BR112020018618A2 - Conjugados anticorpo anti-her2 biparatópico-droga e métodos de uso - Google Patents

Conjugados anticorpo anti-her2 biparatópico-droga e métodos de uso Download PDF

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Rupert H. Davies
James R. RICH
Gerald J. Rowse
Vincent K. C. Fung
Stuart D. Barnscher
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Abstract

conjugados anticorpo anti-her2 biparatópico-droga e métodos de uso. conjugados anticorpo anti-her2 biparatópicos-droga (adcs), em que a droga é um análogo de auristatina e é conjugada ao anticorpo a uma razão de droga para anticorpo (dar) média baixa e métodos de uso dos adcs no tratamento de um câncer que expressa her2. os adcs de dar média baixa (<3,9), conforme descritos neste documento, possuem melhor tolerabilidade e menor toxicidade em comparação a um adc correspondente com uma dar>3,9 quando administrados na mesma dose de toxina.

Description

CONJUGADOS ANTICORPO ANTI-HER2 BIPARATÓPICO-DROGA E
MÉTODOS DE USO CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente divulgação se refere ao campo de terapêutica de câncer e, em particular, a conjugados anticorpo-droga que compreendem um anticorpo anti-HER2 biparatópico e um análogo de auristatina.
FUNDAMENTOS
[0002] O HER2 (ErbB2) é uma tirosina quinase receptora transmembranar ligada à superfície que é membro da família ErbB de tirosina quinases receptoras e está normalmente envolvido nas vias de transdução de sinal que levam ao crescimento e à diferenciação das células. O HER2 é um alvo promissor para o tratamento do câncer de mama, visto que foi observado que é superexpresso em cerca de um quarto de pacientes com câncer de mama (Bange et al, Nature Medicine 7:548 (2001)).
[0003] O Herceptin® (trastuzumabe, patente US nº 5.821.337) foi o primeiro anticorpo monoclonal desenvolvido para o tratamento de câncer de mama HER2- positivo e aumentou os tempos de sobrevivência dos pacientes, de forma que agora são iguais aos de pacientes com câncer de mama HER2-negativo. O Pertuzumabe (Perjeta®, Patente US Nº 7.862.817) é um anticorpo monoclonal humanizado que é projetado especificamente para impedir que o receptor HER2 se emparelhe (dimerize) com outros receptores HER (EGFR/HER1, HER3 e HER4) na superfície das células, um processo que se acredita desempenhar um papel no crescimento e na sobrevivência do tumor. Acredita-se que a combinação de Perjeta, Herceptin e quimioterapia forneça um bloqueio mais abrangente das vias de sinalização de HER. O Pertuzumabe se liga ao domínio II de HER2, essencial para a dimerização, enquanto o trastuzumabe se liga ao domínio extracelular IV de HER2.
[0004] Li et al (Cancer Res., 73:6471-6483 (2013)) descreve anticorpos bivalentes biespecíficos para HER2 que são baseados nas sequências de trastuzumabe e pertuzumabe nativas e que superam a resistência a trastuzumabe. Outros anticorpos biespecíficos anti-HER2 foram descritos (Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2015/077891 e WO 2016/179707; Publicação de Pedido de Patente US Nº 2014/0170148, 2015/0284463, 2017/0029529 e
2017/0291955; Patente US Nº 9.745.382). Um conjugado anticorpo-droga que compreende um anticorpo biparatópico direcionado a HER2 sítio-especificamente conjugado a um derivado de tubulisina também foi descrito (Li et al., Cancer Cell, 29:117-129 (2016)).
[0005] Auristatinas são análogos sintéticos da dolastatina 10, que é um potente inibidor de microtúbulos com atividade anticancerígena. Conjugados anticorpo-droga que compreendem cargas úteis de auristatina, tais como monometil auristatina E (MMAE) ou monometil auristatina F (MMAF), foram descritos (Patentes US Nº 7.498.298 e 7.659.241; Publicações de Pedidos de Patente Internacional Nº WO 2002/088172 e WO 2016/041082). A Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2106/041082 descreve auristatinas modificadas com N-acilsulfonamida e seu uso como cargas úteis de conjugado anticorpo-droga.
[0006] Estas informações de fundamento são fornecidas com a finalidade de tornar conhecidas as informações que o depositante acredita serem de relevância possível para a presente divulgação. Nenhuma admissão necessariamente definida, nem deve ser interpretada, de forma que qualquer informação precedente constitui o estado da técnica contra a invenção reivindicada.
SUMÁRIO
[0007] São descritos neste documento conjugados anticorpo anti-HER2 biparatópico-droga e métodos de uso. Em um aspecto, a presente divulgação se refere a um conjugado anticorpo-droga compreendendo um anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a um análogo de auristatina por meio de um peptídeo de ligação (L) a uma razão de droga para anticorpo (DAR) média baixa, em que o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro epítopo de HER2 e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um segundo epítopo de HER2, o primeiro e o segundo epítopos de HER2 sendo epítopos diferentes, e em que a DAR média baixa é uma DAR média inferior a 3,9.
[0008] Em certas modalidades do conjugado anticorpo-droga, o análogo de auristatina-peptídeo de ligação tem a Fórmula geral (II):
O H N N N N O O O O O X O
HN S H R1 N L
O (II) em que: X é -C(O)NHCH(CH2R2)-, ou X é ausente; R1 é selecionado dentre: e ; L é o peptídeo de ligação, e representa o ponto de ligação do peptídeo de ligação-toxina ao anticorpo anti-HER2 biparatópico; em que o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro epítopo de HER2 e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um segundo epítopo de HER2, com o primeiro e o segundo epítopos de HER2 sendo epítopos diferentes, e em que a DAR média baixa é uma DAR média inferior a 3,9.
[0009] Em certas modalidades, a DAR média baixa do conjugado anticorpo- droga está entre 0,5 e 3,5, ou entre 0,5 e 2,5.
[0010] Em certas modalidades, o conjugado anticorpo-droga compreende 5% ou mais de espécies DAR0 ou 15% ou mais de espécies DAR0. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo-droga compreende entre cerca de 5% e cerca de 50% de espécies DAR0, ou entre cerca de 10% e cerca de 30% de espécies DAR0, ou entre cerca de 10% e cerca de 25% de espécies DAR0, ou entre cerca de 15% e cerca de 25% de espécies DAR0.
[0011] Em certas modalidades, o conjugado anticorpo-droga compreende 25% ou menos de espécies DAR6 ou superiores, ou 15% ou menos de espécies DAR6 ou superiores. Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo-droga compreende entre 0% e cerca de 15% de espécies DAR6 ou superiores ou entre cerca de 0% e cerca de 10% de espécies DAR6 ou superiores.
[0012] Outro aspecto da presente divulgação se refere a uma composição farmacêutica que compreende um conjugado anticorpo anti-HER2 biparatópico- droga conforme descrito neste documento e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0013] Outro aspecto refere-se a um método para inibir o crescimento de uma célula cancerígena que expressa HER2, o método compreendendo o contato da célula cancerígena com uma quantidade eficaz de um conjugado anticorpo anti- HER2 biparatópico-droga conforme descrito neste documento.
[0014] Outro aspecto refere-se a um método de tratamento de um câncer que expressa HER2 compreendendo a administração a um sujeito com um câncer que expressa HER2 de uma quantidade eficaz de um conjugado anticorpo anti- HER2 biparatópico-droga conforme descrito neste documento.
[0015] Outro aspecto refere-se a um conjugado anticorpo-droga conforme descrito neste documento para uso em terapia.
[0016] Outro aspecto refere-se a um conjugado anticorpo-droga conforme descrito neste documento para uso no tratamento de um câncer que expressa HER2 em um sujeito em necessidade.
[0017] Outro aspecto se refere ao uso de um conjugado anticorpo-droga conforme descrito neste documento na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer que expressa HER2.
[0018] Outro aspecto se refere a uma composição de conjugado anticorpo- droga que compreende um anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a um análogo de auristatina por meio de um peptídeo de ligação (L), o análogo de auristatina-peptídeo de ligação possuindo a Fórmula geral (II):
O H N N N N O O O O O X O
HN S H R1 N L
O (II) em que: X está ausente; R1 é selecionado dentre: e ; L é o peptídeo de ligação, e representa o ponto de ligação do análogo de auristatina-peptídeo de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico; em que o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro epítopo de HER2 no ECD4 de HER2 e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um segundo epítopo de HER2 no ECD2 de HER2, e em que a composição do conjugado anticorpo-droga possui uma DAR média entre 0,5 e 2,5 e compreende entre cerca de 10% e cerca de 30% de espécies DAR0 e entre 0% e cerca de 15% de espécies DAR6 ou superiores.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0019] A Figura 1 mostra SDS-PAGE não redutora e redutora de (A) v17597 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR4) e (B) v21252 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR2), cada um comparado ao anticorpo biparatópico anti-HER2 precursor (v10000).
[0020] A Figura 2 mostra traços de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) para (A) anticorpo biparatópico anti-HER2 precursor v10000, (B) v17597 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 mostrando uma DAR média de 3,92), e (C) v21252 (anticorpo biparatópico anti- HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 mostrando uma DAR média de 2,07). As contribuições individuais das espécies DAR0, DAR2, DAR4 e DAR6 para a DAR média dos ADCs purificados são mostradas em (D) e (E).
[0021] A Figura 3 mostra traços de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para (A) anticorpo biparatópico anti-HER2 precursor v10000, (B) v17597 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR4), e (C) v21252 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR2).
[0022] A Figura 4 mostra os resultados dos ensaios de ligação de citometria de fluxo em células positivas para antígeno, comparação de ligação de v17597 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR4) e v10000 (anticorpo anti-HER2 biparatópico precursor) a (A) JIMT-1 células de carcinoma de mama, e (B) células de carcinoma de bexiga RT-112, e (C) comparação de ligação de v21252 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR2) e v10000 (anticorpo biparatópico anti- HER2 precursor) a células de carcinoma de mama JIMT-1.
[0023] A Figura 5 mostra os resultados do tratamento das linhagens celulares de carcinoma de mama que expressa HER2 BT-474 (A), SK-BR-3 (B), HCC1954 (C), JIMT-1 (D) e ZR-75-1 (E), e a linhagem celular negativa para HER2 MDA-MB-468 (F) com v17597 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR4) e v21252 (anticorpo biparatópico anti- HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR2).
[0024] A Figura 6 mostra os resultados do tratamento da linhagem celular de carcinoma de ovário que expressa HER2 SK-OV-3 (A), e as linhagens celulares de carcinoma de mama ZR-75-1 (B) e JIMT-1 (C) com conjugados anticorpo-droga compreendendo v10000 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em várias DAR médias. As contribuições individuais das espécies DAR0, DAR2, DAR4 e DAR6 para a DAR média dos ADCs com uma DAR média de 0,7, 2,2 e 3,9 são mostradas em (D).
[0025] A Figura 7 mostra os resultados do tratamento de camundongos xenoenxertados q14d x2 derivados de pacientes com câncer de mama HBCx-13b com as doses observadas de (A) v17597 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR4) e (B) v21252 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR2). v15496 = veículo.
[0026] A Figura 8 mostra os resultados do tratamento de camundongos xenoenxertados qdx1 derivados de pacientes com câncer de mama ST-910 com as doses observadas de (A) v17597 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR4) e (B) v21252 (anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado com Peptídeo de Ligação-Toxina 001 em DAR2). v15496 = veículo.
[0027] A Figura 9 mostra (A) os perfis de concentração sérica-tempo v21252 médios (+SD), e (B) os perfis (SD) de concentração sérica-tempo de anticorpo totais médios após a administração de uma dose única de v21252 a macacos cynomolgus fêmeas (n=3) a 9 mg/kg ou 12 mg/kg.
[0028] A Figura 10 mostra os perfis de concentração sérica-tempo v21252 médios (SD) no Dia 1 (A) e no Dia 29 (B) após uma infusão bissemanal de v21252 em macacos cynomolgus (n=6) a 12 mg/kg ou 9 mg/kg.
[0029] A Figura 11 mostra os perfis de concentração sérica-tempo de anticorpo totais médios (SD) no Dia 1 (A) e no Dia 29 (B) após uma infusão bissemanal de v21252 em macacos cynomolgus (n=6) a 12 mg/kg ou 9 mg/kg.
[0030] A Figura 12 mostra os perfis de concentração sérica-tempo médias (SD) para v21252 e para anticorpo total (conjugado e não conjugado) após uma infusão bissemanal de v21252 para macacos cynomolgus (n=6) a 12 mg/kg ou 9 mg/kg.
[0031] A Figura 13 mostra a internalização de v21252 a pHAb em comparação com conjugado Trastuzumabe-Peptídeo de Ligação-Toxina 001 conjugado a pHAB e controle negativo em (A) células SKBR3 e (B) células JIMT-
1.
[0032] A Figura 14 mostra a internalização de v21252 conjugado a pHAB
(A) em comparação com Trastuzumabe-Peptídeo de Ligação-Toxina 001 pHAB (B) em células SKBR3 em vários pontos de tempo conforme indicado. Os núcleos são mostrados em cinza e pHAb é mostrado em branco.
[0033] A Figura 15 mostra a exposição comparativa em macacos cynomolgus e camundongos tratados com v21252 nas doses indicadas: (A) exposição em macacos cynomolgus e camundongos implantados subcutaneamente com tumor derivado de paciente de alto HER2 (HBCx-13b), (B) exposição em macacos cynomolgus e camundongos implantados subcutaneamente com tumor derivado de paciente de baixo HER2 (ST-910).
[0034] A Figura 16 mostra os resultados do tratamento de camundongos xenoenxertados qwk x4 derivados de pacientes com câncer de ovário LTL-654 com 3 mg/kg de veículo ou v21252.
[0035] A Figura 17 fornece os resultados de sobrevivência para camundongos implantados intracranialmente com células de tumor de mama BT- 474 após administração i.v. semanal de veículo, conjugado de controle (anticorpo humanizado contra vírus sincicial respiratório conjugado a Peptídeo de Ligação- Toxina 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR3.5) e v24029 (trastuzumabe conjugado em DAR8 a um inibidor de topoisomerase I derivado de exatecana (DXd)), cada um a 6 mg/kg semanalmente para 12 injeções no total.
[0036] A Figura 18 fornece os resultados de sobrevivência para camundongos implantados intracranialmente com células de tumor de mama BT- 474 após administração i.v. de veículo, conjugado de controle (anticorpo humanizado contra vírus sincicial respiratório conjugado a Peptídeo de Ligação- Toxina 001) ou v7155 (T-DM1, DAR3.5) a 6 mg/kg semanalmente para 12 injeções no total ou v21252 ou v24029 (trastuzumabe conjugado em DAR8 a um inibidor de topoisomerase I derivado de exatecana (DXd)), cada um a 6 mg/kg a cada duas semanas para 6 injeções no total.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0037] A presente divulgação se refere a conjugados anticorpo anti-HER2 biparatópico-droga (ADCs) nos quais a droga é um análogo de auristatina e é conjugada ao anticorpo em uma razão de droga para anticorpo (DAR) média baixa. Os ADCs de DAR média baixa (<3,9), conforme descritos neste documento,
possuem melhor tolerabilidade e menor toxicidade em comparação a um ADC correspondente com uma DAR >3,9 quando administrados na mesma dose de toxina (análogo de auristatina). De particular interesse são os ADCs com uma DAR média de cerca de 2,5 ou menos, tal como entre cerca de 1,8 e 2,5.
[0038] A presente divulgação também se refere a métodos de uso de ADCs descritos neste documento no tratamento de um câncer que expressa HER2. Definições
[0039] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa comumente versada na técnica.
[0040] O termo "sujeito", conforme usado neste documento, refere-se a um animal, um mamífero em algumas modalidades, que é o objeto de tratamento, observação ou experimento. O animal pode ser um humano, um primata não humano, um animal doméstico (por exemplo, cão, gato ou semelhante), animal de fazenda (por exemplo, vaca, ovelha, porco, cavalo ou semelhante) ou um animal de laboratório (por exemplo, rato, camundongo, porquinho da índia, primata não humano ou semelhantes). Em modalidades específicas, o sujeito é um ser humano.
[0041] O termo "mamífero", conforme usado neste documento, inclui, mas não se limita a, seres humanos, primatas não humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos e porcinos. Em certas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0042] Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" refere-se a uma variação de aproximadamente +/- 10% de um determinado valor. Deve ser entendido que tal variação é sempre incluída em qualquer valor fornecido neste documento, seja ou não especificamente mencionada.
[0043] O uso das palavras "um" ou "uma", quando usadas neste documento em conjunto com o termo "compreendendo", podem significar "um", mas também é consistente em certas modalidades com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" ou “um ou mais de um ”.
[0044] Conforme usados neste documento, os termos "compreendendo", "possuindo", "incluindo" e "contendo" e variações gramaticais destes são inclusivos ou abertos, e não excluem elementos e/ou etapas de métodos adicionais não citados. O termo "consistindo essencialmente em", quando usado neste documento em conexão com uma composição, uso ou método, indica que elementos adicionais e/ou etapas de método podem estar presentes, mas que essas adições não afetam materialmente a maneira pela qual a composição, o método ou o uso citados funcionam. O termo "consistindo em", quando usado neste documento em conexão com uma composição, uso ou método, exclui a presença de elementos adicionais e/ou etapas de método. Uma composição, uso ou método descritos neste documento como compreendendo certos elementos e/ou etapas também podem, em certas modalidades, consistir essencialmente nesses elementos e/ou etapas, e, em outras modalidades, consistir nesses elementos e/ou etapas, sejam essas modalidades especificamente mencionadas ou não.
[0045] É contemplado que qualquer modalidade discutida neste documento pode ser implementada em relação a qualquer método, uso ou composição divulgados neste documento.
[0046] Recursos, estruturas e/ou características particulares descritos em conexão com uma modalidade divulgada neste documento podem ser combinados com recursos, estruturas e/ou características descritos em conexão com outra modalidade divulgada neste documento de qualquer maneira adequada para fornecer uma ou mais modalidades adicionais.
[0047] Também deve ser entendido que a menção positiva de um recurso em uma modalidade serve como uma base para excluir o recurso em uma modalidade alternativa. Por exemplo, onde uma lista de opções é apresentada para uma determinada modalidade ou reivindicação, deve ser entendido que uma ou mais opções podem ser excluídas da lista, e a lista reduzida pode formar uma modalidade alternativa, seja tal modalidade alternativa especificamente mencionada ou não. CONJUGADOS ANTICORPO ANTI-HER2 BIPARATÓPICO-DROGA
[0048] Os conjugados anticorpo-droga (ADCs) da presente divulgação compreendem um anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a uma toxina por meio de um peptídeo de ligação a uma razão de droga para anticorpo (DAR) média baixa, sendo a toxina uma toxina à base de auristatina (ou “análogo de auristatina”). Exemplos de toxinas à base de auristatina são conhecidos na técnica.
[0049] Em certas modalidades, o análogo de auristatina é um composto de
Fórmula geral (I):
O H N N N N O O O O O X O
HN S 1 NH O R 2 (I) em que: X é -C(O)NHCH(CH2R2)- ou X é ausente; R1 é selecionado dentre: e ,e R2 é fenil.
[0050] "DAR baixa", conforme usado neste documento, é definida como uma DAR média de menos de 3,9, mas mais de 0,5. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs é inferior a 3,5. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs é menor que 3,4, por exemplo, menor que 3,3, menor que 3,2 ou menor que 3,1. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs é 3,0 ou menos. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs é 2,9 ou menos, por exemplo, 2,8 ou menos, 2,7 ou menos ou 2,6 ou menos. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs é 2,5 ou menos, por exemplo, 2,4 ou menos, 2,3 ou menos ou 2,2 ou menos. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs é de cerca de 2,0.
[0051] Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs está entre 0,5 e 3,8, por exemplo, entre 0,5 e 3,5 ou entre 0,5 e 2,5. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs está entre 0,7 e 3,8, por exemplo, entre 0,7 e 3,5, entre 0,7 e 3,0 ou entre 0,7 e 2,5. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs está entre 1,0 e 3,8, por exemplo, entre 1,0 e 3,5, entra 1,0 e 3,0 ou entre 1,0 e 2,5. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs está entre 1,5 e 3,8, por exemplo,
entre 1,5 e 3,5, entre 1,5 e 3,0 ou entre 1,5 e 2,5. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs está entre 1,6 e 3,8, por exemplo, entre 1,6 e 3,5, entra 1,6 e 3,0 ou entre 1,6 e 2,5. Em algumas modalidades, a DAR média dos ADCs está entre 1,8 e 2,8, por exemplo, entre 1,8 e 2,5.
[0052] Conforme observado acima, os ADCs de DAR média baixa (<3,9), conforme descritos neste documento, possuem melhor tolerabilidade e menor toxicidade em comparação a um ADC correspondente com uma DAR >3,9 quando administrados na mesma dose de toxina. Como é conhecido na técnica, a maioria dos métodos de conjugação produz uma composição de ADC que inclui várias espécies de DAR, com a DAR relatada sendo a média das espécies de DAR individuais. Sem ser limitado por qualquer teoria específica, a maior tolerabilidade e a toxicidade reduzida do ADC de DAR baixa pode ser devido a uma ou ambas dentre uma redução nas espécies de DAR alta (6 ou mais) na composição de ADC e/ou um aumento na espécie de DAR0 na composição de ADC.
[0053] Em certas modalidades, as composições de ADC que incluem uma proporção de espécies DAR0 acima de um certo limite podem ser vantajosas. Por conseguinte, em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir 5% ou mais de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a composição de ADC com DAR baixa pode incluir 10% ou mais de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir 15% ou mais de espécies DAR0, por exemplo, 20% ou mais de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir entre cerca de 5% e cerca de 50% de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir entre cerca de 10% e cerca de 50% de espécies DAR0, por exemplo, entre cerca de 10% e cerca de 40%, entre cerca de 10% e cerca de 30% de espécies DAR0 ou entre cerca de 10% e cerca de 25% de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir entre cerca de 12% e cerca de 28% de espécies DAR0, por exemplo, entre cerca de 12% e cerca de 28% de espécies DAR0 ou entre cerca de 15% e cerca de 25% de espécies DAR0.
[0054] Em certas modalidades, as composições de ADC que incluem uma proporção de espécies DAR6 ou superiores abaixo de um certo limite podem ser vantajosas. Por conseguinte, em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir menos de cerca de 35% de espécies DAR6 ou superiores. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir 30% ou menos de espécies DAR6 ou superiores. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir 25% ou menos de espécies DAR6 ou superiores, por exemplo, 20% ou menos, 15% ou menos, ou 10% ou menos de espécies DAR6 ou superiores. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir 9% ou menos de espécies DAR6 ou superiores, por exemplo, 8% ou menos, 7% ou menos, 6% ou menos, ou 5% ou menos de espécies DAR6 ou superiores. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir entre 0% e cerca de 35% de espécies DAR6 ou superiores. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir entre 0% e cerca de 30% de DAR6 ou espécies maiores, por exemplo, entre 0% e cerca de 25%, ou entre 0% e cerca de 20% de espécies DAR6 ou superiores. Em algumas modalidades, a composição de ADC de DAR baixa pode incluir entre 0% e cerca de 15% de DAR6 ou espécies maiores, por exemplo, entre cerca de 0% e cerca de 10%, entre cerca de 0% e cerca de 8%, ou entre 0% e cerca de 5% de espécies DAR6 ou superiores.
[0055] Certas modalidades referem-se a ADCs que compreendem um anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a um análogo de auristatina por meio de um peptídeo de ligação (L) a uma razão de droga para anticorpo (DAR) média baixa, sendo que o análogo de auristatina-peptídio de ligação possui a Fórmula geral (II):
O H N N N N O O O O O X O
HN S H R1 N L
O (II) em que X e R1 são conforme definidos para a Fórmula geral (I); L é o peptídeo de ligação, e representa o ponto de ligação do análogo de auristatina-peptídeo de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico.
[0056] Certas modalidades se referem a um ADC com a Fórmula geral (III):
O H N N N N O O O O O X O
HN S H R1 N L Ab
O n (III) em que X e R1 são conforme definidos para a Fórmula geral (I); L é um peptídeo de ligação; n é a razão de droga para anticorpo (DAR) média e é inferior a 3,9, e Ab é um anticorpo biparatópico anti-HER2. Anticorpos Biparatópicos Anti-HER2
[0057] Os ADCs descritos neste documento compreendem um anticorpo biparatópico anti-HER2 que se liga a dois epítopos de HER2 diferentes.
[0058] O termo "anticorpo", conforme usado neste documento, geralmente se refere a uma molécula de ligação proteica com funções semelhantes a imunoglobulinas. Exemplos típicos de um anticorpo são imunoglobulinas, bem como seus derivados ou fragmentos funcionais que ainda retêm a especificidade de ligação. As técnicas para a produção de anticorpos são bem conhecidas na técnica. O termo "anticorpo" também pode incluir imunoglobulinas de diferentes classes (ou seja. IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) e subclasses (such as IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2). Exemplos ilustrativos de um anticorpo são anticorpos inteiros e fragmentos de ligação ao antígeno destes, tais como fragmentos Fab, F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadeia única (scFv), diacorpos, anticorpos de domínio e combinações destes. Anticorpos de domínio podem ser anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio variável único ou domínio variável único de imunoglobulina com apenas um domínio variável, que pode ser um domínio variável de cadeia pesada ou um domínio variável de cadeia leve, os quais se ligam especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de outras regiões variáveis ou domínios. O termo "anticorpo" também inclui modalidades, como anticorpos quiméricos, de cadeia simples e humanizados.
[0059] Um anticorpo típico compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada compreende três domínios: CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são conhecidos como α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) e μ (IgM). Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende apenas um domínio: CL. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FW). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FWs, dispostas a partir do amino-terminal para o carboxi-terminal na seguinte ordem: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação (um parátopo) que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunológico (como células efetoras) e C1q, que é um componente do sistema complemento.
[0060] Em certas modalidades, os anticorpos biparatópicos anti-HER2 para inclusão nos ADCs descritos neste documento compreendem dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno, cada um dos quais se liga a um epítopo diferente de HER2. Um "construto polipeptídico de ligação ao antígeno", conforme usado neste documento, pode ser um construto baseado em imunoglobulina, por exemplo, um fragmento de anticorpo, ou pode ser um formato mimético de anticorpo não baseado em imunoglobulina, tal como uma anticalina, um finômero, um afímero, um alfacorpo, DARPin ou um avímero. Em algumas modalidades, os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 podem ser construtos à base de imunoglobulina. Em algumas modalidades, os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 podem ser fragmentos de anticorpo.
[0061] Em certas modalidades, os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 podem ser, cada um, independentemente um fragmento Fab, um fragmento Fab', um scFv ou um sdAb. Em algumas modalidades, os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 podem ser, cada um, independentemente um fragmento Fab ou um scFv. Em algumas modalidades, um construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreendido pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 pode ser um fragmento Fab, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno pode ser um scFv.
[0062] Em certas modalidades, pelo menos um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 pode ser um fragmento Fab ou um fragmento Fab'. Um "fragmento Fab" contém o domínio constante da cadeia leve (CL) e o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1) juntamente com os domínios variáveis das cadeias leve e pesada (VL e VH, respectivamente). Fragmentos Fab′ diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos de aminoácido no terminal C do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. Um fragmento Fab também pode ser uma molécula de Fab de cadeia simples, isto é, uma molécula de Fab na qual a cadeia leve de Fab e a cadeia pesada de Fab estão conectadas por um peptídeo de ligação para formar uma cadeia peptídica única. Por exemplo, o terminal C da cadeia leve de Fab pode ser conectado ao terminal N da cadeia pesada de Fab na molécula de Fab de cadeia simples.
[0063] Em certas modalidades, pelo menos um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 pode ser um Fv de cadeia única (scFv). Um "scFv" inclui um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo em uma única cadeia polipeptídica. O scFv pode opcionalmente compreender ainda um peptídeo de ligação polipeptídico entre os domínios VH e VL o qual permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Por exemplo, um scFv pode incluir uma VL conectada de seu terminal C ao terminal N de uma VH por um peptídeo de ligação polipeptídico. Alternativamente, um scFv pode compreender uma VH conectada através de seu terminal C ao terminal N de uma VL por uma cadeia polipeptídica ou peptídeo de ligação (ver revisão em Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)).
[0064] Em certas modalidades, pelo menos um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 pode estar em um formado de anticorpo de domínio único (sdAb). Um formato sdAb refere-se a um único domínio de imunoglobulina. O sdAb pode ser, por exemplo, de origem camelídea. Os anticorpos camelídeos não possuem cadeias leves e seus sítios de ligação ao antígeno consistem em um domínio único, denominado “VHH”. Um sdAb compreende três CDR/loops hipervariáveis que formam o sítio de ligação ao antígeno: CDR1, CDR2 e CDR3. Os sdAbs são bastante estáveis e fáceis de expressar, por exemplo, como uma fusão com a cadeia Fc de um anticorpo (ver, por exemplo, Harmsen & De Haard, Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007)). Formatos de Anticorpo
[0065] Os anticorpos biparatópicos anti-HER2 para inclusão nos ADCs descritos neste documento podem ter vários formatos. Os componentes mínimos do anticorpo biparatópico anti-HER2 são um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro epítopo de HER2 e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um segundo epítopo de HER2, com o primeiro e o segundo epítopos de HER2 sendo diferentes. Um anticorpo que compreende dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno que se ligam a diferentes epítopos de HER2 pode ser considerado um anticorpo bivalente biparatópico. Certas modalidades se referem a anticorpos bivalentes biparatópicos anti-HER2. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti- HER2 pode compreender um ou mais construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno adicionais, cada um dos quais se ligando ao primeiro ou ao segundo epítopo de HER2. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode ser trivalente ou tetravalente.
[0066] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende ainda um peptídeo de ligação que liga o primeiro e o segundo construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende ainda uma estrutura em andaime, e o primeiro e o segundo construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno estão operacionalmente ligados à estrutura em andaime. O termo "operacionalmente ligado", conforme usado neste documento, significa que os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem da maneira pretendida.
[0067] Os anticorpos biparatópicos anti-HER2 podem, portanto, ser considerados como tendo uma arquitetura modular que inclui dois módulos de construto polipeptídico de ligação ao antígeno e, opcionalmente, um ou ambos dentre um módulo de peptídeo de ligação e um módulo de estrutura em andaime. Uma pessoa versada na técnica entenderá que esses módulos podem ser combinados de várias maneiras para fornecer anticorpos biparatópicos anti-HER2 com formatos diferentes. Esses formatos baseiam-se geralmente em formatos de anticorpos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, revisão de Brinkmann & Kontermann, MABS, 9(2):182-212 (2017), e Müller & Kontermann, “Bispecific Antibodies” em Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)).
[0068] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno operacionalmente ligados a uma estrutura em andaime. As estruturas em andaime adequadas são descritas abaixo. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno operacionalmente ligados a uma estrutura em andaime e pelo menos um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno é um scFv. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno operacionalmente ligados a uma estrutura em andaime e pelo menos um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno é um Fab.
[0069] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender três ou quatro construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno e uma estrutura em andaime. Neste formato, pelo menos o primeiro e o segundo construtos de ligação ao antígeno estão operacionalmente ligados à estrutura em andaime. O terceiro e o opcional quarto construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno podem, cada um, ser independentemente operacionalmente ligados à estrutura em andaime ou ao primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno ou ao segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno.
[0070] Os anticorpos biparatópicos anti-HER2 que não possuem estrutura em andaime tipicamente compreendem dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno operacionalmente ligados por um ou mais peptídeos de ligação. Os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno podem estar na forma de scFvs, Fabs, sdAbs ou uma combinação destes. Por exemplo, usando scFvs como os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno, formatos como um scFv em tandem ((scFv)2 ou taFv) podem ser construídos, em que os scFvs são conectados entre si por um peptídeo de ligação flexível. scFvs também podem ser usados para construir formatos de diacorpo, que compreendem dois scFvs conectados por um peptídeo de ligação curto (geralmente cerca de 5 aminoácidos de comprimento). O comprimento restrito do peptídeo de ligação resulta na dimerização dos scFvs de uma maneira de ponta a ponta. Em qualquer um dos formatos anteriores, os scFvs podem ser ainda mais estabilizados pela inclusão de uma ligação dissulfeto entre domínios. Por exemplo, uma ligação dissulfeto pode ser introduzida entre VL e VH através da introdução de um resíduo de cisteína adicional em cada cadeia (por exemplo, na posição 44 em VH e 100 em VL) (ver, por exemplo, Fitzgerald et al., Protein Engineering, 10:1221-1225 (1997)), ou uma ligação dissulfeto pode ser introduzida entre duas VHs para fornecer um construto com um formato DART (ver, por exemplo, Johnson et al., J Mol. Biol., 399:436-449 (2010)).
[0071] Da mesma forma, formatos que compreendem dois sdAbs, como VHs ou VHHs, conectados entre si por meio de um peptídio de ligação adequado, podem ser empregados em algumas modalidades.
[0072] Outros exemplos de formatos de anticorpos biparatópicos anti-HER2 que não possuem uma estrutura em andaime incluem aqueles baseados em fragmentos Fab, por exemplo, formatos Fab2 e F(ab’)2, em que os fragmentos Fab são conectados através de um peptídeo de ligação ou uma região de dobradiça de IgG.
[0073] Combinações de construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno em diferentes formas também podem ser empregadas para gerar formatos sem estrutura em andaime alternativos. Por exemplo, um scFv ou um sdAb pode ser fundido ao terminal C de uma ou ambas as cadeias leve e pesada de um fragmento Fab, resultando em um construto bivalente (Fab-scFv/sdAb).
[0074] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno e um ou mais peptídeos de ligação, e não inclui uma estrutura em andaime. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno que são scFvs, Fabs, sdAbs ou uma combinação destes, e um ou mais peptídeos de ligação, e não inclui uma estrutura em andaime. Estruturas em Andaime
[0075] Os anticorpos biparatópicos anti-HER2 que compreendem uma estrutura em andaime podem ser construídos ligando os dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno a uma estrutura em andaime adequada. Os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno podem estar em uma das formas descritas acima ou uma combinação destas (por exemplo, scFvs, Fabs e/ou sdAbs). Exemplos de estruturas em andaime adequadas são descritos em mais detalhes abaixo e incluem, mas não estão limitados a, regiões Fc de imunoglobulina, albumina, análogos de albumina e derivados, peptídeos de heterodimerização (tais como zíperes de leucina, peptídeos "zíper" formadores de heterodímero derivados de Jun e Fos, Domínios IgG CH1 e CL ou toxinas barnase- barstar), citocinas, quimiocinas ou fatores de crescimento. Outros exemplos incluem anticorpos baseados na tecnologia DOCK-AND-LOCKTM (DNLTM) desenvolvida pela IBC Pharmaceuticals, Inc. e Immunomedics, Inc. (ver, por exemplo, Chang, et al., Clin Cancer Res 13: 5586s-5591s (2007)).
[0076] Em algumas modalidades, os anticorpos biparatópicos anti-HER2 compreendem dois ou mais construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno e uma estrutura em andaime. Em algumas modalidades, os anticorpos biparatópicos anti- HER2 compreendem dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno operacionalmente ligados a uma estrutura em andaime.
[0077] Uma estrutura em andaime pode ser um peptídeo, um polipeptídeo, um polímero, uma nanopartícula ou outra entidade química. Quando a estrutura em andaime é um polipeptídeo, cada construto polipeptídico de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 pode ser ligado ao terminal N ou C da estrutura em andaime polipeptídica. Anticorpos biparatópicos anti-HER2 que compreendem uma estrutura em andaime polipeptídica na qual um ou mais dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno estão ligados a uma região que não seja os terminais N ou C, por exemplo, através da cadeia lateral de um aminoácido com ou sem um peptídeo de ligação, também são contemplados em certas modalidades.
[0078] Em modalidades em que a estrutura em andaime é um peptídeo ou polipeptídeo, os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno podem ser ligados à estrutura em andaime por fusão genética ou conjugação química. Normalmente, quando a estrutura em andaime é um peptídeo ou polipeptídeo, os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno são ligados à estrutura em andaime por fusão genética. Em algumas modalidades, quando a estrutura em andaime é um polímero ou uma nanopartícula, os construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno podem ser ligados à estrutura em andaime por conjugação química.
[0079] Vários domínios de proteína que compreendem pares seletivos de dois polipeptídeos diferentes são conhecidos na técnica e podem ser usados para formar uma estrutura em andaime. Um exemplo são os domínios de zíper de leucina, como Fos e Jun, que se emparelham seletivamente (Kostelny, et al., J Immunol, 148:1547-53 (1992); Wranik, et al., J. Biol. Chem., 287: 43331-43339 (2012)). Outros pares moleculares de emparelhamento seletivo incluem, por exemplo, o par barnase barstar (Deyev, et al., Nat Biotechnol, 21:1486-1492 (2003)), pares de fita de DNA (Chaudri, et al., FEBS Letters, 450(1–2):23-26 (1999)) e dividir pares de proteínas fluorescentes (Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2011/135040).
[0080] Outros exemplos de estruturas em andaime de proteína incluem regiões Fc de imunoglobulina, albumina, análogos e derivados de albumina,
toxinas, citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. O uso de estruturas em andaime de proteína em combinação com frações de ligação ao antígeno foi descrito (ver, por exemplo, Müller et al., J Biol Chem, 282:12650-12660 (2007); McDonaugh et al., Mol Cancer Ther, 11:582-593 (2012); Vallera et al., Clin Cancer Res, 11:3879-3888 (2005); Song et al., Biotech Appl Biochem, 45:147-154 (2006), e Publicação de Pedido de Patente US Nº 2009/0285816).
[0081] Por exemplo, a fusão de frações de ligação ao antígeno, tais como scFvs, diacorpos ou diacorpos de cadeia única à albumina demonstrou melhorar a meia-vida sérica das frações de ligação ao antígeno (Müller et al., Ibid.). As frações de ligação ao antígeno podem ser fundidas nos terminais N e/ou C de albumina, opcionalmente por meio de um peptídeo de ligação.
[0082] Derivados de albumina na forma de heteromultímeros que compreendem dois polipeptídeos transportadores obtidos por segmentação de uma proteína de albumina, de modo que os polipeptídeos transportadores se automontam para formar albumina quase nativa foram descritos (ver Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2012/116453 e WO 2014/012082). Como resultado da segmentação de albumina, o heteromultímero inclui quatro terminais e, portanto, pode ser fundido a até quatro frações de ligação ao antígeno diferentes, opcionalmente por meio de peptídeos de ligação.
[0083] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de proteína. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de proteína que é baseado em uma região Fc de imunoglobulina, uma albumina ou um análogo ou derivado de albumina. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de proteína que é baseada em uma região Fc de imunoglobulina, por exemplo, uma região Fc de IgG.
[0084] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de proteína que é baseada em uma albumina, por exemplo, albumina do soro humano (HSA), ou um análogo ou derivado de albumina. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti- HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de proteína que é baseada em um derivado de albumina, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2012/116453 ou WO 2014/012082. Regiões Fc
[0085] Os termos “região Fc”, “Fc” ou “domínio Fc”, conforme usados neste documento, referem-se a uma região de terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. A menos que especificado de outra forma neste documento, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado o índice EU, conforme descrito em Kabatet al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0086] Em certas modalidades, os anticorpos biparatópicos anti-HER2 podem compreender uma estrutura em andaime que é baseada em uma região Fc de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a região Fc pode ser dimérica e composta por dois polipeptídeos de Fc. Em algumas modalidades, a região Fc pode ser composta por um único polipeptídeo.
[0087] Um "polipeptídeo de Fc" de um Fc dimérico refere-se a um dos dois polipeptídeos formando o domínio de Fc dimérico, isto é, um polipeptídeo compreendendo uma ou mais regiões constantes de terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina capaz de autoassociação estável. Os termos "primeiro polipeptídeo de Fc" e "segundo polipeptídeo de Fc" podem ser usados indistintamente, desde que a região Fc compreenda um primeiro polipeptídeo de Fc e um segundo polipeptídeo de Fc.
[0088] Uma região Fc compreende um domínio CH3 ou ambos um domínio CH3 e um domínio CH2. Por exemplo, um polipeptídeo de Fc de uma região Fc de IgG dimérico compreende um CH2 de IgG e uma sequência de domínio constante de CH3 de IgG. O domínio CH3 compreende duas sequências de CH3, uma de cada um dos dois polipeptídeos de Fc da região Fc dimérica. O domínio CH2 compreende duas sequências de CH2, uma de cada um dos dois polipeptídeos de Fc da região Fc dimérica.
[0089] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime que é baseada em uma região IgG de Fc. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime que é baseada em uma região Fc humana. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime com base em uma região Fc de IgG humana, por exemplo, uma região Fc de IgG1 humana.
[0090] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime com base em uma região Fc de IgG, que é uma região Fc heterodimérica, compreendendo um primeiro polipeptídeo de Fc e um segundo polipeptídeo de Fc, cada um compreendendo uma sequência de CH3 e, opcionalmente, uma sequência de CH2.
[0091] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime baseada em uma região Fc que compreende o primeiro e o segundo polipeptídeos de Fc, e o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno está operacionalmente ligado ao primeiro polipeptídeo de Fc e, o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno está operacionalmente ligado ao segundo polipeptídeo de Fc.
[0092] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime baseada em uma região Fc que compreende o primeiro e o segundo polipeptídeos de Fc, em que o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno está operacionalmente ligado ao primeiro polipeptídeo de Fc, e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno está operacionalmente ligado ao segundo polipeptídeo de Fc, e em que o primeiro e o segundo construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno são independentemente um fragmento Fab ou um scFv.
[0093] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender um arcabouço com base em uma região Fc que compreende duas sequências CH3, pelo menos uma das quais compreende uma ou mais modificações de aminoácido. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime baseada em uma região Fc que compreende duas sequências de CH3 e duas sequências de CH2, sendo que pelo menos uma das sequências de CH2 compre uma ou mais modificações de aminoácido.
[0094] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma região Fc heterodimérica compreendendo um domínio CH3 modificado, em que o domínio CH3 modificado é um domínio CH3 modificado assimetricamente. Geralmente, o primeiro polipeptídeo de Fc do Fc heterodimérico compreende uma primeira sequência de CH3, e o segundo polipeptídeo de Fc compreende uma segunda sequência de CH3.
[0095] Conforme usado neste documento, "modificação de aminoácido assimétrica" refere-se a uma modificação em que um aminoácido em uma posição específica em uma primeira sequência de CH3 é diferente do aminoácido em uma segunda sequência de CH3 na mesma posição. Para sequências de CH3 que compreendem modificações de aminoácido assimétricas, a primeira e a segunda sequência de CH3 irão tipicamente se emparelhar preferencialmente para formar um heterodímero, em vez de um homodímero. Estas modificações de aminoácido assimétricas podem ser um resultado da modificação de apenas um dos dois aminoácidos na mesma posição de aminoácido respectiva em cada sequência, ou modificação diferentes de ambos os aminoácidos em cada sequência na mesma posição respectiva em cada uma das primeira e segunda sequências de CH3. Cada uma dentre a primeira e segunda sequências de CH3 de um Fc heterodimérico pode compreender uma ou mais do que uma modificação de aminoácido assimétrica.
[0096] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime baseada em uma região Fc modificada, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 2012/058768 ou WO 2013/063702.
[0097] A Tabela 1 fornece a sequência de aminoácidos da sequência de Fc de IgG1 humano (SEQ ID NO:1), que corresponde aos aminoácidos 231 a 447 da cadeia pesada de IgG1 humana completa. A sequência de CH3 compreende aminoácidos 341-447 da IgG1 humana de cadeia pesada completa.
[0098] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime Fc heterodimérica que compreende um domínio CH3 modificado que compreende modificações de aminoácido assimétricas que promovem a formação de um Fc heterodimérico em vez de um Fc homodimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime Fc heterodimérico que inclui modificações em uma ou mais das seguintes posições: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 e/ou N390, usando numeração EU.
[0099] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender um Fc heterodimérico que compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência polipeptídica que compreende modificações de aminoácido nas posições F405 e Y407 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição L351, e uma segunda sequência polipeptídica que compreende modificações de aminoácido nas posições T366 e T394 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição K392. Em algumas modalidades, uma primeira sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado pode compreender modificações de aminoácido nas posições F405 e Y407 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição L351, e uma segunda sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende modificações de aminoácido nas posições T366 e T394, e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição K392, e a modificação de aminoácido na posição F405 é F405A, F405I, F405M, F405S, F405T ou F405V; a modificação de aminoácido na posição Y407 é Y407I ou Y407V; a modificação de aminoácido na posição T366 é T366I, T366L ou T366M; a modificação de aminoácido na posição T394 é T394W; a modificação de aminoácido na posição L351 é L351Y, e a modificação de aminoácido na posição K392 é K392F, K392L ou K392M. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácido na posição F405 é F405A, F405S, F405T ou F405V.
[00100] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender um Fc heterodimérico que compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência polipeptídica de Fc que compreende modificações de aminoácido nas posições F405 e Y407 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição L351, e uma segunda sequência polipeptídica de Fc que compreende modificações de aminoácido nas posições T366 e T394 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição K392, e a modificação de aminoácido na posição F405 é F405A, F405I, F405M, F405S, F405T ou F405V; a modificação de aminoácido na posição Y407 é Y407I ou Y407V; a modificação de aminoácido na posição T366 é T366I, T366L ou T366M; a modificação de aminoácido na posição T394 é T394W; a modificação de aminoácido na posição L351 é L351Y, e a modificação de aminoácido na posição K392 é K392F, K392L ou K392M, e uma ou ambas as primeira e segunda sequências polipeptídicas Fc compreendem ainda a modificação de aminoácido T350V. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácido na posição F405 é F405A, F405S, F405T ou F405V.
[00101] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender um Fc heterodimérico compreendendo um domínio CH3 modificado conforme descrito acima, em que a primeira sequência de polipeptídeo de Fc compreende modificações de aminoácido nas posições F405 e Y407 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição L351, e a segunda sequência de polipeptídeo de Fc compreende modificações de aminoácido nas posições T366 e T394 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição K392, e em que a primeira sequência de polipeptídeo de Fc compreende ainda uma modificação de aminoácido em uma ou ambas dentre as posições S400 ou Q347, e/ou a segunda sequência polipeptídica de Fc compreende ainda uma modificação de aminoácido em uma ou ambas dentre as posições K360 ou N390, em que a modificação de aminoácido na posição S400 é S400E, S400D, S400R ou S400K; a modificação de aminoácido na posição Q347 é Q347R, Q347E ou Q347K; a modificação de aminoácido na posição K360 é K360D ou K360E, e a modificação de aminoácido na posição N390 é N390R, N390K ou N390D. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácido na posição F405 é F405A, F405S, F405T ou F405V.
[00102] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de Fc heterodimérico com um domínio CH3 modificado que compreende as modificações de qualquer uma dentre Variante 1, Variante 2, Variante 3, Variante 4 ou Variante 5, conforme mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Sequências Fc de IgG1
Sequência de Fc de APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS IgG1 humana 231-447 HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV (numeração EU) VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K (SEQ ID NO: 1) Sequência de Fc de Cadeia Mutações IgG1 variante 1 A L351Y_F405A_Y407V B T366L_K392M_T394W 2 A L351Y_F405A_Y407V B T366L_K392L_T394W 3 A T350V_L351Y_F405A_Y407V B T350V_T366L_K392L_T394W 4 A T350V_L351Y_F405A_Y407V B T350V_T366L_K392M_T394W 5 A T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V B T350V_T366L_N390R_K392M_T394W
[00103] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de Fc heterodimérico com um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência de CH3 que compreende uma ou mais modificações de aminoácido selecionadas dentre L351Y, F405A e Y407V, e a segunda sequência de CH3 compreendendo as modificações de aminoácido T366L ou T366I; K392L ou K392M e T394W, e uma ou ambas dentre a primeira e a segunda sequências CH3 podem opcionalmente compreender ainda a modificação de aminoácido T350V.
[00104] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de Fc heterodimérico com um domínio CH3 modificado que compreende modificações de aminoácido assimétricas,
conforme descrito acima que promovem a formação de um Fc heterodimérico em que o domínio CH3 heterodimérico possui uma estabilidade que é comparável a um domínio CH3 homodimérico de tipo selvagem. A estabilidade do domínio CH3 pode ser avaliada através da medição da temperatura de fusão (Tm) do domínio CH3, por exemplo, por calorimetria de varredura diferencial (DSC). Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações de aminoácido assimétricas promovem a formação de um domínio de Fc heterodimérico, em que o domínio CH3 possui uma estabilidade conforme observada através da temperatura de fusão (Tm) em um estudo de calorimetria de varredura diferencial que está dentro de cerca de 8 oC, por exemplo, dentro de cerca de 7oC, cerca de 6oC, cerca de 5oC ou cerca de 4 °C daquela observada para o domínio CH3 homodimérico de tipo selvagem simétrico correspondente.
[00105] Um Fc heterodimérico que compreende ainda sequências CH3 modificadas pode ser formado com um grau de pureza de pelo menos cerca de 75% em comparação com o Fc homodimérico no produto expresso. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma estrutura em andaime de Fc heterodimérico com um domínio CH3 modificado que compreende modificações de aminoácido assimétricas que promovem a formação de um Fc heterodimérico com uma pureza maior que cerca de 80%, maior que cerca de 85%, maior do que cerca de 90%, maior do que cerca de 95% ou maior do que cerca de 97%.
[00106] Métodos adicionais para modificar polipeptídeos de Fc monoméricos para promover a formação de Fc heterodimérico são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 96/027011 ("knobs" em "holes"); Gunasekaran et al. J Biol Chem, 285, 19637-46 (2010) (desenho eletrostático para alcançar heterodimerização seletiva); Davis et al., Prot Eng Des Sel, 23 (4): 195-202 (2010) (tecnologia de domínio manipulado por troca de cadeia (SEED)), e Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (2013) (troca de braço de Fab).
[00107] Em algumas modalidades em que o anticorpo biparatópico anti- HER2 compreende uma estrutura em andaime de Fc heterodimérico, o Fc heterodimérico também compreende um domínio CH2. Em algumas modalidades,
o domínio CH2 é um domínio CH2 modificado. Um exemplo de um domínio CH2 de um Fc são os aminoácidos 231-340 da sequência mostrada na Tabela 1. Várias funções efetoras são mediadas por receptores de Fc (FcRs), que se ligam ao Fc de um anticorpo.
[00108] Receptores de Fc (FcRs) incluem receptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas que formas submetidas a splicing alternativo desses receptores. O termo FcR também pode incluir em certas modalidades o receptor neonatal, FcRn.
[00109] As modificações no domínio CH2 podem afetar a ligação dos FcRs ao Fc. Um certo número de modificações de aminoácido na região Fc são conhecidos na técnica para alterar seletivamente a afinidade do Fc com diferentes receptores Fcγ. Em algumas modalidades em que o anticorpo biparatópico anti- HER2 compreende uma estrutura em andaime de Fc heterodimérico com um domínio CH2 modificado, o domínio CH2 modificado pode compreender uma ou mais modificações para promover a ligação seletiva de receptores Fcγ.
[00110] Exemplos não limitativos de modificações que alteram a ligação do Fc por FcRs incluem S298A/E333A/K334A e S298A/E333A/K334A/K326A (Lu, et al., J Immunol Methods, 365(1-2):132-41 (2011)); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L e F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen, et al., Cancer Res, 67(18):8882-90 (2007) e Nordstrom JL, et al., Breast Cancer Res, 13(6):R123 (2011)); F243L (Stewart, et al., Protein Eng Des Sel. 24(9):671-8 (2011)); S298A/E333A/K334A (Shields, et al., J Biol Chem, 276(9):6591-604 (2001)); S239D/I332E/A330L e S239D/I332E (Lazar, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005-10 (2006)); S239D/S267E e S267E/L328F (Chu, et al., Mol Immunol, 45(15):3926-33 (2008)). Modificações adicionais que afetam a ligação de Fc por FcRs são descritas em Therapeutic Antibody Engineering (Strohl & Strohl, série Woodhead Publishing em Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9 de Outubro de 2012, página 283). As regiões Fc que compreendem modificações assimétricas que afetam a ligação por FcRs são descritas na Publicação de Patente Internacional Nº WO 2014/190441.
[00111] Modificações adicionais podem ser feitas nas regiões Fc para melhorar sua capacidade de mediar a função efetora. Tais modificações são conhecidas na técnica e incluem desfucosilação ou manipulação da afinidade do Fc em relação a um receptor de ativação, principalmente FCγRIIIa para ADCC, e em relação a C1q para CDC. Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti- HER2 pode compreender uma região Fc modificada para melhorar sua capacidade de mediar a função efetora.
[00112] Os métodos de produção de anticorpos com pouca ou nenhuma fucose no sítio de glicosilação de Fc (Asn 297, numeração EU) sem alteração da sequência de aminoácidos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a tecnologia GlymaX® (ProBioGen AG) (ver von Horsten et al., Glycobiology, 20 (12):1607-18 (2010) e Patente US Nº 8.409.572). Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma região Fc que é aglicosilada. Neste contexto, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode ser totalmente desfucosilado (ou seja, sem fucose detectável) ou parcialmente desfucosilado, de modo que o anticorpo biparatópico anti-HER2 contenha menos de 95%, menos de 85%, menos de 75%, menos de 65%, menos de 55%, menos de 45%, menos de 35%, menos de 25%, menos de 15% ou menos de 5%, ou qualquer quantidade entre estas, da quantidade de fucose normalmente detectada para um construto semelhante produzido por um sistema de expressão de mamífero.
[00113] Modificações de Fc que reduzem FcR e/ou ligação de complemento e/ou função efetora são conhecidas na técnica e incluem aquelas descritas acima. Diversas publicações descrevem estratégias que foram utilizadas para manipular os anticorpos com atividade efetora reduzida ou silenciada (ver, por exemplo, Strohl, Curr Opin Biotech 20:685-691 (2009), e Strohl e Strohl LM, “Antibody Fc engineering for optimal antibody performance” em Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249). Essas estratégias incluem a redução da função efetora por meio da modificação da glicosilação, o uso de estruturas em andaime de IgG2/IgG4, ou a introdução de mutações nas regiões de dobradiça ou de CH2 do Fc (ver também, Publicação de Patente US Nº 2011/0212087, Publicação de Patente Internacional Nº WO 2006/105338, Publicação de Patente US Nº 2012/0225058, Publicação de Patente US Nº 2012/0251531 e Strop et al., J. Mol. Biol. 420: 204-219 (2012)).
[00114] Exemplos específicos não limitativos de modificações de aminoácido conhecidas para reduzir FcR ou complementar a ligação ao Fc incluem aqueles identificados na Tabela 2. Tabela 2: Modificações para reduzir o FcR ou complementar a ligação ao Fc Empresa Mutações GSK N297A Ortho Biotech L234A/L235A Protein Design Labs IgG2 V234A/G237A Wellcome Labs IgG4 L235A/G237A/E318A GSK IgG4 S228P/L236E Alexion IgG2/IgG4combo Merck IgG2 H268Q/V309L/A330S/A331S Bristol-Myers C220S/C226S/C229S/P238S Seattle Genetics C226S/C229S/E3233P/L235V/L235A Amgen Produção de E. coli, sem glicolisação Medimmune L234F/L235E/P331S Trubion Mutante de dobradiça, possivelmente C226S/P230S
[00115] Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma região Fc que compreende um domínio CH2 modificado com uma ou mais mutações identificadas na Tabela 2. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma região Fc que compreende um domínio CH2 modificado com modificações de aminoácido nas posições L234, L235 e/ou D265. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 pode compreender uma região Fc que compreende um domínio CH2 modificado com as modificações de aminoácido L234A, L235A e D265S. Epítopos de HER2
[00116] Os dois construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 se ligam, cada um, a um epítopo de HER2 diferente, isto é, um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno se liga a um primeiro epítopo de HER2 e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno se liga a um segundo epítopo de HER2. No contexto da presente divulgação, cada um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno se liga especificamente ao seu epítopo alvo.
[00117] "Liga-se especificamente" ou "ligação específica" significa que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser distinguida de interações indesejadas ou não específicas. A capacidade de um construto polipeptídico de ligação ao antígeno para se ligar a um epítopo específico pode ser medida, por exemplo, através de um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), técnicas de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (análise em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329 (2000)) ou ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em algumas modalidades, considera-se que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno se liga especificamente ao seu epítopo alvo quando a extensão da ligação do construto polipeptídico de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do construto polipeptídico de ligação ao antígeno ao seu epítopo alvo conforme medido, por exemplo, por SPR.
[00118] "HER2" (também conhecido como ErbB2) refere-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986) (número de acesso do GenBank X03363). Os termos "erbB2" e "neu" referem-se ao gene que codifica a proteína HER2 humana. Os termos p185 ou p185neu também podem ser usados para se referir ao produto de proteína do gene neu.
[00119] O HER2 compreende um domínio extracelular, que normalmente se liga a um ligante de HER, um domínio transmembranar lipofílico, um domínio de tirosina quinase intracelular conservado e um domínio de sinalização de terminal carboxila abrigando vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. O domínio extracelular (ecto) de HER2 compreende quatro domínios, Domínios I-IV. A sequência de HER2 é fornecida na Tabela 3 (SEQ ID NO: 2). Os limites do Domínio Extracelular (ECD) são: Domínio I - aproximadamente aminoácidos 1-165; Domínio II - aproximadamente aminoácidos 166-322; Domínio III - aproximadamente aminoácidos 323-488 e Domínio IV - aproximadamente aminoácidos 489-607. Tabela 3: Sequência de Aminoácidos de HER2 Humano (SEQ ID NO: 2) 1 TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQG 61 YVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQL 121 RSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGS 181
RCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNH
G 241
ICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEV 301
TAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFD 361 GDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYS 421 LTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPED 481
ECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHC
LP 541
CHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEG
A 601 CQPCPIN
[00120] "Epítopo 2C4" é a região no domínio extracelular de HER2 à qual o anticorpo 2C4 se liga e compreende resíduos do Domínio II no domínio extracelular de HER2 (também referido como ECD2). 2C4 e Pertuzumabe ligam-se ao domínio extracelular de HER2 na junção dos Domínios I, II e III (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
[00121] O "epítopo de 4D5" é a região no domínio extracelular de HER2 à qual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) e o trastuzumabe se ligam. Este epítopo está próximo ao domínio transmembranar de HER2 e dentro do Domínio IV de HER2 (também denominado ECD4).
[00122] Em geral, o anticorpo biparatópico anti-HER2 da presente divulgação se ligará a epítopos dentro dos domínios extracelulares de HER2. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo epítopos de HER2 ligados pelo primeiro e segundo construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 são epítopos não sobrepostos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo epítopos de HER2 ligados pelo primeiro e segundo construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti- HER2 estão em diferentes domínios extracelulares de HER2. Em algumas modalidades, o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 se liga a um primeiro epítopo de HER2 em um primeiro domínio de HER2, e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno se liga a um segundo epítopo de HER2 em um segundo domínio de HER2. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de HER2 é ECD2, e o segundo domínio de HER2 é ECD4.
[00123] Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 compete com o trastuzumabe pela ligação a HER2. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 compete com Pertuzumabe pela ligação a HER2. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 compete com trastuzumabe pela ligação a HER2, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compete com Pertuzumabe pela ligação a HER2.
[00124] Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 está em um formato Fab ou scFv e compete com trastuzumabe pela ligação a HER2, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno está em um formato Fab ou scFv e compete com Pertuzumabe para se ligar a HER2. Em algumas modalidades,
um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 está em um formato Fab e compete com trastuzumabe pela ligação a HER2, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno está em um formato scFv e compete com Pertuzumabe pela ligação a HER2.
[00125] Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 se liga ao mesmo epítopo em HER2 que o trastuzumabe. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 se liga ao mesmo epítopo em HER2 que Pertuzumabe. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 se liga ao mesmo epítopo em HER2 que o trastuzumabe, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo em HER2 que o Pertuzumabe.
[00126] Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno compreendidos pelo anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende as sequências de CDR de trastuzumabe ou uma variante compreendendo uma ou mais mutações conhecidas por aumentar a ligação a HER2, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as CDRs de pertuzumabe ou uma variante compreendendo uma ou mais mutações que sabe-se que aumentam a ligação a HER2. Mutações na literatura que se sabe que aumentam a ligação a HER2 por trastuzumabe ou pertuzumabe incluem aquelas listadas nas Tabelas 4 e 5 abaixo (HC = cadeia pesada; LC = cadeia leve). Combinações dessas mutações também são contempladas. Tabela 4: Mutações de Trastuzumabe que Aumentam a Ligação a HER2 Mutação Melhoria Relatada HC: D102W (HC: D98W) 3,2X HC: D102Y 3,1X HC: D102K 2,3X HC: D102T 2,2X
Mutação Melhoria Relatada HC: N55K 2,0X HC: N55T 1,9X LC: H91F 2,1X LC: D28R 1,9X Tabela 5: Mutações de Pertuzumabe que Aumentam a Ligação a HER2 Mutação Melhoria Relatada LC: I31A 1,9X LC: Y96A 2,1X LC: Y96F 2,5X HC: T30A 2,1X HC: G56A 8,3X HC: F63V 1,9X
[00127] Vários anticorpos biparatópicos anti-HER2 são conhecidos na técnica e podem ser anticorpos candidatos adequados para inclusão nos ADCs descritos neste documento. Os exemplos incluem anticorpos descritos na Publicação de Pedido de Patente US 2014/0170148; 2015/0284463; 2016/0289335; 2017/0029529; 2017/0291955 e 2018/0022820 e na Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/179707.
[00128] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 é um dos anticorpos biparatópicos descritos na Publicação de Pedido de Patente US Nº 2016/0289335. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 é um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717 (ver Tabelas 6, 6A e 6B, e as Tabelas de Sequência). Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência VH e uma sequência VL do braço de ligação a ECD2 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VH e uma sequência de VL do braço de ligação a ECD2 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende uma sequência de VH e uma sequência de VL do braço de ligação a ECD4 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717.
[00129] Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende as sequências de CDR do braço de ligação a ECD2 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti- HER2 compreende sequências de CDR do braço de ligação a ECD2 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende sequências de CDR do braço de ligação a ECD4 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717.
[00130] Uma pessoa versada na técnica apreciará que um número limitado de substituições de aminoácidos pode ser introduzido nas sequências de CDR ou nas sequências de VH ou VL de anticorpos conhecidos sem que o anticorpo perca sua capacidade de se ligar ao seu alvo. As substituições de aminoácidos candidatas podem ser identificadas por modelagem por computador ou por técnicas conhecidas, como varredura de alanina, com as variantes resultantes sendo testadas quanto à atividade de ligação por técnicas padrão. Por conseguinte, em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende um conjunto de CDRs (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve) que possuem 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais ou 100% de identidade de sequência com um conjunto de CDRs do braço de ligação a ECD2 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar ao ECD2. Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma variante dessas sequências de CDR compreendendo entre 1 e 10 substituições de aminoácidos nas seis CDRs (isto é, as CDRs podem ser modificadas através da inclusão de até 10 substituições de aminoácidos com qualquer combinação de CDRs sendo modificadas), por exemplo, entre 1 e 7 substituições de aminoácidos, entre 1 e 5 substituições de aminoácidos, entre 1 e 4 substituições de aminoácidos, entre 1 e 3 substituições de aminoácidos, entre 1 e 2 substituições de aminoácidos, ou 1 substituição de aminoácidos nas CDRs, em que a variante retém a capacidade de se ligar a ECD2. Normalmente, tais substituições de aminoácidos serão substituições de aminoácidos conservativas. Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti- HER2 compreende um conjunto de CDRs (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve) que possuem 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais ou 100% de identidade de sequência com um conjunto de CDRs do braço de ligação a ECD2 de v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar ao ECD2.
[00131] Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VH que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VH do braço de ligação a ECD2 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD2. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VL que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VL do braço de ligação a ECD2 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD2.
[00132] Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VH que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VH do braço de ligação a ECD2 de v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD2. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VL que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VL do braço de ligação a ECD2 de um dentre v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD2.
[00133] Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende um conjunto de CDRs (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve) que possuem 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais ou 100% de identidade de sequência com um conjunto de CDRs do braço de ligação a ECD4 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar ao ECD4. Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma variante dessas sequências de CDR compreendendo entre 1 e 10 substituições de aminoácidos nas seis CDRs (isto é, as CDRs podem ser modificadas através da inclusão de até 10 substituições de aminoácidos com qualquer combinação de CDRs sendo modificadas), por exemplo, entre 1 e 7 substituições de aminoácidos, entre 1 e 5 substituições de aminoácidos, entre 1 e 4 substituições de aminoácidos, entre 1 e 3 substituições de aminoácidos, entre 1 e 2 substituições de aminoácidos, ou 1 substituição de aminoácidos nas CDRs, em que a variante retém a capacidade de se ligar a ECD4. Normalmente, tais substituições de aminoácidos serão substituições de aminoácidos conservativas. Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-
HER2 compreende um conjunto de CDRs (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve) que possuem 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais ou 100% de identidade de sequência com um conjunto de CDRs do braço de ligação a ECD4 de v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar ao ECD4.
[00134] Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VH que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VH do braço de ligação a ECD4 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD4. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VL que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VL do braço de ligação a ECD4 de um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD4.
[00135] Em certas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VH que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VH do braço de ligação a ECD4 de v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD4. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência de VL que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de VL do braço de ligação a ECD4 de um dentre v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno retém a capacidade de se ligar a ECD4. Tabela 6: Anticorpos Biparatópicos Anti-HER2 Exemplificativos Varian Cadeia A Cadeia B te 5019 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituiçõe T350V_L351Y_F405A_Y40 T366I_N390R_K392 s de 7V M_T394W sequência de CH3§ 5020 Domínio ECD4 ECD2 contendo epítopo alvo Formato scFv Fab Nome de Trastuzumabe Pertuzumabe anticorpo Substituiçõe L351Y_S400E_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 s de 7V L_T394W sequência de CH3 7091 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe
Varian Cadeia A Cadeia B te anticorpo Substituiçõe T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 s de 7V L_T394W sequência de CH3 10000 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituiçõe HC: T30A_A49G_L69F s de LC: Y96A sequência de Fab* Substituiçõe T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 s de 7V L_T394W sequência de CH3 6902 Domínio ECD4 ECD2 contendo epítopo alvo Formato Fab Fab Nome de Trastuzumabe Pertuzumabe anticorpo Substituiçõe HC: L143E_K145T HC: D146G_Q179K s de LC: Q124R LC: sequência Q124E_Q160E_T180 de Fab E Substituiçõe T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392
Varian Cadeia A Cadeia B te s de 7V L_T394W sequência de CH3 6903 Domínio ECD4 ECD2 contendo epítopo alvo Formato Fab Fab Substituiçõe HC: L143E_K145T HC: D146G_Q179K s de LC: LC: sequência Q124R_Q1160K_T178R Q124E_Q160E_T180 de Fab E Nome de Trastuzumabe Pertuzumabe anticorpo Substituiçõe T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 s de 7V L_T394W sequência de CH3 6717 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato scFv scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituiçõe T350V_L351Y_F405A_Y40 T366I_N390R_K392 s de 7V M_T394W sequência de CH3 *Fab ou numeração de domínio variável de acordo com Kabat (Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest, 5a Edição, US Department of Health and Human Services, Publicação NIH Nº 91-3242, p.647, 1991)
§ Numeração de CH3 de acordo com o índice EU como em Kabat (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78-85) Tabela 6A: Sequências de CDR do Braço de Ligação a ECD2 das Variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 e v6717 Variante CDRs de HC SEQ ID CDRs de LC SEQ
NO ID NO 5019, H1: GFTFTDYT 6 L1: QDVSIG 12 5020, H2: VNPNSGGS 8 L2: SAS 14 7091, H3: ARNLGPSFYFDY 7 L3: QQYYIYPYT 13 6902, 6903 & 6717 10000 H1: GFTFADYT 39 L1: QDVSIG 27 H2: VNPNSGGS 41 L2: SAS 29 H3: ARNLGPSFYFDY 40 L3: QQYYIYPAT 28 Tabela 6B: Sequências de CDR do Braço de Ligação a ECD4 das Variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 e v6717 CDRs de HC SEQ ID CDRs de LC SEQ ID
NO NO H1: GFNIKDTY 33 L1: QDVNTA 67 H2: IYPTNGYT 35 L2: SAS 68 H3: 34 L3: QQHYTTPPT 69
SRWGGDGFYAMDY
[00136] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 é um dos anticorpos biparatópicos descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/179707. Este pedido descreve variantes de alta afinidade do anticorpo anti-HER2 pertuzumabe, incluindo anticorpos biparatópicos compreendendo sequências de uma variante de alta afinidade como um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti- HER2 é um dentre v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ou v15085 (ver Tabelas 7 e 7A, e as Tabelas de sequência). Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência VH e uma sequência VL do braço de ligação a ECD2 de um dentre v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ou v15085. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende as sequências de CDR do braço de ligação a ECD2 de um dentre v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ou v15085. Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende uma sequência VH e uma sequência VL do braço de ligação a ECD2 de um dentre v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ou v15085, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende a sequência de VH e a sequência de VL de trastuzumabe.
Em algumas modalidades, um dos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno do anticorpo biparatópico anti-HER2 compreende as sequências de CDR do braço de ligação a ECD2 de um dentre v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ou v15085, e o outro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR de trastuzumabe.
Tabela 7: Anticorpos Biparatópicos Anti-HER2 Exemplificativos Adicionais Varian Cadeia A Cadeia B te 7133 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: T30A de sequência LC: Y96A de Fab* Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3§ 15082 Domínio ECD2 ECD4
Varian Cadeia A Cadeia B te contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: G56Y_K75W de sequência de Fab Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3 15085 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: T30Q_S99W de sequência de Fab Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3 15083 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: T30Q
Varian Cadeia A Cadeia B te de sequência LC: Y49W_Y96G de Fab Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3 15080 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: T30Q_K75W de sequência LC: Y49W_Y96G de Fab Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3 15079 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: T30Y_K75W de sequência LC: Y49W_Y96G de Fab Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3 15084 Domínio ECD2 ECD4
Varian Cadeia A Cadeia B te contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: T30Q_G56Y_S99W de sequência LC: Y49W de Fab Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3 15081 Domínio ECD2 ECD4 contendo epítopo alvo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumabe Trastuzumabe anticorpo Substituições HC: T30Q_G56Y de sequência LC: Y49W_Y96G de Fab Substituições T350V_L351Y_F405A_Y40 T350V_T366L_K392 de sequência 7V L_T394W de CH3 *Fab ou numeração de domínio variável de acordo com Kabat (Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest, 5a Edição, US Department of Health and Human Services, Publicação NIH Nº 91-3242, p.647, 1991) § Numeração de CH3 de acordo com o índice EU como em Kabat (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78-85) Tabela 7A: Sequências de CDR do Braço de Ligação a ECD2 das Variantes v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 e v15085
Variante CDRs de HC SEQ ID CDRs de LC SEQ
NO ID NO 7133 H1: GFTFADYT 39 L1: QDVSIG 12 H2: VNPNSGGS 8 L2: SAS 14 H3: ARNLGPSFYFDY 7 L3: QQYYIYPAT 28 15082 H1: GFTFTDYT 6 L1: QDVSIG 12 H2: VNPNSGYS 73 L2: SAS 14 H3: ARNLGPSFYFDY 7 L3: QQYYIYPYT 13 15085 H1: GFTFQDYT 74 L1: QDVSIG 12 H2: VNPNSGGS 8 L2: SAS 14 H3: ARNLGPWFYFDY 75 L3: QQYYIYPYT 13 15083 & H1: GFTFQDYT 74 L1: QDVSIG 12 15080 H2: VNPNSGGS 8 L2: SAS 14 H3: ARNLGPSFYFDY 7 L3: QQYYIYPGT 76 15079 H1: GFTFYDYT 77 L1: QDVSIG 12 H2: VNPNSGGS 8 L2: SAS 14 H3: ARNLGPSFYFDY 7 L3: QQYYIYPGT 76 15084 H1: GFTFQDYT 74 L1: QDVSIG 12 H2: VNPNSGYS 73 L2: SAS 14 H3: ARNLGPWFYFDY 75 L3: QQYYIYPYT 13 15081 H1: GFTFQDYT 74 L1: QDVSIG 12 H2: VNPNSGYS 73 L2: SAS 14 H3: ARNLGPSFYFDY 7 L3: QQYYIYPGT 76 Propriedades dos Anticorpos Biparatópicos Anti-HER2
[00137] A conjugação de toxina em DAR baixa particularmente beneficia os anticorpos biparatópicos anti-HER2 que mostram uma ligação aumentada a HER2 e/ou uma internalização mais alta em células que expressam HER2 em comparação com um anticorpo monoespecífico bivalente correspondente. Um anticorpo monoespecífico bivalente correspondente pode compreender dois dos primeiros construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno ou dois dos segundos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno que são compreendidos pelo anticorpo biparatópico.
[00138] Em certas modalidades, os anticorpos biparatópicos anti-HER2 mostram uma ligação aumentada (isto é , ligam-se com uma afinidade maior) a HER2 em comparação com um anticorpo monoespecífico bivalente correspondente. O aumento da ligação pode ser mostrado, por exemplo, por uma redução na constante de dissociação e/ou um aumento na ligação máxima.
[00139] Uma constante de dissociação ou (KD) refere-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação ligante-proteína particular, tais como as interações anticorpo-antígeno. A KD mede a propensão de duas proteínas (por exemplo, AB) de se dissociarem reversivelmente em componentes menores (A+B), e é definida como a razão da taxa de dissociação (também chamada de "off-rate" ou koff) sobre a taxa de associação (também chamada de “on-rate” ou kon). Assim, KD é igual a koff/kon e é expressa como uma concentração molar (M). Segue-se que quanto menor for a KD, mais forte será a afinidade de ligação. Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Exemplos de tais métodos incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), normalmente usando um sistema de biossensor, como um sistema Biacore®, e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).
[00140] A KD aparente, ou constante de dissociação de equilíbrio aparente, representa a concentração de anticorpo na qual metade da ligação máxima da célula é observada. A KDaparente é dependente das condições do experimento de ligação celular, como os diferentes níveis receptores expressos nas células e as condições de incubação e, assim, a KD aparente é, de forma geral, diferente dos valores de KD determinados a partir de experimentos moleculares sem células, tais como SPR e ITC. No entanto, geralmente há uma boa concordância entre os vários métodos.
[00141] A ligação máxima (ou "Bmax") refere-se ao nível de ligação ao anticorpo máximo nas células em concentrações de saturação de anticorpo. Esse parâmetro pode ser relatado na MFI de unidade arbitrária por comparação relativa ou convertido em um valor absoluto correspondente ao número de anticorpos ligados à célula com o uso de uma curva padrão.
[00142] Bmax e KD aparente podem ser determinados por várias técnicas.
Um exemplo é a medição da ligação a células que expressam o antígeno alvo por citometria de fluxo. Normalmente, em tal experimento, as células que expressam o antígeno alvo são incubadas com anticorpos em diferentes concentrações, lavadas, incubadas com um agente secundário para detectar o anticorpo, lavadas e analisadas por citometria de fluxo para medir a intensidade fluorescente média (MFI) representando a força do sinal de detecção nas células, que por sua vez está relacionada ao número de anticorpos ligados às células. A concentração de anticorpo vs. Dados de MFI são então inseridos em uma equação de ligação de saturação para produzir a Bmax e a KD aparente.
[00143] Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 exibe um aumento em Bmax para uma célula alvo exibindo HER2 em comparação com um anticorpo de referência correspondente. Para um anticorpo biparatópico anti- HER2 que compreende um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno conforme descrito neste documento, um anticorpo de referência correspondente seria um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende dois dos primeiros construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno ou dois dos segundos construtos polipeptídicos de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, a Bmax determinada para o anticorpo biparatópico anti-HER2 é pelo menos cerca de 110% da Bmax de um anticorpo de referência correspondente. Em algumas modalidades, a Bmax determinada para o anticorpo biparatópico anti-HER2 é pelo menos cerca de 125% da Bmax para um anticorpo de referência correspondente, por exemplo, cerca de 150% da Bmax do anticorpo de referência correspondente ou pelo menos cerca de 200% da Bmax do anticorpo de referência correspondente.
[00144] Em algumas modalidades, a Bmax determinada para o anticorpo biparatópico anti-HER2 é 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2,0 vezes a Bmax de um anticorpo de referência.
[00145] Em certas modalidades, os anticorpos biparatópicos anti-HER2 mostram uma maior internalização em células que expressam HER2 do que um anticorpo monoespecífico bivalente de referência correspondente. Os anticorpos biparatópicos anti-HER2 são internalizados em células HER2+ por meio da ligação ao receptor de HER2. Os anticorpos biparatópicos anti-HER2 podem, portanto, ser considerados capazes de induzir internalização de receptor em células HER2+.
[00146] A internalização de anticorpos pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por um método de internalização direta de acordo com o protocolo detalhado em Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008). Como é conhecido na técnica, as células cancerígenas podem expressar HER2 em vários níveis. Um método de classificação de células que expressam HER2 é como HER2 1+, 2+ ou 3+ (baixo, médio e alto, respectivamente). Em certas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 mostra uma internalização mais alta do que um anticorpo monoespecífico bivalente de referência correspondente em células que expressam HER2 no nível 3+. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 mostra uma internalização mais alta do que um anticorpo monoespecífico bivalente de referência correspondente em células que expressam HER2 no nível 2+. Em algumas modalidades, o anticorpo biparatópico anti-HER2 mostra uma internalização mais alta do que um anticorpo monoespecífico bivalente de referência correspondente em células que expressam HER2 no nível 1+. Exemplos de linhagens celulares que expressam diferentes níveis de HER2 são descritos em mais detalhes abaixo.
[00147] No contexto da presente divulgação, um anticorpo biparatópico anti-HER2 é considerado como demonstrando uma maior internalização em células que expressam HER2 do que um anticorpo monoespecífico bivalente de referência correspondente quando a quantidade de anticorpos biparatópicos anti-HER2 internalizados nas células que expressam HER2 é pelo menos 1,2 vezes maior do que a quantidade de anticorpos monoespecífico bivalentes de referência internalizados nas mesmas células que expressam HER2. Em certas modalidades, a quantidade de anticorpos internalizados é determinada pelo método de internalização direta de acordo com o protocolo detalhado em Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008). Em algumas modalidades, a quantidade de anticorpos internalizados é determinada em células que expressam HER2 expressando HER2 no nível 2+.
[00148] Em algumas modalidades, um anticorpo biparatópico anti-HER2 é considerado como demonstrando uma maior internalização em células que expressam HER2 do que um anticorpo monoespecífico bivalente de referência correspondente quando a quantidade de anticorpos biparatópicos anti-HER2 internalizados nas células que expressam HER2 é pelo menos 1,3 vezes maior do que a quantidade de anticorpos monoespecíficos bivalentes de referência internalizados nas mesmas células que expressam HER2. Em algumas modalidades, um anticorpo biparatópico anti-HER2 é considerado como demonstrando uma maior internalização em células que expressam HER2 do que um anticorpo monoespecífico bivalente de referência correspondente quando a quantidade de anticorpos biparatópicos anti-HER2 internalizados nas células que expressam HER2 é pelo menos 1,4 vezes maior, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes maior, 1,6 vezes maior, 1,7 vezes maior, 1,8 vezes maior, 1,9 vezes maior ou 2,0 vezes maior do que a quantidade de anticorpos monoespecíficos bivalentes de referência internalizados nas mesmas células que expressam HER2. Em certas modalidades, a quantidade de anticorpos internalizados é determinada pelo método de internalização direta de acordo com o protocolo detalhado em Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008). Em algumas modalidades, a quantidade de anticorpos internalizados é determinada em células que expressam HER2 no nível 2+. Análogos de Auristatina
[00149] Os ADCs descritos neste documento compreendem uma toxina à base de auristatina (ou "análogo da auristatina"). Vários análogos de auristatina são conhecidos na técnica. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, monometilauristatina F (MMAF), monometilauristatina E (MMAE), auristatina EB (AEB), auristatina EVB (AEVB) e auristatina F fenilenodiamina (AFP). A síntese e a estrutura de vários análogos de auristatina são descritas nas Patentes US Nº
6.884.869; 7.098.308; 7.256.257 e 7.498.298.
[00150] Em certas modalidades, o análogo de auristatina incluído nos ADCs descritos neste documento pode ser um análogo de auristatina conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/041082. Em certas modalidades, o análogo de auristatina incluído nos ADCs descritos neste documento é um composto de Fórmula geral (I):
O H N N N N O O O O O X O
HN S 1 NH O R 2 (I) em que: X é -C(O)NHCH(CH2R2)-, ou X está ausente; R1 é selecionado dentre: e ,e R2 é fenil.
[00151] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula geral (I), R1 é selecionado dentre: e .
[00152] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula geral (I), X está ausente.
[00153] Em certas modalidades, o composto de Fórmula geral (I) tem a Fórmula geral (IV):
O H N N N N O O O O NH O S O
O R1 NH2 (IV) em que R1 é como definido para a Fórmula geral (I).
[00154] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula (IV), R1 é selecionado dentre: e .
[00155] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula (IV), R1 é: ou .
[00156] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula (IV), R1 é: .
[00157] Em certas modalidades, o composto de Fórmula geral (I) tem a Fórmula geral (V):
O H N N N N O O O O NH O
O O HN S R1 NH2
O (V) em que R1 é como definido para a Fórmula geral (I).
[00158] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula (V), R1 é selecionado dentre: e .
[00159] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula (V), R1 é: ou .
[00160] Em certas modalidades, em compostos de Fórmula (V), R1 é:
.
[00161] Os compostos de Fórmula geral (I) podem ser preparados por protocolos de química orgânica sintética padrão a partir de matérias-primas disponíveis comercialmente. Métodos exemplificativos são fornecidos na Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/041082 e na seção de Exemplos abaixo.
[00162] Deve ser entendido que a referência aos compostos de Fórmula geral (I) ao longo do restante desta divulgação inclui, em várias modalidades, compostos de Fórmula geral (IV) e (V), como se as modalidades que citam cada uma destas fórmulas individualmente fossem citadas especificamente.
[00163] Em certas modalidades, o ADC da presente divulgação compreende um anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a um análogo de auristatina (toxina) por meio de um peptídio de ligação (L), em que o peptídeo de ligação-toxina tem a Fórmula geral (II):
O H N N N N O O O O O X O
HN S H 1 N L
O R (II) em que: X é -C(O)NHCH(CH2R2)-, ou X está ausente; R1 é selecionado dentre: e ; R2 é fenil; L é um peptídeo de ligação, e representa o ponto de ligação do peptídeo de ligação-toxina ao anticorpo anti-HER2 biparatópico.
[00164] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (II), R1 é selecionado dentre: e .
[00165] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (II), X está ausente.
[00166] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (II), L é um peptídeo de ligação clivável.
[00167] Em algumas modalidades, n peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (II), L é um peptídeo de ligação que contém um peptídeo.
[00168] Em certas modalidades, o peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (II) tem a Fórmula geral (X):
O H N N N N O O O O NH O S OH
O R1 N L (X) em que R1, L e são conforme definidos acima para a Fórmula geral (II).
[00169] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (X), R1 é selecionado dentre: e .
[00170] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (X), R1 é: ou .
[00171] Em algumas modalidades, em compostos de Fórmula (X), R1 é: .
[00172] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (X), L é um peptídeo de ligação clivável.
[00173] Em algumas modalidades, n peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (X), L é um peptídeo de ligação que contém um peptídeo.
[00174] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (X), L é uma protease-peptídeo de ligação clivável.
[00175] Em certas modalidades, o peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (II) tem a Fórmula geral (XI):
O H N N N N O O O O NH O
O O HN S R1 H
N L
O (XI) em que R1, L e são conforme definidos acima para a Fórmula geral (II).
[00176] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (XI), R1 é selecionado dentre: e .
[00177] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (XI), R1 é: ou .
[00178] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (XI), R1 é:
.
[00179] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (XI), L é um peptídeo de ligação clivável.
[00180] Em algumas modalidades, n peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (XI), L é um peptídeo de ligação que contém um peptídeo.
[00181] Em algumas modalidades, no peptídeo de ligação-toxina de Fórmula geral (XI), L é uma protease-peptídeo de ligação clivável.
[00182] Também contemplados neste documento são os ADCs que compreendem um anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a um peptídeo de ligaçãp-toxina de Fórmula geral (II), Fórmula geral (X) ou Fórmula geral (XI), em que o peptídeo de ligação tem a Fórmula geral (VIII) ou (IX) conforme mostrado abaixo.
[00183] Em certas modalidades, o ADC compreende um peptídeo de ligação-toxina com a estrutura:
H A
S N NH2
O O O N O H H N N N O
O H N N H 3
H O O N N O O S O O O O
N O , em que A-S- é o ponto de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico.
[00184] Em certas modalidades, o ADC da presente divulgação que compreende um anticorpo biparatópico anti-HER2 conjugado a um análogo de auristatina (toxina) por meio de um peptídeo de ligação (L) tem a Fórmula geral (III):
O H N N N N O O O O O X O
HN S H R1 N L Ab
O n (III)
em que X e R1 são conforme definidos para a Fórmula geral (II); L é um peptídeo de ligação; n é a razão de droga para anticorpo (DAR) média e é inferior a 3,9, e Ab é um anticorpo biparatópico anti-HER2.
[00185] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), R1 é selecionado dentre: e .
[00186] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), X está ausente.
[00187] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), R1 é: ou ,e X está ausente.
[00188] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), R1 é: ,e X está ausente.
[00189] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), X é - C(O)NHCH(CH2R2)-
[00190] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), R1 é: ou ,e X é -C(O)NHCH(CH2R2)-.
[00191] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), R1 é: ,e X é -C(O)NHCH(CH2R2)-.
[00192] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), L é um peptídeo de ligação clivável.
[00193] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), L é um peptídeo de ligação que contém peptídeo.
[00194] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), L é uma protease-peptídeo de ligação clivável.
[00195] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), n está entre 0,5 e 3,8.
[00196] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), n está entre 0,7 e 3,8, entre 0,7 e 3,5, entre 0,7 e 3,0 ou entre 0,7 e 2,5.
[00197] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), n está entre 1,0 e 3,8, entre 1,0 e 3,5, entre 1,0 e 3,0 ou entre 1,0 e 2,5.
[00198] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), n está entre 1,5 e 3,8, entre 1,5 e 3,5, entre 1,5 e 3,0 ou entre 1,5 e 2,5.
[00199] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), n está entre 1,6 e 3,8, entre 1,6 e 3,5, entre 1,6 e 3,0 ou entre 1,6 e 2,5.
[00200] Em algumas modalidades, no ADC de Fórmula geral (III), n está entre 1,8 e 2,8 ou entre 1,8 e 2,5.
[00201] Combinações de qualquer uma das modalidades anteriores para compostos de Fórmula geral (III) também são contempladas, e cada combinação forma uma modalidade separada para os fins da presente divulgação. Peptídeos de Ligação
[00202] Nos ADCs descritos neste documento, o anticorpo biparatópico anti-HER2 está ligado ao análogo de auristatina (toxina) por um peptídeo de ligação. Peptídeos de ligação são frações bifuncionais ou multifuncionais capazes de ligar uma ou mais moléculas de toxina a um anticorpo. Um peptídeo de ligação pode ser bifuncional (ou monovalente), de modo que liga uma única droga a um único sítio no anticorpo, ou pode ser multifuncional (ou polivalente), de modo que liga mais de uma molécula de toxina a um único sítio no anticorpo. Os peptídeos de ligação capazes de ligar uma molécula de toxina a mais de um sítios no anticorpo também podem ser considerados multifuncionais.
[00203] A ligação de um peptídeo de ligação a um anticorpo pode ser realizada em uma variedade de maneiras, tais como através de lisinas de superfície no anticorpo, acoplamento redutivo para os carboidratos oxidados no anticorpo, ou através de resíduos de cisteína no anticorpo liberados através da redução de ligações dissulfeto intercadeias. Alternativamente, a ligação de um peptídeo de ligação a um anticorpo pode ser realizada por modificação do anticorpo para incluir resíduos de cisteína adicionais (ver, por exemplo, Patentes US Nº 7.521.541;
8.455.622 e 9.000.130) ou aminoácidos não naturais que fornecem alças reativas, tais como selenometionina, p-acetilfenilalanina, formilglicina ou p-azidometil-L- fenilalanina (ver, por exemplo, Hofer et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101-16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106:3000-3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem., 25:351-361 (2014)), para permitir a conjugação sítio-específica.
[00204] Os peptídios de ligação incluem um grupo funcional capaz de reagir com o grupo ou grupos alvo no anticorpo e um ou mais grupos funcionais capazes de reagir com um grupo alvo na toxina. Grupos funcionais adequados são conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos, por exemplo, em Bioconjugate Techniques (GT Hermanson, 2013, Academic Press).
[00205] Exemplos não limitativos de grupos funcionais para reagir com cisteínas ou tiois livres incluem maleimida, haloacetamida, haloacetil, ésteres ativados, tais como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenil, ésteres de pentafluorofenil, ésteres de tetrafluorofenil, anidridos, cloretos de ácido, cloretos de sulfonil, isocianatos e isotiocianatos. Também úteis neste contexto são as maleimidas "autoestabilizantes", conforme descrito em Lyon et al., Nat. Biotechnol., 32: 1059-1062 (2014).
[00206] Exemplos não limitativos de grupos funcionais para reagir com lisinas de superfície em um anticorpo e aminas livres em uma toxina incluem ésteres ativados, tais como ésteres N-hidroxissuccinimida (NHS), ésteres sulfo- NHS, ésteres imido, como reagente de Traut, isotiocianatos, aldeídos e anidridos ácidos, como anidrido dietilenotriaminopentacético (DTPA). Outros exemplos incluem tetrafluoroborato de succinimido-1,1,3,3-tetra-metilurônio (TSTU) e hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfônio (PyBOP).
[00207] Exemplos não limitativos de grupos funcionais capazes de reagir com um grupo eletrofílico no anticorpo ou toxina (tal como um grupo carbonil aldeído ou cetona) incluem hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona,
carboxilato de hidrazina e aril-hidrazida.
[00208] Outros peptídeos de ligação incluem aqueles que possuem um grupo funcional que permite a ligação de duas cisteínas intercadeias no anticorpo, como um peptídeo de ligação ThioBridgeTM (Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25: 1124-1136 (2014)), um peptídeo de ligação de ditiomaleimida (DTM) (Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986–3998 (2015)), um peptídeo de ligação baseado em ditioaril(TCEP)piridazinediona (Lee et al., Chem. Sci., 7:799-802 (2016)), um peptídeo de ligação baseado em dibromopiridazinediona (Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)) e outros conhecidos na técnica.
[00209] Um peptídeo de ligação pode compreender um ou mais componentes de peptídeo de ligação. Normalmente, um peptídeo de ligação compreenderá dois ou mais componentes de peptídeo de ligação. Os componentes de peptídeo de ligação exemplificativos incluem grupos funcionais para reação com o anticorpo, grupos funcionais para reação com a toxina, extensores, componentes peptídicos, grupos autodestrutivos, grupos de autoeliminação, frações hidrofílicas e semelhantes. Vários componentes de peptídeo de ligação são conhecidos na técnica, alguns dos quais sendo descritos abaixo.
[00210] Certos componentes de peptídeo de ligação úteis podem ser obtidos a partir de várias fontes comerciais, como a Pierce Biotechnology, Inc. (agora Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e a Molecular Biosciences Inc. (Boulder, Colo.), ou podem ser sintetizados de acordo com os procedimentos descritos na técnica (ver, por exemplo, Toki et al., J. Org. Chem., 67:1866-1872 (2002); Dubowchik, et al., Tetrahedron Letters, 38:5257-60 (1997); Walker, M. A., J. Org. Chem., 60:5352-5355 (1995); Frisch, et al., Bioconjugate Chem., 7:180-186 (1996); Patentes US Nº 6.214.345 e 7.553.816, e Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 02/088172).
[00211] Exemplos de componentes de peptídeo de ligação incluem, mas não estão limitados a, éster de N-(β-maleimidopropiloxi)-N-hidroxi succinimida (BMPS), éster de N-(ε-maleimidocaproiloxi) succinimida (EMCS), éster de N-[γ- maleimidobutiriloxi] succinimida (GMBS), 1,6-hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), 4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) de succinimidil (LC- SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS), hidrazida de ácido 4-(4-N-Maleimidofenil)butírico (MPBH), 3-(bromoacetamido)propionato de succinimidil (SBAP), iodoacetato de succinimidil (SIA), (4-iodoacetil)aminobenzoato de succinimidil (STAB), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N- succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1- carboxilato de succinimidil (SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidil (SMPB), 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoato] de succinimidil (SMPH), iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato (SVSB).
[00212] Exemplos adicionais incluem reagentes de bis-maleimida, tais como ditiobismaleimidoetano (DTME), bis-maleimido-trioxietilenoglicol (BMPEO), 1,4-bismaleimidobutano (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-di-hidroxibutano (BMDB), bismaleimido-hexano (BMH), bismaleimidoetano (BMOE), BM(PEG)2 e BM(PEG)3; derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (como suberato de dissuccinimidil), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazônio (como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6- diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno).
[00213] Os peptídios de ligação adequados são tipicamente mais quimicamente estáveis às condições fora da célula do que às condições dentro da célula, embora peptídeos de ligação menos estáveis possam ser contemplados em certas situações, como quando a toxina é seletiva ou direcionada e tem uma baixa toxicidade para células normais. Os peptídeos de ligação podem ser "peptídeos de ligação cliváveis" ou "peptídeos de ligação não cliváveis". Um peptídeo de ligação clivável é tipicamente suscetível à clivagem sob condições intracelulares, por exemplo, por meio de processos lisossomais. Exemplos incluem peptídeos de ligação que são sensíveis a protease, sensíveis a ácido, sensíveis a redução ou fotolábeis. Em contraste, peptídeos de ligação não cliváveis dependem da degradação do anticorpo na célula, que normalmente resulta na liberação de uma fração de aminoácido-peptídeo de ligação-toxina.
[00214] Peptídeos de ligação cliváveis adequados incluem, por exemplo, peptídeos de ligação que compreendem um componente peptídico que inclui dois ou mais aminoácidos e é clivável por uma protease intracelular, como uma protease lisossomal ou uma protease endossomal. Um componente peptídico pode compreender resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente e/ou aminoácidos menores e/ou análogos de aminoácidos de ocorrência não natural, como a citrulina. Os componentes peptídicos podem ser projetados e otimizados para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C ou D, ou uma protease de plasmina.
[00215] Em certas modalidades, o peptídeo de ligação incluído nos ADCs pode ser um peptídeo de ligação contendo dipeptídeo, como um peptídeo de ligação contendo valina-citrulina (Val-Cit) ou fenilalanina-lisina (Phe-Lys). Outros exemplos de dipeptídeos adequados para inclusão em peptídeos de ligação incluem Val-Lys, Ala-Lys, Me-Val-Cit, Phe-homoLys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp- Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys e Met-(D)Lys. Os peptídeos de ligação cliváveis também podem incluir componentes peptídicos mais longos, como tripeptídeos, tetrapeptídeos ou pentapeptídeos. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, os tripeptídeos Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys e (D)Ala-Phe-Lys e os tetrapeptídeos Gly-Phe-Leu-Gly e Ala-Leu-Ala-Leu.
[00216] Exemplos adicionais de peptídeos de ligação cliváveis incluem peptídeos de ligação que contêm dissulfeto, como, por exemplo, N-succinimidil-4- (2-piridilditio) butanoato (SPBD) e N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo butanoato (sulfo-SPBD). Os peptídeos de ligação que contêm dissulfeto podem incluir, opcionalmente, grupos adicionais para fornecer impedimento estérico adjacente à ligação dissulfeto a fim de melhorar a estabilidade extracelular do peptídeo de ligação, por exemplo, inclusão de um grupo dimetil geminal. Outros peptídeos de ligação adequados incluem peptídeos de ligação hidrolisáveis a um pH específico ou em uma faixa de pH, como peptídeos de ligação de hidrazona. Peptídeos de ligação que compreendem combinações destas funcionalidades também podem ser úteis, por exemplo, peptídeos de ligação que compreendem uma hidrazona e um dissulfeto são conhecidos na técnica.
[00217] Um outro exemplo de um peptídeo de ligação clivável é um peptídeo de ligação que compreende um β-glucuronídeo, que é clivável por β- glucuronidase, uma enzima presente em lisossomos, e interstício tumoral (ver, por exemplo, De Graaf et al., Curr. Pharm. Des., 8:1391–1403 (2002)).
[00218] Os peptídeos de ligação cliváveis podem, opcionalmente, compreender ainda um ou mais componentes adicionais, tais como grupos autodestrutivos e de autoeliminação, extensores ou frações hidrofílicas.
[00219] Os grupos autodestrutivos e de autoeliminação que encontram uso em peptídeos de ligação incluem, por exemplo, grupos p-aminobenziloxicarbonil (PABC) e p-aminobenzil éter (PABE) e etilenodiamina metilada (MED). Outros exemplos de grupos autodestrutivos incluem, mas não estão limitados a, compostos aromáticos que são eletronicamente semelhantes ao grupo PABC ou PABE, como derivados heterocíclicos, por exemplo, derivados de 2-aminoimidazol- 5-metanol, conforme descrito na Patente US nº 7.375.078. Outros exemplos incluem grupos submetidos a ciclização após a hidrólise da ligação amida, tais como amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 2:223-227 (1995)) e amidas de ácido 2- aminofenilpropiônico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 55:5867-5877 (1990)).
[00220] Os extensores que encontram uso em peptídios de ligação para ADCs incluem, por exemplo, grupos alquileno e extensores baseados em ácidos alifáticos, diácidos, aminas ou diaminas, tais como diglicolato, malonato, caproato e caproamida. Outros extensores incluem, por exemplo, extensores à base de glicina, extensores de polietilenoglicol (PEG) e extensores de monometoxi polietilenoglicol (mPEG). Os extensores de PEG e mPEG também funcionam como frações hidrofílicas.
[00221] Exemplos de componentes comumente encontrados em peptídeos de ligação cliváveis que podem encontrar uso nos ADCs da presente divulgação em algumas modalidades incluem, mas não estão limitados a, SPBD, sulfo-SPBD, hidrazona, Val-Cit, maleidocaproil (MC ou mc), mc-Val-Cit, mc-Val-Cit-PABC, Phe- Lys, mc-Phe-Lys, mc-Phe-Lys-PABC, maleimido trietileno glicolato (MT), MT-Val- Cit, MT-Phe-Lys e adipato (AD).
[00222] Em certas modalidades, o peptídeo de ligação incluído nos ADCs da presente divulgação são peptídeos de ligação à base de peptídeos de ligação com a Fórmula geral (VI): Z Str AA1 AA2 X D s m o (VI) em que: Z é um grupo funcional capaz de reagir com o grupo alvo no anticorpo; Str é um extensor; AA1 and AA2 são, cada um, independentemente um aminoácido, em que AA1-[AA2]m forma um sítio de clivagem por protease; X é um grupo autodestrutivo; D é o ponto de ligação ao análogo de auristatina; s é 0 ou 1; m é um número inteiro entre 1 e 4, e o é 0, 1 ou 2.
[00223] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), Z é:
O N O .
[00224] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), Str é selecionado dentre:
O O O (CH 2)p C (CH2CH2O)q C (CH2)p (CH 2CH2O)q C ; ; ;
O O R O (CH 2CH2O)q (CH 2)p C (CH 2)p C N (CH 2)p C ; e
O R O (CH 2)p C N (CH 2CH2O)q C , em que: R é H ou C1-C6 alquil; p é um número inteiro entre 2 e 10, e q é um número inteiro entre 1 e 10.
[00225] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), Str é:
O O (CH 2)p C (CH2)p (CH 2CH2O)q C , ou
O (CH 2CH2O)q (CH 2)p C , em que p e q são conforme definidos acima.
[00226] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), Str é:
O O (CH 2)p C (CH 2CH2O)q (CH 2)p C ou , em que p é um número inteiro entre 2 e 6, e q é um número inteiro entre 2 e 8.
[00227] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), AA1-[AA2]m é selecionado dentre Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp- Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys, (D)Ala-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly e Ala-Leu-Ala-Leu.
[00228] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), m é 1 (ou seja AA1-[AA2]m é um dipeptídeo).
[00229] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), AA1-[AA2]m é um dipeptídeo selecionado dentre Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit e Trp-Cit.
[00230] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), cada X é independentemente selecionado dentre p-aminobenziloxicarbonil (PABC), éter p- aminobenzílico (PABE) e etilenodiamina metilada (MED).
[00231] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), m é 1, 2 ou 3.
[00232] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), s é 1.
[00233] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI), o é 0.
[00234] Em algumas modalidades, na Fórmula geral (VI):
O
N Zé O ;
O O (CH 2)p C (CH 2CH2O)q (CH 2)p C Str é ou , em que p é um número inteiro entre 2 e 6, e q é um número inteiro entre 2 e 8; m é 1 e AA1-[AA2]m é um dipeptídeo selecionado dentre Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit e Trp-Cit; s é 1, e o é 0.
[00235] Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação é um peptídeo de ligação que contém dissulfeto, e o ADC tem a Fórmula geral (VII):
H R R
A N Y S S rD
O R R (VII) em que: A é o anticorpo; D é o análogo de auristatina; Y é –(CH2)p- ou –(CH2CH2O)q-, em que p e q são, cada um, independentemente um número inteiro entre 1 e 10; cada R é independentemente H ou C1-C6 alquil; r é 1, 2 ou 3, e
O
H em que N C representa uma ligação amida formada entre o peptídeo de ligação e o grupo ε-amino de uma lisina de superfície no anticorpo.
[00236] Em algumas modalidades na Fórmula geral (VII), p e q são, cada um, independentemente um número inteiro entre 1 e 4.
[00237] Em algumas modalidades na Fórmula geral (VII), Y é –(CH2)p- e p é um número inteiro entre 1 e 4.
[00238] Em algumas modalidades na Fórmula geral (VII), cada R é independentemente H ou Me.
[00239] Em algumas modalidades na Fórmula geral (VII), r é 1 ou 2.
[00240] Vários peptídeos de ligação não cliváveis são conhecidos na técnica para ligar drogas a anticorpos e podem ser úteis nos ADCs da presente divulgação em certas modalidades. Exemplos de peptídeos de ligação não cliváveis incluem peptídeos de ligação com uma fração de éster N-succinimidil ou éster N- sulfosuccinimidil para reação com o anticorpo, bem como uma fração à base de maleimido ou haloacetil para reação com a toxina, ou vice-versa. Um exemplo de tal peptídio de ligação não clivável é baseado em sulfossuccinimidil-4-[N- maleimidometil]ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC). Outros exemplos não limitativos de tais ligantes incluem aqueles baseados em N-succinimidil-4- (maleimidometil)ciclo-hexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N- maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (“cadeia longa” SMCC ou LC-SMCC), éster N-succinimidílico de ácido κ-maleimidoundecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico de ácido γ-maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster de ácido ε-maleimidocaproico (EMCS), m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(α-maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), 4-(p-maleimidofenil)- butirato de N-succinimidil (SMPB) e N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI). Outros exemplos incluem aqueles que compreendem um grupo funcional à base de haloacetil, como N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), iodoacetato de N-succinimidil (SIA), bromoacetato de N-succinimidil (SBA) e 3- (bromoacetamido)propionato N-succinimidil (SBAP).
[00241] Outros exemplos de peptídios de ligação não cliváveis incluem ácidos maleimidocarboxílicos, como maleimidocaproil (MC).
[00242] A seleção de um peptídio de ligação apropriado para um determinado ADC pode ser prontamente feita pela pessoa versada na técnica e levando em consideração fatores relevantes, tais como o sítio de fixação ao anticorpo, quaisquer restrições estruturais da toxina e a hidrofobicidade da toxina (ver, por exemplo, revisão em Nolting, Capítulo 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed.), Springer).
[00243] Em certas modalidades, o peptídio de ligação incluído nos ADCs da presente divulgação têm a Fórmula geral (VIII):
O A O O H S N N D N Y H O O
HN O NH2 (VIII) em que: A-S- é o ponto de ligação ao anticorpo biparatópico anti-HER2; Y é um ou mais componentes do peptídeo de ligação adicionais, ou está ausente, e D é o ponto de ligação ao análogo de auristatina.
[00244] Em certas modalidades, o peptídio de ligação incluído nos ADCs da presente divulgação têm a Fórmula geral (IX):
O O O A H S N O N D O O N Y H O O
HN O NH2 (IX) em que: A-S- é o ponto de ligação ao anticorpo biparatópico anti-HER2; Y é um ou mais componentes do peptídeo de ligação adicionais, ou está ausente, e D é o ponto de ligação ao análogo de auristatina. Preparação de Conjugados Anticorpo-Droga
[00245] Os ADCs da presente divulgação podem ser preparados por uma dentre várias vias conhecidas na técnica, empregando reações, condições e reagentes da química orgânica conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Bioconjugate Techniques (GT Hermanson, 2013, Academic Press e os exemplos fornecidos neste documento). Por exemplo, a conjugação pode ser alcançada por (1) reação de um grupo nucleofílico ou um grupo eletrofílico de um anticorpo com um peptídio de ligação bifuncional para formar um intermediário anticorpo-peptídio de ligação Ab-L, por meio de uma ligação covalente, seguida por reação com um análogo de auristatina ativada (D), ou (2) reação de um grupo nucleofílico ou um grupo eletrofílico de um análogo de auristatina com um peptídio de ligação para formar um peptídio de ligação-toxina D-L através de uma ligação covalente, seguida pela reação com o grupo nucleofílico ou um grupo eletrofílico de um anticorpo. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregados com uma variedade de anticorpos, análogos de auristatina e peptídios de ligação para preparar os ADCs descritos neste documento.
[00246] Conforme descrito acima, o análogo de auristatina pode ser conjugado por meio de um peptídio de ligação apropriado a vários grupos no anticorpo para fornecer o ADC. Por exemplo, a conjugação pode ser através de lisinas de superfície, através de carboidratos oxidados ou através de resíduos de cisteína que foram liberados pela redução de uma ou mais ligações dissulfeto intercadeias. Alternativamente, o anticorpo pode ser modificado para incluir resíduos de cisteína adicionais ou aminoácidos não naturais que fornecem alças reativas, como selenometionina, p-acetilfenilalanina, formilglicina ou p-azidometil- L-fenilalanina. Tais modificações são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Patentes US Nº 7.521.541; 8.455.622 e 9.000.130; Hofer et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101-16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106:3000-3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem., 25:351-361 (2014)).
[00247] Em certas modalidades, os ADCs da presente divulgação compreendem um análogo de auristatina conjugado por meio de um peptídio de ligação apropriado a resíduos de cisteína que foram liberados através da redução de uma ou mais ligações dissulfeto intercadeias.
[00248] Nos ADCs descritos neste documento, o anticorpo biparatópico anti-HER2 é conjugado à toxina por meio de um peptídio de ligação a uma razão de droga para anticorpo (DAR) média baixa, especificamente uma DAR média de menos de 3,9, mas mais de 0,5, por exemplo, entre cerca de 1,5 e cerca de 2,5 em certas modalidades.
[00249] Vários métodos são conhecidos na técnica para preparar ADCs com uma DAR média baixa (ver, por exemplo, revisão por McCombs e Owen, The AAPS Journal, 17 (2):339-351 (2015) e referências nesta; Boutureira & Bernardes, Chem. Rev., 115:2174-2195 (2015)).
[00250] Por exemplo, para a conjugação com resíduos de cisteína, uma redução parcial das ligações dissulfeto intercadeias de anticorpo pode ser conduzida seguida por conjugação a peptídio de ligação-toxina. A redução parcial pode ser alcançada através da limitação da quantidade de agente de redução usado na reação de redução (ver, por exemplo, Lyon et al., Methods in Enzymology, 502:123-138 (2012) e os exemplos neste, e os Exemplos fornecidos neste documento). Agentes redutores adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ditiotreitol (DTT), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 2-mercaptoetanol, cisteamina e várias fosfinas solúveis em água. Alternativamente, ou adicionalmente, menos equivalentes de peptídio de ligação-toxina podem ser empregados a fim de obter uma DAR média baixa.
[00251] Alternativamente, um anticorpo manipulado pode ser empregado em que um ou mais dos resíduos de cisteína que compõem as ligações dissulfeto intercadeias são substituídos por um resíduo de serina, resultando em menos resíduos de cisteína disponíveis para conjugação (ver McDonagh et al., Protein Eng. Des. Sel. PEDS, 19(7):299-307). O anticorpo manipulado pode então ser tratado com agente redutor e conjugado a peptídio de ligação-toxina.
[00252] Outra abordagem é empregar um peptídio de ligação bis-tiol que liga duas cisteínas que normalmente formam uma ligação dissulfeto intercadeia. O uso de um peptídio de ligação bis-tiol que carrega apenas uma molécula de toxina produziria um ADC com uma DAR4 máxima para um anticorpo de tamanho completo se todas as quatro ligações dissulfeto intercadeias forem reduzidas e substituídas pelo peptídio de ligação bis-tiol. A redução parcial das ligações dissulfeto intercadeias e/ou menos equivalentes de peptídio de ligação podem ser usados em conjunto com um peptídio de ligação bis-tiol a fim de reduzir ainda mais a DAR. Vários peptídios de ligação bis-tiol são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25(6):1124-1136 (2014); Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986–3998 (2015); Lee et al., Chem. Sci., 7:799-802 (2016); Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)).
[00253] Abordagens para manipulação de cisteína também podem ser empregadas para gerar ADCs com uma DAR média baixa. Tais abordagens envolvem a manipulação de cisteínas acessíveis por solvente no anticorpo, a fim de fornecer uma alça específica do sítio para conjugação. Vários sítios apropriados para a introdução de um resíduo de cisteína foram identificados com a estrutura de IgG e incluem aqueles descritos em Junutula, et al., J. Immunol Methods, 332 (1- 2): 41-52 (2008); Junutula, et al., Nat. Biotechnol., 26 (8), 925-932 (2008) e Patentes US. Nºs 9.315.581; 9.000.130; 8.455.622; 8.507.654 e 7.521.541.
[00254] Os ADCs de DAR média baixa também podem ser preparados por conjugação de lisina empregando quantidades limitantes de toxina de ligante ativada. A reação seletiva nos aminoácidos N-terminais do anticorpo também pode ser empregada.Por exemplo, a serina N-terminal pode ser oxidada a um aldeído com periodato e, em seguida, reagir com toxina ligante (ver, por exemplo, Thompson, et al., Bioconjug. Chem., 26 (10): 2085-2096 (2015)). Da mesma forma, os resíduos de cisteína N-terminal podem reagir seletivamente com aldeídos para dar tiazolidinonas (ver, por exemplo, Bernardes, et al., Nature Protocols, 8: 2079- 2089).
[00255] Abordagens adicionais incluem a manipulação do anticorpo para incluir um ou mais aminoácidos não naturais, tais como p-acetilfenilalanina (pAcPhe) ou selenocisteína (Sec). O grupo ceto em pAcPhe pode ser reagido com uma toxina ligante compreendendo uma alcoxiamina ou hidrazida terminal para formar uma ligação oxima ou hidrazona (ver, por exemplo, Axup, et al., PNAS USA, 109: 16101-16106 (2012)). Os anticorpos contendo Sec podem ser reagidos com toxinas ligantes contendo maleimida ou iodoacetamida para formar um conjugado de selenoéter (ver, por exemplo, Hofer, et al., Biochemistry, 48: 12047-12057 (2009)).
[00256] Os anticorpos também podem ser manipulados para incluir marcadores de peptídeos reconhecidos por certas enzimas para permitir a conjugação catalisada por enzima. Por exemplo, Sortase-A (SortA) reconhece a sequência LPXTG. Este pentapeptídeo pode ser manipulado no terminal N ou C do anticorpo para permitir a conjugação mediada por SortA (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US. Nº 2016/0136298; Kornberger e Skerra,
mAbs, 6(2):354-366 (2014)). As transglutaminases também foram empregadas para gerar ADCs de DAR2 usando anticorpos que foram desglicosilados na posição N297 (que expõe Q295 para conjugação enzimática) ou por manipulação de anticorpos para incluir uma "tag de glutamina" (LLQG) (Jeger, et al., Angew. Chem. 49: 9995-9997 (2010); Strop, et al, Chem. Biol., 20 (2): 161-167 (2013)). Em outra abordagem, um resíduo de formilglicina pode ser introduzido em um anticorpo por meio da manipulação de uma sequência de consenso apropriada no anticorpo e coexpressando o anticorpo manipulado com a enzima geradora de formilglicina (FGE). A funcionalidade aldeído da formilglicina introduzida pode então ser usada como uma alça para a conjugação de toxina (ver, por exemplo, Drake, et al., Bioconjug. Chem., 25 (7): 1331-1341 (2014)).
[00257] Outra abordagem usada para gerar ADCs de DAR2 é pela conjugação da toxina ligante aos açúcares nativos encontrados nos anticorpos glicosilados. A conjugação com anticorpos glicosilados pode ser conseguida, por exemplo, por oxidação de periodato de resíduos de açúcar terminais para produzir aldeídos, que podem então ser conjugados a uma toxina ligante apropriada, ou por abordagens de glicomanipulação em que açúcares nativos são modificados com resíduos de ácido siálico terminais, que pode então ser oxidado para produzir aldeídos para conjugação com a toxina ligante (Zhou, et al., Bioconjug. Chem., 25 (3): 510-520 (2014)).
[00258] O uso de reticulação UV para a conjugação de frações ativas com anticorpos também foi relatado. Este método usa o sítio de ligação de nucleotídeo (NBS) para funcionalização covalente específica de sítio de anticorpos com frações tiol reativas. Uma versão de cisteína conjugada com ácido indol-3-butírico (IBA) foi usada para foto-reticulação específica de sítio de uma fração tiol reativa para anticorpos no NBS. A fração tiol pode então ser usada para conjugar toxina ligante possuindo um grupo tiol reativo (Alves, et al., Bioconjug. Chem., 25 (7): 1198-1202 (2014)).
[00259] Alternativamente, ADCs com uma DAR média baixa podem ser isolados de uma preparação de ADC contendo uma mistura de espécies de DAR usando técnicas de separação cromatográfica, como cromatografia de interação hidrofóbica (ver, por exemplo, Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10: 7063-7070
(2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371-81 (2017); Publicação do Pedido de Patente US. Nº 2014/0286968).
[00260] As preparações de ADC com uma DAR média baixa também podem ser geradas pela adição de anticorpo não conjugado (ou seja , DAR0) às preparações de ADC com uma DAR média>; 3,9. Como é conhecido na técnica, a maioria dos métodos de conjugação produz uma preparação de ADC que inclui várias espécies de DAR, com o DAR relatado sendo a média das espécies de DAR individuais. Em certas modalidades, as preparações de ADC que incluem uma proporção de espécies DAR0 podem ser vantajosas. Em algumas modalidades, a preparação de ADC com uma DAR média inferior a 3,9 pode incluir pelo menos 5% de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a preparação de ADC pode incluir pelo menos 10% de espécies DAR0, por exemplo, pelo menos 15% de espécies DAR0 ou pelo menos 20% de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a preparação de ADC pode incluir entre cerca de 5% e cerca de 50% de espécies DAR0. Em algumas modalidades, a preparação de ADC pode incluir entre cerca de 10% e cerca de 50% de espécies DAR0, por exemplo, entre cerca de 10% e cerca de 40%, ou entre cerca de 10% e cerca de 30% de espécies DAR0.
[00261] A DAR média para os ADCs pode ser determinado por técnicas padrão, como análise espectroscópica UV/VIS, técnicas baseadas em ELISA, técnicas de cromatografia, como cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), espectrometria de massa UV-MALDI (MS) e MALDI-TOF MS. Além disso, a distribuição de formas ligadas a drogas (por exemplo, a fração de espécies DAR0, DAR1, DAR2, etc.) também pode ser analisada por várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo MS (com ou sem uma etapa de separação cromatográfica associada), cromatografia de interação hidrofóbica, HPLC de fase reversa ou eletroforese em gel de focalização isoelétrica (IEF) (ver, por exemplo, Sun et al., Bioconj Chem., 28:1371-81 (2017); Wakankar et al., mAbs, 3:161-172 (2011)).
[00262] Em certas modalidades, a DAR média dos ADCs é determinado por técnicas de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).
[00263] Após a conjugação, os ADCs podem ser purificados e separados de reagentes não conjugados e/ou quaisquer agregados conjugados por métodos de purificação conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de troca iônica, cromatofocalização, ultrafiltração, ultrafiltração centrífuga e combinações destes. Teste
[00264] A atividade anticâncer dos ADCs em células cancerosas que expressam HER2 pode ser testada in vitro e / ou in vivo usando técnicas padrão.
[00265] Por exemplo, a atividade citotóxica dos ADCs pode ser medida expondo células cancerosas que expressam HER2 ao ADC em um meio de cultura de células, cultivando as células por um período de tempo apropriado (por exemplo, cerca de 6 horas a cerca de 7 dias), em seguida, medir a viabilidade celular. As células que não expressam HER2 podem ser incluídas como um controle.
[00266] Uma variedade de linhagens celulares cancerosas que expressam HER2 em vários níveis, que podem ser usadas para testar os ADCs, são conhecidas na técnica e muitas estão disponíveis comercialmente (por exemplo, na American Type Culture Collection, Manassas, VA; Addexbio Technologies, San Diego, CA; DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Os exemplos incluem as linhagens celulares BT-474 (3+), SK-BR-3 (3+), HCC1954 (3+), JIMT-1 (2+) e ZR-75-1 (1+). Estes e outros exemplos estão resumidos na Tabela 8. Tabela 8: Níveis de Expressão Relativa de HER2 em Linhagens Celulares de Interesse Linhagem Descrição Pontuação Receptores Celular IHC HER2/célula NCI-N87 Carcinoma gástrico humano 3+ Não avaliado A549 Carcinoma alveolar de pulmão 0/1+ Não avaliado humano (câncer de pulmão de células não pequenas) BxPC-3 Adenocarcinoma pancreático 1+ Não avaliado humano MIA PaCa- Adenocarcinoma do ducto 2+ Não avaliado 2 pancreático humano FaDu Carcinoma de células escamosas da 2+ Não avaliado faringe humana
Linhagem Descrição Pontuação Receptores Celular IHC HER2/célula HCT-116 Carcinoma epitelial colorretal 1+ Não avaliado humano MDA-MB- Adenocarcinoma epitelial de mama 0/1+ 1.7x10E4 - 231 triplo negativo humano 2.3x10E4 MCF-7 Adenocarcinoma epitelial de mama 1+ 4x10E4 - positivo para receptor de estrogênio 7x10E4 humano JIMT-1 Carcinoma epitelial de mama 2+ 2x10E5 - resistente a trastuzumabe, 8x10E5 oncogene HER2 amplificado ZR-75-1 Carcinoma ductal da mama positivo 2+ 3x10E5 para receptor de estrogênio SKOV-3 Adenocarcinoma epitelial de ovário 2/3+ 5x10E5 - humano, gene HER2 amplificado 1x10E6 SK-BR-3 Adenocarcinoma epitelial de mama 3+ > 1x10E6 humano BT-474 Carcinoma ductal epitelial de mama 3+ > 1x10E6 humanao MDA-MB- Adenocarcinoma de mama humano, 0 Indetectável 468 derivado de sítio metastático: (< 1000) derrame pleural
[00267] A capacidade dos ADCs para inibir o crescimento do tumor in vivo pode ser determinada em um modelo animal apropriado usando técnicas padrão conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Enna, et al., Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc ., New York, NY). Em geral, os modelos animais atuais para a triagem de compostos antitumorais são modelos de xenoenxerto, nos quais um tumor humano foi implantado em um animal, normalmente um roedor.
[00268] Por exemplo, os ADCs podem ser testados in vivo em tumores que expressam HER2 usando camundongos que são enxertados subcutaneamente com fragmento de tumor, ou implantados com um número apropriado de células cancerosas, no dia 0. Os tumores podem se desenvolver até o tamanho desejado, sendo eliminados os animais com tumores insuficientemente desenvolvidos. O tratamento com ADC geralmente começa de 3 a 22 dias após o enxerto, dependendo do tipo de tumor. O ADC pode ser administrado aos animais, por exemplo, por injeção intravenosa (iv). Os tumores são medidos após um período de tempo pré-determinado ou continuamente (por exemplo, 2 ou 3 vezes por semana) até um ponto final pré-determinado para o estudo, por exemplo, quando o tumor atinge um tamanho ou peso pré-determinado. Os tumores que expressam HER2 em vários níveis podem ser usados nos modelos de xenoenxerto. Os xenoenxertos derivados do paciente (PDX) são particularmente úteis.
[00269] Os efeitos tóxicos in vivo dos ADCs podem ser avaliados inicialmente em roedores, por exemplo, camundongos ou ratos, medindo seu efeito no peso corporal do animal durante o tratamento. Perfis hematológicos e análises de enzimas hepáticas também podem ser realizados em amostras de sangue colhidas dos animais.
[00270] A toxicidade e farmacocinética in vivo podem ser ainda analisadas em modelos animais apropriados, por exemplo, ratos ou primatas não humanos, seguindo protocolos padrão. Os macacos Cynomolgus são particularmente úteis a este respeito, uma vez que HER2 humano e de macaco Cynomolgus partilham 98% de homologia de sequência.
[00271] Os ADCs descritos neste documento têm tolerabilidade melhorada e menor toxicidade em comparação com um ADC correspondente tendo uma DAR >3,9 quando administrado na mesma dose de toxina. Em certas modalidades, os ADCs mostram uma melhoria na tolerabilidade de mais de 2x a de um ADC correspondente tendo uma DAR >3,9 quando administrado na mesma dose de toxina. Em algumas modalidades, os ADCs mostram uma melhoria na tolerabilidade de mais de 2,2x, por exemplo, 2,3x, 2,4x ou 2,5x, de um ADC correspondente tendo uma DAR >3,9 quando administrado na mesma dose de toxina. A melhoria na tolerabilidade pode ser determinada, por exemplo, por comparação da dose máxima tolerada (MTD), nenhum nível de evento adverso observado (NOAEL) ou dose mais tóxica não grave (HNSTD) para o ADC da presente divulgação e o ADC correspondente tendo um DAR >3,9. MTD, NOAEL e/ou HNSTD podem ser medidos por técnicas padrão em um modelo animal apropriado, por exemplo, um roedor ou primata não humano.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00272] Para uso terapêutico, os ADCs podem ser fornecidos na forma de composições compreendendo o ADC e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. As composições podem ser preparadas por procedimentos conhecidos usando ingredientes bem conhecidos e facilmente disponíveis.
[00273] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para administração a um sujeito, por exemplo, por via oral (incluindo, por exemplo, bucal ou sublingual), tópica, parenteral, retal ou vaginal, ou por inalação ou spray. O termo "parenteral", tal conforme usado neste documento, inclui injeção subcutânea e injeção ou infusão intradérmica, intra-articular, intravenosa, intramuscular, intravascular, intraesternal, intratecal. A composição farmacêutica será tipicamente formulada em um formato adequado para administração ao sujeito, por exemplo, como um xarope, elixir, comprimido, trocisco, pastilha, cápsula dura ou mole, pílula, supositório, suspensão oleosa ou aquosa, pó dispersível ou grânulo, emulsão, injetável ou solução. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas como formulações de dosagem unitária.
[00274] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas que compreendem os ADCs são formuladas para administração parenteral em uma forma injetável de dosagem unitária, por exemplo, como formulações liofilizadas ou soluções aquosas.
[00275] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas. Exemplos de tais carreadores incluem, mas não estão limitados a, tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico, álcool benzílico; alquil parabenos (tais como metil ou propil parabeno), catecol; resorcinol, cicloexanol, 3-pentanol; e m-cresol; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica,
gelatina; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, tais como glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos, tais como Zn-proteína e surfactantes não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG).
[00276] Em certas modalidades, as composições que compreendem os ADCs podem estar na forma de uma solução aquosa ou oleaginosa injetável estéril ou suspensão. Essas suspensões podem ser formuladas usando agentes dispersantes ou molhantes adequados e/ou agentes de suspensão que são conhecidos na técnica. A solução ou suspensão injetável estéril pode compreender o ADC em um diluente ou carreador não tóxico parenteralmente aceitável. Os diluentes e carreadores aceitáveis que podem ser empregados incluem, por exemplo, 1,3-butanodiol, água, solução de Ringer ou solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser empregados como carreadores. Para esse fim, diversos óleos fixos brandos podem ser empregados, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tais como o ácido oleico, encontram uso na preparação de injetáveis. Os adjuvantes, tais como anestésicos locais, conservantes e/ou agentes tampões também podem ser incluídos na solução ou suspensão injetável.
[00277] Em certas modalidades, a composição que compreende o ADC pode ser formulada para administração intravenosa a humanos. Normalmente, composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Sempre que necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e/ou um anestésico local como lignocaína para aliviar a dor no sítio da injeção. Geralmente, os ingredientes são também fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade do agente ativo. Onde a composição é administrada por infusão, pode ser dispensado com um frasco de infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou solução salina.
Onde a composição é administrada por injeção, ampola de água esterilizada para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[00278] Outras composições farmacêuticas e métodos de preparação de composições farmacêuticas são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (anteriormente “Remingtons Pharmaceutical Sciences”); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000).
MÉTODOS DE USO
[00279] Os ADCs descritos neste documento podem ser usados em métodos de inibição do crescimento de células tumorais que expressam HER2. As células podem ser in vitro ou in vivo. Em certas modalidades, os ADCs podem ser usados em métodos de tratamento de um câncer ou tumor que expressa HER2 em um sujeito.
[00280] O tratamento de um câncer que expressa HER2 pode resultar em um ou mais de alívio dos sintomas, encolhendo o tamanho do tumor, inibindo o crescimento do tumor, diminuindo uma ou mais consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenindo metástases, diminuindo a taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, melhorando a sobrevida, aumentando a sobrevivência livre de progressão, remissão e/ou melhorando o prognóstico.
[00281] Em certas modalidades, o tratamento de um câncer que expressa HER2 com um ADC, conforme descrito neste documento, retarda a progressão da doença. Em algumas modalidades, o tratamento de um câncer que expressa HER2 com um ADC, conforme descrito neste documento, resulta na regressão do tumor. Em algumas modalidades, o tratamento de um câncer que expressa HER2 com um ADC, conforme descrito neste documento, resulta na inibição do crescimento do tumor.
[00282] Os cânceres que expressam HER2 são tipicamente tumores sólidos. Exemplos de tumores sólidos que expressam HER2 incluem, mas não estão limitados a, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer urotelial, câncer pancreático,
câncer de glândula salivar e câncer cerebral. O câncer de mama que expressa HER2 inclui câncer de mama negativo para receptor de estrogênio (ER-) e/ou receptor de progesterona negativo (PR-) e câncer de mama triplo negativo (ER-, PR-, baixo HER2). Os cânceres de pulmão que expressam HER2 incluem câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e câncer de pulmão de células pequenas.
[00283] Em certas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados no tratamento de câncer de mama que expressa HER2, câncer de ovário, câncer de pulmão ou câncer gástrico. Em algumas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados no tratamento de câncer de mama que expressa HER2. Em algumas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados no tratamento de câncer de mama que expressa HER2 que também é negativo para receptor de estrogênio e receptor de progesterona. Em algumas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados no tratamento de câncer de mama triplo negativo que expressa HER2 (TNBC). Em algumas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados no tratamento de câncer de mama que expressa HER2 que metastatizou para o cérebro. Em algumas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados no tratamento de câncer de ovário que expressa HER2.
[00284] Como é conhecido na técnica, os cânceres que expressam HER2 podem ser caracterizados pelo nível de HER2 que expressam (ou seja , pelo "status HER2"). O status de HER2 pode ser avaliado, por exemplo, por imuno-histoquímica (IHC), hibridização fluorescente in situ (FISH) e hibridização cromogênica in situ (CISH).
[00285] IHC identifica a expressão da proteína HER2 na membrana celular. Seções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia de tumor podem ser submetidas ao ensaio de IHC e de acordo com um critério de intensidade de coloração HER2 como segue: Pontuação 0: nenhuma coloração observada ou coloração da membrana é observada em menos de 10% das células tumorais; tipicamente <20.000 receptores/célula.
Pontuação 1+: uma coloração de membrana fraca/quase imperceptível foi detectada em mais de 10% das células de tumor. As células são apenas coloridas em parte de sua membrana. Normalmente cerca de 100.000 receptores/célula. Pontuação 2+: uma coloração da membrana completa de fraca a moderada é observada em mais de 10% das células tumorais; tipicamente cerca de 500.000 receptores/célula. Pontuação 3+: uma coloração de membrana completa de moderada a forte é observada em mais de 10% das células tumorais; tipicamente cerca de 2.000.000 receptores/célula.
[00286] Os tumores com pontuação 0 ou 1+ para a expressão de HER2 são caracterizados como HER2 negativos, enquanto os tumores com pontuação 2+ ou 3+ são caracterizados como HER2 positivo.
[00287] Exemplos de kits comerciais aprovados pela FDA disponíveis para detecção de HER2 usando IHC incluem HercepTest™ (Dako Denmark A/S); PATHWAY (Ventana Medical Systems, Inc.); Kit InSite™ HER2/NEU (Biogenex Laboratories, Inc.) e Sistema Bond Oracle HER2 IHC (Leica Biosystems.
[00288] Os ADCs, conforme descrito neste documento, podem ser úteis no tratamento de cânceres que expressam HER2 em vários níveis. Em certas modalidades, os ADCs podem ser usados no tratamento de cânceres que expressam altos níveis de HER2 (IHC 3+). Em algumas modalidades, os ADCs podem ser usados no tratamento de cânceres que expressam níveis elevados de HER2 (3+ IHC) ou níveis moderados de HER2 (2+ IHC ou 2+/3+ IHC). Em algumas modalidades, os ADCs podem ser usados no tratamento de cânceres que expressam altos níveis de HER2 (3+ IHC), níveis moderados de HER2 (2+ IHC ou 2+/3+ IHC) ou baixos níveis de HER2 (1 + IHC ou 1+/2+ IHC). Em algumas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados no tratamento de cânceres que são classificados como HER2 negativos por IHC.
[00289] Em certas modalidades, os níveis de HER2 do câncer a serem tratados com os ADCs são determinados por IHC. Em algumas modalidades, os níveis de HER2 do câncer a ser tratado com os ADCs são determinados por IHC realizado usando o ensaio Herceptest™.
[00290] Os cânceres que expressam HER2 podem ser de natureza homogênea (ou seja , a maioria das células tumorais expressa uma quantidade semelhante de HER2) ou podem ser de natureza heterogênea (ou seja, compreender diferentes populações de células tumorais que expressam diferentes níveis de HER2). É contemplado que os ADCs podem ser usados para tratar cânceres que expressam HER2 que são homogêneos ou heterogêneos em relação aos níveis de HER2.
[00291] Em certas modalidades, os ADCs encontram uso em métodos para o tratamento de um sujeito com um câncer que expressa HER2 que é resistente ou se torna resistente a outras terapias padrão de tratamento. Em algumas modalidades, os ADCs encontram uso em métodos para tratar um sujeito com um câncer que expressa HER2 que não responde a uma ou mais terapias atuais, como trastuzumabe (Herceptin®), pertuzumabe (Perjeta®), T-DM1 (Kadcyla® ou trastuzumab emtansina) ou taxanos (tais como paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel e semelhantes). Em algumas modalidades, os ADCs encontram uso em métodos para tratar um sujeito com um câncer que expressa HER2 que é resistente ao trastuzumabe. Em algumas modalidades, os ADCs encontram uso em métodos para tratar um sujeito com um câncer que expressa HER2 que é resistente a pertuzumab. Em algumas modalidades, os ADCs encontram uso em métodos para tratar um sujeito com um câncer que expressa HER2 que é resistente ao T-DM1. Em algumas modalidades, os ADCs encontram uso no tratamento de câncer metastático quando o paciente progrediu na terapia anti-HER2 anterior.
[00292] Quando os ADCs são usados no tratamento de indivíduos com um câncer que expressa HER2 que é resistente, refratário e/ou recidivante do tratamento com outro agente terapêutico, os ADCs podem ser parte de uma terapia de segunda linhagem, ou uma terapia de terceira ou de quarta linhagem, dependendo do número de tratamentos anteriores submetidos ao sujeito.
[00293] Em certas modalidades, os ADCs descritos neste documento podem ser usados em conjunto com um agente antitumoral adicional no tratamento de sujeitos com um câncer que expressa HER2. O agente antitumoral adicional pode ser um anticorpo terapêutico tal como aqueles referidos acima, ou um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos comumente usados para o tratamento de cânceres que expressam HER2 incluem, por exemplo, cisplatina,
carboplatina, paclitaxel, paclitaxel Abraxane®) ligado à albumina, docetaxel, gencitabina, vinorelbina, irinotecano, etoposido, vinblastina, pemetrexed, 5-fluoracil (com ou sem ácido folínico), capecitabina, carboplatina, epirrubicina, oxaliplatina, folfirinox, ciclofosfamida e várias combinações destes agentes como é conhecido na técnica. O(s) agente(s) adicional(ais) pode(m) ser administrado(s) ao sujeito simultaneamente com os ADCs ou sequencialmente.
[00294] Em certas modalidades, é contemplado que os ADCs descritos neste documento podem ser usados para tratar um sujeito com um câncer que expressa HER2 que não foi submetido a nenhum tratamento anticâncer anterior (ou seja , os ADCs podem ser usados como uma terapia de primeira linhagem).
[00295] Em certas modalidades, o sujeito a ser tratado com o ADC nos métodos acima pode ser um ser humano, um primata não humano ou outro mamífero. Em algumas modalidades, o sujeito a ser tratado com o ADC nos métodos acima é um sujeito humano.
[00296] A quantidade de ADC a ser administrada a um sujeito irá variar à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real administrado, a idade, peso e resposta do sujeito individual e a gravidade dos sintomas do sujeito, mas é uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[00297] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal conforme usado neste documento, refere-se à quantidade de ADC necessária para ser administrada a fim de atingir o objetivo do método recitado, por exemplo, a melhoria de um ou mais dos sintomas da doença a ser tratada. A quantidade de ADC descrita neste documento que será eficaz no tratamento de um câncer que expressa HER2 pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, os ensaios in vitro , opcionalmente, podem ser empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideal. As doses eficazes são extrapoladas a partir de curvas de dose- resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelo animal.
KITS FARMACÊUTICOS
[00298] Certas modalidades fornecem kits farmacêuticos que compreendem um ADC conforme descrito neste documento.
[00299] O kit tipicamente compreenderá um recipiente e um rótulo e/ou bula no ou associado ao recipiente. O rótulo ou bula contém as instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, fornecendo informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos quanto ao uso de tais produtos terapêuticos. O rótulo ou bula pode incluir ainda um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração em seres humanos ou em animais. O rótulo ou bula também indica que o ADC é para uso no tratamento de um câncer que expressa HER2. O recipiente contém uma composição que compreende o ADC e pode, em algumas modalidades, ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica).
[00300] Além do recipiente contendo a composição que compreende o ADC, o kit pode compreender um ou mais recipientes adicionais compreendendo outros componentes do kit. Por exemplo, um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer ou solução de dextrose; outros tampões ou diluentes.
[00301] Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução intravenosas e semelhantes. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. Se apropriado, um ou mais componentes do kit podem ser liofilizados ou fornecidos na forma seca, como um pó ou grânulos, e o kit pode conter adicionalmente um solvente adequado para reconstituição do (s) componente (s) liofilizado (s) ou seco (s).
[00302] O kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial ou do usuário, tais como filtros, agulhas e seringas.
[00303] Os exemplos a seguir são fornecidos para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção de qualquer foram.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: SÍNTESE DE TOXINA LIGANTE
[00304] O exemplo a seguir descreve a preparação de uma toxina ligante exemplificativa (Toxina Ligante 001) que compreende o seguinte análogo de auristatina (Composto 9): N NH2
O H N H N N O O S O O O O N
O 9
[00305] Protocolos semelhantes podem ser empregados para preparar toxinas ligantes compreendendo outros análogos de auristatina, incluindo os seguintes compostos exemplificativos (ver também Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/041082):
N N O H O H NH2
N N H H N O O S N N O O S N O O O O O O O O
N N NH2 O
O 16 17
N N O H O
O H O N O N O H O NH2
H N N O O N O O O O O N S N O O N S H N
H O N 19
O 18 NH2
N O H O N O H O N N O O O O N S H N
O 20 NH2
1.1 (2R, 3R)-3-metoxi-2-metil-3-((S)-pirrolidin-2-il)propanoato de etila (Composto 1) SOCl2 N OH HN OEt Boc EtOH HCl
O O O O 1
[00306] Para uma solução agitada de ácido (2R,3R)-3-((S)-1-(terc- butoxicarbonil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico (Boc-Dap-OH, 4,31 g, 15,0 mmol) em etanol absoluto (27,0 mL) a 0oC foi adicionado cloreto de tionil (3,0 mL) gota a gota. A solução resultante foi deixada aquecer à temperatura ambiente e o progresso foi monitorado por HPLC-MS. Após 18h, nenhuma matéria-prima remanescente foi detectada e a solução foi concentrada até a secura sob pressão reduzida. O óleo resultante foi suspenso em tolueno (10 mL) e concentrado sob pressão reduzida duas vezes, em seguida, suspenso em éter dietílico (5 mL) e concentrado sob pressão reduzida duas vezes para se obter uma espuma sólida branca (3,78 g, % de rendimento quantitativo). MS m/z obs. = 216,5 (M+1).
1.2 ácido (3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benziloxi)carbonil)amino)-N,3- dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoico (Composto 3)
[00307] O Composto 2 foi preparado conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/041082.
[00308] A uma solução agitada do Composto 2 (6,965 g, 14,14 mmol) em diclorometano (20 mL) foi adicionado ácido trifluoroacético (5,0 mL). A reação foi monitorada para conclusão por HPLC-MS e após 40h nenhuma matéria-prima permaneceu. A reação foi concentrada sob pressão reduzida, co-evaporada com tolueno (2 x 10 mL) e diclorometano (2 x 10 mL) para obter um sólido branco espumoso (6,2 g, rendimento quantitativo com TFA residual). Este material foi dissolvido em 200 mL de EtOAc: hexanos 1:3 quente e deixado arrefecer à temperatura ambiente. Durante o arrefecimento, um precipitado se formou, bem como alguns pequenos cristais. 5 mL de EtOAc foram adicionados e a suspensão foi aquecida mais uma vez para dissolver completamente o precipitado. Mais cristais se formaram no arrefecimento à temperatura ambiente e o frasco foi colocado a -30 °C durante a noite. Na manhã seguinte, o licor mãe foi decantado e os cristais lavados com 2 x 50 mL de hexanos e secos sob alto vácuo. Recuperou 5,67 g de produto cristalino. MS m/z obs. = 405,7 (M+1).
1.3 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benziloxi)carbonil)amino)- N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanoato (Composto 4)
[00309] A uma solução agitada do Composto 3 (6,711 g, 15,37 mmol, 1,025 equiv) em uma mistura de diclorometano (5,0 mL) e N,N-dimetilformamida (5,0 mL) a temperatura ambiente foi adicionado HATU (5,732 g, 15,07 mmol, 1,005 equiv) e N,N-diisopropiletilamina (7,84 mL, 3 equiv). Após agitação durante 30 minutos a temperatura ambiente, uma solução do Composto 1 (3,776 g, 15,00 mmol, 1,0 equiv) em uma mistura de diclorometano (1,0 mL) e N,N-dimetilformamida (1,0 mL) foi adicionada gota a gota, enxaguada em resíduo Composto 1 com mais 3 mL de 1:1 diclorometano:N,N-dimetilformamida. A reação foi monitorada por HPLC-MS e nenhum Composto 1 restante foi observado após 15 minutos. A reação foi concentrada sob pressão reduzida, diluída com acetato de etila (~125 mL) e a fase orgânica foi extraída com HCl a 1 M (2 x 50 mL), 1 x dH 2O (1 x 50mL), NaHCO3 saturado (3 x 50 mL), salmoura (25 mL). As camadas aquosa ácida e básica foram ambas lavadas com 25 mL de EtOAc. Todos os orgânicos foram então reunidos e secos sobre MgSO4, filtrados e concentrados para dar um óleo vermelho. O resíduo foi dissolvido em uma quantidade mínima de diclorometano (~10 mL), carregado em uma coluna de gel de sílica Biotage® SNAP Ultra 360 g (Isolera Flash System; Biotage AB, Suécia) para purificação (EtOAc a 20-100% em hexanos durante 10 volumes de coluna). As frações contendo o produto puro foram reunidas para recuperar 7,9 g de sólido branco espumoso. As frações impuras foram submetidas a uma segunda purificação em uma coluna de sílica gel Biotage ® SNAP Ultra 100 g e combinadas com o produto puro para recuperar um sólido de espuma branca (8,390 g, 88,3%). MS m/z obs. = 634,7 (M+1).
1.4 ácido (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2- (((benziloxi)carbonil)amino)-N, 3-dimetil butanamido)-3-metoxi-5- metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico (Composto 5)
1,4-dioxano
[00310] A uma solução agitada do Composto 4 (8,390 g, 13,24 mmol) em 1,4-dioxano (158 mL) foi adicionado dH2O (39,7 mL) e monohidrato de hidróxido de lítio (H2O a 1 M, 39,7 mL, 3 equiv). A reação foi agitada a 4 °C e monitorizada por HPLC-MS quanto ao consumo da matéria-prima, o que demorou 3 dias até restar apenas vestígios do Composto 4. No decorrer da reação, um novo produto, correspondente à perda de metanol (β-eliminação, <2%) formou-se em pequenas porcentagens além do material desejado. A reação foi acidificada com a adição de HCl aquoso a 1 M (50 mL) e concentrada sob pressão reduzida para remover o dioxano. A mistura reacional restante foi extraída com acetato de etila (4 x 50 mL) e a fase orgânica foi reunida, lavada com salmoura (15 mL + 2 mL de HCl a 2 M), seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para produzir uma óleo de cor clara. O óleo foi redissolvido em éter dietílico (~50 mL) e concentrado sob pressão reduzida (3x) para facilitar a remoção de dioxano residual, obtendo o produto do título como um óleo rígido (7,81 g 97% de rendimento com algum dioxano residual e Composto 4). MS m/z obs. = 606,7 (M+1).
1.5 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3- oxo-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirrolidin-1-il)-5- metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de benzil (Composto 7) NHCOCF3 O H2N
H
N N S O N Cbz N O O 6 H NHCOCF3
O O N N O
O O O NH EDCI, DMAP Cbz
OH O S DMF, CH2Cl2 O 5 O 7 O
[00311] O Composto 6 foi preparado conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/041082.
[00312] A uma solução agitada do Composto 5 (7,12 g, 11,754 mmol) em diclorometano (20 mL) foi adicionado 2,2,2-trifluoro-N- (4-sulfamoilfenil)acetamida (Composto 6, 4,095 g, 1,3 equiv, dissolvido em 3 mL DMF) N,N-dimetilpiridina (1,867 g, 1,3 equiv) e N,N-dimetilformamida (1,5 mL) para gerar uma suspensão amarela clara. A adição posterior de 5 mL de DMF não clarificou a solução. Cloridrato de N-(3-Dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDCI) (2,817 g, 1,25 equiv) foi adicionado em uma única porção e a reação foi monitorada por HPLC- MS. Após 48 horas, a reação não estava mais progredindo e 400 mg adicionais de EDCI foram adicionados. Após 18 horas, nenhuma matéria-prima remanescente foi observada e a reação foi concentrada sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo. O óleo foi dissolvido em acetato de etila (~150 mL) e HCl a 1 M (20 mL), e a fase orgânica foi lavada com HCl a 2 M frio (2 x 10 mL), NaHCO3 saturado (1 x 10 mL), salmoura ( 20 mL + 5 mL de HCl a 2 M). As frações aquosas ácidas e básicas foram extraídas com EtOAc (1 x 20 mL), todas as frações orgânicas foram reunidas, secas sobre MgSO4 e concentradas sob pressão reduzida para produzir um sólido em bruto oleoso (13 g). O resíduo foi dissolvido em diclorometano (~10 mL), carregado em uma coluna de gel de sílica Biotage ® SNAP Ultra 360 g e purificado sob um gradiente de EtOAc a 10-100% (AcOH a 2%) em hexanos ao longo de 12 volumes de 3 colunas de patamar de volume de EtOAc a 50%. As frações contendo o produto puro foram reunidas, concentradas sob pressão reduzida, dissolvidas e concentradas a partir de tolueno (2 x 10 mL) e éter dietílico (2 x 10 mL) para se obter o produto desejado, 7,1 g de sólido de espuma branca. As frações impuras foram submetidas a purificação repetida sob condições de gradiente mais rasas usando uma coluna de gel de sílica Biotage® SNAP Ultra 100 g em um instrumento Isolera ™. Todas as frações puras foram reunidas para recuperar o produto puro como um sólido de espuma branca (8,60 g, 86%). MS m/z obs. = 856,7 (M+1).
1.6 (S)-2-amino-N-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2- metil-3-oxo-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirrolidin- 1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida (Composto 7a)
O N O N H NHCOCF3 10% Pd/C NHCOCF3 N N O H2N N O O O NH H2,MeOH O O NH Cbz
O S O S
O O 7 O 7a O
[00313] O composto 7 (3,71 g, 4,33 mmol) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida a 10% em acetato de etila (30 mL) em um frasco de fundo redondo contendo um agitador magnético e equipado com um adaptador de linha de gás de 3 vias. O recipiente foi evacuado duas vezes sob pressão reduzida e carregado com gás nitrogênio. Paládio sobre carbono a 10% (0,461g, 0,1 equiv) foi adicionado em uma única porção, o adaptador de 3 vias foi encaixado no frasco, um balão de hidrogênio foi encaixado no adaptador e o recipiente foi evacuado duas vezes sob pressão reduzida e carregado com hidrogênio. A reação foi deixada a agitar durante 2 dias, ao longo dos quais o balão de hidrogênio foi ocasionalmente recarregado. Após aproximadamente 48h, a análise HPLC-MS indicou que nenhuma matéria-prima permaneceu. A reação foi diluída com metanol (20 mL) e filtrada através de um tampão de celite. A celite foi lavada com metanol (2 x 50 mL). Todos os filtrados foram reunidos e concentrados sob pressão reduzida e o óleo resultante dissolvido e concentrado a partir de diclorometano. Após secagem sob pressão reduzida, o composto do título foi isolado como um pó incolor (3,10 g, 99%). MS m/z obs. = 722,6 (M+1).
1.7 (S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3- metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-((4-(2,2,2- trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1- oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida (Composto 8)
O N O N OH N
O NHCOCF3 H NHCOCF3 H2N N O N N O
O O NH N O O NH O S O S
O O O 7a O 8 O
[00314] A uma solução agitada de N,N-(L)-dimetilvalina (1,696 g, 9,35 mmol) em N,N-dimetilformamida (10 mL) foi adicionado HATU (3,216 g, 8,46 mmol) e di-isopropiletilamina (3,10 mL, 17,8 mmol). Uma solução amarela clara resultou após 5 minutos. A agitação continuou por mais 10 minutos, depois o Composto 7a (3,213 g, 4,45 mmol) foi adicionado em uma única porção. Após 1 h adicional de agitação, HPLC-MS indicou que restavam vestígios de Composto 7a e a reação durou 16 h. A reação foi então concentrada sob pressão reduzida, diluída com acetato de etila (120 mL) e 40 mL 1:1 NaHCO 3 (sat.): LiCl a 5% e transferida para um funil de separação. A camada aquosa foi removida e a fase orgânica foi lavada com LiCl (1 x 20 mL), NaHCO3 (sat., 2 x 20 mL). As camadas aquosas foram reunidas e extraídas com EtOAc (3 x 50 mL). As camadas orgânicas foram reunidas e lavadas com salmoura (1 x 20 mL), secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas para dar um óleo carregado de DMF que foi concentrado via evaporador rotativo para remover DMF residual, rendendo 7g de óleo de cor palha em bruto. O óleo foi dissolvido em uma quantidade mínima de metanol em diclorometano a 10% (~11mL) e carregado em uma coluna de gel de sílica Biotage® SNAP Ultra 360 g para purificação (MeOH a 2-20% em CH2Cl2 15 volumes de coluna, eluindo o produto em torno de 10-13%). As frações contendo o produto desejado foram reunidas e concentradas sob pressão reduzida para obter o composto do título como uma espuma incolor. As frações impuras foram combinadas, evaporadas e submetidas a purificação repetida em uma coluna de gel de sílica Biotage® SNAP Ultra 100 g em um instrumento Isolera™ e combinadas com o produto puro da primeira coluna para produzir um sólido de espuma incolor (3,78 g). MS m/z obs. = 850,6 (M+1).
1.8 (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-aminofenil)sulfonamido)-1- metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)- 2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamida (Composto 9)
O N O N H NHCOCF3 H NH2
N N O N N O
N O O NH N O O NH LiOH
O O S O O S
O O 8 O 9 O
[00315] A uma solução agitada do Composto 8 (0,980 g, 1,154 mmol) em 1,4-dioxanos (15 mL) foi adicionada água (3,5 mL) e hidróxido de lítio mono- hidratado a 1 M (3 equiv., 3,46 mL). A suspensão leve resultante foi deixada a agitar a 4 °C e foi monitorada por HPLC-MS quanto ao consumo de matéria-prima. Quando a conversão foi concluída (~5 dias), a reação foi neutralizada com 3,46 mL de HCl a 1 M e concentrada sob pressão reduzida para remover o dioxano. A fase aquosa resultante foi diluída com EtOAc a 60 mL e salmoura a 5 mL, depois extraída com acetato de etila (2 x 30 mL). As frações orgânicas foram reunidas, secas sobre Na2SO4, filtradas e evaporadas para produzir o composto do título como um sólido castanho-amarelado (0,930 g). Rf = 0,5 (MeOH a 8% em CH2Cl2). MS m/z obs. = 753,7 (M+1).
1.9 2,3,5,6-tetrafluorofenil 3-(2-(2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)etoxi)etoxi)etoxi)propanoato (Composto 15)
anidrido maleico, TFP-OH, TFAA syn-colidina
[00316] Em um frasco cônico de 50 mL seco, ácido 3-(2-(2-(2- aminoetoxi)etoxi)etoxi)propanoico (Composto 14, 1,000 g, 4,52 mmol) e anidrido maleico (0,443 g, 4,52 mmol) foram dissolvidos em N,N--dimetilformamida anidra (5 mL). A reação foi agitada a temperatura ambiente durante 6h sob N 2, momento em que foi arrefecida a 0 °C e sin-colidina (1,263 mL, 2,1 eq) foi adicionada gota a gota. Em um balão cônico de 50 mL seco separado, tetrafluorofenol (3,002 g, 4 eq) foi dissolvido em N,N-dimetilformamida anidra (10 mL). O frasco foi arrefecido a 0 °C em um banho de gelo e anidrido trifluoroacético (2,548 mL, 4 eq) foi adicionado gota a gota. Este frasco foi agitado durante 15 minutos, altura em que sin-colidina (2,407 mL, 4 eq) foi adicionada gota a gota. O frasco foi agitado por mais 15 minutos, e então o conteúdo foi adicionado ao primeiro frasco gota a gota, via seringa. A reação foi deixada aquecer à temperatura ambiente e a agitação continuou sob N2. A reação foi monitorada por HPLC-MS para o consumo de matérias-primas. Após 6 dias, a reação foi concluída com o consumo total do Composto 14, deixando apenas o Composto 15 e uma pequena quantidade (~5%) do intermediário amido maleico bis-TFP. A reação foi transferida para um funil de separação, diluída com éter dietílico (75 mL) e lavada com LiCl a 5% (1 x 20 mL), HCl a 1 M (2 x 20 mL), solução sat. NaHCO3 (5 x 20 mL) e salmoura (1 x 20 mL). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e evaporada para dar óleo bruto marrom com DMF residual. O óleo bruto foi dissolvido em 8 mL de 1:1 DMF:H2O + TFA a 0,1%, carregado em uma coluna Biotage® SNAP Ultra C18 de 60 g (Biotage AB, Uppsala, Suécia) e purificado sob um gradiente linear de ACN a 30-100%/H2O + TFA a 0,1% em 8 volumes de coluna. As frações puras foram reunidas e diluídas com salmoura (20 mL) e, em seguida, extraídas 3 x 50 mL de Et 2O. Os orgânicos combinados foram secos sobre MgSO4, filtrados e evaporados para recuperar um óleo amarelo claro (1,34 g, rendimento de 66%).
1.10 ((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2- (dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-
metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanoil)sulfamoil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3- metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de terc-butil (Composto 12)
O
H N NH2 N Boc
O H HO N N H H O N N O O S O O O O O
N O N NH2 9 H 11 EDCl, CuCl2
HOAT CH2Cl2/DMF H N NH2
O O H H
N N N O H N Boc
N H H O N N O O S O O O O N
O 12
[00317] O Composto 11 foi preparado conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente Internacional Nº WO 2016/041082.
[00318] A um frasco vazio em forma de pêra de 25 mL, foi adicionado Composto 11 (1,342 g, 3,58 mmol, 3,0 equiv), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,664 g, 3,46 mmol, 2,9 equiv) e 7-hidroxi- azabenzotriazol (HOAT) (0,472 g, 3,46 mmol, 2,9 equiv). Estes sólidos foram dissolvidos numa mistura de N,N-dimetilformamida (0,5 mL) e diclorometano (4,5 mL) com agitação a temperatura ambiente durante 30 minutos. Separadamente, o Composto 9 (0,900 g, 1,20 mmol) foi dissolvido em uma mistura de N,N- dimetilformamida (0,2 mL) e diclorometano (1,8 mL) e adicionado ao frasco em forma de pêra, enxaguando com diclorometano (1,0 mL). A taxa de agitação foi aumentada para 1000 rpm, produzindo um vórtice. Dentro de 2 minutos após a adição do Composto 9, cloreto de cobre (II) (0,514 g, 3,83 mmol, 3,2 equiv) foi adicionado em uma porção diretamente no centro do vórtice através de um funil de pó estreito. A solução inicialmente amarela clara transformou-se em uma suspensão marrom escura que mudou em 10 minutos para uma suspensão verde escura. A reação foi monitorada para conclusão por HPLC-MS e nenhuma mudança no progresso da reação foi observada entre as amostras tomadas em 30 minutos e 1h (~95% concluído). A reação foi deixada em agitação durante a noite a temperatura ambiente, em seguida, 2-(2-aminoetilamino)etanol (0,483 mL, 4,781 mmol, 4 equiv), EtOAc (10 mL) e dH2O (5 mL) foram adicionados à suspensão agitada, que sofreu uma mudança de cor para azul profundo. A suspensão foi agitada vigorosamente durante 4 horas enquanto os sólidos suspensos se dissolviam gradualmente na mistura bifásica. Esta mistura foi transferida para um funil de separação e diluída com EtOAc (100 mL) e salmoura (10 mL), e a camada aquosa foi extraída com IpOH/EtOAc a 10% (4 x 50 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com salmoura (10 mL), secas sobre Na 2SO4 e evaporadas para produzir um sólido em bruto azul pálido. Este sólido bruto foi dissolvido em uma mistura de metanol (0,5 mL) e diclorometano (6 mL) e purificado em uma coluna de gel de sílica Biotage® SNAP Ultra 100 g (MeOH a 2-20% em CH2Cl2 ao longo de 10 volumes de coluna, seguido por um 8 patamar de volume da coluna a MeOH a 20%). O produto eluiu como um pico amplo após 1-2 volumes de coluna a MeOH a ~20% em CH2Cl2 . As frações contendo o material desejado foram reunidas e concentradas sob pressão reduzida para dar o composto do título como um sólido branco (1,105 g, 83%). MS m/z obs. = 555,9 ((M+2)/2), 1109,8 (M+1).
1.11 (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1- ((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3- dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanol)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2- metilpropanoil)sulfamoil)fenil)-5-ureidopentanamida (Composto 13)
H N NH2
O O H H
N N N O H N Boc
N H H O N N O O S O O O O N
O 12
TFA
H CH2Cl2 N NH2
O O
H N N NH2
O H N N H H O N N O O S O O O O N
O 13
[00319] A uma solução do Composto 12 (0,926 g, 0,834 mmol) foi adicionada uma mistura de diclorometano (10 mL) e ácido trifluoroacético (2,0 mL). A reação foi monitorada por HPLC-MS quanto ao consumo de matéria-prima (~45 minutos). A reação foi co-evaporada com acetonitrila (2 x 10 mL) e diclorometano (2 x 10 mL) sob pressão reduzida para remover o excesso de ácido trifluoroacético. O resíduo resultante foi dissolvido em uma quantidade mínima de diclorometano e metanol (3:1, v/v, ~2 mL) e adicionado a uma solução agitada de éter dietílico (200 mL) e hexanos (100 mL) gota a gota por meio de pipeta, produzindo uma suspensão de sólidos brancos claros. Os sólidos foram filtrados e secos sob vácuo para obter o composto do título na forma de um pó branco, como o sal trifluoroacetato (1,04 g, rendimento quantitativo com alguns solventes residuais). MS m/z obs. = 505,8 ((M+2)/2).
1.12 (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2- (dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5- metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)sulfamoil)fenil)-2- ((S)-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-14-isopropil-12-oxo-3,6,9-trioxa-13- azapentadecanamido)-5-ureidopentanamida (Toxina Ligante 001)
H N NH2
O O
H N N NH2
O H N N H H O N N O O S O O O O N
O 13 Compound 15 Composto 15 NaHCO33 NaHCO H22O/dioxano H O/dioxane H N NH2
O O O N O H H N N N O
O H N N H 3
H O O N N O O S O O O O N
O Linker-Toxin Ligante-Toxina 001001
[00320] A uma solução agitada do Composto 13 (0,722 g, 0,584 mmol) em N,N-dimetilformamida (4 mL) foi adicionado o Composto 15 (0,314 g, 1,2 equiv) e diisopropiletilamina (0,305 mL, 3,0 equiv). A análise HPLC-MS às 2h não indicou nenhuma matéria-prima remanescente. A reação foi acidificada com TFA (300 μL) e depois diluída com diH2O + TFA a 0,1% (9 mL). A solução resultante foi carregada em uma coluna Biotage® SNAP Ultra C18 de 120 g (Biotage, Uppsala, Suécia) e purificada sob um gradiente ACN/H2O + TFA a 0,1%:ACNa 20-60% em 10 volumes de coluna, ACN a 60-100% mais de 5 volumes de coluna. O produto eluiu perto de ACN a 40%. As frações puras conforme identificadas por LCMS foram reunidas e liofilizadas. Um pó branco sólido foi recuperado do liofilizador. A liofilização foi repetida em concentração mais elevada (aprox. 50 mg/mL em 2:1 H 2O/ACN) em um frasco para produzir um sólido liofilizado mais denso e menos floculante (754,2 mg, 91%). MS m/z obs. = 647,4 ((M+2)/2), 1292,8 (M+1). EXEMPLO 2: CONJUGAÇÃO DE TOXINA LIGANTE COM ANTICORPO
BIPARATÓPICO
[00321] Conjugados anticorpo-droga (ADCs) do mAb anti-HER2 biparatópico, v10000 e Toxina Ligante 001 foram gerados por redução parcial das ligações dissulfeto intercadeia do anticorpo, seguido por terminação de cadeia dos resíduos de cisteína livre por reação com o componente maleimida da Toxina Ligante. Através da variação da quantidade de TCEP usada para reduzir o anticorpo, podem ser obtidos ADCs com proporções médias de droga para anticorpo entre 0 e 6. Os ADCs foram purificados para remover pequenas moléculas contaminantes e caracterizados para demonstrar DAR, pureza, conteúdo monomérico, níveis de endotoxina e ligação a células tumorais positivas para antígeno.
[00322] A preparação de v10000 é descrita na Publicação do Pedido de Patente Internacional Nº WO 2015/077891. Os detalhes deste anticorpo são fornecidos na Tabela 9 abaixo. As sequências são fornecidas nas tabelas de sequências. Tabela 9 Variant Cadeia A Cadeia B e 10000 Domínio ECD2 ECD4 contendo o epítopo Formato Fab scFv Nome de Pertuzumab - com Y96A Trastuzumabe anticorpo na região VL* e T30A/A49G/L69F na região VH Substituiçõe T350V/L351Y/F405A/Y40 T350V/T366L/K392L/T39 s de 7V 4W sequência CH3§ *Fab ou numeração de domínio variável de acordo com Kabat (Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest, 5a Edição, US Department of Health and Human Services, Publicação NIH Nº 91-3242, p.647, 1991) § Numeração CH3 de acordo com o índice EU como em Kabat (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78-85)
2.1 Conjugação de anticorpo anti-HER2 por redução parcial de ligações dissulfeto intercadeia (v17597; DAR 3.9)
[00323] Uma solução (138,9 mL) do anticorpo v10000 (2,0 g) em acetato de sódio a 10 mM, 9% (p/v) de sacarose, pH 4,5 foi reduzida pela adição de uma mistura recém preparada de Na2HPO4 a 200 mM, pH 8,9 (15,4 mL), DTPA a 5 mM (PBS a 39,5 mL, pH 7,4) e solução de TCEP a 10 mM (3,68 mL, 2,3 eq.). Após 90 minutos a 37C, a reação foi arrefecida em gelo antes da adição de um excesso de Toxina Ligante 001 (6,41 mL; 8 eq) a partir de uma solução estoque de DMSO a 20 mM. A reação de conjugação foi suprimida após 90 minutos pela adição de um excesso de uma solução de N-acetil cisteína a 20 mM (4,81 mL; 6 eq.).
2.2 Conjugação de anticorpo anti-HER2 por redução parcial de ligações dissulfeto intercadeia (v21252; DAR 2.1)
[00324] Uma solução (138,9 mL) do anticorpo v10000 (2,0 g) em acetato de sódio a 10 mM, sacarosa a 9% (p/v), pH 4,5 foi ajustado para pH pela adição de Na2HPO4 a 200 mM, pH 8,9 (15,4 mL). Após a adição de uma solução de DTPA (44 mL em PBS, pH 7,4, concentração final a 1,0 mM), a redução dos dissulfetos intercadeias foi iniciada pela adição de uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (1,68 mL, 1,05 eq.). Após 90 minutos a 37C, a reação foi arrefecida em gelo antes da adição de um excesso de Toxina Ligante 001 (4,81 mL; 6 eq) a partir de uma solução estoque de DMSO a 20 mM. A reação de conjugação foi suprimida após 90 minutos pela adição de um excesso de uma solução de N-acetil cisteína a 20 mM (4,81 mL; 6 eq.).
2.3 Purificação de conjugados de anticorpo e droga v17597 e v21252
[00325] Soluções suprimidas de conjugado de anticorpo e droga (ADC) foram purificadas com 9-15 diavolumes de acetato de sódio a 10 mM, sacarose a 9% (p/v), pH 4,5 em um instrumento de filtração de fluxo tangencial Millipore Labscale™ usando um módulo de ultrafiltração Pellicon ® XL Ultrafiltration Module (Ultracel® 30 kDa 0,005m2; Millipore Sigma). O ADC eluído foi esterilizado por filtração (0,22 um). ADCs produzidos em pequena escala foram purificados em colunas de 40 KDa MWCO Zeba™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) pré- condicionadas com PBS ou acetato de sódio a 10 mM, sacarose a 9% (p/v), pH 4,5.
[00326] Após a purificação, a concentração do ADC foi determinada por um ensaio BCA com referência a uma curva padrão gerada a partir de v10000. Alternativamente, as concentrações foram estimadas por medição de absorção a 280 nm ( = 195065 M-1 cm-1).
[00327] As amostras dos ADCs foram avaliadas por SDS-PAGE não redutor e redutor (ver Figura 1). Nenhuma banda estranha foi observada.
2.4 Cromatografia de Interação Hidrofóbica
[00328] Anticorpos e ADCs foram analisados por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) para estimar a proporção droga-anticorpo (DAR). A cromatografia foi realizada em uma coluna Proteomix® HIC Ethyl (7,8x50 mm, 5 µm) (Sepax Technologies Inc., Newark, DE) empregando um gradiente de 80% MPA/20% MPB a 35% MPA/65% MPB durante um período de 13,5 minutos a uma taxa de fluxo de 1 mL/min (MPA = 1,5 M (NH4)2SO4, NaxPO4 a 25 mM, e MPB = 75% de NaxPO4 a 25 mM, 25% de isopropanol).
[00329] A proporção média de droga para anticorpo (DAR) de um ADC pode variar dependendo do número de ligações dissulfeto liberadas durante a redução do anticorpo. Uma única reação de conjugação que produz um ADC com um DAR médio particular compreende uma mistura de espécies. Para v17597 e v21252, uma mistura de quatro espécies foi gerada: anticorpo não conjugado, ADC com uma DAR de 2, ADC com uma DAR de 4 e ADC com uma DAR de 6.
[00330] Os resultados do HIC são mostrados na Figura 2 e mostram que v17597 tem uma DAR média de 3,92 (Figura 2A) e v21252 tem uma DAR média de 2,07 (Figura 2B).
[00331] As contribuições individuais das espécies DAR0, DAR2, DAR4 e DAR6 para a DAR média dos ADCs purificados foram avaliadas pela integração do cromatograma HPLC-HIC. Cada pico no cromatograma HIC foi isolado por cromatografia preparativa e a identidade do pico foi verificada por LC-MS. A % de conteúdo de espécies DAR individuais para cada variante (conforme determinado por HIC) é mostrado na Tabela 10 e na Figura 2D. Como pode ser visto na Tabela 10 e na Figura 2D, v17597 contém significativamente mais espécies DAR6 do que v21252 e v21252 contém significativamente mais espécies DAR0 do que v17597.
[00332] A Figura 2E ilustra a mudança nas quantidades relativas de DAR 0, 2, 4 e 6 espécies dentro de v10000-Toxina Ligante 001 para uma série de preparações de ADC com valores médios de DAR variando de 0,5 a 6. Tabela 10: Distribuição DAR para v17597 e v21252
DAR % de Área v17597 v21252 0 2 23 2 35 56 4 26 17 6 36 4
2.5 Cromatografia de Exclusão de Tamanho
[00333] A extensão da agregação do anticorpo e ADCs (~15 ug, 5 uL de volume de injeção) foi avaliada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em uma coluna ACQUITY UPLC® Protein BEH SEC (200 angstrom, 1,7 µm, 4,6x150 mm) (Waters Corporation, Milford, MA) usando uma fase móvel consistindo em fosfato a 150 mM, pH 6,8 e uma taxa de fluxo de 400 uL/min. A detecção foi feita por absorvância a 280 nm.
[00334] Os resultados são mostrados na Figura 3 e resumidos na Tabela
11. O mAb v10000 é altamente monomérico pela análise SEC. Nenhum aumento significativo na agregação foi observado após a conjugação à Toxina Ligante 001. Uma comparação de v21252 e v17597 indica que a extensão da agregação não é afetada pelo aumento do DAR de 2 para 4. Tabela 11: Resumo dos resultados da SEC Variante Pico # Tempo ret Largura Área % de (min) (min) (mAU*s) Área v10000 1 2,557 0,1243 86,8 1,16 2 2,938 0,1101 7387,6 98,40 3 3,516 0,1452 3,8 0,44 v17597 1 2,532 0,1343 31,0 0,68 2 2,914 0,1370 4491,3 98,69 3 3,477 0,1370 28,6 0,63 v21252 1 2,549 0,1376 76,4 0,98 2 2,936 0,1212 7685,8 98,47 3 3,477 0,1456 43,4 0,56
2.6 Quantificação de Toxina Livre e Toxina Ligante por LC-MS-MS
[00335] As concentrações residuais de toxina livre (Composto 9), Toxina
Ligante 001 e o ligante de droga N-acetil cisteína-Toxina Ligante 001 nas formulações de ADC foram avaliadas por separação por cromatografia líquida (LC) e detecção de massa, com referência ao padrão curvas para cada analito. As separações foram realizadas em uma coluna PolymerX™ RP-1 (3 µm, 100 angstrom, 50x 4 mm) (Phenomenex Inc., Torrance, CA) empregando uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min, temperatura da coluna de 30 oC e um gradiente de 75% MPA/25% MPB a 60% MPA/40% MPB ao longo de 7,8 minutos (MPA = ácido fórmico aquoso a 0,1% e MPB = ácido fórmico em acetonitrila a 0,1%). A detecção de massa ESI-MRM de modo positivo foi obtida em um espectrômetro de massa Agilent 6470 Triplo Quadrupolo (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
[00336] Todas as amostras continham <0,1 mol% de analito em relação à carga útil conjugada total.
2.7 Ensaio De Ligação Por Citometria de Fluxo Em Células Positivas Para Antígeno
[00337] A ligação de ADCs a linhagens de células tumorais antígeno- positivas JIMT-1 (carcinoma de mama, Addexbio Technologies, San Diego, CA) e RT-112/84 (carcinoma de bexiga, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi comparada com a ligação a anticorpo de origem (v10000) por citometria de fluxo. As células foram cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor. Resumidamente, as células (50.000 células/poço) foram incubadas com anticorpo ou diluições em série de ADC durante 90 minutos em gelo. A seguir a esta incubação, as células foram lavadas duas vezes e depois incubadas com um reagente secundário anti-hIgG conjugado com AlexaFluor® 647 (Jackson ImmunoResearch Inc., Westgrove, PA) durante 60 minutos em gelo. As células foram então lavadas duas vezes e a fluorescência foi analisada por citometria de fluxo (citômetro de fluxo LSRFortessa™ X-20, BD, San Jose, CA).
[00338] Os resultados são mostrados na Figura 4 e demonstram que a ligação de v17597 e v21252 a células positivas para o antígeno não é afetada pela conjugação com a toxina, com ambos os ADCs mostrando ligação semelhante ao anticorpo de origem v10000.
2.8 Teste de endotoxina
[00339] O nível de endotoxina dos ADCs formulados foi avaliado usando um ensaio de ponto final de gelificação Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Genscript ToxinSensor™ Single Test Kit; GenScript, Piscataway, NJ) com um limite de 0,125 EU/mL. Todos os ADCs empregados em experimentos in vivo (abaixo) foram dosados abaixo de 5 unidades de endotoxina por quilograma de massa corporal. EXEMPLO 3: ATIVIDADE IN VITRO DE ADCS BIPARATÓPICOS
[00340] A potência in vitro de v17597 e v21252 foi medida por um ensaio de proliferação celular em células tumorais antígeno-positivas BT-474 (carcinoma ductal, ATCC, Manassas, VA (HTB-20)), SK-BR-3 (carcinoma de mama, ATCC, Manassas, VA (HTB-30)), HCC-1954 (carcinoma da mama, ATCC (CRL-2338)), JIMT-1 (carcinoma de mama, Addexbio Technologies, San Diego, CA, (C0006005)), ZR-75- 1 (carcinoma de mama, ATCC (CRL-1500)) e células tumorais negativas para o antígeno MDA-MB-468 (carcinoma de mama, Addexbio Technologies (C0006003)). As células foram cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor. Resumidamente, no dia anterior à adição do ADC, as células (50 uL/poço, 1000 células/poço) foram adicionadas a placas de 384 poços tratadas com cultura de tecidos (TC) esterilizadas (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) e incubadas durante a noite a 37 °C/CO2 a 5% para permitir que as células adiram à superfície da placa. Em uma placa de 96 poços estéril de fundo em U, os ADCs foram diluídos em meio de crescimento completo em 4,3 vezes a concentração máxima final desejada e foram titulados 1:3 no mesmo meio, criando uma titulação de resposta à dose de 10 pontos. Os poços de controle sem ADC (meio de crescimento sozinho) foram incluídos em cada placa de microtitulação de 96 poços. 15 uL da titulação de resposta à dose de 10 pontos foram adicionados a cada poço da placa de 384 poços contendo as células semeadas, em triplicado, e as placas foram incubadas a 37oC/5% CO2 durante 5 noites. Após 5 noites de incubação, a viabilidade celular foi quantificada pela adição de 20 uL/poço de CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) e incubação à temperatura ambiente durante 30 min. A luminescência foi medida usando um luminômetro de microplaca. As unidades de luz relativa recolhida (RLU) foram convertidas em % de citotoxicidade utilizando o controle sozinho do meio de crescimento mencionado acima (% de citotoxicidade = 1 - [Poço RLU/controle sozinho do meio médio RLU]). Os dados foram ajustados a curvas usando métodos de regressão não linear disponíveis com o software Prism® (GraphPad Software, La Jolla, CA).
[00341] Os resultados são mostrados na Figura 5 e resumidos na Tabela
12. Os resultados mostram que v17597 e v21252 demonstram morte celular seletiva. HER2 que expressa as linhagens celulares BT-474, SK-BR-3, HCC1954, JIMT-1 e ZR-75-1 (Figura 5A-E) foram sensíveis a v17597 e v21252. Ambos v17597 e v21252 foram ineficazes contra células MDA-MB-468 (Figura 5F), que são de uma linhagem de células de carcinoma de mama HER2 negativa. Tabela 12: Atividade in vitro de v17597 e v21252 EC50 (nM) Variante MDA- BT-474 SK-BR-3 HCC1954 JIMT-1 ZR-75-1 MB-468 v17597 0,04 0,04 0,05 0,19 0,21 NA v21252 0,03 0,04 0,06 0,36 0,47 NA EXEMPLO 4: ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE v10000-TOXINA LIGANTE 001 EM DARS MÉDIAS DIFERENTES
[00342] ADCs compreendidos por v10000 conjugado com Toxina Ligante 001 com uma DAR média variando de 0,7 a 3,9 foram preparados variando a quantidade de TCEP (0,5 a 10 equivalentes molares) utilizada na reação de redução. A reação de conjugação foi conduzida de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 2 e os ADCs resultantes foram purificados usando uma coluna Zeba™ de 40 kDa, pré-equilibrada com PBS pH 7,4.
[00343] A potência in vitro dos ADCs foi medida por um ensaio de proliferação celular em células tumorais positivas para antígeno SK-OV-3 (carcinoma ovariano, ATCC, Manassas, VA (HTB-77)), JIMT-1 (carcinoma de mama, DSMZ, Braunschweig, Alemanha (ACC 589)) e ZR-75-1 (carcinoma de mama, ATCC (CRL-1500)). As células foram cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor. Resumidamente, no dia anterior à adição de ADC, as células (100 uL/poço, 2500 células/poço) foram adicionadas a placas de paredes opacas de 96 poços tratadas com TC (Corning 3904) e incubadas durante a noite a 37 °C/CO2 a 5% para permitir que as células adiram à superfície da placa. No dia seguinte, os ADCs foram diluídos em meio de crescimento completo (placa de fundo em U de 96 poços) a 5 vezes a concentração máxima final desejada e foram titulados 1:3 no mesmo meio, oito etapas (9 pontos de titulação de composto no total). Um ponto de titulação de controle contendo meio de crescimento sozinho também foi incluído, criando uma titulação de resposta à dose de 10 pontos no total. 25 uL da titulação de resposta à dose de 10 pontos foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços contendo as células semeadas, em triplicado, e as placas foram incubadas a 37 °C/CO2 a 5% durante 5 noites. Após a incubação, a viabilidade celular foi quantificada pela adição de 25 uL/poço de CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI) e incubação à temperatura ambiente durante 30 min. A luminescência foi então medida usando um luminômetro de microplaca e as unidades de luz relativas coletadas (RLU) foram convertidas em % de citotoxicidade, conforme descrito no Exemplo 3.
[00344] Os resultados são apresentados na Figura 6. Os ADCs com DARs médias entre 3,9 e 1,6 mostraram potência comparável nas três linhagens celulares, no entanto, o ADC com DAR0,7 média mostrou uma diminuição significativa na potência. As quantidades aproximadas de espécies DAR individuais que constituem os ADCs DAR0.7, DAR2.2 e DAR3.9 são mostradas na Tabela 13 e na Figura 6D. Pode ser visto que o ADC de DAR0,7 contém aproximadamente três vezes mais espécies DAR0 (aproximadamente 65% vs. aproximadamente 20%) do que o ADC de DAR1,9. O ADC de DAR2,2, por sua vez, contém significativamente mais espécies DAR0 do que as espécies DAR3,9 (aproximadamente 20% vs. <3%), no entanto, o ADC de DAR2,2 mostrou potência in vitro comparável ao ADC de DAR3,9. Esses resultados sugerem que pode haver um limite para a proporção de espécies DAR0 que uma preparação de ADC pode conter antes que a potência do ADC seja impactada. Tabela 13: Distribuição aproximada de DAR para ADCs DAR médio de Distribuição DAR (%) ADC DAR 0 DAR 2 DAR 4 DAR 6 0,7 65 33 2 0 1,6 33 54 11 2 2,2 20 55 19 5 2,6 13 55 22 10 3,2 7 47 26 21
DAR médio de Distribuição DAR (%) ADC DAR 0 DAR 2 DAR 4 DAR 6 3,9 3 35 27 35 EXEMPLO 5: INTERNALIZAÇÃO DE ADCS BIPARATÓPICOS EM CÉLULAS DE EXPRESSÃO DE HER2
[00345] Para determinar a internalização de v21252, corante pHAb (Promega Corporation, Madison, WI) foi acoplado a resíduos de amina de v21252, trastuzumab-Toxina Ligante 001 e um controle negativo ADC de acordo com os protocolos recomendados pelo fabricante. O ADC de controle negativo foi um anticorpo anti-proteína F de RSV conjugado com a Toxina Ligante 001.
[00346] Os anticorpos conjugados com pHAb podem ser usados para monitorar a internalização de anticorpos mediada por receptor. O anticorpo conjugado com o corante pHAb ligado ao antígeno na membrana celular exibe fluorescência mínima, mas após a internalização mediada pelo receptor e o tráfego através do endossoma e do sistema lisossomal, o conjugado anticorpo-pHAb é exposto a um pH mais ácido, fazendo com que o conjugado anticorpo-pHAb fluoresça.
[00347] v21252 conjugado com pHAb, trastuzumab-Toxina Ligante 001 conjugado com pHAb e controle conjugado com pHAb foram incubados com as linhagens celulares que expressam HER2 SKBR3 e JIMT-1. Resumidamente, células tumorais SKBR3 e JIMT-1 HER2+ foram semeadas em uma placa de fundo ótico preto de 384 poços (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a 5.000 células/poço em meio de ensaio. A placa foi incubada durante a noite a 37 oC + CO2 a 5%. No dia seguinte, os anticorpos conjugados com pHAb foram adicionados às placas a 10 ug/mL e 1 ug/mL final em meio de ensaio. O meio contendo a coloração Vybrant® DyeCycle ™ Violet (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) foi adicionado a uma concentração final de 2 uM para visualizar os núcleos. A placa foi incubada a 37oC + CO2 a 5% entre os pontos de tempo. Os poços de amostra foram varridos em vários pontos de tempo na plataforma CellInsight ™ CX5 de triagem de alto conteúdo (HCS) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). A placa foi digitalizada usando uma objetiva de 20x no SpotAnalysis Bioapplication com 2 canais. Canal 1 (385 nm, Vybrant Dye Cycle Violet) foi usado como o canal de foco e o Canal 2
(560 nm, pHAb) foi usado para obter dados de internalização. A fluorescência de anticorpos conjugados com pHAb internalizados foi medida usando o parâmetro "Intensidade média total do ponto".
[00348] Os resultados são mostrados nas Figuras 13 e 14 e mostram que v21252 internaliza e trafega para lisossomas em células que expressam HER2 para um nível maior do que o trastuzumabe-Toxina Ligante 001 monoespecífico. EXEMPLO 6: ATIVIDADE IN VIVO DE ADCS BIPARATÓPICOS
6.1 ADCs v17597 e v21252 inibem o crescimento de xenoenxerto derivado de paciente com câncer de mama HBCx-13b
[00349] Camundongos atímicos fêmeas (Envigo, Huntingdon, UK) foram implantados subcutaneamente com um fragmento de tumor de 20 mm 3 (n = 7 por grupo). Uma vez que os tumores atingiram 75 a 200 mm 3 de tamanho, os animais foram atribuídos a grupos de tratamento e v17597, v21252 ou veículo foram dosados por injeção intravenosa para um total de 2 doses no dia 1 e no dia 15 (q14d x2) como indicado na Figura 7. As medições de tumor foram realizadas com paquímetro, quinzenalmente. Os camundongos foram sacrificados eticamente quando os tumores atingiram um tamanho de 1764 mm3. Os volumes do tumor são relatados como a média ± SEM para cada grupo.
[00350] A Figura 7A fornece os resultados para a resposta do tumor em camundongos implantados por via subcutânea com fragmentos de tumor HBCx- 13b após a administração iv de veículo ou v17597. A Figura 7B fornece os resultados para a resposta do tumor em camundongos implantados subcutaneamente com fragmentos de tumor de HBCx-13b após administração iv de veículo ou v21252. Estes resultados mostram que o tratamento de camundongos enxertados com HBCx-13b com v17597 ou v21252 resulta em uma redução do volume do tumor de uma maneira dependente da dose.
6.2 ADCs v17597 e v21252 inibem o crescimento de xenoenxerto derivado de paciente com câncer de mama ST-910
[00351] Camundongos nude atímicos fêmeas (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) foram implantados subcutaneamente com um fragmento de tumor de ~70 mg (n = 6 por grupo). Uma vez que os tumores atingiram 125 a 250 mm 3 de tamanho, os animais foram atribuídos a grupos de tratamento e v17597, v21252 ou veículo foram doseados por injeção intravenosa única como indicado na Figura 8. As medições de tumor foram realizadas com um calibrador digital quinzenalmente. Os camundongos foram sacrificados eticamente quando os tumores atingiram um tamanho de 2000 mm3. Os volumes do tumor são relatados como a média ± SEM para cada grupo.
[00352] A Figura 8A fornece os resultados para a resposta do tumor em camundongos implantados por via subcutânea com fragmentos de tumor ST-910 após a administração iv de veículo ou v17597. A Figura 8B fornece os resultados para a resposta do tumor em camundongos implantados subcutaneamente com fragmentos de tumor de ST-910 após administração iv de veículo ou v21252. Estes resultados mostram que o tratamento de camundongos enxertados com ST-910 com v17597 ou v21252 resulta em uma redução do volume do tumor de uma maneira dependente da dose.
[00353] ST-910 é um xenoenxerto derivado de paciente (PDX) que representa câncer de mama HER2 1+, enquanto HBCx-13b (usado no Exemplo
6.1) é um PDX que representa câncer de mama HER2 3+. Os exemplos 6.1 e 6.2 demonstram, assim, que v17597 e v21252 são ativos em ambos os tumores HER2 3+ e HER2 1+.
6.3 Análise farmacocinética
[00354] Para os xenoenxertos derivados do paciente, HBCx-13b e ST-910, as amostras farmacocinéticas para o anticorpo total (não conjugado e conjugado) foram coletadas em pontos de tempo pré-especificados e foram avaliadas usando um ensaio baseado em ELISA para quantificação do anticorpo total. As concentrações séricas para o anticorpo total para v21252 ou v17597 foram analisadas primeiro revestindo placas ELISA de 384 poços com anticorpo Fc de IgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) em PBS pH 7,4 e incubando a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, as placas foram lavadas e bloqueadas usando diluente de ensaio e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Após o bloqueio, as amostras de curva padrão, controles e amostras de soro diluídas foram adicionadas às placas e incubadas à RT durante 1 hora. O anticorpo de detecção, conjugado HRP-cabra anti-IgG F(ab')2 humano (Jackson ImmunoResearch), foi então adicionado às placas e após 1 hora de incubação a RT, substrato HRP, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), foi adicionada às placas. TMB foi extinto usando HCl e absorvância foi medida a 450 nm usando um leitor de placas. A Figura 15 mostra a concentração de anticorpo total no soro - perfil de tempo para HBCx-13b (A) e ST-910 (B). EXEMPLO 7: FARMACOCINÉTICA DE DOSAGEM ÚNICA / ESTUDO DE TOLERABILIDADE DE v17597 e v21252 EM MACACOS CYNOMOLGUS
[00355] O objetivo deste estudo foi caracterizar a farmacocinética (PK) e tolerabilidade de v17597 e v21252 em macacos cynomolgus após uma única administração de infusão intravenosa (IV). O macaco cynomolgus foi selecionado para a avaliação de segurança não clínica de ambos v17597 e v21252 com base na homologia de sequência e afinidade de ligação. HER2 humano e de macaco cynomolgus compartilham 98% de homologia de sequência, enquanto a homologia de sequência para cão e camundongo/rato HER2 é de 93% e 88%, respectivamente. Além disso, v17597 e v21252 se ligam a HER2 de macaco cynomolgus com afinidade semelhante a HER2 humano (KD = 0,55x10-9 de macaco; KD = 0,83x10-9 de humano) e não se ligam a HER2 de cão, camundongo ou rato.
[00356] O estudo demonstra que uma dose única de v17597 em doses de 3, 6 ou 9 mg/kg foi bem tolerada, e que uma dose única de v21252 em doses de 9 ou 12 mg/kg foi bem tolerada. Materiais e Métodos Tolerabilidade
[00357] Uma dose única de v17597 (3, 6 ou 9 mg/kg) ou v21252 (9 mg/kg ou 12 mg/kg) foi administrada por infusão IV durante 60 minutos em macacos cynomolgus fêmeas (N = 3). A tolerabilidade geral foi avaliada com observações clínicas, peso corporal, consumo de alimentos e patologia clínica (hematologia e química clínica). O sangue foi coletado ao longo do estudo para análise bioanalítica de v17597 ou v21252, anticorpo total e toxina livre (Composto 9). O desenho do estudo está resumido na Tabela 14. Tabela 14: Projeto de Farmacocinética de Dose Única e Estudo de Tolerabilidade Geral em Macacos Cynomolgus Grupo Dose de v17597 Dose v21252 Número de
(mg/kg) (mg/kg) Fêmeas 1 0 0 3 2 3 -- 3 3 6 -- 3 4 9 -- 3 5 -- 9 3 6 -- 12 3 Métodos Bioanalíticos
[00358] v17597 e v21252: as concentrações séricas de v17597 ou v21252 (DAR de 1 ou superior) foram analisadas usando um ensaio de eletroquimioluminescência com a plataforma Meso Scale Discovery (ECL/MSD) (Meso Scale Diagnostics, LLC, Rockville, MD) com IgG de camundongo anti-toxina como o agente de captura e anti-pertuzumab sulfo-TAG como o agente de detecção.
[00359] Anticorpo total: O ensaio bioanalítico de anticorpo total mediu o componente de anticorpo de v17597 ou v21252, independentemente de o componente de anticorpo ter sido conjugado com toxina (em todas as DARs) ou não. As concentrações séricas de anticorpo total foram analisadas usando um ensaio de eletroquimioluminescência com a plataforma Meso Scale Discovery (ECL/MSD) com anticorpo anti-pertuzumabe como agente de captura e anti- trastuzumabe sulfo-TAG como agente de detecção.
[00360] Toxina (Composto 9): As concentrações séricas da toxina foram analisadas usando um método LC-MS/MS. Amostras de soro foram precipitadas com acetonitrila/metanol (50:50, v/v) e os sobrenadantes foram analisados. O sistema de cromatografia líquida utilizado foi uma coluna de fase reversa com fluxo gradiente consistindo em água/ácido acético (100/0,05, v/v) e acetonitrila. A toxina e o padrão interno (toxina-d4; Composto 9deuterado) foram detectados usando um sistema de espectrômetro de massa triplo quadrupolo equipado com uma fonte de ionização por electrospray (ESI) operada no modo de íon positivo. Análise farmacocinética
[00361] A análise não compartimental dos resultados bioanalíticos da amostra de soro foi usada para derivar os parâmetros de PK (concentração sérica máxima [Cmax], meia-vida terminal [T1/2], depuração [CL] e volume aparente de distribuição [Vss]). Resultados Farmacocinética
[00362] v17597: A exposição a v17597 foi geralmente proporcional à dose entre 3 a 9 mg/kg. Cmax foi alcançada no final da infusão de 60 minutos (mediana Tmax) e aumentada proporcionalmente à dose. A exposição sistêmica (AUC 0-∞) aumentou ligeiramente mais do que a forma proporcional à dose. A meia-vida terminal média preliminar (T1/2) geralmente parece aumentar com o aumento da dose, a depuração (CL) geralmente parece diminuir com o aumento da dose e o volume aparente de distribuição (Vss) geralmente não parece mudar com a dose.
[00363] v21252: A exposição a v21252 foi geralmente proporcional à dose entre 9 a 12 mg/kg. Cmax foi alcançada no final da infusão de 60 minutos (mediana Tmax) e aumentada proporcionalmente à dose. O perfil de concentração de soro v21252 - tempo é mostrado na Figura 9A. A exposição sistêmica (AUC 0-∞) aumentou ligeiramente mais do que a forma proporcional à dose. A meia-vida terminal média preliminar (T1/2), a depuração (CL) e o volume aparente de distribuição (Vss) geralmente não parecem mudar com a dose.
[00364] Anticorpo total (conjugado e não conjugado): A concentração sérica máxima de anticorpo total (Cmax) foi alcançada no final da infusão de 60 minutos (mediana Tmax). O perfil de concentração total de anticorpo no soro - tempo de v21252 é mostrado na Figura 9B. Um modelo não compartimentado foi usado para derivar os parâmetros PK. Cmax aumentou de forma proporcional à dose, enquanto AUC0-∞ aumentou ligeiramente mais do que a forma proporcional à dose para v17597 e v21252. A meia-vida terminal média de v17597 aumentou com o aumento da dose, enquanto a depuração sérica (CL) e o volume total aparente de distribuição (Vss) do anticorpo total diminuíram com o aumento da dose. A meia- vida terminal média e o volume total aparente de distribuição (Vss) de v21252 aumentaram com o aumento da dose, enquanto a depuração sérica (CL) do anticorpo total diminuiu com o aumento da dose.
[00365] Toxina (Composto 9): Após a administração de uma dose única de v17597 (3, 6 ou 9 mg/kg) ou v21252 (9 mg/kg ou 12 mg/kg), todas as concentrações de toxina no soro estavam abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ, < 5,00 ng/mL). Tolerabilidade
[00366] Uma dose única de v17597 (3, 6 ou 9 mg/kg) ou v21252 em doses de 9 ou 12 mg/kg foi bem tolerada. Não houve mortalidade durante o curso do estudo. Nenhum efeito relacionado ao tratamento foi observado em observações clínicas, consumo de alimentos ou peso corporal.
[00367] Mudanças mínimas a leves nos parâmetros da patologia clínica que foram consideradas relacionadas ao tratamento foram observadas em alguns animais. Não houve efeitos relacionados ao artigo de teste entre os desfechos de hematologia em qualquer grupo de tratamento. Todas as flutuações foram consideradas dentro dos intervalos esperados para flutuação biológica e/ou relacionada ao procedimento, apesar de quaisquer diferenças aparentes entre os valores individuais. EXEMPLO 8: ESTUDO DE TOXICIDADE NÃO GLP DE v17597 EM
MACACOS CYNOMOLGUS
[00368] Um estudo de toxicidade não GLP foi conduzido para investigar a toxicocinética e a toxicidade do v17597 em macacos cynomolgus. O estudo foi desenhado com base nos resultados do estudo de farmacocinética/tolerabilidade de dose única em macacos cynomolgus fêmeas (Exemplo 6).
[00369] O estudo demonstrou que a administração de v17597 semanalmente em doses de 2,25 e 4,5 mg/kg, e duas vezes por semana em doses de 4,5 e 9 mg/kg não foi bem tolerada em macacos cynomolgus machos e fêmeas. O nível sem efeitos adversos (NOAEL) e a maior dose não gravemente tóxica (HNSTD) para v17597 após a administração semanal ou quinzenal por até 6 semanas foi considerado inferior a 2,25 mg/kg administrado semanalmente ou 4,5 mg/kg administrado duas vezes por semana. Materiais e Métodos
[00370] O veículo ou v17597 foi administrado por uma infusão IV de 1 hora semanalmente nos Dias 1, 8, 15, 22, 29 e 36 nas doses 0, 2,25 e 4,5 mg/kg, e uma vez a cada duas semanas nos Dias 1, 15 e 29 em doses de 4,5 e 9 mg/kg. Todos os animais foram avaliados quanto a alterações nos sinais clínicos, consumo de alimentos, peso corporal, pressão sanguínea, ECGs, taxas de respiração (visual), patologia clínica (hematologia, química clínica, coagulação, análise de urina), pesos de órgãos e exame macroscópico/microscópico de tecidos. O sangue foi coletado para análise toxicocinética e análise de anticorpos anti-drogas (ADA). Os animais dosados semanalmente foram sacrificados no Dia 42 e os animais dosados a cada duas semanas foram sacrificados no Dia 36. O desenho do estudo é apresentado na Tabela 15. Tabela 15: Desenho do Estudo Dose Grupo Regime de Dose Nº de Animais (mg/kg) 1 0 Semanal 3M/3F 2 2,25 Semanal 3M/3F 3 4,5 Semanal 3M/3F Em semanas 3M/3F 4 4,5 alternadas Em semanas 3M/3F 5 9 alternadas Resultados
[00371] Com base no peso corporal, observações clínicas e achados de patologia clínica, o v17597 foi considerado adverso em todas as doses testadas neste estudo. Animais com 9 mg/kg/dose (duas vezes por semana) e uma fêmea com 4,5 mg/kg/dose (duas vezes por semana) foram sacrificados precocemente e receberam doses apenas nos Dias 1 e 15.
[00372] Com base nos resultados desse estudo, o nível sem efeitos adversos (NOAEL) e a maior dose tóxica não grave (HNSTD) para v17597 após a administração semanal ou quinzenal por até 6 semanas foi considerado inferior a 2,25 mg/kg administrado semanalmente ou 4,5 mg/kg administrado duas vezes por semana. EXEMPLO 9: ESTUDO DE TOXICIDADE NÃO GLP DE v21252 EM
MACACOS CYNOMOLGUS
[00373] O objetivo deste estudo foi caracterizar ainda mais a toxicocinética e a toxicidade de v21252.
[00374] O estudo demonstrou que a administração de v21252 nos dias 1, 15 e 29 em doses de até 12 mg/kg foi clinicamente bem tolerada em macacos cynomolgus machos e fêmeas. O nível de eventos adversos não observados (NOAEL) foi de 12 mg/kg e a maior dose tóxica não grave (HNSTD) foi superior a 12 mg/kg. Materiais e Métodos
[00375] Neste estudo, o veículo ou v21252 foi administrado a macacos cynomolgus machos e fêmeas por uma infusão IV de 1 hora uma vez a cada duas semanas nos Dias 1, 15 e 29 em doses de 0, 9 e 12 mg/kg (3 animais por sexo em cada nível de dose). Todos os animais foram avaliados quanto a alterações nos sinais clínicos, consumo de alimentos, peso corporal, pressão sanguínea, ECGs, taxas de respiração (visual), patologia clínica (hematologia, química clínica, coagulação, análise de urina), pesos de órgãos e exame macroscópico/microscópico de tecidos. O sangue foi coletado para análise toxicocinética (TK) (v21252, anticorpo total e toxina livre (Composto 9)) e análise de anticorpo anti-droga (ADA), e os animais foram terminados no Dia 36. Outro grupo de animais recebeu uma dose única de 12 mg/kg v21252 no Dia 1 e terminou 4, 8 e 15 dias após a dose (n = 2 por ponto de tempo). O projeto do estudo é apresentado na Tabela 16. Tabela 16: Projeto de Estudo de Toxicidade Não-GLP Animais do Dia Sacrificados Dose v21252 Grupo (Macho/Fêmea) (mg/kg) 4 8 15 36 1 0 - - - 3/3 2 12 1/1 1/1 1/1 - 3 9 - - - 3/3 4 12 - - - 3/3 Resultados Farmacocinética
[00376] v21252: A farmacocinética foi calculada após a administração repetida de v21252. Cmax foi alcançada no final da infusão de 60 minutos ou 60 minutos após o final da infusão (mediana Tmax). O perfil de tempo de concentração de soro v21252 - é mostrado na Figura 10. No Dia 1, a Cmax e a exposição sistêmica (AUC0-168h) aumentaram de forma ligeiramente maior do que proporcional à dose. No Dia 29, Cmax e AUC0-168h aumentaram de forma aproximadamente proporcional à dose. A exposição sistêmica e AUC0-168h não pareceram alterar e não mostraram acumulação após administração repetida. A meia-vida de eliminação média (T1/2) aumentou do grupo de 9 mg/kg para o grupo de 12 mg/kg. Um mecanismo de depuração saturável para v21252 pode ser responsável pela diferença em T 1/2 e depuração entre os grupos de dose baixa (9 mg/kg) e alta (12 mg/kg).
[00377] Anticorpo total (conjugado e não conjugado): O anticorpo total foi medido em macacos cynomolgus após as administrações repetidas de v21252. A Cmax para o anticorpo total foi alcançada no final da infusão de 60 minutos (mediana Tmax). O perfil de tempo de concentração total de anticorpo no soro - é mostrado na Figura 11. No Dia 1, a Cmax e a exposição sistêmica (AUC0-168h) aumentaram de forma ligeiramente maior do que proporcional à dose. No Dia 29, Cmax e AUC0-168h aumentaram de forma aproximadamente proporcional à dose. A exposição sistêmica a AUC0-168h permaneceu inalterada e não mostrou acumulação após administrações repetidas. Semelhante a v21252, a meia-vida média de eliminação (T1/2) para o anticorpo total aumentou do grupo de 9 mg/kg para o grupo de 12 mg/kg.
[00378] A farmacocinética de v21252, conforme indicado pelos perfis de concentração de soro-tempo de v21252 e Anticorpo Total, são indicativos de perda mínima de toxina ligante de v21252 in vivo (ver Figura 12).
[00379] Toxina (Composto 9): A toxina livre foi medida em macacos cynomolgus após as administrações repetidas de v21252. Todas as concentrações séricas de carga útil (Composto 9) estavam abaixo do limite de quantificação (< 0,500 ng/mL), com exceção de uma mulher a 12 mg/kg no Dia 1, uma fêmea a 9 mg/kg no Dia 29 e um macho a 12 mg/kg no Dia 29.
[00380] Anticorpos anti-droga (ADA): Os anticorpos anti-v21252 foram triados em macacos cynomolgus após as administrações repetidas de v21252. ADA foi detectado no soro de uma única fêmea na coorte de dosagem de 9 mg/kg. Toxicidade
[00381] No geral, a administração de v21252 foi clinicamente bem tolerada em todas as doses testadas. Não foram observadas alterações relacionadas ao tratamento na anális de urina, parâmetros de ECG ou frequências respiratórias.
[00382] Efeitos esporádicos e mínimos nos pesos corporais individuais foram observados em animais que receberam administrações repetidas de v21252 a 12 mg/kg/dose. Todos esses animais se recuperaram parcial ou totalmente no Dia 35. Todos os outros animais mantiveram ou ganharam peso ao longo do estudo.
[00383] Em alguns animais foram observadas alterações mínimas a ligeiras nos sinais clínicos, patologia clínica, peso dos órgãos ou exame macroscópico/microscópico dos tecidos. As observações macroscópicas consideradas relacionadas com v21252 foram limitadas à descoloração vermelha observada no sítio da infusão em todos os animais, incluindo os controles. As alterações no peso do órgão relacionadas com o artigo de teste foram limitadas ao baço. Em animais terminados no Dia 36 após 3 doses bissemanais, os efeitos microscópicos relacionados ao tratamento incluíram alterações no trato gastrointestinal, fígado, baço, nódulos linfáticos, pâncreas, pele e sítios de infusão IV. Todos foram classificados como mínimos ou leves. Em animais que terminaram em vários momentos após uma dose única de 12 mg/kg, foram observados efeitos semelhantes mínimos a leves relacionados ao artigo de teste.
[00384] A análise de PK confirmou a exposição sistêmica nos animais tratados com v21252 e a exposição sistêmica média aumentou com o aumento da dose de uma maneira proporcional à dose para v21252 e anticorpo total, enquanto a exposição à toxina livre (Composto 9) foi observada apenas em níveis baixos em alguns animais.
[00385] As tabelas 17-20 mostram uma comparação dos resultados dos estudos de PK/tolerabilidade e os estudos de dose repetida não GLP para v17597 e v21252. Tabela 17: Comparação da mortalidade observada em estudos de dose única e de dose repetida para v17597 e v21252 em macacos Cynomolgus v17597 v21252 PK/ Repetir Dose PK/ Repeti Dose Tolerabilid Semanal Em Tolerabilid r Dose ade semanas ade alternadas 12 mg/kg -- -- -- 0/3 0/6 9 mg/kg 0/3 -- 3/6 0/3 0/6 6 mg/kg 0/3 -- -- -- -- 4,5 mg/kg -- 0/6 1/6 -- -- 3 mg/kg 0/3 -- -- -- -- 2,25 mg/kg -- 0/6 -- -- -- Tabela 18: Comparação de NOAEL e HNSTD determinado em estudos de dose repetida para v17597 e v21252 em macacos Cynomolgus v17597 v21252 Semanal Em semanas alternadas NOAEL Não foi possível determinar Não foi possível 12 (<2,25 mg/kg) determinar mg/kg (<4,5 mg/kg) HNSTD Não foi possível determinar Não foi possível >12 (<2,25 mg/kg) determinar mg/kg (<4,5 mg/kg) Tabela 19: Análise Bioanalítica ADC Droga e Dose AUC0-336hr AUC0-336hr AUC0-168hr AUC0-168hr Primeira Primeira Última Diferença dose Diferença de Dose de Vezes (hr*ug/mL) Vezes da Dosenº (hr*ug/mL) da Última Dosenº v17597 4,5 9.920 1 7.180 1 mg/kg v17597 9 mg / kg 24.600 2,2 N/A N/A v21252 9 mg/kg 18.800 1,9 18.700 2,60 v21252 12 mg/kg 34.900 3,5 17.700 2,47 nº em comparação com v17597 em 4,5 mg/kg Tabela 20: Análise Bioanalítica de Anticorpo Total Droga e Dose AUC0-336 AUC0-336hr AUC0-168 AUC0-168hr Primeira Diferença de Última Diferença dose Vezes da Dose de Vezes (hr*ug/mL) Primeira Dose (hr*ug/mL) da Última Dose v17597 4,5 8.090 1 7.530 1 mg/kg v17597 9 mg/kg 18.700 2,3 N/A N/A v21252 9 mg/kg 17.400 2,2 13.900 1,8 v21252 12 37.400 4,6 20.600 2,7 mg/kg nº em comparação com v17597 em 4,5 mg/kg Conclusões
[00386] Os análogos de auristatina de Fórmula geral (I) mostraram ter boa tolerabilidade in vivo quando administrados a camundongos. A conjugação do Composto 9 com o anticorpo monoespecífico anti-HER2 trastuzumabe em um DAR4 médio produziu um ADC que mostrou excelente tolerabilidade em macacos cynomolgus com uma dose não severamente tóxica mais alta (HNSTD) de 18 mg/kg. Em contraste, o ADC que compreende o Composto 9 conjugado com um anticorpo biparatópico anti-HER2, v10000, em uma DAR4 média (v17597) mostrou tolerabilidade muito diminuída com um HNSTD de menos de 4,5 mg/kg (Exemplo 8). Sem estar limitado a qualquer teoria particular, é proposto que a diminuição da tolerabilidade observada para v17597 pode ser devido em parte ao aumento da ligação no alvo e internalização do anticorpo biparatópico em comparação com o trastuzumabe monoespecífico, levando ao aumento da toxicidade no alvo, e/ou uma proporção diminuída de DAR0 ou espécies nudes em DAR4 média (v17597) em comparação com DAR2 média (v21252) que aumenta a toxicidade associada a espécies DAR superiores (DAR2, DAR4 e DAR6), e/ou proporção aumentada de espécies DAR6 em DAR4 média em comparação com DAR2 média aumentando a toxicidade associada às espécies DAR mais altas.
[00387] Surpreendentemente, no entanto, o ADC compreendendo o Composto 9 conjugado com v10000 em uma DAR2 média (v21252) mostrou tolerabilidade muito melhorada com um HNSTD de 12 mg/kg (Exemplo 9). Este resultado é inesperado, pois foi demonstrado anteriormente que a toxicidade dos ADCs compreendendo monometil auristatina E (MMAE) ou um maitansinoide se correlaciona diretamente com a quantidade total de droga ligada ao anticorpo, ou seja , a relação entre DAR e a dose máxima tolerada é linear para ADCs (Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063-7070 (2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371- 81 (2017)). Especificamente, a dose máxima tolerada de um ADC com 8 moléculas de droga por anticorpo foi de 50 mg/kg, e a dose máxima tolerada de um ADC com 4 moléculas de droga por anticorpo (ou seja , metade da quantidade de toxina) foi de 100 mg/kg (Hamblett, et al., ibid.). Ou seja, um ADC com metade da quantidade de toxina do ADC de DAR8, quando administrado na mesma dose de anticorpo, apresentou um MTD que era o dobro do ADC de DAR8.
[00388] v21252 tem uma DAR de 2 e, portanto, metade da quantidade de toxina de v17597 quando administrado na mesma dose de anticorpo. Com base em estudos anteriores com v17597, portanto, esperava-se que a quantidade de v21252 tolerada fosse inferior a 9 mg/kg (ou seja , 2x a dose máxima tolerada para v17597). No entanto, como mostrado no Exemplo 9, v21252 administrado a macacos cynomolgus em doses de 9 ou 12 mg/kg a cada duas semanas para três doses foi tolerado e 12 mg/kg foi designado como um nível de evento adverso não observado (NOAEL).
[00389] É importante notar que v21252 tem menos toxicidade e mais tolerabilidade em comparação com v17597 quando dosado duas vezes por semana, embora tenha maior exposição.Com base no estudo de toxicologia não- GLP em macacos cynomolgus (Exemplo 8), v17597 foi considerado como tendo resultados adversos em ambas as doses bi-semanais de 4,5 e 9 mg/kg.No entanto, em um estudo não-GLP semelhante (Exemplo 9), v21252 não foi considerado como tendo resultados adversos em doses quinzenais de 9 mg/kg e 12 mg/kg, apesar de ter aumentos de exposição de aproximadamente 1,8 a 4,6 vezes (AUC 0-336hr após a primeira dose ou última dose AUC0-168hr) em comparação com 4,5 mg/kg de v17597 (resumido nas Tabelas 19 e 20).
[00390] Além disso, o v21252 demonstrou eficácia in vivo em níveis de exposição tolerados em macacos cynomolgus. Especificamente, respostas completas foram alcançadas em modelos de xenoenxerto derivados de pacientes de tumores de alto HER2 e baixo HER2 em exposições toleradas em macacos cynomolgus, conforme resumido na Figura 15 (ver também, Exemplo 6). EXEMPLO 10: ESTUDO DE TOXICIDADE GLP DE v21252 EM MACACOS
CYNOMOLGUS
[00391] Num estudo de toxicidade GLP subsequente, o v21252 foi administrado a macacos cynomolgus a cada duas semanas a 0, 6, 12 e 18 mg/kg para 4 doses, com um período de recuperação de 6 semanas. A dose não gravemente tóxica mais elevada (HNSTD) foi determinada como sendo 18 mg/kg. O v21252 foi bem tolerado em todas as doses. Nenhuma observação clínica foi considerada adversa e nenhuma mortalidade foi observada neste estudo de GLP.A única observação clínica consistente foi aumento da diarreia.Nenhuma mudança no peso corporal foi observada em todas as doses e nenhum achado de patologia clínica (função hepática - aspartato transaminase e alanina transaminase e hematologia - neutrófilos, plaquetas, hemoglobina e linfócitos) foi considerado adverso.A exposição (Cmax e AUC0-168hr) de v21252 foi virtualmente idêntica à de v10000 (anticorpo sozinho).Os detalhes do estudo são fornecidos abaixo.
[00392] O objetivo deste estudo de GLP foi caracterizar ainda mais a toxicocinética e a toxicidade de v21252 administrado 4 vezes por via intravenosa a macacos cynomolgus.
[00393] No estudo de toxicidade de GLP, o v21252 foi administrado a macacos cynomolgus machos e fêmeas nos Dias 1, 15, 29 e 43 nas doses de 0, 6, 12 e 18 mg/kg, com um período de recuperação de 6 semanas. O nível de eventos adversos não observados (NOAEL) foi de 12 mg/kg e a dose não gravemente tóxica mais elevada (HNSTD) foi de 18 mg/kg. Materiais e Métodos
[00394] Neste estudo, o veículo ou v21252 foi administrado a macacos cynomolgus machos e fêmeas por uma infusão IV de 1 hora uma vez a cada duas semanas nos Dias 1, 15, 29 e 43 em doses de 0, 6, 12 e 18 mg/kg (4 animais por sexo em cada nível de dose e 2 animais adicionais por sexo a 0, 12 e 18 mg/kg para avaliação de recuperação). Todos os animais foram avaliados quanto a alterações nos sinais clínicos, consumo de alimentos, peso corporal, pressão sanguínea, ECGs, taxas de respiração (visual), patologia clínica (hematologia, química clínica, coagulação, análise de urina), pesos de órgãos e exame macroscópico/microscópico de tecidos. O sangue foi coletado para análise de toxicocinética (TK) (v21252, anticorpo total e toxina livre (Composto 9)) e análise de anticorpo anti-droga (ADA), e os animais foram sacrificados no Dia 50 e após 6 semanas de recuperação no Dia 92. O projeto do estudo é apresentado na Tabela
21. Tabela 21: Projeto de Estudo de Toxicidade de GLP Animais Sacrificados no Dia Dose v21252 Grupo (macho/fêmea) (mg/kg) D50 D92 1 0 4/4 2/2 2 6 4/4 -- 3 12 4/4 2/2 4 18 4/4 2/2 Resultados Farmacocinética
[00395] v21252: As concentrações séricas de pico médio de v21252 foram observadas por 1 hora após o início da infusão (SOI) nos Dias 1 e 43. Após a administração quinzenal de v21252, os valores médios de Cmax e AUC para v21252 aumentaram com o aumento da dose. Os aumentos na Cmax foram aproximadamente proporcionais à dose no Dia 1. No Dia 1, um aumento de 1:2:3 vezes na dose de v21252 resultou em um aumento aproximado de 1:2,3:3,3 vezes nos valores Cmax, um aumento aproximado de 1:2,6:3,8 vezes aumento nos valores médios de AUC0-168hr e um aumento aproximado de 1:2,9:4,5 vezes nos valores de AUC0-336hr . No Dia 43, a Cmax e o AUC0-168hr foram aproximadamente proporcionais à dose. No Dia 43, um aumento de 1:2:3 vezes na dose de v21252 resultou em um aumento aproximado de 1:2,5:3,5 vezes nos valores de C max e um aumento aproximado de 1:3,2:4,7 vezes nos valores de AUC0-168hr . A exposição sistêmica ao v21252 não pareceu mudar após repetidas infusões IV bissemanais de 6 mg/kg, no entanto, a exposição geralmente pareceu aumentar após repetidas infusões IV bissemanais de 12 e 18 mg/kg. As razões médias de acumulação de AUC 0-168hr foram de 1,20, 1,47 e 1,50 a 6, 12 e 18 mg/kg, respectivamente. As razões de acumulação de AUC0-168hr individuais variaram de 1,01 a 1,64 a 6 mg/kg, de 1,17 a 1,95 a 12 mg/kg e de 0,983 a 2,08 a 18 mg/kg.
[00396] Anticorpo total (conjugado e não conjugado): As concentrações séricas de anticorpo total de pico médio foram observadas durante 1 hora após o SOI de v21252 nos dias 1 e 43. Após a administração quinzenal de v21252, os valores médios de Cmax e AUC0-168hr para o Anticorpo Total aumentaram com o aumento da dose. No Dia 1, um aumento de 1:2:3 vezes na dose de v21252 resultou em um aumento aproximado de 1:2,1:3,3 vezes nos valores de Cmax , um aumento aproximado de 1:2,4:3,8 vezes nos valores de AUC 0-168hr e um aumento aproximado de 1:2,8:4,5 vezes nos valores médios de AUC0-336hr . No Dia 43, um aumento de 1:2:3 vezes na dose de v21252 resultou em um aumento aproximado de 1: 2,6: 3,9 vezes nos valores de Cmax e em um aumento aproximado de 1:3,1:4,8 vezes nos valores de AUC0-168hr . A exposição sistêmica ao Anticorpo Total não pareceu mudar após repetidas infusões IV bissemanais de v21252 a 6 mg/kg, mas pareceu aumentar após repetidas infusões IV bissemanais de v21252 a 12 e 18 mg/kg. As razões médias de acumulação de AUC0-168hr foram de 1,20, 1,47 e 1,50 a 6, 12 e 18 mg/kg, respectivamente.
[00397] Toxina (Composto 9): A toxina livre foi medida após as administrações repetidas de v21252. A maioria das concentrações séricas de toxina (Composto 9) estavam abaixo do limite de quantificação (< 0,500 ng/mL). As seguintes exceções foram observadas: uma fêmea com 12 mg/kg no Dia 43 tinha uma única concentração de toxina quantificável (Composto 9) (0,513 ng/ml 72 horas após a dose); um macho com 18 mg/kg no Dia 29 tinha uma única concentração de toxina quantificável (Composto 9) (0,532 ng/mL em 1 hora após o SOI); dois machos e duas fêmeas a 18 mg/kg no Dia 43 cada um tinha uma única concentração de toxina quantificável (Composto 9) (0,555, 0,505, 0,556 e 0,653 ng/mL, respectivamente, 24 horas após o SOI); e um macho com 18 mg/kg no Dia
43 tinha quatro concentrações consecutivas de toxina quantificável (Composto 9) com um valor de AUC0-168hr de 125 hr* ng/mL.
[00398] Anticorpos antidrogas (ADA): Um total de 144 amostras de todas as coortes de dosagem foram triadas para ADA. Sete amostras foram confirmadas como positivas no ensaio de confirmação/imunodepleção, incluindo um animal de controle e uma amostra de pré-teste de um animal tratado. Estas duas últimas amostras foram consideradas devidas a anticorpos reativos pré-existentes e não relacionadas à exposição a v21252. Para as cinco amostras positivas restantes, uma fêmea administrada com 18 mg/kg teve um título detectável no Dia 43, e os 4 animais restantes (2 fêmeas administradas com 12 mg/kg e um macho e uma fêmea administrada com 18 mg/kg) tinha títulos detectáveis no ponto de recuperação do Dia 92. Embora os resultados reais do anticorpo anti-v21252 não sugiram uma forte resposta imunogênica na maioria dos animais, o v21252 circulante pode estar se ligando aos anticorpos anti-v21252, limitando a detecção dos anticorpos neste formato de ensaio. No entanto, é improvável que o ADA tenha impactado significativamente a PK de v21252, uma vez que nenhuma alteração nos dados de tempo de concentração sérica foi observada no Dia 43 de dosagem em comparação com o Dia 1 de dosagem. Toxicidade
[00399] A administração de doses repetidas de v21252 (em semanas alternadas x4) foi geralmente bem tolerada. Não houve mortes relacionadas ao v21252 e nenhum efeito observado nas avaliações oftálmica e eletrocardiográfica, taxas de respiração visual, análise de urina ou avaliações de troponina I. Não houve alterações relacionadas ao v21252 nos parâmetros de peso corporal observados durante o tratamento ou períodos de recuperação após a administração de v21252.
[00400] O aumento da incidência de fezes moles/aquosas foi observado em animais aos quais foram administradas doses repetidas de v21252 com ≥ 6 mg/kg. Além disso, a inapetência esporádica foi observada em animais machos e fêmeas com 18 mg/kg e postura arqueada foi observada esporadicamente em animais fêmeas com 18 mg/kg. Após o período de recuperação, a inapetência e a postura arqueada estavam ausentes, enquanto a incidência de fezes moles/aquosas diminuiu ou remeteu, sugerindo reversão dos efeitos relacionados ao v21252.
Durante o estudo, os animais receberam suplemento nutricional/líquido (dieta de Gatorade e PeptoPro® congelada) devido a observações repetidas de fezes moles/líquidas. As mulheres que receberam administração repetida de v21252 receberam fluidos e/ou suplementação nutricional desde o dia 4 (6 e 18 mg/kg) ou dia 8 (12 mg/kg) até o final do período de tratamento. Da mesma forma, os machos que receberam administração repetida de v21252 receberam fluido e/ou suplementação nutricional desde o Dia 8 (12 mg/kg) ou Dia 7 (18 mg/kg) até o final do período de tratamento. Nenhum líquido ou suplementação foi fornecido durante a recuperação.
[00401] Os achados patológicos clínicos não foram considerados adversos devido à gravidade limitada e à reversibilidade dos achados. As alterações hematológicas relacionadas ao artigo de teste incluíram: aumento na contagem de monócitos, alterações morfológicas em neutrófilos, diminuição na contagem de reticulócitos e massa de glóbulos vermelhos (RBC, hemoglobina e hematócrito) com aumento concomitante na largura de distribuição de glóbulos vermelhos. Houve aumentos mínimos a leves nas concentrações médias de fibrinogênio em relação às médias basais nos dias 8 a 50 em machos com 18 mg/kg e em fêmeas com ≥ 12 mg/kg. Essas alterações foram relacionadas ao artigo de teste e indicativas de um estímulo imunológico ou inflamatório. Essas mudanças foram resolvidas no Dia 92. Alterações relacionadas ao tratamento foram observadas em AST, fósforo, proteína total, albumina, globulina e citrulina.
[00402] As Tabelas 22-25 mostram uma comparação dos resultados dos estudos de dose repetida não GLP para v17597 e v21252 e o estudo GLP para v21252. Tabela 22: Comparação da mortalidade observada em estudos de dose repetida em semanas alternadas para v17597 e v21252 em macacos Cynomolgus v17597 - DAR 4 v21252 - DAR 2 Dose Mortalidade/ Dose Mortalidade/ Dose Animais Totais cumulativa de Animais Totais cumulativ toxina antes da a de mortalidade toxina 18 mg/kg -- -- 0/12 1,44 mg/kg 12 mg/kg -- -- 0/6 0,72 mg/kg 0/12 0,96 mg/kg 9 mg/kg 3/6 0,36 mg/kg 0/6 0,54 mg/kg 6 mg/kg -- -- 0/12 0,48 mg/kg 4,5 mg/kg 1/6 0,36 mg/kg -- -- Tabela 23: Comparação de NOAEL e HNSTD determinado em estudos de dose repetida em semanas alternadas para v17597 e v21252 em macacos Cynomolgus v17597 - DAR 4 v21252 - DAR 2 (Dose cumulativa de toxina) (Dose cumulativa de toxina) NOAEL Não foi possível determinar <4,5 12 mg/kg mg/kg (0,96 mg/kg) (<0,54 mg/kg) HNSTD Não foi possível determinar <4,5 18 mg/kg mg/kg (1,44 mg/kg) (<0,54 mg/kg) Tabela 24: Comparação de parâmetros de ADC PK para v17597 DAR4 e v21252 DAR2 (dose de toxina correspondente) Dose Droga (Dose) AUC0-336hr Diferença Meia-vida Diferença Toxina Primeira de dobra# primeira dose de dobra# dose (Horas) (hr*ug/mL) 0,18 DAR4 de 9.920 1 39 1 mg/kg v17597 (4,5 mg/kg) DAR2 de 18.800 1,9 85.6 2,2 v21252 (9 mg/kg)
0,36 DAR4 de 24.600 1 103 1 mg/kg v17597 (9 mg/kg) DAR2 de 49.800 2,0 179 1,7 v21252 (18 mg/kg) nº em comparação a v17597 DAR4 em 4,5 e 9 mg/kg Tabela 25: Comparação de parâmetros de Anticorpo Total PK para DAR4 de v17597 e DAR2 de v21252 (dose de toxina correspondente) Dose Droga (Dose) AUC0-336 Diferença Difere Toxina Primeira de Vezes Primeira dose nça de dose da Dose de meia-vida Vezesn (hr*ug/mL) (horas) º 0,18 DAR 4 de 8.090 1 37,3 1 mg/kg v17597 (4,5 mg/kg) DAR2 de 17.400 2,2 67,4 1,8 v21252 (9 mg/kg) 0,36 DAR4 de 18.700 1 81,9 1 mg/kg v17597 (9 mg/kg) DAR2 de 50.300 2,7 155 1,9 v21252 (18 mg/kg) nº em compação com v17597 a 4,5 e 9 mg/kg Conclusões
[00403] A maior dose tóxica não grave (HNSTD) de v21252 foi determinada como sendo 18 mg/kg. O v21252 foi bem tolerado em todas as doses. Nenhuma observação clínica foi considerada adversa e nenhuma mortalidade foi observada neste estudo de GLP.A única observação clínica consistente foi aumento da diarreia.Nenhuma mudança no peso corporal foi observada em todas as doses e nenhum achado de patologia clínica (função hepática - aspartato transaminase e alanina transaminase e hematologia - neutrófilos, plaquetas, hemoglobina e linfócitos) foi considerado adverso.Estes resultados de toxicologia de GLP suportam a dosagem clínica acima das doses eficazes previstas em humanos.
[00404] Surpreendentemente, o ADC compreendendo o Composto 9 conjugado com v10000 em uma DAR2 média (v21252) mostrou tolerabilidade melhorada em comparação com um ADC com uma DAR4 média (v17597) com um HNSTD de 18 mg/kg. Este resultado é inesperado, pois foi demonstrado anteriormente que a toxina do Composto 9 conjugada com v10000 em uma DAR4 médio (v17597) quando administrada em uma dose de toxina de 0,36 mg/kg estava associada com mortalidade tanto quando administrada de forma aguda (com uma dose única de 9 mg/kg) ou subcronicamente (com duas doses de 4,5 mg/kg separadas por duas semanas) (Exemplo 8). Em contraste, quando v21252 (DAR2) foi administrado na dose de 0,36 mg/kg de toxina (Composto 9) para quatro doses (uma dose de toxina cumulativa de 1,44 mg/kg), não houve mortalidade e toxicidade substancialmente reduzida em comparação com v17597. Por exemplo, v21252 administrado a uma dose cumulativa de 0,96 mg/kg de toxina (Composto 9) foi associado a nenhum resultado adverso e foi designado como um nível de evento adverso não observado (NOAEL). Além disso, a dose cumulativa de 1,44 mg/kg de toxina (Composto 9) foi administrada com 18 mg/kg de v21252 ao longo de 4 doses e foi tolerada. Esta é uma dose quatro vezes maior do que a dose de v17597 que foi associada à mortalidade (0,36 mg/kg).
[00405] É importante ressaltar que v21252 tem menos toxicidade e mais tolerabilidade em comparação com v17597 quando administrado a cada duas semanas, embora tenha aproximadamente duas vezes maior exposição (AUC0-336hr após a primeira dose) e meia-vida duas vezes maior após a primeira dose quando comparado com a toxina correspondentes a doses (4,5 mg/kg de v17597 v. 9 mg/kg de v21252 e 9 mg/kg de v17597 v. 18 mg/kg de v21252) (resumido nas Tabelas 24 e 25). EXEMPLO 11: v21252 INIBE O CRESCIMENTO IN VIVO DE XENOENXERTO DERIVADO DE BAIXO HER2 DE PACIENTE
[00406] LTL-654 foi derivado de uma metástase de paciente com carcinoma seroso do ovário e foi classificado por imuno-histoquímica (IHQ) como HER2 negativo. Uma biópsia anterior foi classificada por IHC como HER2 equívoca.
[00407] Camundongos fêmeas NOD Rag gama (NRG) foram implantados por via subcutânea através da cápsula renal com dois fragmentos de tumor LTL- 654, aproximadamente 15 mm3 cada. Os animais foram atribuídos aleatoriamente a um dos dois grupos de tratamento cegos de seis animais cada quando os volumes médios do tumor atingiram 70,3-77,8 mm3.
[00408] Os animais foram tratados com veículo ou 3 mg/kg de v21252 administrados por via intravenosa uma vez por semana para quatro injeções totais (qwx4) (Tabela 21). O tamanho do tumor foi medido usando um sistema de imagem Vevo®3100 (FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Canadá) usando o modo tridimensional (3D). Várias imagens (70 a 100 por tumor) em todo o tumor foram registradas e analisadas usando o software Vevo® LAB v2.1.0 (FUJIFILM VisualSonics, Inc.). O tamanho do tumor foi medido uma vez por semana após a randomização até o Dia 24. Os camundongos foram sacrificados eticamente quando os tumores atingiram um tamanho de 1500 mm 3. Os volumes do tumor são relatados como a média + SEM para cada grupo.
[00409] A Figura 16 fornece os resultados para a resposta do tumor em camundongos implantados subcutaneamente com fragmentos de tumor de LTL- 654 após administração iv de veículo ou v21252, que demonstra que o tratamento de camundongos enxertados com LTL-654 com v21252 inibiu a taxa de crescimento dos xenoenxertos de tumor de LTL-654.
[00410] Este exemplo demonstra que v21252 é eficaz em um xenoenxerto derivado de paciente no qual a expressão de HER2 é suficientemente baixa para ser classificado por IHC como HER2 negativo. Tabela 21: Projeto de estudo modelo PDX de câncer de ovário LTL-654 Artigo de Dose Via de Dias de administração Animais Teste (mg/kg) Administração por grupo Veículo N/A IV 0, 7, 14, 21 6 v21252 3 IV 0, 7, 14, 21 6 N/A = Não aplicável EXEMPLO 12: v21252 PROLONGA A SOBREVIVÊNCIA DE
CAMUNDONGOS COM TUMORES DE MAMA HUMANOS IMPLANTADOS INTRACRANIALMENTE IN VIVO
[00411] Os construtos usados neste exemplo foram: conjugado de controle (anticorpo humanizado contra vírus sincicial respiratório conjugado a Toxina Ligante 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR3.5) e v24029 (trastuzumabe conjugado em DAR8 a uma topoisomerase derivada de exatecan Inibidor I (DXd)). Os tumores de mama humanos BT-474 implantados intracranialmente utilizados neste exemplo servem como um modelo de metástase cerebral de câncer de mama HER2 positivo.
[00412] Camundongos fêmeas Balb/c Nude (CByJ.Cg-Foxn1nu/J) foram irradiados com uma -fonte (2 Gy, 60Co, BioMep, Bretenières, França). Camundongos anestesiados foram injetados estereotaticamente com 1x105 células BT-474 em 2 microlitros de meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento e, começando no dia 8, foram administrados por via intravenosa com veículo, conjugado de controle, v21252, v7155 ou v24029 a 6 mg/kg todas as semanas para um total de doze injeções (Tabela 26). Os pesos corporais foram registrados duas vezes por semana até o dia 18 e, a seguir, diariamente. Os camundongos foram sacrificados eticamente quando a perda de peso corporal atingiu ou excedeu 20% por 3 dias consecutivos.
[00413] A Figura 17 fornece os resultados de sobrevivência para camundongos implantados intracranialmente com células tumorais BT-474 após administração iv de veículo, conjugado de controle, v21252, v7155 ou v24029.
[00414] Duas coortes adicionais de animais implantados intracranialmente com células BT-474 também foram randomizadas em grupos de tratamento e, a partir do dia 8, foram administradas por via intravenosa com v21252 ou v24029 a 6 mg/kg a cada duas semanas para seis injeções no total. Os pesos corporais foram registrados duas vezes por semana até o dia 18 e, a seguir, diariamente. Os camundongos foram sacrificados eticamente quando a perda de peso corporal atingiu ou excedeu 20% por 3 dias consecutivos.
[00415] A Figura 18 fornece os resultados de sobrevivência para camundongos implantados intracranialmente com células tumorais BT-474 após administração iv semanal (qw) de veículo, conjugado de controle ou v7155, ou administração iv a cada duas semanas (q2w) de v21252 ou v24029.
[00416] Este exemplo demonstra que v21252 é eficaz em prolongar a sobrevivência de camundongos implantados intracranialmente com células de tumor de mama BT-474. Tabela 26: Projeto de estudo modelo de câncer de mama humano BT- 474 implantado por via intracraniana Artigo de Dose Via de Dias de administração Animais Teste (mg/kg) Administração por grupo Veículo N/A IV 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 7 71, 78, 85 v21252 6 IV 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 7 71, 78, 85 v7155 6 IV 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 7 71, 78, 85 v24029 6 IV 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 7 71, 78, 85 Conjugado 6 IV 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 7 de controle 71, 78, 85 N/A = Não aplicável
[00417] As divulgações de todas as patentes, pedidos de patente, publicações e entradas de banco de dados referenciadas neste relatório descritivo são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade na mesma extensão como se cada patente individual, pedido de patente, publicação e entrada de banco de dados fossem especificamente e individualmente indicados para ser incorporado por referência.
[00418] As modificações das modalidades específicas descritas neste documento, que seriam evidentes para os versados na técnica, destinam-se a ser incluídas no escopo das reivindicações seguintes.
TABELA DE SEQUÊNCIA S Tabela A: números de clones para variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 e v6717 Variante clone H1 nº clone H2 nº clone L1 nº clone L2 nº
5019 3057 720 1811 -- 5020 719 3041 -- 1811 7091 3057 5244 1811 -- 10000 6586 5244 3382 -- 6903 5065 3468 5037 3904 6902 5065 3468 5034 3904 6717 3317 720 -- -- Tabela B: Sequência para variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 e v6717 por número do clone SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e 3 3468 Compl EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD eta WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT
LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF YFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKGYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLKSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 4 3468 Compl GAAGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTG eta GTGCAGCCAGGAGGGTCCCTGCGCCTGTCTTGC
GCCGCTAGTGGCTTCACTTTTACCGACTACACCA TGGATTGGGTGCGACAGGCACCTGGAAAGGGCC TGGAGTGGGTCGCCGATGTGAACCCAAATAGCG GAGGCTCCATCTACAACCAGCGGTTCAAGGGCC
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GGTTCACCCTGTCAGTGGACCGGAGCAAAAACA CCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGAGCCGA AGATACTGCTGTGTACTATTGCGCCCGGAATCTG GGGCCCTCCTTCTACTTTGACTATTGGGGGCAGG GAACTCTGGTCACCGTGAGCTCCGCCTCCACCAA GGGACCTTCTGTGTTCCCACTGGCTCCCTCTAGT AAATCCACATCTGGGGGAACTGCAGCCCTGGGC TGTCTGGTGAAGGGCTACTTCCCAGAGCCCGTCA CAGTGTCTTGGAACAGTGGCGCTCTGACTTCTGG GGTCCACACCTTTCCTGCAGTGCTGAAGTCAAGC GGGCTGTACAGCCTGTCCTCTGTGGTCACCGTG CCAAGTTCAAGCCTGGGAACACAGACTTATATCT GCAACGTGAATCACAAGCCATCCAATACAAAAGT CGACAAGAAAGTGGAACCCAAGTCTTGTGATAAA ACCCATACATGCCCCCCTTGTCCTGCACCAGAGC TGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACC CAAGCCTAAAGATACACTGATGATTAGTAGGACC CCAGAAGTCACATGCGTGGTCGTGGACGTGAGC CACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTTAACTGGTACG TGGACGGCGTCGAGGTGCATAATGCCAAGACTA AACCCAGGGAGGAACAGTACAACAGTACCTATCG CGTCGTGTCAGTCCTGACAGTGCTGCATCAGGAT TGGCTGAACGGGAAAGAGTATAAGTGCAAAGTGA GCAATAAGGCTCTGCCCGCACCTATCGAGAAAAC AATTTCCAAGGCAAAAGGACAGCCTAGAGAACCA CAGGTGTACGTGCTGCCTCCATCAAGGGATGAG CTGACAAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGTCTGG TGAAAGGATTCTATCCCTCTGACATTGCTGTGGA
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GTGGGAAAGTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTAC CTGACCTGGCCCCCTGTGCTGGACTCAGATGGC AGCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTCGACA AATCCCGGTGGCAGCAGGGGAATGTGTTTAGTTG TTCAGTCATGCACGAGGCACTGCACAACCATTAC
ACCCAGAAGTCACTGTCACTGTCACCAGGG 5 3468 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD
WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF
YFDYWGQGTLVTVSS 6 3468 H1 GFTFTDYT , 3057 , 3041 , 3317 7 3468 H3 ARNLGPSFYFDY , 3057 , 3041 , 3317 8 3468 H2 VNPNSGGS , 3057 ,
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e 3041 , 3317 9 1811 Compl DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY eta QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C 10 1811 Compl GATATTCAGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGA eta GTGCCTCAGTGGGCGACCGAGTCACCATCACAT
GCAAGGCTTCCCAGGATGTGTCTATTGGAGTCGC ATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCCAA GCTGCTGATCTATAGCGCCTCCTACCGGTATACC GGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCAGTGGGTCA GGAACAGACTTTACTCTGACCATCTCTAGTCTGC AGCCTGAGGATTTCGCTACCTACTATTGCCAGCA GTACTATATCTACCCATATACCTTTGGCCAGGGG ACAAAAGTGGAGATCAAGAGGACTGTGGCCGCT CCCTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACA GCTGAAAAGTGGCACAGCCAGCGTGGTCTGTCT GCTGAACAATTTCTACCCTCGCGAAGCCAAAGTG CAGTGGAAGGTCGATAACGCTCTGCAGAGCGGC AACAGCCAGGAGTCTGTGACTGAACAGGACAGTA AAGATTCAACCTATAGCCTGTCAAGCACACTGAC TCTGAGCAAGGCAGACTACGAGAAGCACAAAGT GTATGCCTGCGAAGTCACACATCAGGGGCTGTC
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
CTCTCCTGTGACTAAGAGCTTTAACAGAGGAGAG
TGT 11 1811 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY
QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK 12 1811 L1 QDVSIG , 3904 , 3317 13 1811 L3 QQYYIYPYT , 3904 , 3317 14 1811 L2 SAS , 3904 , 3317 15 5034 Compl DYKDDDDKDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ eta DVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRF
SGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDERLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC 16 5034 Compl GACTACAAAGACGACGATGACAAAGATATCCAGA
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e eta TGACCCAGTCCCCTAGCTCCCTGTCCGCTTCTGT
GGGCGATAGGGTCACTATTACCTGCCGCGCATCT CAGGACGTGAACACCGCAGTCGCCTGGTACCAG CAGAAGCCTGGGAAAGCTCCAAAGCTGCTGATCT ACAGTGCATCATTCCTGTATTCAGGAGTGCCCAG CCGGTTTAGCGGCAGCAGATCTGGCACCGATTTC ACACTGACTATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGACT TTGCCACATACTATTGCCAGCAGCACTATACCAC ACCCCCTACTTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGA GATCAAGCGAACTGTGGCCGCTCCAAGTGTCTTC ATTTTTCCACCCAGCGATGAAAGACTGAAGTCCG GCACAGCTTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTT TTACCCCAGAGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGT CGACAACGCTCTGCAGAGTGGCAACAGCCAGGA GAGCGTGACAGAACAGGATTCCAAAGACTCTACT TATAGTCTGTCAAGCACCCTGACACTGAGCAAGG CAGACTACGAAAAGCATAAAGTGTATGCCTGTGA GGTCACACATCAGGGGCTGTCATCACCAGTCACC
AAATCATTCAATCGGGGGGAGTGC 17 5034 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW
YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK 18 5037 Compl DYKDDDDKDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ eta DVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRF
SGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDERLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSKESVTEQDS KDSTYSLSSRLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
PVTKSFNRGEC 19 5037 Compl GACTACAAAGACGACGATGACAAAGATATCCAGA eta TGACCCAGTCCCCTAGCTCCCTGTCCGCTTCTGT
GGGCGATAGGGTCACTATTACCTGCCGCGCATCT CAGGACGTGAACACCGCAGTCGCCTGGTACCAG CAGAAGCCTGGGAAAGCTCCAAAGCTGCTGATCT ACAGTGCATCATTCCTGTATTCAGGAGTGCCCAG CCGGTTTAGCGGCAGCAGATCTGGCACCGATTTC ACACTGACTATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGACT TTGCCACATACTATTGCCAGCAGCACTATACCAC ACCCCCTACTTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGA GATCAAGCGAACTGTGGCCGCTCCAAGTGTCTTC ATTTTTCCACCCAGCGATGAAAGACTGAAGTCCG GCACAGCTTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTT TTACCCCAGAGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGT CGACAACGCTCTGCAGAGTGGCAACAGCAAGGA GAGCGTGACAGAACAGGATTCCAAAGACTCTACT TATAGTCTGTCAAGCAGACTGACACTGAGCAAGG CAGACTACGAAAAGCATAAAGTGTATGCCTGTGA GGTCACACATCAGGGGCTGTCATCACCAGTCACC
AAATCATTCAATCGGGGGGAGTGC 20 5037 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW
YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK 21 5037 L1 QDVNTA 22 5037 L3 QQHYTTPPT 23 5037 L2 SAS 24 3382 Compl DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e eta QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPATFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C 25 3382 Compl GATATTCAGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGA eta GTGCCTCAGTGGGCGACCGAGTCACCATCACAT
GCAAGGCTTCCCAGGATGTGTCTATTGGAGTCGC ATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCCAA GCTGCTGATCTATAGCGCCTCCTACCGGTATACC GGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCAGTGGGTCA GGAACAGACTTTACTCTGACCATCTCTAGTCTGC AGCCTGAGGATTTCGCTACCTACTATTGCCAGCA GTACTATATCTACCCAGCCACCTTTGGCCAGGGG ACAAAAGTGGAGATCAAGAGGACTGTGGCCGCT CCCTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACA GCTGAAAAGTGGCACAGCCAGCGTGGTCTGTCT GCTGAACAATTTCTACCCTCGCGAAGCCAAAGTG CAGTGGAAGGTCGATAACGCTCTGCAGAGCGGC AACAGCCAGGAGTCTGTGACTGAACAGGACAGTA AAGATTCAACCTATAGCCTGTCAAGCACACTGAC TCTGAGCAAGGCAGACTACGAGAAGCACAAAGT GTATGCCTGCGAAGTCACACATCAGGGGCTGTC CTCTCCTGTGACTAAGAGCTTTAACAGAGGAGAG
TGT 26 3382 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY
QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPATFGQGTKVEIK 27 3382 L1 QDVSIG 28 3382 L3 QQYYIYPAT 29 3382 L2 SAS 30 5065 Compl EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIH eta WVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI
SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF YAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCEVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 31 5065 Compl GAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGAGGAGGACTG eta GTGCAGCCAGGAGGGTCACTGCGACTGAGCTGC
GCAGCTTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACA TTCACTGGGTCCGCCAGGCTCCTGGAAAAGGCC TGGAGTGGGTGGCACGAATCTATCCAACTAATGG ATACACCCGGTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCG GTTCACCATTTCTGCAGATACAAGTAAAAACACTG CCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCCGAAG ATACAGCCGTGTACTATTGCAGCCGATGGGGAG GCGACGGCTTCTACGCTATGGATTATTGGGGGCA GGGAACCCTGGTCACAGTGAGCTCCGCATCAAC
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
AAAGGGGCCTAGCGTGTTTCCACTGGCCCCCTCT AGTAAATCCACCTCTGGGGGAACAGCAGCCCTG GGATGTGAGGTGACCGACTACTTCCCAGAGCCC GTCACTGTGAGCTGGAACTCCGGCGCCCTGACA TCTGGGGTCCATACTTTTCCTGCTGTGCTGCAGT CAAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCTCTGTGGTCAC TGTGCCAAGTTCAAGCCTGGGGACTCAGACCTAT ATCTGCAACGTGAATCACAAGCCATCCAATACCA AAGTCGACAAGAAAGTGGAACCCAAGTCTTGTGA TAAAACACATACTTGCCCCCCTTGTCCTGCACCA GAGCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTT CCACCCAAGCCTAAAGACACCCTGATGATTAGTA GGACTCCAGAAGTCACCTGCGTGGTCGTGGACG TGAGCCACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTCAACT GGTACGTGGATGGCGTCGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAACCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCAC TTATCGCGTCGTGTCTGTCCTGACCGTGCTGCAC CAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGC AAAGTGAGCAATAAGGCTCTGCCCGCACCTATCG AGAAAACAATTTCCAAGGCTAAAGGGCAGCCTAG AGAACCACAGGTGTACGTGTACCCTCCATCTAGG GACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGTCTGACAT GTCTGGTGAAAGGGTTCTATCCCAGCGATATCGC AGTGGAGTGGGAATCCAATGGACAGCCTGAGAA CAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCT GATGGAAGTTTCGCCCTGGTGAGTAAGCTGACC GTCGATAAATCACGGTGGCAGCAGGGCAACGTG TTCAGCTGTTCAGTGATGCACGAAGCACTGCACA
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
ACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGTCCCC
CGGC 32 5065 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIH
WVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF
YAMDYWGQGTLVTVSS 33 5065 H1 GFNIKDTY , 720, 719 34 5065 H3 SRWGGDGFYAMDY , 720, 719 35 5065 H2 IYPTNGYT , 720, 719 36 6586 Compl EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYTM eta DWVRQAPGKGLEWVGDVNPNSGGSIYNQRFKGR
FTFSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGP SFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
PQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 37 6586 Compl GAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGAGGGGGCCTG eta GTGCAGCCCGGAGGGTCTCTGCGACTGTCATGT
GCCGCTTCTGGGTTCACTTTCGCAGACTACACAA TGGATTGGGTGCGACAGGCCCCCGGAAAGGGAC TGGAGTGGGTGGGCGATGTCAACCCTAATTCTG GCGGGAGTATCTACAACCAGCGGTTCAAGGGGA GATTCACTTTTTCAGTGGACAGAAGCAAAAACAC CCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGA AGATACCGCTGTCTACTATTGCGCTCGCAATCTG GGCCCCAGTTTCTACTTTGACTATTGGGGGCAGG GAACCCTGGTGACAGTCAGCTCCGCTAGCACTAA GGGGCCTTCCGTGTTTCCACTGGCTCCCTCTAGT AAATCCACCTCTGGAGGCACAGCTGCACTGGGAT GTCTGGTGAAGGATTACTTCCCTGAACCAGTCAC AGTGAGTTGGAACTCAGGGGCTCTGACAAGTGG AGTCCATACTTTTCCCGCAGTGCTGCAGTCAAGC GGACTGTACTCCCTGTCCTCTGTGGTCACCGTGC CTAGTTCAAGCCTGGGCACCCAGACATATATCTG CAACGTGAATCACAAGCCATCAAATACAAAAGTC GACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGTGATAAAA CTCATACCTGCCCACCTTGTCCGGCGCCAGAACT GCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACC CAAGCCTAAAGACACCCTGATGATTTCCCGGACT CCTGAGGTCACCTGCGTGGTCGTGGACGTGTCT CACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTCAACTGGTAC
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GTGGATGGCGTCGAAGTGCATAATGCCAAGACC AAACCCCGGGAGGAACAGTACAACTCTACCTATA GAGTCGTGAGTGTCCTGACAGTGCTGCACCAGG ACTGGCTGAATGGGAAGGAGTATAAGTGTAAAGT GAGCAACAAAGCCCTGCCCGCCCCAATCGAAAA AACAATCTCTAAAGCAAAAGGACAGCCTCGCGAA CCACAGGTCTACGTCTACCCCCCATCAAGAGATG AACTGACAAAAAATCAGGTCTCTCTGACATGCCT GGTCAAAGGATTCTACCCTTCCGACATCGCCGTG GAGTGGGAAAGTAACGGCCAGCCCGAGAACAAT TACAAGACCACACCCCCTGTCCTGGACTCTGATG GGAGTTTCGCTCTGGTGTCAAAGCTGACCGTCGA TAAAAGCCGGTGGCAGCAGGGCAATGTGTTTAG CTGCTCCGTCATGCACGAAGCCCTGCACAATCAC
TACACACAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCTGGC 38 6586 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYTM
DWVRQAPGKGLEWVGDVNPNSGGSIYNQRFKGR FTFSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGP
SFYFDYWGQGTLVTVSS 39 6586 H1 GFTFADYT 40 6586 H3 ARNLGPSFYFDY 41 6586 H2 VNPNSGGS 42 3904 Compl YPYDVPDYATGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCK eta ASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYP YTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEELKSGTAS VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSEESVTE QDSKDSTYSLSSTLELSKADYEKHKVYACEVTHQG
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
LSSPVTKSFNRGEC 43 3904 Compl TATCCCTACGATGTGCCTGACTACGCTACTGGCT eta CCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCAAGCTCCCT
GAGTGCATCAGTGGGGGACCGAGTCACCATCAC ATGCAAGGCTTCCCAGGATGTGTCTATTGGAGTC GCATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCC AAGCTGCTGATCTACAGCGCCTCCTACCGGTATA CTGGGGTGCCTTCCAGATTCTCTGGCAGTGGGT CAGGAACCGACTTTACTCTGACCATCTCTAGTCT GCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAG CAGTACTATATCTACCCTTATACCTTTGGCCAGG GGACAAAAGTGGAGATCAAGAGGACAGTGGCCG CTCCAAGTGTCTTCATTTTTCCCCCTTCCGACGAA GAGCTGAAAAGTGGAACTGCTTCAGTGGTCTGTC TGCTGAACAATTTCTACCCCCGCGAAGCCAAAGT GCAGTGGAAGGTCGATAACGCTCTGCAGAGCGG CAATTCCGAGGAGTCTGTGACAGAACAGGACAGT AAAGATTCAACTTATAGCCTGTCAAGCACACTGG AGCTGTCTAAGGCAGACTACGAGAAGCACAAAGT GTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTC CTCTCCCGTGACAAAGAGCTTTAACAGAGGAGAG
TGT 44 3904 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY
QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK 45 719 Compl DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW eta YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQM NSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLV TVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTY PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDEDGSFALVSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 46 719 Compl GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGT eta CTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG
CCGGGCAAGTCAGGACGTTAACACCGCTGTAGC TTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAG CTCCTGATCTATTCTGCATCCTTTTTGTACAGTGG GGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTCGATCTGG GACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAA CCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGCA TTACACTACCCCACCCACTTTCGGCCAAGGGACC AAAGTGGAGATCAAAGGTGGTTCTGGTGGTGGTT CTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTG GTTCTGGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG GAGGCTTGGTACAGCCTGGCGGGTCCCTGAGAC TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAACATTAAAGAT ACTTATATCCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGA AGGGCCTGGAGTGGGTCGCACGTATTTATCCCA CAAATGGTTACACACGGTATGCGGACTCTGTGAA
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GGGCCGATTCACCATCTCCGCAGACACTTCCAAG AACACCGCGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAG CTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTTCAAGATG GGGCGGAGACGGTTTCTACGCTATGGACTACTG GGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC CGCCGAGCCCAAGAGCAGCGATAAGACCCACAC CTGCCCTCCCTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGG AGGACCTAGCGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCA AAAGACACTCTGATGATTTCCAGGACTCCCGAGG TGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGG ACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGG CGTGGAAGTGCATAATGCTAAGACAAAACCAAGA GAGGAACAGTACAACTCCACTTATCGCGTCGTGA GCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAAGTCAGTAATAA GGCCCTGCCTGCTCCAATCGAAAAAACCATCTCT AAGGCCAAAGGCCAGCCAAGGGAGCCCCAGGTG TACACATACCCACCCAGCAGAGACGAACTGACCA AGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAAGG CTTCTATCCTAGTGATATTGCTGTGGAGTGGGAA TCAAATGGACAGCCAGAGAACAATTACAAGACCA CACCTCCAGTGCTGGACGAGGATGGCAGCTTCG CCCTGGTGTCCAAGCTGACAGTGGATAAATCTCG ATGGCAGCAGGGGAACGTGTTTAGTTGTTCAGTG ATGCATGAAGCCCTGCACAATCATTACACTCAGA
AGAGCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAA 47 719 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW
YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK 48 719 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIH
WVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF
YAMDYWGQGTLVTVSS 49 720 Compl DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW eta YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQM NSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLV TVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLICLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENRYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 50 720 Compl GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGT eta CTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG
CCGGGCAAGTCAGGACGTTAACACCGCTGTAGC TTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAG CTCCTGATCTATTCTGCATCCTTTTTGTACAGTGG GGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTCGATCTGG GACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAA CCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGCA TTACACTACCCCACCCACTTTCGGCCAAGGGACC
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
AAAGTGGAGATCAAAGGTGGTTCTGGTGGTGGTT CTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTG GTTCTGGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG GAGGCTTGGTACAGCCTGGCGGGTCCCTGAGAC TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAACATTAAAGAT ACTTATATCCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGA AGGGCCTGGAGTGGGTCGCACGTATTTATCCCA CAAATGGTTACACACGGTATGCGGACTCTGTGAA GGGCCGATTCACCATCTCCGCAGACACTTCCAAG AACACCGCGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAG CTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTTCAAGATG GGGCGGAGACGGTTTCTACGCTATGGACTACTG GGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC CGCCGAGCCCAAGAGCAGCGATAAGACCCACAC CTGCCCTCCCTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGG AGGACCTAGCGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCA AAAGACACTCTGATGATTTCCAGGACTCCCGAGG TGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGG ACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGG CGTGGAAGTGCATAATGCTAAGACAAAACCAAGA GAGGAACAGTACAACTCCACTTATCGCGTCGTGA GCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAAGTCAGTAATAA GGCCCTGCCTGCTCCAATCGAAAAAACCATCTCT AAGGCCAAAGGCCAGCCAAGGGAGCCCCAGGTG TACACACTGCCACCCAGCAGAGACGAACTGACCA AGAACCAGGTGTCCCTGATCTGTCTGGTGAAAGG CTTCTATCCTAGTGATATTGCTGTGGAGTGGGAA
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
TCAAATGGACAGCCAGAGAACAGATACATGACCT GGCCTCCAGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCT TCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGATAAATCTCG ATGGCAGCAGGGGAACGTGTTTAGTTGTTCAGTG ATGCATGAAGCCCTGCACAATCATTACACTCAGA
AGAGCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAA 51 720 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW
YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK 52 720 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIH
WVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF
YAMDYWGQGTLVTVSS 53 3041 Compl EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD eta WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT
LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF YFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 54 3041 Compl GAAGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTG eta GTGCAGCCAGGAGGGTCCCTGCGCCTGTCTTGC
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GCCGCTAGTGGCTTCACTTTTACCGACTACACCA TGGATTGGGTGCGACAGGCACCTGGAAAGGGCC TGGAGTGGGTCGCCGATGTGAACCCAAATAGCG GAGGCTCCATCTACAACCAGCGGTTCAAGGGCC GGTTCACCCTGTCAGTGGACCGGAGCAAAAACA CCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGAGCCGA AGATACTGCTGTGTACTATTGCGCCCGGAATCTG GGGCCCTCCTTCTACTTTGACTATTGGGGGCAGG GAACTCTGGTCACCGTGAGCTCCGCCTCCACCAA GGGACCTTCTGTGTTCCCACTGGCTCCCTCTAGT AAATCCACATCTGGGGGAACTGCAGCCCTGGGC TGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTCA CAGTGTCTTGGAACAGTGGCGCTCTGACTTCTGG GGTCCACACCTTTCCTGCAGTGCTGCAGTCAAGC GGGCTGTACAGCCTGTCCTCTGTGGTCACCGTG CCAAGTTCAAGCCTGGGAACACAGACTTATATCT GCAACGTGAATCACAAGCCATCCAATACAAAAGT CGACAAGAAAGTGGAACCCAAGTCTTGTGATAAA ACCCATACATGCCCCCCTTGTCCTGCACCAGAGC TGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACC CAAGCCTAAAGATACACTGATGATTAGTAGGACC CCAGAAGTCACATGCGTGGTCGTGGACGTGAGC CACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTTAACTGGTACG TGGACGGCGTCGAGGTGCATAATGCCAAGACTA AACCCAGGGAGGAACAGTACAACAGTACCTATCG CGTCGTGTCAGTCCTGACAGTGCTGCATCAGGAT TGGCTGAACGGGAAAGAGTATAAGTGCAAAGTGA GCAATAAGGCTCTGCCCGCACCTATCGAGAAAAC
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
AATTTCCAAGGCAAAAGGACAGCCTAGAGAACCA CAGGTGTACGTGCTGCCTCCATCAAGGGATGAG CTGACAAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGTCTGG TGAAAGGATTCTATCCCTCTGACATTGCTGTGGA GTGGGAAAGTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTAC CTGACCTGGCCCCCTGTGCTGGACTCAGATGGC AGCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTCGACA AATCCCGGTGGCAGCAGGGGAATGTGTTTAGTTG TTCAGTCATGCACGAGGCACTGCACAACCATTAC
ACCCAGAAGTCACTGTCACTGTCACCAGGG 55 3041 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD
WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF
YFDYWGQGTLVTVSS 56 3057 Compl EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD eta WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT
LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF YFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 57 3057 Compl GAAGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTG
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e eta GTGCAGCCAGGAGGGTCCCTGCGCCTGTCTTGC
GCCGCTAGTGGCTTCACTTTTACCGACTACACCA TGGATTGGGTGCGACAGGCACCTGGAAAGGGCC TGGAGTGGGTCGCCGATGTGAACCCAAATAGCG GAGGCTCCATCTACAACCAGCGGTTCAAGGGCC GGTTCACCCTGTCAGTGGACCGGAGCAAAAACA CCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGAGCCGA AGATACTGCTGTGTACTATTGCGCCCGGAATCTG GGGCCCTCCTTCTACTTTGACTATTGGGGGCAGG GAACTCTGGTCACCGTGAGCTCCGCCTCCACCAA GGGACCTTCTGTGTTCCCACTGGCTCCCTCTAGT AAATCCACATCTGGGGGAACTGCAGCCCTGGGC TGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTCA CAGTGTCTTGGAACAGTGGCGCTCTGACTTCTGG GGTCCACACCTTTCCTGCAGTGCTGCAGTCAAGC GGGCTGTACAGCCTGTCCTCTGTGGTCACCGTG CCAAGTTCAAGCCTGGGAACACAGACTTATATCT GCAACGTGAATCACAAGCCATCCAATACAAAAGT CGACAAGAAAGTGGAACCCAAGTCTTGTGATAAA ACCCATACATGCCCCCCTTGTCCTGCACCAGAGC TGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACC CAAGCCTAAAGATACACTGATGATTAGTAGGACC CCAGAAGTCACATGCGTGGTCGTGGACGTGAGC CACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTTAACTGGTACG TGGACGGCGTCGAGGTGCATAATGCCAAGACTA AACCCAGGGAGGAACAGTACAACAGTACCTATCG CGTCGTGTCAGTCCTGACAGTGCTGCATCAGGAT TGGCTGAACGGGAAAGAGTATAAGTGCAAAGTGA
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GCAATAAGGCTCTGCCCGCACCTATCGAGAAAAC AATTTCCAAGGCAAAAGGACAGCCTAGAGAACCA CAGGTGTACGTGTATCCTCCATCAAGGGATGAGC TGACAAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGTCTGGT GAAAGGATTCTATCCCTCTGACATTGCTGTGGAG TGGGAAAGTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACA AGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCAGATGGCA GCTTCGCGCTGGTGAGCAAGCTGACCGTCGACA AATCCCGGTGGCAGCAGGGGAATGTGTTTAGTTG TTCAGTCATGCACGAGGCACTGCACAACCATTAC
ACCCAGAAGTCACTGTCACTGTCACCAGGG 58 3057 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD
WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF
YFDYWGQGTLVTVSS 59 3317 Compl DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY eta QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNP NSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSAAEP KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK 60 3317 Compl GACATTCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTGA eta GTGCCTCAGTCGGGGACAGGGTGACTATCACCT
GCAAGGCTTCACAGGATGTCAGCATTGGCGTGG CATGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCCA AGCTGCTGATCTATAGCGCCTCCTACAGGTATAC AGGCGTGCCATCCCGCTTCTCTGGCAGTGGGTC AGGAACTGACTTTACACTGACTATTTCTAGTCTGC AGCCCGAAGATTTCGCCACATACTATTGCCAGCA GTACTATATCTACCCTTATACTTTTGGCCAGGGGA CCAAAGTGGAGATTAAGGGCGGAGGAGGCTCCG GAGGAGGAGGGTCTGGAGGAGGAGGAAGTGAG GTCCAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGACTGGTG CAGCCAGGAGGGTCCCTGAGGCTGTCTTGTGCC GCTAGTGGCTTCACCTTTACAGACTACACAATGG ATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGG AATGGGTCGCTGATGTGAACCCTAATAGCGGAG GCTCCATCTACAACCAGCGGTTCAAAGGACGGTT CACCCTGTCAGTGGACCGGAGCAAGAACACCCT GTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA TACTGCTGTGTACTATTGCGCCAGGAATCTGGGC CCAAGCTTCTACTTTGACTATTGGGGGCAGGGAA CACTGGTCACTGTGTCAAGCGCAGCCGAACCCA AATCCTCTGATAAGACTCACACCTGCCCACCTTG TCCAGCTCCAGAGCTGCTGGGAGGACCTAGCGT GTTCCTGTTTCCACCCAAGCCAAAAGACACTCTG ATGATTTCTAGAACCCCTGAAGTGACATGTGTGG TCGTGGACGTCAGTCACGAGGACCCCGAAGTCA
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
AATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTCGAGGTGCA TAATGCCAAGACCAAACCCCGAGAGGAACAGTAC AACTCAACCTATCGGGTCGTGAGCGTCCTGACAG TGCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGT ATAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCTCTGCCTGC ACCAATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCTAAAGGG CAGCCCCGCGAACCTCAGGTCTACGTGTATCCTC CAAGCCGAGATGAGCTGACAAAAAACCAGGTCTC CCTGACTTGTCTGGTGAAGGGATTTTACCCAAGT GACATCGCAGTGGAGTGGGAATCAAATGGCCAG CCCGAAAACAATTATAAGACCACACCCCCTGTGC TGGACTCTGATGGGAGTTTCGCACTGGTCTCCAA ACTGACCGTGGACAAGTCTCGGTGGCAGCAGGG AAACGTCTTTAGCTGTTCCGTGATGCACGAGGCC CTGCACAATCATTACACACAGAAATCTCTGAGTCT
GTCACCTGGCAAG 61 3317 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY
QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK 62 3317 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD
WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF
YFDYWGQGTLVTVSS 63 5244 Compl DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW eta YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
VARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQM NSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLV TVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVL PPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 64 5244 Compl GACATTCAGATGACACAGAGCCCCAGCTCCCTGA eta GTGCTTCAGTCGGCGACAGGGTGACTATCACCT
GCCGCGCATCCCAGGATGTCAACACCGCTGTGG CATGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAAGCCCCAA AGCTGCTGATCTACAGCGCTTCCTTCCTGTATTCT GGCGTGCCAAGTCGGTTTTCTGGAAGTAGATCAG GCACTGACTTCACACTGACTATCTCTAGTCTGCA GCCCGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAG CACTATACCACACCCCCTACATTCGGACAGGGCA CTAAAGTGGAGATTAAGGGCGGGTCAGGCGGAG GGAGCGGAGGAGGGTCCGGAGGAGGGTCTGGA GGAGGGAGTGGAGAGGTCCAGCTGGTGGAATCT GGAGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAGGCTCACTG CGACTGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTTAACATCA AAGACACATACATTCATTGGGTCAGGCAGGCACC AGGGAAGGGACTGGAATGGGTGGCCCGCATCTA TCCCACAAATGGGTACACTCGATATGCCGACAGC GTGAAAGGACGGTTTACCATTTCTGCTGATACCA GTAAGAACACAGCATACCTGCAGATGAACAGCCT
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
GCGCGCAGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCAG TCGATGGGGGGGAGACGGCTTCTACGCCATGGA TTATTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACCGTGTC AAGCGCAGCCGAACCTAAATCCTCTGACAAGACC CACACATGCCCACCCTGTCCTGCTCCAGAGCTGC TGGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAA GCCTAAAGATACACTGATGATTAGCCGCACTCCC GAAGTCACCTGTGTGGTCGTGGACGTGTCCCAC GAGGACCCCGAAGTCAAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTCGAGGTGCATAATGCCAAGACTAAA CCAAGAGAGGAACAGTACAATTCAACCTATAGGG TCGTGAGCGTCCTGACAGTGCTGCATCAGGATTG GCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAAGTGTCT AACAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACTA TTAGCAAGGCAAAAGGGCAGCCACGGGAACCCC AGGTCTACGTGCTGCCCCCTAGCAGAGACGAGC TGACCAAAAACCAGGTCTCCCTGCTGTGTCTGGT GAAGGGCTTTTATCCTAGTGATATCGCTGTGGAG TGGGAATCAAATGGGCAGCCAGAAAACAATTACC TGACATGGCCACCCGTGCTGGACAGCGATGGGT CCTTCTTTCTGTATTCCAAACTGACTGTGGACAAG TCTAGATGGCAGCAGGGAAACGTCTTCAGCTGTT CCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCATTACAC
CCAGAAGTCTCTGAGTCTGTCACCCGGC 65 5244 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAW
YQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK 66 5244 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIH
SEQ Nº Desc Sequência (aminoácido ou DNA) ID de NO. Clon e
WVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF
YAMDYWGQGTLVTVSS 67 5244 L1 QDVNTA , 5034 , 719, 720 68 5244 L2 SAS , 5034 , 719, 720 69 5244 L3 QQHYTTPPT , 5034 , 719, 720 70 5244 H1 GFNIKDTY 71 5244 H2 IYPTNGYT 72 5244 H3 SRWGGDGFYAMDY Tabela C: Sequências para regiões VH e VL das variantes v7133, v15082, v15085, v15083, v15080, v15079, v15084 e v15081
SE Varian Desc Sequência Q ID te .
NO 78 7133 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYTM
DWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPS
FYFDYWGQGTLVTVSS 79 7133 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY
QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPATFGQGTKVEIK 80 15082 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMD
WVRQAPGKGLEWVADVNPNSGYSIYNQRFKGRFT LSVDRSWNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSF
YFDYWGQGTLVTVSS 81 15082 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY e QQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF 15085 TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK 82 15085 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQDYTM
DWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPW
FYFDYWGQGTLVTVSS 83 15083 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQDYTM
DWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPS
FYFDYWGQGTLVTVSS 84 15083, VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY 15080, QQKPGKAPKLLIWSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF 15079 TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPGTFGQGTKVEIK e 15081 85 15080 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQDYTM
DWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRF
SE Varian Desc Sequência Q ID te .
NO TLSVDRSWNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPS
FYFDYWGQGTLVTVSS 86 15079 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYDYTM
DWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRF TLSVDRSWNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPS
FYFDYWGQGTLVTVSS 87 15084 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQDYTM
DWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGYSIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPW
FYFDYWGQGTLVTVSS 88 15084 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWY
QQKPGKAPKLLIWSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK 89 15081 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQDYTM
DWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGYSIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPS FYFDYWGQGTLVTVSS

Claims (71)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado anticorpo-droga caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo anti-HER2 biparatópico conjugado a um análogo de auristatina por meio de um peptídeo de ligação (L) a uma razão média baixa de droga para anticorpo (DAR), em que o anticorpo anti-HER2 biparatópico compreende um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro epítopo de HER2 e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um segundo epítopo de HER2, com o primeiro e o segundo epítopo de HER2 sendo epítopos diferentes, e em que a DAR média baixa é uma DAR média inferior a 3,9.
2. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o análogo de auristatina-peptídeo de ligação possui a Fórmula geral (II):
O
H
N N
N N
O O O O
O X O
HN S H R1 N L
O (II) em que: X é -C(O)NHCH(CH2R2)-, ou X está ausente; R1 é selecionado dentre: e ; L é o peptídeo de ligação, e representa o ponto de ligação do análogo de auristatina-peptídeo de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico.
3. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R1 é: ou .
4. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que X está ausente.
5. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R1 é: .
6. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que X é -C(O)NHCH(CH2R2)-.
7. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que R1 é: .
8. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a DAR média está entre 0,5 e 3,5.
9. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a DAR média está entre 0,5 e 2,5.
10. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende 5% ou mais de espécies DAR0.
11. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende 15% ou mais de espécies DAR0.
12. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre cerca de 5% e cerca de 50% de espécies DAR0.
13. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre cerca de 10% e cerca de 30% de espécies DAR0.
14. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre cerca de 10% e cerca de 25% de espécies DAR0.
15. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre cerca de 15% e cerca de 25% de espécies DAR0.
16. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende 25% ou menos de espécies DAR6 ou superiores.
17. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende 15% ou menos de espécies DAR6 ou superiores.
18. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre 0% e cerca de 15% de espécies DAR6 ou superiores.
19. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre cerca de 0% e cerca de 10% de espécies DAR6 ou superiores.
20. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que L é um peptídeo de ligação clivável.
21. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que L é um peptídeo de ligação clivável por protease.
22. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que L possui a Fórmula geral (VI): Z Str AA1 AA2 X D s m o (VI) em que: Z é um grupo funcional capaz de reagir com o grupo alvo no anticorpo anti-
HER2 biparatópico; Str é um extensor; AA1 e AA2 são, cada um independentemente, um aminoácido, em que AA1- [AA2]m forma um sítio de clivagem por protease; X é um grupo autodestrutivo; D é o ponto de ligação ao análogo de auristatina; s é 0 ou 1; m é um número inteiro entre 1 e 4, e o é 0, 1 ou 2.
23. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que L possui a Fórmula geral (VIII):
O
A O O
H
S N N D
N Y
H
O O
HN O NH2 (VIII) em que: A-S- é o ponto de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico; Y é um ou mais componentes do peptídeo de ligação adicionais, ou está ausente, e D é o ponto de ligação ao análogo de auristatina.
24. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que L possui a Fórmula geral (IX):
O
O O
A H
S N O N D
O O N Y
H
O O
HN O NH2 (IX) em que:
A-S- é o ponto de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico; Y é um ou mais componentes do peptídeo de ligação adicionais, ou está ausente, e D é o ponto de ligação ao análogo de auristatina.
25. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o análogo de auristatina-peptídeo de ligação possui a estrutura:
H A
S N NH2
O O
O N O
H H
N N N O
O H N N H 3
H O O
N N O O S
O O O O
N
O , em que A-S- é o ponto de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico.
26. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a DAR média está entre 0,5 e 2,5.
27. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende 5% ou mais de espécies DAR0.
28. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre cerca de 5% e cerca de 50% de espécies DAR0.
29. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende 25% ou menos de espécies DAR6 ou superiores.
30. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende entre 0% e cerca de 15% de espécies DAR6 ou superiores.
31. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER2 biparatópico se liga ao HER2 com maior afinidade em comparação a um anticorpo monoespecífico bivalente correspondente.
32. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER2 biparatópico mostra uma maior internalização em células que expressam HER2 em comparação a um anticorpo monoespecífico bivalente correspondente.
33. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno são, independentemente, um scFv, um Fab, um Fab' ou um sdAb.
34. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno são, independentemente, um scFv ou um Fab.
35. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno é um scFv, e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno é um Fab.
36. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo epítopo de HER2 são epítopos não sobrepostos.
37. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo epítopo de HER2 estão em diferentes domínios de HER2.
38. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o primeiro epítopo de HER2 está no ECD4 de HER2 e o segundo epítopo de HER2 está no ECD2 de HER2.
39. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compete com o trastuzumabe pela ligação ao HER2.
40. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno compete com o pertuzumabe pela ligação ao HER2.
41. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR do braço de ligação ao ECD4 de qualquer um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ou v6717.
42. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38 e 41, caracterizado pelo fato de que o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR do braço de ligação ao ECD2 de qualquer um dentre v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, v6717, v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ou v15085.
43. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38 e 41, caracterizado pelo fato de que o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR do braço de ligação ao ECD2 de v10000.
44. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR do braço de ligação ao ECD4 de v10000, e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR do braço de ligação ao ECD2 de v10000.
45. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende um conjunto de seis CDRs que possuem 90% ou mais de identidade de sequência com um conjunto de CDRs do braço de ligação ao ECD4 de v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno mantém a capacidade de se ligar ao ECD4.
46. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38 e 45, caracterizado pelo fato de que o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende um conjunto de seis CDRs que possuem 90% ou mais de identidade de sequência com um conjunto de CDRs do braço de ligação ao ECD2 de v10000, em que o construto polipeptídico de ligação ao antígeno mantém a capacidade de se ligar ao ECD2.
47. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR indicadas nas SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 39, 40 e 41, e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR indicadas nas SEQ ID NOs: 67, 68, 69, 70, 71 e 72.
48. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HER2 biparatópico compreende ainda uma estrutura em andaime, e em que o primeiro e o segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno estão operacionalmente ligados à estrutura em andaime.
49. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a estrutura em andaime é uma região Fc de IgG.
50. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a região Fc de IgG é uma região Fc heterodimérica compreendendo um domínio CH3 modificado.
51. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a região Fc de IgG é uma região Fc heterodimérica compreendendo um domínio CH3 modificado possuindo uma primeira sequência polipeptídica que compreende modificações de aminoácido nas posições F405 e Y407 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição L351, e uma segunda sequência polipeptídica que compreende modificações de aminoácido nas posições T366 e T394 e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição K392, em que a modificação de aminoácido na posição F405 é F405A, F405S, F405T ou F405V; a modificação de aminoácido na posição Y407 é Y407I ou Y407V; a modificação de aminoácido na posição T366 é T366I, T366L ou T366M; a modificação de aminoácido na posição T394 é T394W; a modificação de aminoácido na posição L351 é L351Y, e a modificação de aminoácido na posição K392 é K392F, K392L ou K392M.
52. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que: (a) a primeira sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido L351Y, F405A e Y407V, e a segunda sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T366L, K392M e T394W; ou (b) a primeira sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido L351Y, F405A e Y407V, e a segunda sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T366L, K392L e T394W; ou (c) a primeira sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T350V, L351Y, F405A e Y407V, e a segunda sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T350V, T366L, K392M e T394W; ou (d) a primeira sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T350V, L351Y, F405A e Y407V, e a segunda sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T350V, T366L, K392L e T394W; ou (e) a primeira sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T350V, L351Y, S400E, F405A e Y407V, e a segunda sequência polipeptídica do domínio CH3 modificado compreende as modificações de aminoácido T350V, T366L, N390R, K392M e T394W.
53. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 52, e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
54. Método para inibir o crescimento de uma célula cancerosa que expressa HER2, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato da célula cancerosa com uma quantidade eficaz do conjugado anticorpo- droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52.
55. Método para tratar um câncer que expressa HER2, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um sujeito com um câncer que expressa HER2, de uma quantidade eficaz do conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão ou câncer gástrico.
57. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de mama.
58. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de ovário.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é classificado como HER2 negativo por imuno-histoquímica.
60. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
61. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um câncer que expressa HER2 em um sujeito em necessidade.
62. Conjugado anticorpo-droga para uso de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão ou câncer gástrico.
63. Conjugado anticorpo-droga para uso de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de mama.
64. Conjugado anticorpo-droga para uso de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de ovário.
65. Conjugado anticorpo-droga para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 64, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é classificado como HER2 negativo por imuno-histoquímica.
66. Uso do conjugado anticorpo-droga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado pelo fato de que se aplica na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer que expressa HER2.
67. Uso, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão ou câncer gástrico.
68. Uso, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de mama.
69. Uso, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é um câncer de ovário.
70. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa HER2 é classificado como HER2 negativo por imuno-histoquímica.
71. Composição de conjugado anticorpo-droga caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-HER2 biparatópico conjugado a um análogo de auristatina por meio de um peptídeo de ligação (L), com o análogo de auristatina- peptídeo de ligação possuindo a Fórmula geral (II):
O
H
N N
N N
O O O O
O X O
HN S H R1 N L
O (II) em que: X está ausente; R1 é selecionado dentre: e ; L é o peptídeo de ligação, e representa o ponto de ligação do análogo de auristatina-peptídeo de ligação ao anticorpo anti-HER2 biparatópico; em que o anticorpo anti-HER2 biparatópico compreende um primeiro construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro epítopo de HER2 no ECD4 de HER2 e um segundo construto polipeptídico de ligação ao antígeno que se liga a um segundo epítopo de HER2 no ECD2 de HER2, e em que a composição do conjugado anticorpo-droga possui uma DAR média entre 0,5 e 2,5 e compreende entre cerca de 10% e cerca de 30% de espécies
DAR0 e entre 0% e cerca de 15% de espécies DAR6 ou superiores.
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