JP2020532543A - 抗egfr抗体薬物コンジュゲート(adc)及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、リンカーを経て抗EGFR抗体に連結された細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤を含む抗体−薬物コンジュゲート(ADC)、ADCを含む組成物、ADCを作成する方法及びがんに罹っている対象にADCを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。本開示は、EGFR、特にヒトEGFR(hEGFR)に特異的に結合するADCを提供する。本明細書に記載される抗EGFR Abは、重鎖定常領域にS239C突然変異を含み、番号付けはKabatに従う。
Description
本出願は、2017年9月2日提出の米国特許仮出願第62/553,840号の利益を主張し、前記開示は参照によりその全体をここに組み込む。
本開示は、とりわけ、ヒト上皮成長因子受容体(EGFR、HER−1又はErb−B1としても知られる)抗体薬物コンジュゲート(ADC)、そのようなADCを含む組成物、ADCを作成する方法、及びその使用に関する。
がん療法は、手術、放射線及び化学療法を含む広範囲の治療手法を含む。多くの場合、補完的な手法のおかげで、がんを処置する医師は広い選択を利用可能になるが、既存の療法は、正常で健康な細胞よりもがん細胞のほうを標的にする選択性がないこと、及び処置に対するがんの抵抗性の発現などの、いくつかの不都合を被っている。
抗体などの標的療法に基づくがんを処置する最近の手法は、放射線処置などの非標的療法と比べて、副作用が少ない化学療法レジメンをもたらした。抗体の抗腫瘍能力を増強するための1つの効果的な手法は、標的細胞が内部移行させることができるモノクローナル抗体に細胞傷害性薬物又は毒素を連結させることである。これらの作用物質は、抗体薬物コンジュゲート(ADC)と名付けられている。患者に投与すると、ADCはその抗体部分を介して標的細胞に結合し、内部移行されて、薬物又は毒素はその効果を発揮できるようになる(例えば、米国特許出願公開第2005/0180972号及び米国特許出願公開第2005/0123536号参照)。
ヒト上皮成長因子受容体は、c−erbBプロトオンコジーンによりコードされた170kDaの膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す(Modjtahediら、Br.J.Cancer 73:228〜235頁(1996);Herbst and Shin、Cancer 94:1593〜1611頁(2002))。SwissProtデータベース登録P00533は、ヒトEGFRの配列を提供する。EGFRは、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂誘発及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むがこれに限定されないチロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を通じて数多くの細胞過程を調節する(Atalayら、Ann.Oncology 14:1346〜1363頁(2003);Tsao and Herbst、Signal 4:4〜9頁(2003);Herbst and Shin、Cancer 94:1593〜1611頁(2002);Modjtahediら、Br.J.Cancer 73:228〜235頁(1996))。
EGFRの既知のリガンドは、EGF、TGFA/TGFアルファ、アンフィレギュリン、エピジェン/EPGN、BTC/ベータセルリン、エピレギュリン/EREG及びHBEGF/ヘパリン結合EGFを含む。EGFRによるリガンド結合は、受容体ホモ−及び/又はヘテロ二量体化並びに重要な細胞質残基の自己リン酸化のきっかけとなる。リン酸化EGFRはGRB2のようなアダプタータンパク質を動員し、これが今度は、少なくとも以下の主要な下流シグナル伝達カスケード:RAS−RAF−MEK−ERK、PI3キナーゼ−AKT、PLCガンマ−PKC及びSTATモジュールを含む複雑な下流シグナル伝達カスケードを活性化する。この自己リン酸化は、それ自体のホスホチロシン結合SH2ドメインを通じてリン酸化チロシンと会合する他のいくつかのタンパク質による下流活性化及びシグナル伝達も誘発する。これらの下流シグナル伝達タンパク質は、いくつかのシグナル伝達カスケード、主にMAPK、Akt及びJNK経路を開始し、細胞増殖をもたらす。EGFRによるリガンド結合は、NF−カッパ−Bシグナル伝達カスケードも活性化する可能性がある。リガンド結合はRGS16のような他のタンパク質も直接リン酸化し、そのGTPアーゼ活性を活性化し、潜在的にEGF受容体シグナル伝達をGタンパク質結合受容体シグナル伝達に連結させる。リガンド結合はMUC1もリン酸化し、SRC及びCTNNB1/ベータカテニンとのその相互作用を増やす。
膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、前立腺がん及び腎臓がんを含む、数多くのヒト悪性状態においてEGFRの過剰発現が報告されている(Atalayら、Ann.Oncology 14:1346〜1363頁(2003);Herbst and Shin、Cancer 94:1593〜1611頁(2002);and Modjtahediら、Br.J.Cancer 73:228〜235頁(1996))。これらの状態の多くで、EGFRの過剰発現は患者の予後不良と相関している又は関連している(Herbst and Shin、Cancer 94:1593〜1611頁(2002);and Modjtahediら、Br.J.Cancer 73:228〜235頁(1996))。EGFRは、正常な組織、特に皮膚、肝臓及び消化管の上皮組織の細胞でも発現されるが、その発現レベルは悪性細胞よりも一般的に低い(Herbst and Shin、Cancer 94:1593〜1611頁(2002))。
EGFR遺伝子の増幅(すなわち、EGFR遺伝子の複数のコピー)を含有する腫瘍のかなりの割合が、de2−7 EGFR、ΔEGFR、EGFRvIII又はΔ2−7(本明細書では互換的に使用される用語)として知られる受容体の切断型(Wikstrandら、(1998)J.Neurovirol.4、148〜158頁)も共発現する(Olapade−Olaopaら、(2000)Br.J.Cancer.82、186〜94頁)。de2−7 EGFRに見られる再編成により、エキソン2〜7にまたがる801のヌクレオチドを欠くインフレーム成熟mRNAが生じる(Wongら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89、2965〜9頁;Yamazakiら、(1990)Jpn.J.Cancer Res.81、773〜9頁;Yamazakiら、(1988)Mol.Cell.Biol.8、1816〜20頁;and Sugawaら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87、8602〜6頁)。対応するEGFRタンパク質は、細胞外ドメインの残基6〜273を含む267アミノ酸の欠失及び融合接合点の新規のグリシン残基を有する(Sugawaら、1990年)。この欠失は、グリシン残基の挿入と併せて、欠失境界面で独特の接合ペプチドを産生する(Sugawaら、1990年)。
EGFRvIIIは、神経膠腫、乳がん、肺がん、卵巣がん及び前立腺がんを含むいくつかの腫瘍タイプにおいて報告されている(Wikstrandら、(1997)Cancer Res.57、4130〜40頁;Olapade−Olaopaら、(2000)Br.J.Cancer.82、186〜94頁;Wikstrandら、(1995)Cancer Res.55、3140〜8頁;Garcia de Palazzoら、(1993)Cancer Res.53、3217〜20頁)。この切断型受容体はリガンドには結合しないが、低い構成的活性を有し、ヌードマウスにおいて腫瘍異種移植片として成長させた神経膠腫細胞に著しい増殖優位性を分け与え(Nishikawaら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91、7727〜31頁)、NIH3T3細胞(Batraら、(1995)Cell Growth Differ.6、1251〜9頁)及びMCF−7細胞を形質転換することができる。神経膠腫細胞中でde2−7 EGFRが利用する細胞機構は十分には定義されていないが、アポトーシスの減少(Naganeら、(1996)Cancer Res.56、5079〜86頁)及び増殖のわずかな増強(Naganeら、1996年)を含むことが報告されている。この切断型受容体の発現は腫瘍細胞に制限されているので、この受容体は抗体療法のための高度に特異的な標的を表している。
Modjtahediら、Br.J.Cancer 73:228〜235頁(1996)
Herbst and Shin、Cancer 94:1593〜1611頁(2002)
Atalayら、Ann.Oncology 14:1346〜1363頁(2003)
Tsao and Herbst、Signal 4:4〜9頁(2003)
Wikstrandら、(1998)J.Neurovirol.4、148〜158頁
Olapade−Olaopaら、(2000)Br.J.Cancer.82、186〜94頁
Wongら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89、2965〜9頁
Yamazakiら、(1990)Jpn.J.Cancer Res.81、773〜9頁
Yamazakiら、(1988)Mol.Cell.Biol.8、1816〜20頁
Sugawaら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87、8602〜6頁
Wikstrandら、(1997)Cancer Res.57、4130〜40頁
Wikstrandら、(1995)Cancer Res.55、3140〜8頁
Garcia de Palazzoら、(1993)Cancer Res.53、3217〜20頁
Nishikawaら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91、7727〜31頁
Batraら、(1995)Cell Growth Differ.6、1251〜9頁
Naganeら、(1996)Cancer Res.56、5079〜86頁
したがって、がんの処置における治療目的で使用することが可能な抗EGFR抗体及びADCの必要性が当技術分野には残されている。
(発明の要旨)
本開示は、リンカーを経て抗EGFR抗体に連結された細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤を含む抗体−薬物コンジュゲート(ADC)、ADCを含む組成物、ADCを作成する方法及びがんに罹っている対象にADCを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。実施例においてさらに詳細に記載されるように、かついかなる特定の動作理論にも縛られるつもりもないが、本明細書に含まれるデータは、特定のリンカー並びに特定の細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(すなわち、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマー)を含む抗EGFR ADCが強力な抗腫瘍活性を発揮することを実証している。さらに、本開示の抗EGFR ADCは固定低単一種薬物負荷を特徴とし、低薬物負荷は驚くべきことに高度に効果的なADCを提供する。
本開示は、リンカーを経て抗EGFR抗体に連結された細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤を含む抗体−薬物コンジュゲート(ADC)、ADCを含む組成物、ADCを作成する方法及びがんに罹っている対象にADCを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。実施例においてさらに詳細に記載されるように、かついかなる特定の動作理論にも縛られるつもりもないが、本明細書に含まれるデータは、特定のリンカー並びに特定の細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(すなわち、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマー)を含む抗EGFR ADCが強力な抗腫瘍活性を発揮することを実証している。さらに、本開示の抗EGFR ADCは固定低単一種薬物負荷を特徴とし、低薬物負荷は驚くべきことに高度に効果的なADCを提供する。
したがって、実施形態では、本開示は、EGFR、特にヒトEGFR(hEGFR)に特異的に結合するADCを提供する。
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗体に連結された細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を含む抗体薬物コンジュゲート(ADC)を提供し、ADCは構造式(I):
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは抗ヒト上皮成長因子受容体抗体である。実施形態では、抗EGFR Abは、(i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDRH1ドメイン;配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDRH2ドメイン;配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDRH3ドメイン;(ii)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDRL1ドメイン;配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDRL2ドメイン;配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDRL3ドメイン;及び(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含み、番号付けはKabatに従っている。XYは、S239C突然変異を通じてリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表す。実施形態では、nは任意の整数である。実施形態では、nは2である。実施形態では、抗体Abは、配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。実施形態では、抗体Abは、配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。実施形態では、XYはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Lは、式III、IV、V、VI、VII、VIII又はIXに記載されるリンカーを含む。例えば、実施形態では、Lは式IXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、リンカーは、マレイミドカプロイル−バリン−アラニン(mc−Val−Ala)リンカーである。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。ある特定の実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは抗ヒト上皮成長因子受容体抗体である。実施形態では、抗EGFR Abは、(i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDRH1ドメイン;配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDRH2ドメイン;配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDRH3ドメイン;(ii)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDRL1ドメイン;配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDRL2ドメイン;配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDRL3ドメイン;及び(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含み、番号付けはKabatに従っている。XYは、S239C突然変異を通じてリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表す。実施形態では、nは任意の整数である。実施形態では、nは2である。実施形態では、抗体Abは、配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。実施形態では、抗体Abは、配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。実施形態では、XYはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Lは、式III、IV、V、VI、VII、VIII又はIXに記載されるリンカーを含む。例えば、実施形態では、Lは式IXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、リンカーは、マレイミドカプロイル−バリン−アラニン(mc−Val−Ala)リンカーである。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。ある特定の実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗体に連結された細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を含む抗体−薬物コンジュゲート(ADC)を提供し、抗体薬物コンジュゲートは構造式(I):
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは(i)配列番号2を含む重鎖可変領域、(ii)配列番号7を含む軽鎖可変領域、及び(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含む抗EGFR抗体であり、番号付けはKabatに従い、XYはリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し、nは任意の整数である。実施形態では、nは2又は4である。実施形態では、nは2である。実施形態では、XYは、抗体Ab上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。実施形態では、XYはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Lは、式III、IV、V、VI、VII、VIII又はIXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、Lは式IXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは(i)配列番号2を含む重鎖可変領域、(ii)配列番号7を含む軽鎖可変領域、及び(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含む抗EGFR抗体であり、番号付けはKabatに従い、XYはリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し、nは任意の整数である。実施形態では、nは2又は4である。実施形態では、nは2である。実施形態では、XYは、抗体Ab上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。実施形態では、XYはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Lは、式III、IV、V、VI、VII、VIII又はIXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、Lは式IXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗体に連結された細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を含む抗体薬物コンジュゲートを提供し、抗体薬物コンジュゲートは構造式(I):
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、(ii)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗EGFR抗体であり、XYはリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し、nは任意の整数である。実施形態では、nは2又は4である。実施形態では、nは2である。実施形態では、XYは、抗体Ab上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。実施形態では、XYはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Lは、式III、IV、V、VI、VII、VIII又はIXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、Lは式IXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、(ii)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗EGFR抗体であり、XYはリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し、nは任意の整数である。実施形態では、nは2又は4である。実施形態では、nは2である。実施形態では、XYは、抗体Ab上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。実施形態では、XYはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Lは、式III、IV、V、VI、VII、VIII又はIXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、Lは式IXに記載されるリンカーを含む。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
実施形態では、本開示は、式(X):
実施形態では、本開示は、式(X):
実施形態では、本開示は、式(X):
実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるADCを含む組成物を提供する。実施形態では、組成物は、少なくとも1つの賦形剤、担体及び/又は希釈剤をさらに含む。実施形態では、本開示の組成物はヒトにおける製薬学的使用のために処方される。
実施形態では、本開示はADCを作成する方法であって、抗EGFR抗体を構造式(Ia)D−L−RXに従ったシントンに接触させることを含み、Dは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤であり、Lはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、RXはシントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下でシントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、DはPBDダイマーであり、抗体は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む方法を提供する。
実施形態では、本開示はADCを作成する方法であって、抗EGFR抗体を構造式(Ia)D−L−RXに従ったシントンに接触させることを含み、Dは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤であり、Lはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、RXはシントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下でシントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、DはPBDダイマーであり、抗体は(i)配列番号3を含むCDRH1配列、配列番号4を含むCDRH2配列、及び配列番号5を含むCDRH3配列を含む重鎖可変領域;(ii)配列番号8を含むCDRL1配列、配列番号9を含むCDRL2配列、及び配列番号10を含むCDRL3配列を含む軽鎖可変領域;並びに(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含み、番号付けはKabatに従う方法を提供する。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
実施形態では、本開示はADCを作成する方法であって、抗EGFR抗体を構造式(Ia)D−L−RXに従ったシントンに接触させることを含み、Dは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤であり、Lはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、RXはシントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下でシントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、DはPBDダイマーであり、抗体は(i)配列番号3を含むCDRH1配列、配列番号4を含むCDRH2配列、及び配列番号5を含むCDRH3配列を含む重鎖可変領域;(ii)配列番号8を含むCDRL1配列、配列番号9を含むCDRL2配列、及び配列番号10を含むCDRL3配列を含む軽鎖可変領域;並びに(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含み、番号付けはKabatに従い、RXはスルフヒドリル基又はマレイミド−スルフヒドリル基である、方法を提供する。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
実施形態では、本開示はADCを作成する方法であって、抗EGFR抗体を構造式(Ia)D−L−RXに従ったシントンに接触させることを含み、Dは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤であり、Lはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、RXはシントンを抗体に連結させることができる官能基を含み、DはPBDダイマーであり、Lは式III、IV、V、VI、VII、VIII又はIXに記載されるリンカーを含み、抗体は(i)配列番号3を含むCDRH1配列、配列番号4を含むCDRH2配列、及び配列番号5を含むCDRH3配列を含む重鎖可変領域;(ii)配列番号8を含むCDRL1配列、配列番号9を含むCDRL2配列、及び配列番号10を含むCDRL3配列を含む軽鎖可変領域;並びに(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含み、番号付けはKabatに従い、RXはスルフヒドリル基又はマレイミド−スルフヒドリル基である、方法を提供する。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
実施形態では、本開示はADCを作成する方法であって、抗EGFR抗体を構造式(Ia)D−L−RXに従ったシントンに接触させることを含み、Dは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤であり、Lはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、RXはシントンを抗体に連結させることができる官能基を含み、DはPBDダイマーであり、Lは式IXに記載されるリンカーを含み、抗体は(i)配列番号3を含むCDRH1配列、配列番号4を含むCDRH2配列、及び配列番号5を含むCDRH3配列を含む重鎖可変領域;(ii)配列番号8を含むCDRL1配列、配列番号9を含むCDRL2配列、及び配列番号10を含むCDRL3配列を含む軽鎖可変領域;並びに(iii)重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異を含み、番号付けはKabatに従い、RXはスルフヒドリル基又はマレイミド−スルフヒドリル基である、方法を提供する。実施形態では、抗EGFR抗体はIgG1アイソタイプを含む。実施形態では、抗EGFR抗体の重鎖定常領域は、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗EGFR抗体はヒト化抗体である。
本開示は、EGFRを標的にする抗体薬物コンジュゲート(ADC)及びその使用に関する。本開示のADCは、先行技術で開示された他のADCよりも明確な利点を提供する有利な属性を有する。例えば、本開示のADCは、下の実施例3〜6に示されるように、本質的に同じ抗体骨格を使用するオーリスタチンベースのADCよりも相当強力である。すなわち、本開示のADCは、(1)同じ用量を投与された場合対応するオーリスタチンADCよりも大きな効力を示し、(2)かなり低い(すなわち、10分の1)用量で投与される場合、対応するオーリスタチンADCに類似する効力を示す。本開示の抗体は、高い程度の効力を保持しつつ、約2(又は約2の平均薬物対抗体比)の低単一種薬物負荷も有する。
したがって、本開示は、リンカーを経て抗EGFR抗体に連結された細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(例えば、PBD)を含む抗体薬物コンジュゲート、本開示のADCを含む組成物、本開示のADCを作成する方法及びEGFRの過剰発現又は増殖に関連するがんなどのがんを処置するためにADCを使用する方法に関する。
実施形態では、本開示は、式(X):
実施形態では、本開示は、式(X):
実施形態では、本開示は、式(X):
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗EGFR抗体に連結された細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を含むADCを特色とし、ADCは構造式(I):
[D−L−XY]nAb
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号6を含む軽鎖を含む抗EGFR抗体であり、XYはリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し、nは整数である。特に、本明細書に記載される特定のリンカー並びに特定の細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(例えば、PBDダイマー)を含む抗EGFR ADCは、特に、オーリスタチンに連結された本質的に同じ抗体を含むADCと比べた場合、驚くほど強力な抗腫瘍活性を発揮する。さらに、本開示の抗EGFR ADCは低単一種薬物負荷を特徴とし、これによって驚くべきことに、例えば、高又は低レベルのEGFR発現に関連するがんを処置するのに高度に効果的なADCが得られる。本明細書の実施例に記載されているように、Ab1(S239C)−PBDは、対応するAb1オーリスタチンADC(例えば、Ab1−MMAF)よりも強力なコンジュゲートである。本明細書で使用される場合、「Ab1」とは、配列番号11を含む重鎖及び配列番号6を含む軽鎖を有する抗体のことである。「Ab1(S239C)」とは、配列番号1を含む重鎖及び配列番号6を含む軽鎖を有する抗体のことである。Ab1はAb1(S239C)と同じ重鎖配列を有するが、293位(Kabat番号付け)にセリンがある。
[D−L−XY]nAb
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号6を含む軽鎖を含む抗EGFR抗体であり、XYはリンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し、nは整数である。特に、本明細書に記載される特定のリンカー並びに特定の細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(例えば、PBDダイマー)を含む抗EGFR ADCは、特に、オーリスタチンに連結された本質的に同じ抗体を含むADCと比べた場合、驚くほど強力な抗腫瘍活性を発揮する。さらに、本開示の抗EGFR ADCは低単一種薬物負荷を特徴とし、これによって驚くべきことに、例えば、高又は低レベルのEGFR発現に関連するがんを処置するのに高度に効果的なADCが得られる。本明細書の実施例に記載されているように、Ab1(S239C)−PBDは、対応するAb1オーリスタチンADC(例えば、Ab1−MMAF)よりも強力なコンジュゲートである。本明細書で使用される場合、「Ab1」とは、配列番号11を含む重鎖及び配列番号6を含む軽鎖を有する抗体のことである。「Ab1(S239C)」とは、配列番号1を含む重鎖及び配列番号6を含む軽鎖を有する抗体のことである。Ab1はAb1(S239C)と同じ重鎖配列を有するが、293位(Kabat番号付け)にセリンがある。
当業者であれば認識するように、抗体及び/又は結合断片は実際には「モジュラー」である。本開示全体を通じて、抗体及び/又は結合断片を含む種々の「モジュール」の様々な特定の実施形態が記載される。特定の非限定的例として、可変重鎖(VH)CDR、VH鎖、可変軽鎖(VL)CDR及びVL鎖の様々な特定の実施形態が記載される。本明細書に開示されるADCも実際には「モジュラー」である。本開示全体を通じて、ADCを含む種々の「モジュール」の様々な特定の実施形態が記載される。特定の非限定的例として、ADCを構成してもよい抗体、リンカー並びに細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤の特定の実施形態が記載される。
本明細書に記載されるADCは、塩、及び一部の特定の実施形態では、薬学的に許容される塩の形態でもよい。十分に酸性の、十分に塩基性の、又は両方の官能基を有する本開示のADCは、いくつかの無機塩、並びに無機及び有機酸のいずれかと反応して塩を形成することが可能である。
本明細書で別段に定義されなければ、本開示に関連して使用される科学及び専門用語は、当業者が一般に理解している意味を有するものとする。
用語「抗上皮成長因子(EGF)受容体抗体」又は「抗EGFR抗体」は、本明細書では互換的に使用されるが、EGFRに特異的に結合する抗体のことである。目的の抗原、すなわち、EGFR「に結合する」抗体とは、抗体が抗原を発現している細胞を標的にするのに有用であるように、十分な親和性でその抗原に結合することができる抗体である。好ましい実施形態では、抗体はヒトEGFR(hEGFR)に特異的に結合する。抗EGFR抗体の例は、下の実施例1に開示されている。別段に指示されなければ、用語「抗EGFR抗体」は、野生型EGFR又はEGFRvIIIなどのEGFRの任意の変異体に結合する抗体を指すことが意図されている。
野生型ヒトEGFRのアミノ酸配列は、配列番号12として下に提供されており、シグナルペプチド(アミノ酸残基1〜24)は下線が施されており、細胞外ドメインのアミノ酸残基(ECD、アミノ酸残基25〜645)は太字で強調されている。EGFRの切断された野生型ECD(本明細書ではEGFR(1〜525)とも呼ばれる)は、配列番号12のアミノ酸1〜525と等価である。野生型EGFRの成熟型は、シグナルペプチドなしのタンパク質、すなわち、配列番号12のアミノ酸残基25〜1210に一致する。
ヒトEGFRのECDのアミノ酸配列は配列番号13として下に提供されており、シグナル配列(下線部)を含む。
EGFRの全体構造は図1に記載されている。EGFRのECDは4つのドメインを有する(Cochranら、(2004)J.Immunol.Methods、287、147〜158頁)。ドメインI及びIIIは、リガンドに対する高親和性結合部位の形成に寄与すると示唆されてきた。ドメインII及びIVは、タンパク質フォールディングを安定化し可能なEGFR二量体境界面を含有するシステイン豊富なラミニン様領域である。図は、Ab1及びAb2が結合している領域をさらに示している。Ab1は、配列番号15で提供される重鎖可変領域(VH)配列(それぞれ配列番号16、17及び18に示されているCDRH1、CDRH2及びCDRH3セットを有する)及び配列番号7で提供される軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列(それぞれ配列番号8、9及び10に示されているCDRL1、CDRL2及びCDRL3セットを有する)を有するヒト化EGFR抗体である。Ab2は、セツキシマブの同じ6つのCDRアミノ酸配列を有する抗体である。
EGFR変異体は、EGFR遺伝子増幅に伴う遺伝子再構成から生じる場合がある。EGFRvIIIはヒトがんにおいてEGFRの最もよく生じる変異体である(Kuanら、Endocr Relat Cancer.8(2):83〜96頁(2001))。遺伝子増幅の進行中、267アミノ酸欠失がEGFRの細胞外ドメインで起こり、グリシン残基が融合接合部で挿入されている。したがって、EGFRvIIIは野生型EGFRの細胞外ドメインのアミノ酸6〜273を欠き、接合部にグリシン残基挿入を含む。EGFRのEGFRvIII変異体は、グリシンが欠失接合部に挿入されている細胞外ドメインに267アミノ酸残基の欠失を含有する。EGFRvIIIアミノ酸配列は配列番号14として下に示されている(ECDは太字で強調されておりシグナル配列は下線が施されている)。
EGFRvIIIは、構成的シグナル伝達を通じてリガンド非依存的に腫瘍進行に寄与する。EGFRvIIIは正常な組織において発現されることは知られていない(Wikstrandら、Cancer Research 55(14):3140〜3148頁(1995);Olapade−Olaopaら、Br J Cancer.82(1):186〜94頁(2000))が、腫瘍細胞において、特に、多形神経膠芽腫において著しい発現を示す(Wikstrandら、Cancer Research 55(14):3140〜3148頁(1995);Geら、Int J Cancer.98(3):357〜61頁(2002);Wikstrandら、Cancer Research 55(14):3140〜3148(1995);Moscatelloら、Cancer Res.55(23):5536〜9頁(1995);Garcia de Palazzoら、Cancer Res.53(14):3217〜20(1993);Moscatelloら、Cancer Res.55(23):5536〜9頁(1995);and Olapade−Olaopaら、2(1):186〜94頁(2000))。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」(Ab)とは、特定の抗原、すなわち、hEGFRに特異的に結合する、又はこれと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子のことである。抗体は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方に、高頻度可変領域としても知られる相補性決定領域(CDR)を含む。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク(FR)と呼ばれる。当技術分野で知られているように、抗体の高頻度可変領域を描写するアミノ酸位置/境界は、文脈及び当技術分野で公知の種々の定義に応じて変動することがある。可変領域内の一部の位置は、これらの位置が基準の1つのセットの下では高頻度可変領域内にあると見なすことができ、基準の異なるセットの下では高頻度可変領域の外側にあると見なされる点で、ハイブリッド高頻度可変位置と見なされる場合がある。これらの位置のうちの1つ以上は、伸長された高頻度可変領域に見出すことも可能である。天然の重及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれが、大部分が、3つのCDRにより連結された、βシート立体構造をとることにより、4つのFR領域を含み、この3つのCDRは、βシート構造を連結し、いくつかの場合にはβシート構造の一部を形成するループを形成する。それぞれの鎖中のCDRはFR領域により極めて接近して互いに保持され、もう一方の鎖由来のCDRと一緒に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health、Bethesda、Md.1987年)を参照されたい。本明細書で使用される場合、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、別段に指示がなければ、Kabatらの免疫グロブリンアミノ酸残基番号付け方式に従って行われる。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野で利用可能な又は公知であるいかなる手段によっても、任意の真核、原核又はファージクローンを含む、単一クローンに由来する。本開示に関して有用であるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組合せの使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技法を使用して調製することが可能である。ヒトにおける抗EGFR抗体を含むADCのインビボ使用を含む、本開示の多くの使用において、キメラ、霊長類化、ヒト化又はヒト抗体は好適に使用可能である。実施形態では、本開示の抗EGFR抗体はヒト化されている。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、CDR領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのCDR領域と一致し、FR領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の一部も含むことが可能である。抗体ヒト化の方法は当技術分野では公知である。
本開示の抗EGFR ADCは、EGFRに特異的に結合することができる完全長(無傷の)抗体分子を含んでいてもよい。実施形態では、本開示のADCは完全長Ab1(S239C)抗体を含む。
用語「細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤」は、本明細書で使用される場合、細胞の成長及び/若しくは複製を阻害する、並びに/又は細胞を殺傷することが知られている任意の作用物質又は薬物を指すことが意図されている。一実施形態では、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤は、ピロロベンゾジアゼピン(「PBD」)及びPBDダイマーなどの細胞浸透性DNA副溝結合剤である。
用語「抗体薬物コンジュゲート」又は「ADC」とは、1種以上の細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤に化学的に連結された抗体のことである。実施形態では、ADCは抗体、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤並びに細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を抗体に結合させる又はコンジュゲートさせることができるリンカーを含む。本開示のADCは典型的には、1、2又は3つの薬物負荷種を含む、抗体にコンジュゲートされた1〜3の細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を有する。
本明細書に開示されるADCは、抗体の立体配置に及び少なくとも一部分、立体配置をもたらすのに使用される方法に応じて、様々な化学量論的モル比で薬物分子及び抗体部分を含んでもよい。
本開示の目的では、当業者であれば、「薬物負荷」と「薬物対抗体比」(DARとも呼ばれる)は異なることを理解する。DARとは、少なくとも2つのADC分子の集団中の抗体あたりの薬物分子の平均モル比のことであり、薬物負荷とは、個々のADC分子中の抗体あたりの薬物分子のモル比のことである。薬物負荷は主に、ADCの構築及び設計に関連性を有し、DARは主に患者に投与されることになる治療ADC組成物に関連性を有する。
用語「薬物負荷(drug load)」又は「薬物負荷(drug loading)」とは、個々のADC分子中の抗体あたりの薬物分子のモル比のことである。ある特定の実施形態では、薬物負荷は1〜2、1〜4薬物分子、2〜4薬物分子、1〜3薬物分子又は2〜3薬物分子を含んでいてもよい(すなわち、前述ごとに、ADC分子の一般式はA(−L−D)nであり、nは整数又は列挙された薬物分子の範囲を表すある範囲の整数である)。
用語「薬物対抗体比」又は「DAR」とは、少なくとも2つのADC分子の集団中の抗体あたりの薬物分子の加重平均モル比のことである。操作された抗体構築物、選択システイン還元及び製作後精製などの技術により提供される相対的コンジュゲート特異性にもかかわらず、ADCの所与の集団は異なる薬物負荷(例えば、IgG1抗体の場合は1〜8にわたる)を有するADC分子を含んでもよい。すなわち、コンジュゲーションに続いて、本発明のADC組成物は、薬物負荷が異なるADCの混合物を含んでもよい。そのような集団は種々の理由で生じる場合があるが、とりわけ、バッチ間変動及び化学コンジュゲーション反応が完全に終了するまで進行することができなかった場合を含んでもよい。したがって、DARはADC集団全体(すなわち、すべてのADC分子をまとめる)についての薬物負荷の加重平均を表す。ADC集団は、優勢ではない又は好ましくないADC種(例えば、薬物負荷1、2、3又は4、等のADC)のレベルが比較的低い単一の優勢な又は好ましいADC種(例えば、薬物負荷2のADC)を含有してもよく、又はADC集団は、変動する割合の薬物負荷を有する任意の多様な種(例えば、薬物負荷2.0±0.1、±0.2、±0.3、±0.4、±0.5、等のDAR)を含有してもよい。
実施形態では、本開示のADCは、細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤(例えば、PBD)にコンジュゲートされた抗EGFR抗体、例えば、Ab1(S239C)、を含み、薬物負荷2を有する。実施形態では、本開示のADC組成物は、細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤(例えば、PBD)にコンジュゲートされた抗EGFR抗体、例えば、Ab1(S239C)、を含み、DARは約2である。
実施形態では、本開示のADCは、配列番号3、4及び5に示されるCDRセット(CDRH1、CDRH2、CDRH3)を含む重鎖可変領域、並びに配列番号8、9及び10に示されるCDRセット(CDRL1、CDRL2、CDRL3)を含む軽鎖可変領域を含む抗EGFR抗体を含む。実施形態では、抗EGFR抗体は、PBDにコンジュゲーション部位を提供するように操作されたシステイン突然変異を有する重鎖定常領域を有するIgG1アイソタイプである。実施形態では、システイン突然変異は重鎖の239位にある。実施形態では、突然変異はS239Cであり、Kabatに従って番号付けされている。本明細書に記載される、抗EGFR抗体Ab1(S239C)は、それぞれ配列番号3、4及び5に示されるCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖可変領域、並びに、それぞれ配列番号8、9及び10に示されるCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖可変領域を有する。実施形態では、抗EGFR抗体はC終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。
実施形態では、本開示のADCは、配列番号2を含む重鎖可変領域及び配列番号7を含む軽鎖可変領域を含む抗EGFR抗体を含む。実施形態では、抗EGFR抗体は、PBDにコンジュゲーション部位を提供するように操作されたシステイン突然変異を有する重鎖定常領域を有するIgG1アイソタイプである。実施形態では、システイン突然変異は重鎖の239位にある。実施形態では、突然変異はS239Cであり、Kabatに従って番号付けされている。本明細書に記載される、抗EGFR抗体Ab1(S239C)は、配列番号2を含む重鎖可変領域及び配列番号7を含む軽鎖可変領域を有する。実施形態では、本開示の抗EGFR抗体はC終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む。
実施形態では、本開示のADCは、配列番号1を含む重鎖及び配列番号6を含む軽鎖を含む抗EGFR抗体を含む。本明細書に記載される抗EGFR抗体Ab1(S239C)は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。配列番号1は、配列番号1がS239C突然変異を含有する点でのみ配列番号11とは異なる。
本明細書に記載される抗EGFR ADCの実施形態は、配列が、少なくとも1つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を変更するように改変されている抗体又は断片であってもよい。例えば、実施形態では、抗EGFR ADCは、非改変抗体と比べて少なくとも1つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を減らす、例えば、Fc受容体(FcγR)への結合を減らすように改変されてもよい。FcγR結合は、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントをFcγR相互作用に必要な特定の領域で突然変異させることにより減らしてもよい(例えば、Canfield and Morrison、1991年、J.Exp.Med.173:1483〜1491頁;and Lundら、1991年、J.Immunol.147:2657〜2662頁参照)。FcγR結合を減らして、オプソニン作用、食作用及び抗原依存性細胞傷害性(「ADCC」)などのFcγR相互作用に頼っている他のエフェクター機能を減らしてもよい。
抗EGFR ADCに含まれる抗体は、低レベルのフコースを有する、又はフコースを欠く場合がある。フコースを欠く抗体は、特に、低用量の抗体で増強されたADCC活性と相関付けられてきた。Shieldsら、2002年、J.Biol.Chem.277:26733〜26740頁;Shinkawaら、2003年、J.Biol.Chem.278:3466〜73頁を参照されたい。フコースのない抗体を調製する方法は、ラット骨髄腫YB2/0細胞(ATCC CRL 1662)での成長を含む。YB2/0細胞は低レベルのFUT8 mRNAを発現し、このmRNAは、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素である、α−1,6−フコシル基転移酵素をコードする。
抗EGFR ADCに含まれる抗体は、例えば、免疫グロブリン定常領域セグメントをFcRn相互作用に関与する特定の領域で突然変異させることにより新生児Fc受容体、FcRnに対するその結合親和性を増加させる又は減少させる改変を含んでもよい(例えば、国際公開第2005/123780号参照)。抗EGFR抗体及び/又は結合断片は、例えば、Jung&Pluckthun、1997年、Protein Engineering 10:9、959〜966頁;Yazakiら、2004年、Protein Eng.Des Sel.17(5):481〜9頁;及び米国特許出願公開第2007/0280931号に記載されているように、その高頻度可変領域の1つ以上に1つ以上のアミノ酸が挿入されていてもよい。
抗体は、例えば、国際公開第2015/143382号及び国際公開第2010/096434号に記載されているように、いくつかの技法のうちのいずれかにより産生してもよい。前記特許文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
EGFR、例えば、ヒトEGFRに対して高親和性のある抗EGFR抗体及び/又は結合断片は、治療用途に望ましい可能性がある。したがって、本開示は、EGFR、特に、ヒトEGFRに対して高結合親和性のある抗EGFR抗体及び/又は結合断片を含むADCを想定している。特定の実施形態では、抗体及び/又は結合断片は、少なくとも約100nMの親和性でEGFRに結合するが、もっと高い親和性、例えば、少なくとも約90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM、又はそれよりもずっと高い親和性を示してもよい。一部の実施形態では、抗体はEGFRに、約1pM〜約100nMの範囲の親和性で、又は前述の値のいずれかの間にわたる親和性で結合する。
EGFRに対する抗体及び/又は結合断片の親和性は、例えば、ELISA、等温滴定熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は蛍光偏光アッセイなどのしかし限定するためではない、当技術分野で周知の又は本明細書に記載される技法を使用して決定することが可能である。
抗EGFR抗体は、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版(Sambrook、Fritsch and Maniatis(eds)、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年)に記載される方法などの当技術分野で公知の標準組換えDNA法を使用して宿主細胞において免疫グロブリン軽及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製することが可能である。例えば、部分又は完全長軽及び重鎖をコードするDNAは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結され宿主細胞に形質転換されるように、発現ベクター中に挿入される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することが可能であり、又はより典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入され、当技術分野では公知の方法により達成される。抗体は化学合成によっても産生することが可能である(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、1984年 The Pierce Chemical Co.、Rockford、ILに記載される方法により)。
本開示の抗EGFR ADCは一般に、これに、こちらも同じでも異なっていてもよい1つ以上のリンカーを経て連結された同じでも異なっていてもよい1つ以上の細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を有する抗EGFR抗体(例えば、Ab1(S239C))を含む。実施形態では、抗EGFR ADCは構造式I:
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、それぞれの「D」は、その他のものとは無関係に、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(「薬物」)を表し;それぞれの「L」は、その他のものとは無関係に、リンカーを表し;「Ab」は抗EGFR抗体を表し;それぞれの「XY」はリンカー上の官能基Rxと抗原結合部分上の「補完的」官能基Ryの間に形成される連鎖を表し;nはAbに連結された薬物の数(すなわち、単一種薬物負荷)を表す。構造式(I)に従ってADCを構成しうる種々の抗EGFR抗体の特定の実施形態は上に記載されている。
[D−L−XY]n−Ab
(I)
に従った化合物、又はその塩であり、それぞれの「D」は、その他のものとは無関係に、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(「薬物」)を表し;それぞれの「L」は、その他のものとは無関係に、リンカーを表し;「Ab」は抗EGFR抗体を表し;それぞれの「XY」はリンカー上の官能基Rxと抗原結合部分上の「補完的」官能基Ryの間に形成される連鎖を表し;nはAbに連結された薬物の数(すなわち、単一種薬物負荷)を表す。構造式(I)に従ってADCを構成しうる種々の抗EGFR抗体の特定の実施形態は上に記載されている。
構造式(I)のADC又は塩の実施形態では、それぞれのDは同じである及び/又はそれぞれのLは同じである。
抗EGFR ADCを構成しうる細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(D)並びにリンカー(L)の特定の実施形態は下にさらに詳細に記載されている。
実施形態では、ADCは式(I)の構造、又はその塩を有し、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み、Lはリンカーであり、Abは配列番号1を含む抗体であり、XYはリンカーLを抗体Abに連結させる共有結合を表し、nは任意の整数である。実施形態では、nは2又は4である。実施形態では、nは2である。
実施形態では、ADCのDARとは、少なくとも2つのADC分子の集団中の抗体あたりの薬物分子の平均モル比のことである場合、DARは約2である。この文脈では、用語「約(about)」は実測値の±7.5%内の量を意味する。すなわち、「約2」は、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99、2.00、2.01、2.02、2.03、2.04、2.05、2.06、2.07、2.08、2.09、2.10、2.11、2.12、2.13、2.14、2.15及び任意の間の範囲を意味する。
本開示のADC、並びに別のADC構造体において使用しうる薬物(式IのD)及びリンカー(式IのL)に関して追加の詳細は下に記載されている。実施形態では、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤は、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、例えば、PBDダイマーである。
PBDの構造は、例えば、米国特許出願公開第2013/0028917号及び米国特許出願公開第2013/0028919号に、並びに国際公開第2011/130598号に見出すことができ、前記特許文献のそれぞれは参照によりその全体を本明細書に組み込む。PBDの包括的構造は式(II)として下に提供されている。
PBDは、その芳香族A環とピロロC環の両方で置換基の数、種類及び位置が、並びにC環の飽和の程度が異なる。B環では、一般に、DNAをアルキル化する原因になる求電子中心であるN10−C11位に、イミン(N=C)、カルビノールアミン(NH−CH(OH))又はカルビノールアミンメチルエーテル(NH−CH(OMe))が存在する。既知の天然産物のすべてが、C環からA環の方を見た場合右回りねじれを提供するキラルC11a位に(S)−立体配置を有する。本明細書で提供されるPBD例は本開示の抗EGFR抗体にコンジュゲートされていてもよい。本開示の抗EGFR抗体にコンジュゲートされてもよいPBDのさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第2013/0028917号及び米国特許出願公開第2013/0028919号に、米国特許第7,741,319号に、並びに国際公開第2011/130598号及び国際公開第2006/111759号に見出すことが可能であり、前記特許文献のそれぞれは参照によりその全体を本明細書に組み込む。
本明細書に記載される抗EGFR ADCでは、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤はリンカーを経て抗体に連結されている。リンカーは短い、長い、疎水性、親水性、柔軟な又は硬直していてもよく、リンカーが異なる特性を有するセグメントを含むように、上記の特性のうちの1つ以上を独立して有するセグメントで構成されていてもよい。リンカーは、1つよりも多い作用物質を抗体上の単一部位に共有結合させるように多価でも、又は単一作用物質を抗体上の単一部位に共有結合させるように一価でもよい。
ある特定の実施形態では、選択されるリンカーはインビボで切断可能である。切断可能なリンカーは、化学的に又は酵素的に不安定である又は分解可能な連鎖を含んでいてもよい。切断可能なリンカーは一般に、細胞質での還元、リソソームにおける酸性条件への曝露又は細胞内での特定にプロテアーゼ若しくは他の酵素による切断などの、細胞内部でのプロセスに頼って薬物を遊離させる。切断可能なリンカーは一般に、化学的に又は酵素的に切断可能である1つ以上の化学結合を組み込み、リンカーの残りは非切断性である。ある特定の実施形態では、リンカーは、ヒドラゾン及び/又はジスルフィド基などの化学的に不安定な基を含む。化学的に不安定な基を含むリンカーは、血漿と一部の細胞質区画の間で差示的特性を活用する。ヒドラゾン含有リンカーについて薬物放出を促進する細胞内条件は、エンドソーム及びリソソームの酸性環境であり、ジスルフィド含有リンカーはサイトゾルで還元され、サイトゾルは高チオール濃度、例えば、グルタチオンを含有する。ある特定の実施形態では、化学的に不安定な基近くに置換基を使用して立体障害を導入することにより、化学的に不安定な基を含むリンカーの血漿安定性を増やしてもよい。
ヒドラゾンなどの酸不安定基は、血液中性pH環境(pH7.3〜7.5)での体循環中は無傷のままであり、ADCが細胞の弱酸性エンドソーム(pH5.0〜6.5)及びリソソーム(pH4.5〜5.0)区画に内部移行した後は加水分解を受け薬物を放出する。このpH依存性放出機構は薬物の非特異的放出と関連付けられてきた。リンカーのヒドラゾン基の安定性を高めるため、リンカーは、循環での消失を最小限に抑えてリソソームでより効率的な放出を達成する調整を可能にする化学修飾、例えば、置換により変化させてもよい。
ヒドラゾン含有リンカーは、追加の酸不安定切断部位及び/又は酵素不安定切断部位などの、追加の切断部位を含有していてもよい。例示的ヒドラゾン含有リンカーを含むADCは、式(III)、(IV)及び(V)の以下の構造
リンカーに含まれてもよい他の酸不安定基は、シスアコニチル含有リンカーを含む。シスアコニチル化学はアミド結合に並置されたカルボン酸を使用して、酸性条件下でアミド加水分解を加速させる。
切断可能リンカーはジスルフィド基を含んでもよい。ジスルフィドは、生理的pHでは熱力学的に安定しており、細胞内に内部移行されると薬物を放出するように設計されており、そこではサイトゾルは細胞外環境と比べて著しく還元性の環境を提供する。ジスルフィド結合の切断には一般に、ジスルフィド含有リンカーが循環では適度に安定しており、サイトゾルでは薬物を選択的に放出するように、(還元)グルタチオン(GSH)などの、細胞質チオール補因子の存在が必要である。ジスルフィド結合を切断することができる細胞内酵素タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又は類似の酵素は、細胞内でのジスルフィド結合の優先的切断にも寄与し得る。GSHは、循環ではおおよそ5μMである著しく低濃度のGSH又は最も豊富な低分子量チオールであるシステインと比べて、0.5〜10mMの濃度範囲で細胞内に存在することが報告されている。腫瘍細胞は、不規則な血流のせいで低酸素状態になるが、還元性酵素の活性が増強され、したがって、グルタチオンの濃度がはるかに高くなる。ある特定の実施形態では、ジスルフィド含有リンカーのインビボ安定性は、リンカーの化学修飾、例えば、ジスルフィド結合に隣接する立体障害の使用により増強してもよい。
例示的ジスルフィド含有リンカーを含むADCは、式(VI)、(VII)及び(VIII)の以下の構造
使用してもよい別の種類の切断可能リンカーは、酵素により特異的に切断されるリンカーである。そのようなリンカーは典型的にはペプチドベースである又は酵素に対する基質として作用するペプチド領域を含む。ペプチドベースのリンカーは、血漿及び細胞外環境において、化学的に不安定なリンカーよりも安定している傾向がある。ペプチド結合は一般に、血清安定性が良好である。なぜならば、リソソームタンパク質分解酵素は、内在性阻害因子及び血液の不利に高いpH値のせいで、リソソームと比べて血液中では活性が極めて低いからである。抗体からの薬物の放出は、特にリソソームプロテアーゼ、例えば、カテプシン及びプラスミンの作用のせいで起こる。これらのプロテアーゼはある特定の腫瘍細胞においては上昇したレベルで存在する場合がある。
例示的実施形態では、切断可能ペプチドは、Gly−Phe−Leu−Gly、Ala−Leu−Ala−Leuなどのテトラペプチド、又はVal−Cit、Val−Ala、Met−(D)Lys、Asn−(D)Lys、Val−(D)Asp、Phe−Lys、Ile−Val、Asp−Val、His−Val、NorVal−(D)Asp、Ala−(D)Asp、Met−Lys、Asn−Lys、Ile−Pro、Me3Lys−Pro、PhenylGly−(D)Lys、Met−(D)Lys、Asn−(D)Lys、Pro−(D)Lys、Met−(D)Lys、Asn−(D)Lys、Met−(D)Lys、Asn−(D)Lysなどのジペプチドから選択される。実施形態では、切断可能ペプチドはVal−Alaである。実施形態では、リンカーは、マレイミドカプロイル−バリン−アラニン(mc−Val−Ala)リンカーである。ある特定の実施形態では、ジペプチドは、もっと長いペプチドの疎水性のせいで、もっと長いポリペプチドよりも好ましい。
ドキソルビシン、マイトマイシン、カンプトテシン、タリソマイシン及びオーリスタチン/オーリスタチンファミリーメンバーなどの薬物を抗体に連結するのに有用な様々なジペプチドベースの切断可能リンカーは記載されている(Dubowchikら、1998年、J.Org.Chem.67:1866〜1872頁;Dubowchikら、1998年、Bioorg.Med.Chem.Lett.8(21):3341〜3346頁;Walkerら、2002年、Bioorg.Med.Chem.Lett.12:217〜219頁;Walkerら、2004年、Bioorg.Med.Chem.Lett.14:4323〜4327頁;and Franciscoら、2003年、Blood 102:1458〜1465頁、Dorninaら、2008年、Bioconjugate Chemistry 19:1960〜1963頁参照、前記文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込む。)。これらのジペプチドリンカー、又はこれらのジペプチドリンカーの改変版はすべて、本明細書に記載されるADCに使用してもよい。使用してもよい他のジペプチドリンカーは、Seattle Genetics’Brentuximab Vendotin SGN−35(Adcetris(商標))、Seattle Genetics SGN−75(抗−CD−70、Val−Cit−MMAF)、Celldex Therapeutics グレンバツムマブ(CDX−011)(抗−NMB、Val−Cit−MMAE)、及びCytogen PSMA−ADC(PSMA−ADC−1301)(抗−PSMA、Val−Cit−MMAE)などのADCに見出せるリンカーを含む。
酵素的に切断可能なリンカーは、薬物を酵素的切断部位と空間的に分離するための自壊性スペーサーを含んでもよい。ペプチドリンカーへの薬物の直接結合により、薬物のアミノ酸付加体をタンパク質分解性放出させ、それによりその活性を損なうことが可能になる。自壊性スペーサーを使用すれば、アミド結合の加水分解により完全活性な化学的に修飾されていない薬物を除去することが可能になる。
1つの自壊性スペーサーは、二機能性パラアミノベンジルアルコール基であり、これはアミノ基を通じてペプチドに連結されてアミド結合を形成し、アミン含有薬物はカルバミン酸官能性を通じて、リンカーのベンジルヒドロキシル基に結合されてもいい(PABC)。得られたプロドラッグはプロテアーゼ媒介切断により活性化され、1,6−脱離反応を起こし、非修飾薬物、二酸化炭素及びリンカー基の残りを放出する。以下の図式は、p−アミドベンジルエーテルの断片化及び薬物の放出を描いており:
この自壊性基の複素環式変異体も記載されている。例えば、米国特許第7,989,434号を参照されたい。この特許文献は参照により本明細書に組み込む。
一部の実施形態では、酵素的切断可能リンカーはβグルクロン酸ベースのリンカーである。薬物の容易な放出は、リソソーム酵素βグルクロニダーゼによるβグルクロニドグリコシド結合の切断を通じて実現してもよい。この酵素は、リソソーム内に豊富に存在しており、一部の腫瘍型では過剰発現され、細胞外での酵素活性は低い。βグルクロン酸ベースのリンカーを使用して、βグルクロニドの親水性のせいでADCが凝集を受ける傾向を回避してもよい。一部の実施形態では、βグルクロン酸ベースのリンカーは、疎水性薬物に連結されたADCのリンカーとして好ましい。以下の図式は、βグルクロン酸ベースのリンカーからの薬物の放出及びβグルクロン酸ベースのリンカーを含有するADCを描いている。
オーリスタチン、カンプトテシン及びドキソルビシン類似物、CBI副溝結合剤、並びにプシンベリンなどの薬物を抗体に連結させるのに有用な様々な切断可能βグルクロン酸ベースのリンカーは記載されている(Nolting、Chapter 5「Linker Technology in Antibody−Drug Conjugates」、In:Antibody−Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology、1045巻、71〜100頁、Laurent Ducry(Ed.)、Springer Science&Business Medica、LLC、2013年;Jeffreyら、2006年、Bioconjug.Chem.17:831〜840頁;Jeffreyら、2007年、Bioorg.Med.Chem.Lett.17:2278〜2280頁;and Jiangら、2005年、J.Am.Chem.Soc.127:11254〜11255頁参照、前記文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込む。)。これらのβグルクロン酸ベースのリンカーはすべて、本明細書に記載される抗EGFR ADCにおいて使用してよい。
一実施形態では、本開示のADCに使用されるリンカーは、式(IX)、YはValであり、ZはAlaであり、Dは薬物(例えば、PBDダイマー)であり、qは1、2、3、4、5、6、7又は8である:
一態様では、本開示はリンカー経由で抗体に連結されている細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を含むADCを記載しており、抗体薬物コンジュゲートは、構造式(I)に従った化合物又はその塩であり、Dはピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを含み;Lはリンカーであり;Abは配列番号1を含む抗体であり;XYはリンカーLを抗体Abに連結させる共有結合を表し;nは任意の整数である。一実施形態では、XYはリンカーLを抗体Abに連結させる共有結合を表し、XYは抗体Ab上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。別の実施形態では、XYはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。
ある特定の実施形態では、本開示のADCは、式(X)の構造:
実施形態では、本開示のADCは、式(X)の構造、
実施形態では、本開示のADCは、式(X)の構造、
本開示のADCは、当技術分野で公知の化学を使用して合成してもよい。選択される化学は、とりわけ、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤(複数可)の正体、リンカー並びに抗体にリンカーを結合させるのに使用される基に依存することになる。一般的に、式(I)に従ったADCは以下の図式:
D−L−RX+Ab−RY→[D−L−XY]n−Ab
(Ia) (Ib) (I)
に従って調製してもよく、D、L、Ab、XY及びnは以前に上で定義されており、RX及びRYは、上で考察したように、互いと共有結合を形成することができる補完的基を表す。
D−L−RX+Ab−RY→[D−L−XY]n−Ab
(Ia) (Ib) (I)
に従って調製してもよく、D、L、Ab、XY及びnは以前に上で定義されており、RX及びRYは、上で考察したように、互いと共有結合を形成することができる補完的基を表す。
基RX及びRYの正体は、シントンD−L−RXを抗体に連結するのに使用される化学に依存することになる。一般的に、使用される化学は、抗体の完全性、例えば、その標的に結合する能力を変更すべきではない。好ましくは、コンジュゲートされた抗体の結合特性はコンジュゲートされていない抗体の結合特性と酷似している。分子を抗体などの生体分子にコンジュゲートさせるための様々な化学及び技法は、当技術分野では公知であり、特に抗体にコンジュゲートさせるための様々な化学及び技法は周知である。例えば、Amonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、in:Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら、Eds.、Alan R.Liss、Inc.、1985年;Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、in:Controlled Drug Delivery、Robinsonら、Eds.、Marcel Dekker、Inc.、第2版、1987年;Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」in:Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら、Eds.、1985年;「Analysis、Results、and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」in:Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら、Eds.、Academic Press、1985年;Thorpeら、1982年、Immunol.Rev.62:119〜58頁;国際公開第89/12624号を参照されたい。これらの化学はいずれもシントンを抗体に連結するのに使用しうる。
シントンを接近可能なリジン残基に連結するのに有用ないくつかの官能基RX及び化学は知られており、例として及び限定せずにNHS−エステル及びイソチオシアネートを含む。
シントンをシステイン残基の接近可能な遊離のスルフヒドリル基に連結するのに有用ないくつかの官能基RX及び化学は知られており、例として及び限定せずにハロアセチル及びマレイミドを含む。
しかし、コンジュゲーション化学は利用可能な側鎖基に限定されない。アミンなどの側鎖は、適切な小分子をアミンに連結することにより、ヒドロキシルなどの他の有用な基に変換してもよい。この戦略を使用すれば、多機能性小分子を抗体の接近可能なアミノ酸残基の側鎖にコンジュゲートすることにより、抗体上の利用可能な連結部位の数を増やすことが可能である。次に、シントンをこれらの「変換された」官能基に共有結合させるのに適した官能基RXはシントンに含まれている。
抗体はコンジュゲーションのためのアミノ酸残基を含むように操作されていてもよい。シントンを非コードアミノ酸に連結するのに有用である化学及び官能基と同様に、ADCという文脈で薬物をコンジュゲートするのに有用である遺伝的にコードされていないアミノ酸残基を含むように抗体を操作するためのアプローチはAxupら、2012年、Proc Natl Acad Sci U S A.109(40):16101〜16106頁により記載されている。
典型的には、シントンは、例えば、接近可能なリジン残基の一次アミノ基又は接近可能なシステイン残基のスルフヒドリル基を含む、抗体のアミノ酸残基の側鎖に連結される。遊離のスルフヒドリル基は、鎖内ジスルフィド結合を還元することにより得てもよい。
RYがスルフヒドリル基である連鎖では(例えば、RXがマレイミドである場合)、抗体は一般的に、先ず完全に又は部分的に還元されて、システイン残基間の鎖内ジスルフィド架橋を破壊する。特定のシステイン残基及び鎖間ジスルフィド架橋は、抗体重鎖に存在する場合、スルフヒドリル基へのコンジュゲーションに適した基を含む薬物−リンカーシントンの結合のために還元してもよく、例として及び限定せずに、ヒトIgG1重鎖状の残基C233、C239及びC242(Kabat番号付け方式;残基C220、C226及びC229Eu番号付けに対応する)並びにヒトIgカッパ軽鎖上の残基C214(Kabat番号付け方式)を含む。しかし、抗体重鎖が結合部位にシステイン残基を含有しない場合には、抗体は、所与の位置、例えば、239位にシステインを含有するように操作することが可能である。
シントン結合のための、ジスルフィド架橋に関与していないシステイン残基を、1つ以上のコドンの突然変異により抗体中に操作してもよい。これらの不対システインを還元するとコンジュゲーションに適したスルフヒドリル基が得られる。操作されたシステインを組み込むのに好ましい位置は、例として及び限定せずに、ヒトIgG1重鎖上の位置S112C、S113C、A114C、S115C、A176C、S180C、S239C、S252C、V286C、V292C、S357C、A359C、S398C、S428C(Kabat番号付け)及びヒトIgカッパ軽鎖上の位置V110C、S114C、S121C、S127C、S168C、V205C(Kabat番号付け)を含む(例えば、米国特許第7,521,541号、米国特許第7,855,275号及び米国特許第8,455,622号参照)。一実施形態では、残基S239(Kabat番号付け方式)はシステインに突然変異され、抗体Ab1へのPBDのコンジュゲーションを可能にする。この突然変異は本明細書では「S239C」と呼ばれる。
ある特定の実施形態では、本開示のADCは、操作されたシステインを介して薬物負荷2を有する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ADCを作成する方法であって、それぞれ配列番号1及び6に示される抗体重鎖及び軽鎖を、構造式(Ia)に従ったシントンに接触させることを含む方法を特色とし、Dは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤であり、Lはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、RXは、シントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下で、シントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、Dは、例えば、PBDダイマーである。
当業者であれば認識するように、抗体分子に連結される細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤の数は、ADC調製物が不均一な性質であり、調製物中の一部の抗体は1つの連結された作用物質、一部は2つ、一部は3つ、等を含有する(及び一部はない)ように、変動してもよい。不均一の程度は、とりわけ、細胞傷害性及び/又は細胞分裂阻害剤を連結するのに使用される化学に依存することになる。例えば、抗体が還元されて結合のためのスルフヒドリル基を生じる場合、1分子あたりゼロ、2、4、6又は8個の連結された作用物質を有する抗体の不均一な混合物が産生されることが多い。さらに、結合化合物のモル比を制限することにより、1分子あたりゼロ、1、2、3、4、5、6、7又は8個の連結された作用物質を有する抗体が産生されることが多い。したがって、文脈次第で、所定の薬物抗体比(DAR)は抗体のコレクションについての平均でもよいことは理解される。例えば、「DAR4」とは、特定のDARピークを単離するための精製を受けたことがなく、抗体あたり異なる数の細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が結合しているADC分子の不均一な混合物を含むが(例えば、抗体あたりの単一種薬物負荷が、0、2、4、6、8の阻害剤)、4の平均薬物対抗体比を有するADC調製物のことである。
不均一なADC調製物は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー(「HIC」)により処理して、目的の特定のDAR(又は2つ以上の特定のDARの混合物)を有するADCが濃縮された調製物を得てもよい。そのような濃縮された調製物は本明細書では「EX」と名付けられ、「E」は、ADC調製物が処理されて特定の薬物負荷を有するADCが濃縮されていることを示し、「X」は、ADC分子あたりの連結された細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤の数を表す。2つの特定のDARを有するADCの混合物が濃縮された調製物は「EX/EY」、3つの特定のDARは「EX/EY/EZ」、等と名付けられ、「E」はADC調製物が処理されて特定の薬物負荷を濃縮していることを示しており、「X」、「Y」及び「Z」は濃縮された薬物負荷を表す。特定の例として、「E2」とは、濃縮されて、主にADC分子あたり2つの細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が連結されているADCを含有するADC調製物のことである。「E4」とは、濃縮されて、主にADC分子あたり4つの細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が連結されているADCを含有するADC調製物のことである。「E2/E4」とは、濃縮されて、1つはADC分子あたり2つの細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が連結されており、もう1つはADC分子あたり4つの細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が連結されている2つのADC集団を主に含有するADC調製物のことである。
本明細書で使用される場合、濃縮された「E」調製物は一般に、所定のADC種で少なくとも約80%純粋であるが、少なくとも約85%、90%、95%、98%又はそれよりもはるかに高い純度などのもっと高いレベルの純度が入手可能であり、望ましい場合がある。例えば、「EX」調製物は一般に、ADC分子あたりXの細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が連結されているADCでは少なくとも約80%純粋になる。例えば、「EX/EY」調製物などの、もっと高次の濃縮調製物では、ADC分子あたりXとYの細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が連結されているADCの総数は一般に、調製物中全ADCの少なくとも約80%を占める。同様に、濃縮「EX/EY/EZ」調製物では、ADC分子あたりX、YとZの細胞分裂阻害剤及び/又は細胞傷害性剤が連結されているADCの総数は、調製物中全ADCの少なくとも約80%を占める。
当技術分野では公知であるように、純度は様々な方法により評価しうる。特定の例として、ADC調製物はHPLC又は他のクロマトグラフィーにより分析し、得られたピークの曲線下の面積を分析することにより純度を評価してもよい。
実施形態では、本開示は、薬物負荷2を有するAb1(S239C)−PBD ADCを含む不均一な組成物を含み、DAR E2種は組成物中すべてのADCの>80%(>80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセント)で存在している。例えば、実施形態では、適用は、2のDAR(DAR E2)を有するAb1(S239C)−PBD ADCを含む不均一な組成物を含み、DAR E2種は組成物中すべてのADCの集団の>85%(>85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセント)で存在している。実施形態では、適用は、2のDAR(DAR E2)を有するAb1(S239C)−PBD ADCを含む不均一な組成物を含み、DAR E2種は組成物中すべてのADCの集団の>90%(>90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセント)で存在している。
ある特定の実施形態では、本開示のADCのDARは約2又は約4である。さらなる実施形態では、本開示のADCのDARは約2である。
本明細書に記載されるADCは、ADC並びに1つ以上の担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含む医薬組成物の形態でもよい。組成物は、獣医用途又はヒトにおける医薬用途のためなどの、特定の用途のために処方してもよい。
配列の簡単な説明
配列番号1から配列番号20まで通して含む、Sequence_Listing_12390と表題を付けた配列表は参照によりその全体を本明細書に組み込み、この配列表には本明細書で開示される核酸及び/又はアミノ酸配列を含む。配列表は、本明細書に添えてASCIIテキスト形式で提出している。配列表は最初、2018年9月4日に作成し、サイズは45.1KBである。
配列番号1から配列番号20まで通して含む、Sequence_Listing_12390と表題を付けた配列表は参照によりその全体を本明細書に組み込み、この配列表には本明細書で開示される核酸及び/又はアミノ酸配列を含む。配列表は、本明細書に添えてASCIIテキスト形式で提出している。配列表は最初、2018年9月4日に作成し、サイズは45.1KBである。
以下の実施例は、抗EGFR ADCの例示的実施形態のある特定の特色及び特性に光を当てているが、限定ではなく、説明の目的で提供されている。
別段に記載されていなければ、実施例に記載されるPBD ADCのおおよそのDARは約2である。
実施例1:抗EGFR Ab1(S239C)の作成
抗体1(Ab1、ABT−806又はデパツキシズマブとしても知られる)は、国際公開第2010/096434号に記載される通りに開発されたヒト化抗EGFR抗体であり、前記特許文献の全開示は参照によりその全体を本明細書に組み込む。Ab1の軽鎖アミノ酸配列は下で配列番号6に提供されている。軽鎖可変領域はイタリック体にされており(配列番号7)、Ab1のVL CDRアミノ酸配列は下線が施され以下の通りである:
HSSQDINSNIG(VL CDR1;配列番号8);HGTNLDD(VL CDR2;配列番号9);及びVQYAQFPWT(VL CDR3;配列番号10)。
抗体1(Ab1、ABT−806又はデパツキシズマブとしても知られる)は、国際公開第2010/096434号に記載される通りに開発されたヒト化抗EGFR抗体であり、前記特許文献の全開示は参照によりその全体を本明細書に組み込む。Ab1の軽鎖アミノ酸配列は下で配列番号6に提供されている。軽鎖可変領域はイタリック体にされており(配列番号7)、Ab1のVL CDRアミノ酸配列は下線が施され以下の通りである:
HSSQDINSNIG(VL CDR1;配列番号8);HGTNLDD(VL CDR2;配列番号9);及びVQYAQFPWT(VL CDR3;配列番号10)。
Ab1の軽鎖可変領域は下に配列番号7として提供されている。
Ab1の重鎖アミノ酸配列は配列番号11に記載されている。重鎖可変領域はイタリック体にされており(配列番号2)、VH CDRアミノ酸配列は下線が施されており以下の通りである:GYSISSDFAWN(VH CDR1;配列番号3;YISYSGNTRYQPSLKS(VH CDR2;配列番号4);及びAGRGFPY(VH CDR3;配列番号5)。
Ab1の重鎖可変領域は下に配列番号2として提供されている。
Ab1は、弾頭PBDの部位特異的コンジュゲーション部位を操作するために改変した。具体的には、操作されたシステイン抗体(C239)は、薬物負荷2を有するPBDダイマーの部位特異的コンジュゲーションを可能にするため当技術分野で公知の一般的な技法を使用して作成された。この突然変異された抗体は本明細書ではAb1(S239C)と呼ばれ、Ab1軽鎖及び改変されたAb1(C239)重鎖配列を含む。Ab1(S239C)の重鎖アミノ酸配列は下で配列番号1に記載されている。可変領域(配列番号2)はイタリック体にされており、CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)(配列番号3〜5)は下線を施され、以下の通りである:GYSISSDFAWN(VH CDR1;配列番号3;YISYSGNTRYQPSLKS(VH CDR2;配列番号4);及びAGRGFPY(VH CDR3;配列番号5)。
Ab1(S239C)の重鎖定常領域は、その親抗体Ab1と比べて改変された残基を含有する。具体的には、残基239(Kabat番号付け)は、Ab1の重鎖と比べてSからCに突然変異された。この残基は上の配列番号1では下線が施され/太字にされている。S239C(Kabat番号付け)は、配列番号1のアミノ酸残基238(S238C)に対応していることに留意すべきである。
AbA(S239C)の軽鎖アミノ酸配列(配列番号6)は下に提供されており、CDR1、CDR2及びCDR3(それぞれ配列番号8、9及び10)は下線が施されており、可変領域(配列番号7)はイタリック体にされている。
Ab1(S239C)は、下の実施例2に記載されているように、PBDダイマーにさらにコンジュゲートされてADCとして試験された。
もう1つの抗体AbAは、例えば、米国特許第9,493,568号に記載のAb1変異体についてのスクリーニングにおいて同定されたもので、前記特許文献は参照によりその全体を本明細書に取り込む。Ab1変異体抗体AbAのVH領域のアミノ酸配列は下に提供されている。CDRは下線が施され、Ab1と比べたアミノ酸変化は太字で強調されている。
AbA VH
AbAは、同じCDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列(それぞれ配列番号8〜10)を含めて、Ab1と同じ軽鎖及び可変軽鎖配列(それぞれ配列番号6及び配列番号7)を有する。
AbAのVHアミノ酸配列は上で配列番号15に提供されている。AbAのVH CDRアミノ酸配列は以下の通りである:GYSISRDFAWN(CDR1;配列番号16);YISYNGNTRYQPSLKS(CDR2;配列番号17);及びASRGFPY(CDR3;配列番号18)。図3及び図4は、Ab1及びAbAのVH及びVL領域のアミノ酸配列(図3)並びに完全重及び軽鎖(図4)のアライメントを提供している。AbAの重鎖アミノ酸配列は配列番号20に記載されている。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)は下線が施されており、可変領域はイタリック体にされている。
抗EGFR抗体AbAの同定に続いて、抗体は、弾頭PBDの部位特異的コンジュゲーション部位を操作するために改変された。具体的には、操作されたシステイン抗体(C239)は、薬物負荷2を有するPBDダイマーの部位特異的コンジュゲーションを可能にするため当業者の一般的な技法を使用して作成された。この突然変異された抗体は本明細書ではAbA(S239C)と呼ばれ、AbA軽鎖及び改変されたAbA(C239)重鎖配列を含む。AbA(S239C)の重鎖アミノ酸配列は下で配列番号19に記載されている。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)は下線を施され、可変領域はイタリック体にされている。
AbA(S239C)の軽鎖アミノ酸配列は配列番号6で提供されている。
実施例2:PBDコンジュゲートの作成及び生理化学的特徴付け
Ab1(S239C)−PBDは、Cys操作された抗EGFR抗体Ab1にコンジュゲートされた2つのPBD薬物−リンカー分子で構成されている。PBD及びリンカーの構造は図2に記載されている。図2はAb1(S239C)−PBDを調製する工程も記載している。コンジュゲーション工程は、鎖間ジスルフィドの還元、量的酸化及び過剰なPBD薬物リンカーとのコンジュゲーションを含んでいた。コンジュゲーション工程は操作されたジスルフィドと鎖間ジスルフィドの両方の量的還元からなっていた。次に、還元混合物は精製して過剰な試薬及びその副産物を取り除き、続いて鎖間ジスルフィドの量的酸化、次に過剰なPBD薬物リンカーとのコンジュゲーションを行った。クエンチング後、反応混合物を精製しバッファー交換して、>87%DAR2薬物負荷のAb1(S239C)−PBDを得た。精製後のAb1(S239C)−PBD ADCの全収率はおおよそ90%であった。コンジュゲーション工程には、おおよそ2.5%wt負荷(約2g)のPBD薬物リンカーが必要であった。
Ab1(S239C)−PBDは、Cys操作された抗EGFR抗体Ab1にコンジュゲートされた2つのPBD薬物−リンカー分子で構成されている。PBD及びリンカーの構造は図2に記載されている。図2はAb1(S239C)−PBDを調製する工程も記載している。コンジュゲーション工程は、鎖間ジスルフィドの還元、量的酸化及び過剰なPBD薬物リンカーとのコンジュゲーションを含んでいた。コンジュゲーション工程は操作されたジスルフィドと鎖間ジスルフィドの両方の量的還元からなっていた。次に、還元混合物は精製して過剰な試薬及びその副産物を取り除き、続いて鎖間ジスルフィドの量的酸化、次に過剰なPBD薬物リンカーとのコンジュゲーションを行った。クエンチング後、反応混合物を精製しバッファー交換して、>87%DAR2薬物負荷のAb1(S239C)−PBDを得た。精製後のAb1(S239C)−PBD ADCの全収率はおおよそ90%であった。コンジュゲーション工程には、おおよそ2.5%wt負荷(約2g)のPBD薬物リンカーが必要であった。
Cys操作された抗EGFR抗体Ab1(S239C)にコンジュゲートされた2つのPBD薬物リンカー分子で構成されたAbA(S239C)−PBDも、上に記載され図2に示される工程に従って調製された。
実施例3:フローサイトメトリー分析
PBDへのCys操作されたAb1(S239C)のコンジュゲーションは、親抗体Ab1と比べて結合特性を変更しないことを確かめるため、フローサイトメトリーベースのアッセイを、野生型EGFR又は、Ab1及びAbAにより認識される潜在エピトープを露出させることが知られている点突然変異体である、EGFRのCA突然変異版(EGFRC271A、C283A)を発現するように操作されたNR6ヒト線維芽細胞を用いて実施した。
PBDへのCys操作されたAb1(S239C)のコンジュゲーションは、親抗体Ab1と比べて結合特性を変更しないことを確かめるため、フローサイトメトリーベースのアッセイを、野生型EGFR又は、Ab1及びAbAにより認識される潜在エピトープを露出させることが知られている点突然変異体である、EGFRのCA突然変異版(EGFRC271A、C283A)を発現するように操作されたNR6ヒト線維芽細胞を用いて実施した。
図5は、抗体Ab1及びAbA、これらの対応するS239C変異型Ab1(S239C)及びAbA(S239C)、並びにこれらのPBDコンジュゲートAb1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDのフローサイトメトリー分析を示す。増加する濃度の抗体を、野生型EGFR過剰発現(図5A)及びEGFR CA突然変異体過剰発現(図5B)NR6細胞に添加した。図5に示される結果は、PBDへのCys操作されたAb1のコンジュゲーション(又はPBDへのCys操作されたAbAのコンジュゲーション)は、親抗体と比べて結合特性を変更しないことを示している。
実施例4:Ab1(S239C)−PBD ADC対Ab1−MMAF ADCのインビトロ比較
Ab1(S239C)−PBDの細胞障害活性は、AbA(S239C)−PBDと共に、細胞殺傷アッセイにおいて異なるレベルの表面EGFRを発現する腫瘍細胞株のパネルに対して評価した。この分析において使用される細胞上のEGFR数は、図6にいくつかの他のEGFR過剰発現細胞株と比べて示されている。A431は、EGFRが増幅されている(>2×106受容体/細胞)類表皮癌細胞株である。SW−48は、EGFRを発現する(細胞あたり>200,000受容体;IHC Hスコア228)結腸直腸腺癌細胞株であり;NCI−H441は、EGFR発現が中程度から低いまで(細胞あたり約100,000受容体;IHC Hスコア150)の肺腺腫異種移植片モデルであり、LoVoは、EGFR発現がもっと低い(細胞あたり<100,000受容体;IHC Hスコア140)KRAS突然変異結腸直腸腺癌である(図6)。図7の結果は、対応するオーリスタチンコンジュゲート(Ab1−MMAF ADC、すなわち、微小管破壊剤モノメチルオーリスタチンFに連結されているAb1)と比べてPBDコンジュゲートAb1(S239C)−PBDの処置に続く3つの細胞株すべてにおいて改善された細胞傷害活性を示している。図7は、AbA(S239C)−PBD及び対応するオーリスタチンコンジュゲート、AbA−MMAEの細胞障害活性をさらに示す。
Ab1(S239C)−PBDの細胞障害活性は、AbA(S239C)−PBDと共に、細胞殺傷アッセイにおいて異なるレベルの表面EGFRを発現する腫瘍細胞株のパネルに対して評価した。この分析において使用される細胞上のEGFR数は、図6にいくつかの他のEGFR過剰発現細胞株と比べて示されている。A431は、EGFRが増幅されている(>2×106受容体/細胞)類表皮癌細胞株である。SW−48は、EGFRを発現する(細胞あたり>200,000受容体;IHC Hスコア228)結腸直腸腺癌細胞株であり;NCI−H441は、EGFR発現が中程度から低いまで(細胞あたり約100,000受容体;IHC Hスコア150)の肺腺腫異種移植片モデルであり、LoVoは、EGFR発現がもっと低い(細胞あたり<100,000受容体;IHC Hスコア140)KRAS突然変異結腸直腸腺癌である(図6)。図7の結果は、対応するオーリスタチンコンジュゲート(Ab1−MMAF ADC、すなわち、微小管破壊剤モノメチルオーリスタチンFに連結されているAb1)と比べてPBDコンジュゲートAb1(S239C)−PBDの処置に続く3つの細胞株すべてにおいて改善された細胞傷害活性を示している。図7は、AbA(S239C)−PBD及び対応するオーリスタチンコンジュゲート、AbA−MMAEの細胞障害活性をさらに示す。
本開示の目的では、「Ab1−MMAF」とは、切断不可能マレイミドカプロイルリンカーを介してオーリスタチン弾頭モノメチルオーリスタチンFにコンジュゲートされているヒト化IgG1抗体Ab1を有する抗体−薬物コンジュゲート(ADC)のことである。別段記載されなければ、本開示の実施例において使用されるAb1−MMAF ADCは約3.8のDARを有することに留意すべきである。本開示の目的では、「AbA−MMAE」又は(「AbA−vcMMAE」)とは、切断可能バリン−シトルリン(VC)リンカーを介してオーリスタチン弾頭モノメチルオーリスタチンEにコンジュゲートされているAbAを含む、オーリスタチンベースのADCのことである。別段記載されなければ、本開示の実施例において使用されるAbA−MMAE ADCは約3のDARを有することに留意すべきである。
Ab1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDも、異なるレベルのEGFRを発現している22の結腸直腸がん細胞株のパネルの成長を阻害するその能力について評価した(表1)。細胞増殖アッセイにおける、ADCの感受性は、オーリスタチンADC Ab1−MMAF及びAbA−MMAEと共に、IC50値により示される。この研究で使用されるAbA(S239C)−PBD及びAb1(S239C)−PBDコンジュゲートは>85%のDAR2薬物負荷を含有する。
マイクロチューブリン阻害剤は、EGFR陽性結腸直腸腫瘍を含む一部の疾患状況において有意な有効性を示していない。Perez EA.Microtubule Inhibitors:Differentiating tubulin−inhibiting agents based on mechanisms of action、clinical activity、and resistance.Mol Cancer Ther 2009年;8(8):2086〜95頁を参照されたい。IHC分析は、>25%のCRCがEGFRを発現することを示しており、CRCはいくつかのEGFRベースの治療についての承認された徴候である。Mendelsohn J、Baselga J.Epidermal growth factor receptor targeting in cancer.Semin Oncol 2006年;33(4):369〜85頁;Herbst RS、Kim ES、Harari PM.IMC−C225、an anti−epidermal growth factor receptor monoclonal antibody、for treatment of head and neck cancer.Expert Opin Biol Ther 2001年;1(4):719〜32頁;Lynch DH、Yang XD.Therapeutic potential of ABX−EGF:a fully human anti−epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for cancer treatment.Semin Oncol 2002年;29(1 Suppl 4):47〜50頁を参照されたい。
表1に示されるように、細胞株の大半は、一般に>100nmのIC50値を有する、対応するオーリスタチンコンジュゲート(Ab1−MMAF ADC及びAbA−MMAE ADC)には大いに非感受性であったが(SW48及びSK−O−1を除いて)、AbA(S239C)−PBD及びAb1(S239C)−PBDは細胞成長を阻害するのにはるかに効果的であった。細胞成長の阻害はEGFR発現レベルとは相関しておらず、本開示のPBD ADCは低EGFR発現結腸直腸腫瘍細胞株に対して効果的である可能性があることが示唆される。EGFリガンド誘導自己分泌活性化及びAbAエピトープの露出の対応する増加も、これら腫瘍細胞株の一部の感受性に寄与している可能性がある。非ターゲティングPBD ADC対照も選ばれた腫瘍細胞株に対してある程度の抑制活性を有していたが、全体ではその活性は、EGFRターゲティングPBDを用いて観察された活性と比べると有意に減少していた。要約すると、これらの結果は、EGFR−PBD ADCの活性が、オーリスタチンベースのADCには大いに非感受性である低レベル及び中程度レベルのEGFR発現結腸直腸腫瘍まで及ぶ可能性があることを示している。
EGFR−PBD ADC AbA(S239C)−PBD及びAb1(S239C)−PBDの活性は、ヒト神経膠芽腫(GBM)腫瘍細胞株のパネルに対しても評価された。
表2に示されるように、AbA−MMAE及びAb1 MMAFはこれらの腫瘍細胞株の増殖を阻害するのが大部分無効であった。なぜならば、このパネルに含まれる細胞株は増幅されたEGFRがないからである(U87MGde2−7を除いて)。これらの腫瘍細胞株上で発現されたEGFRのレベルはさらに低いにもかかわらず、PBDコンジュゲートAb1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDは効力が改善されており、EGFR−PBDコンジュゲートは、EGFR増幅又は過剰発現腫瘍以上にGBMに活性がある可能性があるという所見と一致している。
実施例5:EGFR ADCのインビボ特徴付け
EGFR−PBD ADC Ab1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDのインビボ有効性は、EGFRの発現レベルが変化する腫瘍モデルにおいて判定した。
EGFR−PBD ADC Ab1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDのインビボ有効性は、EGFRの発現レベルが変化する腫瘍モデルにおいて判定した。
NCI−H441は、図6に示されるように、中程度から低EGFR発現の肺腺腫異種移植片モデルである。図8Aは、肺腺癌NCI−H441におけるAb1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDの有効性を示している。丸カッコ内の数はmg/kgでの用量を表し、矢印は投与日を表す。図8に示されているように、AbA(S239C)−PBD及びAb1(S239C)−PBDは、7日毎に1回0.3mg/kgで合計6用量投与され(Q7Dx6)、動物の100%において完全及び永続的退縮を誘導し、図8Aに示されているように、10倍の高用量(3mg/kg)Q7Dx6で投与されたAb1−MMAFは動物の40%において完全奏功を誘導しなかった。完全奏功(CR)は、少なくとも3回の連続測定について25mm3未満の腫瘍量と定義される。Ab1−MMAF処置に続いてすべての腫瘍が最終的に再発した。負の対照ADCであるAb095−PBDも動物の100%において永続的及び完全奏功を誘導した。この感受性は、他のADCの場合に観察されたが、腫瘍関連抗原の認識というよりもNCI−H441腫瘍におけるPBD感受性と抗体蓄積の組合せからの増強された透過性及び保持効果から生じる可能性がある。IHCによれば、NCI−H441腫瘍細胞の細胞膜上のEGFRの発現は3+であった。
図8Bは、結腸直腸腺癌LoVo異種移植片におけるAb1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDの有効性を示している。LoVoは、EGFR発現がNCI−H441よりも低い(細胞あたり<100,000受容体;IHC Hスコア140)KRAS突然変異結腸直腸腺癌である。標的発現がNCI−H441よりも低いLoVoである結腸直腸腺癌モデルでは、AbA(S239C)−PBDは完全及び永続的奏功を誘導したが、Ab1(S239C)−PBDを用いた投与の休止に続いて腫瘍が再発した(図8B)。両方のコンジュゲートはq7dx6レジメン(マウスは6週の間7日毎に投与された)において0.5mg/kgで投与された。このモデルでは、抗EGFRコンジュゲートの特異性は、負の対照コンジュゲートAb095PBDと比べて奏功の持続性の増加により実証された。AbA−MMAEもこのモデルでは活性であり、活性はAb1(S239C)−PBDで観察された活性に類似していた。しかし、これらの結果を達成するため、AbA−MMAEは、はるかに高用量で投与しなければならなかった。
Ab1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDの有効性を、結腸直腸腺癌の第2のモデルである、SW−48(EGFR Hスコア:228)において評価した。図9Aに示されるように、0.1mg/kgの単回投与に続いて、AbA(S239C)−PBDはAb1(S239C)−PBDよりも永続性のある奏功を誘導した。図9Bに示されるように、0.2mg/kgでの投与に従ったAb1(S239C)−PBDに続く奏功の永続性は、0.1mg/kgでのAbA(S239C)−PBDで観察された奏功の永続性と類似しており、このモデルでは、AbA(S239C)−PBDの効力はAb1(S239C)−PBDの少なくとも2倍であることが示唆される。図9A及び図9Bでは、丸カッコ内の数はmg/kgでの用量を表す。矢印は投与日を表す。IHCにより決定されるSW48異種移植片におけるEGFRの発現は3+である。
Ab1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDの有効性を、CTG−0162非小細胞肺がんモデルでもAb1及びAbA−MMAEと比べて評価した。図10Aに示されるように、CTG−0162NSCLCモデルでは、q7x6で投与されたAb1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDは腫瘍成長を阻害するのに非常に効果的であり、AbA−MMAEは、AbA(S239C)−PBD又はAb1(S239C)−PBDの10倍投与されたにもかかわらず、効果はもっと低かった。Ab1もこのモデルでは効果的ではなかった。
AbA(S239C)−PBD及びAb1(S239C)−PBDの有効性を、CTG−9786頭頚部がんモデルでもAb1及びAbA−MMAEと比べて評価した。図10Bに示されるように、CTG−9786頭頚部がんモデルでは、q7x6で投与されたAb1(S239C)−PBD及びAbA(S239C)−PBDは腫瘍成長を阻害するのに非常に効果的であった。AbA−MMAEも効果的であったが、はるかに高用量を必要とした。
要約すると、これらのインビボ結果は、PBDコンジュゲートが、もっと低いEGFR発現結腸直腸腫瘍を含む、様々な異なる腫瘍型にわたってオーリスタチンベースのコンジュゲートよりも強力であり、より持続する抗腫瘍応答を生み出すことを示している。
実施例6:多形神経膠芽腫異種移植片における有効性
表2に示されるように、インビトロ結果は、EGFR−PBD ADCがGBM細胞株の成長を阻害するのに効果的であることを示している。GBMでのPBDコンジュゲートの有効性をさらに評価するため、増幅された突然変異体EGFRvIIIを有するU−87 MGde2−7異種移植片腫瘍モデルを使用した(図6;IHC Hスコア230)。Ab1(S239C)−PBD(0.05mg/kg、Q7Dx6)を標準治療テモゾロミド(1.5mg/kg、QDx14)及び放射線(XRT、2Gy、QDx5x2)と組み合わせて投与し、2サイクルの間は2日休みを取った。図11に示されるように、テモゾロミドへの若しくは分割照射法へのAb1(S239C)−PBDの追加又は三重組合せは、腫瘍成長阻害を著しく増加させ、GBMでのこの組合せレジメンの有効性が増強される可能性が示唆される。丸カッコ内の数はmg/kgでの用量を表し、矢印は投与日を表す。
表2に示されるように、インビトロ結果は、EGFR−PBD ADCがGBM細胞株の成長を阻害するのに効果的であることを示している。GBMでのPBDコンジュゲートの有効性をさらに評価するため、増幅された突然変異体EGFRvIIIを有するU−87 MGde2−7異種移植片腫瘍モデルを使用した(図6;IHC Hスコア230)。Ab1(S239C)−PBD(0.05mg/kg、Q7Dx6)を標準治療テモゾロミド(1.5mg/kg、QDx14)及び放射線(XRT、2Gy、QDx5x2)と組み合わせて投与し、2サイクルの間は2日休みを取った。図11に示されるように、テモゾロミドへの若しくは分割照射法へのAb1(S239C)−PBDの追加又は三重組合せは、腫瘍成長阻害を著しく増加させ、GBMでのこの組合せレジメンの有効性が増強される可能性が示唆される。丸カッコ内の数はmg/kgでの用量を表し、矢印は投与日を表す。
実施例7:インビトロ血漿安定性
蛍光標識されたAb1(S239C)抗体及びAb1(S239C)−PBD DAR2の安定性を、マウス、ラット、イヌ及びヒト由来の血漿中、並びにバッファー中、37℃、6日間インビトロで評価した。タンパク質凝集及び断片化はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により測定した。コンジュゲートされていないPBDは液体クロマトグラフィー−質量分析(LC/MS/MS)により判定した。
蛍光標識されたAb1(S239C)抗体及びAb1(S239C)−PBD DAR2の安定性を、マウス、ラット、イヌ及びヒト由来の血漿中、並びにバッファー中、37℃、6日間インビトロで評価した。タンパク質凝集及び断片化はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により測定した。コンジュゲートされていないPBDは液体クロマトグラフィー−質量分析(LC/MS/MS)により判定した。
Ab1(S239C)モノクローナル抗体のインビトロ血漿安定性は図12Aに示されている。Ab1(S239C)モノクローナル抗体は、バッファー及び血漿中t0で1.5〜2.8%の初期凝集体を示し、バッファー及び血漿中では凝集体の低増加/日(≦1.5%)であった。Ab1(S239C)抗体はバッファー及び血漿中t0で初期断片は0%であり、バッファー及び血漿中断片の1日あたり低増加(≦2.4%)であった。
Ab1(S239C)PBD DAR2 ADCのインビトロ血漿安定性は図12Bに示されている。Ab1(S239C)−PBDは、バッファー及び血漿中で中程度の初期凝集体(5〜11%)を示し、1日あたりの%凝集体増加は血漿の方が高く(0.5〜2.8%)、ヒト>イヌ>マウスの順であった。Ab1(S239C)−PBD DAR2 ADCはバッファー及び血漿中で初期断片は0%であり、バッファー及び血漿中で1日あたり最少%増加(≦0.4%)であった。
PBD弾頭それ自体が試験され、すべての血漿マトリックス中37℃で6日間血漿中にて安定であることが見出された。Ab1(S239C)−PBD DAR2 ADCから放出されるコンジュゲート弾頭は、すべての時点で及びすべてのマトリックスにおいて定量レベルより下であった。これは、投与された弾頭等価物の<0.4%に相当する。
蛍光標識されたAb1−MMAF ADCの安定性も、マウス、ラット、イヌ及びヒト由来の血漿中、並びにバッファー中、37℃、6日間インビトロで評価した。タンパク質凝集及び断片化はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により測定した。Ab1 MMAF ADCはバッファー及び血漿中、t0で2.5〜4.8%の初期凝集体を示し、血漿中での凝集体の1日あたりの%増加は2.0〜2.8%にわたった。Ab1 MMAF ADCは、t0で0〜0.5%の初期断片を有し、1日あたりの%増加はバッファー及び血漿中、0〜0.2%であった。
全体では、Ab1(S239C)mAb及びAb1(S239C) PBD DAR2 ADCのインビトロ血漿安定性はAb1−MMAF ADCに類似していた。
本出願に引用されるすべての出版物、特許、特許出願及び他の文書は、参照によりその全体をあらゆる目的のために、まるでそれぞれ個々の出版物、特許、特許出願又は他の文書が、参照によりあらゆる目的のために組み込まれることを個々に指示されている場合と同じ程度に本明細書に組み込む。
種々の特定の実施形態が図示され説明されたてきが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変化を加えることが可能であることは認識されるであろう。
Claims (20)
- 式(X)の構造、又はその塩を含む抗体−薬物コンジュゲート(ADC)であって、
抗EGFR抗体は
配列番号3を含むCDRH1配列、配列番号4を含むCDRH2配列、及び配列番号5を含むCDRH3配列を含む重鎖可変領域;
配列番号8を含むCDRL1配列、配列番号9を含むCDRL2配列、及び配列番号10を含むCDRL3配列を含む軽鎖可変領域;並びに
重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異
を含み、番号付けはKabatに従い、
抗EGFR抗体はS239Cを含む突然変異を通じて細胞障害性弾頭にコンジュゲートされており、
nは2である、
抗体−薬物コンジュゲート。 - 重鎖可変領域が配列番号2を含み、軽鎖可変領域が配列番号7を含む、請求項1に記載のADC。
- 配列番号1を含む完全重鎖、及び配列番号6を含む完全軽鎖を含む、請求項1に記載のADC。
- 抗EGFR抗体がIgG1アイソタイプを含む、請求項1に記載のADC。
- 抗EGFR抗体がIgG1アイソタイプを含む、請求項2に記載のADC。
- 抗EGFR抗体の重鎖定常領域が、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項1に記載のADC。
- 抗EGFR抗体の重鎖定常領域が、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項2に記載のADC。
- 抗EGFR抗体の重鎖定常領域が、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項3に記載のADC。
- 抗EGFR抗体がヒト化抗体である、請求項1に記載のADC。
- 抗EGFR抗体がヒト化抗体である、請求項2に記載のADC。
- 少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と組み合わせた請求項1に記載のADCを含む医薬組成物。
- 医薬組成物の薬物−抗体比が約2である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 式(IX)の構造、又はその塩を含む抗体−薬物コンジュゲート(ADC)であって、
抗EGFR抗体は、
配列番号3を含むCDRH1配列、配列番号4を含むCDRH2配列、及び配列番号5を含むCDRH3配列を含む重鎖可変領域;
配列番号8を含むCDRL1配列、配列番号9を含むCDRL2配列、及び配列番号10を含むCDRL3配列を含む軽鎖可変領域;
重鎖定常領域にS239Cを含む突然変異、
を含み、番号付けはKabatに従い、
抗EGFR抗体AbはS239Cを含む突然変異を通じて式(IX)の構造にコンジュゲートされており、
nは2である、
抗体−薬物コンジュゲート。 - qが5である、請求項13に記載のADC。
- 重鎖可変領域が配列番号2を含み、軽鎖可変領域が配列番号7を含む、請求項13に記載のADC。
- 重鎖が配列番号1を含み、軽鎖が配列番号6を含む、請求項13に記載のADC。
- 抗EGFR抗体がIgG1アイソタイプを含む、請求項13に記載のADC。
- 抗EGFR抗体の重鎖定常領域が、C終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のC終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項14に記載のADC。
- 少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と組み合わせた請求項13に記載のADCを含む医薬組成物。
- 医薬組成物の薬物−抗体比が約2である、請求項19に記載の医薬組成物。
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