述的抗PRLR抗体缀合至如在2014年3月14日提交的国际专利申请号PCT/US14/29757中所阐述的连接子-药物组合物(例如，化合物“7”，在此也称为“M0026”)。
本领域中公知的用于缀合化学部分到肽、多肽或其他大分子的任何方法可以在本发明的情况中用来制备如本文所述的抗PRLR ADC。用于经由连接子的抗体-药物缀合的示例性方法在本文的实施例6中进行阐述。此示例性方法的变化也将被本领域的普通技术人员理解，并且也被考虑在本发明的范围之内。
使ADC靶向表达低水平的PRLR的细胞
本发明人出人意料地发现，包含缀合至细胞毒性试剂的抗PRLR抗体的ADC能够特异性靶向并杀死表达相对低水平的细胞表面PRLR的细胞。例如，本文实施例7中，示出了包含缀合至DM1的抗PRLR抗体H1H6953N的ADC能够以1.3nM的IC50抑制T47D细胞(仅以超出背景的12X表达PRLR)，并且显示78％的杀伤。与此相反，针对其它肿瘤相关抗原(如ErbB2)的ADC，对于可比较的杀伤效力，通常需要细胞上靶抗原的高得多的表达水平。例如，利用抗-ErbB2-DM1ADC获得在亚纳摩尔IC50范围的细胞杀伤仅能使用以超出背景约200X至约400X的水平表达ErbB2的细胞(见，例如本文的表14-17)。杀死表达相对低水平的肿瘤相关抗原(如PRLR)的肿瘤细胞的能力意味着，本发明的抗PRLR ADC能够以相比于靶向其它肿瘤抗原(如ErbB2)的ADC所需的更低剂量和/或更不频繁的给药，来提供显著的治疗益处。
因此，本发明提供抗体-药物缀合物(ADC)，其包含缀合至细胞毒性剂、特异性结合人类PRLR的抗体或其抗原结合片段，其中，所述ADC有效杀死表达低水平的PRLR的细胞(例如，肿瘤细胞)。在相关的实施方案中，本发明包括用于有效地杀死表达低水平PRLR的细胞的方法。根据本发明的这个方面的方法包括使细胞接触抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物(ADC)包含缀合至细胞毒性剂的抗PRLR抗体。“使细胞接触”可以在体外或在体内进行，例如，通过向需要其的受试者施用抗PRLR ADC，其中所述施用使得ADC接触表达PRLR的细胞。
根据本发明的范围内设想的某些情况，“低水平的PRLR”意指超出背景小于约30倍的表达水平。根据某些实施方案，提供抗PRLR的ADC，所述ADC能有效杀死以下述表达水平表达PRLR的细胞：超出背景的小于约30倍，25倍，20倍，18倍，16倍，14倍，12倍，10倍，8倍或更小。如本文所用的术语“背景”是指当细胞用同种型对照抗体(即，对PRLR为非特异性的)处理时所产生的(非特异性的)信号。
在某些其他情况下，“低水平的PRLR”可表示为每个细胞的PRLR的分子数。例如，如本文所用，表达“低水平”的PRLR的细胞表达每个细胞的少于约1百万拷贝数的PRLR。在具体的实施方案中，“低水平”的PRLR指每个细胞的小于约900,000拷贝数,小于约800,000拷贝数,小于约700,000拷贝数,小于约600,000拷贝数,小于约500,000拷贝数,小于约400,000拷贝数,小于约300,000拷贝数,小于约200,000拷贝数,小于约100,000拷贝数,小于约90,000拷贝数,小于约80,000拷贝数,小于约70,000拷贝数,小于约60,000拷贝数,小于约50,000拷贝数,小于约40,000拷贝数,小于约30,000拷贝数,小于约20,000拷贝数,或小于约10,000拷贝数的PRLR。
如本文所用，“有效杀死”的意思是在肿瘤细胞杀伤试验(诸如本文实施例7中所限定的试验)或实质上类似的试验中，ADC表现出小于约20nM、或小于约1nM(例如，小于约0.9nM，小于约0.8nM，小于约0.7nM，小于约0.6nM，小于约0.5nM，小于约0.4nM，或小于约0.3nM)的IC50。根据本发明的这一方面，ADC的抗PRLR抗体组分可以是包括含有本文表1中所列出的任一CDR或HCVR/LCVR氨基酸序列的抗PRLR抗体的任何抗PRLR抗体。另外，ADC的细胞毒性剂组分可以是任何细胞毒性剂，诸如DM1，或本文所述的任何其他细胞毒性剂。
本发明的ADC都能够抑制肿瘤生长和/或减少在具有PRLR+肿瘤动物中的肿瘤大小。例如，如在本文实施例8中所示，抗PRLR-DM1ADC被证明在具有PRLR+乳腺癌异种移植物的小鼠中降低肿瘤到检测不到的水平。因此，本发明包括抗PRLR抗体和包含这样的抗体的ADC，其中所述抗体或ADC，当施用于具有PRLR+肿瘤的动物时(例如，以大约每周一次的频率，和以约1至15mg/kg的剂量)，在施用后第52天或更早，抑制肿瘤生长和/或减少肿瘤的大小(例如，100％或更高的肿瘤生长抑制)。
I类细胞因子受体靶向
PRLR属于Ⅰ类细胞因子受体家族。如以上所阐明和在本文的工作实施例中所证明的，意外地发现，包含抗PRLR抗体的抗体-药物缀合物(ADC)可以有效地靶向和杀死表达低水平PRLR的细胞(见本文实施例7)。另外，它表明，针对其他类型Ⅰ类细胞因子受体(IL-4R和IL-6R)的ADC也能够有力地杀死表达比较低的水平的靶抗原的细胞系(见本文的实施例9)。该属性与针对其他细胞表面表达的蛋白质(如ErbB2)的ADC形成对照，在针对其他细胞表面表达的蛋白质(如ErbB2)的ADC的情况中，有效的细胞杀伤需要高靶表达。此外，还令人惊讶地发现，在肿瘤细胞(例如，T47D肿瘤细胞)上抗PRLR抗体的内化比抗Her2抗体实质上更快，并且该属性与细胞表面PRLR的相比于细胞表面Her2的更快的内化和的降解相关。
鉴于本文所述的结果，本发明人设想，靶向和杀死表达低水平的细胞表面抗原的细胞的能力可以是靶向I类细胞因子受体总体、特别是被迅速内化的I类细胞因子受体的ADC共享的共同的特性。因此，本发明包括用于靶向I类细胞因子受体(例如，快速地内化的I类细胞因子受体)的方法，和用于杀死表达I类细胞因子受体的细胞(例如表达低水平的I类细胞因子受体的细胞)的方法。
根据本发明的这个方面的方法包括使表达I类细胞因子受体的细胞接触ADC，所述ADC包含特异性结合I类细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。根据某些实施方案，待靶向的细胞表达低水平(如在本文别处所定义的表达)的I类细胞因子受体和/或迅速内化和降解(例如比参照细胞表面分子如Her2内化更快)的I类细胞因子受体。也包括在本发明内的是ADC，所述ADC包含缀合至细胞毒性剂、特异性结合I类细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。任何所述细胞毒性剂、连接子、和/或本文中别处描述的ADC相关的技术可以在本发明的这个方面的情况下使用。
如本文所使用的“I类细胞因子受体”(有时也被称为“I型细胞因子受体”)表示识别并应答具有四个α-螺旋束的细胞因子的、在细胞的表面上表达的跨膜受体。如下面所解释的，I类细胞因子受体可以是异二聚体或同型二聚体。如本文所用，术语“I类细胞因子受体”包括异二聚体和同型二聚体受体。
异二聚体I类细胞因子受体由细胞因子特异性链和“共同链”组成。因此，这样的异二聚体I类细胞因子受体可以基于用于信号转导的受体所使用的共同链的类型进行分类。异二聚体I类细胞因子受体的示例性类别包括：(i)含共同的γ链的异二聚体受体，例如IL-2R，IL-4R，IL-7R，IL-9R，IL-13R和IL-15R；(ⅱ)含共同的β链的的异二聚体受体，如GM-CSF受体，IL-3R和IL-5R；和(iii)含gp130的异二聚体受体如IL-6R，IL-11R，CNTF受体，白血病抑制因子(LIF)受体，制瘤素M(OSM)受体和IL-12受体。
同型二聚体I类细胞因子受体包括生长激素(GH)受体，促红细胞生成素(EPO)受体，G-CSF受体，瘦素受体，和PRLR。
在本发明的这个方面的某些实施方案中，ADC包含特异性结合异二聚体I类细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的该方面的其他实施方案，ADC包含特异性结合同型二聚体I类细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。
本发明包括用于杀死表达低水平的异二聚体I类细胞因子受体的细胞的方法。根据本发明的这个方面的方法包括使表达低水平的的异二聚体I类细胞因子受体的细胞与ADC接触，所述ADC包含特异性地结合异二聚体I类细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。
或者，本发明包括用于杀死表达低水平的同型二聚体I类细胞因子受体细胞的方法。根据本发明的这个方面的方法包括使表达低水平的同型二聚体I类细胞因子受体接触ADC，所述ADC包含特异性地结合同型二聚体I类细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。
表位作图及相关技术
本发明的抗体所结合的表位可以由3个或更多个(例如，3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多个)PRLR蛋白质的氨基酸的单一连续序列组成。可替代地，该表位可以由多个PRLR的非连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成。在一些实施方案中，表位是位于或靠近PRLR的催乳素结合结构域。在其他实施方案中，所述表位位于PRLR的催乳素结合结构域之外，例如在PRLR的表面上的位置，当抗体在该位置结合到这样的表位时，不干扰催乳素与PRLR的结合。
可使用本领域技术人员所熟知的各种技术来决定一个抗体是否会与多肽或蛋白质中的“一或多个氨基酸相互作用”。例示性技术包括，例如Harlow和Lane的Antibodies所述的惯用交叉-阻断分析(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.，NY)、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)及肽切割分析。此外，可以采用诸如表位切除、表位提取以及化学修饰抗原的方法(Tomer,2000,ProteinScience9:487-496)，另一种可用于鉴别与抗体相互作用之多肽中的氨基酸的方法为透过质谱检测氢/氘交换。在一般性术语中，氢/氘交换法涉及将感兴趣的蛋白质标记氘，然后透过将抗体结合至经氘标记的蛋白质。接下来，蛋白质/抗体复合体被转移至水中以容许氢-氘交换在除了受抗体保护之残基(其维持经氘标记)以外的所有残基发生。在抗体解离后，目标蛋白质被进行蛋白酶切割与质谱分析，从而揭开经氘标记的残基，其对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry267(2):252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本发明进一步包括抗PRLR抗体，所述抗PRLR抗体结合至与本文所述特定例示性抗体(例如包含本文表1所列出的氨基酸序列中的任一种的抗体)中的任一者相同的表位。同样地,本发明亦包括与本文所述特定例示性抗体(例如包含本文表1所列出的氨基酸序列中的任一种的抗体)中的任一者竞争结合至PRLR的抗PRLR抗体。
人们可容易地通过使用本领域已知的和本文示例的常规方法确定抗体是否会与参考抗PRLR抗体结合至相同的表位，或与参考抗PRLR抗体竞争结合至相同表位。例如，为确定一测试抗体是否会结合至与本发明参考抗PRLR抗体相同的表位，容许该参考抗体结合至PRLR蛋白。接着，评估测试抗体结合至PRLR分子的能力。若测试抗体能够在参考抗PRLR抗体饱合结合之后结合至PRLR，则可推论该测试抗体结合至与参考抗PRLR抗体不同的表位。另一方面，若测试抗体无法在参考抗PRLR抗体饱合结合后结合至PRLR分子，则该测试抗体可能结合至与本发明参考抗PRLR抗体所结合之表位相同的表位。接而可进行其他常规实验(例如肽突变与结合分析)以确认观察到的测试抗体没有结合是因为结合至与参考抗体相同的表位，或若没有观察到结合是因为其空间位阻(或另一现象)。这类实验系使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或本领域中可供使用的其他任何定量或定性抗体-结合分析来进行。依据本发明的某些实施方案，若例如在一个竞争性结合分析中测量一个过量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗体抑制另一个抗体达至少50％，但优选75％、90％或甚至99％,则两个抗体结合至相同(或重叠)表位(参见，例如Junghans et al.,CancerRes.1990:50:1495-1502)。或者，若基本上所有在抗原中会减少或消除一个抗体结合的氨基酸突变也会减少或消除另一个抗体结合，则两个抗体被视为是结合至相同表位。若减少或消除一抗体结合之仅有一部分氨基酸突变也会减少或消除另一个抗体结合，则两个抗体被视为具有”重叠的表位”。
为测定一个抗体是否与参考抗PRLR抗体竞争结合(交叉竞争结合)，以两个方面来进行上述结合方法学:在第一个方面，容许参考抗体在饱和条件下结合至PRLR蛋白，继而评估测试抗体对PRLR分子的结合。在第二个方面，容许测试抗体在饱和条件下结合至PRLR分子，继而评估参考抗体对PRLR分子的结合。若在两个方面中，仅有第一(饱和)抗体能够结合至PRLR分子，则推断测试抗体与参考抗体竞争结合至PRLR。如本领域技术人员所了解，与参考抗体竞争结合之抗体不必然会结合至与参考抗体相同的表位，但可能会在空间上通过结合重叠或相邻表位来阻断参考抗体的结合。
人抗体的制备
本发明的抗PRLR抗体可以是完全人类抗体。用于制造单克隆抗体(包括完全人类单克隆抗体)的方法为本领域中已知的。任何这些已知方法可用于本发明的情况中以制造特异结合至人类PRLR的人类抗体。
使用例如VELOCIMMUNETM技术或任何其他用于生成完全人类单克隆抗体的类似已知方法，首先分离出带有人类可变区以及小鼠恒定区的对PRLR具高亲和力的嵌合抗体。如同在下面实验节中，鉴定抗体的特征并且筛选所欲的特性，包括亲和力、配体阻断活性、选择性、表位等。如果需要的话，小鼠恒定区取代成所需的人类恒定区，例如野生型或经修饰的IgGl或IgG4，以生成本发明的完全人类抗PRLR抗体。尽管选定的恒定区可能会依据特定用途、可变区中的高亲和力抗原-结合以及靶特异性特性而改变。在某些情况下，完全的人抗PRLR抗体是直接从抗原阳性的B细胞分离。
生物等同物
本发明的抗PRLR抗体以及抗体片段包括带有由那些所述抗体变化而来，但仍保有结合人类PRLR能力的氨基酸序列的蛋白质。当与亲代序列相较之下，这些变异抗体以及抗体片段包含有一或多个氨基酸添加、缺失或置换，但仍展现出基本上与所述抗体等同的生物活性。同样地，当与所公开的序列相较之下，本发明的抗PRLR抗体编码DNA序列包括具有一或多个核苷酸添加、缺失或置换，但仍编码基本上与本发明的抗PRLR抗体或抗体片段生物等同的抗PRLR抗体或抗体片段的序列。上面详述这样的变体氨基酸以及DNA序列的实例。
举例而言，若两个抗原-结合蛋白或抗体是药学等同物或药学替换物，当它们以相同摩尔剂量在类似实验条件下施用时的吸收速率与程度未显示出明显差异(不论是单剂量或多剂量)，它们被视为生物等同的。若一些抗体在它们的吸收程度上相等但在它们的吸收速率上不等，它们将会被视为等同物或药学替换物但仍被视为生物等同，因为这样的在吸收速率上的差异是有目的并且在归类时被反映，对于在例如长期使用上达到有效身体药物浓度来说不是必要的，并且就所研究的特定药物产品来说被视为在医学上不重要的。
在一个实施方案中，若两个抗原-结合蛋白在临床上就其安全性、纯度以及效力而言并无有意义的差异，它们是生物等同的。
在一个实施方案中，若患者在参考产品与生物产品之间可以改变一或多次而没有预期增高不良反应的风险(包括与持续治疗而没有这样改变的情况下相比，在免疫原性上的临床显著变化，或减低的有效性)时，它们是生物等同的。
在一个实施方案中，若两个抗原-结合蛋白就使用条件来说均是通过共同作用机制而作用达致这样的机制已知的程度，它们是生物等同的。
生物等同性可以通过体内和体外方法证实。生物等同性测量法包括，例如(a)在人类或其他哺乳动物体内的体内测试，其中随着时间测量抗体或其代谢物在血液、血浆、血清或其他生物液中的浓度；(b)已使用人类体内生物可利用性数据校正并且可合理预测的体外测试；(C)在人类或其他哺乳动物体内的体内测试，其中随着时间测量抗体(或其标的)之适当急性药理学效用；以及(d)在已证实抗体的安全性、效力或生物可利用性或生物等同性的充分控制临床试验中。
本发明的抗PRLR抗体的生物等同变体可以通过例如，制造各种残基或序列置换，或缺失不是生物活性所必需的末端或内部残基或序列而构建。举例而言，对于生物活性来说不是必要的半胱氨酸残基可以被缺失或取代为其他会在复性之后防止形成不必要或不正确分子内双硫桥的氨基酸。在其他上下文中，生物等同抗体可包括抗PRLR抗体变体，其含有会修饰抗体之糖基化特性的氨基酸变化，例如消除或移除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应
本发明中，根据某些实施方案，提供了结合人PRLR但不结合来自其他物种PRLR的抗PRLR抗体。本发明还包括结合人PRLR和结合来自一种或多种非人类物种的PRLR的抗PRLR抗体。例如，本发明的抗PRLR抗体可结合人PRLR并视情况而定可以结合或不结合下述物种中的一种或多种的PRLR：小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，沙鼠，猪，猫，狗，兔子，山羊，绵羊，牛，马，骆驼，食蟹猴(cynomologous)，狨猴，猕猴或黑猩猩。根据本发明的某些示例性实施方案，提供了抗PRLR抗体，其特异性结合人类PRLR和食蟹猴(例如食蟹猴(Macaca fascicularis))PRLR。本发明的其它抗PRLR抗体结合人PRLR但不结合或只弱结合食蟹猴PRLR。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性、或多特异性(例如双特异性)。多特异性抗体可以是对一个标的多肽的不同表位具有特异性或者可能含有对超过一个标的多肽具有特异性的抗原-结合域。参见例如Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明的抗PRLR抗体可以链接至另一个功能性分子(例如另一个肽或蛋白质)或与该另一个功能性分子共表达。举例而言，抗体或其片段在功能上可以链接(例如，通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一个抗体或抗体片段，以产生带有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。举例而言，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一臂对于HLA-B*27或其片段具有特异性，而免疫球蛋白的另一臂对第二治疗标的具有特异性或缀合至一个治疗部分。
本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人PRLR，且免疫球蛋白的另一臂特异于第二抗原。PRLR结合臂可以包括在本文表1中所列出的HCVR/LCVR或CDR的氨基酸序列中的任一种。在某些实施方案中，PRLR结合臂结合人PRLR并阻断结合PRLR的催乳素。在其他实施方案中，PRLR结合臂结合人PRLR但不会阻断催乳素结合PRLR。
可以使用于本发明上下文的例示性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域，其中第一与第二Ig CH3域因为至少一个氨基酸而彼此不同，以及其中与缺少该氨基酸差异的双特异性抗体相较之下，至少一个氨基酸差异会减低该双特异性抗体结合至蛋白质A。在一个实施方案中，该第一Ig CH3域结合蛋白质A而该第二IgCH3域含有一个会减低或消除蛋白质A结合的突变，诸如H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号为H435R)。该第二CH3可进一步包含有Y96F修饰(按照IMGT；按照EU为Y436F)。可以在第二CH3中发现到的更多修饰包括:在IgGl抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT；按照EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N以及V82I(按照IMGT；按照EU为N384S、K392N以及V422I)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT；按照EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述双特异性抗体形式的变化在本发明范围中是可预想的。
可以使用于本发明上下文的其他例示性双特异性抗体形式包括，但不限于以基于scFv-的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双重可变域(DVD)-Ig、四价体瘤、结进孔(knobs-into-holes)、共同轻链(例如具有结进孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody,IgGl/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG,以及Mab2双特异性形式(参见例如Klein et al.2012,mAbs 4:6,1-11，及其中所引用的参考资料，有关先前形式的综述)。双特异性抗体也可以使用肽/核酸缀合来构建，例如其中具有直角化学反应性的非天然氨基酸用来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，其接而自我组装成具有限定组成、化合价与几何学的多聚合复合体(参见例如Kazane et al.,J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
治疗性制剂和施用
本发明提供包含有本发明的抗PRLR抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物可与适当载体、赋形剂以及其他提供改善输送、递送、耐受性等的药剂一起配制。可以在对于药学化学家来说为熟悉的处方书中找到大量适当的剂型:Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些剂型包括，例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(诸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA),DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油与油包水乳剂、乳化卡波蜡(具有各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶以及含有卡波蜡的半固体混合物。亦参见Powell et al."Compendium of excipients for parenteralformulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
施用给患者的抗体剂量可以视患者的年龄与身材、标的疾病、病况、给药途径以及类似者来改变。较佳剂量通常是依据体重或体表面积来计算。在成人患者中，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更佳约0.02至约7、约0.03至约5、或约0.05至3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明抗体是有益的。可以视病况的严重性调整治疗频率以及持续时间。用于施用抗PRLR抗体的有效剂量与时间表可按经验来决定；例如，可透过定期评估来监测患者进展，并据此调整剂量。此外,剂量的物种间标度可使用本领域中已知的方法来进行(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
已知有各种不同的递送系统并且可用于施用本发明的药物组合物，例如封装在脂质体内、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见，例如Wuet al.,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括，但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜上以及口服途径。组合物可以通过任何习知途径来施用，例如通过输注或快速浓注、通过透过上皮或黏膜内衬(例如口腔黏膜、直肠以及小肠黏膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。给药可以是全身性或局部的。
本发明的药物组合物可以使用标准注射针与注射器来皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔型递送装置很容易应用于递送本发明的药物组合物。这样的一种笔型递送装置可以是重复使用或抛弃式。可重复使用的笔型递送装置通常使用含有药物组合物的可换式卡匣。一旦卡匣内的所有药物组合物被施用且卡匣空了，空的卡匣可易于丢弃并且置换成含有药物组合物的新卡匣。那么就可以重复使用笔型递送装置。就抛弃式笔型递送装置来说，没有可换式卡匣。更确切地来说，抛弃式笔型递送装置在装置的贮器内预先填充药物组合物供选购。一旦贮器没有药物组合物，整个装置就被丢弃。
许多可重复使用的笔型以及自动注射递送装置在皮下递送本发明之药物组合物方面具实用性。实例包括，但不限定于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)，ISETRONICTMpen(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland),HUMALOG MIX75/25TMpen,HUMALOGTMpen,HUMALIN 70/30TMpen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN),NOVOPENTMI,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark),NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark),BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ),OPTIPENTM,OPTIPEN PROTM,OPTIPEN STARLETTM,和OPTICLIKTM(sanof1-aventis，Frankfurt,Germany)，仅举几个为例。在皮下投递本发明之药物组合物方面具实用性的抛弃式笔型递送装置的实例包括,但不限于SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis),FLEXPENTM(NovoNordisk),和KWIKPENTM(Eli Lilly),SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA),PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany),EPIPEN(Dey,L.P.),和HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅举几个为例。
在某些情况下，药物组合物以控制释放系统的方式被投递。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(编),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又另一个实施方案中，控制释放系统被置放在组合物标的邻近处，因此仅需要全身性剂量的一部分(参见，例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138中)。其他控制释放系统在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中被讨论。
可注射制品可包括用于静脉内、皮下、皮内及肌肉内注射、点滴输注等的剂型。这样的可注射制品可依照公知方法制备。例如，可注射制品可例如，通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于习知用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。有关用于注射的水性介质，例如生理盐水、含有葡萄糖与其他助剂的等渗溶液等，其可与适当助溶剂(诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。有关油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可与助溶剂(诸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等)组合使用。由此制备的注射剂较佳地被填充于适当安瓿中。
有利地，上述供经口或肠胃外使用的药物组合物被制备为呈适于活性成分剂量之单位剂量的剂型。这样的呈单位剂量的剂型包括，例如锭剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。在单位剂量中，所含前述抗体量通常每剂型约5至约500mg；尤其是在注射形式中，前述抗体就其他剂型而言优选含有约5至约100mg以及约10至约250mg。
抗体的治疗用途
本发明包括包括向需要其的受试者施用治疗性组合物的方法，所述治疗性组合物包含抗PRLR抗体或包含抗PRLR抗体的抗体-药物缀合物(例如，抗PRLR抗体或包括本文表1中所列出的HCVR/LCVR或CDR序列中的任一种的ADC)。治疗组合物可以包括抗PRLR抗体、其抗原结合片段，或本文所公开的ADC中的任一种，和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的抗体和ADC可特别用于治疗、预防和/或改善下述任意疾病或病症：即，与PRLR表达活性相关联或通过PRLR表达活性介导的疾病或病症，或通过下述方式可治疗的疾病或病症：阻断PRLR和催乳素之间的相互作用、或以其他方式抑制PRLR活性和/或信号转导、和/或促进受体的内化和/或降低细胞表面受体数量。例如，本发明的抗体和ADC可用于治疗表达PRLR和/或应答促乳素介导的信号传导的肿瘤，例如，乳腺肿瘤。本发明的抗体和抗原结合片段也可以用于治疗在下述部位出现的原发性和/或转移性肿瘤：脑和脑膜，口咽，肺和支气管树，胃肠道，男性和女性生殖道，肌肉，骨骼而产生，皮肤和附件，结缔组织，脾脏，免疫系统，血液形成细胞和骨髓，肝和泌尿道，和特殊感觉器官如眼。在某些实施方案中，本发明的抗体和ADC用于治疗下列癌症中的一种或多种：肾细胞癌，胰腺癌，头颈部癌，前列腺癌，恶性神经胶质瘤，骨肉瘤，结肠直肠癌，胃癌(例如，具有MET扩增的胃癌)，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，卵巢癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，滑膜肉瘤，甲状腺癌，乳腺癌，或黑素瘤。
本发明的抗PRLR抗体也可用于治疗或预防选自由下述所构成的组的一种或多种疾病或病症：子宫内膜异位症，子宫腺肌症，非激素女性生育避孕，良性乳房疾病和乳腺痛，泌乳抑制，良性前列腺增生，子宫肌瘤，高-和正常生乳素血症脱发(hyper-andnormoprolactinemic hair loss)，和作为激素治疗的部分来抑制乳腺上皮细胞增殖。
在本文所述治疗方法的情况中，抗PRLR抗体可以给药作为单一疗法(即，作为唯一的治疗剂)施用或与一种或多种附加的治疗剂(其实例在本文别处描述)组合施用。
本发明包括用于识别可用本发明的抗体或ADC治疗的患者方法，其通过测定患者的一个或多个组织(诸如肿瘤组织)中的高水平PRLR表达来实现。在相关实施方案中，本发明包括用于治疗以PRLR的高水平表达为特征的癌症的方法。例如，本发明包括下述治疗方法：所述治疗方法包括对患有肿瘤的受试者施用本发明的抗PRLR抗体或其ADC(例如，本文别处所述的任何抗PRLR ADC)，其中该肿瘤被识别为表达高水平的PRLR。在某些实施方案中，通过活检样品的免疫组织化学或其他成像技术诸如，例如，免疫PET成像等，而将肿瘤被识别为表达高水平的PRLR。
组合疗法和制剂
本发明包括组合物和治疗性制剂和治疗方法，所述组合物和治疗性制剂包含与一种或多种其它的治疗活性成分组合的本文描述的任一抗PRLR抗体，所述治疗方法包括对需要其的受试者施用这样的组合。
本发明的抗PRLR抗体可以与一种或多种附加的治疗活性组分共配制和/或组合施用，所述附加的治疗活性组分选自由下述所构成的组：EGFR拮抗剂(例如，抗-EGFR抗体[例如，西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼或厄洛替尼])，另一个EGFR家族成员如Her2/ErbB2,ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗ErbB2[例如曲妥珠单抗或T-DM1]，抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)，EGFRvIII的拮抗剂(例如，特异性结合EGFRvIII的抗体)，cMET拮抗剂(例如，抗cMET的抗体)，IGF1R拮抗剂(例如，抗IGF1R抗体)，B-raf抑制剂(例如，威罗菲尼，索拉非尼，GDC-0879，PLX-4720)，PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)，PDGFR-β抑制剂(例如，抗PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂诸如，例如，甲磺酸伊马替尼或苹果酸舒尼替尼)，PDGF配体抑制剂(例如，抗PDGF-A，-B，-C，或-D的抗体，适体，siRNA等)，VEGF拮抗剂(例如，VEGF-Trap如阿柏西普(aflibercept)，见，例如，US 7,087,411(在此也称为“VEGF-抑制融合蛋白”)，抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)，VEGF受体小分子抑制剂(如，舒尼替尼，索拉非尼或帕唑帕尼))，DLL4拮抗剂(例如，US 2009/0142354中公开的抗DLL4的抗体如REGN421)，Ang2的拮抗剂(例如，US 2011/0027286中公开的抗Ang2的抗体如H1H685P)，FOLH1拮抗剂(例如，抗FOLH1抗体)，STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如，抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)，TMPRSS2拮抗剂(例如，抗TMPRSS2抗体)，MSLN拮抗剂(例如，抗MSLN抗体)，CA9拮抗剂(如抗CA9抗体)，尿路上皮特异蛋白(uroplakin)拮抗剂(例如，抗尿路上皮特异蛋白[例如，抗UPK3A]抗体)，MUC16拮抗剂(例如，抗MUC16抗体)，一个Tn的抗原拮抗剂(例如，抗Tn抗体)，CLEC12A拮抗剂(例如，抗CLEC12A抗体)，TNFRSF17拮抗剂(例如，抗TNFRSF17抗体)，LGR5拮抗剂(例如，抗LGR5抗体)，单价的CD20拮抗剂(如单价抗CD20抗体，如利妥昔单抗)等。可组合本发明的抗体有益施用的其它药剂包括，例如，他莫昔芬，芳香酶抑制剂，和细胞因子抑制剂，包括小分子的细胞因子抑制剂和结合细胞因子的抗体，所述细胞因子如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-13，IL-17，IL-18，或它们各自的受体。
本发明包括组合物和治疗性制剂，所述组合物和治疗性制剂包含与一种或多种化学治疗剂组合的本文描述的任一抗PRLR抗体。化学治疗剂的实例包括烷化剂，如塞替派和环磷酰胺(CytoxanTM)；烷基磺酸盐如白消安，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯佐替派，卡波醌，美妥替派和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素，氨茴霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，加利车霉素，carabicin，洋红霉素，嗜癌霉素，色霉素，更生霉素，柔红霉素，地托比星，6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表阿霉素，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素,三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星，链黑菌素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮，表硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗肾上腺如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；蒽双咪腙；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSKTM；雷佐生；西索菲兰；螺环锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“阿糖胞苷”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(泰素TM，施贵宝公司肿瘤，普林斯顿，新泽西州)和多西他赛(泰索帝TM；安万特安东尼，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林；替尼泊苷；柔红霉素；氨基；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟(DMFO)；维甲酸；esperamicins；卡培他滨；和药学上可接受的盐，酸或上述任何的衍生物。也包括在此定义中的是抗激素剂，其作用是调节或抑制肿瘤上的激素作用，如抗雄激素类，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，雷洛西芬(keoxifene)，LY 117018，奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞林，和戈舍瑞林；和药学上可接受的盐，酸或上述任何的衍生物。
本发明的抗PRLR抗体也可与下述组合施用和/或共配制，抗病毒剂，抗生素，止痛剂，皮质类固醇，类固醇，氧，抗氧化剂，COX抑制剂，cardioprotectants，金属螯合剂，IFN-γ，和/或NSAIDs。
附加治疗活性成分(S)，例如，上面列出的任何试剂或其衍生物，可以在本发明的抗PRLR抗体刚刚施用之前、与其同时、或在其施用之后不久施用；(出于本公开的目的，这样的施用方案被认为是抗PRLR抗体“组合”施用额外的治疗活性成分)。本发明包括药物组合物，其中本发明的抗PRLR抗体与一种或多种如本文中别处所述的其他的治疗活性组分共配制。
施用方案
依据本发明的某些实施方案，多剂量的抗PRLR抗体(或包含抗PRLR抗体和本文提及的任一种其他的治疗活性剂的组合的药物组合物)可在一段限定时间里被施用给个体。依据本发明此方面的方法包含顺序将多剂量的本发明的抗PRLR抗体施用给受试者。如本文所用，“顺序施用”表示各剂量的抗PRLR抗体在不同时间点被施用给个体，例如在由预定间隔(例如数小时、数天、数周或数月)所分开的不同天。本发明包括含有将单一起始剂量之抗PRLR抗体，接而为一或多个第二剂量的抗PRLR抗体，以及视情况一或多个第三剂量的抗PRLR抗体顺序施用给患者的方法。
术语“起始剂量”、“第二剂量”及“第三剂量”意指施用本发明的抗PRLR抗体的时间顺序。因此“起始剂量是在治疗方案开始时被施用的剂量(亦意指为“基线剂量”)；“第二剂量”为在起始剂量之后被施用的剂量；而“第三剂量”为在第二剂量之后被施用的剂量。起始剂量、第二剂量与第三剂量可全都含有等量之抗PRLR抗体，但通常会在施用频率方面有所不同。但是，在某些实施方案中，起始剂量、第二剂量及/或第三剂量中所含有之抗PRLR抗体数量将会在治疗期间彼此改变(例如调高或调低，若需要的话)。在某些实施方案中，两个或更多个(例如2、3、4或5)剂量在治疗方案开始被施用作为“加载剂量”，接着以较不频繁的方式施用后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的某些示例性实施方案中，在紧接先前剂量后的1至26(例如，1,11/2,2,21/2,3,31/2,4,41/2,5,51/2,6,61/2,7,71/2,8,81/2,9,91/2,10,101/2,11,111/2,12,121/2,13,131/2,14,141/2,15,151/2,16,161/2,17,171/2,18,181/2,19,191/2,20,201/2,21,211/2,22,221/2,23,231/2,24,241/2,25,251/2,26,261/2,或更多)周施用各第二和/或第三剂量。如本文中所使用的，短语“紧接先前剂量”是指在多次施用的顺序中，抗PRLR抗体剂量在顺序上于下一个剂量施用之前没有任何插入的剂量被施用给患者。
依据本发明此方面的方法可含有将任一数目的第二剂量及/或第三剂量抗PRLR抗体施用给患者。例如，在某些实施方案中，仅有单一第二剂量被施用给患者。在其他实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量被施用给患者。同样地，在某些实施方案中，仅有单一第三剂量被施用给患者。在其他实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量被施用给患者。施用方案可无限期地在特定受试者的生命期进行，或直到这种治疗不再是治疗需要或有利的。
在涉及多个第二剂量的实施方案中，各第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率被施用。例如，各第二剂量可在紧接先前剂量之后1至2周或1至2个月被施用给患者。同样地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，各第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率被施用。例如，各第三剂量可在紧接先前剂量之后2至12周被施用给患者。在某些实施方案中，第二剂量及/或第三剂量施用给患者的频率可能随着治疗方案过程而改变。施用频率也可在治疗过程期间由临床医师依据个别患者的需要遵循临床检验来予以调整。
本发明包括下述施用方案：其中2至6个负荷剂量以第一频率(例如，每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次等)施用于患者，接着在较不频繁的基础上，施用两个或更多的维持剂量给患者。例如，根据本发明的这一方面，如果负荷剂量以每月一次的频率施用，则维持剂量可以每6周一次、每两个月一次、每三个月一次等来施用给患者。
抗体的诊断用途
本发明之抗PRLR抗体还可用于检测和/或测量试样中的PRLR或表达PRLR的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗PRLR抗体或其片段可用于诊断特征为PRLR异常表达(例如过度表达、表达不足、缺乏表达等)的病症或疾病。典型的PRLR诊断检测法可包括例如用一种本发明之抗PRLR抗体与获自患者的试样接触，其中该抗PRLR抗体以一种可检测的标记或报告分子标记。或者，在诊断应用中也可以将一种未标记的抗PRLR抗体与本身具有可检测标记的第二种抗体结合使用。该可检测标记或报告分子可以是一种放射性同位素，如3H,14C,32P,35S,or125I；-荧光或化学发光基团，或罗丹明；或一种酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或荧光素酶。可用于检测或测量试样中PRLR的特别的典型测定法包括酶联免疫吸附检测法(ELISA)、放射免疫检测法(RIA)，免疫-PET(例如,89Zr,64Cu,等)，以及荧光激活细胞分类术(FACS)。
可依照本发明用于PRLR诊断分析的试样，包括获自患者的在正常或病理条件下含有可检测量PRLR蛋白或其片段的任何组织或体液试样。一般而言，先从一位健康患者(例如未患与PRLR异常水平或活性相关的疾病或病症的患者)获得特定的试样并测量其PRLR表达水平，以建立PRLR水平的基线或标准。然后，可将这一PRLR基线水平与从获自疑为患有PRLR相关性疾病或病症的人员的试样测得的PRLR表达水平进行比较。
实施例
提出下列实施例以将如何制造与使用本发明方法和组合物的完整公开内容以及说明提供给本领域技术人员，且并没有试图限制发明人认为是他们的发明的范围。已尽力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但可能产生某些实验误差与偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，且压力为大气压或接近大气压。
实施例1.抗PRLR抗体的产生
通过使用含有人类PRLR的可溶二聚体胞外结构域的免疫原免疫小鼠(即，含有编码DNA的人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的工程化的小鼠)获得抗PRLR抗体。抗体的免疫应答是由PRLR特异性的免疫测定监测。当达到所期望的免疫应答，脾细胞被收集并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留它们的活性和形成杂交瘤细胞系。对杂交瘤细胞系进行筛选和选择，以确定产生PRLR特异性抗体的细胞系。使用这种技术获得几种抗PRLR嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。此外，如US2007/0280945A1中所述，在不融合至骨髓瘤细胞的情况下，直接从抗原-阳性B细胞分离若干完全的人抗PRLR抗体。
按照此实施例的方法产生的示例性抗PRLR抗体的某些生物学特性将在下面阐述的实施例中详细描述。
实施例2重和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1列出了本发明的选择的抗PRLR抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符显示在表2中。
表1：氨基酸序列标识符
表2：核酸序列标识符
本文中的抗体通常按照如下命名法提及：Fc字首(例如“H1H”、“H1M”、“H2M”)，随后是数字识别符(例如，“6762”，“6953”，“6958”等)，随后是字尾“P”或“N”。因此，按照此命名法，抗体在本文中可称为例如“H1H6762P，”“H1M6953N”，“H2M6958N”等。本文所用抗体名称上的字首H1H、H1M和H2M和H3M表示该抗体特定的Fc区同种型。例如，“H1H”抗体具有人IgG1Fc，“H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc，且“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc(所有可变区是如通过抗体名称中的第一'H'所表示的全人的)。如本领域中的普通技术人员所理解的，具有特定的Fc同种型的抗体可以被转换成具有不同的Fc同种型的抗体(例如，具有小鼠IgG1Fc的抗体可以被转换为具有人IgG4的抗体等)，但在任何情况下，由于表1和2中所示的数值标识符表示的可变结构域(包括CDR)将保持不变，且不管Fc结构域的性质如何，结合特性预计是相同或实质上类似的。
在以下实施例中所使用的对照构建体
对照构建体被包括在以下实验中用于比较目的：对照I：具有“he.06.642-2”的相应的结构域的氨基酸序列的具有重链和轻链可变区的人抗PRLR抗体，如WO2008/02295A2中所列出的；和对照II：具有“4D5v8”的相应结构域的氨基酸序列的具有重链和轻链可变区的人抗ErbB2抗体，如在Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289中所列出的。
实施例3.表面等离振子共振导出的人类单克隆抗PRLR抗体的结合亲和力与动力学常数
人类单克隆抗PRLR抗体的结合亲和力和动力学常数通过在25℃和37℃的表面等离子共振测定。表示为人类IgG1Fc(即“H1H”名称)的抗体，被捕获到抗人Fc传感器表面(单抗捕获形式(format))，且可溶性单体(hPRLR.mmh；SEQ ID NO：401，或食蟹猴(mf)PRLR.mmh；SEQ ID NO：403)或二聚体(hPRLR.mFc；SEQ ID NO：402)PRLR蛋白被注射在传感器的表面上。在T200Biacore仪器上进行测量。动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数通过使用Scrubber 2.0曲线拟合软件处理和拟合数据至1:1结合模型来确定。结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)从动力学速率常数计算为如下：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。结果总结在表3和4中。
表3：在25℃人Fc单克隆抗体的Biacore结合亲和力
NB＝在使用条件下没有观察到结合
表4：在37℃人Fc单克隆抗体的Biacore结合亲和力
NB＝在使用条件下没有观察到结合
如表3和4所示，本发明的几种抗体对人和猴PRLR蛋白显示亚纳摩尔亲和力，且显示出比比较者抗PRLR抗体(对照I)更高的亲和力。例如，在37℃，本发明的许多抗PRLR抗体结合到单体人类PRLR，其中KD值小于4nM且T1/2时间(times)大于5分钟；和本发明的许多抗PRLR抗体结合到二聚体人PRLR，其中KD值小于250pM且T1/2时间(times)大于60分钟。这些结合特性实质上比在相同的实验条件下用对照I抗体所观察到的更好。
实施例4A.抗PRLR抗体结合内源性和过表达PRLR的细胞系
测定抗PRLR抗体选择性结合表达PRLR的细胞系的能力。具有HA标签的人、猴食蟹猴和小鼠PRLR构建体通过脂质体2000介导的转染方法稳定引入入HEK293细胞。转染子(HEK293/hPRLR，HEK293/mfPRLR和HEK293/mPRLR)被选定在添加G418的完全生长培养基中培养至少2周。
在293/hPRLR细胞上的PRLR的细胞表面表达通过FACS分析评估。简言之，将1×105个细胞用10微克/毫升对照抗体I或同种型对照在冰上在抗体稀释缓冲液中孵育30分钟。随后用抗体稀释缓冲液洗涤两次，将细胞用10微克/毫升的PE缀合的抗-人二抗(secondaryantibodies)在冰上孵育30分钟。进行两次额外的洗涤后，样品在流式细胞仪上运行，并在ForeCytTM(IntelliCyt，Albuquerque,NM)中进行分析。平均荧光强度(MFI)表示为超出同种型对照水平(背景)的倍数变化。FACS结合确认对照I选择性地结合到表达293/hPRLR的细胞，其中MFI是在背景(同种型CTRL)之上的30倍，且在亲本细胞上是小于2倍的结合。
在T47D、MCF7和MCF7/hPRLR过表达的细胞株上，也定量确定了PRLR的细胞表面拷贝数。简言之，将1x105个细胞用100nM的抗PRLR抗体H1H6953N-Alexa647在冰上在抗体稀释缓冲液中孵育30分钟。用抗体稀释缓冲液洗涤两次后，将样品在流式细胞仪(IntelliCyt，Albuquerque,NM)上运行，且平均荧光强度(MFI)在ForeCytTM(IntelliCyt，Albuquerque,NM)中测定。然后将用于每个细胞系的MFI经由Quantum Alexa Fluor647MESF试剂盒，根据制造商的说明书(Bangs Laboratories,Inc,Fishers,IN)而转换为等量可溶荧光(MESF)的Alexa647分子。每H1H6953N-A647蛋白的荧光团的平均数目(F/P比)经由Simply Cellular anti-Human IgG试剂盒根据制造说明书(Bangs Laboratories,Inc,Fishers,IN)而测定。将MESF值除以F/P比率以确定在每个细胞系上的PRLR细胞表面的拷贝数或H1H6953N抗原结合能力。使用这种方法，确定在各种细胞系上的PRLR的近似的细胞表面的拷贝数为如下：T47D＝27,000；MCF7＝3000；和MCF7/hPRLR＝190,000。
接着，通过FACS测试本发明的抗PRLR抗体对工程化的过表达PRLR HEK293细胞系，以及对非表达的HEK293细胞和天然表达PRLR的细胞系(T47D)的选择亲和性。结果示于表5中。
表5：抗PRLR抗体的FACS细胞表面结合
*表示对HEK293/hPRLR，HEK293/mfPRLR和T47D特异性结合且对HEK293亲代细胞小于2倍结合的抗体。
如表5中所示，大多数抗人PRLR抗体以>超出背景水平的25倍特异性结合到HEK293/PRLR细胞，对亲代细胞具有可忽略不计的结合。结合人PRLR的抗体同样显示结合到在HEK293/mfPRLR细胞上的猴子(食蟹猴)的PRLR。该被鉴定为HEK293/hPRLR细胞的强的结合物的抗体同样显示出是天然表达PRLR的T47D细胞的强大的结合物。对啮齿类PRLR的交叉反应未被观察到。
总之，本发明的抗体显示对工程化的细胞系上的人和猴PRLR以及内源表达的PRLR的强结合。
实施例4B.抗PRLR抗体通过体外表达PRLR的细胞而内化
在本实施例中，评估通过表达PRLR的细胞(T47D)进行的抗PRLR抗体的内化。简言之，将20,000个T47D细胞接种在胶原包被的96孔板中。第二天，将细胞用抗人PRLR抗体(10微克/毫升)在冰上孵育30分钟，然后进行两次PBS洗涤。然后将细胞用alexa488缀合的抗hFc Fab的二抗在冰上孵育30分钟，接着进行两次附加的PBS洗涤。使抗体在37℃下在内部缓冲液(PBS+2％FBS)中内化1小时或维持在4℃。将细胞固定在4％的甲醛中，细胞核用DRAQ5染色(细胞信号)，且在ImageXpress micro XL(分子装置)上获得图像。通过哥伦布图像分析软件(PerkinElmer)确定全细胞alexa488在37℃的强度(结合)和在37℃在细胞内小泡中的alexa488强度(内化)。强度被表达为最强内化抗体H1H6975N的百分比，并总结于表6中。
表6
除H1H6959N2外，所有测试抗体结合T47D且近100％的所有结合的mAbs在1小时内内化。大多数的抗体的总内化抗体强度比抗人PRLR对照抗体(对照Ⅰ)更大。
实施例5.抗PRLR抗体抑制在表达人PRLR的细胞中的PRL介导的受体活化
抗PRLR抗体阻断催乳素(PRL)介导的受体活化的能力在基于荧光素酶报告测定法中进行了检测。内分泌激素的PRL结合其同源受体PRLR的胞外域，触发快速同源二聚化和活化几个下游信号级联。
在这个例子中，工程化的细胞系被用于测定抗PRLR抗体阻断PRLR受体的配体活化的能力。简单地说，通过连续几轮2000介导转染(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)而生成具有人PRLR表达组件和STAT5依赖的荧光素酶的稳定掺入的HEK293/hPRLR/STAT5-Luc细胞系。在500微克/毫升G418(hPRLR)和100微克/毫升潮霉素B(STAT5-Luc)的存在下进行至少两周的细胞选择。STAT5-Luc测定法采用在PDL包被的96孔板上的完全生长培养基中接种的、在37℃，5％CO2生长过夜的2x105个HEK293/hPRLR/STAT5-Luc细胞。为了产生抗体抑制曲线，在记录信号之前，将细胞用连续稀释的抗人PRLR抗体(100nM至24pM)在5nM的恒定的PRL的存在下进行孵育(在37℃下，6小时)。通过加入连续稀释的PRL(100nM至24pM)至细胞和记录在抗体不存在时的6小时(37℃)孵育后的信号而生成PRL剂量响应曲线。还评估了抗体在不存在配体时的活化PRLR的能力。
用ONE-GloTM试剂(Promega,Madison,WI)测量荧光素酶的活性。相对光单位(RLUs)在Victor光度计(Perkin Elmer,Shelton,CT)上进行测量。EC50/IC50值使用GraphPadPrism相对于8点响应曲线的四参数逻辑方程来确定。针对最高抗体剂量报道了阻断百分比和活化百分比。结果示于表7中。
表7：通过抗PRLR抗体的PRL介导的信号的IC50和阻断百分比
NB：没有阻断；ND：由于不完全阻断而未测定
如表7所总结的，本发明的大多数抗体抑制STAT5报告基因(reporter)的活化，其中IC50值范围为从22pM至8nM。所有抑制性抗体阻断活化至基线水平(100％的阻断)。此外，在该测定中测试的抗体在没有PRL配体存在的情况下不活化STAT5。
总之，本实施例的数据显示，大多数的本发明的抗PRLR抗体阻断PRL介导的受体活化。此外，大多数的抗体相比于抗PRLR对照I抗体更有效地抑制受体活化。例如，本发明的几个抗PRLR抗体以具有小于约1.3nM的IC50值阻断催乳素介导的信号。另一方面，本发明的某些抗PRLR抗体，尽管能够结合PRLR，但未显示出催乳素阻断活性。这种非阻断性抗PRLR抗体可应用于各种治疗情况中，在这些治疗情况中，靶向PRLR是期望的，而不干扰正常催乳素介导的信号。
实施例6.抗PRLR抗体药物缀合物的制备与表征
使用类似于在美国专利号5,208,020和美国专利申请公开号2010/0129314所述的方法，将所选抗PRLR抗体通过SMCC连接子缀合于类美登素DM1。所述缀合物通过尺寸排阻层析和无菌过滤而纯化。除非另有说明，所有的起始原料和溶剂是商业购买的且使用时未经纯化。
蛋白质和连接子/有效载荷浓度通过紫外光谱分析和MALDI-TOF质谱测定。尺寸排阻HPLC确定所用的所有的所用缀合物均是>95％的单体(monomeric)，且RP-HPLC确定有<0.5％未结合的连接子的有效载荷。基于蛋白质，产率报道于表8和9中。通过UV，针对根据Hamblett等,2004,Clinical Cancer Research 10(20):7063-7070的有效载荷载荷值，以及通过天然的与缀合的的质量差，而对所有的缀合的抗体进行分析。
表8：抗PRLR未缀合抗体的蛋白质浓度
表9：抗PRLR-SMCC-DM1缀合物的抗体连接子/有效载荷浓度
ND：未测定
本实施例说明了本发明的抗PRLR抗体与DM1通过SMCC连接子进行缀合。对于本实施例的缀合抗体，有效载荷：抗体的摩尔比被计算为约2.3至约3.8。本发明的抗体的百分比产率为从约50％至70％。
实施例7.抗PRLR抗体-药物缀合物有效地杀死具有低到中度PRLR表达水平的细胞以及具有高PRLR表达水平的细胞
为了确定相比类似的抗ErbB2的ADC的本发明的抗PRLR ADC的相对细胞杀伤效力，细胞杀伤试验在表达PRLR、ErbB2或这两种受体的组合中的任一种的多个细胞系上运行。
生成包括HEK293、PC3、MCF7和NCI-N87的PRLR过度表达细胞，以评估抗PRLR缀合的抗体降低细胞生存力的能力。为了比较的目的，具有过表达ErbB2的PC3和T47D细胞也被生成，以及过表达hPRLR和hErbB2两者的MCF7细胞系也被生成。简言之，2000介导的转染方法被利用来产生表达人PRLR(HEK293/hPRLR)或人ErbB2(HEK293/hErbB2)的HEK293细胞。使用Lipofectamine LTX with Plus Reagent来产生表达人PRLR(PC3/hPRLR)或人的ErbB2(PC3/hErbB2)PC3细胞。慢病毒介导的转导用于产生表达人PRLR(MCF7/hPRLR)的MCF7细胞、表达人PRLR(NCI-N87/hPRLR)的NCI-N87细胞，过表达人ErbB2(T47D/hErbB2)的T47D细胞和表达人类PRLR和人ErbB2(MCF7/hPRLR/hErbB2)的MCF7细胞。被选定的行为，在添加适当选择试剂的完全生长培养中对所有的细胞系进行至少两周的选择。利用抗PRLR抗体对照I，经由FACS，针对PRLR表达，富集稳定表达的种群。
分别利用对照I抗PRLR抗体或对照II抗HER2抗体，经由FACS分析PRLR和ErbB2的细胞表面表达。此外，在T47D#11细胞系(针对更有进攻性的体内肿瘤生长所选择的T47D系的变体)上的内源性PRLR细胞表面表达也被测定。将大约1x106个细胞用10微克/毫升抗PRLR对照抗体(对照I)、抗ErbB2对照抗体(对照II)或同种型对照在抗体稀释缓冲液中在冰上孵育30分钟。用抗体稀释缓冲液进行两次洗涤后，将细胞用10微克/毫升的PE缀合的抗-人二抗在冰上孵育30分钟。进行另外的两次洗涤后，将样品在Accuri C6(BD)细胞计数器上运行并用FlowJo软件(Tree Star,Inc.,Ashl和,OR)进行分析。相对表达水平的结果示于表10。
表10：人PRLR细胞表面表达(工程化及内源性细胞系)
一般地，外源PRLR表面表达超过背景6倍至55倍，其中大多数工程化的细胞表现出超过背景的12倍至18倍的PRLR表达。内源性PRLR表达在MCF7细胞中超过背景3倍，但在亲代HEK293、PC3和NCI-N87系中没有被检测到。内源性PRLR表达在T47D细胞系中超过背景12倍且在T47D#11变体的细胞系中超过背景10倍。在所有表达PRLR的细胞系中检测到ErbB2表达，范围为超过背景18倍至1400倍。
接下来，使用体外基于细胞的测定法，测定抗PRLR-DM1抗体-药物缀合物(即，抗PRLR抗体通过不可切割的连接子[SMCC]缀合至DM1)的减少细胞活力的能力。在完全生长培养基中，将细胞以1500到10000个细胞每孔接种在PDL包被的96孔板中，并使其生长过夜。针对细胞活力的曲线，将ADC或游离DM1(如甲基二硫化物衍生物DM1-SME)以终浓度范围为从500nM至5pM加入到细胞，并孵育3天。将293、PC3和T47D细胞用CCK 8(Dojindo,Rockville,MD)孵育最后的1-3小时，并在Flexstation3(分子器件，桑尼维尔，加州)上测定在450nm(OD450)的吸光度。将MCF7细胞用Hoechst 33342核染色剂处理，同时用4％的甲醛进行固定。在ImageXpress micro XL(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上获得图像，并通过哥伦布图像分析软件(Perkin Elmer,Shelton,CT)测定核计数。将来自毛地黄皂苷(40nm)处理过的细胞的背景OD450值(PC3，293，和T47D)或核计数(MCF7)从所有孔中减去，且活力表示为未处理的对照的百分比。IC50值从相对于10多点响应曲线(GraphPad Prism)的四参数逻辑方程确定。IC50值和细胞杀伤百分比示于表11和12。
表11：细胞杀死抗PRLR-DM1抗体-药物缀合物的效力(Potency)
IC50值为nM；ND：未测定
表12：细胞杀死抗PRLR-DM1抗体-药物缀合物的效力(续)
IC50值为nM
如表11和12中所总结的，以低至100pM的IC50值，多个抗PRLR-DM1抗体-药物缀合物有力地降低在多个细胞背景中的细胞活力。示例性抗PRLR缀合的抗体H1H6958N2-DM1，以100pM至460pM的亚-nM的IC50减少HEK293、PC3和MCF7-PRLR表达细胞，且以1.3nM的IC50杀死内源性表达的T47D细胞。相似地缀合的抗PRLR对照I抗体(对照I-DM1)在所有的细胞系中都比H1H6958N2-DM1效力低数倍。非结合性的同种型对照和未缀合的抗体对细胞活力没有影响。
另外，评估了PRLR配体PRL对PRLR-SMCC-DM1的T47D细胞的细胞杀死的影响。将T47D细胞用PRL(15nM)以及非阻断性抗PRLR抗体(H1H6782P)或受体阻断性抗体(H1H6958N2)的任一种同时孵育。结果总结于表13。
表13：PRLR配体(PRL)存在下的抗PRLR-DM1抗体-药物缀合物的细胞杀死效力
如表13所示，PRL的存在仅对PRLR ADC介导的细胞杀死有适度影响，观察到所测试的mAbs的细胞杀伤效力的2-3倍的降低。
相比于类似缀合的抗体，还评估了抗PRLR缀合抗体对共表达ErbB2的细胞表面靶的效力。PRLR和ErbB2二者同时在大多数乳腺癌中表达，且缀合至DM1的抗ErbB2抗体在靶向ErbB2(+)的乳腺癌中显示出临床疗效(Hurvitz等人；2013年)。对缀合到DM1的ErbB2的对照抗体(对照II)(对照II-DM1)在以上所产生的细胞系中在体外活力检测进行测试。相比于抗ErbB2缀合的抗体的缀合的抗PRLR抗体的细胞杀伤效力总结于表14-17。
表14：抗PRLR-DM1和抗ErbB2-DM1抗体-药物缀合物的细胞杀死效力
IC50值是nM
表15：抗PRLR-DM1和抗ErbB2-DM1抗体-药物缀合物的细胞杀死效力(续)
IC50值是nM
表16：抗PRLR-DM1和抗ErbB2-DM1抗体-药物缀合物的细胞杀死效力(续)
IC50值是nM
表17：抗PRLR-DM1和抗ErbB2-DM1抗体-药物缀合物的细胞杀死效力(续)
IC50值是nM
抗PRLR-DM1抗体有效地杀死即使具有PRLR表达的相对较低水平的细胞。例如，H1H6953N-DM1(抗PRLR-DM1)以1.3nM的IC50抑制T47D细胞(以超出背景仅12X表达PRLR)的生长，并表现出78％的杀伤。此相同的抗体也以0.43nM的IC50抑制293/hPRLR细胞(以超出背景18X表达PRLR)的生长，并表现出93％的杀伤。仅在以超出背景大于约200X至约400X的水平表达靶抗原的细胞(参见例如，以超出背景238X表达ErbB2的PC3/hErbB2，和以超出背景437X表达ErbB2的T47D/hErbB2)中，观察到抗ErbB2-DM1抗体(“对照II”)的等效的杀伤力。因此，这些数据表明，抗PRLR抗体-药物缀合物可以有效地靶向并杀死具有相对较低的水平的PRLR表达的肿瘤细胞，而抗ErbB2抗体药物缀合物仅对具有非常高的ErbB2表达水平的肿瘤有效。
最后，比较了通过不可切割的连接子SMCC缀合至DM1的抗PRLR抗体的效力与通过可切割的连接子(mc-vc-PAB(购自Concortis,San Diego,CA))缀合至MMAE的抗PRLR抗体的细胞的杀伤效力。在这个实验中使用的细胞是PC3、PC3/hPRLR、MCF7/ATCC和MCF7/PRLR。结果示于表18。
表18：抗PRLR ADC细胞杀死效力
如表18所示，对于不可切割的DM1ADCs(H1H6953-SMCC-DM1、H1H6958N2-SMCC-DM1、和H1H6765-SMCC-DM1)和可切割的MMAE ADCs(H1H6953-mc-vc-PAB-MMAE、H1H6958N2-mc-VC-PAB-MMAE、和H1H6765-mc-VC-PAB-MMAE)两者，观察在PC3/hPRLR和MCF7/hPRLR细胞系中几乎同等的细胞杀伤。
缀合到抗PRLR抗体的附加毒素(DM4、MeNHC3-May、和MMD)也在T47D和MCF7/hPRLR细胞系中进行测试，结果总结在表19(293和T47D细胞杀伤)和20(MCF7/ATCC和MCF7/PRLR细胞杀伤)中。(ND＝未检测到)。
表19：抗PRLR抗体药物缀合物-细胞杀伤性能
表20：抗PRLR抗体药物缀合物-细胞杀伤性能(MCF7/ATCC和MCF7/PRLR细胞系)
所有测试的抗PRLR的ADC，无论所使用的毒素和连接子如何，特异性杀死测试细胞。T47D细胞活力的IC50为0.6nM至3.4nM，且MCF7/hPRLR细胞活力的IC50为0.2nM至0.8nM。
实施例8.抗PRLR抗体-药物缀合物有效地抑制体内肿瘤生长
为了确定抗PRLR-DM1抗体-药物缀合物的体内效力，在具有PRLR+乳腺癌异种移植物的免疫低下小鼠中进行研究。
简单地说，将20x 106个MCF7/PRLR细胞(以如前所述的全长hPRLR转染的ATCCHTB-22)皮下植入到雌性NCr裸鼠的左乳房脂肪垫。在其它研究中，将10x 106个PC3/PRLR(以如前所述的全长hPRLR转染的ATCC CRL-1435)皮下植入雄性SCID小鼠的左胁腹(flank)。此外，将10x 106个亲代T47D(ATCC HTB-133)或7.5x 1010个T47D#11细胞(如下所述在体内连续传代的ATCC HTB-133)皮下植入到雌性CB17SCID小鼠的左胁腹。所有的小鼠获得自Taconic(Hudson,NY)。每团细胞被补充90天的雌激素释放丸(1.7毫克/丸；Innovative Research America,Sarasota FL)。一旦肿瘤达到250立方毫米的平均体积，则将小鼠随机分为七组，并用本发明的抗PRLR抗体-药物缀合物或对照试剂给药。对照试剂包括PBS媒介物、游离的甲基二硫化物DM1(DM1-SME)和同种型对照1-DM1。
在多剂量研究中，将小鼠每周给药一次，总共进行三周，在整个研究中肿瘤体积和体重被每周监测两次。在多剂量研究中，以5和/或15mg/kg施用测试的ADCs。在单剂量研究中，小鼠接受单剂量的测试的ADC，并在整个研究中，肿瘤体积和体重被每周监测两次。在单剂量研究中，以1、2.5、5和15mg/kg施用测试的ADC。计算出各组的平均肿瘤大小以及相对于媒介物治疗组的肿瘤生长抑制率。肿瘤被使用卡尺每周测量两次，直到媒介物组的平均尺寸达到1000mm3。肿瘤尺寸用下式(长度x宽度2)/2计算。肿瘤生长抑制率按照下式计算：(1-((T最终-T开始)/(C最终-C开始)))*100，其中T(治疗组)和C组(对照组)代表在媒介物组达到1000mm3那天时的肿瘤平均质量。观察动物至第52天。结果总结于表21-25(多剂量)和表26(单剂量)。(NT＝在示出的特定的实验中未被测试)。
表21：多剂量施用抗PRLR抗体-药物缀合物和对照物后的肿瘤尺寸和肿瘤生长抑制率-MCF7/PRLR肿瘤(试验#1)[NCr裸鼠-在第52天收集的数据]
表22：多剂量施用抗PRLR抗体-药物缀合物和对照物后的肿瘤尺寸和肿瘤生长抑制率-MCF7/PRLR肿瘤(试验#2)[NCr裸鼠-在第63天收集的数据]
表23：多剂量施用抗PRLR抗体-药物缀合物和对照物后的肿瘤尺寸和肿瘤生长抑制率-PC3/PRLR肿瘤(试验1#)[SCID小鼠-在第63天收集的数据]
表24：多剂量施用抗PRLR抗体-药物缀合物和对照物后的肿瘤尺寸和肿瘤生长抑制率-PC3/PRLR肿瘤(试验2#)[SCID小鼠-在第55天收集的数据]
表25：多剂量施用抗PRLR抗体-药物缀合物和对照物后的肿瘤尺寸和肿瘤生长抑制率-T47D#11肿瘤[SCID小鼠-在第66天收集的数据]
表26：单剂量施用抗PRLR抗体-药物缀合物和对照物后的肿瘤尺寸和肿瘤生长抑制率-MCF7/PRLR肿瘤[在第55天收集的数据]
讨论
在这个实施例中，在多剂量研究中，缀合至DM1的5个示例性抗PRLR抗体针对减小MCF7/PRLR和PC3/PRLR肿瘤体积的能力被初步评估。在第一多剂量试验(表21)中，H1H6958N2-DM1、H1H6953N-DM1和H1H6975N-DM1抗体在5mg/kg和15mg/kg的剂量均有力地抑制MCF7/PRLR肿瘤生长。在最高剂量时，所有三个DM1缀合的抗体全部减小肿瘤至不可检测的水平，具有为约133-135％的肿瘤体积的减小百分数。当H1H6958N2-DM1连同两个另外的缀合到DM1:H1H6782P和H1H6765P的示例性抗PRLR抗体被检测时，该发现在第二多剂量试验(表22)中重复。在该第二试验中，肿瘤的生长在15mg/kg的最高剂量时也被减小到检测不到的水平，肿瘤体积的减少百分数为136-137％。虽然相比于媒介物组，用未缀合的抗PRLR抗体治疗得到中度减少的肿瘤体积(17-79％)，溶媒组肿瘤体积(17-79％)的，但在用抗体-药物缀合物治疗的组群中观察到肿瘤尺寸的最大抑制率。
接着，在多剂量研究中(表23和24)，在具有PRLR阳性PC3/PRLR异种移植物的小鼠中评估了这些相同的示例性抗PRLR-DM1抗体的抗肿瘤功效。在肿瘤生长21天之后对小鼠进行治疗。H1H6958N2-DM1、H1H6953N-DM1和H1H6975N-DM1均显示抑制肿瘤生长，特别是在15mg/kg的最高剂量时(表23)。当肿瘤生长15天后对H1H6958N2-DM1连同H1H6765P-DM1和H1H6782P-DM1进行测试时，在第二试验中同样地观察到抗肿瘤效果。在施用最高剂量时，在所有试验中的肿瘤抑制为从38-98％(表24)。相比之下，缀合到DM1的同种型对照只产生了16％的肿瘤抑制，最终肿瘤体积没有显著不同于媒介物对照组。
以5和15mg/kg被重复施用的抗PRLR ADC的进一步评估在具有内源性表达PRLR的T47D#11移植物的小鼠中进行(表25)。正如在其它肿瘤模型中，当肿瘤体积为平均200立方毫米是开始给药。在这一肿瘤模型得到的结果与以前的结果一致，并清楚地表明缀合至DM1的抗PRLR抗体的抗肿瘤活性。例如，H1H6958N2-DM1、H1H6765P-DM1和H1H6782P-DM1ADCs同时在5和15mg/kg剂量时有效抑制肿瘤的生长。在5mg/kg时，抗PRLR-DM1缀合的抗体显示出89-100％的肿瘤抑制，而在15mg/kg时，DM1缀合的抗体产生了106-112％的肿瘤生长抑制。重要的是，在此内源性肿瘤模型中，未缀合的抗PRLR抗体未观察到具有任何抗肿瘤效力，表明DM1缀合物的产生抗肿瘤效力的作用。同样，抗PRLR ADC的功效是非常特异性的，因为对照ADC对肿瘤生长没有任何影响。
在最后的例子中，在单剂量研究中，抗PRLR DM1缀合的抗体H1H6958N2在MCF7/PRLR异种移植小鼠中被进行评估(表26)。如在多剂量研究中一样，在施用单一剂量之前，使已确定的肿瘤生长至大约200mm3。这里，以1、2.5、5和15mg/kg给予H1H6958N2-DM1。如表26中所总结的，在该研究中，在使用的所有的宽的范围中，观察到剂量依赖性的抗肿瘤效果。在所有剂量中均观察到抗肿瘤作用，其中相对于媒介物对照肿瘤，1mg/kg引起显著的肿瘤体积的减小。此外，虽然15mg/kg的同种型对照的I-DM1具有一些抗肿瘤作用(～38％的肿瘤生长抑制)，2.5mg/kg和更高的剂量的抗PRLR-DM1显著降低肿瘤体积(在所有所测试的高于1mg/kg的剂量中，>100％肿瘤生长抑制)。5和15mg/kg的单剂量显示了与以相同的水平重复给药后所观察到的抗肿瘤功效可比较的抗肿瘤功效，示出了抗PRLR ADC的效力。
总之，本实施例示出了，在所测试的各种肿瘤模型中，本发明的缀合的抗PRLR抗体是有效的肿瘤生长抑制剂，并且能够降低肿瘤尺寸至检测不到的水平。
实施例9.针对I类细胞因子受体的抗体药物缀合物有效杀死表达低水平靶抗原的细胞系
如本文其它部分所讨论的，针对PRLR的抗体-药物缀合物有效地杀死表达PRLR的细胞系，即使是表达相对较低水平靶抗原的那些细胞系。如前所述，PRLR属于I类细胞因子受体家族，其包括IL-4R和IL-6R。类似于PRLR，IL-4R和IL-6R也是单次跨膜受体；IL-4R介导IL-4和IL-13信号传导，而IL-6R经由具有gp130受体的共复合体介导的IL-6信号传导。为了进一步证明下述一般概念：即，靶向I类细胞因子受体的ADCs可被用于有效地杀死细胞，包括表达低水平靶抗原的细胞，评价了靶向IL-4R和IL-6R的ADCs的细胞杀伤能力。
使用FACS，首先确定内源性或重组表达IL-4R或IL-6R的细胞上的细胞表面抗原水平。简言之，将大约100万KG-1(IL-4R+)、HEK293/IL-4R和Ramos(IL-6R+)细胞，用示例性的抗IL-4R(H4H083P2，参见美国专利号7,608,693)和抗IL-6R(VV6A9-5，见美国专利号7582298)抗体在冰上孵育30分钟。洗涤后，以30分钟添加PE-缀合的抗人第二抗体(10微克/毫升)，随后进行第二洗涤步骤，且利用FlowJo软件(Tree Star,Inc.,Ashl和,OR)在Accuri C6细胞计数器上进行随后的分析。相对的IL-4R和IL-6R的细胞表面的表达水平被计算为超出同种型对照水平的平均荧光强度(MFI)。表达水平总结于表27。
表27：在内源性或重组表达IL-4R和IL-6R的细胞系上的相对IL-4R和IL-6R的细胞表面表达
如表27所示，HEK293和Ramos细胞分别以超出背景2倍和4倍的水平内源性表达IL-4R，而工程化的HEK293/IL-4R细胞系以50倍的水平表达IL-4R。在KG-1细胞上，IL-4R的表达在背景之上是检测不到的。IL-6R的表达，在KG-1细胞中以超出背景7倍的水平被检测到，而在HEK293或Ramos细胞系上没有被检测到。
接下来，将示例性的抗IL-4R(H4H083P2)和抗IL-6R(VV6A9-5)抗体缀合至细胞毒性药物DM1，且对它们在细胞毒性测定中的效力进行评价。简要地说，以每孔1500到10,000个细胞将HEK293/IL-4R、Ramos或KG-1细胞系、以及HEK293亲代细胞接种在PDL包被的96孔板中。以300nM到15pM终浓度范围将ADC或游离DM1(如甲基二硫化物衍生物DM1-SME)加入到细胞，并孵育3天。细胞用CCK8(Dojindo,Rockville,MD)孵育最后1-3小时，并在Flexstation3(分子器件，桑尼维尔，加州)上测定450nm(OD450)处的吸光度。将来自毛地黄皂苷(40nm)处理过的细胞的背景OD450值从所有孔中减去，且活力表示为未处理的对照的百分比。从相对于10点响应曲线(GraphPad Prism)的四参数逻辑方程确定IC50值。结果列于表28。
表28：抗IL4R和抗IL6R抗体药物缀合物对表达IL4R和IL-6R的细胞系的细胞杀伤性能
如表28所示，尽管只有超出背景4倍水平的IL-4R表面表达，但抗IL-4R-DM1抗体-药物缀合物以18nM的IC50值降低了Ramos细胞活力。IL-4R-DM1ADCs以0.22nM的IC50降低了高IL-4R表达的HEK293/IL-4R活力。相比于同样缀合的同种型对照ADC的100nM的IC50值，抗IL-6R-DM1抗体-药物缀合物以38nM的IC50值对KG-1细胞(以超出背景7倍的水平表达IL-6R)的活力具有适度但可重现性的影响。
总之，本实施例表明，抗IL-4R和抗IL-6R抗体药物缀合物甚至对表达适度受体水平的细胞系显示出有效的和可重现的细胞毒性。这个结果类似于抗PRLR ADCs的情形，在抗PRLR ADCs的情形中，甚至在表达低水平PRLR的细胞上获得有效的细胞杀伤(参见，例如，本文的实施例7)。因此，这个实施例对下述发明构思提供了进一步的支持：即，抗I类细胞因子受体的ADCs通常可以是针对甚至以低水平表达I类细胞因子受体的细胞系和肿瘤的有效治疗剂。
另外，本发明不应被限制在本文所描述的具体实施例的范围内。实际上，除了本文所述的那些之外，根据前面的描述和附图，对本领域技术人员而言，本发明的各种修改将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围之内。

Claims (41)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合催乳素受体(PRLR)，其中所述抗体或其抗原结合片段具有选自由下述所构成的组中的一种或多种性质：
(i)在37℃，以由表面等离振子共振测定的小于约4.0nM的KD，结合单体人类PRLR；
(ii)在37℃，以由表面等离振子共振测定的大于约5分钟的t1/2，结合单体人类PRLR；
(iii)在37℃，以由表面等离振子共振测定的小于约250pM的KD，结合二聚的人类PRLR；
(iv)在37℃，以由表面等离振子共振测定的大于约55分钟的t1/2，结合二聚的人类PRLR；和
(v)以小于约1.3nM的IC50阻断表达人类PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导。
2.分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合至细胞表面表达的催乳素受体(PRLR)，但不阻断表达PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导。
3.分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合至细胞表面表达的催乳素受体(PRLR)并阻断表达PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导。
4.如权利要求3所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以小于约1.3nM的IC50阻断表达人类PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导。
5.分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合催乳素受体(PRLR)，其中所述抗体或抗原结合片段包含：(a)具有如表1中所列出的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)；和(b)具有如表1中所列出的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的互补决定区(CDR)。
6.如权利要求5所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：具有如表1中所列出的氨基酸序列的HCVR和具有如表1中所列出的氨基酸序列的LCVR。
7.抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含缀合到细胞毒性剂、特异性地结合人类催乳素受体(PRLR)的抗体或其抗原结合片段，其中，所述ADC抑制表达PRLR的细胞的生长。
8.抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含缀合到细胞毒性剂的权利要求1-7中任一项所限定的抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求8所述的ADC，其中所述细胞毒性剂是类美登素。
10.如权利要求9所述的ADC，其中所述类美登素是DM1、DM4、或它们的衍生物。
11.如权利要求9或10所述的ADC，其中所述类美登素通过可切割的连接子而连接到所述抗体。
12.如权利要求9或10所述的ADC，其中所述类美登素通过不可切割的连接子而连接到所述抗体。
13.如权利要求7或8所述的ADC，其中所述细胞毒性剂是澳瑞他汀。
14.如权利要求7至13中任一项所述的ADC，其中，所述ADC以小于5nM的IC50杀死细胞，所述细胞以超出背景低于30倍的表达水平表达PRLR。
15.如权利要求14所述的ADC，其中，所述ADC以小于5nM的IC50杀死细胞，所述细胞以超出背景低于20倍的表达水平表达PRLR。
16.如权利要求14所述的ADC，其中，所述ADC以小于5nM的IC50杀死细胞，所述细胞以超出背景高于12倍但超出背景低于30倍的表达水平表达PRLR。
17.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或如权利要求7至16中任一项所述的ADC，其中，所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体竞争结合到PRLR，所述参照抗体包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由下述所构成的组：SEQID NOs:18/26；66/74；274/282；290/298；和370/378。
18.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或如权利要求7至16中任一项所述的ADC，其中，所述抗体或其抗原结合片段结合到与参照抗体相同的表位，所述参照抗体包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由下述所构成的组：SEQ IDNOs:18/26；66/74；274/282；290/298；和370/378。
19.用于杀死表达低水平的PRLR的细胞的方法，所述方法包括使该细胞与抗体-药物缀合物(ADC)接触，所述抗体-药物缀合物包含缀合到细胞毒性剂的抗PRLR抗体。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述肿瘤细胞每细胞表达小于1百万拷贝数的PRLR。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述肿瘤细胞每细胞表达10,000至500,000拷贝数的PRLR。
23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性剂是类美登素。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述类美登素是DM1或DM4。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中，所述类美登素通过可切割的连接子而连接到所述抗体。
26.如权利要求23或24所述的方法，其中所述类美登素通过不可切割的连接子而连接到所述抗体。
27.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是澳瑞他汀。
28.如权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述抗PRLR抗体结合到细胞表面表达的PRLR但不阻断表达PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导。
29.如权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述抗PRLR抗体结合到细胞表面表达的催乳素受体(PRLR)并阻断表达PRLR的细胞中的催乳素介导的信号转导。
30.如权利要求19至29中任一项所述的方法，其中所述细胞以超出背景小于约60倍的表达水平表达PRLR。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述细胞以超出背景小于约20倍的表达水平表达PRLR。
32.如权利要求19至31中任一项所述的方法，其中所述抗PRLR抗体包含：(a)具有如表1中所列出的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)；和(b)具有如表1中所列出的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的互补决定区(CDR)。
33.药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求7至16中任一项所述的ADC，和药学上可接受的载体或稀释剂。
34.用于抑制或减弱肿瘤生长的方法，所述方法包括对患有肿瘤的受试者施用权利要求33所述的药物组合物。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤选自由下述组成的组：肾肿瘤、胰腺肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、结肠肿瘤、胃肿瘤和卵巢肿瘤、肺肿瘤、和皮肤瘤。
36.用于抑制或减弱受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求33所述的药物组合物和第二治疗剂，其中所述第二治疗剂是特异性结合HER2、ErbB3、ErbB4、cMet、IGF1R、Ang2、PDGFR-α或PDGFR-β的抗体或其抗原结合片段。
37.用于抑制或减弱受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用权利要求33所述的药物组合物和第二治疗剂，其中所述第二治疗剂是VEGF拮抗剂。
38.用于抑制或减弱受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求33所述的药物组合物和第二治疗剂，其中所述第二治疗剂是化学治疗剂。
39.抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含特异性结合I类细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。
40.用于杀死表达低水平的I类细胞因子受体的细胞的方法，所述方法包括使细胞与抗体-药物缀合物(ADC)接触，所述抗体-药物缀合物(ADC)包含缀合至细胞毒性剂的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合I类细胞因子受体。
41.如权利要求39所述的ADC，或权利要求40所述的方法，其中所述I类细胞因子受体类选自由下述所构成的组：IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-9R、IL-13R、IL-15R、IL-3R、IL-5R、IL-6R、IL-11R、CNTF受体、LIF受体、OSM受体、IL-12R、EPO受体、G-CSF受体、瘦素受体和PRLR。
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