BR112016018005B1 - Conjugados anticorpo-droga e imunotoxinas - Google Patents

Abstract

CONJUGADOS ANTICORPO-DROGA E IMUNOTOXINAS. A presente invenção refere- se a conjugados, em especial os conjugados anticorpo-droga e imunotoxinas, caracterizada pelo fato de que possui a fórmula (I): A-(L-D)p ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos da mesma, em que: A é um anticorpo que liga seletivamente FAP; L é um ligante; D é uma droga compreendendo uma citolisina ou uma cadeia A Nigrin-b; e p é 1 a 10, e o uso de tais conjugados no tratamento terápico de tumores. Métodos de produção de tais conjugados e componentes para uso em tais métodos são divulgados.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente invenção se refere a conjugados anticorpos-droga (ADCs) e Imunotoxinas que direcionam Proteína de Ativação de Fibroblastos α (FAP), e a seu uso em medicamentos, por exemplo, no tratamento de certos cânceres.

Fundamentos da invenção

[0002] Tumores epiteliais malignos são a principal causa de morte humana relacionada ao câncer. Estes tumores sólidos frequentemente exibem reações significativas do estroma, tais como o chamado "estroma desmoplástico" ou "estroma reativo", que representa 20 a 60% da massa total do tumor e é caracterizado pela existência de um grande número de células do estroma e da matriz extracelular densa (ECM). Estudos recentes indicaram as funções de promoção de tumores das células de estroma, como é exemplificado pelas células vasculares, células do sistema imunológico, miofibroblastos, fibroblastos, adipócitos e células progenitoras derivadas de medula óssea (1-6). Em particular, um número considerável de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são frequentemente observados dentro de estroma associado a um tumor de vários cânceres humanos, incluindo o da mama, pulmão, cólon e carcinomas do pâncreas (14,15). Interagir coordenadamente com os diferentes componentes do estroma, CAFs tem a capacidade de promover o crescimento e a neoangiogênese do tumor; CAFs também têm sido mostrados como crucial para o desenvolvimento de tumores agressivos e invasividade do tumor durante a progressão do câncer (16-25); CAFs facilitam a difusão e a infiltração de células tumorais em órgãos distantes, contribuindo, assim, para a formação de metástases. Importantemente, a relevância das células do estroma para o fracasso da administração sistêmica de drogas para tumores e para o desenvolvimento de resistência a drogas também tem sido indicada (7-11).

[0003] A identificação de alvos moleculares e celulares que revoga interações celulares estroma tumor e atenuando tumorigênese é atualmente um dos assuntos mais importantes em oncologia translacional. De fato, tendo como alvo o estroma peritumoral é uma estratégia relativamente nova para o tratamento de tumores metastáticos, que representam mais de 90% de mortalidade de pacientes com câncer: apenas alguns produtos obtiveram aprovação terapêutica até agora, a maioria deles sendo drogas anti- angiogênicos (Avastin®; 26). A identificação e o direcionamento de outras moléculas novas dentro do microambiente do tumor, em seguida, é essencial para aumentar a eficácia de terapias convencionais em combinação com as abordagens terapêuticas baseadas em estroma, e representam uma abordagem poderosa para o tratamento de câncer e metástase (12, 13).

[0004] Drogas à base de anticorpo monoclonal (Mab) representam uma grande promessa na luta contra o câncer. Isso é porque eles permitem que o tratamento seja direcionado a um nível molecular de uma forma precisa e específica. Estas vantagens, juntamente com o seu apelo comercial (tempo de desenvolvimento curto, competência restrita e ser facilmente exportável para outros tipos de câncer, uma vez que foram aprovados), levaram muitas empresas farmacêuticas a investir fortemente no desenvolvimento de novas moléculas baseadas em anticorpos, bem como no in-licensing de novas moléculas ou tecnologias de empresas de biotecnologia.

[0005] No entanto, apesar do sucesso clínico de anticorpos terápicos, MAbs nuas direcionando antígenos tumorais de superfície celular raramente apresentam eficácia suficiente por conta própria. Para aumentar a baixa atividade das MAbs, novas estratégias estão se concentrando ao ligá-las a moléculas tóxicas. De toxinas de plantas e bacterianas, bem como moléculas pequenas quimioterápicas podem ser bons candidatos, uma vez que elas são muito potentes e ativas em quantidades muito pequenas.

[0006] O campo de imunotoxinas (ITS) e os conjugados de Anticorpo- droga (ADCs) para o tratamento de câncer tem experimentado recentemente uma atividade crescente de desenvolvimento por empresas farmacêuticas, devido aos avanços tecnológicos realizados nos últimos anos, direcionada a resolver os problemas que inicialmente apresentaram sobre a imunogenicidade, toxicidade indesejável, produção, meia-vida e resistência.

[0007] Os imunoconjugados são feitos de um anticorpo recombinante humano, humanizado ou quimérico, ligado covalentemente a uma droga citotóxica. O principal objetivo de uma tal estrutura é unir o pequeno poder citotóxico (300 a 1000Da) e a alta especificidade de MAbs direcionados antígenos associados a tumor (TAA).

[0008] O Ab deve ser muito seletivo para alcançar o antígeno, cuja expressão deve ser limitada em células normais. O Ab também deve ser internalizado eficazmente nas células cancerosas.

[0009] O agente citotóxico selecionado como a porção efetora deve matar células apenas depois da internalização e liberar para dentro do citoplasma celular. As cargas úteis mais utilizadas em ADCs são drogas que prejudicam DNA como caliqueamicinas, duocarmicinas, ou compostos de direcionamento de microtúbulos como auristatinas e maitansinoides.

[0010] Os ligantes Ab-citotóxicos são concebidos para serem sistemicamente estáveis e para liberar o agente citotóxico no interior das células alvo.

[0011] Os TAAs são frequentemente proteínas de membrana celular que são sobre-expressas em tecidos doentes ou pelo menos suficientemente expressas para facilitar a citotoxicidade ativada por internalização. Idealmente, o antígeno apresenta uma expressão restrita em tecidos normais, com uma expressão reduzida ou nula em órgãos vitais. Além de tudo isso, o antígeno tumoral tem de ser reconhecido seletivamente e com elevada afinidade por um Ab.

[0012] Em muitos tipos de câncer humano, a resposta de fibroblastos é caracterizada pela indução de uma proteína da superfície celular, de Proteína Ativadora de Fibroblastos α (FAPα), uma serina-protease de 95 kDa, cuja expressão é altamente restrita para órgãos em desenvolvimento, cicatrização de feridas e remodelação do tecido.

[0013] FAP apresenta as seguintes características: • Glicoproteína do tipo de membrana II com atividade SER- protease (DPP + colagenase) • 89% de homologia de proteínas humano-murina • Tumor estroma-expresso em> 90% carcinomas (de mama, pâncreas, pulmão, bexiga e cólon) • Expressão transitória e altamente restrita em tecidos adultos normais durante a cicatrização de feridas e órgãos em desenvolvimento. • FAP (+) fibroblastos localizados fechados para a vasculatura do tumor • Expressão muito focal • Internalização • Implicação na remodelação da matriz extracelular, o crescimento de tumores e metástases.

[0014] Expressão FAP foi recentemente encontrada em células tumorais de Pâncreas, bem como os fibroblastos de estroma associados ao tumor. Expressão FAP foi correlacionada com menor sobrevida dos pacientes e pior prognóstico, sugerindo um possível ciclo autócrino/parácrino baseado em FAP neste tipo de tumor (32).

[0015] Durante os últimos 10 anos, Kontermann e Pfizenmaier (IZI, Universidade de Stuttgart, Alemanha) desenvolveram derivados anti-FAP MAb contra ambas as proteínas humanas e de murino (27, 28). Eles têm mostrado in vitro que imunolipossomas anti-FAP scFv ligam especificamente células FAP+ e são internalizados (29). Em um estudo recente demonstrouse que o efeito anti-tumoral das nanopartículas cobertas de lípidos e antiFAP scFvs e carregados com TNFα (30).

[0016] O tratamento com imunotoxina MAb de murina FAP5-DM1 induziu inibição de longa duração do crescimento de tumores e a regressão completa em modelos de xenotransplante de câncer do pâncreas e pulmão,sem qualquer efeito intolerância-relacionada (31).

[0017] Apesar destes avanços, continua a existir uma necessidade não satisfeita de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de tumores, incluindo os tumores epiteliais, e para os componentes para uso em tais estratégias terapêuticas. A presente invenção contempla esta e outras necessidades.

Breve Descrição da Invenção

[0018] Em termos gerais, a presente invenção refere-se a anticorpos anti-FAP, seus conjugados e cargas úteis otimizadas para uso em estratégias de anticorpo conjugado. Em particular, os presentes inventores verificaram que os anticorpos anti-FAP, tal como aqui descritos exibem ligação altamente específica, e internalização rápida e eficiente. Além disso, os presentes inventores descobriram que a cadeia A Nigrin b pode ser isolada e produzida em células hospedeiras bacterianas, ainda retém in vitro atividade Inativadora de Ribossoma na ausência da cadeia B Nigrin-b e, apenas uma vez conjugado a um anticorpo, exibe ao mesmo tempo a capacidade de translocar em células e a atividade citotóxica que resulta sem cadeia B Nigrin-b.

[0019] A cadeia A Nigrin-b aqui descrita e/ou derivados de citolisina são vantajosamente conjugados com anticorpos anti-FAP para uso no tratamento de tumores.

[0020] Em conformidade, num primeiro aspecto, a presente invenção fornece um conjugado que tem a fórmula I: ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo. em que: A é um anticorpo que liga seletivamente FAP; L é um ligante; D é uma droga compreendendo uma citolisina ou uma cadeia A Nigrin- b; e p é 1 a 10.

[0021] Em alguns casos, em conformidade com este e outros aspectos da presente invenção, A é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação resultante do mesmo que se liga seletivamente a uma região extracelular de FAP humana. Em alguns casos, A pode reagir de forma cruzada com ambas FAP humana e murina. Em casos especiais, A pode compreender a complementaridade da cadeia pesada 1-3 (CDRH1-3) e complementaridade de regiões determinantes de cadeia leve 1-3 (CDRL1-3) possuindo as seguintes sequências de aminoácidos: (i) CDRH1: SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 7; (ii) CDRH2: SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 8; (iii) CDRH3: SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 9; (iv) CDRL1: SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 10; (v) CDRL2: SEQ ID NO: 11 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 11; e (vi) CDRL3: SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 12.

[0022] Em certos casos, CDRH1-3 compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 7-9, respectivamente, e CDRL1-3 compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 10-12, respectivamente.

[0023] Em certos casos, A compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de comprimento total de SEQ ID NO: 5.

[0024] Em certos casos, A compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0025] Em certos casos, A compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de comprimento total de SEQ ID NO: 6. Em particular, A pode compreender uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0026] Em certos casos, A compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de comprimento total de SEQ ID NO: 3. Em particular, A pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0027] Em certos casos, A compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de comprimento total de SEQ ID NO: 4. Em particular, A pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[0028] Em certos casos, A pode ser um anticorpo competitivamente ligando anti-FAP, que é estruturalmente diferente das moléculas de anticorpo anti-FAP aqui exemplificadas. Por exemplo, A pode ser uma molécula antiFAP de anticorpo que compete com o anticorpo IgG1 anti-FAP aqui identificado como "hu36" para a ligação de FAP humana recombinante imobilizada. hu36 tem a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e a sequência de aminoácidos da cadeia leve de SEQ ID NO: 4. O anticorpo anti-FAP pode, em alguns casos, ligar-se ao mesmo epítopo que hu36. Os métodos para a determinação de competição de ligação de anticorpos e para o mapeamento de epítopo são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, “Epitope Mapping by Competition Assay” Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi: 10,1101/pdb.prot4277.

[0029] De acordo com este e outros aspectos da presente invenção, D pode ser uma citolisina. A citolisina pode, em alguns casos, ser um composto divulgado no documento WO 2008/138561 A1, a totalidade do conteúdo da qual é expressamente aqui incorporada por referência (compostos aqui divulgados são também referidos como derivados Tubulisina). A citolisina pode ser sintetizada tal como descrito no documento WO 2008/138561. Em certos casos, a citolisina pode ser tal como definida na Fórmula I ou Fórmula IV do documento WO 2008/138561 A1. Em certos casos, a citolisina pode ser de fórmula IV: em que: R2 (i) está direta ou indiretamente ligada ao ligante L ou (ii) é H ou é C1-C4 alquil; R6 é C1-C6 alquil; R7 é C1-C6 alquil, CH2OR19 ou CH2OCOR20, em que R19 é alquil, R20 é C2-C6-alcenil, fenil, ou CH2-fenil; R9 é C1-C6 alquil; R10 é H, OH, O-alquil ou O-acetil; f é 1 ou 2; R11 tem a seguinte estrutura: em que R21 é H, OH, halogênio, NH2, alquilóxi, fenil, amino alquil ou dialquilamino; R16 é H ou um C1-C6-grupo alquil; R17 (i) está direta ou indiretamente ligado ao ligante L ou (ii) é CO2H, CO2R18, CONHNH2, OH, NH2, SH ou um grupo alquil, cicloalquil, heteroalquil ou heterocicloalquil, opcionalmente substituído, em que R18 é um grupo alquil, heteroalquil ou hetercicloalquil opcionalmente substituído; e q é 0, 1, 2 ou 3; e em que o termo "opcionalmente substituído" refere-se a grupos, em que um ou vários átomos de H podem ser substituídos por F, Cl, Br ou I ou OH, SH, NH2, ou NO2; o termo "opcionalmente substituído" refere-se ainda a grupos, que podem ser exclusiva ou adicionalmente substituídos com grupos alquil C1-C6, alquenil C2C6, alquinil C2-C6, heteroalquil C1-C6, cicloalquil C3C10, heterocicloalquil C2-C9, aril C6-C10, heteroaril C1-C9, aralquil C7-C12 ou heteroaralquil C2-C11 não substituídos.

[0030] Em alguns casos R2 é uma ligação para ligante L.

[0031] Em alguns casos R17 é C (O) X, CONHNHX, OX, NHX ou SX, em que X é uma ligação ao ligante L.

[0032] Em alguns casos ligante L pode ainda compreender um espaçador.

[0033] Em alguns casos, o espaçador tem um comprimento de cadeia de 2 a 30 átomos.

[0034] Em alguns casos, o espaçador compreende ou é constituído por um grupo alquileno (por exemplo, alquil bivalente) ou grupo heteroalquileno (isto é, heteroalquil bivalente).

[0035] Em alguns casos, o espaçador compreende ou consiste em um grupo alquileno ou oxialquileno.

[0036] Em alguns casos, o espaçador compreende ou consiste em um grupo -(CH2)n- ou -(OCH2CH2)n-, em que n > 1.

[0037] Em alguns casos, o espaçador compreende ou consiste em um grupo-(OCH2CH2)n-, em que n > 1. Em particular, n pode ser 1 a 15, 1 a 10, 1 a 6, ou de 2 a 5. Por exemplo, n pode ser 3 ou 4.

[0038] Em alguns casos, o espaçador compreende entre um e seis unidades de etileno glicol, por exemplo, um glicol de trietileno.

[0039] Em alguns casos, o espaçador pode ser diretamente ligado ao grupo R17, ou pode ser ligado ao grupo R17 através de um grupo de formação de ponte.

[0040] Em alguns casos, o espaçador está ligado ao grupo R17 através de um grupo -C (O) X de formação de ponte, em que X é uma ligação com R17.

[0041] Em alguns casos R17 é CONHNHX e o espaçador está ligado ao grupo R17 através de um grupo -C (O) X de formação de ponte, em que X representa a ligação entre o espaçador e R17.

[0042] Em alguns casos R17 é CONHNHX e o espaçador é um grupo - (OCH2CH2)n- ligado a R17 através de um grupo -C (O) X de formação de ponte, em que n = 2, 3 ou 4.

[0043] Em alguns casos D compreende uma citolisina possuindo a seguinte estrutura:

[0044] Em alguns casos D compreende uma citolisina possuindo a seguinte estrutura:

[0045] Em certos casos, L compreende um grupo de fixação para fixação a A e uma porção clivável de protease. Por exemplo, L pode compreender uma unidade de valina-citrulina. Em particular, L pode compreender maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenzilcarbamato.

[0046] Em alguns casos, faz-se reagir a ligação dupla do maleimido com um grupo tiol de um resíduo de cisteína do anticorpo A para formar uma ligação enxofre-carbono, a fim de efetuar a ligação do ligante L ao anticorpo A.

[0047] Em alguns casos -L-D tem uma estrutura selecionada a partir do grupo consistindo de:

[0048] Em certos casos -L-D pode ter a seguinte estrutura:

[0049] Em certos casos -L-D pode ter a seguinte estrutura:

[0050] De acordo com este e outros aspectos da presente invenção p pode, em alguns casos, estar na gama de 1 a 5, por exemplo. 1 a 4, ou 1 a 3. Em casos particulares, p pode ser 1 ou 2. Em particular, os casos p podem ser 3 ou 4.

[0051] De acordo com este e outros aspectos da presente invenção D pode ser uma cadeia A Nigrin-b. De um modo preferido, a cadeia A Nigrin-b é, na ausência de uma cadeia B Nigrin-b. A cadeia A Nigrin-b pode compreender ou consistir da sequência de SEQ ID NO: 13.

[0052] Em certos casos, a cadeia A Nigrin-b pode ser, ou pode ter sido produzida de forma recombinante, por exemplo, numa célula hospedeira bacteriana. Os presentes inventores descobriram, surpreendentemente, que cadeia A Nigrin-b retém a sua atividade (por exemplo, citotóxica e/ou atividade de inibição de ribossoma), apesar da perda ou alteração de glicosilação nativa tal como é o caso quando a cadeia A Nigrin-b é produzida de forma recombinante numa célula hospedeira bacteriana.

[0053] Quando o conjugado da presente invenção compreende uma cadeia A Nigrin-b como a carga útil tóxica (isto é. D), L pode ser simplesmente uma ligação bissulfeto entre um átomo de enxofre em A e um átomo de enxofre em D. Portanto, L pode compreender ou consistir de uma ligação bissulfeto.

[0054] Num segundo aspecto, a presente invenção fornece um conjugado tal como definido em conformidade com o primeiro aspecto da invenção para uso em medicamentos.

[0055] Num terceiro aspecto, a presente invenção fornece um conjugado tal como definido em conformidade com o primeiro aspecto da invenção para uso num método de tratamento de um tumor num sujeito mamífero.

[0056] Em alguns casos, o conjugado é para administração simultânea, sequencial ou separada com um ou mais outras drogas antitumorais. A uma ou outras drogas antitumorais compreendem um agente quimioterápico citotóxico ou um agente anti-angiogênico ou um agente imunoterápico. Em alguns casos, as uma ou outras drogas antitumorais compreendem Gencitabina, Abraxane bevacizumab, itraconazol, carboxiamidotriazol, uma molécula anti-PD-1 ou uma molécula de anticorpo anti-PD-L1 (por exemplo, nivolumab ou pembrolizumab).

[0057] Em certos casos, o conjugado é para uso no tratamento de um tumor sólido. Em particular, o conjugado pode ser para uso no tratamento de câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça & pescoço, câncer de ovário, câncer de bexiga ou câncer de cólon.

[0058] Num quarto aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor num sujeito mamífero, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado tal como definido em conformidade com o primeiro aspecto da invenção ao sujeito em necessidade da mesma. Em alguns casos, o método pode ser para o tratamento de um tumor sólido. Em particular, o método pode ser para o tratamento de câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça & pescoço, câncer de ovário, câncer de bexiga ou câncer de cólon.

[0059] Num quinto aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma citolisina na preparação de um conjugado anticorpo-droga, em que o anticorpo é um anticorpo específico de FAP, por exemplo, um anticorpo específico de FAP de acordo com o oitavo aspecto da invenção. Em alguns casos, o uso pode ser de uma citolisina na preparação de um conjugado anticorpo-droga, tal como definido de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[0060] Num sexto aspecto, a presente invenção fornece um conjugado do primeiro aspecto da invenção para uso no tratamento de uma condição inflamatória (por exemplo, artrite reumatoide).

[0061] Num sétimo aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma condição inflamatória (por exemplo, artrite reumatoide) num sujeito mamífero, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado do primeiro aspecto da invenção ao sujeito em necessidade do mesmo.

[0062] Num oitavo aspecto, a presente invenção proporciona um isolado de cadeia A Nigrin-b na ausência da cadeia B Nigrin-b. A sequência de aminoácido cadeia A Nigrin-b pode compreender ou consistir da sequência de SEQ ID NO: 13.

[0063] Num nono aspecto a presente invenção fornece o uso de um isolado de cadeia A Nigrin-b de acordo com o oitavo aspecto da invenção na preparação de uma imunotoxina. Em alguns casos, a imunotoxina compreende um anticorpo monoclonal conjugado e/ou ligado ao referido isolado de cadeia A Nigrin-b (na ausência da cadeia B Nigrin-b). Em alguns casos, a imunotoxina compreende um anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal, por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, que liga seletivamente FAP. Em alguns casos, a imunotoxina compreende um anticorpo de acordo com o décimo aspecto da invenção.

[0064] Num décimo aspecto a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal, por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, que liga seletivamente FAP e que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[0065] Num décimo primeiro aspecto a presente invenção fornece o anticorpo do décimo aspecto da presente invenção para uso em medicamentos. O anticorpo pode ser para uso no tratamento de uma condição inflamatória (por exemplo, artrite reumatoide).

[0066] Num décimo segundo aspecto a presente invenção fornece o uso de um anticorpo monoclonal de acordo com o décimo aspecto da invenção na preparação de um conjugado anticorpo-droga ou uma imunotoxina.

[0067] Num décimo terceiro aspecto a presente invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NOs: 1-6 e 13. Em alguns casos, o polinucleotídeo pode incluir a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14.

[0068] Num décimo quarto aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um conjugado de acordo com o primeiro aspecto da invenção, compreendendo: (a) derivatização do anticorpo que liga seletivamente FAP para introduzir, pelo menos, um grupo sulfidril; e (b) fazer reagir o anticorpo derivatizado com um resíduo adequado (por exemplo, um aminoácido de cisteína) em uma cadeia A Nigrin-b (cadeia B Nigrin-b ausente) sob condições que permitam a formação de uma ligação bissulfeto entre o anticorpo e a cadeia A Nigrin-b produzindo desse modo o conjugado. O processo pode ainda compreender uma etapa (c), de purificação e/ou isolamento do conjugado.

[0069] Em alguns casos, o passo (a) pode compreender a reação do anticorpo com 4-succinimidiloxicarbonil-α-metil-α- (2-piridil-ditio) tolueno (SMPT), N-succnimidil 3- (2-piridil-ditiopropionato) (SPDP) ou metil 4- mercaptobutirimidato.

[0070] Num décimo quinto aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um conjugado de acordo com o primeiro aspecto da invenção, compreendendo: (c) ligar o anticorpo que liga seletivamente FAP ao ligante através de um grupo tiol; e (d) ligar a citolisina ao ligante através de um grupo apropriado na molécula citolisina. Em alguns casos, a citolisina está ligada ao ligante através da posição R2 ou posição R17. Os passos (a) e (b) podem ser realizados em qualquer ordem. Numa etapa adicional opcional (c), o processo pode compreender purificar e/ou isolar o conjugado.

[0071] A presente invenção inclui a combinação dos aspectos e características preferidas descritos, exceto onde tal combinação é evidentemente inaceitável ou declarada como expressamente evitada. Estes e outros aspectos e modalidades da invenção são descritas abaixo em mais pormenor e com referência aos exemplos e figuras que a acompanham.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0072] A Figura 1 mostra a caracterização de scFv humanizado hu33 e hu36. A) Análise de SDS-PAGE dos fragmentos scFv purificados. Coloração com Coomassie. R-redução, NR - não redutor. B) Análise da citometria de fluxo da ligação de hu36 (humanizado) e mo36 (quimérico) para células HT1080-huFAP. Os anticorpos ligados foram detectados com um anticorpo anti-His-tag (n = 2). C) ELISA de ligação de scFv hu36 e mo36 scFv para FAP imobilizada humana recombinante (revestido em 100ng/ml). Os anticorpos ligados foram detectados com um anticorpo anti-Mic-tag conjugado com HRP.

[0073] A Figura 2 mostra A) ELISA de anti-FAP mo36-IgG1 (círculos) e hu36-IgG1 (quadrados) para a ligação a FAP recombinante humana (rhFAP) ou proteína de controle (BSA) (triângulos e triângulos invertidos, respectivamente). 50 ng de proteína foram revestidos por poço. Os anticorpos ligados foram detectados com IgG-Fc anti-humana de conjugado- HRP. B) Análise de citometria de fluxo da anti-FAP mo36-IgG1 (triângulos e estrelas) e hu36-IgG1 (quadrados e círculos) para a ligação a HT1080-FAP. As proteínas ligadas foram detectadas com um anticorpo marcado com PE anti-Hu IgG-Fc.

[0074] A Figura 3 mostra o fluxo de análise de citometria de ligação do hu36-IgG1 a HT1080 estavelmente transfectada a expressar A) FAP humana (HT1080-huFAP) e B) FAP camundongo (HT1080-moFAP). Os anticorpos ligados foram detectados com um anticorpo Fc anti-humano marcado com PE.

[0075] A Figura 4 mostra microscopia confocal de células HT1080- FAP, incubadas com hu36-IgG1 durante vários tempos (0, 30 e 60 minutos) e coradas com anticorpo anti-IgG marcado com FITC, WGA-TRed (coloração da membrana), e DAPI (núcleo). Os painéis da direita mostram uma imagem mesclada das três manchas.

[0076] A Figura 5 mostra a análise da internalização de hu36-IgG1 por discriminação de células (n = 10-30) mostrando apenas coloração da membrana (PM; barras abertas), PM e coloração intracelular (barras sombreadas) ou apenas intracelular de coloração (barras a cheio). A internalização clara dependente do tempo é evidenciada.

[0077] A Figura 6 mostra o perfil MALDI-Tof de cadeia A nigrin-b recombinante. Massa observada (Da): 28546,55; Massa esperada (Da): 28546,09; Desvio de massa: 0,5; Precisão de massa: 16ppm.

[0078] A Figura 7 mostra a atividade da proteína inativadora de ribossomo (RIP) de cadeia A Nigrin-b recombinante (recNgA) testado em lisados de células livres de reticulócitos de coelho (RRL) versus Nigrin-b nativa (WT). (3a, 3b, 6c, 9c) representam diferentes formulações de recNgA.

[0079] A Figura 8 mostra a citotoxicidade de recNgA testado em linha de células HT1080-FAP através de ensaio de viabilidade de cristal violeta (Nigrin nativo - diamantes; cadeia A Nigrin-b recombinante - quadrados).

[0080] A Figura 9 mostra a atividade de imunotoxina RIP de conjugados anti-FAP hu36-IgG1-recNgbA (HSP131-001; cruzes) em um ensaio RRL comparado com nigrin (triângulos) nativa (WT) e cadeia A Nigrin- b recombinante (recNgA; quadrados).

[0081] A Figura 10 mostra a atividade citotóxica de conjugados de imunotoxina anti-FAP hu36-IgG1-recNgbA (HSP131-001; triângulos), (nu) anti-FAP hu36-IgG1 (quadrados) não conjugados e cadeia A Nigrin-b recombinante (recNgA; diamantes) em A) linha de células HT1080-WT; e B) linha de células HT1080-FAP. Modulação na proliferação é representada graficamente na concentração de anticorpo/imunotoxina.

[0082] A Figura 11 mostra a estrutura geral de conjugado de anticorpo para um anticorpo citolisina conjugado através de um ligante vcPABA. Fixação da citolisina pode ser através de R1 ou R4 (identificados por setas).

[0083] A Figura 12 mostra imunodetecção de secções de tumor hu36 anti-FAP de camundongos (PDX) de xenoenxerto derivado do paciente (tumor pancreático). A coloração específica dependente de Dose e Tempo do estroma é observada em tumores subcutâneos de camundongo modelo PDX para o câncer de pâncreas (Panc185) - Dose única (1 & 5 mg/kg) de anti-hu/moFAP hu36 IgG1 foi administrada por via intraperitoneal em camundongos PDX Panc-185; imunodetecção foi realizada com um IgG1 anti-humano secundário anticorpo-20x imagens em escala são mostradas. Controle-48h: Camundongos administrados com um veículo e tumores extirpados após 48h.

[0084] A Figura 13 mostra o peso dos animais monitorizados após o tratamento com imunotoxina anti-FAP: recNgA em doses diferentes (2,5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 mg/kg) administradas uma vez por semana. Perda de peso significativa e toxicidade foi observada em Grupo 1 e 2 (2,5 e 1 mg/kg, respectivamente), de forma semelhante ao tratamento com 5 mg/kg (não mostrado); 0,5 mg/kg foi a dose máxima tolerada quando aplicado como agente único.

[0085] A Figura 14 mostra (A) o peso Corporal Relativo e (B) O volume do tumor medido a partir de xenoenxerto de camundongos derivados de pacientes (PAXF 736) não tratados (veículo; 10 ml/kg/dia; uma vez por semana), tratadas com Gencitabina (GEM; 150 mg/kg, uma vez por semana), ou imunotoxina antiFAP: recNgA (OMTX505; 0,5/0,25 mg/kg, uma vez por semana), ou ambos (OMTX505 (0,25 mg/kg): GEM (150 mg/kg)), durante 4 semanas de tratamento (dias 1, 8, 15, 22, 29).

[0086] A Figura 15 mostra análise de ELISA e FACS de ligação ADC471 ao FAP direcionado. (A) Detecção por ELISA de ligação a ADC-471 proteína de fusão huFAP hu36 em comparação com anticorpo anti-hu/mo FAP hu36; os valores de EC50 são indicados para molécula HPS124-3 ADC- 471 com DAR = 3,48; (B) & (C): A análise FACS da ligação em HT1080- huFAP, células HT1080-wt e HEK293 de HPS131-143-1 (ADC-471; DAR 4), HPS131-124-1 (ADC-467; DAR 1.2) e HPS131-124-3 ( ADC-471; DAR 3,48) ADCs. Os valores EC50 são indicados para este último (B).

[0087] A Figura 16 mostra a análise de imunofluorescência de lapso de tempo da capacidade de interiorização da hu36:ADC citolisina anti-FAP (ADC-471; HPS131-124-3) em que vivem as células HT1080-FAP. Painel esquerdo: A incubação com anti-hu/moFAP hu36 nua (FITC-AB; verde); Painel direito: A incubação com ADC-471 (FITC-ADC; verde). Tempo 0, 30, 60, 90min (painéis superiores): células HT1080-FAP. 30 min Tempo (painéis inferiores): as células do tipo selvagem HT1080.

[0088] A Figura 17 espectáculos in vitro efeito citotóxico do hu36 anti- hu/moFAP: ADCs citolisina em (A) HT1080-wt e (B) FAP (+) células. A parada de proliferação celular foi evidenciada através de coloração com violeta de cristal, após incubação de 72h de cada composto a uma gama de concentrações a partir de 10-6 10-12M. Citolisina parental TAM334 foi utilizada como controle positivo para citotoxicidade não específica.

[0089] A Figura 18 mostra o efeito de inibição de crescimento do tumor de anti-hu/moFAP hu36:citolisina candidatos ADC. (A) ADC471 contra ADC551; (B) ADC471 e ADC553 (OMTX705-553) versus ADC558 (OMTX705-558). Veículo e GEM (Gencitabina): grupos de controle positivo e negativo.

Descrição Detalhada da Invenção

[0090] Na descrição da presente invenção, serão empregados os seguintes termos, que se definem segundo as indicações abaixo

FAP

[0091] Tal como aqui utilizado “Proteína de ativação de fibroblastos”, “Proteína ativadora de fibroblastos”, “FAP” e “FAPα” são utilizados alternadamente. O FAP pode ser um FAP de qualquer espécie de mamífero. Em alguns casos FAP é FAP humana (também conhecida como Seprase, 170 kDa gelatinase de melanoma ligado à omplete, alfa proteína de ativação de fibroblastos ou integrante da protease de serina omplete), a sequência de aminoácidos do que é divulgado no UniProt No. de acesso Q12884 (Versão 140, de 11 de Dezembro de 2013) (SEQ ID NO: 15). Em alguns casos, uma molécula que se liga a FAP (por exemplo, uma molécula de anticorpo ou um conjugado do mesmo) pode ligar-se a uma região do domínio omplete ular de FAP. O domínio omplete ular da FAP humana compreende os resíduos 26-760 da proteína FAP humana de comprimento omplete. Em alguns casos FAP é FAP murina (também conhecida como proteína de ativação de fibroblastos ou integrante da protease de serina omplete), a sequência de aminoácidos do que é divulgado no UniProt No. de acesso P97321 (Versão 117, de 11 de Dezembro de 2013) (SEQ ID NO: 16). O domínio omplete ular da FAP murina compreende os resíduos 26-761 da proteína FAP murina de comprimento omplete.

Conjugado

[0092] Tal como aqui utilizado “conjugado” inclui a estrutura resultante formada através das moléculas de ligação e inclui especificamente moléculas de conjugados anticorpo-droga (ADCs) e as imunotoxinas (Its).

Seletivamente liga

[0093] Os termos liga seletivamente e ligação seletiva referem-se a ligação de um anticorpo, ou fragmento de ligação do mesmo, a uma molécula pré-determinada (por exemplo, um antígeno) de um modo específico. Por exemplo, o anticorpo, ou fragmento de ligação do mesmo, podem-se ligar a FAP, por exemplo, uma porção extracelular dos mesmos, com uma afinidade de pelo menos cerca de 1x107M-1, e podem-se ligar à molécula pré- determinada com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior (por exemplo, cinco vezes ou mais de dez vezes) do que a sua afinidade para se ligar a uma molécula diferente da molécula pré-determinada.

Molécula de anticorpo

[0094] Tal como aqui utilizado com referência a todos os aspectos da invenção, o termo "anticorpo" ou "molécula de anticorpo" inclui qualquer imunoglobulina quer natural ou total ou parcialmente produzidas sinteticamente. O termo "anticorpo" ou "molécula de anticorpo" inclui anticorpos monoclonais (mAb) e anticorpos policlonais (incluindo anti-soros policlonais). Os anticorpos podem ser intactos ou fragmentos derivados de anticorpos completos (ver abaixo). Os anticorpos podem ser anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos de origem não-humana. "Anticorpos monoclonais" são populações de anticorpos altamente específicas, homogêneas, dirigidas contra um único local antigênico ou "determinante" da molécula-alvo. "Anticorpos policlonais" incluem populações heterogêneas de anticorpos que são dirigidas contra diferentes determinantes antigênicos da molécula alvo. O termo "anti-soro" ou "anti- soro" refere-se ao soro de sangue contendo anticorpos obtidos a partir de animais imunizados.

[0095] Foi demonstrado que fragmentos de um anticorpo completo podem desempenhar a função de antígenos de ligação. Assim, a referência ao anticorpo aqui, e com referência aos métodos, matrizes e kits da invenção, abrange um anticorpo completo e também cobre qualquer proteína ou polipeptídeo compreendendo um fragmento de ligação ao anticorpo. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1 ; (ii) o fragmento Fd que consiste em domínios VH e CH1 ; (iii) o fragmento Fv consistindo dos domínios Veu e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb que consiste de um domínio VH ; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antígeno; (viii) dímeros biespecíficos de cadeia simples Fv (WO 93/11161) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (WO94/13804; 58).Moléculas Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de bissulfeto que ligam os domínios VH e VL. Minicorpos que compreendem um scFv ligado a um domínio CH3 também podem ser feitos.

[0096] Em relação a uma molécula de um anticorpo, o termo "seletivamente liga" pode ser aqui utilizado para referir a situação em que um membro de um par de ligações específicas não apresentará qualquer ligação significativa a moléculas outras do que o seu parceiro de ligação específico (s). O termo também é aplicável onde por exemplo, um antígeno de ligação de local é específico para um epítopo particular, que é transportado por um número de antígenos, caso em que o membro de ligação específico que transporta o local de ligação ao antígeno será capaz de se ligar aos vários antígenos que transportam o epítopo.

[0097] Em alguns casos, em conformidade com a presente invenção, o anticorpo pode ser um anticorpo totalmente humano.

Agentes quimioterápicos citotóxicos

[0098] Em alguns casos, em conformidade com qualquer aspecto da presente invenção, o conjugado da invenção pode ser administrado com, ou para administração com, (quer simultaneamente, sequencialmente ou separadamente) uma ou outras drogas antitumorais, incluindo, mas não limitado a um agente quimioterápico citotóxico ou um agente anti- angiogênico ou um agente imunoterápico.

[0099] Agentes quimioterápicos citotóxicos são bem conhecidos na técnica e incluem agentes anti-câncer, tais como: Os agentes alquilantes incluindo mostardas de nitrogênio tais como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano (L-sarcolisina) e clorambucil; 10 etileniminas e metilmelaminas tais como hexametilmelamina, tiotepa; sulfonatos de alquil tais como bussulfano; nitrosoureias tais como carmustina (BCNU), lomustina (CCNLJ), semustina (metil-CCN-L) e estreptozoeína (estreptozotocina); e triazenos tais como decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazolcarboxamida); Antimetabolitos incluindo análogos de ácido fólico tais como metotrexato (ametopterina); análogos de pirimidina tais como fluorouracil (5- fluorouracil; 5-FU), floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) e citarabina (arabinósido de citosina); e análogos de purina e inibidores relacionados tais como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) e pentostatina (2'-deoxicofonicina). Produtos naturais incluindo alcaloides de vinca tais como vinblastina (VLB) e vincristina; epipodofilotoxinas tais como etoposido e teniposido; antibióticos tais como dactinomicina (actinomicina D), daunorabicina (daunomicina; rubidomicina), doxorrubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) e mitomicina (mitomicina Q; enzimas, tais como L-asparaginase; e modificadores de resposta biológica, tais como interferon alfenomos. Agentes diversos incluindo complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina (cis-DDP) e a carboplatina; antracenodiona tal como mitoxantrona e antbraciclina; ureia substituída tal como hidroxiureia; metil derivado de hidrazina tais como procarbazina (N- metil-hidrazina, MIH); e supressor adrenocortical tais como mitotano (o, p'-DDD) e aminoglutetimida; taxol e análogos/derivados; e agonistas/antagonistas de hormônio tais como flutamida e tamoxifeno. Um outro agente citotóxico preferido é Gencitabina (Gemzar®). Um outro agente citotóxico preferido é o paclitaxel ligado a albumina de soro humano (Abraxane®).

[0100] Agentes anti-angiogênicos são bem conhecidos na técnica e incluem agentes anti-câncer, tais como bevacizumab, itraconazol e carboxiamidotriazol.

[0101] Agentes imunoterápicos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, anticorpos de proteína de morte celular anti-programada 1 (PD- 1) e anticorpos de ligante de morte anti-programada 1 (PD-L1), incluindo Nivolumab (MDX1106) e Pembrolizumab (MK-3475).

Composições Farmacêuticas

[0102] Os conjugados da presente invenção podem ser compreendidos em composições farmacêuticas com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0103] Um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um composto ou uma combinação de compostos que entram numa composição farmacêutica que não provoca reações secundárias e que permite, por exemplo, facilitar a administração do conjugado, um aumento da sua vida útil e/ou na sua eficácia no corpo ou um aumento da sua solubilidade em solução. Estes veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão adaptados pelo versado na técnica em função do modo de administração do conjugado.

[0104] Em algumas modalidades, os conjugados da presente invenção podem ser fornecidos numa forma liofilizada para reconstituição antes da administração. Por exemplo, os conjugados liofilizados podem ser reconstituídos em água estéril e misturados com solução salina antes da administração a um indivíduo.

[0105] Os conjugados da presente invenção serão geralmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente em adição ao conjugado. Assim, composições farmacêuticas podem compreender, além do conjugado, um excipiente, carreador, tampão, estabilizador farmaceuticamente aceitável ou outros materiais bem conhecidos àqueles versados na técnica. Esses materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do conjugado. A natureza precisa do transportador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser por bolus, infusão, injeção ou qualquer outra via adequada, tal como discutido abaixo.

[0106] Para administração intravenosa, por exemplo, por injeção, a composição farmacêutica que compreende o conjugado pode estar na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogênios e possui pH adequado, a isotonicidade e a estabilidade. Os versados na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de lactato de Ringer. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser utilizados, conforme necessário, incluindo tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3'-pentanol; e m-cresol) ; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; sal formador de contra-íons, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo. complexos de proteína-Zn); e/ou surfactantes não-iônicos, tais como TWEENTM, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG).

Sujeito

[0107] O sujeito pode ser um humano, um animal de companhia (por exemplo um cão ou um gato), um animal de laboratório (por exemplo, um camundongo, rato, coelho, porco ou um primata não humano), um animal doméstico ou agrícola (por exemplo, um porco, vaca, cavalo ou ovelha). Preferencialmente, o sujeito é um ser humano. Em alguns casos, o sujeito pode ser um ser humano diagnosticado ou classificado como estando em risco de desenvolver um câncer, por exemplo, um tumor epitelial. Em certos casos, o sujeito pode ser um animal de laboratório, por exemplo, um modelo de camundongo de um câncer. Em certos casos, o sujeito pode ser um mamífero (por exemplo, um humano) que foi diagnosticado com, ou classificado como estando em risco de desenvolver uma condição inflamatória, como a artrite reumatoide (RA). Em particular, o sujeito pode ser um humano tendo RA.

Câncer

[0108] Os conjugados anti-FAP aqui descritos encontram utilidade no tratamento de um tumor num sujeito mamífero. O tumor pode ser um tumor sólido. Em particular, o tumor pode ser câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça & pescoço, câncer de ovário, câncer de bexiga ou câncer de cólon.

Condição inflamatória

[0109] Em alguns casos, em conformidade com a presente invenção, o anticorpo anti-FAP ou o conjugado anticorpo-droga pode ser para uso no tratamento de uma condição inflamatória. Expressão FAP tem sido relatada em sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSs) em pacientes de artrite reumatoide (RA) (ver, por exemplo, Bauer et al., Arthritis Res. Therp. (2006): 8 (6); R171). Os presentes inventores acreditam que os anticorpos anti-FAP aqui descritos, e/ou os conjugados dos mesmos aqui descritos, são capazes de melhorar RA e/ou sintomas de RA.

[0110] O que se segue é apresentado a título de exemplo e não é para ser interpretado como uma limitação ao âmbito das reivindicações.

Exemplos Exemplo 1 - Produção de anticorpos anti-FAP

[0111] ScFvs anti-FAP selecionados por exibição em fagos a partir de uma FAP imunizada- / - camundongo knock-out foram descritos anteriormente (28). Dois scFvs, "MO36" e "MO33", com reatividade cruzada para o FAP humano e murino (28) foram convertidos em IgG de comprimento completo para estudos subsequentes de caracterização e para geração de imunotoxinas e ADCs. Estes scFv (scFv33 e scFv36) foram usados para gerar anticorpos quiméricos, fundindo domínios constantes de cadeia pesada e leve a VH e VL, respectivamente. Além disso, ambos foram humanizados por enxerto de CDR e testados quanto à ligação a células que expressam FAP e FAP recombinante em comparação com o scFv parental. A partir desta comparação, o melhor ligante foi utilizado para gerar a IgG de comprimento completo. Todos os scFvs foram produzidos em E. coli e purificado por IMAC, IgG foram produzidas em células de mamífero (CHO), utilizando os vetores de expressão Lonza GS pEE6.4 e pEE14.4 desenvolvidos para a produção de anticorpos. Características dos scFvs estão resumidos na Tabela 1.Tabela 1: anticorpos, especificidades, subclasse e vetores utilizados como material de partida

[0112] Todos os scFvs foram produzidos por bactérias, em E.coli TG1 e purificada a partir dos extratos periplasmáticos de culturas de 1L por IMAC. Ambos os anticorpos humanizados (scFv hu33 e hu36) foram purificados na forma solúvel, com rendimentos de cerca de 0,6 mg/L de cultura. Em SDS- PAGE as proteínas migraram com o tamanho esperado de aproximadamente 30kDa (Figura 1A). A pureza foi estimada como sendo> 90%. Em experiências de citometria de fluxo utilizando células HT1080 que expressam FAP (transfectantes estáveis) humanas, uma ligação semelhante foi observada para o scFv hu36 e mo36 scFv, que também foi produzido em bactérias (não mostrado). Valores EC50 ficaram na gama nanomolar baixa. Algumas diferenças foram observadas para concentrações mais elevadas (Figura 1B). scFv hu33 não mostrou nenhuma ligação ou apenas ligação marginal nesses experimentos. Por conseguinte, um maior desenvolvimento focado em hu36. A ligação de scFv hu36 também foi observada por ELISA com FAP humana recombinante (região extracelular aa 26-760; sistemas de R&D), embora a ligação foi um pouco mais fraca do que a observada para mo36 scFv (Figura 1C).

[0113] Os plasmídeos correspondentes aos anticorpos IgG1 de comprimento completo foram gerados e transfectados em células CHO para produção de anticorpos no sistema de expressão Lonza CHO com rendimentos de cerca de 1 mg/L de cultura de células (escala laboratorial). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura celular por cromatografia de proteína A. As proteínas purificadas foram caracterizadas por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho. A bioatividade foi analisada por ELISA usando FAP recombinante e a detecção de anticorpos ligados com anticorpos anti-IgG humana conjugados com HRP. A ligação celular foi analisada por citometria de fluxo utilizando células HT1080 linha FAP.

Resultados:

[0114] Os plasmídeos gerados (e sequenciados):mo36 IgG1: pEE14.4 mo36-IgG1 OCMTX001p (IgG1 quimérico anti FAP) hu36 IgG1: pEE14.4 hu36-IgG1 OCMTX002p (IgG1 humanizado anti-FAP)

Exemplo 2 - Caracterização dos anticorpos anti-FAP

[0115] As sequências de aminoácidos do anticorpo humanizado antiFAP IgG1 hu36 (hu36-IgG1) de cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC), respectivamente, estão apresentados a seguir: Anti-FAP hu36-IgG1-HC: METDTLLLWVLLLWVPGSTG QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTENIIHWVRQAPGQGLEWMG WFHPGSGSIKYNEKFKDRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR HGGTGRGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK G LP SSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 1) aa 449 MW de HC processado 49,069 PI teórico 8,69 Potencial local de glicosilação (duplo sublinhado): N297 Mutações que conduzem a deficiência de ADCC e CDC são mostradas em negrito e itálico (ver também WO 99/58572) Sequência de sinal é mostrada em caixa Domínio VH é sublinhado; CDRH1-H3 são exibidas em negrito e sublinhado curvo. Anti-FAP hu36-IgG1-LC: METDTLLLWVLLLWVPGSTG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSAYSYM-HWYQQKPGKAPK LLIYLAS.NLE.SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSRELPY TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2) aa 218 MW de HC processado 23.919 pI teórico 7,77 Sequência de sinal é colocada em caixa Domínio VL é sublinhado; CDRL1-L3 são exibidas em negrito e sublinhado curvo. hu36-IgG1-HC - sem sequência de sinal: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTENIIHWVRQAPGQGLEWMG WFHPG.SGSIKYNEKFKDRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR HGGTGRGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK G LP SSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 3) hu36-IgG1-LC - sem sequência de sinal: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSAYSYM.HWYQQKPGKAPK LLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSRELPY. TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4) hu36-VH: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTENIIHWVRQAPGQGLEWMG WFHPGsGsIKYNEKFKDRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR HGGTGRGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5) hu36-VL: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAsKsVsTsAYsYMHWYQQKPGKAPK LLIYLAsNLEsGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHsRELPY TFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 6) hu36-CDRH1: ENIIH (SEQ ID NO: 7) hu36-CDRH2: WFHPGSGSIKYNEKFKD (SEQ ID NO: 8) hu36-CDRH3: HGGTGRGAMDY (SEQ ID NO: 9) hu36-CDRL1: RASKSVSTSAYSYMH (SEQ ID NO: 10) hu36-CDRL2: LASNLES (SEQ ID NO: 11) hu36-CDRL3: QHSRELPYT (SEQ ID NO: 12) Parâmetros do hu36-IgG total são os seguintes: Comprimento total de IgG (aa): 1.334 Massa molecular calculada de IgG de comprimento total: 145.922 Coeficiente de extinção calculado de IgG de comprimento total: 209.420 Abs 0,1% (=1 g/l) 1.435 pl teórico: 8,60 potencial local de glicosilação: N297

[0116] Anticorpos anti-FAP humanos e quiméricos purificados mo36 hu36 foram analisados em ELISA para ligação de FAP recombinante. Ambos os anticorpos anti-FAP mostraram específica e forte ligação ao FAP recombinante com valores EC50 semelhantes (cerca de 5 nM) (Figura 2A). Além disso, ambos os anticorpos mostraram ligação a HTP1080-FAP expressando FAP humana na sua superfície celular (Figura 2B). A IgG humanizada deu sinais mais fortes em comparação com a IgG quimérica, no entanto, com valores EC50 semelhantes. O anticorpo humanizado anti-FAP hu36 era capaz de reagir de forma cruzada com ambos FAP humana e murina como mostrado por análise de FACS (Figuras 3A e 3B). Hu36-IgG1 ligado de um modo dependente da concentração de ambas as linhas celulares, com valores de EC50 (0,33 subnanomolares e 0,25nM).

[0117] Para aumentar a escala os construtos de anticorpo foram clonados em vetores GS duplos (pEE14,4). Os plasmídeos de DNA foram transformados, amplificados, e transientemente transfectados para células CHOK1SV para a avaliação da expressão a um volume de 200 ml. Num segundo passo, os anticorpos foram transitoriamente expressos em culturas em larga escala de 5-10 L.

[0118] Sobrenadante clarificado de cultura foi purificado utilizando cromatografia em Proteína A de um só passo. Produto de análise de qualidade através de SE-HPLC, SDS-PAGE e LAL foi realizado utilizando material purificado a uma concentração de 1 mg/ml, juntamente com um anticorpo humano interno, como uma amostra de controle.

[0119] As amostras de proteínas purificadas foram filtradas através de um filtro de 0,2 μm e analisadas por SE-HPLC cromatogramas. Os anticorpos foram purificados a> 98,8%. Os níveis de endotoxina foram <0,5 EU/mg.

[0120] Todas as proteínas purificadas foram analisadas por SDS- PAGE em condições redutoras e não redutoras (dados não mostrados).

[0121] As proteínas purificadas hu36-IgG e mu36-IgG foram caracterizadas por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho. A bioatividade foi analisada por ELISA usando FAP recombinante e a detecção de anticorpos ligados com anticorpos anti-IgG humana conjugados com HRP. A ligação celular foi analisada por citometria de fluxo utilizando células HT1080 linha FAP. Os pontos de fusão foram determinados por dispersão de luz dinâmica usando um nano Zetasizer. Afinidades foram determinadas por QCM usando um Attana A100. Estudo de internalização foi realizado por meio de microscopia confocal de imunofluorescência indireta em células permeabilizadas, a detecção de anticorpos ligados e internalizados com um anticorpo secundário marcado com FITC.

[0122] Os anticorpos IgG1 de comprimento completo purificados foram produzidos com sucesso, tanto à escala laboratorial e em grande escala, para a produção de imunoconjugados. Um resumo das propriedades de anticorpo é apresentado na Tabela 2. Os anticorpos mantiveram a sua especificidade, como se mostra por ELISA e experiências de citometria de fluxo. As células que expressam FAP ligadas a anticorpos com valores EC50 subnanomolares. As afinidades, como determinado por QCM, eram comparáveis com as de anticorpos parentais. Medições QCM indicaram a contribuição de efeitos de avidez para a ligação de alta afinidade. A estabilidade térmica diferente entre as diferentes IgGs (77-80°C).

[0123] Internalização rápida foi mostrada para hu36-IgG1 (anticorpo humanizado anti-FAP) em células HT1080-FAP (ver Figuras 4 e 5).Tabela 2: Resumo das propriedades de anticorposy1 * = deficiente para o ADCC e CDC (ver Amour et al., 1999; Richter et al., 2013).

Ligação in vivo de anti-FAP IgG1.

[0124] Anti-FAP IgG1 hu36 foi administrada por via intraperitoneal a camundongos de xenoenxerto derivados de paciente para o câncer de pâncreas com uma dose única de 1 mg e 5 mg/kg. Os tumores foram retirados após 12, 24 e 48 h de administração, fixados em formol e fixados em parafina. A imunodetecção de hu36 anti-FAP foi feita com um anticorpo secundário anti-IgG humano. A Figura 12 mostra a coloração da dose dependente de tempo específica de estroma, apenas em amostras de tumores de camundongos tratados.

Exemplo 3 - cadeia A Nigrin-b

[0125] A fim de evitar os efeitos colaterais da toxina livre que poderia ser liberada na corrente sanguínea e para reduzir a potencial imunogenicidade da toxina RIP, como extensivamente descrita com ricina, o domínio enzimático de Nigrin b, a cadeia A, foi clonada e expressa em bactérias. Os presentes inventores hipotetizaram que, se a cadeia A produzida em bactérias era capaz de manter a sua atividade, não seria capaz de entrar nas células, a não ser conjugada com uma molécula veículo, tal como um anticorpo.

Produção

[0126] Cadeia A Nigrin-b- foi sintetizada tendo em conta a otimização de códons para expressão bacteriana e o gene sintetizado foi clonado em dois vetores diferentes, Nigrin_pET30b-3 e Nigrin_pET33b-1 (+/- His tag) para a expressão em duas estirpes E. coli diferentes, E. coli BLR (DE3) e E. coli HMS174 (DE3). Meios de cultura diferentes foram usados para verificar diferentes condições de expressão. Purificação de processo foi estabelecida utilizando cromatografia Capto Q e SP Sepharose de alta performance. Recombinante purificada cadeia A Nigrin-b (recNgA) foi formulada a 5mg/ml em PBS 1X pH 7,4, DTT 0,5 mM, glicerol a 10%. Os níveis de endotoxina foram <1EU/mg de Nigrin e a pureza> 99% na forma monomérica.

[0127] Sequenciação N-terminal Eldman revelou que extremidade do terminal N de recNgA correspondeu à sequência esperada.

[0128] Nigrin-b sequência de aminoácidos da cadeia A recombinante: MIDYPSVSFNLDGAKSATYRDFLSNLRKTVATGTYEVNGLPVLRRESEVQ VKSRFVLVPLTNYNGNTVTLAVDVTNLYVVAFSGNANSYFFKDATEVQKS NLFVGTKQNTLSFTGNYDNLETAANTRRESIELGPSPLDGAITSLYHGDSV ARSLLVVIQMVSEAARFRYIEQEVRRSLQQATSFTPNALMLSMENNWSSM SLEIQQAGNNVSPFFGTVQLLNYDHTHRLVDNFEELYKITGIAILLFRCSSP SND (SEQ ID NO: 13)

[0129] A cadeia A Nigrin-b recombinante tem as seguintes características: Número de aminoácidos: 256 Peso molecular: 28546,0 Pl teórico: 5,45

[0130] A sequência de nucleotídeos que codifica cadeia A Nigrin-b recombinante é a seguinte: atagactatc cctccgtctc cttcaacttg gatggagcca agtcggctac atacagggac ttcctcagca acctgcgaaa aacagtggca actggcacct atgaagtaaa cggtttacca gtactgaggc gcgaaagtga agtacaggtc aagagtcggt tcgttctcgt ccctctcacc aattacaatg gaaacaccgt cacgttggca gtagatgtga ccaaccttta cgtggtggct tttagtggaa atgcaaactc ctactttttc aaggacgcta cggaagttca aaagagtaat ttattcgttg gcaccaagca aaatacgtta tccttcacgg gtaattatga caaccttgag actgcggcga atactaggag ggagtctatc gaactgggac ccagtccgct agatggagcc attacaagtt tgtatcatgg tgatagcgta gcccgatctc tccttgtggt aattcagatg gtctcggaag cggcaaggtt cagatacatt gagcaagaag tgcgccgaag cctacagcag gctacaagct tcacaccaaa tgctttgatg ctgagcatgg agaacaactg gtcgtctatg tccttggaga tccagcaggc gggaaataat gtatcaccct tctttgggac cgttcagctt ctaaattacg atcacactca ccgcctagtt gacaactttg aggaactcta taagattacg gggatagcaa ttcttctctt ccgttgctcc tcaccaagca atgat(SEQ ID NO: 14) Materiais - Nigrin_pET30b-3 construto genético. - Escherichia coli (Migula) Castellani e Palmers BLR (DE3) - Meios de cultivo: média autoinduzida (AIM) - Tampão de cultura de extração: Glicina/NaOH a 10 mM, Leupeptina 1 ug/ml, Pepstatina 1 μg/ml, pH 9,5. - Tampão sobrenadante de extração Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 2 mM, leupeptina 1μgml-1, pepstatina 1 μgml-1, lisozima 0,1 mgml-1, pH 8,0. - Diálise solução: Ácido cítrico/ NaOH a 25 mM pH 5,0. -Capto Q FPLC: Tampão de equilíbrio A: Glicina/NaOH pH 9,5 50 mM. Tampão de eluição B: Glicina/NaOH a 50 mM pH 9,5, NaCl 1 M. - Frações reunidas a partir da etapa Capto Q (extração de + 80 mL). - SP Sepharose HP FPLC: Tampão de equilíbrio A: Ácido cítrico pH4.0.Eluição 25 mM de tampão B: Ácido cítrico pH 4,0 25 mM, NaCl 1 M.

Métodos

[0131] E. coli BLR (DE3) segurando expressão Nigrin_pET30b-3 cultivada em formato de 1L de Meio Auto Induzível (AIM) com 30 μgml-1 Canamicina. A expressão proteica foi desencadeada pela ativação de lactose e glicose após depleção de cerca de 3-4 horas de crescimento. Em seguida, a temperatura foi baixada para 20°C durante a duração de uma noite.

[0132] Para a extração, cada sedimento celular foi ressuspenso em 80 ml inicialmente de tampão de extração por litro de cultura, e 3 ciclos de 7 minutos a desintegração em 1100-110 Bar foram realizados após 30 minutos de incubação à temperatura de 8°C sob agitação. Em seguida, o extrato foi submetido a centrifugação a 60 minutos 15,900g, 8°C. O sobrenadante foi o material de partida da purificação.

[0133] -Capto Q FPLC: 160 ml de produto foi extraído a partir da cultura 8l foram carregados em 160 ml Capto Q e equilibrados usando 4CV de tampão de equilibração e lavados com 15CV de tampão de equilibração. A eluição foi efetuada em três passos: 15CV em 1.5mS/cm (7,6%B); 20CV em 23,8 mS/cm (18,9%B); 20CV 100%B.

[0134] A diálise foi realizada nas seguintes condições: 650 ml do produto foram dialisados em 4x5Lbathsin em ácido cítrico/NaOH a 25 mM pH 5,0, 6-8000Da de corte. Fator de diálise ~ 3500, <24h. Após diálise, a 30 minutos de centrifugação em 20,500g e 8°C, deixou-se separar as frações solúveis das insolúveis. SDS-PAGE foi realizada em frações solúveis totais e ambas as pré e pós diálise (10μl carregados em SDS-PAGE). O eluente foi dialisado em PBS pH 7,4 e filtrou-se Φ = 0,22μm utilizando 2x20cm2 filtros EKV.

[0135] -SP Sepharose HP: 610ml de piscina dialisada Capto Q em pH 5,0 de ácido cítrico a 25 mM foram colocados em 240 ml de SP Sepharose de alta performance com 4CV de tampão de equilibração e lavada com 15CV de tampão de equilibração e eluida com um gradiente de 25CV a 20%B; etapa 4CV de 100%B.

[0136] As frações reunidas derivadas da etapa SP Sepharose HP foram dialisadas em PBS pH 7,4, DTT 0,5 mM (banhos 5x4L, frações reunidas, de 950 mL a 0,97 mg/ml). Corte foi 6-8000 Da, fator de diálise foi de ~ 3130, time> 24h. Depois de 30 minutos de centrifugação a 8°C e 20,55g deixou-se separar frações solúveis a partir de insolúveis. 10% de glicerol foi adicionado depois.

[0137] Finalmente, o eluente foi dialisado em PBS pH 7,4 (5 banhos ~ 3100) e filtrado Φ = 0,2μm, em seguida, o lote recNg b A foi rapidamente congelado a -80°C. A SEC no S200 Superdex Semi-Preparativo mais tarde foi realizado.

[0138] A cromatografia de exclusão por tamanho e a análise de espectrometria de massa demonstraram estado monomérico e de purificação do recombinante obtido cadeia A nigrin-b (recNgA) (Figura 6).

[0139] Os estudos de estabilidade foram realizados para avaliar o efeito do pH e da temperatura na própria proteína de cadeia A nigrin-b e a sua atividade. recNgA é estável a um pH variando de 5 a 9, e na presença ou não de glicerol (de 10 a 45%) (dados não mostrados).

Atividade

[0140] A atividade da proteína de inativação de ribossomas (RIP) de cadeia A Nigrin-b recombinante foi testada em lisados livres de células de reticulócitos de coelho: Valor IC50 obtido foi semelhante à nigrin-b nativa e dentro da gama de 2,5 a 25 pM (ver Figura 7). Assim, a cadeia A Nigrin-b, expressa como uma proteína recombinante em bactérias, mantém a sua atividade enzimática, apoiando que a glicosilação não é necessária para a atividade da RIP cadeia A Nigrin-b.

[0141] RecNgA retém a sua atividade nos lisados de células livres de reticulócitos de coelho, se armazenado congelado a (-80 ° C) e inferior a 3 ciclos de congelação-descongelação (não mostrados).

[0142] A atividade citotóxica dos recNgA foi testada em culturas de células por meio de ensaio de viabilidade baseados em violeta de cristal. recNgA, a que falta a cadeia B para translocar dentro de células, apresenta uma atividade de 100 a 1000 menos tóxica do que Nigrin-b nativa, tal como mostrado na Figura 8. Nigrin b nativa mostrou uma IC50~2x10-8M (similar aos dados publicados anteriormente; veja 33), enquanto recNgA mostrou uma IO—2x10 6M.

[0143] Anteriormente estudos publicados mostraram que Nigrin b nativa apresenta maior atividade RIP do que Ricina em ensaio RRL, ao mesmo tempo que é muito menos tóxica (30-10,000 vezes, aproximadamente), em células ou in vivo (ver IC50 e LD50 valores na Tabela 3).

[0144] Após a remoção da cadeia B, cadeia de ricina A perde atividade em ambos ensaios RRL e ensaios de citotoxicidade. Inesperadamente, cadeia A Nigrin b, gerada pela primeira vez na presente invenção, só perde atividade no ensaio de citotoxicidade de célula, ao mesmo tempo que foi ainda aumentada no ensaio RRL em relação à Nigrin b nativa. Estes dados estavam sugerindo que, no caso de ricina, a remoção da cadeia B estava afetando não só a ligação e translocação da cadeia A, mas também a sua atividade RIP, enquanto este não era o caso para cadeia A Nigrin b que mantém e até aumenta a sua atividade RRL em relação ao seu homólogo nativo. Como resultado, cadeia A Nigrin b é 50 vezes mais ativa do que a cadeia de ricina A em RRL.

[0145] Consequentemente, após conjugação, conjugados de cadeia A Nigrin b apresentam maior atividade citotóxica (IC50 dentro da gama pM) do que de conjugados de cadeia de ricina A, (gama de nM) (dados não mostrados).Tabela 3: In vitro e in vivo dados da atividade ricina e Nigrin (nativo e cadeia A).(Próprios dados dos Inventores - cadeia A Nigrin b; ver também Ferreras JM et al, Toxins, 3: 420, 2011; Svinth M. et al., BBRC, 249: 637, 1998)

Exemplo 4 - Conjugação de cadeia A Nigrin-b a anticorpos anti-FAP

[0146] Para imunoconjugados contendo RIPs exibirem citotoxicidade máxima, a RIP deve ser liberada a partir do veículo de direcionamento em forma totalmente ativa, que exige evitar detenção estérica (34)). A ligação bissulfeto é o único tipo de ligação que se encaixa nesse critério (35, 36). Esta ligação permite que a conjugação utilizando reagentes para a introdução de grupos sulfidril livres, tais como N-succinimidil 3 (2-piridil- ditiopropionato) (SPDP) e tolueno 4-succinimidiloxicarbonil-α-metil-α (2- piridil-ditio) (SMPT). Imunotoxinas constituídas de mAbs covalentemente ligadas a toxinas por ligantes bissulfeto impedidos, muitas vezes rotuladas como imunotoxinas de segunda geração, são estáveis e de longa vida e exibem potente citotoxicidade a células alvo (37).

[0147] SPDP já foi utilizado na confecção de imunotoxinas (ITs) contendo nigrin b (38, 39). Além disso SMPT protege a ligação bissulfeto de ataques de ânions tiolato, melhorando a estabilidade da ligação in vivo (40, 41).

Material

[0148] Cadeia A nigrin b -Recombinante em PBS, pH 7,4, 10%glicerol, 0,5mM DTT, 4,92gl-1, armazenadas a 5°C. - 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico) - GE PD MiniTrap G-10 colunas de dessalinização. - 0,2 Mm 28 milímetros filtros Minisart estéreis. - Sciclone estação de trabalho ALH 3000. - Sarstedt Microtest placa de 96 poços de fundo plano, ref n° 82,1581. Métodos

[0149] Ditiotreitol (DTT, reagente de Cleland's) é um agente redox que vai ser utilizado para liberar os grupos de tiol presentes na amostra de proteína. Uma vez que os referidos grupos tenham sido liberados e assim estão disponíveis para a reação de 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico) (reagente de Ellman) será adicionado. Ponte de reagente bissulfeto Ellman vai ser clivada e as 2 moléculas resultantes tio-nitrobenzoato (TNB) irão anexar à proteína nos locais de grupo tiol. TNBS para titular os valores de absorvância serão tomados em À = 412 nm, um comprimento de onda em que não é absorvido DTT, resultando na concentração de grupos tiol. A proporção destes com a concentração da proteína feita a partir da sua absorvância a À = 280 produzirá o número de grupos tiol livres por molécula de proteína.

[0150] Titulação direta de tiol foi realizada como se segue:

[0151] 204 ul recNg b A foram dissolvidas em 796μl 20 mM de fosfato de 250 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7,0 (tampão de ensaio) (1.0033gl-1= concentração final). Reagente de Ellman foi dissolvido em tampão fosfato 0,2 M a 3gl-1. Para ambos os tampões fosfato de sódio monobásico e dibásico foram adicionados numa proporção de massa de 1,61 a 1. O pH foi ajustado à temperatura ambiente e os tampões foram filtrados. Tampão de 100 ml de Ellman e 500 ml de tampão de ensaio foram preparados. Reagente de Ellman foi completamente ressuspenso em vez pesado.

[0152] A amostra recNgA foi incubada na presença de 4,8 mM DTT à temperatura ambiente durante 30 min. A amostra recNgbA foi então purificada na coluna e os primeiros 10 ml do eluente divididos em partes iguais (V = 0,5 ml). A A280 das partes iguais foi tomada e as duas mais concentradas misturadas. A280 foi tomada novamente. 10 μl de 3 gl-1 DTNB foram adicionados e A412 medida após 2 min (n = 1), usando Ellman diluído em tampão de ensaio na mesma concentração que uma peça em bruto (nb= 3). Leituras pertenciam à faixa linear 0,1-3 AU. Soluções de proteína foram pipetadas logo abaixo do menisco após vórtex. 100 μl foram pipetados por poço.

[0153] Os resultados deste estudo mostram que o grupo tiol pertencente ao resíduo de cisteína única de recNgA é livre e disponível para a reação, não sendo bloqueado por sua estrutura terciária. Isto irá permitir que recNgbA seja conjugado utilizando um ligante que requer uma ligação de bissulfeto inter-cadeias impedida.

[0154] Está bem estabelecido que imunoconjugados que contêm proteína de inativação de ribossomas exibem citotoxicidade máxima apenas quando a molécula da toxina é liberada a partir do veículo de direcionamento em uma forma totalmente ativa. A separação da molécula de RIP, a partir do suporte é necessária para evitar a detenção estérica e para permitir uma translocação eficaz da toxina para o citoplasma (34)). Atualmente, a ligação bissulfeto é o único tipo de ligação que parece se encaixar nesses critérios (36).

[0155] O acoplamento das duas macromoléculas de proteínas diferentes, que resulta na formação de heterodímeros, requer que cada proteína seja modificada antes de misturá-las para reagir. No caso das cadeias A do tipo 2 RIPs, a modificação é limitada à clivagem redutora do resíduo de cisteína nativo que liga as cadeias ativa (A) e de ligação (B) da molécula.

[0156] Para moléculas de IgG, isto não é possível, porque os resíduos de cisteína estão envolvidos na manutenção da estrutura terciária e/ou quaternária da proteína, de modo que não é possível reduzi-las sem perda das funções específicas de proteínas. Além disso, presumivelmente, alguns dos resíduos de cisteína não são estéricamente acessíveis, como foi demonstrado pelos 10 grupos tióis por imunoglobulina que tinham de ser gerados para uma conjugação ótima para uma RIP ativada (42).

[0157] Por estas razões, na maior parte das moléculas de IgG, grupos tiol são quimicamente inseridos utilizando reagentes hetero-bifuncionais, e vários métodos foram desenvolvidos a fim de gerar hetero-conjugados evitando ou reduzindo ao mínimo a formação de homopolímeros. Na maioria dos casos, os reagentes utilizados para introduzir grupos tiol reagem com os grupos amino, formação de ligações amida ou amidina. Os grupos amino são reativos, abundantes e, de uma forma limitada para a maioria das proteínas, dispensáveis. Isto é, um número limitado de grupos amino podem ser modificados, sem diminuir a atividade biológica da proteína (36).

[0158] Os reagentes mais frequentemente utilizados para a introdução de grupos sulfidril livres são N-succinimidil 3- (2-piridil-ditiopropionato) (SPDP) e 4-succinimidiloxicarbonil-α-metil-α- (2-piridil-ditio) tolueno (SMPT), que introduzem os grupos dissulfureto de 2-piridil na proteína por meio de reação com grupos amino para formar amidas neutras, e metil-4- mercaptobutirimidato (2-iminotiolano. reagente de Traut) que introduz grupos mercaptobutirimidoil, que reagem para formar amidinas carregadas, preservando assim a carga positiva do ácido amino derivatizado (36, 41).

[0159] SPDP e SMPT introduzem ligação dissulfureto impedida, enquanto -SH 2-iminotiolano deve ser protegido fazendo-o reagir com ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (reagente de Ellman).

[0160] A reação com o reagente de Ellman é também utilizada para a medição rápida de grupos sulfidril de proteínas (43, 44).

[0161] SMPT tem um grupo metil e um anel de benzeno ligado ao átomo de carbono adjacente à ligação bissulfeto que o protege contra o ataque de anions tiolato, melhorando assim a estabilidade da ligação in vivo (40, 41).

[0162] Com base nestes dados, as proteínas de IgG podem ser modificadas com SMPT, que não afetam significativamente a propriedade de ligação ao antígeno das moléculas nas seguintes condições, mesmo se eles mudam a carga da proteína no local de reação.

[0163] No presente estudo, os inventores investigaram a conjugação humanizada anti-FAP-IgG1s com recNgA, utilizando 2 razões molares recNgA:mAb diferentes de 2,5 e 3,5, após derivatização utilizando uma proporção molar SMPT:mAb de 6, seguindo os protocolos de conjugação (36). A purificação foi realizada por cromatografia por exclusão de tamanho em Sephacryl S200 (37).

[0164] Sob as condições descritas, a imunotoxina é predominantemente uma mistura de anticorpo ligado a uma ou duas moléculas de toxina, com a presença de componentes de elevado peso molecular (IgG ligada a várias proteínas RIP), bem como RIPs livres e poliméricas (dimérica no caso de recNgA) e anticorpo livre. Assim, uma purificação cuidadosa se pensa ser desejável a obtenção de um produto puro.

Caracterização Bioquímica

[0165] Conjugados de imunotoxina anti-FAP hu36-IgG1-recNgA foram produzidos e caracterizados como se segue: Conjugado HPS131-001-1 Concentração 0,277 mg/mL Proporção droga:anticorpo (DAR): 1,8 PM: 182 kDa Pureza: 87% (13% de mAb livre)

Teste de atividade in vitro

[0166] Teste de atividade de conjugados preparados tal como descrito acima foi efetuado através de avaliação da atividade RIP no ensaio de lisado de reticulócitos de coelho isento de células (RRL) (Figura 9), e o efeito citotóxico sobre as culturas de células (Figuras 10A e 10B).

[0167] Os resultados do ensaio RRL mostram que os conjugados antiFAP hu36-IgG1-recNgA (HPS131-001-1) apresentaram valores de IC50 semelhantes aos de Nigrin-b ou recNgA nativas e estavam na gama de 3pM, que mostra que a conjugação de anticorpos não diminui a atividade enzimática de recNgA (ver Figura 9).

[0168] Os resultados de citotoxicidade celular demonstram que, em células de alelo selvagem HT1080, anticorpo conjugado HPS131-001-1 mostra apenas uma ligeira toxicidade (se houver) e somente em maior concentração, anti-FAP hu36-IgG1 nu não tem qualquer efeito, e recNgA mostra efeito citotóxico somente em 10-6M e, após incubação de 72h (ver Figura 10A).

[0169] No entanto, em células que expressam FAP, HT1080-FAP, apenas anticorpos anti-FAP HPS131-001-1 conjugados reduzem fortemente viabilidade celular de HT-1080-FAP na gama de concentração picomolar, com valores IC50 de 5pM (ver Figura 10B).

[0170] 1, estes resultados mostram que: 1) imunotoxinas anti- FAP:recNgA são altamente ativas in vitro, sendo citotóxicas na gama picomolar; 2) Atividade é altamente específica para a expressão FAP, uma vez que nenhum efeito significativo foi observado na HT1080-WT; 3)especificidade anti-FAP hu36-IgG1 para o seu alvo não é afetada pela conjugação de recNgA, nem a atividade enzimática da RIP recNgA; 4) A atividade é específica do conjugado anti-FAP hu36-IgG1, uma vez que nenhum efeito foi observado com a IgG1 nua; 5) imunotoxinas anti FAP:recNgA são internalizadas, uma vez que recNgA não conjugado (falta de domínio de ligação à membrana) mostra quase nenhum efeito citotóxico (IC50> 1μM) (ver Figura 8).

[0171] Em resumo, imunotoxinas anti-FAP:recNgA têm a capacidade in vitro de reconhecer especificamente o alvo (FAP), a ser internalizado no citosol e liberar a porção efetora recNgA para inibir ativamente os ribossomas, resultando em valores de citotoxicidade IC50 dentro da gama picomolar.

Avaliação in vivo do efeito anti-tumoral

[0172] Imunotoxina anti-FAP: recNgA foi testada in vivo em ambos os modelos de xenoenxerto de camundongo derivados de células e derivados de pacientes para câncer do pâncreas. Um estudo de gama de dose foi realizado pela primeira vez para definir a dose máxima tolerada em camundongos normais e cada um destes modelos: doses de 5-0,1 mg/kg foram administradas por via intraperitoneal uma vez por semana durante 3 semanas, e peso do animal foi monitorizado a cada 2 dias para detectar a possível perda de peso devido ao efeito tóxico da imunotoxina. Resultados são apresentados na Figura 13.

[0173] Doses elevadas (> 0,5 mg/kg) induziram hepatotoxicidade em camundongos normais, enquanto que nenhuma toxicidade dependente de FAP foi observada após análise patológica do útero e músculo esquelético, em que a baixa expressão FAP tem sido descrita (Dolznig H., et al., Cancer Immunol., 5: 10,2005; Roberts EW, et al., J. Exp.Med., 210:1137, 2013), nem no rim e coração. Doses mais baixas do que 0,5 mg/kg não induziram qualquer toxicidade não específica detectável na linha de células derivada ortotópica (Figura 13) e subcutânea derivada de paciente (Figura 14A) de xenoenxerto de modelos murinos de câncer de pâncreas.

[0174] Em estudos de eficácia realizados em seguida, em doses não tóxicas 0,5-0,1 mg/kg, imunotoxina anti-FAP:recNgA, aplicada como agente único ou em combinação com Gencitabina (240 mg/kg), não revelou nenhuma eficácia antitumoral in vivo em FAP (-) modelos murinos de linha celular ortotópica derivada de xenoenxertos (não mostrado), enquanto a alta eficácia antitumoral in vivo foi evidenciada na dose de 0,5 mg/kg em FAP (+) modelos de murino de xenoenxerto subcutâneo derivados de pacientes de câncer de pâncreas (Figura 14B). Quando combinado com Gencitabina (150 mg/kg), mostrou mesmo 100% de inibição do crescimento do tumor e regressão do tumor.

Exemplo 5 - citolisinas e sua conjugação a anticorpos anti-FAP

[0175] Tubulisinas são compostos naturais recentemente descobertos isolados a partir de Mixobacteria, capazes de desestabilizar o esqueleto de tubulina, induzindo a apoptose com uma atividade muito alta.

[0176] Levando a uma mudança rápida, irreversível e forte na morfologia celular, tubulisinas e os seus análogos sintéticos tetrapeptídicos, as citolisinas, são agentes altamente potentes que matam células (nM a atividade de pM). Tubulisina A inibe a polimerização da tubulina in vitro com uma IC50 de 0.75-1μM, bloqueando, assim, a formação de fusos mitóticos e induzindo a paragem do ciclo celular na fase G2/M. Tubulisinas competem fortemente com vinblastina através da ligação no local da tubulina vinblastina. Além disso, eles são estáveis em frações de células enriquecidas por lisossoma (45-48).

[0177] Passíveis de conjugação, muitos derivados de tubulisina/citolisina diferentes são acessíveis por síntese total em quantidades suficientes para o desenvolvimento pré-clínico e clínico; grupos funcionais na sua estrutura podem ser adaptados a diversas tecnologias diferentes de ligantes.

[0178] As citolisinas empregues para estudos de conjugação foram escolhidas a partir da estrutura geral acima indicada (fórmula IV). Estas estruturas exibem atividade contra diferentes linhas celulares de câncer (gama de nM a pM).

[0179] Vários sistemas de ligante podem ser utilizados e ligados a posição ou R2 ou R17 da molécula.

[0180] O esboço geral de conjugados de citolisina, incluindo o ligante vcPABA e anticorpo anti-FAP, é mostrado na Figura 11 (na estrutura ilustrada na Figura 11, o local de ligação da citolisina ao ligante vcPABA está na posição R1 ou R4 - R1 e R4 sistema de numeração utilizado na Figura 11 difere do sistema de numeração grupo R utilizado, por exemplo, nas reivindicações; pretende-se que R1 da Figura 11 corresponda a R2 nas reivindicações e que R4 da Figura 11 corresponda a R17 das reivindicações).

[0181] O ligante clivável vcPABA (valina-citrulina-PABC) protease foi anteriormente utilizado na molécula ADC Brentuximabe Vedotine, desenvolvida por Takeda e Seattle Genetics, e recentemente aprovada pela FDA e EMEA como Adcetris® (2011, e novembro 2012, respectivamente). Neste ADC o vcPABA foi acoplado na sua livre NH2 a maleimida caproil para a conjugação à base de tiol em mAb (anticorpo cAC10 anti-CD30). Por outro lado, vcPABA foi conjugada através do seu COOH na droga citotóxica auristatina de Seattle Genetics (MMAE). (ver 49)

[0182] Os presentes inventores utilizaram este ligante (maleimida caproil-vcPABA) para conjugar os anticorpos anti-FAP por meio de reação à base de tiol com o caproil maleimida, e na outra extremidade, as moléculas citotóxicas de citolisina através da sua piperidina cíclica com vcPABA (posições R1 ou R4 da citolisina mostradas na Figura 11).Síntese de maleimido-val-cit-PABOCO-Tubulisina/Citolisina-TAM461: TAM461 (Tubulisina/Citolisina): 30,0 mg (0,041 mmol) DMF: TAM465 (Ligante): 35 mg (0,045 mmol) HOBt: 1,4 mg DIPEA: 10 μL

[0183] TAM461 e TAM465 foram dissolvidos em DMF anidro sob condições secas e a solução resultante foi tratada com HOBt e DIPEA. A reação foi agitada à RT durante 18 h. A mistura de reação foi concentrada e o óleo resultante foi purificado por cromatografia em coluna, utilizando 2-6% de metanol: DCM para dar 35 mg (64%) de TAM467 como um sólido branco. ESI-MS: m/z = 1371 [M+H].Síntese de Maleimido-val-cit-PABOCO-Tubulisina/Citolisina-TAM470: TAM470 (Tubulisina/Citolisina): 0,07 mmol DMF: 5 mL TAM466 (Ligante): 50 mg (0,065 mmol) HOBt: 2,4 mg DIPEA: 18 µL

[0184] TAM470 e TAM466 foram dissolvidos em DMF anidro sob condições secas e a solução resultante foi tratada com HOBt e DIPEA. A reação foi agitada à RT durante 18h e, em seguida, analisada por TLC, que indicando a conclusão da reação, a mistura reacional foi concentrada e o óleo resultante foi purificado por cromatografia em coluna utilizando 4-12% de metanol: DCM para dar 56 mg de TAM471 (produção: 62%). ESI-MS: 1384,6 [M+1].

[0185] Teste de atividade In vitro é realizado. Atividade funcional será avaliada através de ensaio de inibição de microtúbulos, enquanto a atividade citotóxica é determinada através de ensaio de viabilidade de cristal violeta.

Geração de derivados de citolisina-ligante

[0186] Diferentes derivados de citolisina-ligante foram sintetizados de acordo com a estrutura geral apresentada na Figura 11, onde ligante vcPABA foi adicionado quer na posição R1 (TAM467, TAM551) ou R4 (TAM471, TAM553, TAM558), isoladamente ou com espaçador etileno-glicol (EG ; n=1 a 3), ou substituído por grupos etileno glicol (n=3) (TAM552). As respectivas estruturas químicas são apresentadas na Tabela 4.Tabela 4 - As estruturas químicas dos derivados de citolisina- ligante

[0187] A atividade de inibição de microtúbulos e atividade citotóxica de cada novo derivado foi avaliada através de ensaio de inibição da polimerização da tubulina (TPI; kit de ensaio de Polimerização de Tubulina; Citoesqueleto, Cat. #BK011P) e parada de proliferação celular em células HT1080 (CPA; cristal violeta). IC50 foram calculadas e os resultados são apresentados na Tabela 5.Tabela 5: Atividade de inibição de microtúbulos e a atividade de Citotoxicidade Celular de derivados de citolisina-ligante. (ND: Não determinado)

[0188] In vitro atividade de citolisina parental TAM334 está dentro da mesma gama de outras cargas úteis atualmente utilizadas para a produção de conjugados anticorpo-droga, tais como auristatinas (MMAE) ou maitansinoides (DM1-DM4). Como esperado e anteriormente descrito para outros compostos da família Tubulisina A, após a adição de ligante, a atividade citotóxica de células de citolisinas foi diminuída em relação ao composto parental TAM334. Além disso, derivado TAM467 estava apresentando atividade significativamente menor em ambos os ensaios. Todos os derivados foram usados em conjugação para gerar moléculas de ADC.

Conjugação e caracterização química de ADCs

[0189] Cada um dos derivados recém-gerados foi conjugado com o anti-FAP hu36 seguindo um método de conjugação não específico de local em resíduos de cisteína. Para este objetivo, um lote de anticorpo foi reduzido e feito reagir com cada um dos derivados. Proporções diferentes de TCEP foram testadas para atingir ótima DAR de 3-4, menos de 10% do anticorpo livre e drogas. Condições de conjugação ótimas foram como se segue: TCEP = 2,5 e 3,57 níveis de tiol de Ellmann. Os conjugados foram então purificados em Sephadex G25 e analisados através de Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) para determinar o seu grau de pureza, assim como a Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) e a cromatografia de fase reversa Polimérica líquida (PLRP) para determinar DAR, o conteúdo do anticorpo e de distribuição de perfil livre de diferentes espécies ADC (0-8 drogas/mAb). Conteúdo de droga livre foi avaliado pelo método de detecção de UV a 280 nm. Os resultados da análise química (perfis de SEC, HIC e PRLP) foram determinados para cada ADC e para o anticorpo livre (dados não mostrados). As características bioquímicas dos ADCs são mostradas na Tabela 6.Tabela 6: Resumo das características químicas das diferentes moléculas de ADC

[0190] As várias drogas produziram diferentes níveis de agregação. Especificamente ADC HPS157-039-002 (TAM551) mostraram maior nível de agregação já em DAR=3,08, deixando 22,4% do anticorpo não conjugado. A conjugação preliminar com TAM467 também mostrou alto nível de agregação: No Dar 3,27, pureza SEC já foi apenas 67% com 16% de droga livre (dados não mostrados). Estes dados foram sugerindo que ligante vcPABA na posição R1 era aparentemente menos do que ótimo para este tipo de molécula de citolisina sob estas condições.

Ligação de alvo de conjugados

[0191] Ligação anti-FAP hu36:TAM471 ADC à proteína de fusão huFAP foi analisada por ELISA, e a ligação às células HT1080-FAP por FACS (Figura 15). Para a análise FACS, os compostos foram incubados quer em diluições em série (Fig. 15B) ou em uma diluição (Fig. 15C; 10 nM) e detectada com uma IgG-PE anti-humana (cadeia / específica).

[0192] Valores EC50 obtidos nos dois ensaios não apresentaram diferença significativa em relação ao anticorpo hu36 anti-hu/moFAP nu (Fig. 15A & 15B). Nenhuma ligação foi observada em células FAP (-), tais como células HEK293 HT1080 em peso e (Fig. 15C).

[0193] A Figura 16 mostra que a ADC-471 (Fig. 16B) se liga especificamente e fica completamente internalizada após 90min em células HT1080-FAP, à semelhança do anticorpo anti-FAP nu (Fig. 16A). Estes resultados evidenciam que a conjugação não afetou especificidade alvo e afinidade, ou habilidade internalização do hu36 IgG1 anti-FAP.

Exemplo 6 - Avaliação da atividade citotóxica do efeito anti- tumoral in vitro e in vivo

[0194] Anti-FAP: candidatos citolisina ADC foram avaliados in vitro através de ensaio de paragem de proliferação (coloração violeta cristal). Os resultados são apresentados na Figura 17 e os valores IC50 na Tabela 7. Efeito anti-tumoral de cada candidato ADC foi avaliado num modelo de camundongo de xenoenxerto de derivados de paciente (PDX) para o câncer de pâncreas (PAXF-736). Este modelo foi previamente selecionado para o nível de expressão de FAP e expansão de estroma. Compostos ADC foram administrados uma vez por semana intraperitonealmente a 2,5 mg/kg. O volume do tumor e peso corporal foram medidos duas vezes por semana. Camundongos PDX tratados com veículo e tratados com Gencitabina (150 mg/kg) foram utilizados como grupos de controle negativo e positivo, respectivamente. Os resultados são mostrados na Figura 18.

[0195] Localização do ligante vcPABA sozinho na posição R1 (ADC- 551) gerou conjugados com atividade muito menos citotóxica in vitro em comparação com os conjugados utilizando a posição R4 (ADC-471) (Figura 17; Tabela 7) e nenhuma atividade anti-tumoral in vivo (Figura 18).

[0196] Aumentando o número de grupos de etileno-glicol como espaçador para ligante vcPABA na posição R4 (ADC-471 (n = 0) contra ADC- 553 (n = 1) e ADC-558 (n = 3)) foi demonstrado que o aumento de atividade citotóxica específica FAP in vitro (Figura 17) e efeito anti-tumoral in vivo (Figura 18). O conjugado TAM552 (ADC-552), tendo um espaçador 3 etilenoglicol, mas nenhum vcPABA presente no ligante foi encontrado para exibir pouca ou nenhuma atividade anti-tumoral in vivo (dados não mostrados). Enquanto ADC-471 e ADC-553 apresentaram baixa e nenhuma atividade citotóxica específica FAP (gama 10 nM e 100 nM de IC50, respectivamente) sem diferença entre as células HT1080-WT e FAP nem efeito anti-tumoral in vivo, ADC-558 apresentou uma atividade citotóxica específica FAP uma gama de 1 nM com uma razão de especificidade de 500 entre células HT1080 FAP (+) e FAP (-), e um efeito de inibição do crescimento do tumor de 40% a uma dose de 2,5 mg/kg no modelo de camundongo PDX para o câncer de pâncreas. Não foi observada perda de peso, nem nenhum efeito tóxico para os candidatos com esta dose (não mostrado).Tabela 7: Os valores IC50 obtidos em Ensaio de Detenção de Proliferação (nM)

[0197] Outras investigações foram realizadas utilizando ADC-558. A dose máxima tolerada (MTD) foi realizada em camundongos normais e ADC- 558 verificou-se ser não tóxico dentro da gama de 2,5 a 25 mg/kg de dose com um tratamento semanalmente durante 3 semanas. As doses de 20, 10, e 5 mg/kg, foram, em seguida, administradas semanalmente durante 4 semanas a um modelo de camundongo PDX (Panc185) com o nível de expressão elevado FAP e expansão de estroma para confirmar a inibição do crescimento do tumor e eficácia de regressão completa do conjugado ADC- 558.

[0198] Todas as referências aqui citadas são incorporadas aqui por referência a este documento na sua totalidade e para todos os efeitos, na mesma medida como se cada publicação ou patente ou pedido de patente individual tivesse sido especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência, na sua totalidade.

[0199] As modalidades específicas aqui descritas são oferecidas a título de exemplo, e não como forma de limitação. Quaisquer subtítulos são aqui incluídos apenas por conveniência, e não são para ser interpretados como limitando a divulgação de qualquer forma. Referências 1. Weinberg, R.A., et al., Garland science, Taylor & Francis Group LLC, Nova York, NY, USA, 2007 2. Nieman, K.M., et al., Nat. Med., 2011, 17: 1498-1503 3. Joyce, J.A., et al., Nat. Rev. Cancer, 2009, 9: 239-252 4. Hanahan, D., et al., Cancer Cell, 2012, 21: 309-322 5. Gupta, G.P., et al., Cell, 2006: 127: 679-695 6. Valastyan, S., et al., Cell, 2011, 147: 275-292 7. Meads, M.B, et al., Nat. Rev. Cancer, 2009, 9: 665-674 8. Olive, K.P., et al., Science, 2009, 324: 1457-1461 9. Acharyya, S., et al., Cell, 2012, 150: 165-178 10. Crawford, Y., et al. Cancer Cell, 2009, 15: 21-34 11. Straussman, R., Nature, 2012, 487: 500-504 12. Joyce, J.A., et al., Cancer Cell, 2005, 7: 513-520 13. Hanahan, D., et al., Cell, 2011, 144: 646-674 14. Kalluri, R., Nat. Rev. Cancer, 2006, 6: 392-401 15. Pietras, K., et al., Exp. Cell Res., 2010, 316: 1324-1331 16. Orimo, A., et al., Cell, 2005, 121: 335-348 17. Erez, N., et al., Cancer Cell, 2010, 17: 135-147 18. Olumi, A.F., et al., Cancer Res., 1999, 59: 5002-5011 19. Yang, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103: 16472 16477 20. Hwang, R.F., et al., Cancer Res., 2008, 68: 918-926 21. Hu, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106: 3372 3377 22. Medema, J.P., et al., Nature, 2011, 474: 318-326 23. Malanchi, I., et al., Nature, 2012, 481: 85-89 24. Strell, C., et al., Ups. J. Med. Sci., 2012, 117: 187-195 25. Horimoto, Y., et al., Cell Adhes. Migr., 2012, 6: 193202 26. Wu, et al., J. Cancer Mol., 2008, 4: 37-45 27. Mersmann M., et al., Int. J. Cancer, 2001, 92: 240-248 28. Brocks B., et al., Molecular Medicine, 2001, 7: 461-469 29. Schmidt A., et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268: 1730-1738 30. Messerschmidt, S.K., et al., J Control Release, 2009, 137: 6977 31. Ostermann E., et al., Clin. Cancer Res., 2008, 14: 4584-4592 32. Shi, M., et al., World J. Gastroenterology, 2012, 28: 840-846. 33. Munoz et al., Cancer Res., 2001 34. Trush et al., Annu. Rev. Immunol., 1996, 14:49-71 35. Lambert et al., 1988, 36. Barbieri, et al., Methods in Mol. Biol., 2001, 166: 71-85 37. Ghetie and Vitetta, Mol. Biotechnol., 2001, 18: 251-286 38. Munoz R., et al., Cancer Lett., 2007, 256: 73-80. 39. Munoz R., et al., Cancer Immunol. Immunother., 2012 40. Thorpe et al., Cancer Res., 1987, 47:5924-5931 41. Fracasso et al., Mini Rev. Med. Chem., 2004, 4: 545-562 42. Marsh et al., ”Immunotoxins”, Frankel A.E. ed., Kluwer Academic Publishers, Boston, MA, 1988, 213-237 43. Riddles et al., Anal. Biochem., 1979, 94:75-81 44. Riener et al., Anal. Bioanal. Chem, 2002, 373:266-276 45. Sasse, F., et al., Journal of Antibiotics, 2000, 53:879-885. 46. Kaur, G., et al., Biochem. J., 2006, 396:235-242. 47. Schluep, T., et al., Clin. Cancer Res., 2009, 15:181-189 48. Reddy, J.A., et al., Mol. Pharmaceutics, 2009. 49. Gualberto A. Expert Opin Investig Drugs. 2012; 21(2): 205-16 50. Perez-Soler et al., Clin. Cancer Res., 2000, 6: 4932-4938; 51. Yabuchi et al., Cancer Letters, 2013

Claims (6)

1. Conjugado, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula I: ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: A é um anticorpo que liga seletivamente à FAP (proteína de ativação de fibroblastos); L é um ligante, referido ligante compreendendo um espaçador compreendendo -(OCH2CH2)n-, em que n = 2 a 5, e em que L compreende um grupo de fixação para fixação a A e uma porção clivável de protease compreendendo um unidade de valina-citrulina; p é 1 a 10; e D é uma droga compreendendo uma citolisina de fórmula IV: em que: R2 é H ou alquil C1-C4; R6 é alquil C1-C6; R7 é alquil C1-C6, CH2OR19 ou CH2OCOR20, em que R19 é alquil, R20 é alquenil C2-C6, fenil ou CH2-fenil; R9é alquil C1-C6; R10é H, OH, O-alquil ou O-acetil; f é 1 ou 2; R11 tem a seguinte estrutura: em que R21 é H, OH, halogênio, NH2, alquiloxi, fenil, alquilamino ou dialquilamino; R16 é H ou um grupo alquil C1-C6; R17 é uma fixação direta ao ligante L ou R17 é C(O)X, CONHNHX, OX, NHX ou SX; em que X é uma ligação ao ligante L; e q é 0, 1, 2 ou 3.

2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que A compreende a complementaridade da cadeia pesada de regiões determinantes de 1-3 (CDRH1-3) e complementaridade da cadeia leve de regiões determinantes 1-3 (CDRL1-3) possuindo as seguintes sequências de aminoácidos: (i) CDRH1: SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 7; (ii) CDRH2: SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 8; (iii) CDRH3: SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 9; (iv) CDRL1: SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 10; (v) CDRL2: SEQ ID NO: 11 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 11; e (vi) CDRL3: SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma com até 1 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 12.

3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que A compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que A compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o L compreende maleimidocaproil-valina- citrulina-p-aminobenzilcarbamato.

6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que -L-D tem a: