KR20240015646A - 마이크로칩 모세관 전기영동 분석 및 시약 - Google Patents
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Abstract
순도를 분석하고 단백질 약물 샘플의 불순물을 식별하기 위한 마이크로칩 모세관 전기영동(Microchip Capillary Electrophoresis, MCE) 분석 및 시약이 제공된다. 단백질 약물 샘플의 분석물을 분석하는 방법이 제공된다.
Description
본 출원은 2018년 3월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/644,933의 이익과 우선권을 주장하는 2019년 3월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 16/355,050의 부분 계속 출원인 2021년 6월 1일에 출원된 미국 특허 출원 번호 17/335,756의 부분 계속 출원이다. 본 출원은 또한 2018년 3월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/644,933의 이익과 우선권을 주장하는 2019년 3월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 16/355,050의 부분 계속 출원이다. 이들 각각의 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야는 일반적으로 모세관 전기영동 분야, 특히 마이크로칩 모세관 전기영동에 관한 것이다.
강력하고, 재현 가능하며, 사용자 친화적인 기술을 구현하는 것은 오늘날 품질 관리(QC) 실험실에서 생물학적 제품의 테스트 요구 사항을 충족하는 데 매우 중요하다. 생산량 증가를 촉진하면서도 고품질 분석 데이터를 지속적으로 생성하고 유효하지 않은 테스트 결과 및 기기 관련 점검 수를 최소화하기 위해서는 기술 업그레이드가 필요하다. 전기영동은 제품의 순도 및 단편화 분석을 위해 QC 과정에서 이용되어 왔지만, 전기영동 방법은 젤 기반에서 모세관 기반으로, 그리고 최근에는 마이크로칩으로 전환되었다. 마이크로칩 모세관 전기영동(Microchip Capillary Electrophoresis, MCE)를 사용하면 QC 분석에 필요한 성능 및 재현성 기준을 유지하면서도 샘플 분석 시간을 크게 줄일 수 있다(Ouimet, C., 등, Expert Opin Drug Discov., 12(2): 213-224 (2017)).
MCE는 바이오 의약품 특성화, 품질 관리 및 약물 발견을 위해 제약 산업에서 사용 사례가 증가하고 있는 유망한 기술로 부상했지만, 분석 간섭이 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 분석 간섭을 줄이는 개선된 MCE 분석 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 약물 내 불순물 검출을 개선하기 위한 MCE 분석 및 조성물을 제공하는 것이다.
순도를 분석하고 단백질 약물 샘플의 불순물을 식별하기 위한 MCE 분석 및 시약이 제공된다. 단백질 약물 샘플의 분석물을 분석하는 방법이 제공된다. 바람직한 단백질 약물에는 항체 및 그 항원 결합 단편 등을 포함되지만 이에 국한되지는 않는 재조합 단백질 및 융합 단백질을 포함한다. 분석 과정은 MCE 기술을 사용하여 단백질 제품과 단백질 제품 내의 불순물을 분리, 식별 및 정량화한다. 불순물에는 단백질 응집체, 단백질 단편, 단백질 다량체 및 분석 오염물질이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 환원성 및 비환원성 완충용액 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 문서에 제공된 MCE 분석 및 시약은 REGEN-COV™(카시리비맙 및 임데비맙)을 포함한 치료 단백질 제품과 같은 Anti-SARS-CoV-2 제품의 분석 및 순도 테스트에 사용될 수 있다.
한 실시형태에서는 2-아이오도아세트아마이드(IAM), 아이오도아세트산(IAA) 또는 N-에틸말레이미드(NEM)와 같은 알킬화제를 함유하는 비환원성 전기영동 샘플 완충용액을 제공한다. 한 실시형태에서, 비환원성 전기영동 샘플 완충용액은 알킬화제인 2-아이오도아세트아마이드 155 내지 175mM; 리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%; 그리고 인산나트륨 65 내지 95mM을 포함하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 7 미만이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 6이다. 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 166mM, 리튬 도데실설페이트 0.81%, 그리고 인산나트륨 81mM을 포함한다.
다른 실시형태에서, 비환원성 전기영동 샘플 완충용액은 알킬화제인, 예를 들어 2-아이오도아세트아마이드 50 내지 250mM, 155 내지 200mM, 또는 155 내지 250mM; 리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%; 그리고 인산나트륨 40 내지 80mM 또는 50 내지 70mM을 포함하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 미만이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다. 또 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM을 포함한다.
다른 실시형태에서, 비환원성 전기영동 샘플 완충용액은 알킬화제인, 예를 들어 2-아이오도아세트아마이드 155 내지 200mM; 리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%; 그리고 인산나트륨 50 내지 70mM을 포함하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 미만이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 6이다. 또 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM을 포함한다.
환원성 완충용액 또한 제공된다. 한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 전기영동 샘플 완충용액으로서 리튬 도데실설페이트 0.5 내지 1.5%, 인산나트륨 55 내지 85mM 및 환원제를 포함하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 이상이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 9이다. 한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 디티오트레이톨 135 내지 155mM을 포함한다. 또 다른 실시형태에서는 리튬 도데실설페이트 0.69%, 인산나트륨 69mM, 그리고 디티오트레이톨 142mM로 이루어진 환원성 완충용액을 제공한다.
한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 전기영동 샘플 완충용액으로서 리튬 도데실설페이트 0.5 내지 1.5%, 인산나트륨 45 내지 85mM 및 환원제를 포함하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 이상이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다. 한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 디티오트레이톨 80 내지 155mM을 포함한다. 또 다른 실시형태에서는 리튬 도데실설페이트 1.2%, 인산나트륨 60mM, 그리고 디티오트레이톨 80mM로 이루어진 환원성 완충용액을 제공한다.
HEPES 기반 완충용액 또한 제공된 방법과 함께 사용 가능하다. 한 실시형태에서는 알킬화제, 예를 들어 2-아이오도아세트아마이드 55 내지 75mM; 리튬 도데실설페이트 0.1 내지 1.0%; HEPES 5 내지 85mM, 그리고 염화나트륨 5 내지 115mM을 포함하는 비환원성 HEPES 기반 전기영동 샘플 완충용액을 제공하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 9 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다. 또 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 66.4mM, 리튬 도데실설페이트 0.32%, HEPES 16.2mM, 그리고 염화나트륨 48.6mM을 포함한다.
다른 실시형태에서는 리튬 도데실설페이트 0.05 내지 0.75%, 염화나트륨 5mM 내지 115mM, HEPES 5mM 내지 115mM 및 환원제를 포함하는 환원성 HEPES 기반 전기영동 샘플 완충용액을 제공하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 7 이상이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다. 한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 디티오트레이톨 35 내지 50mM을 포함한다. 또 다른 실시형태에서는 리튬 도데실설페이트 0.28%, 염화나트륨 41.5mM, HEPES 13.8mM, 그리고 디티오트레이톨 42.5mM로 이루어진 환원성 완충용액을 제공한다.
한 실시형태는 단백질 샘플을 상기 논의된 비환원성 완충용액에 첨가하여 완충된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계를 포함하는 단백질 약물 샘플에서 오염물질 또는 불순물을 식별하기 위한 비환원성 MCE 방법을 제공한다. 완충된 단백질 약물 샘플을 65 내지 85℃로 5 내지 15분 동안 가열하여 변성된 완충 단백질 약물 샘플을 형성한다. 한 실시형태에서, 완충된 단백질 약물 샘플은 70℃로 10분 동안 가열된다.
다른 실시형태에서는, 단백질 샘플을 상기 논의된 비환원성 완충용액에 첨가하여 완충된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계를 포함하는 단백질 약물 샘플에서 오염물질 또는 불순물을 식별하기 위한 비환원성 MCE 방법을 제공한다. 완충된 단백질 약물 샘플을 50 내지 72℃로 5 내지 15분 동안 가열하여 변성된 완충 단백질 약물 샘플을 형성한다. 위와는 다르게, 완충된 단백질 약물 샘플을 45 내지 75℃로 5 내지 15분 동안 가열하여 변성된 완충 단백질 약물 샘플을 형성한다. 한 실시형태에서, 완충된 단백질 약물 샘플은 60℃-65℃로 10분 동안 가열된다. 다른 실시형태에서는, 완충된 단백질 약물 샘플은 63℃로 10분 동안 가열된다. 다른 실시형태에서는, 완충된 단백질 약물 샘플은 60℃로 10분 동안 가열된다.
일부 실시형태에서, 단백질 약물 샘플은 검출가능한 표지와 혼합되고 30 내지 40℃에서 20 내지 40분 또는 10 내지 40분 동안 가열되어 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 다른 실시형태에서, 단백질 약물 샘플은 검출가능한 표지와 혼합되고 30 내지 40℃에서 15분 동안 가열되어 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 검출가능한 표지에는 Dyomics DY-631 NHS Ester가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시형태에서는 표지가 MilliQ 정제수로 희석되고, 다른 실시형태에서는 표지가 인산나트륨 완충용액으로 희석된다. 일부 실시형태에서, 검출가능한 표지는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용해 복원시킨 후 인산나트륨 200mM pH 7.2 완충용액으로 희석된다. 다른 염료, 형광단, 발색단, 질량 태그, 퀀텀 닷 등과 미국 특허 번호 6,924,372에 개시된 검출가능한 표지를 포함하는 다른 검출가능한 표지를 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 표지가 추가된 단백질 약물 샘플은 35℃로 30분 동안 가열된다. 다른 실시형태에서, 표지가 추가된 단백질 약물 샘플은 35℃로 15분 동안 가열된다. 선택 사항으로, 예를 들어 스핀 필터를 사용하는 등의 방식으로 과잉 표지를 샘플에서 제거한다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 ??칭되지 않는다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 제거되지 않는다.
변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 희석하고 마이크로칩 모세관 전기영동 시스템 상에서 MCE 과정을 거쳐 희석된 단백질 약물 샘플을 분리하여 전기영동도를 생성한다. 한 실시형태에서는 0.5mg/ml에서 시작하여 마이크로칩 위로 주입되는 샘플의 최종 농도는 MCE 시점에서 9μg/ml이다. 다른 실시형태에서는 0.2mg/ml에서 시작하여 마이크로칩 위로 주입되는 샘플의 최종 농도는 MCE 시점에서 3.6μg/ml이다. 전기영동도에는 단백질 약물 및 불순물에 해당하는 피크가 포함되어 있다. 이 방법은 전기영동도에서 단백질 약물, 오염물질 및/또는 불순물에 해당하는 피크를 식별함으로써 마무리된다.
또 다른 실시형태에서는 단백질 약물 샘플에서 오염물질 또는 불순물을 식별하기 위한 환원성 MCE법을 제공합니다. 이 방법은 상기 설명된 환원성 완충용액 중 어느 하나에 단백질 샘플을 첨가하여 완충된 단백질 약물 샘플을 형성하는 것으로 시작된다. 완충된 단백질 약물 샘플을 65 내지 85℃, 바람직하게는 75℃로 10분 동안 가열하여 완충된 단백질 약물 샘플을 변성시켜 변성된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 단백질 약물 샘플을 검출가능한 표지와 혼합하고 30 내지 40℃로 20 내지 40분 동안 가열되어 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 한 실시형태에서, 표지가 추가된 단백질 약물 샘플은 35℃로 30분 동안 가열된다.
다른 실시형태에서는, 완충된 단백질 약물 샘플을 50 내지 72℃, 바람직하게는 60℃로 10분 동안 가열되어 완충된 단백질 약물 샘플을 변성시켜 변성된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 예를 들어, 단백질 약물 샘플이 검출가능한 표지와 혼합되고 30 내지 40℃로 15분 동안 가열되어 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 다른 실시형태에서, 표지가 추가된 단백질 약물 샘플은 35℃로 15분 동안 가열된다.
선택 사항으로, 예를 들어 스핀 필터를 사용하는 등의 방식으로 과잉 표지를 샘플에서 제거한다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 ??칭되지 않는다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 제거되지 않는다. 검출가능한 표지의 예시에는 Dyomics DY-631 NHS Ester가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 다른 염료, 형광단, 발색단, 질량 태그, 퀀텀 닷 등과 미국 특허 번호 6,924,372에 개시된 검출가능한 표지를 포함하는 다른 검출가능한 표지를 사용할 수 있다.
한 실시형태에서, 샘플 농도에 대해 확립된 분석 범위는 0.4mg/ml 내지 0.6mg/ml이며, 이는 마이크로칩 모세관 전기영동 시스템 상에서 전기영동도를 생성하기 위해 MCE 분석의 대상이 되는 최종 분석 농도 7μg/ml 내지 11μg/ml에 해당한다. 한 실시형태에서, 샘플 농도에 대해 확립된 분석 범위는 0.2mg/ml 내지 0.6mg/ml이며, 이는 최종 분석 농도 3.6μg/ml 내지 11μg/ml에 해당한다. 이 방법은 전기영동도에서 단백질 약물, 오염물질 및/또는 불순물에 해당하는 피크를 식별함으로써 마무리된다.
도 1a는 일반적인 비환원 샘플 분석의 전기영동도를 나타낸다.
도 1b는 일반적인 환원 샘플 분석의 전기영동도를 나타낸다. X축은 시간(분)을 나타내고 Y축은 상대 형광 단위(RFU)를 나타낸다. 이동 시간의 증가는 단백질 크기의 증가와 연관된다.
도 1b는 일반적인 환원 샘플 분석의 전기영동도를 나타낸다. X축은 시간(분)을 나타내고 Y축은 상대 형광 단위(RFU)를 나타낸다. 이동 시간의 증가는 단백질 크기의 증가와 연관된다.
I.
정의
현재 청구된 발명을 기술하는 맥락에서(특히 청구범위의 맥락에서) 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에서 다르게 지시되지 않거나 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않으면, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 값의 범위에 대한 언급은 본원에서 달리 명시되지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서의 역할을 하기 위한 것일 뿐이며, 각 개별적인 값은 본원에 개별적으로 언급된 경우와 같이 본 명세서에 포함된다.
용어 "약"의 사용은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 10%의 범위의 값을 기술하는 것을 의도한다. 다른 실시형태에서, 값들은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 5%의 범위의 값의 범위일 수 있다. 다른 실시형태에서, 값들은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 2%의 범위의 값의 범위일 수 있다. 다른 실시형태에서, 값들은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 1%의 범위의 값의 범위일 수 있다. 상기 범위들이 문맥에 의해 명확해지는 것을 의도하고, 더 이상의 제한은 함축되지 않는다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 전형적 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 분명히 하기 위한 것을 의도하고, 달리 주장되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 두지 않는다. 본원의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것이라 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"단백질"은 펩타이드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 단백질은 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하고, 또한 변형 예컨대 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 알킬화, 히드록실화 및 ADP-리보실화를 포함할 수 있다. 단백질-기반 약물을 포함해서 단백질은 과학적 또는 상업적 관심을 끌 수 있고, 단백질은 무엇보다도 효소, 리간드, 수용체, 항체 및 키메릭 또는 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 잘 알려진 세포 배양 방법을 사용하여 다양한 유형의 재조합 세포에 의해 생성되고, 일반적으로 유전 공학 기술(예를 들어, 예컨대 키메릭 단백질을 코딩하는 서열, 또는 코돈-최적화된 서열, 인트론이 없는 서열 등)에 의해 세포 내로 도입되며, 세포 내에서 단백질은 에피솜(episome)으로서 거주할 수 있거나 또는 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
"항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화된 및 비글리코실화된 면역글로불린 둘 모두의 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현시키기 위해 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조된, 발현된, 생성된 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함하는, 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공개 제8,586,713호에 기재되어 있다.
"Fc 융합 단백질"은 2가지 이상의 단백질 중 일부 또는 전부를 포함하며, 이 중 하나는 그렇지 않으면 자연에서 함께 발견되지 않는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이다. 항체-유래 폴리펩타이드(Fc 도메인을 포함함)의 다양한 부분에 융합된 일부 이종 폴리타이티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예를 들어 Ashkenazi 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 10535 (1991); Byrn 등, Nature 344:677 (1990); 및 Hollenbaugh 등, “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, 페이지 10.19.1 - 10.19.11 (1992) 등에서 기술되었다. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하며, 이는 일부 실시형태에서 힌지 영역, 이에 이어 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 트랩, 예컨대 예를 들어 IL-1 트랩 또는 VEGF 트랩이다.
"MCE" 또는 "마이크로칩 모세관 전기영동"이라는 용어는 분석물의 마이크로칩 기반 모세관 전기영동(CE) 분리를 의미한다.
II.
MCE 분석 및 완충용액
단백질 약물 샘플의 분석물을 분석하는 방법이 제공된다. 단백질 약물에는 항체 및 그 항원 결합 단편, 융합 단백질 및 재조합 단백질이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 분석 과정은 MCE 기술을 사용하여 단백질 제품과 단백질 제품 내의 불순물을 분리, 식별 및 정량화한다. 불순물에는 단백질 응집체, 단백질 단편, 단백질 다량체 및 분석 오염물질이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 환원성 및 비환원성 완충용액 또한 제공된다.
마이크로칩 모세관 전기영동(MCE)은 공정 중 테스트, 로트 출하 및 안정성 표시에 적합한 단백질 순도 및 불순물 분석을 제공한다. 카시리비맙 및 임데비맙과 같은 단백질 샘플을 가열을 통해 샘플을 변성시키고 알킬화제(비환원) 또는 환원제(환원)와 함께 리튬 도데실설페이트(LDS)을 첨가하여 제조하였다. 이론에 얽매이려는 의도는 아닌 이 과정을 통해 음전하를 띤 선형 단백질-LDS 폴리펩티드 사슬이 생성되며, 이후 이를 아민 에스테르 염료와 함께 배양하여 자유 아민 그룹을 공유적으로 표지한다. 표지된 샘플은 전류를 가하면 질량-전하비에 따라 샘플 구성 요소가 분리되는 마이크로칩에 주입될 수 있다. 레이저 유도 형광으로 검출 과정을 수행하여 전기영동도를 생성할 수 있다. 전기영동도를 분석하면 존재하는 불순물 대비 샘플의 상대적 순도를 제공합니다.
A. 완충용액
1. 비환원성 완충용액
한 실시형태에서는 알킬화제, 예를 들어 2-아이오도아세트아마이드 155 내지 200mM; 리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%; 그리고 인산나트륨 60 내지 95mM을 포함하는 비환원성 전기영동 샘플 완충용액을 제공하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 7 미만이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 6이다. 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 166mM, 리튬 도데실설페이트 0.81%, 그리고 인산나트륨 81mM을 포함한다.
다른 실시형태에서는 알킬화제 155 내지 200mM; 리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%; 그리고 인산나트륨 60 내지 95mM을 포함하는 비환원성 전기영동 샘플 완충용액을 제공하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 이하이다. 또 다른 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다. 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM을 포함한다.
다른 실시형태에서는 알킬화제 155 내지 200mM; 리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%; 그리고 인산나트륨 60 내지 95mM을 포함하는 비환원성 전기영동 샘플 완충용액을 제공하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 완충용액의 pH는 6이다. 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM을 포함한다.
2. 환원성 완충용액
환원성 완충용액 또한 제공된다. 한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 전기영동 샘플 완충용액으로서 리튬 도데실설페이트 0.5 내지 1.5%, 인산나트륨 65 내지 95mM 및 환원제를 포함하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 이상이다. 다른 실시형태에서, 환원성 완충용액은 리튬 도데실설페이트 0.5 내지 1.5%, 인산나트륨 45 내지 95mM 및 환원제를 포함하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 8 이상이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 9이다. 또 다른 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다.
환원제는 당업계에 공지되어 있다. 환원제의 예시에는 디티오트레이톨(DTT, CAS 3483-12-3), 베타-머캅토에탄올(BME, 2BME, 2-ME, b-mer, CAS 60-24-2), 2-아미노에탄티올(2-MEA-HCl, 시스테아민-HCl이라고도 함, CAS 156-57-0), 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 염산염, (TCEP, CAS 5961-85-3), 시스테인 염산염(Cys-HCl, CAS 52-89-1), 또는 2-머캅토에탄술폰산 나트륨염(MESNA) 등이 있지만 이에 국한되지 않는다. 단백질 결합을 환원시키는 다른 방법, 예를 들어 펩타이드 및 단백질 다이설파이드 결합의 고체상 환원을 가능하게 하기 위해 티올계 환원제가 고정된 수지를 포함하는 고정 환원제 컬럼과 같은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 다이설파이드 결합을 절단하는 데 적합한 추가적인 환원제가 또한 구상된다.
한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 디티오트레이톨 135 내지 155mM을 포함한다. 다른 실시형태에서, 환원성 완충용액은 디티오트레이톨 80 내지 155mM을 포함한다.
또 다른 실시형태에서는 리튬 도데실설페이트 0.69%, 인산나트륨 69mM, 그리고 디티오트레이톨 142mM 또는 로 리튬 도데실설페이트 1.2%, 인산나트륨 60mM, 그리고 디티오트레이톨 80mM으로 이루어진 환원성 완충용액을 제공한다.
3. HEPES 기반 비환원성 완충용액
HEPES 기반 완충용액 또한 제공된 방법과 함께 사용 가능하다. 한 실시형태에서는 알킬화제, 예를 들어 2-아이오도아세트아마이드 55 내지 75mM; 리튬 도데실설페이트 0.1 내지 1.0%; HEPES 5 내지 85mM, 그리고 염화나트륨 5 내지 115mM을 포함하는 비환원성 HEPES 기반 전기영동 샘플 완충용액을 제공하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 9 미만이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다. 다른 실시형태에서, 완충용액은 2-아이오도아세트아마이드 66.4mM, 리튬 도데실설페이트 0.32%, HEPES 16.2mM 및 염화나트륨 48.6mM을 포함한다.
4. HEPES 기반 환원성 완충용액
다른 실시형태에서는 리튬 도데실설페이트 0.05 내지 0.75%, 염화나트륨 5mM 내지 115mM, HEPES 5mM 내지 115mM 및 환원제를 포함하는 환원성 HEPES 기반 전기영동 샘플 완충용액을 제공하며, 상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH는 7 이상이다. 한 실시형태에서, 완충용액의 pH는 8이다. 한 실시형태에서, 환원성 완충용액은 디티오트레이톨 35 내지 50mM을 포함한다. 또 다른 실시형태에서는 리튬 도데실설페이트 0.28%, 염화나트륨 41.5mM, HEPES 13.8mM, 그리고 디티오트레이톨 42.5mM로 이루어진 환원성 완충용액을 제공한다.
B.
분석
1. 비환원적 분석
한 실시형태는 단백질 샘플을 상기 논의된 비환원성 완충용액에 첨가하여 완충된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계를 그 방법에 포함하는 단백질 약물 샘플에서 오염물질 또는 불순물을 식별하기 위한 비환원성 MCE 방법을 제공한다. 완충된 단백질 약물 샘플을 50 내지 85℃로 5 내지 15분 동안 가열하여 변성된 완충 단백질 약물 샘플을 형성한다. 한 실시형태에서 완충된 단백질 약물 샘플은 75℃로 10분 동안 가열되며, 다른 실시형태에서는 완충된 단백질 약물 샘플을 45 내지 75℃로 5 내지 15분 동안 가열하여 변성된 완충 단백질 약물 샘플을 형성한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 완충된 단백질 약물 샘플은 60℃로 10분 동안 가열된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 완충된 단백질 약물 샘플은 63℃로 10분 동안 가열된다.
검출가능한 표지는 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 공급업체 권장 사항에 따라 준비된다. 이후 진행되는 희석은 MilliQ의 공급업체 권장 사항에 따라 준비된다. 다른 실시형태에서, 표지는 200mM 인산나트륨 pH 7.2에서 희석하여 제조된다. 일부 실시형태에서, 표지는 5μM 용액으로 희석된다. 다른 실시형태에서, 표지는 16μM 용액으로 희석된다. 희석된 표지는 이후 상기 변성된 완충 단백질 약물 샘플에 첨가하고 30 내지 40℃로 10 내지 40분간 가열하여 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 또 하나의 실시형태에서는 검출가능한 표지가 상기 변성된 완충 단백질 약물 샘플에 첨가하고 30 내지 40℃로 15분간 가열하여 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 한 실시형태에서, 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플은 35℃로 30분 동안 가열된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플은 35℃로 15분 동안 가열된다. 선택 사항으로, 예를 들어 스핀 필터를 사용하는 등의 방식으로 과잉 표지를 샘플에서 제거한다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 ??칭되지 않는다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 제거되지 않는다.
바람직한 검출가능한 표지에는 Dyomics DY-631 NHS Ester가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 다른 염료, 형광단, 발색단, 질량 태그, 퀀텀 닷 등과 미국 특허 번호 6,924,372에 개시된 검출가능한 표지를 포함하는 다른 검출가능한 표지를 사용할 수 있다.
변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 희석하고 마이크로칩 모세관 전기영동 시스템 상에서 MCE 과정을 거쳐 희석된 단백질 약물 샘플을 분리하여 전기영동도를 생성한다. 한 실시형태에서는 0.5mg/ml에서 시작하여 마이크로칩 위로 주입되는 샘플의 최종 농도는 MCE 시점에서 9μg/ml이다. 다른 실시형태에서, 샘플 시작 농도는 0.2mg/ml이다. 전기영동도에는 단백질 약물 및 불순물에 해당하는 피크가 포함되어 있다. 이 방법은 전기영동도에서 오염 물질 또는 불순물에 해당하는 피크를 식별함으로써 마무리된다.
2. 환원적 분석
또 다른 실시형태에서는 단백질 약물 샘플에서 오염물질 또는 불순물을 식별하기 위한 환원성 MCE법을 제공합니다. 이 방법은 상기 설명된 환원성 완충용액 중 어느 하나에 단백질 약물 샘플을 첨가하여 완충된 단백질 약물 샘플을 형성하는 것으로 시작된다. 완충된 단백질 약물 샘플을 65 내지 85℃, 바람직하게는 75℃로 10분 동안 가열하여 완충된 단백질 약물 샘플을 변성시켜 변성된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 다른 실시형태에서는, 완충된 단백질 약물 샘플을 50 내지 72℃ 또는 45 내지 75℃, 바람직하게는 60℃로 10분 동안 가열되어 완충된 단백질 약물 샘플을 변성시켜 변성된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 완충된 단백질 약물 샘플은 63℃로 10분 동안 가열된다. 목표 단백질 약물 샘플의 변성에 필요한 온도는 목표 단백질 약물 샘플의 구조에 따라 달라질 수 있다.
표지가 추가된 단백질 약물 샘플은 이후 30 내지 40℃로 20 내지 40분, 10 내지 20분 또는 10 내지 40분 동안 가열하여 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성한다. 한 실시형태에서, 표지가 추가된 단백질 약물 샘플은 35℃로 30분 동안 가열된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 표지가 추가된 단백질 약물 샘플은 35℃로 15분 동안 가열된다. 선택 사항으로, 예를 들어 스핀 필터를 사용하는 등의 방식으로 과잉 표지를 샘플에서 제거한다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 ??칭되지 않는다. 또 다른 실시형태에서는, 과잉 표지가 제거되지 않는다. 바람직한 검출가능한 표지에는 Dyomics DY-631 NHS Ester가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 다른 염료, 형광단, 발색단, 질량 태그, 퀀텀 닷 등과 미국 특허 번호 6,924,372에 개시된 검출가능한 표지를 포함하는 다른 검출가능한 표지를 사용할 수 있다.
한 실시형태에서, 샘플 농도에 대해 확립된 분석 범위는 0.4mg/ml 내지 0.6mg/ml이며, 이는 마이크로칩 모세관 전기영동 시스템 상에서 전기영동도를 생성하기 위해 MCE 분석의 대상이 되는 최종 분석 농도 7μg/ml 내지 11μg/ml에 해당한다. 다른 실시형태에서, 샘플 농도에 대해 확립된 분석 범위는 0.2mg/ml 내지 0.6mg/ml이며, 이는 마이크로칩 모세관 전기영동 시스템 상에서 전기영동도를 생성하기 위해 MCE 분석의 대상이 되는 최종 분석 농도 약 3.6μg/ml 내지 11μg/ml에 해당한다. 이 방법은 전기영동도에서 단백질 약물, 오염물질 및/또는 불순물에 해당하는 피크를 식별함으로써 마무리된다.
C.
기기
공개된 MCE 분석을 수행하기 위한 기기는 상업적으로 이용 가능한 기기이다. 실시형태에서, 공개된 MCE 분석은 LabChip GXII 또는 LabChip GXII Touch HT 및 LabChip® HT Protein Express Chip을 사용하여 수행된다.
III.
관심 단백질
공개된 MCE 분석 및 시약으로 분석된 관심 단백질, 예를 들어 단백질 약물은 원핵 또는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 임의의 관심 단백질일 수 있으며, 제공된 조작된 숙주 세포 시스템에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 단백질에는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 키메라 항체 또는 그 항원 결합 단편, ScFv 또는 그 단편, Fc-융합 단백질 또는 그 단편, 성장 인자 또는 그 단편, 사이토카인 또는 그 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 그 단편이 표함되지만 그로 국한되지 않는다. 관심 단백질은 하나의 하위 단위로 구성된 단순한 폴리펩티드일 수도 있고, 두 개 이상의 하위 단위로 구성된 복잡한 다중 하위 단위 단백질일 수도 있다. 관심 단백질은 바이오 의약품, 식품 첨가물이나 방부제, 그리고 정제 및 품질 표준이 적용되는 모든 단백질 제품일 수 있습니다.
일부 실시형태에서, 단백질 약물(관심 단백질)은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체이다. 한 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 한 실시형태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 한 실시형태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 한 실시형태에서, 항체는 키메릭 IgG2/IgG4 항체이다. 한 실시형태에서, 항체는 키메릭 IgG2/IgG1 항체이다. 한 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
실시형태는 임의의 알려진 치료용 항체 치료제와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 항-프로그래밍된 세포 사멸 1 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0203579A1에 기재된 바와 같은 항-PD1 항체), 항-프로그래밍된 세포 사멸 리간드-1(예를 들어,미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0203580A1에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포에틴-2 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,402,898에 기재된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항-안지오포에틴-유사 3 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,018,356에 기재된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,265,827에 기재된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,302,015에 기재된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0313194A1에 기재된 바와 같은 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,132,192에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체. 출원 공개 번호 US2015/0259423A1에 기재된 바와 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-프로프로테인 전환효소 서브틸리신 켁신-9 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 8,062,640 또는 미국 특허 번호 9,540,449에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,871,209 또는 9,260,515에 기재된 바와 같이 또한 항-미오스타틴 항체로도 알려져 있는 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0337045A1 또는 US2016/0075778A1에 기재된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터루킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0271681A1 또는 미국 특허 번호 8,735,095 또는 8,945,559에 기재된 바와 같은 항-IL4R 항체), 항-인터루킨 6 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 7,582,298, 8,043,617 또는 9,173,880에 기재된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터루킨 33(예를 들어, 미국 특허 번호 9,453,072 또는 9,637,535에 기재된 바와 같은 항-IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 9,447,173에 기재된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3(예를 들어, 미국 특허 번호 9,447,173 및 9,447,173과 미국 특허 번호 62/222,605에 기재된 바와 같은 항-CD3 항체), 항-분화 클러스터 20(예를 들어, 미국 특허 번호 9,657,102 및 US20150266966A1, 및 미국 특허 번호 7,879,984에 기재된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-분화 클러스터-48(예를 들어, 미국 특허 번호 9,228,014에 기재된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체( 예를 들어, 미국 특허 번호 9,079,948에 기재된 바와 같음), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0337029A1에 기재된 바와 같은 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2016/0215040에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체(예를 들어, 항-LAG3 항체 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 US2016/0017029 및 미국 특허 번호 번호 8,309,088 및 9,353,176에 기재된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-단백질 Y 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체 (미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0088295A1 및 US20150266966A1에 기재된 바와 같음), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc 16 이중특이적 항체), 및 항-CD3 x 항-전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 관심 단백질은 카시리비맙, 임데비맙, 라불리주맙-cwvz, 앱식시맙, 아달리무맙, 아달리무맙-아토, 아도트라스투주맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아텔리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 카나키누맙, 카프로맙 펜데티드, 세르톨리주맙 페골, 세미플리맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에미시주맙-kxwh, 엠탄시네알리로쿠맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 파시누맙, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 인플릭시맙, 인플릭시맙-abda, 인플릭시맙-dyyb, 이필리무맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 네시투무맙, 네스바쿠맙, 니볼루맙, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레슬리주맙, 리누쿠맙, 리툭시맙, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 토실리주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 트레보그루맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 관심 단백질은 Fc 모이어티 및 또 다른 도메인(예를 들어, Fc-융합 단백질)을 포함하는 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 힌지 영역, 이에 이어 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다수 리간드에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 TRAP 단백질, 예컨대 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트; 미국 특허 번호 6,927,044 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는 아플리베르셉트 또는 ziv-아플리베르셉트; 미국 특허 번호 7,087,411 및 7,279,159 참조)이다. 다른 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 ScFv-Fc-융합 단백질이며, 이는 Fc 모이어티에 커플링된 항체의 하나 이상의 항원-결합 도메인(들), 예컨대 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편 중 하나 이상을 포함한다.
IV.
세포 배양물
공개된 MCE 검정 및 시약으로 검정된 단백질 약물은 생산된 세포 배양물이다. 세포 배양물은, "유가식 세포 배양물" 또는 "유가식 배양물"일 수 있으며, 이는 세포와 배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급되고 배양 동안 배양물에 개별 증분으로 배양 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생산 수확 여부에 관계 없이 추가적인 배양 영양소가 서서히 공급되는 회분식 배양을 지칭한다. 유가식 배양은 주기적으로 전체 배양물(세포 및 배지를 포함할 수 있음)은 제거되고 새로운 배지로 대체되는 "반-연속 유가식 배양"을 포함한다. 회분식 배양에서 세포 배양을 위한 모든 구성요소(동물 세포 및 모든 배양 영양소를 포함함)가 배양 공정의 시작 시 배양 용기에 공급된다는 점에서 유가식 배양은 단순한 "회분식 배양"과 구별된다. 관류 배양에서 세포는, 예를 들어 여과에 의해 배양물로 제한되고, 배양 배지는 연속적으로 또는 간헐적으로 배양 용기에 도입되고 배양 용기로부터 제거된다는 점에서 유가식 배양은 표준 유가식 배양 공정 동안 상청액이 배양 용기로부터 제거되지 않는 한 “관류 배양”과는 다르다. 그러나, 유가식 세포 배양 동안 테스트 목적을 위한 샘플의 제거가 고려된다. 유가식 공정은 최대 작업량 및/또는 단백질 생산에 도달하였다고 결정되고 이후 단백질이 수확될 때까지 계속된다.
세포 배양은 일반적으로 특정 성장 단계에서 세포를 지속적으로 성장시키는 데 사용되는 기술인 "연속 세포 배양"일 수 있다. 예를 들어, 세포의 지속적인 공급이 요구되거나, 특정 관심 단백질의 생산이 요구되는 경우, 세포 배양물을 특정 성장 단계에서 유지해야 할 수 있다. 따라서, 해당 특정 단계에서 세포를 유지하기 위하여 조건은 지속적으로 모니터링되고 이에 따라 조정되어야 한다.
세포는 세포 배양 배지에서 배양된다. 용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 전형적으로 탄수화물 에너지원, 필수(예를 들어, 페닐알라닌, 발린, 트레오닌, 트립토판, 메티오닌, 류신, 아이소류신, 라이신, 및 히스티딘) 및 비필수(예를 들어, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 및 타이로신) 아미노산, 미량 원소, 에너지원, 지질, 비타민 등과 같은 세포의 성장을 향상시키기 위해 필요한 영양소를 제공하는 포유동물 세포를 성장시키는 데 사용되는 영양 용액을 지칭한다. 배지는 동물-유래 추출물 대신에 효모-유래 추출물 또는 대두 추출물을 포함할 수 있다. 화학적으로 규정된 배지는 모든 화학적 구성요소가 알려진(즉, 알려진 화학 구조를 갖는) 세포 배양 배지를 지칭한다. 화학적으로 규정된 배지에는 동물-유래 구성요소, 예컨대, 혈청-유래 또는 동물-유래 펩톤이 전혀 없다. 일 실시형태에서, 배지는 화학적으로 규정된 배지이다.
용액은 또한 호르몬 및 성장 인자를 포함하여, 최소 속도 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 구성요소를 포함할 수 있다. 용액은 배양되는 특정 세포의 생존 및 증식에 최적화된 pH 및 염 농도로 제제화될 수 있다.
"세포주"는 세포의 연속 계대배양 또는 계대배양을 통해 특정 계통으로부터 유래된 세포 또는 세포들을 지칭한다. 용어 "세포"는 "세포 개체군"과 호환 가능하게 사용된다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포, 예컨대 박테리아 세포, 포유동물 세포, 인간 세포, 비-인간 동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 중국햄스터난소세포(CHO) (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, 예를 들어 Jurkat(T 림프구) 또는 Daudi(B 림프구), A431(표피), U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6®세포)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 CHO K1 세포이다.
V.
키트
한 실시형태에는 공개된 완충용액을 제조하기 위한 공개된 완충용액 또는 성분 중 하나 이상을 포함하는 키트가 제공된다. 키트에는 완충용액이나 성분을 담는 용기가 포함될 수 있다. 완충용액은 용액 상태이거나 동결건조된 형태일 수 있다. 키트는 선택적으로 동결건조 제제용 희석제 또는 용해용 용액이 담긴 두 번째 용기; 그리고 선택적으로 용액의 사용 또는 동결건조된 완충용액 또는 분말 성분의 용해 및/또는 사용에 대한 지침을 포함한다.
키트에는 완충용액, 희석제 및 필터 중 하나 이상을 포함하는 공개된 MCE 분석을 수행하는 데 필요한 추가 시약을 추가로 포함될 수 있다. 완충용액과 시약은 병, 바이알 또는 시험관에 들어 있을 수 있다.
다음 예시는 발명자가 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도로 제공되지 않는다.
실시예
실시예 1: 치료용 단백질의 순도 및 불순물 분석을 위한 MCE 분석.
방법 및 재료:
재료:
LabChip GXII 또는 LabChip GXII Touch HT 및 LabChip® HT Protein Express Chip이 모세관 전기영동 분리 및 데이터 수집에 사용되었다(Perkin Elmer). 상기 공개된 비환원성 및 환원성 변성 완충용액이 MCE 분석에 사용되었다.
방법:
마이크로칩 모세관 전기영동(MCE)은 공정 중 테스트, 로트 출하 및 안정성 표시에 적합한 단백질 순도 및 불순물 분석을 제공한다. 카시리비맙 및 임데비맙 단백질 샘플을 가열을 통해 샘플을 변성시키고 알킬화제(비환원) 또는 환원제(환원)와 함께 리튬 도데실설페이트(LDS)을 첨가하여 제조하였다. 이로 인해 생성된 샘플을 아민 에스테르 염료와 함께 배양하여 모든 자유 아민기를 공유결합적으로 표지하였다. 표지된 샘플은 마이크로칩에 주입하였으며, 전류를 가하여 샘플 구성 요소를 크기순(낮은 분자량에서 높은 분자량 순으로)으로 분리되었다. 레이저 유도 형광으로 검출 과정을 수행하여 전기영동도를 생성하였다. 전기영동도를 분석하여 존재하는 불순물 대비 샘플의 상대적 순도를 얻었다.
표 1은 첫 번째 MCE 분석에 사용될 샘플을 준비하기 위한 작업 흐름 절차를 나타낸다. 간단히 말하자면, 단백질 샘플을 0.5mg/ml로 희석하였다. 비환원성(NR) 또는 환원성(R) 변성 완충용액 1μl와 희석된 샘풀 4μl를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 샘플을 혼합하고 원심분리한 후 제품마다 지정된 온도(일반적으로 75℃)에서 10분 동안 가열하였다. 그 뒤 샘플을 시판되는 염료(예: PICO 염료라고도 불리는 Dyomics DY-631 NHS Ester) 5μM로 표지하였다. 샘플을 혼합하고 원심분리한 후 35℃에서 30분간 가열하였다. 이후, 표지된 샘플을 희석된 중지 용액 105μl로 희석하였다. 샘플을 LabChip GXII 또는 LabChip GXII Touch HT를 사용하여 분리하였다.
| 샘플 제조 | |
| NR | R |
| 0.5mg/mL 샘플 4μl | 0.5mg/mL 샘플 4μl |
| NR 완충용액 1μL | R 완충용액 1μL |
| 혼합 및 원심분리 후 지정된 온도에서 10분간 가열 | |
| 샘플 라벨링 | |
| 변성된 샘플 5μL | |
| 5μM PICO 염료 5μL | |
| 혼합 및 원심분리 후 35℃에서 30분간 가열 | |
| 최종 희석 | |
| 표지된 샘플 5μL | |
| 희석된 중지 용액 105 μL | |
| 분리 방법 | |
| HT PICO 단백질 익스프레스 200 | |
표 2는 두 번째 MCE 분석에 사용될 샘플을 준비하기 위한 작업 흐름 절차를 나타낸다. 간단히 말하자면, 단백질 샘플을 0.5 또는 2mg/ml로 희석하였다. 비환원성(NR) 또는 환원성(R) 변성 완충용액 10μl와 희석된 샘풀 40μl를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 샘플을 혼합하고 원심분리한 후 제품마다 지정된 온도(일반적으로 60℃)에서 10분 동안 가열하였다. 그 뒤 샘플을 시판되는 염료(예: Dyomics DY-631 NHS Ester) 16μM로 표지하였다. 샘플을 혼합하고 원심분리한 후 35℃에서 15분간 가열하였다. 이후, 표지된 샘플을 105μl의 희석된 중지 용액 또는 희석된 용액으로 희석하였다. 샘플을 LabChip GXII 또는 LabChip GXII Touch HT를 사용하여 분리하였다.
실시예 1A: 비환원성 완충용액
샘플 제조 단계에서 2-아이오도아세트아마이드 166mM, 리튬 도데실설페이트 0.81%, 그리고 인산나트륨 81mM을 포함하며 pH가 6인 비환원성 전기영동 샘플 완충용액을 사용하여 표 1에 제시된 일반적인 제조 방법을 따랐다. 샘플을 75℃에서 10분 동안 가열하였다. 샘플 표지 단계에서는 5μM 염료 용액을 사용하였다. 최종 희석 단계에서는 희석된 중지 용액 105μL을 사용하였다.
실시예 1B: 환원성 완충용액
샘플 제조 단계에서 리튬 도데실설페이트 0.69%, 인산나트륨 69mM, 그리고 디티오트레이톨 142mM을 포함하며 pH가 9인 환원성 전기영동 샘플 완충용액을 사용하여 표 1에 제시된 일반적인 제조 방법을 따랐다. 샘플을 75℃에서 10분 동안 가열하였다. 샘플 표지 단계에서는 5μM 염료 용액을 사용하였다. 최종 희석 단계에서는 희석된 중지 용액 105μL을 사용하였다.
| 샘플 제조 | |
| NR | R |
| 0.2mg/mL 샘플 40μl | 0.2mg/mL 샘플 40μl |
| NR 완충용액 10μL | R 완충용액 10μL |
| 혼합 및 원심분리 후 지정된 온도에서 10분간 가열 | |
| 샘플 라벨링 | |
| 변성된 샘플 5μL | |
| 16μM PICO 염료 16μL | |
| 혼합 및 원심분리 후 35℃에서 15분간 가열 | |
| 최종 희석 | |
| 표지된 샘플 5μL | |
| 희석된 중지 용액 또는 희석된 용액 105 μL | |
| 분리 방법 | |
| HT PICO 단백질 익스프레스 200 | |
완충용액
인산나트륨 일염기 일수화물 200mM, 인산나트륨 이염기 칠수화물 200mM 및 10% 리튬 도데실설페이트(LDS)의 저장 용액을 준비하였다. 그 대안으로, 상업적으로 준비된 pH 8의 인산나트륨 완충용액을 사용하였다.
저장 용액과 Milli-Q® 물을 사용하여 100mM 인산나트륨 1% LDS pH 6 및 100mM 인산나트륨 1% LDS pH 9 용액을 제조하였다.
저장 용액과 Milli-Q 물을 사용하여 만들어진 대안 완충용액으로 100mM 인산나트륨 2% LDS pH 6 및 100mM 인산나트륨 2% LDS pH 8 용액이 있다.
비환원성 완충용액은 1M 아이오도아세트아마이드(IAM)(Milli-Q® 물을 사용해 새로 제조됨) 34μL + 100mM 인산나트륨 1% LDS pH 6 166μL + Milli-Q® 물 5μL을 첨가하여 준비되었다. 최종 농도는 2-아이오도아세트아마이드 166mM, 리튬 도데실설페이트 0.81%, 그리고 인산나트륨 81mM이었다.
1M 아이오도아세트아마이드(IAM)(Milli-Q® 물을 사용해 새로 제조됨) 800μL + 100mM 인산나트륨 2% LDS pH 8 1200μL을 첨가해 대안 비환원성 완충용액을 준비하였다. 최종 농도는 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM이었다.
1M 아이오도아세트아마이드(IAM)(Milli-Q® 물을 사용해 새로 제조됨) 800μL + 100mM 인산나트륨 2% LDS pH 6 1200μL을 첨가해 또 다른 대안 비환원성 완충용액을 준비하였다. 최종 농도는 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM이었다.
환원성 완충용액은 10x 환원제(500mM 디티오트레이톨(DTT)) 68μL + 100mM 인산나트륨 1% LDS pH 9 166μL + Milli-Q® 물 6μL을 첨가하여 준비되었다. 최종 농도는 리튬 도데실설페이트 0.69%; 인산나트륨 69mM, 그리고 디티오트레이톨 142mM이었다.
10x 환원제(500mM 디티오트레이톨(DTT)) 320μL + 100mM 인산나트륨 2% LDS pH 8 1200μL + Milli-Q® 물 480μL을 첨가하여 대안 환원성 완충용액이 준비되었다. 최종 농도는 리튬 도데실설페이트 1.2%; 인산나트륨 60mM, 그리고 디티오트레이톨 80mM이었다.
실시예 2A: 비환원성 완충용액
샘플 제조 단계에서 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM을 포함하며 pH가 8인 비환원성 전기영동 샘플 완충용액을 사용하여 표 2에 제시된 일반적인 제조 방법을 따랐다. 샘플을 60℃에서 10분 동안 가열하였다. 샘플 표지 단계에서는 16μM 염료 용액을 사용하였다. 최종 희석 단계에서는 희석된 중지 용액 105μL을 사용하였다.
실시예 2B: 환원성 완충용액
샘플 제조 단계에서 리튬 도데실설페이트 1.2%, 인산나트륨 60mM, 그리고 디티오트레이톨 80mM을 포함하며 pH가 8인 환원성 전기영동 샘플 완충용액을 사용하여 표 2에 제시된 일반적인 제조 방법을 따랐다. 샘플을 60℃에서 10분 동안 가열하였다. 샘플 표지 단계에서는 16μM 염료 용액을 사용하였다. 최종 희석 단계에서는 희석된 중지 용액 105μL을 사용하였다.
실시예 2C: 비환원성 완충용액, ??칭 미실시
샘플 제조 단계에서 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 그리고 인산나트륨 60mM을 포함하며 pH가 6인 비환원성 전기영동 샘플 완충용액을 사용하여 표 2에 제시된 일반적인 제조 방법을 따랐다. 샘플을 63℃에서 10분 동안 가열하였다. 샘플 표지 단계에서는 16μM 염료 용액을 사용하였다. 최종 희석 단계에서는 희석된 용액 105μL을 사용하였다.
실시예 2D: 환원성 완충용액, ??칭 미실시
샘플 제조 단계에서 리튬 도데실설페이트 1.2%, 인산나트륨 60mM, 그리고 디티오트레이톨 80mM을 포함하며 pH가 8인 환원성 전기영동 샘플 완충용액을 사용하여 표 2에 제시된 일반적인 제조 방법을 따랐다. 샘플을 63℃에서 10분 동안 가열하였다. 샘플 표지 단계에서는 16μM 염료 용액을 사용하였다. 최종 희석 단계에서는 희석된 용액 105μL을 사용하였다.
결과:
마이크로칩 모세관 전기영동(Microchip Capillary Electrophoresis, MCE)를 사용하면 QC 분석에 필요한 성능 및 재현성 기준을 유지하면서도 샘플 분석 시간을 크게 줄일 수 있다. 본원에 개시된 비환원성 및 환원성 변성 완충용액을 사용하여 MCE 분석이 개발되었다. 도 1a-1b는 첫 번째 MCE 분석에서 비환원 샘플과 환원 샘플 내 단백질의 대표적인 전기영동도를 보여준다. 도 1a는 비환원 분석의 전기영동도를 보여준다. 0.426에 위치한 주요 피크(MP)는 주요 항체에 해당하고, 표지된 저분자량(LMW) 피크는 항체 단편에 해당한다. 이 예에서는 존재하지 않지만, 일부 사례에서 하나 이상의 고분자량 단편에 해당하는 피크가 존재하기도 한다. 도 1b는 환원 분석의 전기영동도를 보여준다. 경쇄(LC), 중쇄, 비당화 중쇄(NGHC), 저분자량(LMW) 및 고분자량(HMW) 항체 단편에 해당하는 피크를 알맞게 표지하였다. 제품마다 생성된 전기영동도가 다를 수 있으므로 표지 규칙도 다를 수 있다는 점에 유의해야 한다.
전술한 명세서에서 본 발명이 그의 일부 실시양태와 관련하여 기재되었고 많은 세부사항들이 예시 목적으로 제시되었지만, 본 발명이 추가적인 실시양태를 허용할 수 있고, 본원에 기재된 세부사항들 중 일부는 본 발명의 기본 원리에서 벗어남이 없이 상당히 변화될 수 있다는 것이 관련 분야의 숙련자에게는 명백할 것이다.
본 발명은 그의 정신 또는 본질적 속성으로부터 벗어남이 없이 다른 특정한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위를 지시하는 것으로서는 상기 명세서보다 첨부된 청구범위를 참고해야 한다.
Claims (25)
- 전기영동 샘플 완충용액으로서,
2-아이오도아세트아마이드 155 내지 200mM;
리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%; 및
인산나트륨 60 내지 95mM을 포함하며,
상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH가 8 이하인 완충용액. - 제1항에 있어서, 상기 pH가 6인 완충용액.
- 제1항에 있어서, 2-아이오도아세트아마이드 200mM, 리튬 도데실설페이트 1.2%, 및 인산나트륨 60mM을 포함하는 완충용액.
- 전기영동 샘플 완충용액으로서,
2-아이오도아세트아마이드 165.9mM,
리튬 도데실설페이트 0.81%, 및
인산나트륨 81mM을 포함하며,
상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH가 6.0인 완충용액. - 전기영동 샘플 완충용액으로서,
2-아이오도아세트아마이드 200mM,
리튬 도데실설페이트 1.2%, 및
인산나트륨 60mM을 포함하며,
상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH가 6.0인 완충용액. - 전기영동 샘플 완충용액으로서,
2-아이오도아세트아마이드 200mM,
리튬 도데실설페이트 1.2%, 및
인산나트륨 60mM을 포함하며,
상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH가 8.0인 완충용액. - 전기영동 샘플 완충용액으로서,
리튬 도데실설페이트 0.50 내지 1.5%;
인산나트륨 45 내지 75mM,
디티오트레이톨 80 내지 155mM을 포함하며,
상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH가 8 이상인 완충용액. - 제7항에 있어서, 상기 pH가 8인 완충용액.
- 제7항에 있어서, 상기 pH가 9인 완충용액.
- 제8항에 있어서, 디티오트레이톨을 80mM 포함하는 완충용액.
- 제8항에 있어서, 디티오트레이톨을 142mM 포함하는 완충용액.
- 제7항에 있어서, 추가로 리튬 도데실설페이트 1.2% 및 인산나트륨 60mM을 포함하는 완충용액.
- 전기영동 샘플 완충용액으로서,
리튬 도데실설페이트 0.69%;
인산나트륨 69mM, 및
디티오트레이톨 80 내지 155mM로 이루어져 있으며,
상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH가 9.0인 완충용액. - 전기영동 샘플 완충용액으로서,
리튬 도데실설페이트 1.2%;
인산나트륨 60mM, 및
디티오트레이톨 80mM로 이루어져 있으며,
상기 전기영동 샘플 완충용액의 pH가 8.0인 완충용액. - 단백질 약물 샘플로부터 오염물 또는 불순물을 식별하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
상기 단백질 약물 샘플을 제1항의 상기 완충용액에 첨가하여 완충된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계;
상기 완충된 단백질 약물 샘플을 45 내지 75℃로 5 내지 15분 동안 가열하여 변성된 완충 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계;
검출가능한 표지를 상기 변성된 완충 단백질 약물 샘플에 첨가하고 30 내지 40℃에서 10 내지 40분간 가열하여 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계;
상기 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 희석하고 마이크로칩 모세관 전기영동 시스템 상에서 MCE 과정을 거쳐 희석된 단백질 약물 샘플을 분리하여 전기영동도를 생성하는 단계; 그리고
상기 전기영동도에서 단백질 약물, 오염물 및/또는 불순물에 해당하는 피크를 식별하는 단계를 포함하는 방법. - 제15항에 있어서, 상기 완충된 단백질 약물 샘플을 60℃에서 10분간 가열하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 표지된 단백질 약물 샘플을 35℃에서 15분간 가열하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 희석된 단백질 약물 샘플이 3.6μg/ml인 방법.
- 단백질 약물 샘플로부터 오염물 또는 불순물을 식별하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
상기 단백질 샘플을 제5항의 상기 완충용액에 첨가하여 완충된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계;
상기 완충된 단백질 약물 샘플을 45 내지 75℃로 5 내지 15분 동안 가열하여 변성된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계;
검출가능한 표지를 상기 변성된 단백질 약물 샘플에 첨가하고 30 내지 40℃에서 10 내지 40분간 가열하여 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 형성하는 단계;
상기 변성 및 표지된 단백질 약물 샘플을 희석하고 마이크로칩 모세관 전기영동 시스템 상에서 MCE 분석을 거쳐 전기영동도를 생성하는 단계; 그리고
상기 전기영동도에서 오염물 또는 불순물에 해당하는 피크를 식별하는 단계를 포함하는 방법. - 제19항에 있어서, 상기 완충된 단백질 약물 샘플을 60℃에서 10분간 가열하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 샘플을 35℃에서 15분간 가열하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 희석된 단백질 약물 샘플이 3.6μg/ml인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 DY-631 N-하이드록실석신이미딜 에스테르인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 검출가능한 표지를 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용해 복원시킨 후, 인산나트륨 200mM pH 7.2 완충용액으로 희석하는 방법.
- 제1항에 따른 완충용액 및
상기 완충용액에서 전기영동을 위한 샘플을 준비하기 위한 서면 지침을 포함하는 키트.
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