JP2023530662A - 抗ヒトニューロテンシン受容体１抗体及びその使用 - Google Patents

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Abstract

単離された抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を備え、抗体はヒトニューロテンシン受容体１（ｈＮＴＳＲ１）に特異的に結合する。【選択図】 図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月９日に出願された米国仮特許出願第６３／０３６，７４０号の優先権を主張し、その内容の全体は参照によってここに取り込まれる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、癌及び感染性疾患などの疾患の治療において並びに分子生物学、薬学及び医学研究を含むいくつかの分野において重要なツールとなっている。Ｂａｅｒｔ他、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２００３年、３４８（７）：ｐ．６０１－８、Ｃａｖａｌｌｉ－Ｂｊｏｒｋｍａｎ他、Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ、２００２年、１９（４）：ｐ．２７７－８０、並びにＰｌｏｓｋｅｒ及びＦｉｇｇｉｔｔ、Ｄｒｕｇｓ、２００３年、６３（８）：ｐ．８０３－４３参照。過去１０年の間に、様々な腫瘍の種類における特定の抗原又は細胞表面受容体を標的とする単独特異的な抗体は、実質的な成功を収め、癌治療の最前線にある。
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、化学的リンカーによって細胞毒性化合物に連結された抗体からなる新たな部類の非常に強力なバイオ医薬品である。これら新規の標的化された薬剤は、細胞毒性薬物による健常組織と癌組織の間で高感度な選別を可能とする抗体の独自の標的能力を示す。ＡＤＣは、単独使用では毒性が強すぎる細胞毒性低分子薬物の強力な細胞殺傷活性と組み合わされた、癌特異的であるが細胞毒性は十分ではないｍＡｂの、高い特異性、特性及び抗腫瘍活性からなる革新的な治療ツールである。少なくとも５個のＡＤＣが市場認可を取得しており、８０を超えるＡＤＣが現在臨床試験中である。Ａｂｄｏｌｌａｈｐｏｕｒ－Ａｌｉｔａｐｐｅｈ他、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＡＤＣｓ）ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，ａｎｄ ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１８年参照。ＡＤＣは、最先端の技術の進歩により、今後、抗癌治療市場を支配することが非常に期待される。
ニューロテンシン受容体１（ＮＴＳＲ１）のリガンドであるニューロテンシン（ＮＴＳ）は、神経系において及び末梢組織において見られる短鎖ペプチドである。Ｃａｒｒａｗａｙ及びＬｅｅｍａｎ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９７３年、２４８（１９）：ｐ．６８５４－６１参照。ＮＴＳは、広範囲の生物学的活性を示し、パーキンソン病及び統合失調症の病態、ドーパミン神経伝達の調節、低体温症、抗侵害受容作用において、並びに癌細胞の成長促進において重要な役割を担う。Ｂｉｓｓｅｔｔｅ，Ｇ．他、Ｎａｔｕｒｅ、１９７６年、２６２（５５６９）：ｐ．６０７－９、Ｃａｒｒａｗａｙ及びＰｌｏｎａ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２００６年、２７（１０）：ｐ．２４４５－６０、Ｇｒｉｅｂｅｌ及びＨｏｌｓｂｏｅｒ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、２０１２年、１１（６）：ｐ．４６２－７８、Ｋｉｔａｂｇｉ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ、２００２年、５（５）：ｐ．７６４－７６、並びにＳｃｈｉｍｐｆｆ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２００１年、７０（６）：ｐ．７８４－６参照。３個のニューロテンシン受容体（ＮＴＳＲ）が同定されている。ＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２は、クラスＡのＧＰＣＲファミリーに属するが、ＮＴＳＲ３（ＳＯＲＴ１とも呼ばれる）は、一回膜貫通ドメインを有するソルチリンファミリーのメンバーである。Ｔａｎａｋａ他、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９０年、４（６）：ｐ．８４７－５４、Ｃｈａｌｏｎ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９６年、３８６（２－３）：ｐ．９１－４、及びＭａｚｅｌｌａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ、２００１年、１３（１）：ｐ．１－６参照。ＮＴＳの既知の効果の大半は、優先的にＧｑタンパク質を介してシグナル伝達するＮＴＳＲ１を介して媒介される。Ｋｉｔａｂｇｉ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ、２００２年、５（５）：ｐ．７６４－７６参照。
ニューロテンシン及びそのコグネイト受容体は、腫瘍過程中に頻繁に制御が解除される神経ペプチド－受容体複合体である。ニューロテンシン受容体１（ＮＴＳＲ１）は、中皮腫、非小細胞肺癌、肝臓癌、乳癌、頭頚部扁平上皮癌などの侵攻性の悪性固形腫瘍において癌の進行を増強し得ることが報告されている。Ａｌｉｆａｎｏ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、２０１０年、９２（２）：ｐ．１６４－７０、Ａｌｉｆａｎｏ他、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０１０年、１６（１７）：ｐ．４４０１－１０、Ｗｕ，Ｚ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ、２０１７年、３８８：ｐ．７３－８４、Ｄｕｐｏｕｙ他、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００９年、４（１）：ｐ．ｅ４２２３、及びＳｈｉｍｉｚｕ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２００８年、１２３（８）：ｐ．１８１６－２３参照。ＮＴＳＲ１は、患者組織の染色に基づいて、非小細胞肺癌及び前立腺癌についての有望な分子マーカーとなる。Ｈｅ他、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ、２０１９年、４６（１０）：２１９９－２２０７、及びＡｌｉｆａｎｏ他、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０１０年、１６（１７）：ｐ．４４０１－１０参照。ＮＴＳＲ１の活性化はまた、結腸癌、前立腺癌及び膵臓癌の細胞株においてＥＧＦＲ受容体をトランス活性化する。Ａｍｏｒｉｎｏ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、２６（５）：ｐ．７４５－５６、及びＭｕｌｌｅｒ他、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、２０１１年、１１：ｐ．４２１参照。近年、ゲノムワイド関連研究は、ＮＴＳＲ１が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の予後において役割を有し得ることも明らかにした。Ｃｈａｎｇ他、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、２０１７年、１９５（５）：ｐ．６６３－６７３参照。ＮＴＳ及びＮＴＳＲ１は、５０％を超える肝細胞癌（ＨＣＣ）において異常に発現する。ＮＴＳ又はＮＴＳＲ１のｍＲＮＡの発現の上昇は、患者の転帰不良と相関する。Ｗｕ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ、２０１７年、３８８：ｐ．７３－８４。
したがって、ＮＴＳＲ１は、癌療法のための潜在的な標的である。発癌現象及び癌再発は、ＮＴＳＲ１の活性を阻害することを介して低減され得る。
一態様では、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を備える単離された抗体であって、ヒトニューロテンシン受容体１（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １；ｈＮＴＳＲ１）に特異的に結合する単離された抗体が、ここに説明される。例えば、抗体はｈＮＴＳＲ１の第２細胞外ループに結合し得る。
ある実施形態では、抗体は、配列番号１内に、Ｔ２８、Ｆ２９、Ｔ３０、Ｓ３１、Ｓ３２Ａ、Ｉ５１、Ｐ５３Ａ、Ｎ５４、Ｓ５５、Ｇ５６、Ｎ５７、Ｔ５８、Ｙ６０、Ｎ６１、Ｅ６２、Ｋ６３、Ｆ６４、Ｋ６５、Ｖ６６Ａ、Ｙ１００、Ｄ１０４及びＹ１０５から選択される位置で１以上の置換を有する。
ある実施形態では、抗体は、配列番号２内に、Ｇ９６、Ｓ９７、Ｈ９８及びＰ１００から選択される位置で１以上の置換を有する。
ある実施形態では、抗体は、重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）又はＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）、重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号６）、ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）、軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）又はＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）を含む。
ある実施形態では、抗体は、重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）、重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）、軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）を含む。
ある実施形態では、抗体は、重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）、重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）、軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）を含む。
ある実施形態では、抗体は、重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）、重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）、軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）を含む。
ある実施形態では、抗体は、重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）、重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号６）、軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）を含む。
ある実施形態では、単離された抗体は、重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）、重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）、軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）を含む。
ある実施形態では、抗体は、配列番号１３の配列であるＶＨ配列、及び配列番号１４の配列であるＶＬ配列を含む。
ある実施形態では、抗体は、配列番号１５の配列であるＶＨ配列、及び配列番号１６の配列であるＶＬ配列を含む。
ある実施形態では、抗体は、組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＩｇＧ１抗体又は抗原結合部位を含む抗体断片である。
他の態様では、ここに記載される抗ｈＮＴＳＲ１抗体のいずれかと、非抗体分子と、を含む抗体複合体がここに提供される。
ある実施形態では、非抗体分子は、ポリペプチド、ポリマー、オリゴ糖、脂質、糖脂質、固体支持体、低分子薬物、ビオチン、核酸分子、担体タンパク質又は検出可能標識である。
ある実施形態では、抗体複合体は抗体薬物複合体であり、非抗体分子は癌細胞を阻害し、又はｈＮＴＳＲ１を発現する腫瘍を処置する制癌剤である。例えば、制癌剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり得る。
ある実施形態では、腫瘍は、中皮腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頚部扁平上皮癌、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍又は肝臓癌である。
さらに他の態様では、ここに記載される抗体又は抗体薬物複合体のいずれかと、薬学的担体と、を含む薬学的組成物が、ここに記載される。
一態様では、ここに記載される抗体薬物複合体又は薬学的組成物のいずれかをそれを必要とする被検体に投与するステップを備える、被検体における腫瘍を処置する方法が、ここに記載される。ある実施形態では、腫瘍はｈＮＴＳＲ１を発現する。
ある実施形態では、腫瘍は、中皮腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頚部扁平上皮癌、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍又は肝臓癌である。
他の態様では、サンプル又はＮＴＳＲ１を発現する組織若しくは細胞においてＮＴＳＲ１を検出する方法が、ここに記載される。方法は、サンプル、組織又は細胞をここに記載される抗体又は抗体複合体のいずれかと接触させるステップと、抗体又は抗体複合体の、サンプルにおける標的への又は組織若しくは細胞への結合を特定するステップと、を含む。
さらに他の態様では、ここに記載される抗体又はその成分のいずれかをコードする単離された核酸分子が、ここに記載される。
１以上の実施形態の詳細が、添付の図面及び以下の説明において記載される。実施形態の他の特徴、目的及び有利な効果は、説明及び図面により並びに特許請求の範囲により明らかとなる。
図１は、７Ｃ３ｍＡｂの特徴付けを示すグラフのセットである。（Ａ）ＥＬＩＳＡにおけるＮＴＳＲ１の環状ＥＣＬ２ペプチドへの７Ｃ３ｍＡｂの結合である。（Ｂ）フローサイトメトリにより測定されたＡ５４９細胞におけるＮＴＳＲ１への７Ｃ３（１０μｇ／ｍｌ）の結合である。 図２は、ｈ７Ｃ３－３の親和性及び速度論的データを示すグラフである。ｈ７Ｃ３－３とＮＴＳＲ１ ＥＣＬ２ペプチドの間の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって特定した。 図３は、ＮＴＳＲ１を過剰発現する種々の癌細胞株における抗ＮＴＳＲ１ｍＡｂの内在化を示すグラフのセットである。それぞれ、様々な抗体（１０μｇ／ｍｌ）により４℃又は３７℃で処置された（Ａ）Ａ５４９、（Ｂ）Ｈ１２９９、（Ｃ）ＨＡ２２Ｔ及び（Ｄ）Ｍａｈｌａｖｕ細胞のフローサイトメトリ分析である。 図４は、ｈ７Ｃ３－４変異体抗体の特徴付けを示す表及びグラフを含む。（Ａ）ｈ７Ｃ３－３又はｈ７Ｃ３－４の等電点（ｐＩ）及び結合親和性である。ＮＴＳＲ１発現Ａ５４９細胞におけるｈ７Ｃ３－３又はｈ７Ｃ３－４の結合を、０．５μｇ／ｍｌの濃度でフローサイトメトリにより測定した。（Ｂ）ＢＬＴＷ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスにおける抗体の薬物動態である。単回静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ）後の時間プロファイルに対する抗体の血清濃度である。マウス血清におけるｈ７Ｃ３－３又はｈ７Ｃ３－４抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡによって分析した。 図５は、ヒト化ｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－５抗体の特徴付けを示す。ｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－５の（Ａ）重鎖アミノ酸配列及び（Ｂ）軽鎖アミノ酸配列のアラインメントである。突然変異した残基は太字で示され、ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義に従って定義される。（Ｃ）フローサイトメトリにより測定されたＡ５４９細胞におけるＮＴＳＲ１へのｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－５の結合である。ｈ７Ｃ３－４重鎖（配列番号１３）、ｈ７Ｃ３－４軽鎖（配列番号１４）、ｈ７Ｃ３－５重鎖（配列番号１５）、ｈ７Ｃ３－５軽鎖（配列番号１６）である。 図６は、（Ａ）ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ複合体及び（Ｂ）ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ複合体の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）分析を示すグラフのセットである。「ＤＡＲ：０」、「ＤＡＲ：２」、「ＤＡＲ：４」、「ＤＡＲ：６」及び「ＤＡＲ：８」は、それぞれ、抗体あたり０、２、４、６及び８個のＭＭＡＥ分子が付着した複合体の異性体をいう。 図７は、Ａ５４９細胞におけるｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥの内在化効率性を示すグラフのセットである。（Ａ）Ａ５４９癌細胞におけるｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥの結合親和性を、４℃で１時間のインキュベーション後にフローサイトメトリによって測定した。細胞の分布は右側である。（Ｂ及びＣ）フローサイトメトリ分析を適用してＮＴＳＲ１発現Ａ５４９癌細胞における１μｇ／ｍｌの濃度でのｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥの内在化効率性を評価した。細胞を、抗体とともに氷上で１時間インキュベーションした。未結合抗体を洗い流した。その後、実験群を、３７℃で９０分間インキュベーションした。収穫後、細胞を、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧで染色し、フローサイトメトリ分析した。細胞分布の内在化は、左側である。 図８は、種々の癌細胞株におけるｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を示すグラフのセットである。 図９は、種々の癌細胞株におけるｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を示すグラフ及び目録を含む。 図１０は、種々の癌細胞株におけるｈ７Ｃ３－５－ＭＭＡＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を示すグラフ及び目録を含む。 図１１は、Ｈ１２９９肺腫瘍異種移植モデルにおける、７ｍｇ／ｋｇの用量でのシスプラチンと比較した、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ、ｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの有効性を示すグラフのセットである。（Ａ）ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの抗腫瘍有効性を、腫瘍体積の変化により示す。（Ｂ）群の双方とも体重損失を示さなかった。 図１２は、ＨＡ２２Ｔ－Ｌｕｃ肝腫瘍異種移植モデルにおける１０ｍｇ／ｋｇの用量での抗ＮＴＳＲ１ ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの有効性を示すグラフのセットである。（Ａ）ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの抗腫瘍有効性を腫瘍体積の変化により示す。（Ｂ）群の双方とも体重損失を示さなかった。 図１３は、ＰＣ３前立腺腫瘍異種移植モデルにおける１０ｍｇ／ｋｇの用量での抗ＮＴＳＲ１ ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの有効性を示すグラフのセットである。（Ａ）ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの抗腫瘍有効性を、腫瘍体積の変化により示す。（Ｂ）処置は、体重損失を発生させなかった。 図１４は、２μｇ／ｍｌのＢ－１２、７Ｃ３、ｈ７Ｃ３－２又はｈ７Ｃ３－３抗体による異種移植ＰＣ－３前立腺癌組織の免疫組織化学染色を示す画像のセットである。固形腫瘍を無処置のＰＣ－３異種移植マウスから摘出し、続けてＮＴＳＲ１に特異的な抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。画像は、５０倍及び１００倍の倍率で撮影された。
ヒトＮＴＳＲ１に結合する新規抗体及びその複合体がここに説明される。
抗ＮＴＳＲ１抗体の各々は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％）同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％）同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み得る。
配列番号１
ＱＶＱＬＱＱＰＧＳＶＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨＷＡＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＶＤＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＹＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
抗体は、各々、配列番号１内に、Ｔ２８、Ｆ２９、Ｔ３０、Ｓ３１、Ｓ３２Ａ、Ｉ５１、Ｐ５３Ａ、Ｎ５４、Ｓ５５、Ｇ５６、Ｎ５７、Ｔ５８、Ｙ６０、Ｎ６１、Ｅ６２、Ｋ６３、Ｆ６４、Ｋ６５、Ｖ６６Ａ、Ｙ１００、Ｄ１０４及びＹ１０５から選択される位置で１以上の置換を有し得る。さらに又は代替的に、抗体は、配列番号２内に、Ｇ９６、Ｓ９７、Ｈ９８及びＰ１００から選択される位置で１以上の置換を有し得る。アミノ酸置換は、配列番号１及び２の配列を有する抗体と比較して、置換がＮＴＳＲ１に対する抗体の結合親和性を有意に（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％以下に）低下させない限り、任意のアミノ酸（例えば、Ａｌａ）であり得る。ＮＴＳＲ１への抗体の結合親和性は、当技術分野では周知であり、又はここに説明される種々の方法、例えば細胞におけるＮＴＳＲ１への又はＥＣＬ２ペプチドへの結合を用いて特定され得る。
ある実施形態では、抗ＮＴＳＲ１抗体は、ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）又はＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）の配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ＡＲＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号６）、ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）の配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）又はＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する。
ある実施形態では、抗体（例えば、ｈ７Ｃ３－１）は、ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）、ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）を有する。
ある実施形態では、抗体（例えば、ｈ７Ｃ３－２）は、ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）、ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及びＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）を有する。
ある実施形態では、抗体（例えば、ｈ７Ｃ３－３、ｈ７Ｃ３－４又はｈ７Ｃ３－５）は、ＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）、ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及びＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）を含む。
ある実施形態では、抗体（例えば、ｈ７Ｃ３）は、ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）、ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）、ＡＲＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号６）、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）、及びＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）を有する。
ある実施形態では、抗体は、配列番号１３又は１５の配列を有するＶＨ、及び配列番号１４又は１６の配列を有するＶＬを含む。
配列番号１３
ＱＶＱＬＱＱＰＧＴＶＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨＷＡＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＶＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＨＹＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１４
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＡＨＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
配列番号１５
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＨＹＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１６
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＡＨＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
ここに用いられるように、用語「抗体」は、抗原結合活性を有する種々の抗体構造体を含み、限定されることなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、全長抗体又はその断片、Ｆｃ領域を含む抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体、ｓｃＦＶマルチマー、単価抗体、多価抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む。
ここに開示される抗体ＣＤＲ配列に基づいて、熟練した実践者は、当技術分野において周知の方法、例えば組換え方法を用いて、種々の形態において抗ＮＴＳＲ１抗体を生成可能となる。
また、ここに説明される抗ＮＴＳＲ１抗体のうちの１つをコードする単離された核酸分子（例えば、発現ベクター）又はその構成要素も、ここでは考慮される。核酸を含む宿主細胞も、ここに提供される。核酸分子及び宿主細胞は、抗ＮＴＳＲ１抗体を生成するのに用いられ得る。
ここに説明される抗ＮＴＳＲ１抗体のいずれも、当技術分野では周知の方法を用いて非抗体分子に結合されて抗体複合体を形成し得る。非抗体分子は、例えば、ポリペプチド、ポリマー、オリゴ糖、脂質、糖脂質、固体支持体（例えば、ビーズ又はプレート）、低分子薬物（例えば、細胞毒性薬物）、ビオチン、核酸分子、担体タンパク質又は検出可能標識（例えば、蛍光標識）であり得る。非抗体分子は、切断可能リンカー（例えば、バリン－シトルリン）又は非切断可能リンカー（例えば、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）又はマレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル）を介して抗体に連結され得る。そのような抗体複合体は、癌を処置すること又はサンプルにおけるＮＴＳＲ１を検出することなどの種々の目的に用いられ得る。
ある実施形態では、抗体複合体は、薬物が癌細胞を阻害し又は腫瘍を処置するための、例えば、ＮＴＳＲ１を発現する癌細胞又は腫瘍のためのものである抗体薬物複合体である。ある実施形態では、薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
ここに説明される抗体又は抗体複合体のいずれも、ＮＴＳＲ１とそのリガンドの間の結合を阻害し、ＮＴＳＲ１の機能を阻害し、サンプルにおけるＮＴＳＲ１タンパク質若しくはその断片を（例えば、免疫アッセイにおいて）検出し、ＮＴＳＲ１を発現する組織若しくは細胞に（例えば、細胞を同定し、又はＮＴＳＲ１発現細胞を単離するように）結合し、癌細胞若しくは腫瘍の成長を阻害し、又は被検体における癌を処置するのに用いられ得る。
用語「サンプル」は、任意の生物学的サンプル、例えば、体液サンプル、血液サンプル、細胞サンプル、尿サンプル、唾液サンプル又は組織サンプルであり得る。
ＮＴＳＲ１を発現する腫瘍は、抗ＮＴＳＲ１抗体又はその複合体の潜在的な標的であり得る。そのような腫瘍は、限定されることなく、中皮腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頚部扁平上皮癌、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍又は肝臓癌を含む。任意選択的に、被検体に抗ＮＴＳＲ１抗体又は複合体のうちいずれかを投与する前に、被検体における腫瘍がＮＴＳＲ１を発現するか否かについて特定され得る。処置方法は、単独で、又は他の薬物若しくは療法との併用で行われ得る。
「被検体」は、ヒト又は非ヒト動物をいう。「処置している／治療している」又は「処置／治療」は、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態又は障害になりやすい傾向を治癒し、緩和し、軽減し、修復し、発症を遅延させ又は改善することを目的とした、障害を有する被検体への化合物又は組成物の投与をいう。「有効量」は、処置された被検体に医学的に望ましい結果をもたらし得る化合物又は組成物の量をいう。
ここで説明する抗ＮＴＳＲ１抗体及び抗体複合体はいずれも、種々の投与経路、例えば、静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、髄腔内又は皮下経路の投与に適した薬学的組成物として処方され得る。薬学的組成物は、水性溶液又は凍結乾燥製剤であり得る。それは、薬学的に許容可能な担体、例えば、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含み得る。薬学的組成物は、抗体又は抗体複合体とともに作用する他の活性原料、例えば、他の治療薬又は補助剤を含み得る。
以下の具体例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いずれにしても開示の残りを限定するものではない。更なる詳述なしに、当業者であればここでの説明に基づいて、本開示をその最大限に利用し得ると考えられる。ここに引用されるすべての刊行物は、その全体において参照によって取り込まれる。
実施例１ 材料及び方法
細胞株
Ａ５４９（ＮＳＣＬＣ）細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）を有するＦ－１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）において維持した。Ｈ１２９９（ＮＳＣＬＣ）細胞を、１０％のＦＢＳ及び２ｍＭのＬ－グルタミンを補足したＲＰＭＩ培地において維持した。ＨＡ２２Ｔ（ＨＣＣ）を、１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸及び２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）を補足したＤＭＥＭ培地において維持した。Ｍａｈｌａｖｕを、１０％のＦＢＳを補足したＤＭＥＭ培地において維持した。ＰＣ－３（ＰＣａ）細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び１０％のＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社、ＳＨ３００２７）において維持した。
マウスの免疫付与及びＲＮＡ精製
５匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（４～６週齢）に、１２週間にわたって２週間に１回、０．１ｍｇの卵白アルブミン結合ＥＣＬ２ペプチドの腹腔内注入を与えた。各免疫付与の１週間後に血液サンプルを採取し、間接的酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって滴定を行った。合計６回の追加免疫後、マウスを屠殺して脾臓を摘出した。細胞を可溶化し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、独国）によりマウスからｔｏｔａｌ ｍＲＮＡを生成した。
重鎖のＲＴ－ＰＣＲ増幅及びカッパー鎖精製
収穫したマウス脾臓のＴｏｔａｌ ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔにより製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）の手順に従って抽出した。純度及び濃度を、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度（Ａ）（Ａ２６０／Ａ２８０）を測定することによって特定した。１μｌのＲＮａｓｅＯｕｔ（４０Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＭｕＪＨ（又はＭｕＪＫ）－ＦＯＲプライマーの混合物とともに逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、３５０ｎｇのｍＲＮＡ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社）から第一鎖ｃＤＮＡを生成した。
ファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーの構築
簡潔には、ライブラリー構築工程は、（ｉ）フレームワーク領域ファミリー特異的プライマーを用いたＶＨ及びＶＬドメインの増幅、（ｉｉ）リンカーセグメントを含むプライマーによる各セグメントの再増幅、（ｉｉｉ）オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による両セグメント（ＶＨ及びＶＬ）のアセンブリ、の３ステップからなる。すべてのＰＣＲ反応を、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲＲ００１Ａ）、並びにマウス重鎖及びカッパー軽鎖に特異的なプライマーにより行った。Ｂｅｎｈａｒ及びＲｅｉｔｅｒ、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００２年、第１０章：ｐ．ユニット１０ １９Ｂ参照。
ｓｃＦｖを含むＰＣＲ産物を、過剰な制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ（ＮＥＢ）により消化し、約１０．０μｇを、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ－直鎖化ｐＨＥＮ２ベクター（アガロースゲル抽出によって精製）とともに、合計体積１００μｌにおいて、２４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）により１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーションに続けて、組換えＤＮＡを沈殿させ、洗浄し、２０μｌの蒸留水に溶解した。１μｌの組換えＤＮＡを、その都度、エレクトロポレーションによって２５μｌの大腸菌ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）に形質転換した。形質転換後、２０ｍｌのＲｅｃｏｖｅｒ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）を添加し、培養物を３７℃で１時間振とうしてから、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌの２ＹＴを３７℃で振とう機においてさらに１６～１８時間培養した。この時点で、アンピシリン耐性コロニー数を計数することによって計算されるライブラリーサイズを力価とするように、培養アリコートを２ＹＴ寒天／アンピシリン上に播種した。ｓｃＦｖを含むファージミドを、この一晩の培養物から調製した。Ｍ１３Ｋ０７（約１０１２ｐｆｕ）のヘルパーファージを、ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを含むＴＧ１サンプルに添加し、振とうにより３７℃で２～３時間インキュベーションした。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、培養物を３０℃で一晩振とうした。細胞を４℃において２０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を５０ｍｌの２０％のＰＥＧ８０００／２．５ＭのＮａＣｌと混合し、氷上で６０分間インキュベーションしてから４℃において２０分間８０００ｒｐｍで遠心分離することによってファージを沈殿させた。上清を廃棄し、ペレットを水切りした。ファージを、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ボルテックスし、１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離してデブリをペレット化した。上清を、４℃で保存し又は次のバイオパニング工程に直接用いた。
ファージの親和性選択（パニング）
ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢＳＡ及び０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＮ３を含む１０倍の体積のＴＢＳで予洗浄し、洗浄したビーズを２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢＳＡ、５ｍＭのＤＴＴ及び０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＮ３を含むＴＢＳに懸濁した。ｓｃＦｖファージライブラリーの非特異的結合を、１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブにおいて最終体積５００ｕｌのストレプトアビジンビーズにより枯渇させ（ＴＢＳにおける４％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢＳＡと、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＴｗｅｅｎ－２０及び１０ｍＭのＤＴＴとの５００ｕｌに２×１０１２ファージ粒子を混合し）、そして６０μｌの予洗浄したストレプトアビジンビーズを添加し、４℃で一晩インキュベーションした。次に、３ｍｌの１×ＴＢＳ、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢＳＡ、０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＴｗｅｅｎ－２０及び５ｍＭのＤＴＴにおける０．４μｇのビオチン－ヒトＮＴＳＲ１直鎖ＥＣＬ２ペプチドを、２ｍｌの予め吸着されたファージ粒子（２×１０１２ファージ粒子）に添加し、混合物を免疫チューブにおいて室温（ＲＴ）で４時間インキュベーションした。２回のパニングサイクル後、ファージミド保有細胞の個々のコロニーを用いて、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされる滅菌９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社、スウェーデン）においてモノクローナルファージを調製した。
ファージＥＬＩＳＡ
９６ウェルＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社）に、洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０ ＰＨ７．２）における５ｍｇ／ｍｌのビオチン－ヒトＮＴＳＲ１直鎖ＥＣＬ２ペプチドを１００ｍｌ充填した。翌日、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、洗浄緩衝液における５％の脱脂乳で１時間、室温でブロッキングした。洗浄緩衝液でさらに洗浄した後、ウェルあたり１００μｌの新たに調製したファージを添加し、室温で１時間インキュベーションした。プレートを、洗浄緩衝液で再度洗浄し、１：５０００に希釈した抗Ｍ１３抗体（ａｂ２４２２９）を各ウェルに室温で１時間配置し、続けて洗浄緩衝液でさらに洗浄した。１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ社、１１５－０３５－００３）を各ウェルに室温で１時間配置し、続けて洗浄緩衝液でさらに洗浄した。最後に、追加の１００μｌの３，３’，４，４’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＨＲＰ基質）溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社）を各ウェルに添加し、室温でインキュベーションした。反応を、各ウェルに１００μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって停止させた。プレートを、プレートリーダー（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸリーダー）により４５０ｎｍで分析した。
抗体の構築及び発現
７Ｃ３の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの配列を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社によるｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１及びｐＦＵＳＥ２－ＣＬＩｇ－ｈＫベクターにコードされたヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトＩｇＧ（κ）軽鎖の定常ドメインの配列にそれぞれ融合させた。ヒト－マウスキメラ抗体の発現を、ベクターをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションすることによって達成した。そして、分泌された抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィによって培養上清から精製し、キメラ化後もなお抗原結合能を保持するか否かについて特定するように試験した。
部位特異的突然変異誘発を介した親和性成熟
すべての突然変異を、オーバーラップ伸長ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインに導入した。ＶＨ及びＶＬの突然変異したコード領域を、特定のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、それらの共通のオーバーラップを介してアニーリングし、２回目のＰＣＲ反応で増幅してから精製し、ｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１又はｐＦＵＳＥ２－ＣＬＩｇ－ｈＫベクターにそれぞれライゲーションした。大腸菌ＪＭ１０９（ＥＣＯＳ（商標）９－５）の形質転換後、各個々の突然変異体について、適切な制限酵素による消化によって、個々のコロニーをスクリーニングした。この分析的な制限酵素消化によって同定された推定突然変異体を、シーケンシングによって確認した。
ＮＴＳＲ１－結合親和性アッセイ
異なる抗体のＮＴＳＲ１結合能を、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。簡潔には、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｃａｔ：１５１２８）を、５μｇ／ｍｌの最終濃度でのｃｙＬ２－ビオチンペプチドにより室温で１時間コーティングした。翌日、コーティング溶液を除去し、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）における５％（ｖ／ｖ）の無脂肪乾燥乳により１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄した後、勾配濃度の抗ＮＴＳＲ１抗体をトリプリケートで添加した。１時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、続けて室温でさらに１時間、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（１００μＬ）の各ウェルへの添加を行った。最後に，１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を各ウェルに添加して、可視化のための発色を生成させた。２分間のインキュベーション後、１００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、プレートリーダーにより４５０ｎｍで読み取った。
フローサイトメトリ
合計１×１０６個の細胞を、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ）において抗ＮＴＳＲ１抗体と４℃で６０分間反応させ、２回洗浄して過剰な抗体を除去した。ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））結合マウス抗ヒトＩｇＧ２次抗体を、氷上でさらに６０分間インキュベーションした。細胞を再度洗浄し、続けて４℃でさらに１０分間、０．５ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含む１ｍｌのＰＢＳとのインキュベーションを行った。データを、ＦＡＣＳ（Ｂｉｏ－Ｒｅｄ Ｓ３ｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）によって１０，０００個の生細胞について収集した。チャネルＦＬ－１による蛍光強度を、Ｆｌｏｗ Ｊｏフローサイトメトリ解析ソフトウェアで計算した。
表面プラズモン共鳴
ＮＴＳＲ１特異的ｍＡｂの、ＮＴＳＲ１の細胞外ループ２（ＥＣＬ２）ペプチドとの相互作用は、Ｏｐｅｎ ＳＰＲ（Ｎｉｃｏｙａ社、カナダ）装置を用いて表面プラズモン共鳴によって測定された。ビオチン結合ＥＣＬ２ペプチドを、ＨＢＳ－ＥＰ５緩衝生理食塩水（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０及び０．５％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４）において１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈したペプチドを流速３０μｌ／ｍｉｎで注入することによって、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサーチップに固定化した。速度論的実験について、ＨＢＳ－ＥＰ５において２４～１．５ｎＭの範囲の濃度に希釈したＮＴＳＲ１特異的ｍＡｂを、固定化ＥＣＬ２ペプチド上に３０μｌ／ｍｉｎの流速で注入した。様々な濃度でのＮＴＳＲ１特異的ｍＡｂの固定化ＥＣＬ２ペプチドへの結合を、ＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒソフトウェア（Ｎｉｃｏｙａ社、カナダ）を用いて分析した。会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）及び親和性（ＫＤ）を、データを単純な１：１結合モデルに当てはめて、グローバル解析を用いて計算した。
様々なＮＴＳＲ１発現細胞株におけるＮＴＳＲ１抗体の内在化（フローサイトメトリ）
ＮＴＳＲ１抗体をフローサイトメトリ分析に用いて、Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＨＡ２２Ｔ及びＭａｈｌａｖｕを含む、様々な肺及びＨＣＣ細胞株におけるＮＴＳＲ１発現レベルを比較した。合計１×１０６個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液においてｈ７Ｃ３－３抗体と４℃で６０分間反応させ、２回洗浄して過剰な抗体を除去した。そして、細胞を４℃又は３７℃に０、０．５、２、５、２４時間移し、続けて抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）２次抗体とのさらなるインキュベーションを４℃で６０分間行った。細胞を再度洗浄し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａによってデータを収集した。チャネルＦＬ－１による蛍光強度を、Ｆｌｏｗ Ｊｏフローサイトメトリ解析ソフトウェアで計算した。
Ａ５４９細胞におけるｈ７Ｃ３－３又はｈ７Ｃ３－３－ＡＤＣ抗体の内在化（フローサイトメトリ）
合計１×１０６個の細胞を、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液において、示された抗体又はＡＤＣと４℃で６０分間反応させ、洗浄して過剰な抗体又はＡＤＣを除去した。そして、細胞を４℃又は３７℃に９０分間移した。細胞表面におけるｈ７Ｃ３－３又はｈ７Ｃ３－３－ＡＤＣの相対数を特定するために、細胞を、飽和量のＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））結合マウス抗ヒトＩｇＧ抗体により染色し、氷上でさらに６０分間インキュベーションした。細胞を再度洗浄し、続けて０．５ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含む１ｍｌのＰＢＳとともに４℃で１０分間のさらなるインキュベーションを行った。データを、ＦＡＣＳ（Ｂｉｏ－Ｒｅｄ Ｓ３ｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）によって１０，０００個の生細胞において収集した。チャネルＦＬ－１による蛍光強度を、Ｆｌｏｗ Ｊｏフローサイトメトリ解析ソフトウェアで計算した。
抗ＮＴＳＲ１抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製
ｈ７Ｃ３－３又はｈ７Ｃ３－４を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）ｐＨ ６．９及び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）における０．１モル当量のＴＣＥＰ－ＨＣｌ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）により３７℃で２時間処置した。還元された抗体を、ｖｃＭＭＡＥ（Ａｃｈｅｍｂｌｏｃｋ社、Ｑ７０２３１）と室温で６０分間反応させた。未反応のｖｃＭＭＡＥを、１ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いてクエンチングし、室温で３０分間インキュベーションした。そして、反応混合物を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてＰＢＳ（ｐＨ６．９）に緩衝液交換した。
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）分析
ｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－３ ＡＤＣの特徴付けを、以下の、１２００ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲ ｃｏｌｕｍｎ（４．６×３５ｍｍ、粒子サイズ２．５μｍ、ＴＯＳＯＨ社）、１．５ｍｏｌＬ－１の硫酸アンモニウム及び２５ｍＭのリン酸塩（ｐＨ＝６．９５）の溶媒Ａ、７５％（Ｖ／Ｖ）２５ｍＭのリン酸塩と、２５％（Ｖ／Ｖ）のイソプロパノール（ｐＨ＝６．９５）との溶媒Ｂ、勾配は１５分にわたって１００％Ａから１００％Ｂであり、流速０．５ｍＬｍｉｎ－１、カラム温度２５℃、ＵＶ検出波長２８０ｎｍ、のようにＨＩＣを用いて行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ
生細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｇ７５７１）を用いて特定した。細胞を、９６ウェルの不透明Ｃｏｓｔａｒプレート（カタログ番号１３６１０１）に播種した。簡潔には、９０μＬの培地における５００～２５００個の細胞をクワドラプリケートで各ウェルに添加し、１６時間接着させた。抗ＮＴＳＲ１（用量範囲：０～５００ｎＭ）、抗ＮＴＳＲ１－ＭＭＡＥ（用量範囲：０～５００ｎＭ）又はパクリタキセル（用量範囲：０～１００ｎＭ）を、１０μｌで添加した。７２～１２０時間後、培地を除去し、２００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）生存試薬含有培養培地（１：１）を各ウェルに添加し、暗所におけるオービタルシェーカーに２分間配置した。プレートを、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＧＭ３５００）における読取り前に、室温で１０分間安置した。
薬物動態
ｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－４の薬物動態を、Ｂ６マウスにおいて評価した。Ｂ６マウス（ｎ＝６）に、尾静脈注入によって（抗体の成分に基づいて）１０ｍｇ／ｋｇの試験材料を投与した。血液サンプルを、注入後１、２及び６時間目並びに１、２、３、４、７、９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５、３５及び４２日目に伏在静脈を介して各マウスから採取し、血清サンプルを採取した。ｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－４の血漿濃度を、ＩｇＧ（Ｔｏｔａｌ）Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＢＭＳ２０９１）によって測定した。
マウス異種移植腫瘍モデル及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）処置
ＢｉｏＬＡＳＣＯ社から購入した７週齢の（Ｈ１２９９及びＰＣ－３異種移植研究のための）免疫不全の雄のＮＵ／ＮＵヌードマウス及び（ＨＡ２２Ｔ－Ｌｕｃ異種移植研究のための）雄のＦｏｘ ＣｈａｓｅＳＣＩＤ（登録商標）マウスを、ＡＡＡＬＡＣ国際認定施設である国立衛生研究院（ＮＨＲＩ）の実験動物センターで、エアフィルター及び滅菌寝具材料を装備した滅菌ケージに収容した。すべてのマウスに、研究全体を通して１２時間の明／１２時間の暗サイクル下で、滅菌水及び餌を自由に摂食させた。腫瘍細胞接種日に、光学顕微鏡下でトリパンブルー染色による血球計算盤を用いることによって生存細胞数を計数した。細胞を、フェノールレッド不含培地［ＲＰＭＩ１６４０（Ｈ１２９９）又はＤＭＥＭ（ＨＡ２２Ｔ－Ｌｕｃ）］又はＰＢＳ（ＰＣ－３）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（３５６２３７、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、マサチューセッツ州、米国）に１：１の比率で懸濁した。Ｈ１２９９（１×１０６個の細胞）、ＨＡ２２Ｔ－Ｌｕｃ（５×１０６個の細胞）及びＰＣ－３（１×１０６個の細胞）を、１ｍＬの注射器（２４Ｇ×１インチ針）を用いてヌードマウス又はＳＣＩＤマウスの左側腹部に皮下移植した。腫瘍の寸法を、デジタルノギスにより測定し、腫瘍の体積（ｍｍ３）を、体積＝（長さ×幅∧２）／２の式によって計算した。担腫瘍マウスは、群分けされ（群あたりｎ＝５～８匹）、平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３になった場合に投与された。３つの個々の異種移植研究では、ヒトＩｇＧ（ＨＵ－ＧＦ－ＥＤ、ロット番号１２０９１６ＤＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社、ミズーリ州、米国）、ｈ７Ｃ３－４、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥを、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で投与する前に、１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝生理食塩水（０２－０２３－５Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、コネチカット州、米国）で新たに希釈した。シスプラチン（ＫＥＭＯＰＬＡＴ、１ｍｇ／ｍＬ、８７２００００９ＡＡ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ社、バート ホンブルク、独国）を購入した。Ｈ１２９９異種移植研究では、担腫瘍マウスを、ヒトＩｇＧ－１０ｍｇ／Ｋｇ群（陰性コントロール）、シスプラチン－７ｍｇ／Ｋｇ群（陽性コントロール）、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ－１０ｍｇ／Ｋｇ群、ｈ７Ｃ３－４－１０ｍｇ／Ｋｇ群及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ－１０ｍｇ／Ｋｇ群の５群（群あたり６匹のマウス）に分割した。マウスに、３週間にわたって１週間あたり１回のシスプラチン群を除いて、３週間にわたって１週間あたり２回、４ｍＬ／Ｋｇの用量体積を尾静脈から静脈内注入した。ＨＡ２２Ｔ－Ｌｕｃ異種移植研究では、担腫瘍マウスをヒトＩｇＧ－１０ｍｇ／Ｋｇ群（陰性コントロール）、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ－１０ｍｇ／Ｋｇ群及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ（ＡＤＣ）－１０ｍｇ／Ｋｇ群の３群（群あたり８匹のマウス）に分割した。マウスに、２週間にわたって１週間あたり２回で、４ｍＬ／Ｋｇの用量体積を尾静脈から静脈内注入した。ＰＣ－３異種移植研究では、担腫瘍マウスを、未処置群（５匹のマウス）及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ（ＡＤＣ）－１０ｍｇ／Ｋｇ（８匹のマウス）の２群に分割した。ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ－１０ｍｇ／Ｋｇ群におけるマウスに、３週間にわたって１週間あたり２回で、４ｍＬ／Ｋｇの用量体積を尾静脈から静脈内注入した。各処置は体重に基づいていた。体重及び腫瘍のサイズを、１週間に２回測定した。
免疫組織化学
脱パラフィンした組織切片（４μｍ）を、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９）において９５℃で３０分間、熱誘導性エピトープ回復させた。切片を、阻害物質ＣＭにより３７℃で４分間ブロッキングした。スライドを、２μｇ／ｍｌの抗ＮＴＳＲ１－Ｂ１２（ＳＣ－３７６９５８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び様々な抗ＮＴＳＲ１抗体クローン（７Ｃ３、ｈ７Ｃ３－２及びｈ７Ｃ３－３）を含む１次抗体とともに１時間インキュベーションした。そして、スライドを、適切な２次抗体、抗ＮＴＳＲ１－Ｂ１２のためのＯｍｎｉＭａｐ抗マウス－ＨＲＰ並びに７Ｃ３、ｈ７Ｃ３－２及びｈ７Ｃ３－３のための抗ヒト－ＨＲＰとともに、室温で３０分間インキュベーションした。染色を、ジアミノベンジジン四塩酸塩により行った。
実施例２ ７Ｃ３抗体の特徴付け
ヒトＮＴＳＲ１に対する抗体を、ヒトＮＴＳＲ１の細胞外ループ２（ＥＣＬ２）ペプチドを用いたペプチド免疫付与及びファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって生成し、その結果７Ｃ３ｓｃＦｖを単離した。固有の７Ｃ３ｓｃＦｖ結合体を、全長ＩｇＧに変換し、環状ＥＣＬ２ペプチドへの結合親和性について試験した。図１Ａ参照。７Ｃ３ ＩｇＧの細胞表面ＮＴＳＲ１への結合を、肺癌細胞株Ａ５４９細胞におけるフローサイトメトリにより測定した。７Ｃ３抗体は、Ａ５４９細胞への強い結合を示した。図１Ｂ参照。
実施例３ 抗ＮＴＳＲ１抗体の親和性成熟
７Ｃ３抗体（配列番号１及び２を有する）の親和性を増加させるために、コンピュータモデルの使用を通じて変異体を試験した。実際の集団のものと同様の特性を示す３次元構造を有する個別の抗体及び抗原の大きなレパートリーが、モデルの基礎にある。ｈ７Ｃ３－１（ＣＤＲ Ｈ３にＹ１００Ｈの突然変異を有する）、ｈ７Ｃ３－２（ＣＤＲ Ｈ３にＹ１００Ｈの突然変異及びＣＤＲ Ｌ３にＳ９７Ａの突然変異を有する）及びｈ７Ｃ３－３（ＣＤＲ Ｈ１にＴ２８Ａの突然変異、ＣＤＲ Ｈ３にＹ１００Ｈの突然変異及びＣＤＲ Ｌ３にＳ９７Ａの突然変異を有する）を含む３つの変異体を作成した。親和性増強における変異体の活性を調査するために、それらの抗体をＦＡＣＳ分析した。これらの変異体のうち、ｈ７Ｃ３－３は、０．３ｎＭのより低いＫＤ値（図２）及び１．１μｇ／ｍｌのＥＣ５０値（表１）を明らかにし、これらのアミノ酸置換は親和性の向上をもたらすことが示された。表２にｈ７Ｃ３－３のＣＤＲ配列を示す。
表１．親和性成熟後の種々の抗ＮＴＳＲ１抗体の親和性
ａＡ５４９細胞における抗ＮＴＳＲ１抗体（１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）の用量依存的結合能
ｂＡ５４９細胞における、それぞれ、抗ＮＴＳＲ１抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対する効果的濃度（ＥＣ５０）
表２．ｈ７Ｃ３－３のＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔの定義）
実施例４ 抗ＮＴＳＲ１抗体のＣＤＲ領域のアラニンスキャニング
抗原結合に伴うＣＤＲ Ｈ３の許容部位を同定するために、ｈ７Ｃ３のＣＤＲ Ｈ３の８箇所の部位で実験的アラニンスキャニング突然変異誘発を用いて変異体を試験した。変異体を、環状ＥＣＬ２ペプチドに結合するそれらの能力について酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）において比較した。Ｒ９８Ａ、Ｙ９９Ａ、Ｙ１００Ａ、Ｙ１０１Ａ、Ｇ１０２Ａ及びＦ１０３Ａは、ペプチドに対するｈ７Ｃ３の明白な親和性を約３０～７０％有意に減少させた。Ｄ１０４Ａ及びＹ１０５Ａを含む他の置換は、ｈ７Ｃ３親和性に影響を与えなかった。コンピュータモデリングの結果に基づき、ｈ７Ｃ３結合活性に対するＹ１００のＨによる置換を調査した。Ｙ１００Ｈの突然変異を有するｈ７Ｃ３は、より高い親和性を示した。
結果は、ｈ７Ｃ３－１抗体（ＣＤＲ Ｈ３内にＹ１００Ｈの突然変異を含むｈ７Ｃ３）は、親ｈ７Ｃ３と比較してより高い親和性を示すことを示した。ｈ７Ｃ３－１におけるＣＤＲ Ｌ３における９箇所の部位の変異体を、アラニンスキャニング突然変異誘発を介して試験した。いくつかの残基、特にＦ９４Ａ及びＷ１０１Ａ（３０％～４０％減）、さらにＬ９９Ａ（７０％減）は、ｈ７Ｃ３－１親和性を有意に減少させであった。Ｇ９１のＡによる置換は、ペプチドについてｈ７Ｃ３－１の親和性に大きな増加をもたらした。Ｇ９６Ａ、Ｓ９７Ａ、Ｈ９８Ａ及びＰ１００Ａを含む他の置換では、ｈ７Ｃ３－１親和性に対する影響はなかった。細胞表面ＮＴＳＲ１への変異体の結合をさらに確認するために、Ｇ９６Ａ、Ｓ９７Ａ、Ｈ９８Ａ又はＰ１００Ａを有するｈ７Ｃ３－１をＦＡＣＳ分析した。Ｇ９６Ａ又はＰ１００Ａの突然変異は、ｈ７Ｃ３－１の細胞表面ＮＴＳＲ１への結合親和性を、ｈ７Ｃ３－１のものと比較して有意に低下させ、一方でＨ９８Ａは、そのＮＴＳＲ１への結合にわずかに影響を与える。驚くことに、Ｓ９７Ａの突然変異を有するｈ７Ｃ３－１は、より高い親和性を示した。
抗原抗体相互作用に重要な残基を同定するために、ｈ７Ｃ３－２のＣＤＲ Ｈ１及びＣＤＲ Ｈ２の１０箇所及び１８箇所の部位にそれぞれアラニンスキャニング突然変異誘発を行なった。Ｇ２６Ａ、Ｙ２７Ａ、Ｗ３３Ａ、Ｉ３４Ａ、Ｈ３５Ａ、Ｑ５０Ａ、Ｒ５２Ａ及びＹ５９Ａは、ｈ７Ｃ３－２のペプチドに対する明白な親和性を約５０％以上有意に減少させた。２８個の突然変異体のうち１９個が、ＣＤＲ Ｈ１の５個（Ｔ２８Ａ、Ｆ２９Ａ、Ｔ３０Ａ、Ｓ３１Ａ及びＳ３２Ａ）及びＣＤＲ Ｈ２の１４個（Ｉ５１Ａ、Ｐ５３Ａ、Ｎ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｇ５６Ａ、Ｎ５７Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｙ６０Ａ、Ｎ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｋ６３Ａ、Ｆ６４Ａ、Ｋ６５Ａ及びＶ６６Ａ）を含み、８０％を超えるｈ７Ｃ３－２結合活性を保持した。Ｔ２８Ａ又はＮ５４Ａの突然変異を有するｈ７Ｃ３－２変異体は、ペプチドに対するより高い結合親和性を示し、ＦＡＣＳ分析された。興味深いことに、ＣＤＲ Ｈ１にＴ２８Ａの突然変異を有するｈ７Ｃ３－２は、Ａ５４９細胞におけるＮＴＳＲ１についてより高い親和性を示した。
実施例５ ｈ７Ｃ３－３内在化
ｈ７Ｃ３－３が細胞表面に結合すると内在化され、したがって細胞毒性ペイロード複合体の候補を示す否かについて試験するために、Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＨＡ２２Ｔ又はＭａｈｌａｖｕ細胞を抗体（１０μｇ／ｍｌ）に曝露し、ＦＡＣＳによって分析した。図３Ａに示すように、インキュベーション時間の延長とともに、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の大きさは、細胞が４℃から３７℃まで推移すると徐々に低下し、Ａ５４９細胞によって取り込まれるｈ７Ｃ３－３抗体の数が増加することを表した。同様の結果は、Ｈ１２９９細胞（図３Ｂ）、ＨＡ２２Ｔ細胞（図３Ｃ）及びＭａｈｌａｖｕ細胞（図３Ｄ）において観察された。これらの結果は、ｈ７Ｃ３－３が速やかにかつ効率的にＮＴＳＲ１発現細胞に内在化されることを示した。
実施例６ ｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－５の特徴付け
ｈ７Ｃ３－３の薬物動態特性を向上するために、（ｈ７Ｃ３－３と比較してＶＨドメインにＳ９Ｔ及びＤ８２Ｅの突然変異並びにＶＬドメインにＫ７９Ｔの突然変異を有する）ｈ７Ｃ３－４を、コンピュータモデルの使用を通じて作成した。図４Ａに示すように、より低い等電点（ｐＩ）値を有するｈ７Ｃ３－４は、ｈ７Ｃ３－３と比較して同様の結合親和性を示した。さらに、ｈ７Ｃ３－４は、ｈ７Ｃ３－３と比較して伏在静脈注入後のクリアランスを有意に向上させた。図４Ｂ参照。これらの結果は、ｈ７Ｃ３－４がより良好な薬物動態を有することを示した。
さらなる変異体、ｈ７Ｃ３－５も作成した。図５のＡ及びＢ参照。ｈ７Ｃ３－５は、Ａ５４９細胞におけるＮＴＳＲ１に対して、ｈ７Ｃ３－４と比較して同様の結合親和性を示した。図５Ｃ参照。
実施例７ 抗ＮＴＳＲ１抗体複合ＭＭＡＥの特徴付け
Ｅｘｐｉ２９３細胞におけるｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－の高効率生成の達成に応じて、切断可能な化学的リンカーを介した、抗有糸分裂性チューブリン阻害剤モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）との抗ＮＴＳＲ１抗体の複合体について調査した。ＡＤＣを、分子内のジスルフィド結合の部分的還元に続けてチオール反応性のマレイミド含有薬物リンカーによる複合によって調製した。これら２つのＡＤＣの同一性をＨＩＣによって確認した。ＨＩＣ分析は、複合の抗ＮＴＳＲ１抗体あたり０、２、４、６又は８個の薬物分子に対応する５つの主要ピークへの分解を可能とし（図６のＡ及びＢ）、平均ＤＡＲは約３．８～４であった。
実施例８ 抗ＮＴＳＲ１抗体薬物複合体の内在化効率性
標的細胞に導入されるペプチド切断可能なマレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）リンカーからなる抗ＮＴＳＲ１ ＡＤＣ、及び通常はリソソームのプロテアーゼによるそれらの後続の放出は、細胞毒性薬物送達のために重要である。ＮＴＳＲ１発現ＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９における、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ ＡＤＣの内在化を測定し、ヒトＩｇＧ Ａｂ（陰性コントロール）及び非複合親Ａｂ（陽性コントロール）と比較した。ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及び非複合親Ａｂ（ｈ７Ｃ３－３）の双方は、細胞表面における結合効率性を有し、細胞分布は右側である（図７Ａ）。ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ又はｈ７Ｃ３－３の内在化を開始するために、１次抗体処置細胞を、２次検出Ａｂインキュベーション前に、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁して３７℃で９０分間インキュベーションした。１次抗体が３７℃で細胞に内在化された場合、細胞分布は左側である。ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及び非複合親抗体（ｈ７Ｃ３－３）の双方は、効率的に内在化された。図７のＢ及びＣ参照。
実施例９ 抗ＮＴＳＲ１抗体薬物複合体の細胞毒性効果
ＮＴＳＲ１特異的ＡＤＣを、ｈ７Ｃ３－３、ｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－５のドラスタチン類似体ＭＭＡＥとの複合によって生成した。アウリスタチンは、微小管を破壊することによって細胞死を誘導する強力な細胞毒性薬剤である。ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ、ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－５－ＭＭＡＥは、ヒト血漿における最適な安定性及びヒトカテプシンＢによる効率的な切断のために設計されたプロテアーゼ感受性バリン－シトルリンジペプチド配列を含む。内在化に続いて、リボソームのプロテアーゼは、抗体及びリンカーの双方を代謝して活性薬物を放出させる。ＮＴＳＲ１特異的ＡＤＣは、ブレンツキシマブベドチン、ポラツズマブベドチン及びエンホルツマブベドチンの最適な治療指数を提供することを示す比率の、抗体あたり平均３．８～４のＭＭＡＥと複合された。
表３．種々のＮＴＳＲ１発現癌細胞株（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）におけるｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥの細胞毒性効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈ７Ｃ３－３及びｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥの直接比較は、標的結合及び内在化の特徴がＡＤＣにおいて保存されることを確認した。表３及び図８参照。ＮＴＳＲ１特異的ＡＤＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて優れた細胞毒性を示した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイでのｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの比較も、ＡＤＣが標的結合、内在化及び細胞毒性を示すことを示した。表４及び図９参照。
ｈ７Ｃ３－５及びｈ７Ｃ３－５－ＭＭＡＥを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて比較した。結果は、このＡＤＣも優れた細胞毒性を示すことを示した。表５及び図１０参照。
表６に示すように、ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－５－ＭＭＡＥは、試験された細胞株において、同等のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を示した。
表４．種々のＮＴＳＲ１発現癌細胞株におけるｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの細胞毒性効果
表５．種々のＮＴＳＲ１発現癌細胞株におけるｈ７Ｃ３－５及びｈ７Ｃ３－５－ＭＭＡＥの細胞毒性効果
表６．種々のＮＴＳＲ１発現癌細胞株におけるｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－５－ＭＭＡＥの細胞毒性効果
実施例１０ ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
標的細胞における抗ＮＴＳＲ１ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ効果を、いくつかのＮＴＳＲ１陽性異種移植モデルにおいて評価した。
ヌードマウスに、ＮＴＳＲ１発現細胞、Ｈ１２９９を皮下接種した（マウスあたり１×１０６個の細胞）。腫瘍が２００ｍｍ３の体積に到達すると、担腫瘍マウスを群分けし（ｎ＝６）、それぞれヒトＩｇＧ（陰性コントロール）、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ、ｈ７Ｃ３－４及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥを６用量分、１０ｍｇ／Ｋｇで１週間に２回静脈内投与した。シスプラチン（陽性コントロール）を３用量分、７ｍｇ／Ｋｇで１週間に１回静脈内投与した。図１１Ａに示すように、１８日目に、１０ｍｇ／Ｋｇのｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥは、コントロールのヒトＩｇＧ（１０ｍｇ／Ｋｇ）及びシスプラチン（７ｍｇ／Ｋｇ）群よりも腫瘍の成長を強力に阻害した。３５日目まで、非小細胞肺癌の臨床治療的な処置において一般的に用いられる陽性コントロールであるシスプラチンと比較して、ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ処置では腫瘍の長期退縮が観察された。さらに、３５日目に、１０ｍｇ／ｋｇのｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥは、腫瘍成長の部分的な阻害を示し、肺異種移植モデルにおいてｈ７Ｃ３－４がｈ７Ｃ３－３よりも効率的に内在化されることを示した。
ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの抗腫瘍有効性を比較するために、５×１０６個のＨＡ２２Ｔ－ｌｕｃ肝癌細胞をＳＣＩＤマウスに皮下接種して実験を行った。担腫瘍マウスを３群（ｎ＝８）に分割した。腫瘍が２００ｍｍ３の体積に到達すると、１０ｍｇ／ＫｇのヒトＩｇＧ、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥをそれぞれ４用量分、１週間に２回静脈内投与した。１５日目に、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥの双方は、腫瘍退縮を示し（図１２Ａ）、３６日目まで、ＡＤＣ処置の双方において腫瘍の長期退縮が観察された。
さらなる実験を、ＰＣ３前立腺癌細胞株（１×１０６個の細胞）の異種移植により、ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ処置を用いて行った（図１３Ａ）。腫瘍が２００ｍｍ３の体積に到達すると、担腫瘍マウスを無処置（ｎ＝５）及びｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ（ｎ＝８）群に分割した。１０ｍｇ／Ｋｇのｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥを６用量分、１週間に２回静脈内投与した。ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥも、ＰＣ３前立腺癌の種類に高い有効性を有することが示された。６０日目まで、ｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥ処置において、腫瘍の長期退縮が観察された。投薬処置による腫瘍退縮は、マウスの一般的な生理学的状態にも体重変化にも異常を誘発せず（図８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ）、ｈ７Ｃ３－３－ＭＭＡＥ又はｈ７Ｃ３－４－ＭＭＡＥがＮＴＳＲ１陽性悪性腫瘍の処置について強力な薬剤であることを示した。
実施例１１ 免疫組織化学染色
前立腺癌細胞におけるＮＴＳＲ１発現を評価するために、ＰＣ－３異種移植腫瘍組織を、２μｇ／ｍｌのＢ－１２（抗ＮＴＳＲ１－Ｂ１２、ＳＣ－３７６９５８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、７Ｃ３、ｈ７Ｃ３－２又はｈ７Ｃ３－３抗体によるＮＴＳＲ１免疫組織化学染色を行なった。図１４参照。免疫組織化学染色は、ＰＣ－３異種移植腫瘍組織における強力なＮＴＲ１発現を示した。これらの抗体のうち、ｈ７Ｃ３－３の染色は、クラスター化され、より顕著にｈ７Ｃ３－３が免疫組織化学染色に適していることを示唆した。
他の実施形態
この明細書において開示されたすべての特徴は、任意の組合せにおいて組み合わされ得る。この明細書において開示された各特徴は、同一、同等又は同様の目的を果たす代替的な特徴によって置換され得る。したがって、明示的に断りのない限り、開示された各特徴は、同等又は同様の特徴の一般的な一連の一例に過ぎない。
上記の説明により、当業者は、説明した実施形態の本質的な特徴を容易に把握することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、実施形態に種々の変更及び修正を加えて種々の使用及び条件にそれを適合させ得る。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲に含まれる。

Claims (24)

  1. 単離された抗体であって、
    配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
    配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、
    を備え、
    ヒトニューロテンシン受容体１（ｈＮＴＳＲ１）に特異的に結合する単離された抗体。
  2. 重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）又はＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）と、
    重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）と、
    重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号６）、ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）と、
    軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）と、
    軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）と、
    軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）又はＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）と、を含む請求項１に記載の単離された抗体。
  3. 重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）と、
    重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）と、
    重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）と、
    軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）と、
    軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）と、
    軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）と、を含む請求項２に記載の単離された抗体。
  4. 重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＡＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号４）と、
    重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）と、
    重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）と、
    軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）と、
    軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）と、
    軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）と、を含む請求項３に記載の単離された抗体。
  5. 配列番号１３の配列であるＶＨ配列及び配列番号１４の配列であるＶＬ配列を含む請求項４に記載の単離された抗体。
  6. 配列番号１５の配列であるＶＨ配列及び配列番号１６の配列であるＶＬ配列を含む請求項４に記載の単離された抗体。
  7. 重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）と、
    重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）と、
    重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）と、
    軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）と、
    軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）と、
    軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）と、を含む請求項２に記載の単離された抗体。
  8. 重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）と、
    重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）と、
    重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＨＹＧＦＤＹ（配列番号７）又はＡＲＹＲＹＧＦＤＹ（配列番号８）と、
    軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）と、
    軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）と、
    軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＡＨＬＰＷＴ（配列番号１２）と、を含む請求項２に記載の単離された抗体。
  9. 重鎖ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＳＷＩＨ（配列番号３）と、
    重鎖ＣＤＲ２：ＱＩＲＰＮＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＶ（配列番号５）と、
    重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号６）と、
    軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号９）と、
    軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）と、
    軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＷＴ（配列番号１１）と、を含む請求項２に記載の単離された抗体。
  10. 組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＩｇＧ１抗体又は抗原結合部位を含む抗体断片である請求項１から９のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  11. ｈＮＴＳＲ１の第２細胞外ループに結合する請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 抗体複合体であって、
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離された抗体と、
    非抗体分子と、
    を含む抗体複合体。
  13. 前記非抗体分子は、ポリペプチド、ポリマー、オリゴ糖、脂質、糖脂質、固体支持体、低分子薬物、ビオチン、核酸分子、担体タンパク質又は検出可能標識である、請求項１２に記載の抗体複合体。
  14. 前記複合体は、抗体薬物複合体である、請求項１３に記載の抗体複合体。
  15. 前記非抗体分子は、ｈＮＴＳＲ１を発現する腫瘍を処置するための制癌剤である、請求項１４に記載の抗体複合体。
  16. 前記腫瘍は、中皮腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頚部扁平上皮癌、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍又は肝臓癌である、請求項１５に記載の抗体複合体。
  17. 前記制癌剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項１６に記載の抗体複合体。
  18. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離された抗体と、薬学的担体と、を含む薬学的組成物。
  19. 請求項１５から１７のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体と、薬学的担体と、を含む薬学的組成物。
  20. 請求項１９に記載の薬学的組成物を、それを必要とする被検体に投与するステップ
    を備える被検体における腫瘍を処置する方法。
  21. 前記腫瘍はｈＮＴＳＲ１を発現する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記腫瘍は、中皮腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頚部扁平上皮癌、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍又は肝臓癌である、請求項２０に記載の方法。
  23. ｈＮＴＳＲ１を検出する方法であって、
    サンプル、組織又は細胞を、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１２若しくは１３に記載の抗体複合体と接触させるステップと、
    前記抗体又は抗体複合体の、前記サンプルにおける標的への又は前記組織若しくは細胞への結合を特定するステップと、
    を備える方法。
  24. 前記抗体複合体は、検出可能標識を含む、請求項２３に記載の方法。
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