KR20230021663A - 항인간 뉴로텐신 수용체 1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항인간 뉴로텐신 수용체 1 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 중쇄 가변 도메인(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하되, 항체가 인간 뉴로텐신 수용체 1(hNTSR1)에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체.

Description

항인간 뉴로텐신 수용체 1 항체 및 이의 용도
이 출원은 2020년 6월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 63/036,740에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
단클론항체(mAb)는 암 및 전염병과 같은 질병의 치료에서 및 분자 생물학, 제약 및 의학 연구를 포함하는 여러 분야에서 중요한 도구가 되었다. Baert et al., N Engl J Med, 2003. 348(7): p. 601-8; Cavalli-Bjorkman et al., Med Oncol, 2002. 19(4): p. 277-80; 및 Plosker and Figgitt, Drugs, 2003. 63(8): p. 803-43을 참고한다. 지난 10년 동안, 다양한 종양 유형의 특정 항원 또는 세포 표면 수용체를 표적으로 하는 단일특이적 항체가 상당한 성공을 거두었고, 암 치료의 최전선에 있어 왔다.
항체-약물 접합체(ADC)는 화학 링커에 의해 세포독성 화합물에 연결된 항체로 구성된 매우 강력한 생물약학적 약물의 새로운 클래스이다. 이 새로운 표적 제제는, 세포독성 약물을 사용하여, 건강한 조직과 암 조직 사이에서 민감한 선택을 허용하는 항체의 고유한 표적 기능을 보여준다. ADC는, 암 특이적이지만 세포독성이 충분하지 않은 mAb의 높은 특이성, 성질 및 항종양 활성, 및 너무 독성이 강하여 독자적으로 사용하기에는 세포독성 소분자 약물의 강력한 세포 살상 활성으로 구성되는 혁신적인 치료 도구를 나타낸다. 최소 5개의 ADC가 시장 승인을 받았으며, 현재 80개 초과의 ADC가 임상 시험 중에 있다. Abdollahpour-Alitappeh, et al., Antibody-drug conjugates (ADCs) for cancer therapy: Strategies, challenges, and successes. J Cell Physiol, 2018을 참조한다. 첨단 기술의 발전에 따라, ADC가 향후 항암치료제 시장을 장악할 것으로 기대된다.
뉴로텐신 수용체 1(NTSR1)의 리간드인 뉴로텐신(NTS)은 신경계와 말초 조직에서 발견되는 짧은 펩타이드이다. Carraway and Leeman, J Biol Chem, 1973. 248(19): p. 6854-61을 참조한다. NTS는 광범위한 생물학적 활성을 나타내며, 파킨슨병 및 정신분열병의 발병기전, 도파민 신경전달의 조절, 저체온증, 항통각수용 및 암 세포의 성장을 촉진시키는 데에 있어 중요한 역할을 한다. Bissette, G., et al., Nature, 1976. 262(5569): p. 607-9; Carraway and Plona, Peptides, 2006. 27(10): p. 2445-60; Griebel and Holsboer, Nat Rev Drug Discov, 2012. 11(6): p. 462-78; Kitabgi, Curr Opin Drug Discov Devel, 2002. 5(5): p. 764-76; 및 Schimpff et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2001. 70(6): p. 784-6을 참조한다. 3개의 뉴로텐신 수용체(NTSR)가 확인되었다. NTSR1 및 NTSR2는 클래스 A GPCR 패밀리에 속하는 한편, NTSR3(SORT1이라고도 함)은 단일 막관통 도메인을 갖는 sortilin 패밀리의 구성원이다. Tanaka et al., Neuron, 1990. 4(6): p. 847-54; Chalon et al., FEBS Lett, 1996. 386(2-3): p. 91-4; 및 Mazella, Cell Signal, 2001. 13(1): p. 1-6을 참조한다. NTS의 알려진 효과의 대부분은, Gq 단백질을 통해 우선적으로 신호를 보내는 NTSR1을 통해 매개된다. Kitabgi, Curr Opin Drug Discov Devel, 2002. 5(5): p. 764-76을 참조한다.
뉴로텐신 및 이의 동족 수용체는 신생물 과정 동안 자주 탈조절되는 신경펩타이드-수용체 복합체이다. 뉴로텐신 수용체 1(NTSR1)은 중피종, 비소세포 폐암, 간암, 유방암 및 두경부 편평암종과 같은 공격적인 악성 고형 종양에서 암 진행을 향상시킬 수 있다고 보고되었다. Alifano et al., Biochimie, 2010. 92(2): p. 164-70; Alifano et al., Clin Cancer Res, 2010. 16(17): p. 4401-10; Wu, Z., et al., Cancer Lett, 2017. 388: p. 73-84; Dupouy et al., PLoS One, 2009. 4(1): p. e4223; 및 Shimizu et al., Int J Cancer, 2008. 123(8): p. 1816-23을 참조한다. NTSR1은 환자 조직 염색을 기반으로 한 비소세포 폐암 및 전립선암에 대한 유망한 분자 마커이다. He et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2019 46(10):2199-2207; 및 Alifano et al., Clin Cancer Res, 2010. 16(17): p. 4401-10을 참조한다. NTSR1 활성화는 또한 결장암, 전립선 암 및 췌장암 세포주에서 EGFR 수용체를 트랜스-활성화한다. Amorino et al., Oncogene, 2007. 26(5): p. 745-56; 및 Muller et al., BMC Cancer, 2011. 11: p. 421을 참조한다. 최근 게놈 차원의 연관성 연구에서도, NTSR1이 비소세포 폐암(NSCLC) 환자의 예후에 역할을 할 수 있음이 밝혀졌다. Chang et al., Am J Respir Crit Care Med, 2017. 195(5): p. 663-673을 참조한다. NTS 및 NTSR1은 간세포 암종(HCC)의 50% 초과에서 비정상적으로 발현된다. NTS 또는 NTSR1 mRNA의 증가된 발현은 불량한 환자 결과와 상관관계가 있다. Wu et al., Cancer Lett, 2017. 388: p. 73-84.
따라서, NTSR1은 암 치료의 잠재적 표적이다. 발암 및 암 재발은 NTSR1의 활성을 억제함으로써 감소될 수 있다.
일 측면에서, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 중쇄 가변 도메인(VH); 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하되, 항체가 인간 뉴로텐신 수용체 1(hNTSR1)에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체가 본원에 기재된다. 예를 들어, 항체는 hNTSR1의 2차 세포외 루프에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 TT28, F29, T30, S31, S32A, I51, P53A, N54, S55, G56, N57, T58, Y60, N61, E62, K63, F64, K65, V66A, Y100, D104 및 Y105로부터 선택된 위치에서 서열번호 1 내의 하나 이상의 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체는 G96, S97, H98 및 P100으로부터 선택된 위치에서 서열번호 2 내의 하나 이상의 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열 번호 3) 또는 GYAFTSSWIH(서열 번호 4); 중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); 중쇄 CDR3: ARYYYGFDY(서열번호 6), ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8); 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및 경쇄 CDR3: FQGSHLPWT(서열번호 11) 또는 FQGAHLPWT(서열번호 12)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열번호 3); 중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); 중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8); 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및 경쇄 CDR3: FQGSHLPWT(서열번호 11)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열번호 3); 중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); 중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8); 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및 경쇄 CDR3: FQGAHLPWT(서열번호 12)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 CDR1: GYAFTSSWIH(서열번호 4); 중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); 중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8); 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및 경쇄 CDR3: FQGAHLPWT(서열번호 12)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열번호 3); 중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); 중쇄 CDR3: ARYYYGFDY(서열번호 6); 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및 경쇄 CDR3: FQGSHLPWT(서열번호 11)를 포함한다.
일부 실시예에서, 분리된 항체는 중쇄 CDR1: GYAFTSSWIH(서열번호 4); 중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); 중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7); 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및 경쇄 CDR3: FQGAHLPWT(서열번호 12)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열번호 13의 서열인 VH 서열; 및 서열번호 14의 서열인 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열번호 15의 서열인 VH 서열; 및 서열번호 16의 서열인 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 재조합 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, IgG1 항체 또는 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항-hNTSR1 항체 및 비-항체 분자를 포함하는 항체 접합체가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 비-항체 분자는 폴리펩타이드, 중합체, 올리고당, 지질, 당지질, 고체 지지체, 소분자 약물, 비오틴, 핵산 분자, 담체 단백질 또는 검출 가능한 표지이다.
일부 실시양태에서, 항체 접합체는 항체-약물 접합체이고, 비-항체 분자는 hNTSR1을 발현하는 암 세포를 억제하거나 종양을 치료하기 위한 암 약물이다. 예를 들어, 암 약물은 모노메틸 오리스틴 E(MMAE)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양은 중피종, 폐 종양, 유방 종양, 두경부 편평 암종, 결장 종양, 췌장 종양, 전립선 종양 또는 간 암종이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항체-약물 접합체 및 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된다.
일 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 종양은 hNTSR1을 발현한다.
일부 실시양태에서, 종양은 중피종, 폐 종양, 유방 종양, 두경부 편평 암종, 결장 종양, 췌장 종양, 전립선 종양 또는 간 암종이다.
또 다른 측면에서, NTSR1을 발현하는 샘플 또는 조직 또는 세포에서 NTSR1을 검출하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 이 방법은 샘플, 조직 또는 세포를 본원에 기술된 임의의 항체 또는 항체 접합체와 접촉시키는 단계; 및 샘플 내의 표적에 대한 또는 조직 또는 세포에 대한 항체 또는 항체 접합체의 결합을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 성분을 코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 기재된다.
하나 이상의 실시양태의 세부사항은 첨부된 도면 및 아래의 설명에 기재되어 있다. 실시양태의 다른 특징, 목적 및 장점은 설명, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 7C3 mAb의 특성화를 나타내는 일련의 그래프이다. (A) ELISA에서 NTSR1의 사이클릭 ECL2 펩타이드에 대한 7C3 mAb의 결합. (B) 유동 세포측정법으로 측정된 A549 세포 상의 NTSR1에 대한 7C3(10μg/ml)의 결합.
도 2는 h7C3-3의 친화도 및 동역학 데이터를 나타내는 그래프이다. h7C3-3과 NTSR1 ECL2 펩타이드 사이의 결합 친화도는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정되었다.
도 3은 NTSR1을 과발현하는 다양한 암 세포주에 대한 안티-NTSR1 mAb의 내재화를 나타내는 일련의 그래프이다. 각각 4℃ 또는 37℃에서 여러 항체(10μg/ml)로 처리된, (A) A549, (B) H1299, (C) HA22T 및 (D) Mahlavu 세포의 유동 세포측정 분석.
도 4는 h7C3-4 변이체 항체의 특징을 보여주는 표 및 그래프를 포함한다. (A) h7C3-3 또는 h7C3-4의 등전점(pI) 및 결합 친화도. NTSR1 발현 A549 세포에 대한 h7C3-3 또는 h7C3-4의 결합은 0.5㎍/ml의 농도에서 유동 세포측정법으로 측정되었다. (B) BLTW:CD1(ICR) 마우스에서 항체의 약동학. 단일 정맥 투여(10mg/kg) 후 시간 프로필에 기초한 항체의 혈청 농도. 마우스 혈청 내 h7C3-3 또는 h7C3-4 항체의 농도를 ELISA로 분석하였다.
도 5는 인간화 h7C3-4 및 h7C3-5 항체의 특성화를 나타낸다. h7C3-4 및 h7C3-5의 중쇄(A) 및 경쇄(B) 아미노산 서열 정렬. 돌연변이된 잔기는 굵게 표시되고, CDR 서열은 Kabat 정의에 따라 정의된다. (C) 유동 세포측정법으로 측정된 A549 세포 상의 NTSR1에 대한 h7C3-4 및 h7C3-5의 결합. h7C3-4 중쇄(서열번호 13); h7C3-4 경쇄(서열번호 14); h7C3-5 중쇄(서열번호 15); h7C3-5 경쇄(서열번호 16).
도 6은 (A) h7C3-3-MMAE 및 (B) h7C3-4-MMAE 접합체의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 분석을 보여주는 일련의 그래프이다. "DAR:0", "DAR:2", "DAR:4", "DAR:6" 및 "DAR:8"은 각각 항체당 0, 2, 4, 6 및 8개의 MMAE 분자가 부착된 접합체의 이성질체를 나타낸다.
도 7은 A549 세포에 대한 h7C3-3 및 h7C3-3-MMAE의 내재화 효율을 보여주는 일련의 그래프이다. (A) A549 암 세포에 대한 h7C3-3 및 h7C3-3-MMAE의 결합 친화도를 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후 유동 세포측정법으로 측정하였다. 세포 분포는 오른쪽에 있다. (B 및 C) NTSR1-발현 A549 암 세포에 대한 1 ㎍/ml 농도에서 h7C3-3 및 h7C3-3-MMAE의 내재화 효율을 평가하기 위해 유동 세포측정 분석을 적용하였다. 세포를 얼음 위에서 항체와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체는 씻겨나갔다. 그런 다음, 실험군을 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 수확 후, 세포를 FITC 접합된 항인간 IgG로 염색하고, 유동 세포측정 분석을 실시하였다. 세포 분포의 내재화는 왼쪽에 있다.
도 8은 다양한 암 세포주에서 h7C3-3-MMAE의 시험관 내 세포독성 효과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 9는 다양한 암 세포주에서 h7C3-4-MMAE의 시험관 내 세포독성 효과를 나타내는 그래프 및 표를 포함한다.
도 10은 다양한 암 세포주에서 h7C3-5-MMAE의 시험관 내 세포독성 효과를 나타내는 그래프 및 표를 포함한다.
도 11은, H1299 폐 종양 이종이식 모델에서 7mg/kg 용량의 시스플라틴과 비교하여, 10mg/kg 용량의 h7C3-3-MMAE, h7C3-4 및 h7C3-4-MMAE의 효능을 나타내는 일련의 그래프이다. (A) h7C3-3-MMAE 및 h7C3-4-MMAE의 항종양 효능은 종양 부피에서의 변화와 함께 나타난다. (B) 두 그룹 모두 체중 감소를 나타내지 않았다.
도 12는 HA22T-Luc 간 종양 이종이식 모델에서 10mg/kg 용량의 안티-NTSR1 h7C3-3-MMAE 및 h7C3-4-MMAE의 효능을 보여주는 일련의 그래프이다. (A) h7C3-3-MMAE 및 h7C3-4-MMAE의 항종양 효능은 종양 부피에서의 변화와 함께 나타난다. (B) 두 그룹 모두 체중 감소를 나타내지 않았다.
도 13은 PC3 전립선 종양 이종이식 모델에서 10mg/kg 용량의 안티-NTSR1 h7C3-4-MMAE의 효능을 나타내는 일련의 그래프이다. (A) h7C3-4-MMAE의 항종양 효능은 종양 부피에서의 변화와 함께 나타난다. (B) 치료가 체중 감소를 일으키지 않았다.
도 14는 2μg/ml B-12, 7C3, h7C3-2 또는 h7C3-3 항체를 사용하는 이종이식 PC-3 전립선 암 조직의 면역조직화학적 염색을 나타내는 일련의 이미지이다. 치료 없이 PC-3 이종이식 마우스에서 고형 종양을 절제한 다음, NTSR1에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학 염색을 실시하였다. 이미지는 50 X 및 100 X 배율로 촬영되었다.
상세 설명
인간 NTSR1 및 이의 접합체에 결합하는 신규 항체가 본원에 기재된다.
각각의 안티-NTSR1 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 75%(예를 들어, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 동일한 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 75%(예를 들어, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함할 수 있다.
서열번호 1
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTSSWIHWAKQRPGQGLEWIGQIRPNSGNTYYNEKFKVKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARYYYGFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 2
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHLPWTFGGGTKLEIKR
항체는 각각 T28, F29, T30, S31, S32A, I51, P53A, N54, S55, G56, N57, T58, Y60, N61, E62, K63, F64, K65, V66A, Y100, D104 및 Y105으로부터 선택된 위치에서 서열번호 1 내의 하나 이상의 치환을 가질 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 G96, S97, H98 및 P100으로부터 선택되는 위치에서 서열번호 2 내의 하나 이상의 치환을 가질 수 있다. 치환이 서열 번호: 1 및 2의 서열을 갖는 항체와 비교하여 NTSR1에 대한 항체의 결합 친화도를 유의하게 감소시키지 않는 한(예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이하까지), 아미노산 치환은 임의의 아미노산(예컨대, Ala)일 수 있다. NTSR1에 대한 항체의 결합 친화도는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 다양한 방법, 예를 들어, 세포 상의 NTSR1에 대한 또는 ECL2 펩타이드에 대한 결합을 사용하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티-NTSR1 항체는 GYTFTSSWIH(서열 번호: 3) 또는 GYAFTSSWIH(서열 번호: 4)의 서열을 갖는 중쇄 CDR1; QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5)의 서열을 갖는 중쇄 CDR2; ARYYYGFDY(서열번호 6), ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8)의 서열을 갖는 중쇄 CDR3; RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9)의 서열을 갖는 경쇄 CDR1; KVSNRFS(서열번호 10)의 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 FQGSHLPWT(서열번호 11) 또는 FQGAHLPWT(서열번호 12)의 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체(예를 들어, h7C3-1)는 GYTFTSSWIH(서열번호 3); QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8); RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); KVSNRFS(서열번호 10); 및 경쇄 CDR3: FQGSHLPWT(서열번호 11)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체(예를 들어, h7C3-2)는 GYTFTSSWIH(서열번호 3); QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8); RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); KVSNRFS(서열번호 10); 및 FQGAHLPWT(서열번호 12)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체(예를 들어, h7C3-3, h7C3-4, 또는 h7C3-5)는 GYAFTSSWIH(서열번호 4); QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8); RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); KVSNRFS(서열번호 10); 및 FQGAHLPWT(서열번호 12)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체(예를 들어, h7C3)는 GYTFTSSWIH(서열번호 3); QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5); ARYYYGFDY(서열번호 6); RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9); KVSNRFS(서열번호 10); 및 FQGSHLPWT(서열번호 11)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열번호 13 또는 15의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 14 또는 16의 서열을 갖는 VL을 포함한다.
서열번호 13
QVQLQQPGTVLVRPGASVKLSCKASGYAFTSSWIHWAKQRPGQGLEWIGQIRPNSGNTYYNEKFKVKATLTVDTSSSTAYVELSSLTSEDSAVYYCARYHYGFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 14
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEAEDLGVYYCFQGAHLPWTFGGGTKLEIKR
서열번호 15
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTSSWIHWVRQAPGQRLEWMGQIRPNSGNTYYNEKFKVRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYHYGFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 16
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGAHLPWTFGGGTKVEIKR
본원에서 사용되는 "항체"라는 용어는, 단일클론 항체, 다클론 항체, 전장 항체 또는 이의 단편, Fc 영역을 포함하는 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단쇄 항체, scFV 다량체, 1가 항체, 다가 항체, 인간화 항체 및 키메라 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 항원-결합 활성을 갖는 다양한 항체 구조를 포함한다.
본원에 개시된 항체 CDR 서열에 기초하여, 숙련된 실무자는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 재조합 방법을 사용하여 다양한 형태로 안티-NTSR1 항체를 생산할 수 있을 것이다.
또한 본원에 기재된 안티-NTSR1 항체 중 하나 또는 이의 성분을 코딩하는 분리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터)가 본원에서 고려된다. 핵산을 함유하는 숙주 세포도 본원에서 제공된다. 핵산 분자 및 숙주 세포는 안티-NTSR1 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 안티-NTSR1 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 항체 접합체를 형성하기 위해 비-항체 분자에 접합될 수 있다. 비-항체 분자는 예를 들어 폴리펩타이드, 중합체, 올리고당, 지질, 당지질, 고체 지지체(예: 비드 또는 플레이트), 소분자 약물(예: 세포독성 약물), 비오틴, 핵산 분자, 캐리어 단백질 또는 검출 가능한 라벨(예: 형광 라벨)일 수 있다. 비-항체 분자는 절단 가능한 링커(예: 발린-시트룰린) 또는 절단 불가능한 링커(예: N-말레이미도메틸사이클로헥산-1-카복실레이트(MCC) 또는 말레이미도카프로일 메르캅토아세트아미도카프로일)를 통해 항체에 연결될 수 있다. 이러한 항체 접합체는 암을 치료하거나 샘플에서 NTSR1을 검출하는 것과 같은 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 접합체는 항체-약물 접합체이며, 여기서 약물은 암 세포를 억제하거나 종양, 예를 들어 NTSR1을 발현하는 암 세포 또는 종양을 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 약물은 모노메틸 오리스틴 E(MMAE)이다.
본원에 기재된 임의의 항체 또는 항체 접합체는 NTSR1과 이의 리간드 사이의 결합을 억제하거나, NTSR1 기능을 억제하거나, 샘플에서 NTSR1 단백질 또는 이의 단편을 검출하거나(예를 들어, 면역분석에서), NTSR1을 발현하는 조직 또는 세포에 결합하거나(예를 들어, 세포를 확인하거나 NTSR1-발현 세포를 분리하기 위해), 암 세포 또는 종양의 성장을 억제하거나, 대상에서 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
용어 "샘플"은 임의의 생물학적 샘플, 예를 들어 체액 샘플, 혈액 샘플, 세포 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 또는 조직 샘플일 수 있다.
NTSR1을 발현하는 종양은 안티-NTSR1 항체 또는 이의 접합체의 잠재적 표적이 될 수 있다. 이러한 종양에는 중피종, 폐 종양, 유방 종양, 두경부 편평 암종, 결장 종양, 췌장 종양, 전립선 종양 또는 간 암종이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 임의로, 임의의 안티-NTSR1 항체 또는 접합체를 피험자에게 투여하기 전, 피험자의 종양이 NTSR1을 발현하는지 여부를 결정할 수 있다. 치료 방법은 단독으로 또는 다른 약물 또는 요법과 함께 수행할 수 있다.
"대상"은 인간 또는 인간이 아닌 동물을 의미한다. "치료하는" 또는 "치료"는, 장애, 장애의 증상, 장애에 이차적인 질병 상태 또는 장애에 대한 소인을 치료, 경감, 경감, 치유, 개시 지연 또는 개선하기 위한 목적으로, 장애를 갖는 대상에게 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. "유효량"은 치료 대상에서 의학적으로 바람직한 결과를 생성할 수 있는 화합물 또는 조성물의 양을 의미한다.
본원에 기재된 임의의 안티-NTSR1 항체 및 항체 접합체는 다양한 투여 경로, 예를 들어 정맥내, 관절내, 결막, 두개내, 복강내, 흉막내, 근육내, 척수강내 또는 피하 투여 경로에 적합한 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 수용액 또는 동결건조 제형일 수 있다. 이는 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 완충제, 부형제, 안정제 또는 방부제를 함유할 수 있다. 약학 조성물은 항체 또는 항체-접합체와 함께 작용하는 다른 활성 성분, 예를 들어 또 다른 치료제 또는 보조제를 포함할 수 있다.
아래의 특정 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며 어떠한 방식으로든 개시 내용의 나머지 부분을 제한하지 않는다. 추가 설명 없이, 당업자는 본 명세서의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 여겨진다. 여기에 인용된 모든 간행물은 이의 전체가 참조로 포함된다.
실시예 1: 재료 및 방법
세포주
A549(NSCLC) 세포는 10% 태아 소 혈청(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 F-12K 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 유지되었다. H1299(NSCLC) 세포는 10% FBS 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI 배지에서 유지되었다. HA22T(HCC)는 10% FBS, 0.1mM 비필수 아미노산 및 2mM L-글루타민(Gibco)이 보충된 DMEM 배지에서 유지되었다. Mahlavu는 10% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 유지되었다. PC-3(PCa) 세포는 10mM HEPES, 1mM 피루브산나트륨(Gibco), 4.5g/L 포도당 및 10% FBS가 보충된 RPMI1640 배지(Gibco, SH30027)에서 유지되었다.
마우스의 면역화 및 RNA 정제
5마리의 암컷 BALB/c 마우스(생후 4 내지 6주)에게 12주 동안 2주마다 0.1 mg의 난알부민 접합된 ECL2 펩타이드를 복강내 주사하였다. 각 면역화 1주 후 혈액 샘플을 수집하고, 간접 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 적정하였다. 총 6회의 부스트 후, 마우스를 희생시켜 비장을 절개하였다. 세포를 가용화하고, 제조사의 지침에 따라 RNeasy protect midi 키트(Qiagen, Germany)를 사용하여 마우스에서 총 mRNA를 생성하였다.
중쇄의 RT-PCR 증폭 및 카파 쇄 정제
수확된 마우스 비장의 총 RNA는 제조업체의 절차(Invitrogen, USA)에 따라 Trizol Reagent로 추출되었다. 순도 및 농도는 260 nm 및 280 nm(A260/A280)에서 흡광도(A)를 측정하여 결정되었다. 1μl의 RNaseOut(40U/μl, Invitrogen) 및 MuJH(또는 MuJK)-FOR 프라이머의 혼합물과 함께 역전사 효소(Roche)를 사용하여 350ng의 mRNA(Oligotex mRNA Mini 키트, QIAGEN)로부터 첫 번째 가닥 cDNA를 생성하였다.
파지 디스플레이 scFv 라이브러리의 구성
간략하게, 라이브러리 구성 프로세스는 (i) 프레임워크 영역 패밀리 특이적 프라이머를 사용하는 VH 및 VL 도메인의 증폭, (ii) 링커 세그먼트를 포함하는 프라이머로 각 세그먼트의 재증폭, (iii) 중복 확장 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 두 세그먼트(VH 및 VL)의 조립로 구성되었다. 모든 PCR 반응은 TaKaRa Ex Taq 폴리머라제(RR001A) 및 쥐 중쇄 및 Kappa 경쇄에 특이적인 프라이머로 수행되었다. Benhar and Reiter, Curr Protoc Immunol, 2002. Chapter 10: p. Unit 10 19B를 참조한다.
scFvs를 포함하는 PCR 산물은 과량의 제한효소 EcoRI 및 NcoI(NEB)로 분해하고, 약 10.0μg은 16℃에서 T4 DNA 리가제(NEB) 2400 단위로 총 부피 100μg에서 EcoRI/NcoI-선형화된 pHEN2 벡터(아가로스 겔 추출로 정제됨) 40.0μg으로 밤새 결찰시켰다. 결찰 후, 재조합 DNA를 침전시키고, 세척하고, 20μl의 증류수에 용해시켰다. 재조합 DNA 1μl를 E.coli TG1(Lucigen) 25μl에 매번 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환 후, 20 ml Recover 배지(Lucigen)를 첨가하고, 배양물을 37℃에서 1시간 동안 진탕한 후, 100 μg/ml ampicillin을 함유하는 200 ml의 2YT는 37℃에서 16 내지 18시간 동안 진탕기에서 추가로 배양하였다. 이 시점에서, 배양 분취량은 역가 라이브러리 크기로 2YT 한천/암피실린에 플레이팅하였으며, 이는 앰피실린 내성 콜로니의 수를 세어 계산하였다. scFv를 포함하는 파지플라스미드복합체는 이러한 하룻밤 배양으로부터 제조되었다. 약 M13K07(1012 pfu) 헬퍼 파지는 scFv 유전자 라이브러리를 포함하는 TG1 샘플에 첨가하고, 진탕하면서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양하였다. 50 μg/ml Kanamycin을 첨가하고, 배양액을 30℃에서 밤새 진탕하였다. 세포를 4℃에서 20분 동안 4000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 50 ml 20% PEG 8000/2.5 M NaCl과 혼합하고, 얼음 위에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 4℃에서 20분 동안 8000 rpm으로 원심분리하여 파지를 침전시켰다. 상청액을 버리고, 펠렛을 배출하였다. 파지를 1ml PBS에 재현탁하고, 볼텍싱하고, 13000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛 파편을 얻었다. 상청액은 4℃에 보관하거나, 또는 바이오패닝의 다음 라운드를 위해 직접 사용하였다.
파지의 친화성 선택(패닝)
스트렙타비딘-코팅된 자성 비드는 2%(wt/vol) BSA 및 0.02%(wt/vol) NaN3을 함유하는 10부피의 TBS로 사전 세척되었고, 세척된 비드는 2%(wt/vol) BSA, 5mM DTT 및 0.02%(wt/vol) NaN3을 함유하는 TBS에 현탁되었다. scFv 파지 라이브러리의 비특이적 결합은 1.5ml 마이크로원심분리기 튜브(TBS 플러스 1%(vol/vol) Tween-20 및 10mM DTT에서 4%(wt/vol) BSA 500ul에 2 × 1012 파지 입자를 혼합)에서 최종 부피 500ul의 스트렙타비딘 비드로 고갈되고, 그 다음에 60μl의 미리 세척된 스트렙타비딘 비드를 첨가하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음으로, 3ml의 1× TBS, 2%(wt/vol) BSA, 0.5%(vol/vol) Tween-20 및 5mM DTT에 0.4μg의 비오틴-인간 NTSR1 선형 ECL2 펩타이드를 2ml의 미리 흡착된 파지 입자(2x1012 파지 입자)에 첨가하고, 혼합물은 실온(RT)에서 4시간 동안 면역-튜브에서 인큐베이션하였다. 2회 패닝 사이클 후, ELISA에 의해 스크리닝된 멸균 96-웰 플레이트(Nunc, Sweden)에서 단일클론 파지를 제조하기 위해 파지미드-보유 세포의 개별 콜로니를 사용하였다.
파지 ELISA
96-웰 NeutrAvidin 코팅 플레이트(Pierce)에 세척 완충액(25mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% Tween20 PH7.2)에서 5mg/ml 비오틴-인간 NTSR1 선형 ECL2 펩타이드 100ml를 적재하였다. 다음날, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고, 세척 완충액 중 5% 탈지유로 RT에서 1시간 동안 차단하였다. 세척 완충액으로 추가 세척한 후, 새로 준비한 파지 100μl를 웰당 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 다시 세척하고, 1:5000 희석된 안티-M13 항체(ab24229)를 실온에서 1시간 동안 각 웰에 넣은 후, 세척 완충액으로 추가 세척하였다. 1:5000 희석된 Goat Anti-Mouse IgG-HRP(Jackson, 115-035-003)를 RT에서 1시간 동안 각 웰에 넣은 후, 세척 완충액으로 추가 세척하였다. 마지막으로 100μl의 3,3',4,4'테트라메틸벤지딘(TMB)(HRP 기질) 용액(Pierce)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 인큐베이션하였다. 각 웰에 100μl의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 450nm에서 플레이트 판독기(Discover X 판독기)로 분석하였다.
항체의 구성 및 발현
7C3의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인의 서열은 각각 InvivoGen의 pFUSE-CHIg-hG1 및 pFUSE2-CLIg-hK 벡터에 암호화된 인간 IgG1 중쇄 및 인간 IgG(κ) 경쇄의 불변 도메인의 서열에 융합시켰다. 인간-마우스 키메라 항체의 발현은 벡터를 Expi293 세포에 형질감염시켜 달성하였다. 이어서, 분비된 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상청액으로부터 정제하고, 키메라화 후에도 여전히 항원 결합 능력을 유지하는 지를 결정하기 위해 시험하였다.
부위-지정 돌연변이유발을 통한 친화도 성숙
중첩 확장 PCR 돌연변이유발을 사용하여 모든 돌연변이를 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 도메인에 도입하였다. VH 및 VL에 대한 돌연변이 코딩 영역은 특정 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 산물은 공통 중첩을 통해 어닐링되고, 두 번째 PCR 반응에서 증폭한 다음, 정제하고 각각 pFUSE-CHIg-hG1 또는 pFUSE2-CLIg-hK 벡터에 연결하였다. E.coli JM109(ECOS(상표명) 9-5)의 형질전환 후, 개별 콜로니는 각각의 개별 돌연변이에 대한 적절한 제한 효소로 분해하여 스크리닝하였다. 이 분석적 제한 효소 다이제스트에 의해 확인된 추정 돌연변이는 시퀀싱에 의해 확인되었다.
NTSR1 결합 친화도 분석
여러 항체의 NTSR1-결합 능력을 ELISA로 측정하였다. 요약하면, NeutrAvidin 96-웰 플레이트(Pierce Cat:15128)를 RT에서 1시간 동안 5μg/ml의 최종 농도로 cyL2-비오틴 펩타이드로 코팅하였다. 다음날, 코팅액을 제거하고, 플레이트는 인산완충식염수(PBS)에 녹인 5%(v/v) 무지방 분유로 1시간 동안 블로킹하였다. PBST로 세척한 후, 안티-NTSR1 항체의 구배 농도를 3회 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제HRP-접합 염소 항인간 IgG Fc 항체(100μL)를 각 웰에 추가로 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 마지막으로, 100μL의 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 각 웰에 첨가하여 시각화를 위한 색상을 생성하였다. 2분 배양 후, 100μl의 2M H2SO4를 사용하여 반응을 중지시켰다. 플레이트 판독기로 각 웰의 흡광도를 450nm에서 판독하였다.
유동 세포측정
총 1x106개의 세포는 100 μl의 FACS 완충액(0.5% BSA를 포함하는 PBS)에서 안티-NTSR1 항체와 60분 동안 4℃에서 반응시키고, 2회 세척하여 여분의 항체를 제거하였다. 2차 FITC(BD Pharmingen(상표명)) 접합된 마우스 항인간 IgG 항체를 얼음 위에서 추가로 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 세척하고, 4℃에서 10분 동안 0.5 mg/mL 요오드화프로피듐을 함유하는 1 ml PBS로 추가 배양하였다. 데이터는 FACS(Bio-Red S3e 세포 분류기)로 10,000개의 살아있는 세포에서 수집되었다. 채널 FL-1로부터의 형광 세기는 Flow Jo 유동 세포측정 분석 소프트웨어로 계산되었다.
표면 플라즈몬 공명
NTSR1의 세포외 루프 2(ECL2) 펩타이드와 NTSR1-특이적 mAb의 상호작용은 Open SPR(Nicoya, Canada) 장비를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다. 30μl/min의 유속에서 10μg/ml의 농도에서 HBS-EP5 완충액 식염수(20mM HEPES, 250mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20 및 0.5% BSA, pH 7.4)에 희석된 펩타이드를 주입하여 비오틴-접합된 ECL2 펩타이드를 스트렙타비딘 코팅된 센서 칩에 고정화하였다. 동역학 실험을 위해, HBS-EP5에 24 내지 1.5nM 범위의 농도로 희석된 NTSR1-특이적 mAb를 고정된 ECL2 펩타이드에 30μl/min의 유속으로 주입하였다. 고정된 ECL2 펩타이드에 대한 여러 농도의 NTSR1-특이적 mAb의 결합을 TraceDrawer 소프트웨어(Nicoya, Canada)를 사용하여 분석하였다. 결합율(ka), 해리율(kd) 및 친화도(KD)는 데이터를 간단한 1:1 결합 모델에 맞추는 글로벌 분석을 사용하여 계산되었다.
다양한 NTSR1 발현 세포주에서 NTSR-1 항체의 내재화(유동 세포측정)
NTSR-1 항체는 A549, H1299, HA22T 및 Mahlavu를 포함하는 여러 폐 및 HCC 세포주에서 NTSR1 발현 수준을 비교하기 위해 유동 세포측정 분석에 사용되었다. 총 1x106개의 세포는 FACS 완충액에서 60분 동안 4℃에서 h7C3-3 항체와 반응시키고, 2회 세척하여 과잉 항체를 제거하였다. 그런 다음, 세포를 0, 0.5, 2, 5, 24시간 동안 4℃ 또는 37℃로 옮긴 후, 4℃에서 60분 동안 2차 항인간 IgG Fc-PE(BioLegend) 항체와 함께 추가 배양하였다. 세포를 다시 세척하고, 데이터를 BD LSRFortessa로 수집하였다. 채널 FL-1의 형광 세기는 Flow Jo 유동 세포측정 분석 소프트웨어로 계산되었다.
A549 세포에서 h7C3-3 또는 h7C3-3-ADC 항체의 내재화(유동 세포측정)
총 1x106개의 세포는 지시된 항체 또는 ADC와 100μL의 FACS 완충액에서 60분 동안 4℃에서 반응시키고, 세척하여 과량의 항체 또는 ADC를 제거하였다. 그런 다음, 세포를 90분 동안 4℃ 또는 37℃로 옮겼다. 세포 표면에서 h7C3-3 또는 h7C3-3-ADC의 상대적인 수를 결정하기 위해, 세포를 포화량의 FITC(BD PharmingenTM) 접합된 마우스 항인간 IgG 항체로 염색하고, 얼음 위에서 추가로 60분 동안 배양하였다. 세포를 다시 세척하고, 4℃에서 10분 동안 0.5 mg/mL 요오드화프로피듐을 함유하는 1 ml PBS로 추가 배양하였다. 데이터는 FACS(Bio-Red S3e 세포 분류기)로 10,000개의 살아있는 세포에서 수집되었다. 채널 FL-1의 형광 세기는 Flow Jo 유동 세포측정 분석 소프트웨어로 계산되었다.
안티-NTSR1 항체-약물 접합체(ADC)의 제조
h7C3-3 또는 h7C3-4는, 50mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 완충액, Sigma-Aldrich), pH 6.9 및 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Sigma-Aldrich)에서 37℃에서 2시간 동안 0.1몰 당량의 TCEP-HCl(Tris(2-Carboxyethyl)phosphine hydrochloride, Sigma-Aldrich)로 처리하였다. 환원된 항체를 vcMMAE(Achemblock, Q70231)와 실온에서 60분간 반응시켰다. 미반응 vcMMAE를 1mM N-아세틸-L-시스테인(Sigma-Aldrich)을 사용하여 켄칭하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 반응 혼합물은 Amicon Ultrafree 원심 필터 장치(Millipore)를 사용하여 PBS(pH 6.9)로 완충액 교환하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 분석
HIC를 사용하여 h7C3-3 및 h7C3-3 ADC의 특성화를 다음과 같이 수행하였다: 1200 HPLC(Agilent Technologies); TSKgel Butyl-NPR 컬럼(4.6 x 35 mm, 입자 크기 2.5 μm; TOSOH,); 용매 A, 1.5mol L-1 황산암모늄 및 25mM 인산염(pH = 6.95); 용매 B, 75%(V/V) 25mM 인산염, 25%(V/V) 아이소프로판올(pH = 6.95); 구배 15분에 걸쳐 100% A로부터 100% B까지; 0.5mL min-1 유속; 컬럼 온도 25℃; 280nm의 UV 검출 파장.
생체외 세포 세포독성 분석
살아 있는 세포의 수는 CellTiter-Glo(등록상표) Luminescent Cell Viability Assay(Promega G7571)를 사용하여 결정되었다. 세포를 96-웰 불투명 Costar 플레이트(Cat number 136101)에 플레이팅하였다. 요약하면, 90μL 배지에 있는 500 내지 2500개의 세포를 각 웰에 4중으로 첨가하고, 16시간 동안 부착되도록 하였다. 안티-NTSR1(용량 범위: 0 내지 500nM), 안티-NTSR1-MMAE(용량 범위: 0 내지 500nM) 또는 파클리탁셀(용량 범위: 0 내지 100nM)을 10μl에 첨가하였다. 72 내지 120시간 후, 배지를 제거하고, 200μL의 CellTiter-Glo(등록상표) 생존 시약 함유 배양 배지(1:1)를 각 웰에 첨가하고, 어두운 곳에서 오비탈 진탕기에 2분 동안 두었다. 플레이트는 GloMax(등록상표) Explorer 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(GM3500)에서 판독 전 실온에서 10분 동안 두었다.
약동학
h7C3-3 및 h7C3-4의 약동학을 B6 마우스에서 평가하였다. B6 마우스(n=6)에게 꼬리 정맥 주사로 시험 물질(항체 성분 기준) 10mg/kg을 투여하였다. 1, 2, 6시간 및 주사 후 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 35 및 42일에 복재 정맥을 통해 각 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하고, 혈청 샘플을 수집하였다. h7C3-3 및 h7C3-4의 혈장 농도는 IgG(Total) Human ELISA Kit(Invitrogen, BMS2091)로 측정하였다.
마우스 이종이식 종양 모델 및 항체-약물 접합체(ADC) 치료
BioLASCO에서 구입한 생후 7주의 수컷 Fox Chase SCID(등록상표) 마우스(HA22T-Luc 이종이식 연구용) 및 면역결핍 수컷 NU/NU 누드 마우스(H1299 및 PC-3 이종이식 연구용)는, AAALAC International 공인 시설인 NHRI(National Health Research Institutes)의 실험실 동물 센터에서 공기 필터 및 살균 침구 재료가 구비된 멸균 케이지에 수용하였다. 모든 마우스는 연구 기간 내내 12시간 명/12시간 암 주기 하에서 살균된 물과 사료를 자유롭게 먹였다. 종양 세포 접종 당일에, 광학 현미경 하에서 트리판 블루 염색으로 혈구계산기를 사용하여 생존 세포의 수를 세었다. 세포는 페놀 레드가 없는 배지[RPMI1640(H1299) 또는 DMEM(HA22T-Luc)] 또는 PBS(PC-3) 및 Matrigel(상표명)(356237, Matrigel(등록상표) Matrix, Corning, MA, United States)에 1:1 비율로 현탁시켰다. H1299(1×106 세포), HA22T-Luc(5×106 세포) 및 PC-3(1×106 세포)은, 1 mL 주사기(바늘 24G×1 인치)를 사용하여 누드 또는 SCID 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주입하였다. 종양 치수는 디지털 캘리퍼스로 측정하고, 종양 부피(mm3)는 다음 공식으로 계산하였다. 부피 = (길이×너비^2)/2. 종양 보유 마우스를 그룹화하고(그룹당 n=5 내지 8), 평균 종양 부피가 대략 200 mm3일 때 투여하였다. 3개의 개별 이종이식 연구에서, 2.5 mg/ml의 농도로 투여하기 전에 인간 IgG(HU-GF-ED, Lot#120916DG, Molecular Innovations, MI, USA), h7C3-4, h7C3-3-MMAE 및 h7C3-4-MMAE를 1X Dulbecco's Phosphate Buffered 식염수(02-023-5A, Biological Industries, CT, USA)에 새로이 희석하였다. 시스플라틴(KEMOPLAT, 1 mg/mL, 87200009AA, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany)을 구입하였다. H1299 이종이식편 연구에서, 종양 보유 마우스를 5개 그룹(그룹당 6마리)으로 나누었다: 인간 IgG -10mg/Kg 그룹(음성 대조군), 시스플라틴 - 7mg/kg 그룹(양성 대조군), h7C3-3-MMAE -10mg/kg 그룹, h7C3-4 -10mg/kg 그룹 및 h7C3-4-MMAE -10mg/kg 그룹. 3주 동안 주 1회 투여한 시스플라틴군을 제외하고서, 마우스의 꼬리 정맥에 4 mL/Kg의 투여량을 3주 동안 주 2회 정맥 주사하였다. HA22T-Luc 이종이식편 연구에서, 종양 보유 마우스를 3개 그룹(그룹당 8마리)으로 나누었다: 인간 IgG -10mg/kg 그룹(음성 대조군), h7C3-3-MMAE -10mg/kg 그룹 및 h7C3 -4-MMAE(ADC) -10mg/kg 그룹. 마우스에 2주 동안 주당 2회 꼬리 정맥을 통해 4 mL/Kg의 투여량을 정맥 주사하였다. PC-3 이종이식편 연구에서, 종양 보유 마우스를 2개의 그룹으로 나누었다: 무처리 그룹(5마리 마우스) 및 h7C3-4-MMAE(ADC) -10mg/kg(8마리 마우스). h7C3-4-MMAE -10mg/kg 그룹의 마우스는 4 mL/Kg 용량의 용량을 꼬리 정맥을 통해 3주 동안 주당 2회 정맥 주사하였다. 각각의 치료는 체중을 기준으로 하였다. 체중 및 종양 크기를 매주 2회 측정하였다.
면역조직화학
파라핀이 제거된 조직 절편(4μm)은 95℃에서 30분 동안 Tris-EDTA 완충액(pH 9)에서 열 유도 에피토프 검색을 거쳤다. 절편을 억제제 CM으로 37℃에서 4분 동안 차단하였다. 슬라이드를 2μg/ml 안티-NTSR1-B12(SC-376958, Santa Cruz Biotechnology) 및 여러 안티-안티-NTSR1 항체 클론(7C3, h7C3-2 및 h7C3-3)을 포함하는 1차 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 슬라이드를 적절한 2차 항체: 안티-NTSR1-B12에 대한 OmniMap 항-마우스-HRP 및 7C3, h7C3-2 및 h7C3-3에 대한 항인간-HRP를 실온에서 30분 동안 함께 배양하였다. 염색은 다이아미노-벤지딘 테트라하이드로클로라이드로 시행하였다.
실시예 2: 7C3 항체의 특성화
인간 NTSR1에 대한 항체는, 펩타이드 면역화 및 인간 NTSR1의 세포외 루프 2(ECL2) 펩타이드를 사용하는 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성되어서 7C3 scFv가 분리되었다. 고유한 7C3 scFv 바인더를 전장 IgG로 전환하고, 고리형 ECL2 펩타이드에 대한 결합 친화도에 대해 테스트하였다. 도 1A를 참조한다. 세포 표면 NTSR1에 대한 7C3 IgG의 결합은 폐암 세포주 A549 세포에서 유동 세포측정법으로 측정되었다. 7C3 항체는 A549 세포에 강한 결합을 나타냈다. 도 1B를 참조한다.
실시예 3: 안티-NTSR1 항체의 친화성 성숙
7C3 항체(서열번호 1 및 2를 가짐)의 친화도를 증가시키기 위해, 컴퓨터 모델을 사용하여 변이체를 시험하였다. 모델의 기초에는 실제 집단과 유사한 특성을 나타내는 3차원 구조를 갖는 별개의 항체 및 항원의 대규모 레퍼토리가 있었다. h7C3-1(CDR H3에 Y100H 돌연변이 보유), h7C3-2(CDR H3에 Y100H 돌연변이 보유, CDR L3에 S97A 돌연변이 보유) 및 h7C3-3(CDR H1에 T28A 돌연변이 보유, CDR H3에서 Y100H 돌연변이 보유 및 CDR L3에서 S97A 돌연변이 보유)을 포함하는 3가지 변종이 생성되었다. 친화성 향상에서 변이체의 활성을 조사하기 위해, 이들 항체를 FACS 분석에 적용하였다. 이러한 변이체 중에서, h7C3-3은 0.3 nM의 더 낮은 KD 값(도 2)과 1.1 μg/ml의 EC50 값(표 1)을 나타냈으며, 이는 이러한 아미노산 치환이 친화도 향상을 부여함을 나타낸다. 표 2는 h7C3-3의 CDR 서열을 보여준다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 4: 안티-NTSR1 항체의 CDR 영역의 알라닌 스캐닝
항원 결합과 관련된 CDR H3의 허용 부위를 확인하기 위해, h7C3의 CDR H3의 8개 부위에서 실험적인 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여 변이체를 테스트하였다. 변이체는 ELISA에서 사이클릭 ECL2 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 비교하였다. R98A, Y99A, Y100A, Y101A, G102A 및 F103A는 펩타이드에 대한 h7C3의 겉보기 친화도를 약 30 내지 70%까지 상당히 감소시켰다. D104A 및 Y105A를 포함하는 다른 치환은 h7C3 친화도에 영향을 미치지 않았다. 컴퓨터 모델링 결과에 기초하여, h7C3 결합 활성에 대한 Y100의 H로의 치환을 조사하였다. Y100H 돌연변이를 갖는 h7C3는 더 높은 친화도를 나타낸다.
결과에서는 h7C3-1 항체(CDR H3 내에 Y100H 돌연변이를 함유하는 h7C3)가 부모 h7C3에 비해 더 높은 친화성을 나타냄을 나타냈다. h7C3-1의 CDR L3에 있는 9개 부위의 변이체를 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 통해 테스트하였다. 몇몇 잔기는 h7C3-1 친화도, 특히 F94A 및 W101A(30 내지 40%)뿐만 아니라 L99A(70%)도 상당히 감소시켰다. G91을 A로 교체하면, 펩타이드에 대한 h7C3-1의 친화도가 크게 증가한다. G96A, S97A, H98A 및 P100A를 포함하는 다른 치환은 h7C3-1 친화도에 영향을 미치지 않았다. 세포 표면 NTSR1에 대한 변이체의 결합을 추가로 확인하기 위해, G96A, S97A, H98A 또는 P100A를 포함하는 h7C3-1을 FACS 분석에 적용하였다. h7C3-1과 비교하여, G96A 또는 P100A 돌연변이는 세포 표면 NTSR1에 대한 h7C3-1의 결합 친화도를 유의하게 감소시킨 반면, H98A는 NTSR1에 대한 결합에 약간 영향을 미쳤다. 놀랍게도, h7C3-1 보유 S97A 돌연변이는 더욱 높은 친화도를 나타냈다.
항원-항체 상호작용에 중요한 잔기를 확인하기 위해 h7C3-2에서 각각 CDR H1 및 CDR H2의 10개 및 18개 부위에서 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하였다. G26A, Y27A, W33A, I34A, H35A, Q50A, R52A 및 Y59A는 펩타이드에 대한 h7C3-2의 겉보기 친화성을 약 50% 이상 상당히 감소시켰다. 28개 돌연변이 중 19개는 CDR H1의 5개(T28A, F29A, T30A, S31A 및 S32A) 및 CDR H2의 14개(I51A, P53A, N54A, S55A, G56A, N57A, T58A, Y60A, N61A, E62A, K63A, F64A, K65A 및 V66A)를 포함하여 h7C3-2 결합 활성의 >80%를 유지하였다. T28A 또는 N54A 돌연변이를 갖는 h7C3-2 변이체는 펩타이드에 대한 더 높은 결합 친화도를 나타내었고, FACS 분석을 받았다. 흥미롭게도, CDR H1에 T28A 돌연변이가 있는 h7C3-2는 A549 세포에서 NTSR1에 대해 더 높은 친화성을 나타냈다.
실시예 5: h7C3-3 내재화
h7C3-3이 세포 표면에 결합할 때 내재화되어 세포독성 페이로드 접합의 후보인지 여부를 조사하기 위해, A549, H1299, HA22T 또는 Mahlavu 세포를 항체(10㎍/ml)에 노출시키고, FACS로 분석하였다. 도 3A에서 보는 바와 같이, 배양 시간이 길어짐에 따라, 세포가 4℃에서 37℃로 이동함에 따라 평균 형광 세기(MFI)의 크기가 점차 감소하였으며, 이는 A549 세포에 의해 취해지는 h7C3-3 항체의 수가 증가함을 나타낸다. 유사한 결과가 H1299 세포(도 3B), HA22T 세포(도 3C) 및 Mahlavu 세포(도 3D)에서 관찰되었다. 이러한 결과는 h7C3-3이 NTSR1 발현 세포에서 신속하고 효율적으로 내재화됨을 나타낸다.
실시예 6: h7C3-4 및 h7C3-5의 특성화
h7C3-3의 약동학 특성을 개선하기 위해, 컴퓨터 모델의 사용을 통해 h7C3-4를 생성하였다(h7C3-3과 비교하여, VH 도메인에서 S9T 및 D82E 돌연변이 및 VL 도메인에서 K79T 돌연변이를 보유). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 등전점(pI) 값이 더 낮은 h7C3-4는 h7C3-3과 비교하여 유사한 결합 친화도를 나타냈다. 또한 h7C3-4는 h7C3-3에 비해 복재 정맥주사 후 클리어런스를 유의하게 향상시켰다. 도 4B를 참조한다. 이러한 결과는 h7C3-4가 더 나은 약동학을 가지고 있음을 나타낸다.
추가 변종인 h7C3-5도 생성되었다. 도 5A 및 5B를 참조한다. h7C3-5는 h7C3-4와 비교하여, A549 세포 상의 NTSR1에 대해 유사한 결합 친화도를 나타냈다. 도 5C를 참조한다.
실시예 7: 안티-NTSR1 항체 접합체 MMAE의 특성화
Expi293 세포에서 h7C3-3 및 h7C3-의 고효율 생산을 달성한 후, 절단 가능한 화학적 링커를 통한 항유사분열의 튜불린-억제제 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)와의 안티-NTSR1 항체의 접합을 조사하였다. ADC는 분자간 다이설파이드 결합의 부분적 환원에 의해 이어서 싸이올 반응성의 말레이미도-함유 약물 링커와의 접합에 의해 제조되었다. 이들 두 ADC의 정체성은 HIC에 의해 확인되었다. HIC 분석을 통해 안티-NTSR1 항체당 0, 2, 4, 6 또는 8개의 약물 분자에 해당하는 5개의 주요 피크로 결합을 분석할 수 있었으며(도 6A 및 6B), 평균 DAR은 약 3.8 내지 4이다.
실시예 8: 안티-NTSR1 항체-약물 접합체의 내재화 효율
안티-NTSR1 ADC는 표적 세포에 도입된 펩타이드 절단 가능한 말레이미도카프로일-발린 시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐(vc) 링커로 구성되며, 일반적으로 리소좀 프로테아제에 의한 후속 방출은 세포독성 약물 전달에 중요하다. h7C3-3-MMAE ADC의 내재화를 측정하고, NTSR1-발현 NSCLC 세포주 A549에서 인간 IgG Ab(음성 대조군) 및 부모 비접합 Ab(양성 대조군)와 비교하였다. h7C3-3-MMAE 및 접합되지 않은 부모 Ab(h7C3-3)는 둘 다 세포 표면에서 결합 효율을 가지며, 세포 분포는 오른쪽에 있다(도 7A). h7C3-3-MMAE 또는 h7C3-3의 내재화를 개시하기 위해, 1차 항체-처리된 세포를 100μl FACS 완충액에 현탁시키고, 2차 검출 Ab 배양 전에 37℃에서 90분 동안 배양하였다. 1차 항체가 37℃에서 세포로 내재화되었을 때 세포 분포는 왼쪽에 있다. h7C3-3-MMAE 및 접합되지 않은 부모 항체(h7C3-3) 모두 효율적으로 내재화되었다. 도 7B 및 7C를 참조한다.
실시예 9: 안티-NTSR1 항체-약물 접합체의 세포독성 효과
NTSR1-특이적 ADC는 h7C3-3, h7C3-4 및 h7C3-5를 돌라스타틴 유사체 MMAE와 접합하여 생성되었다. 오리스타틴은 미세소관을 파괴하여 세포 사멸을 유도하는 강력한 세포독성 물질이다. h7C3-3-MMAE, h7C3-4-MMAE 및 h7C3-5-MMAE는 인간 혈장에서 최적의 안정성과 인간 카텝신 B에 의한 효율적인 절단을 위해 설계된 프로테아제 민감성 발린-시트룰린 다이펩타이드 서열을 포함한다. 내재화 후, 리소좀 프로테아제는 항체 및 링커 둘 다를 대사하여 활성 약물을 방출한다. NTSR1-특이적 ADC는 항체당 평균 3.8 내지 4 MMAE로 접합되었으며, 이 비율은 브렌툭시맙 베도틴, 폴라투주맙 베도틴 및 엔포르투맙 베도틴에 대한 최적의 치료 지수를 제공하는 것으로 나타났다.
Figure pct00003
시험관 내에서 h7C3-3 및 h7C3-3-MMAE의 직접적인 비교는 표적 결합 및 내재화 특성이 ADC에서 보존되었음을 확인시켜 주었다. 표 3 및 도 8을 참조한다. NTSR1-특이적 ADC는 시험관 내에서 우수한 세포독성을 보였다.
시험관 내 세포독성 검정에서, h7C3-4 및 h7C3-4-MMAE의 비교는 또한 ADC가 표적 결합, 내재화 및 세포독성을 나타냄을 보여주었다. 표 4 및 도 9를 참조한다.
h7C3-5 및 h7C3-5-MMAE를 시험관 내 세포독성 검정에서 비교하였다. 결과는 이 ADC가 또한 우수한 세포 독성을 나타냄을 보여주었다. 표 5 및 도 10을 참조한다.
표 6에 나타낸 바와 같이, h7C3-4-MMAE 및 h7C3-5-MMAE는 시험된 세포주에서 필적할만한 시험관 내 세포독성 효과를 나타내었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 10: 생체 내 항종양 활성
표적 세포에 대한 안티-NTSR1 ADC의 생체 내 효과는 여러 NTSR1-양성 이종이식 모델에서 평가되었다.
누드 마우스에 NTSR1-발현 세포인 H1299(마우스당 1×106개 세포)를 피하 접종하였다. 종양이 200 mm3의 부피에 도달했을 때, 종양-보유 마우스를 그룹화하고(n=6), 인간 IgG(음성 대조군), h7C3-3-MMAE, h7C3-4 및 h7C3-4-MMAE를 각각 10mg/kg으로 주 2회 6회 정맥내 투여하였다. 시스플라틴(양성 대조군)을 매주 7mg/Kg씩 3회 정맥 주사하였다. 도 11A에 나타낸 바와 같이, 10mg/kg의 h7C3-4-MMAE는 18일째 대조군 인간 IgG(10mg/kg) 및 시스플라틴(7mg/kg) 그룹보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하였다. 비소세포 폐암 임상 치료에 흔히 사용되는 양성 대조군인 시스플라틴과 비교하여, 종양의 연장된 퇴행은 h7C3-4-MMAE 치료에서 35일까지 관찰되었다. 또한, 10mg/kg의 h7C3-3-MMAE는 35일째에 종양 성장의 부분적 억제를 나타냈고, 이는 h7C3-4가 폐 이종이식 모델에서 h7C3-3보다 더 효율적으로 내재화되었음을 나타낸다.
h7C3-3-MMAE와 h7C3-4 MMAE의 항종양 효능을 비교하기 위해, SCID 마우스에 5×106 HA22T-luc 간암 세포를 피하 접종하여 실험을 수행하였다. 종양 보유 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 나누었다. 종양이 200 mm3의 부피에 도달했을 때, 10mg/Kg의 인간 IgG, h7C3-3-MMAE 및 h7C3-4 MMAE를 각각 4회 용량 동안 매주 2회 정맥내 투여하였다. h7C3-3-MMAE 및 h7C3-4 MMAE 둘 다 15일에 종양 퇴행을 보였고(도 12A), 36일까지 두 ADC 처리에서 종양의 연장된 퇴행이 관찰되었다.
h7C3-4-MMAE 처리를 사용하여 PC3 전립선 암 세포주(1×106 세포) 이종이식편으로 추가 실험을 수행하였다(도 13A). 종양이 200 mm3의 부피에 도달했을 때. 종양-보유 마우스를 무처리(n=5) 그룹과 h7C3-4-MMAE(n=8) 그룹으로 나누었다. 10mg/kg의 h7C3-4-MMAE를 매주 2회 정맥 내로 6회 투여하였다. h7C3-4-MMAE는 또한 PC3 전립선 암 유형에서 매우 효과적인 것으로 나타났다. 종양의 연장된 퇴행은 h7C3-4-MMAE 처리에서 60일까지 관찰되었다. 투약 치료에 의한 종양 퇴행은 마우스의 일반적인 생리학적 조건 또는 체중 변화에서 어떠한 이상도 유도하지 않았으며(도 8B, 9B, 10B), 이는 h7C3-3-MMAE 또는 h7C3-4-MMAE가 NTSR1-양성 악성종양의 치료를 위한 강력한 제제임을 나타낸다.
실시예 11: 면역조직화학 염색
전립선 암 세포에서 NTSR1 발현을 평가하기 위해, PC-3 이종이식 종양 조직은 2μg/ml B-12(안티-NTSR1-B12; SC-376958, Santa Cruz Biotechnology), 7C3, h7C3- 2, 또는 h7C3-3 항체를 사용하는 NTSR1 면역조직화학 염색에 가하였다. 도 14를 참조한다. 면역조직화학 염색은 PC-3 이종이식 종양 조직에서 강한 NTR1 발현을 보였다. 이들 항체 중, h7C3-3의 염색이 군집화되고, 더 강렬하게는, h7C3-3이 면역조직화학 염색에 적합함을 시사한다.
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 기능은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대체 기능으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 설명된 실시양태의 본질적인 특성을 쉽게 확인할 수 있고, 이의 사상 및 범위를 벗어나지 않고서 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 실시예의 다양한 변경 및 수정을 할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> National Health Research Institutes <120> ANTI-HUMAN NEUROTENSIN RECEPTOR 1 ANTIBODY AND USE THEREOF <130> 218384-0020PCT <150> US 63/036,740 <151> 2020-06-09 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH SEQUENCE <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Arg Pro Asn Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL SEQUENCE <400> 2 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 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Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH SEQUENCE <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Arg Pro Asn Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr His Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL SEQUENCE <400> 16 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 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Claims (24)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 중쇄 가변 도메인(VH); 및
    서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하되,
    항체가 인간 뉴로텐신 수용체 1(hNTSR1)에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    항체가
    중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열번호 3) 또는 GYAFTSSWIH(서열번호 4);
    중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5);
    중쇄 CDR3: ARYYYGFDY(서열번호 6), ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8);
    경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9);
    경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및
    경쇄 CDR3: FQGSHLPWT(서열번호 11) 또는 FQGAHLPWT(서열번호 12)
    를 포함하는, 분리된 항체.
  3. 청구항 2에 있어서,
    항체가
    중쇄 CDR1: GYAFTSSWIH(서열번호 4);
    중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5);
    중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8);
    경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9);
    경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및
    경쇄 CDR3: FQGAHLPWT(서열번호 12)
    를 포함하는, 분리된 항체.
  4. 청구항 3에 있어서,
    항체가
    중쇄 CDR1: GYAFTSSWIH(서열번호 4);
    중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5);
    중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7);
    경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9);
    경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및
    경쇄 CDR3: FQGAHLPWT(서열번호 12)
    를 포함하는, 분리된 항체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    항체가 서열번호 13의 서열인 VH 서열; 및 서열번호 14의 서열인 VL 서열을 포함하는, 분리된 항체.
  6. 청구항 4에 있어서,
    항체가 서열번호 15의 서열인 VH 서열; 및 서열번호 16의 서열인 VL 서열을 포함하는, 분리된 항체.
  7. 청구항 2에 있어서,
    항체가
    중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열번호 3);
    중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5);
    중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8);
    경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9);
    경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및
    경쇄 CDR3: FQGSHLPWT(서열번호 11)
    를 포함하는, 분리된 항체.
  8. 청구항 2에 있어서,
    항체가
    중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열번호 3);
    중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5);
    중쇄 CDR3: ARYHYGFDY(서열번호 7) 또는 ARYRYGFDY(서열번호 8);
    경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9);
    경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및
    경쇄 CDR3: FQGAHLPWT(서열번호 12)
    를 포함하는, 분리된 항체.
  9. 청구항 2에 있어서,
    항체가
    중쇄 CDR1: GYTFTSSWIH(서열번호 3);
    중쇄 CDR2: QIRPNSGNTYYNEKFKV(서열번호 5);
    중쇄 CDR3: ARYYYGFDY(서열번호 6);
    경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 9);
    경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 10); 및
    경쇄 CDR3: FQGSHLPWT(서열번호 11)
    를 포함하는, 분리된 항체.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 청구항에 있어서,
    항체가 재조합 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, IgG1 항체 또는 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편인, 분리된 항체.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 청구항에 있어서,
    항체가 hNTSR1의 2차 세포외 루프에 결합하는 항체.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 청구항의 분리된 항체; 및
    비-항체 분자
    를 포함하는 항체 접합체.
  13. 청구항 12에 있어서,
    비-항체 분자가 폴리펩타이드, 중합체, 올리고당, 지질, 당지질, 고체 지지체, 소분자 약물, 비오틴, 핵산 분자, 담체 단백질 또는 검출 가능한 표지인 항체 접합체.
  14. 청구항 13에 있어서,
    접합체가 항체-약물 접합체인 항체 접합체.
  15. 청구항 14에 있어서,
    비-항체 분자가 hNTSR1을 발현하는 종양을 치료하기 위한 암 약물인 항체 접합체.
  16. 청구항 15에 있어서,
    종양이 중피종, 폐 종양, 유방 종양, 두경부 편평 암종, 결장 종양, 췌장 종양, 전립선 종양 또는 간 암종인 항체 접합체.
  17. 청구항 16에 있어서,
    암 약물이 모노메틸 오리스틴 E(MMAE)인 항체 접합체.
  18. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 청구항의 분리된 항체 및 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물.
  19. 청구항 15 내지 청구항 17 중 어느 한 청구항의 항체-약물 접합체 및 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물.
  20. 청구항 19의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양을 치료하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    종양이 hNTSR1을 발현하는 방법.
  22. 청구항 20에 있어서,
    종양이 중피종, 폐 종양, 유방 종양, 두경부 편평 암종, 결장 종양, 췌장 종양, 전립선 종양 또는 간 암종인 방법.
  23. 샘플, 조직 또는 세포를 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 청구항의 항체 또는 청구항 12 또는 청구항 13의 항체 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    샘플 내의 표적에 대한 또는 조직 또는 세포에 대한 항체 또는 항체 접합체의 결합을 결정하는 단계
    를 포함하는, hNTSR1을 검출하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    항체 접합체가 검출 가능한 표지를 포함하는 방법.
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