KR20200131840A - 항-her2 2파라토프 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-her2 2파라토프 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20200131840A
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her2
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antigen
ser
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케빈 햄블렛
루퍼트 에이치. 데이비스
제임스 알. 리치
제럴드 제이. 로우즈
빈센트 케이. 씨. 펑
스튜어트 디. 반셔
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자임워크스 인코포레이티드
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Abstract

약물이 아우리스타틴 유사체이고 낮은 평균 약물-대-항체비(DAR)로 항체에 접합되는 항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체(ADC), 및 HER2-발현 암의 치료에서 ADC를 이용하는 방법. 본 명세서에 기재된 바와 같은 낮은 평균 DAR(3.9 미만) ADC는 동일한 독소 용량으로 투여될 때 DAR이 3.9 이상인 대응하는 ADC에 비해 개선된 내약성 및 감소된 독성을 가진다.

Description

항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법
본 개시내용은 암 치료제 및, 특히, 2파라토프(biparatopic) 항-HER2 항체 및 아우리스타틴(auristatin) 유사체를 포함하는 항체-약물 접합체 분야에 관한 것이다.
HER2(ErbB2)는 수용체 타이로신 키나제의 ErbB 패밀리 구성원이며 세포 성장 및 분화를 야기하는 신호 전달 경로에 정상적으로 연루되어 있는 막관통 표면-결합 수용체 타이로신 키나제이다. HER2는 유방암 환자의 약 1/4에서 과발현되는 것으로 발견되었기 때문에 유방암의 치료를 위한 유망한 표적이다(Bange et al, Nature Medicine 7:548 (2001)).
허셉틴(Herceptin)(등록상표)(트라스투주맙(trastuzumab), 미국 특허 제5,821,337호)은 HER2-양성 유방암의 치료를 위해 개발된 제1 단클론성 항체이고, 환자에 대해 증가된 생존 시간을 가지며, 따라서 이들은 현재 HER2-음성 유방암을 갖는 환자와 동일하다. 퍼투주맙(pertuzumab)(퍼제타(Perjeta)(등록상표), 미국 특허 제7,862,817호)은 종양 성장 및 생존에서 어떤 역할을 하는 것으로 여겨지는 과정인 세포 표면 상에서 HER2 수용체가 다른 HER 수용체(EGFR/HER1, HER3 및 HER4)와 짝지어지는 것을 특이적으로 방지하도록 설계된 인간화된 단클론성 항체이다. 퍼제타, 허셉틴 및 화학요법의 조합은 HER 신호전달 경로의 더 포괄적인 차단을 제공하는 것으로 생각된다. 퍼투주맙은 이량체화에 본질적인 HER2의 도메인 II에 결합하는 한편, 트라스투주맙은 HER2의 세포외 도메인 IV에 결합한다.
　Li 등은(Cancer Res., 73:6471-6483 (2013)) 천연 트라스투주맙 및 퍼투주맙 서열에 기반하며 트라스투주맙 내성을 극복하는 HER2에 대해 이중특이성, 2가 항체를 기재한다. 다른 이중특이성 항-HER2 항체가 기재되어 있다(국제 특허 출원 공개 WO 2015/077891 및 WO 2016/179707; 미국 특허 출원 공개 제2014/0170148호, 제2015/0284463호, 제2017/0029529호 및 제2017/0291955호; 미국 특허 제9,745,382호). 튜불라이신 유도체에 특이적으로 접합된 HER2-표적화 2파라토프 항체 부위를 포함하는 항체-약물 접합체가 또한 기재되었다(Li et al., Cancer Cell, 29:117-129(2016)).
아우리스타틴(Auristatin)은 항암 활성을 갖는 강한 미세소관 저해제인 돌라스타틴 10의 합성 유사체이다. 아우리스타틴 페이로드(payload), 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)를 포함하는 항체-약물 접합체가 기재되어 있다(미국 특허 제7,498,298호 및 제7,659,241호; 국제 특허 출원 공개 WO 2002/088172 및 WO 2016/041082). 국제 특허 출원 공개 WO 2106/041082는 항체-약물 접합체 페이로드로서 N-아실 설폰아마이드 변형된 아우리스타틴 및 이들의 용도를 기재한다.
이 배경 정보는 본 출원인에 의해 본 개시내용에 대한 가능한 적절성을 갖는 것으로 여겨지는 공지된 정보를 만들 목적을 위해 제공된다. 어떤 인용도, 임의의 앞서 언급한 정보가 특허 청구된 발명에 대해 선행기술을 구성한다는 것으로 반드시 의도되지도 않으며, 그렇게 해석되어서도 안 된다.
본 명세서에서 항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체 및 사용 방법이 기재된다. 일 양상에서, 본 개시내용은 낮은 평균 약물-대-항체비(antibody-drug conjugate: DAR)로 링커(L)를 통해 아우리스타틴 유사체에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이되, 항-HER2 2파라토프 항체는 제1 HER2 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 HER2 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하며, 제1 HER2 에피토프와 제2 HER2 에피토프는 상이한 에피토프이고, 낮은 평균 DAR은 평균 DAR이 3.9 미만이다.
항체-약물 접합체의 특정 실시형태에서, 아우리스타틴 유사체-링커는 하기 일반식 (II)을 갖는다:
Figure pct00001
식 중,
X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이거나, X는 존재하지 않고(absent);
R1은
Figure pct00002
로부터 선택되며;
L은 링커이고, 그리고
Figure pct00003
는 항-HER2 2파라토프 항체에 대한 링커-독소의 부착지점을 나타내며;
항-HER2 2파라토프 항체는 제1 HER2 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 HER2 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하며, 제1 HER2 에피토프와 제2 HER2 에피토프는 상이한 에피토프이고, 그리고
낮은 평균 DAR은 평균 DAR이 3.9 미만이다.
특정 실시형태에서, 항체-약물 접합체의 낮은 평균 DAR은 0.5 내지 3.5, 또는 0.5 내지 2.5이다.
특정 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 5% 이상의 DAR0 종 또는 15% 이상의 DAR0 종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 약 5% 내지 약 50%의 DAR0 종, 또는 약 10% 내지 약 30%의 DAR0 종, 또는 약 10% 내지 약 25%의 DAR0 종, 또는 약 15% 내지 약 25%의 DAR0 종을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 25% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종, 또는 15% 이하 DAR6 또는 더 큰 종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 0% 내지 약 15%의 DAR6 또는 더 큰 종, 또는 약 0% 내지 약 10%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함한다.
본 개시내용의 다른 양상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 양상은 HER2-발현 암세포의 성장을 저해하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 암세포를 유효량의 본 명세서에 기재된 항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 양상은 HER2-발현 암을 갖는 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 유효량의 항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 HER2-발현 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상은 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
다른 양상은 치료가 필요한 대상체에서 HER2-발현 암을 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
다른 양상은 HER2-발현 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체-약물 접합체의 용도에 관한 것이다.
다른 양상은 링커(L)를 통해 아우리스타틴 유사체에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 조성물에 관한 것이며, 아우리스타틴 유사체-링커는 하기 일반식 (II)를 갖는다:
Figure pct00004
식 중,
X는 존재하지 않고;
R1은
Figure pct00005
로부터 선택되며;
L은 링커이고, 그리고
Figure pct00006
는 항-HER2 2파라토프 항체에 대한 아우리스타틴 유사체-링커의 부착지점을 나타내며;
항-HER2 2파라토프 항체는 HER2의 ECD4 상의 제1 HER2 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 HER2의 ECD2 상의 제2 HER2 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하며, 그리고
항체-약물 접합체 조성물은 평균 DAR이 0.5 내지 2.5이고, 약 10% 내지 약 30%의 DAR0 종 및 0% 내지 약 15%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함한다.
도 1은 각각 모 항-HER2 2파라토프 항체(v10000)에 비교되는, (A) v17597 (DAR4에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체), 및 (B) v21252(DAR2에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체)의 비환원성 및 환원성 SDS-PAGE를 도시한 도면.
도 2는 (A) 모 항-HER2 2파라토프 항체 v10000, (B) v17597(3.92의 평균 DAR을 나타내는 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체), 및 (C) v21252(2.07의 평균 DAR을 나타내는 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체)에 대한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 도시한 도면. 정제된 ADC의 평균 DAR에 대한 DAR0, DAR2, DAR4 및 DAR6 종의 개개 기여를 (D) 및 (E)에 나타낸다.
도 3은 (A) 모 항-HER2 2파라토프 항체 v10000, (B) v17597(DAR4에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체), 및 (C) v21252(DAR2에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체)에 대한 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 흔적을 도시한 도면.
도 4는 항원-양성 세포에 대한 유세포분석 결합 분석 결과, (A) JIMT-1 유방 암종 세포, 및 (B) RT-112 방광 암종 세포에 대한 v17597(DAR4에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체) 및 v10000(모 2파라토프 항-HER2 항체)의 비교, 및 (C) JIMT-1 유방 암종 세포에 대한 v21252(DAR2에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체)와 v10000(모 항-HER2 2파라토프 항체) 결합의 비교를 도시한 도면.
도 5는 HER2-발현 유방 암종 세포주 BT-474(A), SK-BR-3(B), HCC1954(C), JIMT-1(D) 및 ZR-75-1(E), 및 HER2 음성 세포주 MDA-MB-468(F)를 v17597(DAR4에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체) 및 v21252(DAR2에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체)로 치료하는 결과를 도시한 도면.
도 6은 다양한 평균 DAR에서 링커-독소 001에 접합된 v10000을 포함하는 항체-약물 접합체로 HER2-발현 난소 암종 세포주 SK-OV-3(A), 및 유방 암종 세포주 ZR-75-1(B) 및 JIMT-1(C)을 치료하는 결과를 도시한 도면. 평균 DAR이 0.7, 2.2 및 3.9인 ADC의 평균 DAR에 대한 DAR0, DAR2, DAR4 및 DAR6 종의 개개 기여를 (D)에 나타낸다.
도 7은 (a) v17597(DAR4에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체) 및 (b) v21252(DAR2에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체)의 언급된 용량으로 HBCx-13b 유방암 환자 유래 이종이식 마우스를 q14d x2로 치료한 결과를 도시한 도면. v15496 = 비히클.
도 8은 (a) v17597(DAR4에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체) 및 (b) v21252(DAR2에서 링커-독소 001에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체)의 언급된 용량으로 ST-910 유방암 환자 유래 이종이식 마우스를 qdx1로 치료한 결과를 도시한 도면. v15496 = 비히클.
도 9는 암컷 사이노몰거스 원숭이(n=3)에 v21252의 단일 용량을 9㎎/㎏ 또는 12㎎/㎏으로 투여 후, (A) 평균(+SD) v21252 혈청 농도-시간 프로파일, 및 (B) 평균(±SD) 총 항체 혈청 농도-시간 프로파일을 도시한 도면.
도 10은 사이노몰거스 원숭이(n=6)에 12㎎/㎏ 또는 9㎎/㎏ 중 하나로 v21252의 2주마다의 주입 후, 제1일(A) 및 제29일(B)에 대한 평균(±SD) v21252 혈청 농도-시간 프로파일을 도시한 도면.
도 11은 사이노몰거스 원숭이(n=6)에 12㎎/㎏ 또는 9㎎/㎏ 중 하나로 v21252의 2주마다의 주입 후, 제1일(A) 및 제29일(B)에 대한 평균(±SD) 총 항체 혈청 농도-시간 프로파일을 도시한 도면.
도 12는 12㎎/㎏ 또는 9㎎/㎏ 중 하나로 사이노몰거스 원숭이(n=6)에 대한 v21252의 2주마다의 주입 후 v21252와 총 항체(접합 및 비접합) 둘 다에 대한 평균(±SD) 혈청 농도-시간 프로파일을 도시한 도면.
도 13은 pHAb-접합 트라스투주맙-링커-독소 001 및 음성 대조군에 비교되는 pHAb-접합 v21252의 (A) SKBR3 세포, 및 (B) JIMT-1 세포 내로의 내재화를 도시한 도면.
도 14는 표시한 바와 같은 다양한 시점에 SKBR3 세포 내로의 pHAb-접합 트라스투주맙-링커-독소 001(B)에 비교되는 pHAb-접합 v21252(A)의 내재화를 도시한 도면. 핵은 회색으로 나타내고, pHAb는 백색으로 나타낸다.
도 15는 표시된 용량에서 v21252로 처리한 사이노몰거스 원숭이 및 마우스에서의 비교 노출을 도시한 도면: (A) 높은 HER2 환자 유래 종양(HBCx-13b)을 피하로 이식한 사이노몰거스 원숭이 및 마우스에서의 노출, (B) 낮은 HER2 환자 유래 종양(ST-910)을 피하로 이식한 사이노몰거스 원숭이 및 마우스에서의 노출.
도 16은 3㎎/㎏의 비히클 또는 v21252로 qwk x4에 LTL-654 난소암 환자 유래 이종이식 마우스를 치료하는 결과를 도시한 도면.
도 17은 12회의 총 주사에 대해 각각 매주 6㎎/㎏로, 비히클, 대조군 접합체(링커-독소 001에 접합된 호흡기 세포융합 바이러스에 대해 인간화된 항체), v21252, v7155(T-DM1, DAR3.5) 및 v24029(DAR8에서 엑사테칸(exatecan)-유도체 토포아이소머라제 I 저해제(DXd)에 접합된 트라스투주맙)의 매주 i.v. 투여 후 BT-474 유방 종양 세포로 두개내로 이식된 마우스에 대한 생존 결과를 제공한다.
도 18은 매주 6㎎/㎏으로 12회의 주사에 대해 비히클, 대조군 접합체(링커-독소 001에 접합된 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 인간화된 항체), 또는 v7155(T-DM1, DAR3.5), 또는 각각 총 6회의 주사에 대해 2주마다 6㎎/㎏으로 v21252 또는 v24029(DAR8에서 엑사테칸-유도체 토포아이소머라제 I 저해제(DXd)에 대해 접합된 트라스투주맙)의 i.v. 투여 후 BT-474 유방암이 두개내로 이식된 마우스에 대한 생존 결과를 제공하는 도면.
본 개시내용은 약물이 아우리스타틴 유사체이고 낮은 평균 약물-대-항체비(DAR)로 항체에 접합되는 항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate: ADC)에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 낮은 평균 DAR(3.9 미만) ADC는 동일한 독소(아우리스타틴 유사체) 용량으로 투여될 때 3.9 이상의 DAR에 대응하는 ADC에 비해 개선된 내약성 및 감소된 독성을 가진다. 평균 DAR이 약 2.5 이하, 예컨대 약 1.8 내지 2.5인 ADC에 특히 관심이 있다.
본 개시내용은 또한 HER2-발현 암의 치료에서 본 명세서에 기재된 ADC를 이용하는 방법에 관한 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험 대상인 동물, 일부 실시형태에서, 포유류를 지칭한다. 동물은 인간, 비인간 영장류, 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 실험 동물(예를 들어, 래트, 마우스, 기니픽, 비인간 영장류 등)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포유류"는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 뮤린, 소, 말 및 돼지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 포유류는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 주어진 값으로부터의 대략 +/-10% 변동을 지칭한다. 이러한 변동은 구체적으로 언급되든 아니든, 본 명세서에 제공된 임의의 주어진 값에 항상 포함된다는 것이 이해되어야 한다.
단수 단어의 사용은, 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 본 명세서에서 사용될 때, "하나"를 의미할 수 있지만, 특정 실시형태에서 "하나 이상", "적어도 하나" 또는 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는", "갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)" 및 이의 문법적 변형은 포괄적이거나 또는 제한을 두지 않으며, 추가적인, 열거되지 않은 요소 및/또는 방법 단계를 제외하지는 않는다. 용어 "으로 본질적으로 이루어진"은, 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 추가적인 요소 및/또는 방법 단계가 존재할 수 있지만, 이들 첨가가 열거된 조성물, 방법 또는 용도가 작용하는 방식에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 용어 "이루어진"은 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 사용될 때, 추가적인 요소 및/또는 방법 단계의 존재를 제외한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 것으로 본 명세서에 기재된 조성물, 용도 또는 방법은 또한, 특정 실시형태에서 해당 요소 및/또는 단계로 본질적으로 이루어질 수 있고, 다른 실시형태에서, 이들 실시형태가 구체적으로 언급하든 아니든, 해당 요소 및/또는 단계로 이루어진다.
본 명세서에 논의된 임의의 실시형태는 본 명세서에 개시된 임의의 방법, 용도 또는 조성물에 관해 실행될 수 있다는 것이 상정된다.
본 명세서에 개시된 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 및/또는 특징은 하나 이상의 추가적인 실시형태를 제공하는 임의의 적합한 방식으로 본 명세서에 개시된 다른 실시형태와 관련하여 기재된 특성, 구조 및/또는 특징과 조합될 수 있다.
또한 특성의 긍정적 열거는 일 실시형태에서, 대안의 실시형태에서 특징을 제외하기 위한 기준으로서 작용한다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 선택사항의 열거는 주어진 실시형태 또는 청구범위에 대해 제시되는 경우, 이러한 대안의 실시형태가 구체적으로 언급되든 아니든, 하나 이상의 선택사항이 목록으로부터 삭제될 수 있고, 단축된 목록은 대안의 실시형태를 형성할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
항-HER2 2파라토프 항체-약물 접합체
본 개시내용의 항체-약물 접합체(ADC)는 낮은 평균 약물-대-항체비(DAR)로 링커를 통해 독소에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하며, 독소는 아우리스타틴-깁간 독소(또는 "아우리스타틴 유사체")이다. 아우리스타틴-기반 독소의 예는 당업계에 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 아우리스타틴 유사체는 일반식 (I)의 화합물이다:
Figure pct00007
식 중,
X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이거나, X는 존재하지 않고;
R1은
Figure pct00008
로부터 선택되며,
R2는 페닐이다.
본 명세서에서 사용되는 "낮은 DAR"은 3.9 미만이지만, 0.5 초과인 평균 DAR로서 정의된다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 3.5 미만이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 3.4 미만, 예를 들어, 3.3 미만, 3.2 미만 또는 3.1 미만이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 3.0 이하이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 2.9 이하, 예를 들어, 2.8 이하, 2.7 이하, 또는 2.6 이하이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 2.5 이하, 예를 들어, 2.4 이하, 2.3 이하, 또는 2.2 이하이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 약 2.0이다.
일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 0.5 내지 3.8, 예를 들어, 0.5 내지 3.5, 또는 0.5 내지 2.5이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 0.7 내지 3.8, 예를 들어, 0.7 내지 3.5, 0.7 내지 3.0, 또는 0.7 내지 2.5이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 1.0 내지 3.8, 예를 들어, 1.0 내지 3.5, 1.0 내지 3.0, 또는 1.0 내지 2.5이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 1.5 내지 3.8, 예를 들어, 1.5 내지 3.5, 1.5 내지 3.0, 또는 1.5 내지 2.5이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 1.6 내지 3.8, 예를 들어, 1.6 내지 3.5, 1.6 내지 3.0, 또는 1.6 내지 2.5이다. 일부 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 1.8 내지 2.8, 예를 들어, 1.8 내지 2.5이다.
상기 언급한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 낮은 평균 DAR(3.9 미만) ADC는 동일한 독소 용량으로 투여될 때 3.9 이상의 DAR에 대응하는 ADC에 비해 개선된 내약성 및 감소된 독성을 가진다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대다수의 접합 방법은 다양한 DAR 종을 포함하는 ADC 조성물을 수득하며, 보고된 DAR은 개개 DAR 종의 평균이다. 임의의 특정 이론으로 제한되는 일 없이, 낮은 DAR ADC의 보다 높은 내약성 및 감소된 독성은 ADC 조성물에서 높은 DAR(6 이상) 종의 감소 및/또는 ADC 조성물에서 DAR0 종의 증가 중 하나 또는 둘 다 때문일 수 있다.
특정 실시형태에서, 특정 역치 초과의 DAR0 종의 비율을 포함하는 ADC 조성물이 유리할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 5% 이상의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 10이상의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 15% 이상의 AR0 종, 예를 들어, 20% 이상의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 약 5% 내지 약 50%의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 약 10% 내지 약 50%의 DAR0 종, 예를 들어, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%의 DAR0 종, 또는 약 10% 내지 약 25%의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 약 12% 내지 약 28%의 DAR0 종, 예를 들어, 약 12% 내지 약 28%의 DAR0 종, 또는 약 15% 내지 약 25%의 DAR0 종을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 특정 역치 미만의 DAR6 또는 더 큰 종의 비율을 포함하는 ADC 조성물이 유리할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 약 35% 미만의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 30% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 25% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종, 예를 들어, 20% 이하, 15% 이하 또는 10% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 9% 이하 DAR6 또는 더 큰 종, 예를 들어, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하 또는 5% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 0% 내지 약 35%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 0% 내지 약 30%의 DAR6 또는 더 큰 종, 예를 들어, 0% 내지 약 25%, 또는 0% 내지 약 20%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 낮은 DAR ADC 조성물은 0% 내지 약 15%의 DAR6 또는 더 큰 종, 예를 들어, 약 0% 내지 약 10%, 약 0% 내지 약 8%, 또는 0% 내지 약 5%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함할 수 있다.
특정 실시형태는 낮은 평균 약물-대-항체비(DAR)로 링커(L)를 통해 아우리스타틴 유사체에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하는 ADC에 관한 것이며, 아우리스타틴 유사체-링커는 하기 일반식 (II)를 갖는다:
Figure pct00009
식 중, X 및 R1은 일반식 (I)에 대해 정의된 바와 같고;
L은 링커이고, 그리고
Figure pct00010
는 항-HER2 2파라토프 항체에 대한 아우리스타틴 유사체-링커의 부착지점을 나타낸다.
특정 실시형태는 하기 일반식 (III)을 갖는 ADC에 관한 것이다:
Figure pct00011
식 중, X 및 R1은 일반식 (I)에 대해 정의된 바와 같고;
L은 링커이며;
n은 평균 약물-대-항체비(DAR)이고, 3.9 미만이며, 그리고
Ab는 항-HER2 2파라토프 항체이다.
항-HER2 2파라토프 항체
본 명세서에 기재된 ADC는 HER2의 두 상이한 에피토프에 결합하는 항-HER2 2파라토프 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 일반적으로 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백성 결합 분자를 지칭한다. 항체의 전형적인 예는 면역글로불린뿐만 아니라 여전히 결합 특이성을 보유하는 이의 유도체 또는 기능성 단편이다. 항체의 생성을 위한 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 용어 "항체"는 또한 상이한 부류(즉, IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE) 및 하위부류(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 면역글로불린을 포함할 수 있다. 항체의 예시적 예는 전체 항체 및 이의 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 단편, F(ab')2, Fv 단편, 단일쇄 Fv 단편(scFv), 다이어바디(diabody), 도메인 항체 및 이들의 조합이다. 도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인일 수 있고, 다른 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체, 단일 가변 도메인 항체 또는 단지 하나의 가변 도메인을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다. 용어 "항체"는 또한 키메라, 단일쇄 및 인간화된 항체와 같은 실시형태를 포함한다.　
전형적인 전체 항체는 이황화결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인을 포함한다: CH1, CH2 및 CH3. 상이한 부류의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 및 μ(IgM)로서 알려져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 단지 하나의 도메인인 CL을 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람타 중 하나로서 분류된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region: CDR)으로 칭해지는 초가변 영역으로 다시 나눌 수 있는데, 그 사이에 프레임워크 영역(framework region: FW)으로 칭해지는 더 보존된 영역이 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FW를 포함한다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인(파라토프)을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대 효과기 세포) 및 보체 시스템의 성분인 C1q를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC에 포함하기 위한 항-HER2 2파라토프 항체는 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하며, 이들 각각은 HER2의 상이한 에피토프에 결합한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항원-결합 폴리펩타이드 작제물"은 면역글로불린-기반 작제물, 예를 들어, 항체 단편일 수 있거나, 또는 비-면역글로불린-기반 항체 모방체 형식, 예컨대 안티칼린(anticalin), 파이노머(fynomer), 애피머(affimer), 알파바디(alphabody), DARPin 또는 아비머(avimer)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 면역글로불린-기반 작제물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 항체 단편일 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 각각 독립적으로 Fab 단편, Fab' 단편, scFv 또는 sdAb일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 각각 독립적으로 Fab 단편 또는 scFv일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 하나의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab 단편일 수 있고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 scFv일 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 적어도 하나는 Fab 단편 또는 Fab' 단편일 수 있다. "Fab 단편"은 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인(각각 VL 및 VH)과 함께 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄(CH1)의 제1 불변 도메인을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에서 소수의 아미노산 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 다르다. Fab 단편은 또한 단일쇄 Fab 분자, 즉, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄는 펩타이드 링커에 의해 연결되어 단일 펩타이드 쇄를 형성하는 Fab 분자일 수 있다. 예를 들어, Fab 경쇄의 C-말단은 단일쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 적어도 하나는 단일쇄 Fv(scFv)일 수 있다. "scFv"는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. scFv는 선택적으로 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, scFv는 폴리펩타이드 링커에 의해 VH의 C-말단으로부터 N-말단까지 연결된 VL을 포함한다. 대안적으로, scFv는 폴리펩타이드 쇄 또는 링커에 의해 VL의 C-말단을 통해 N-말단까지 연결되는 VH를 포함할 수 있다(문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]의 검토 참조).
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 적어도 하나는 단일 도메인 항체(sdAb) 형식일 수 있다. sdAb 형식은 단일 면역글로불린 도메인을 지칭한다. sdAb는, 예를 들어, 낙타 유래일 수 있다. 낙타 항체는 경쇄를 결여하고, 이들의 항원-결합 부위는 "VHH"로 칭해지는 단일 도메인으로 이루어진다. sdAb는 항원-결합 부위를 형성하는 3개의 CDR/초가변 루프를 포함한다: CDR1, CDR2 및 CDR3. sdAb는 상당히 안정하며, 예를 들어, 항체의 Fc 쇄와의 융합으로서, 발현이 쉽다(예를 들어, 문헌[Harmsen & De Haard, Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007)]).
항체 형식
본 명세서에 기재된 ADC에 포함하기 위한 항-HER2 2파라토프 항체는 다양한 형식을 가질 수 있다. 항-HER2 2파라토프 항체의 최소 성분은 제1 HER2 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 HER2 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이며, 제1 HER2 에피토프와 제2 HER2 에피토프는 상이하다. 상이한 HER2 에피토프에 결합하는 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 항체는 2가의, 2파라토프 항체인 것으로 고려될 수 있다. 특정 실시형태는 2가의, 항-HER2 2파라토프 항체에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 하나 이상의 추가적인 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 제1 HER2 에피토프 또는 제2 HER2 에피토프 중 하나에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 3가 또는 4가일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 연결하는 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 스캐폴드를 추가로 포함하고, 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 스캐폴드에 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 성분이 이들이 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계에 있다는 것을 의미한다.
따라서 항-HER2 2파라토프 항체는 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 모듈 및 선택적으로 링커 모듈 및 스캐폴드 모듈 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 모듈 구조를 갖는 것으로 간주될 수 있다. 당업자는 이들 모듈이 상이한 형식을 갖는 항-HER2 2파라토프 항체를 제공하기 위해 다양한 방식으로 합쳐질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이들 형식은 일반적으로 당업자계 공지된 항체 형식에 기반한다(예를 들어, 문헌[Brinkmann & Kontermann, MABS, 9(2):182-212 (2017)], 및 문헌[
Figure pct00012
& Kontermann, "Bispecific Antibodies" in Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)]에서 검토됨).
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 스캐폴드에 작동 가능하게 연결된 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 적합한 스캐폴드를 이하에 기재한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 스캐폴드에 작동 가능하게 연결된 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 적어도 하나는 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 스캐폴드에 작동 가능하게 연결된 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 적어도 하나는 Fab이다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 3 또는 4개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이 형식에서, 적어도 제1 및 제2 항원-결합 작제물은 스캐폴드에 작동 가능하게 연결된다. 제3 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 선택적 제4 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 각각 독립적으로 스캐폴드에 또는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 또는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
스캐폴드를 결여하는 항-HER2 2파라토프 항체는 전형적으로 하나 이상의 링커에 의해 작동 가능하게 연결된 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 scFv, Fab, sdAb 또는 이들의 조합의 형태일 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물로서 scFv를 이용하여, 탠덤 scFv((scFv)2 또는 taFv)와 같은 형식이 작제될 수 있으며, 이때, scFv는 가요성 링커에 의해 함께 연결된다. scFv는 또한 짧은 링커(보통 약 5개의 아미노산 길이)에 의해 연결되는 2개의 scFv를 포함하는 다이어바디 형식을 작제하기 위해 사용될 수 있다. 제한된 길이의 링커는 헤드-투-테일(head-to-tail) 방식으로 scFv의 이량체화를 초래한다. 임의의 앞서 언급한 형식에서, scFv는 도메인간 이황화결합의 포함에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 예를 들어, 이황화결합은 각각의 쇄 내 추가적인 시스테인 잔기의 도입을 통해(예를 들어, VH에서의 위치 44 및 VL에서의 100에서) VL과 VH 사이에 도입될 수 있거나(예를 들어, 문헌[Fitzgerald et al., Protein Engineering, 10:1221-1225 (1997)] 참조), 또는 이황화결합은 DART 형식을 갖는 작제물을 제공하기 위해 두 VH 사이에 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., J Mol. Biol., 399:436-449(2010)] 참조).
유사하게, 적합한 링커를 통해 함께 연결되는 두 sdAb, 예컨대 VH 또는 VHH를 포함하는 형식이 일부 실시형태에서 사용될 수 있다.
스캐폴드를 결여하는 항-HER2 2파라토프 항체 형식의 다른 예는 Fab 단편, 예를 들어, Fab2 및 F(ab')2 형식에 기반하는 것을 포함하며, 이때 Fab 단편은 링커 또는 IgG 힌지 영역을 통해 연결된다.
대안의 무 스캐폴드 형식을 생성하기 위해 상이한 형태의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 조합이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, scFv 또는 sdAb는 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄 중 하나 또는 둘 다의 C-말단에 융합되어 2가(Fab-scFv/sdAb) 작제물을 초래할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 하나 이상의 링커를 포함할 수 있고, 스캐폴드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 scFv, Fab, sdAb 또는 이들의 조합, 및 하나 이상의 링커이며, 스캐폴드를 포함하지 않는 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다.
스캐폴드
스캐폴드를 포함하는 항-HER2 2파라토프 항체는 적합한 스캐폴드에 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 연결함으로써 작제될 수 있다. 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 상기 기재한 형태(예를 들어, scFv, Fab 및/또는 sdAb) 중 하나 또는 조합일 수 있다. 적합한 스캐폴드의 예는 이하에 더 상세하게 기재하며, 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 알부민 유사체 및 유도체, 이형이량체화 펩타이드(예컨대 류신 지퍼, Jun 및 Fos로부터 유래된 이형이량체-형성 "지퍼" 펩타이드, IgG CH1 및 CL 도메인 또는 바나제(barnase)-바스타(barstar) 독소), 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 예는 IBS 파마슈티칼스 인코포레이티드(IBC Pharmaceuticals, Inc.) 및 이뮤노메딕스 인코포레이티드(Immunomedics, Inc.)에 의해 개발된 독-앤-락(DOCK-AND-LOCK)(상표명)(DNL(상표명)) 기술에 기반한 항체를 포함한다(예를 들어, 문헌[Chang, et al., Clin Cancer Res 13:5586s-5591s (2007)] 참조).
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 스캐폴드에 작동 가능하게 연결된 2개의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다.
스캐폴드는 펩타이드, 폴리펩타이드, 중합체, 나노입자 또는 기타 화학적 독립체일 수 있다. 스캐폴드가 폴리펩타이드인 경우, 항-HER2 2파라토프 항체의 각각의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 폴리펩타이드 스캐폴드의 N- 또는 C-말단 중 하나에 연결될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나 이상이, 예를 들어, 링커가 있는 또는 링커가 없는 아미노산의 측쇄를 통해 N- 또는 C-말단 이외의 영역에 연결된 폴리펩타이드 스캐폴드를 포함하는 항-HER2 2파라토프 항체가 또한 상정된다.
스캐폴드가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 유전자 융합 또는 화학적 접합에 의해 스캐폴드에 연결될 수 있다. 전형적으로, 스캐폴드가 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 때, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 유전자 융합에 의해 스캐폴드에 연결된다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드가 중합체 또는 나노입자인 경우, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 화학적 접합에 의해 스캐폴드에 연결될 수 있다.
두 상이한 폴리펩타이드의 선택적 쌍을 포함하고 스캐폴드를 형성하는 데 사용될 수 있는 다수의 단백질 도메인은 당업계에 공지되어 있다. 예는 류신 지퍼 도메인, 예컨대 함께 선택적으로 짝지어지는 Fos와 Jun이다(Kostelny, et al., J Immunol, 148:1547-53 (1992); Wranik, et al., J. Biol. Chem., 287: 43331-43339(2012)). 다른 선택적으로 짝지어지는 분자 쌍은, 예를 들어, 바나제 바스타 쌍(barnase barstar pair)(Deyev, et al., Nat Biotechnol, 21:1486-1492 (2003)), DNA 가닥 쌍(Chaudri, et al., FEBS Letters, 450(1-2):23-26 (1999)) 및 분할 형광 단백질 쌍을 포함한다(국제 특허 출원 공개 WO 2011/135040).
단백질 스캐폴드의 다른 예는 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 알부민 유사체 및 유도체, 독소, 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 포함한다. 항원-결합 모이어티와 조합한 단백질 스캐폴드의 사용이 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[M
Figure pct00013
ller et al., J Biol Chem, 282:12650-12660(2007); McDonaugh et al., Mol Cancer Ther, 11:582-593 (2012); Vallera et al., Clin Cancer Res, 11:3879-3888 (2005); Song et al., Biotech Appl Biochem, 45:147-154 (2006)] 및 미국 특허 출원 공개 제2009/0285816호).
예를 들어, 항원-결합 모이어티, 예컨대 scFv, 다이어바디 또는 단일쇄 다이어바디를 알부민에 융합시키는 것은 항원-결합 모이어티의 혈청 반감기를 개선시키는 것으로 나타났다(
Figure pct00014
et al., 이하 참조). 항원-결합 모이어티는 선택적으로 링커를 통해 알부민의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다.
수송체 폴리펩타이드가 자가 조립(self-assemble)하여 준-천연 알부민을 형성도록 알부민 단백질의 세그먼트화에 얻어진 2개의 수송체 폴리펩타이드를 포함하는 이형다량체 형태의 알부민 유도체가 기재되었다(국제 특허 출원 공개 제 WO 2012/116453 및 WO 2014/012082). 알부민의 세그먼트화의 결과로서, 이형다량체는 4개의 말단을 포함하고, 따라서 선택적으로 링커를 통해 최대 4개의 상이한 항원-결합 모이어티에 융합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 면역글로불린 Fc 영역, 알부민 또는 알부민 유사체 또는 유도체에 기반한 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 면역글로불린 Fc 영역, 예를 들어, IgG Fc 영역에 기반한 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA), 또는 알부민 유사체 또는 유도체에 기반한 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 국제 특허 출원 공개 WO 2012/116453 또는 WO 2014/012082에 기재한 바와 같은 알부민 유도체에 기반한 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다.
Fc 영역
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "Fc 영역", "Fc" 또는 "Fc 도메인"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 본 명세서에 달리 구체화되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 바와 같은 EU 색인으로도 불리는 EU 넘버링 색인에 따른다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 면역글로불린 Fc 영역에 기반한 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 이량체일 수 있고, 두 Fc 폴리펩타이드로 구성된다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 단일 폴리펩타이드로 구성될 수 있다.
이량체 Fc의 "Fc 폴리펩타이드"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 두 폴리펩타이드 중 하나, 즉, 안정하게 자가-회합할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 하나 이상의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "제1 Fc 폴리펩타이드" 및 "제2 Fc 폴리펩타이드"는 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 단, Fc 영역은 하나의 제1 Fc 폴리펩타이드 및 하나의 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
Fc 영역은 CH3 도메인 또는 CH3과 CH2 도메인 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 이량체 IgG Fc 영역의 Fc 폴리펩타이드는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다. CH3 도메인은 2개의 CH3 서열을 포함하는데, 이량체 Fc 영역의 2개의 Fc 폴리펩타이드로부터 각각 하나씩 유래된다. CH2 도메인은 2개의 CH2 서열을 포함하는데, 이량체 Fc 영역의 2개의 Fc 폴리펩타이드로부터 각각 하나씩 유래된다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 IgG Fc 영역에 기반한 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 인간 Fc 영역에 기반한 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 인간 IgG Fc 영역, 예를 들어 인간 IgG1 Fc 영역에 기반한 스캐폴드를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 각각 CH3 서열 및 선택적으로는 CH2 서열을 포함하는 이형이량체 Fc 영역인 IgG Fc 영역에 기반한 스캐폴드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 제1 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 영역에 기반한 스캐폴드를 포함할 수 있고, 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제1 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되며, 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제2 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 제1 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 영역에 기반하여 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 이때 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제1 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제2 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되며, 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 독립적으로 Fab 단편 또는 scFv이다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 2개의 CH3 서열을 포함하는 Fc 영역에 기반하여 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 이 중 적어도 하나는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 2개의 CH3 서열 및 2개의 CH2 서열을 포함하는 Fc 영역에 기반한 스캐폴드를 포함할 수 있으며, CH2 서열 중 적어도 하나는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc 영역을 포함하되, 변형된 CH3 도메인은 비대칭적으로 변형된 CH3 도메인이다. 일반적으로, 이형이량체 Fc의 제1 Fc 폴리펩타이드는 제1 CH3 서열을 포함하고, 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 CH3 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "비대칭적 아미노산 변형"은 제1 CH3 서열 상의 특정 위치에서 아미노산이 동일한 위치에서 제2 CH3 서열 상의 아미노산과 상이한 변형을 지칭한다. 비대칭 아미노산 변형을 포함하는 CH3 서열에 대해, 제1 및 제2 CH3 서열은 전형적으로 동형이량체보다는 이형이량체를 형성하기 위해 우선적으로 짝지어질 것이다. 이들 비대칭 아미노산 변형은 각각의 서열 상의 동일한 각각의 아미노산 위치에서 두 아미노산 중 단지 하나의 변형, 또는 제1 및 제2 CH3 서열 각각에 대해 동일한 각각의 위치에서 각각의 서열 상의 아미노산의 상이한 변형의 결과일 수 있다. 이형이량체 Fc의 제1 및 제2 CH3 서열 각각은 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 국제 특허 출원 공개 WO 2012/058768 또는 WO 2013/063702에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역에 기반하여 스캐폴드를 포함할 수 있다.
표 1은 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 231 내지 447에 대응하는 인간 IgG1 Fc 서열(서열번호 1)의 아미노산 서열을 제공한다. CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 341 내지 447을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 동형이량체 Fc보다는 이형이량체 Fc의 형성을 촉진시키는 비대칭 아미노산 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 EU 넘버링을 이용하여, 다음의 위치: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 및/또는 N390 중 하나 이상에서 변형을 포함하는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하고, 선택적으로 위치 L351에서 아미노산 변형을 추가로 포함하는 제1 폴리펩타이드 서열, 및 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하고, 선택적으로 위치 K392에서 아미노산 변형을 추가로 포함하는 제2 폴리펩타이드 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 CH3 도메인의 제1 폴리펩타이드 서열은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 선택적으로 위치 L351에서 아미노산 변형을 추가로 포함하며, 변형된 CH3 도메인의 제2 폴리펩타이드 서열은 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하고, 선택적으로 위치 K392에서 아미노산 변형을 추가로 포함하며, 위치 F405에서 아미노산 변형은 F405A, F405I, F405M, F405S, F405T 또는 F405V이고; 위치 Y407에서 아미노산 변형은 Y407I 또는 Y407V이며; 위치 T366에서 아미노산 변형은 T366I, T366L 또는 T366M이고; 위치 T394에서 아미노산 변형은 T394W이고; 위치 L351에서 아미노산 변형은 L351Y이며, 위치 K392에서 아미노산 변형은 K392F, K392L 또는 K392M이다. 일부 실시형태에서, 위치 F405에서 아미노산 변형은 F405A, F405S, F405T 또는 F405V이다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하고, 선택적으로 위치 L351에서 아미노산 변형을 더 포함하는 제1 Fc 폴리펩타이드 서열, 및 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하고, 선택적으로 위치 K392에서 아미노산 변형을 더 포함하는 제2 Fc 폴리펩타이드 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc를 포함할 수 있으며, 위치 F405에서 아미노산 변형은 F405A, F405I, F405M, F405S, F405T 또는 F405V이고; 위치 Y407에서 아미노산 변형은 Y407I 또는 Y407V이며; 위치 T366에서 아미노산 변형은 T366I, T366L 또는 T366M이고; 위치 T394에서 아미노산 변형은 T394W이며; 위치 L351에서 아미노산 변형은 L351Y이고, 위치 K392에서 아미노산 변형은 K392F, K392L 또는 K392M이며, 제1 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드 서열 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 변형 T350V를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 F405에서 아미노산 변형은 F405A, F405S, F405T 또는 F405V이다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 상기 기재한 바와 같이 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc를 포함할 수 있으며, 이때 제1 Fc 폴리펩타이드 서열은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하고, 선택적으로 위치 L351에서 아미노산 변형을 추가로 포함하며, 제2 Fc 폴리펩타이드 서열은 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하고, 선택적으로 위치 K392에서 아미노산 변형을 추가로 포함하며, 이때 제1 Fc 폴리펩타이드 서열은 위치 S400 또는 Q347 중 하나 또는 둘 다에서 아미노산 변형을 추가로 포함하고/하거나 제2 Fc 폴리펩타이드 서열은 위치 K360 또는 N390 중 하나 또는 둘 다에서 아미노산 변형을 추가로 포함하며, 위치 S400에서 아미노산 변형은 S400E, S400D, S400R 또는 S400K이고; 위치 Q347에서 아미노산 변형은 Q347R, Q347E 또는 Q347K이며; 위치 K360에서 아미노산 변형은 K360D 또는 K360E이고, 위치 N390에서 아미노산 변형은 N390R, N390K 또는 N390D이다. 일부 실시형태에서, 위치 F405에서 아미노산 변형은 F405A, F405S, F405T 또는 F405V이다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 표 1에 나타낸 바와 같이, 변이체 1, 변이체 2, 변이체 3, 변이체 4 또는 변이체 5 중 어느 하나의 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 갖는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함할 수 있다.
Figure pct00015
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 L351Y, F405A 및 Y407V로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 제1 CH3 서열, 및 아미노산 변형 T366L 또는 T366I를 포함하는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 갖는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함할 수 있고; K392L 또는 K392M 및 T394W, 및 제1 및 제2 CH3 서열 중 하나 또는 둘 다는 선택적으로 아미노산 변형 T350V을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 이형이량체 Fc의 형성을 촉진시키는 상기 기재한 바와 같은 비대칭 아미노산 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 갖는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 이때, 이형이량체 CH3 도메인은 야생형 동형이량체 CH3 도메인과 비슷한 안정성을 가진다. CH3 도메인의 안정성은 CH3 도메인의 융점(Tm)을 측정함으로써, 예를 들어 시차주사 열량측정법(differential scanning calorimetry: DSC)에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이형이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진시키며, 이때 CH3 도메인은 대응하는 대칭적 야생형 동형이량체 CH3 도메인에 대해 관찰되는 것의 시차주사 열량측정법 연구에서 약 8℃ 이내, 예를 들어, 약 7℃, 약 6℃, 약 5℃, 또는 약 4℃ 이내인 융점(Tm)을 통해 관찰되는 바와 같은 안정성을 가진다.
변형된 CH3 서열을 포함하는 이형이량체 Fc는 발현된 생성물에서 동형이량체 Fc에 비해 적어도 약 75%의 순도로 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과 또는 약 97% 초과의 순도로 이형이량체 Fc의 형성을 촉진시키는 비대칭적 아미노산 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 갖는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함할 수 있다.
이형이량체 Fc 형성을 촉진시키기 위한 단량체 Fc 폴리펩타이드를 변형시키기 위한 추가적인 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 96/027011(노브 인투 홀(knobs into holes)); 문헌[Gunasekaran et al. J Biol Chem, 285, 19637-46 (2010)](선택적 이형이량체를 달성하기 위한 정전기적 설계); 문헌[Davis et al., Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (2010)](가닥 교환 조작 도메인(strand exchange engineered domain: SEED) 기술), 및 문헌[Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50(2013)](Fab-아암(arm) 교환)에 설계된 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함하는 경우, 이형이량체 Fc는 또한 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH2 도메인은 변형된 CH2 도메인이다. Fc의 CH2 도메인의 일례는 표 1에 나타낸 서열의 아미노산 231 내지 340이다. 몇몇 효과기 기능은 항체의 Fc에 결합하는 Fc 수용체(FcR)에 의해 매개된다.
Fc 수용체(FcR)는 대립 유전자 변이체 및 이들 수용체의 대안적으로 스플라이스된 형태를 포함하는, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. 용어 FcR은 또한 특정 실시형태에서, 신생아 수용체인 FcRn을 포함할 수 있다.
CH2 도메인에서 변형은 Fc에 대한 FcR의 결합에 영향을 미칠 수 있다. 상이한 Fcγ 수용체에 대해 Fc의 친화도를 선택적으로 변경시키기 위한 Fc 영역에서의 다수의 변형은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체가 변형된 CH2 도메인을 갖는 이형이량체 Fc 스캐폴드를 포함하는 경우, 변형된 CH2 도메인은 Fcγ 수용체의 선택적 결합을 촉진시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
FcR에 의해 Fc의 결합을 변경시키는 변형의 비제한적 예는 S298A/E333A/K334A 및　S298A/E333A/K334A/K326A(Lu, et al., J Immunol Methods, 365(1-2):132-41(2011)); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및　F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen, et al., Cancer Res, 67(18):8882-90(2007) 및　Nordstrom JL, et al., Breast Cancer Res, 13(6):R123 (2011)); F243L(Stewart, et al., Protein Eng Des Sel. 24(9):671-8 (2011)); S298A/E333A/K334A(Shields, et al., J Biol Chem, 276(9):6591-604 (2001)); S239D/I332E/A330L 및 S239D/I332E(Lazar, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005-10(2006)); S239D/S267E 및　S267E/L328F(Chu, et al., Mol Immunol, 45(15):3926-33 (2008))를 포함한다. FcR에 의한 Fc 결합에 영향을 미치는 추가적인 변형은 치료적 항체 조작에 기재되어 있다(Strohl & Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012, 페이지 283). FcR에 의한 결합에 영향을 미치는 비대칭적 변형을 포함하는 Fc 영역은 국제 특허 출원 공개 WO 2014/190441에 기재되어 있다.
추가적인 변형은 효과기 기능을 매개하는 이들의 능력을 개선시키기 위해 Fc 영역으로 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 당업계에 공지되어 있으며, 비푸코실화, 또는 ADCC에 대해 활성화 수용체, 주로 FcγRIIIa로 향하고, CDC에 대해 C1q로 향하는 Fc의 능력 조작을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 효과기 기능을 매개하는 이의 능력을 개선시키도록 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있다.
아미노산 서열을 변경시키는 일 없이 Fc 글리코실화 부위(Asn 297, EU 넘버링) 상에서 푸코스를 거의 또는 전혀 갖지 않는 항체를 생성하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.　　예를 들어, 글리맥스(GlymaX)(등록상표)　기술(프로바이오겐 아게(ProBioGen AG))(문헌[von Horsten et al., Glycobiology, 20(12):1607-18 (2010)] 및 미국 특허 제8,409,572호 참조). 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 비글리코실화된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 항-HER2 2파라토프 항체가 포유류 발현 시스템에 의해 생성된 유사한 작제물에 대해 정상적으로 검출된 푸코스 양의 95% 미만, 85% 미만, 75% 미만, 65% 미만, 55% 미만, 45% 미만, 35% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 5% 미만, 또는 그 사이의 임의의 양을 함유하도록, 항-HER2 2파라토프 항체는 완전히 비푸코실화(즉, 검출 가능한 푸코스를 함유하지 않음) 또는 부분적으로 비푸코실화될 수 있다.
FcγR 및/또는 보체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키기 위한 Fc 변형은 당업계에 공지되어 있으며, 상기 기재한 것을 포함한다. 다양한 간행물은 감소된 또는 침묵 효과기 활성을 갖는 항체를 조작하기 위해 사용된 전략을 기재한다(예를 들어, 문헌[Strohl, Curr Opin Biotech 20:685-691(2009), 및 Strohl & Strohl, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249] 참조). 이들 전략은 글리코실화 변형을 통한 효과기 기능의 감소, IgG2/IgG4 스캐폴드의 사용, 또는 Fc의 힌지 또는 CH2 영역에서 돌연변이의 도입을 포함한다(또한, 미국 특허 공개 제2011/0212087호, 국제 특허 공개 WO 2006/105338, 미국 특허 공개 제2012/0225058호, 미국 특허 공개 제2012/0251531호 및 문헌[Strop et al., J. Mol. Biol. 420: 204-219(2012)] 참조).
Fc에 대한 FcγR 또는 보체 결합을 감소시키기 위한 공지된 아미노산 변형의 구체적인, 비제한적 예는 표 2에서 확인되는 것을 포함한다.
Figure pct00016
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 표 2에서 확인되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 위치 L234, L235 및/또는 D265에서 아미노산 변형을 갖는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 아미노산 변형 L234A, L235A 및 D265S를 갖는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
HER2 에피토프
항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 두 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 각각 HER2의 상이한 에피토프에 결합하며, 즉, 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제1 HER2 에피토프에 결합하고, 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제2 HER2 에피토프에 결합한다. 본 개시내용과 관련하여, 각각의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 이의 표적 에피토프에 특이적으로 결합한다.
"특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고, 원치않는 또는 비특이적 상호작용과 식별될 수 있다는 것을 의미한다. 특정 에피토프에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 능력은, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 기법(비아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석)(Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329(2000)) 또는 전통적인 결합 분석(Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002))을 통해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 없는 단백질에 대한 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 결합 정도가, 예를 들어, SPR에 의해 측정하여 표적 에피토프에 대한 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 결합의 약 10% 미만일 때, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다.
"HER2"(ErbB2로도 알려짐)는, 예를 들어, 문헌[Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501(1985)] 및 문헌[Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986)(젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 X03363)에 기재된 인간 HER2 단백질을 지칭한다. 용어 "erbB2" 및 "neu"는 인간 HER2 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 용어 p185 또는 p185neu는 또한 neu 유전자의 단백질 생성물을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
HER2는 HER 리간드에 전형적으로 결합하는 세포외 도메인, 친유성 막관통 도메인, 보존된 세포내 타이로신 키나제 도메인 및 인산화될 수 있는 몇몇 타이로신 잔기를 보유하는 카복실-말단의 신호전달 도메인을 포함한다. HER2의 세포외(엑토) 도메인은 4개의 도메인, 즉, 도메인 I 내지 IV를 포함한다. HER2의 서열은 표 3에 제공된다(서열번호 2). 세포외 도메인(Extracellular Domain: ECD) 경계는 다음과 같다: 도메인 I - 대략 아미노산 1 내지 165; 도메인 II - 대략 아미노산 166 내지 322; 도메인 III - 대략 아미노산 323 내지 488, 및 도메인 IV - 대략 아미노산 489 내지 607.
Figure pct00017
"에피토프 2C4"는 항체 2C4가 결합하고 HER2(ECD2로도 지칭됨)의 세포외 도메인에서 도메인 II로부터의 잔기를 포함하는 HER2의 세포외 도메인 내 영역이다. 2C4 및 퍼투주맙은 도메인 I, II 및 III의 접합에서 HER2의 세포외 도메인에 결합한다(Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
"에피토프 4D5"는 항체 4D5(ATCC CRL 10463) 및 트라스투주맙이 결합하는 HER2의 세포외 도메인 내 영역이다. 이 에피토프는 HER2의 막관통 도메인에 가깝고, HER2(ECD4로도 지칭됨)의 도메인 IV 내에 있다.
일반적으로, 본 개시내용의 항-HER2 2파라토프 항체는 HER2의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합할 것이다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 의해 결합되는 제1 HER2 에피토프와 제2 HER2 에피토프는 비중복 에피토프이다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 의해 결합되는 제1 HER2 에피토프와 제2 HER2 에피토프는 HER2의 상이한 세포외 도메인 상에 있다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2의 제1 도메인 상의 제1 HER2 에피토프에 결합하고, 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2의 제2 도메인 상의 제2 HER2 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, HER2의 제1 도메인은 ECD2이고, HER2의 제2 도메인은 ECD4이다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 HER2에 대한 결합에 대해 트라스투주맙과 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 HER2에 대한 결합에 대해 퍼투주맙과 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 HER2에 대한 결합에 대해 트라스투주맙과 경쟁하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 대한 결합에 대해 퍼투주맙과 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 Fab 또는 scFv 형식이며, HER2에 대한 결합에 대해 트라스투주맙과 경쟁하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab 또는 scFv 형식이며, HER2에 대한 결합에 대해 퍼투주맙과 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 Fab 형식이며, HER2에 대한 결합에 대해 트라스투주맙과 경쟁하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 scFv 형식이며, HER2에 대한 결합에 대해 퍼투주맙과 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 HER2 상에서 트라스투주맙과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 HER2 상에서 퍼투주맙과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 HER2 상에서 트라스투주맙과 동일한 에피토프에 결합하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2 상에서 퍼투주맙과 동일한 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 HER2 결합을 증가시키는 것으로 알려진 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 트라스투주맙 또는 이의 변이체의 CDR 서열을 포함하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2 결합을 증가시키는 것으로 알려진 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 퍼투주맙 또는 이의 변이체의 CDR을 포함한다. 트라스투주맙 또는 퍼투주맙에 의해 HER2 결합을 향상시키는 것으로 알려진 문헌 돌연변이는 이하의 표 4 및 표 5에 열거된 것을 포함한다(HC = 중쇄; LC = 경쇄). 이들 돌연변이의 조합이 또한 상정된다.
Figure pct00018
Figure pct00019
다양한 항-HER2 2파라토프 항체가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재된 ADC에 포함을 위한 적합한 후보 항체일 수 있다. 예는 미국 특허 출원 공개 제2014/0170148호; 제2015/0284463호; 제2016/0289335호; 제2017/0029529호; 제2017/0291955호 및 제2018/0022820호 및 국제 특허 출원 공개 WO 2016/179707에 기재되어 있는 항체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 미국 특허 출원 공개 제2016/0289335호에 기재되어 있는 2파라토프 항체 중 하나이다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나이다(표 6, 표 6A 및 표 6B, 및 서열 표 참조). 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 VH 서열 및 VL 서열을 포함하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD4-결합 아암으로부터의 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD4-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함한다.
당업자는 제한된 수의 아미노산 치환은 항체가 표적에 결합하는 능력을 상실하는 일 없이 CDR 서열 내로 또는 알려진 항체의 VH 또는 VL 서열에 도입될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 후보 아미노산 치환은 컴퓨터 모델링에 의해 또는 당업계에 공지된 기법, 예컨대 알라닌 스캐닝에 의해 확인될 수 있으며, 얻어진 변이체는 표준 기법에 의해 결합 활성에 대해 시험된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터 CDR의 세트에 대해 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 CDR의 세트(즉, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3)를 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 6개의 CDR에 걸쳐 1 내지 10개의 아미노산 치환(즉, CDR은 최대 10개의 아미노산 치환을 포함함으로써 변형될 수 있으며, CDR의 임의의 조합은 변형됨), 예를 들어, CDR에 걸쳐 1 내지 7개의 아미노산 치환, 1 내지 5개의 아미노산 치환, 1 내지 4개의 아미노산 치환, 1 내지 3개의 아미노산 치환, 1 내지 2개의 아미노산 치환, 또는 1개의 아미노산 치환을 포함하는 이들 CDR 서열의 변이체를 포함하고, 변이체는 ECD2에 결합하는 능력을 보유한다. 전형적으로, 이러한 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 것이다. 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v10000의 ECD2-결합 아암으로부터 CDR의 세트에 대해 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 CDR의 세트(즉, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3)를 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD2에 결합하는 능력을 보유한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 VH 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD2에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 VL 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD2에 결합하는 능력을 보유한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v10000의 ECD2-결합 아암으로부터의 VH 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD2에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v10000의 ECD2-결합 아암으로부터의 VL 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD2에 결합하는 능력을 보유한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD4-결합 아암으로부터 CDR의 세트에 대해 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 CDR의 세트(즉, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3)를 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD4에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 6개의 CDR에 걸쳐 1 내지 10개의 아미노산 치환(즉, CDR은 최대 10개의 아미노산 치환을 포함함으로써 변형될 수 있으며, CDR의 임의의 조합은 변형됨), 예를 들어, CDR에 걸쳐 1 내지 7개의 아미노산 치환, 1 내지 5개의 아미노산 치환, 1 내지 4개의 아미노산 치환, 1 내지 3개의 아미노산 치환, 1 내지 2개의 아미노산 치환, 또는 1개의 아미노산 치환을 포함하는 이들 CDR 서열의 변이체를 포함하고, 변이체는 ECD4에 결합하는 능력을 보유한다. 전형적으로, 이러한 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 것이다. 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v10000의 ECD4-결합 아암으로부터 CDR의 세트에 대해 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 CDR의 세트(즉, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3)를 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD4에 결합하는 능력을 보유한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD4-결합 아암으로부터의 VH 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD4에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 하나의 ECD4-결합 아암으로부터의 VL 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD4에 결합하는 능력을 보유한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v10000의 ECD4-결합 아암으로부터의 VH 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VH 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD4에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v10000의 ECD4-결합 아암으로부터의 VL 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 VL 서열을 포함하되, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD4에 결합하는 능력을 보유한다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 국제 특허 출원 공개 WO 2016/179707호에 기재되어 있는 2파라토프 항체 중 하나이다. 본 출원은 하나의 항원-결합 도메인으로서 고친화도 변이체로부터의 서열을 포함하는 2파라토프 항체를 포함하는 항-HER2 항체 퍼투주맙의 고친화도 변이체를 기재한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 또는 v15085 중 하나이다(표 7 및 표 7A, 및 서열 표 참조). 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 또는 v15085 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 또는 v15085 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 또는 v15085 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 VH 서열 및 VL 서열을 포함하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 트라스투주맙으로부터의 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 또는 v15085 중 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함하고, 다른 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 트라스투주맙으로부터의 CDR 서열을 포함한다.
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Figure pct00024
Figure pct00025
항-HER2 2파라토프 항체의 특성
낮은 DAR에서 독소의 접합은 대응하는 2가 단일특이성 항체에 비해 HER2에 대해 증가된 결합 및/또는 HER2-발현 세포 내로의 더 높은 내재화를 나타내는 항-HER2 2파라토프 항체에 대해 특정 이점을 가진다. 대응하는 2가 단일특이성 항체는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 둘, 또는 2파라토프 항체에 의해 포함되는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 둘을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 2가 단일특이성 항체에 비해 HER2에 대해 증가된 결합을 나타낸다(즉, 고친화도로 결합한다). 증가된 결합은, 예를 들어, 해리 상수의 감소 및/또는 최대 결합의 증가에 의해 나타날 수 있다.
해리 상수(KD)는 특정 리간드-단백질 상호작용, 예컨대 항체-항원 상호작용의 평형 해리상수를 지칭한다. KD는 두 단백질(예를 들어, AB)이 더 작은 성분(A+B)으로 가역적으로 해리되는 경향을 측정하며, 해리 속도("오프-속도" 또는 koff로도 불림) 대 결합 속도("온-속도(on-rate)" 또는 kon로도 불림)의 비로서 정의된다. 따라서, KD는 koff/kon과 동일하고, 몰 농도(M)로서 표현된다. KD가 작을수록, 결합 친화도가 더 강하다는 것을 따른다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에서 잘 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법의 예는 전형적으로 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(등록상표) 시스템 및 등온선 적정 열량계(isothermal titration calorimetry: ITC)를 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 포함한다.
겉보기 KD, 또는 겉보기 평형 해리상수는 절반의 최대 세포 결합이 관찰된 항체 농도를 나타낸다. 겉보기 KD는 세포 결합 실험 조건, 예컨대 세포 상에서 발현된 상이한 수용체 수준 및 인큐베이션 조건에 의존적이며, 따라서 겉보기 KD는 일반적으로 무세포 분자 실험, 예컨대 SPR 및 ITC로부터 결정된 KD 값과 상이하다. 그러나, 상이한 방법 간에 양호한 일치가 있다.
최대 결합(또는 "Bmax")는 항체의 포화 농도에서의 세포의 최대 항체 결합 수준을 지칭한다. 이 파라미터는 상대적 비교를 위해 임의의 단위 MFI로 보고되거나, 표준 곡선의 사용에 의해 세포에 결합된 항체 수에 대응하는 임의의 값으로 전환될 수 있다.
Bmax 및 겉보기 KD는 다양한 기법에 의해 결정될 수 있다. 일례는 유세포분석에 의한 표적 항원-발현 세포의 측정이다. 전형적으로, 이러한 실험에서, 표적 항원-발현 세포는 상이한 농도에서 항체와 함께 인큐베이션되고, 세척되고 나서, 항체를 검출하기 위한 2차 제제와 함께 인큐베이션되고, 세척된 다음, 결국 세포에 결합된 항체 수에 관한 세포 상의 검출 신호 강도를 나타내는 중위 형광 강도(median fluorescent intensity: MFI)를 측정하기 위해 유세포분석기에서 분석된다. 이어서, 항체 농도 대 MFI 데이터는 포화 결합식에 적합화되어 Bmax 및 겉보기 KD를 수득한다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 기준 항체에 비해 HER2를 나타내는 표적 세포에 대해 Bmax의 증가를 나타낸다. 본 명세서에 기재한 바와 같은 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 항-HER2 2파라토프 항체에 대해, 대응하는 기준 항체는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 둘, 또는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 둘을 포함하는 2가 단일특이성 항체일 것이다. 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 대해 결정된 Bmax는 대응하는 기준 항체의 Bmax의 적어도 약 110%이다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 대해 결정된 Bmax는 대응하는 기준 항체에 대한 Bmax의 적어도 약 125%이며, 예를 들어, 대응하는 기준 항체의 Bmax의 약 150%, 또는 대응하는 기준 항체의 Bmax의 적어도 약 200%이다.
일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체에 대해 결정된 Bmax는 기준 항체의 Bmax의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0배이다.
특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 기준 2가 단일특이성 항체보다 HER2-발현 세포 내로 더 높은 내재화를 나타낸다. 항-HER2 2파라토프 항체는 수용체 HER2에 대한 결합을 통해 HER2+ 세포에서 내재화된다. 따라서 항-HER2 2파라토프 항체는 HER2+ 세포 내 수용체 내재화를 유도할 수 있는 것으로 간주될 수 있다.
항체 내재화는 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, 문헌[Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890(2008)]에 상술된 프로토콜에 따른 직접 내재화 방법에 의해 측정될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 암세포는 HER2를 다양한 수준으로 발현시킬 수 있다. HER2 발현 세포를 분류하는 한 가지 방법은 HER2 1+, 2+ 또는 3+(각각 낮음, 중간 및 높음)로서이다. 특정 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 3+ 수준에서 HER2를 발현시키는 세포 내 대응하는 기준 2가 단일특이성 항체보다 더 큰 내재화를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 2+ 수준에서 HER2를 발현시키는 세포 내 대응하는 기준 2가 단일특이성 항체보다 더 큰 내재화를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 1+ 수준에서 HER2를 발현시키는 세포 내 대응하는 기준 2가 단일특이성 항체보다 더 큰 내재화를 나타낸다. 상이한 수준의 HER2를 발현시키는 세포주의 예는 이하에 더 상세하게 기재되어 있다.
본 개시내용과 관련하여, HER2-발현 세포 내로 내재화된 항-HER2 2파라토프 항체의 양이 동일한 HER2-발현 세포 내로 내재화된 기준 2가 단일특이성 항체의 양보다 적어도 1.2배 더 클 때, 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 기준 2가 단일특이성 항체보다 HER2-발현 세포 내로의 더 큰 내재화를 입증하는 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 내재화된 항체의 양은 문헌[Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890(2008)]에서 상술되는 프로토콜에 따라 직접 내재화에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 내재화된 항체의 양은 2+ 수준에서 HER2를 발현시키는 HER2-발현 세포에서 결정된다.
일부 실시형태에서, HER2-발현 세포 내로 내재화된 항-HER2 2파라토프 항체의 양이 동일한 HER2-발현 세포 내로 내재화된 기준 2가 단일특이성 항체의 양보다 적어도 1.3배 더 클 때, 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 기준 2가 단일특이성 항체보다 HER2-발현 세포 내로의 더 큰 내재화를 입증하는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, HER2-발현 세포 내로 내재화된 항-HER2 2파라토프 항체의 양이 동일한 HER2-발현 세포 내로 내재화된 기준 2가 단일특이성 항체의 양보다 적어도 1.4배 더 크거나, 예를 들어, 적어도 1.5배 더 크거나, 1.6배 더 크거나, 1.7배 더 크거나, 1.8배 더 크거나, 1.9배 더 크거나 또는 2.0배 더 클 때, 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 기준 2가 단일특이성 항체보다 HER2-발현 세포 내로의 더 큰 내재화를 입증하는 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 내재화된 항체의 양은 문헌[Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890(2008)]에서 상술되는 프로토콜에 따라 직접 내재화에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 내재화된 항체의 양은 2+ 수준에서 HER2를 발현시키는 HER2-발현 세포에서 결정된다.
아우리스타틴 유사체
본 명세서에 기재된 ADC는 아우리스타틴-기반 독소(또는 "아우리스타틴 유사체")를 포함한다. 다양한 아우리스타틴 유사체는 당업계에 공지되어 있다. 예는 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 아우리스타틴 EB(AEB), 아우리스타틴 EVB(AEVB) 및 아우리스타틴 F 페닐렌다이아민(AFP)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다양한 아우리스타틴 유사체의 합성 및 구조는 미국 특허 제6,884,869호; 제7,098,308호; 제7,256,257호 및 제7,498,298호에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC에 포함된 아우리스타틴 유사체는 국제 특허 출원 공개 WO 2016/041082에 기재된 바와 같은 아우리스타틴 유사체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC에 포함된 아우리스타틴 유사체는 하기 일반식 (I)의 화합물이다:
Figure pct00026
식 중,
X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이거나, X는 존재하지 않고;
R1은
Figure pct00027
로부터 선택되며,
R2는 페닐이다.
특정 실시형태에서, 일반식 (I)의 화합물에서, R1은
Figure pct00028
로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 일반식 (I)의 화학식에서, X는 존재하지 않는다.
특정 실시형태에서, 일반식 (I)의 화합물은 하기 일반식 (IV)를 갖는다:
Figure pct00029
식 중, R1은 일반식 (I)에 대해 정의한 바와 같다.
특정 실시형태에서, 화학식 (IV)의 화합물에서, R1은
Figure pct00030
로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 화학식 (IV)의 화합물에서, R1은
Figure pct00031
이다.
특정 실시형태에서, 화학식 (IV)의 화합물에서, R1은
Figure pct00032
이다.
특정 실시형태에서, 일반식 (I)의 화합물은 하기 일반식 (V)를 갖는다:
Figure pct00033
,
식 중, R1은 일반식 (I)에 대해 정의한 바와 같다.
특정 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물에서, R1은:
Figure pct00034
로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물에서, R1은
Figure pct00035
이다.
특정 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물에서, R1은
Figure pct00036
이다.
일반식 (I)의 화합물은 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터의 표준 합성 유기 화학 프로토콜에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 방법은 국제 특허 출원 공개 WO 2016/041082에서 그리고 이하의 실시예 부문에서 제공된다.
본 개시내용의 나머지 전체적으로 일반식 (I)의 화합물에 대한 언급은 각각의 이들 화학식을 열거하는 실시형태가 개개로 구체적으로 열거되는 것과 동일한 정도로 일반식 (IV) 및 (V)의 화합물을 포함한다는 것이 이해되어야 한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 ADC는 링커(L)를 통해 아우리스타틴 유사체(독소)에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하며, 이때 링커-독소는 하기 일반식 (II)를 갖는다:
Figure pct00037
식 중,
X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이거나, X는 존재하지 않고;
R1은
Figure pct00038
로부터 선택되며;
R2는 페닐이고;
L은 링커이며, 그리고
Figure pct00039
는 항-HER2 2파라토프 항체에 대한 링커-독소의 부착지점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 일반식 (II)의 링커-독소에서, R1은
Figure pct00040
로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 일반식 (II)의 링커-독소에서, X는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 일반식 (II)의 링커-독소에서, L은 절단성 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (II)의 링커-독소에서, L은 펩타이드-함유 링커이다.
특정 실시형태에서, 일반식 (II)의 링커-독소는 하기 일반식 (X)를 갖는다:
Figure pct00041
식 중, R1, L 및
Figure pct00042
는 일반식 (II)에 대해 상기 정의한 바와 같다.
일부 실시형태에서, 일반식 (X)의 링커-독소에서, R1은
Figure pct00043
로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 일반식 (X)의 링커-독소에서, R1은
Figure pct00044
이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (X)의 화합물에서, R1은
Figure pct00045
이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (X)의 링커-독소에서, L은 절단성 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (X)의 링커-독소에서, L은 펩타이드-함유 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (X)의 링커-독소에서, L은 프로테아제-절단성 링커이다.
특정 실시형태에서, 일반식 (II)의 링커-독소는 하기 일반식 (XI)를 갖는다:
Figure pct00046
식 중, R1, L 및
Figure pct00047
는 일반식 (II)에 대해 상기 정의한 바와 같다.
일부 실시형태에서, 일반식 (XI)의 링커-독소에서, R1은
Figure pct00048
로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 일반식 (XI)의 링커-독소에서, R1은
Figure pct00049
이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (XI)의 링커-독소에서, R1은
Figure pct00050
이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (XI)의 링커-독소에서, L은 절단성 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (XI)의 링커-독소에서, L은 펩타이드-함유 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (XI)의 링커-독소에서, L은 프로테아제-절간 가능 링커이다.
또한 본 명세서에서 일반식 (II), 화학식 (X) 또는 화학식 (XI)의 링커-독소에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하는 ADC가 상정되며, 이때 링커는 이하에 나타내는 일반식 (VIII) 또는 (IX)를 가진다.
특정 실시형태에서, ADC는 하기 구조를 갖는 링커-독소를 포함한다:
Figure pct00051
식 중, A-S-는 항-HER2 2파라토프 항체의 부착 지점이다.
특정 실시형태에서, 링커(L)를 통해 아우리스타틴 유사체(독소)에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하는 본 개시내용의 ADC는 하기 일반식 (III)을 갖는다:
Figure pct00052
식 중, X 및 R1은 일반식 (II)에 대해 정의된 바와 같고;
L은 링커이며;
n은 평균 약물-대-항체비(DAR)이고, 3.9 미만이며, 그리고
Ab는 항-HER2 2파라토프 항체이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, R1은
Figure pct00053
로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, X는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, R1은
Figure pct00054
이고,
X는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, R1은
Figure pct00055
이고,
X는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이다:
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, R1은
Figure pct00056
이고,
X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, R1은
Figure pct00057
이고,
X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, L은 절단성 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, L은 펩타이드-함유 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, L은 프로테아제-절단성 링커이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, n은 0.5 내지 3.8이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, n은 0.7 내지 3.8, 0.7 내지 3.5, 0.7 내지 3.0, 또는 0.7 내지 2.5이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, n은 1.0 내지 3.8, 1.0 내지 3.5, 1.0 내지 3.0, 또는 1.0 내지 2.5이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, n은 1.5 내지 3.8, 1.5 내지 3.5, 1.5 내지 3.0, 또는 1.5 내지 2.5이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, n은 1.6 내지 3.8, 1.6 내지 3.5, 1.6 내지 3.0, 또는 1.6 내지 2.5이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (III)의 ADC에서, n은 1.8 내지 2.8, 또는 1.8 내지 2.5이다.
일반식 (III)의 화합물에 대한 임의의 앞서 언급한 실시형태의 조합이 또한 상정되며, 각각의 조합은 본 개시내용의 목적을 위한 별개의 실시형태를 형성한다.
링커
본 명세서에 기재된 ADC에서, 항-HER2 2파라토프 항체는 링커에 의해 아우리스타틴 유사체(독소)에 연결된다. 링커는 항체에 하나 이상의 독소 분자를 연결시킬 수 있는 2작용성 또는 다중작용성 모이어티이다. 링커는 항체 상의 단일 부위에 단일 약물을 연결하도록 2작용성(또는 1가)일 수 있거나, 또는 항체 상의 단일 부위에 하나 초과의 독소를 연결하도록 다중작용성(또는 다가)일 수 있다. 항체 상에서 하나 초과의 부위에 하나의 독소 분자를 연결할 수 있는 링커는 또한 다중작용성인 것으로 간주될 수 있다.
항체에 대한 링커의 부착은 다양한 방법으로, 예컨대 항체 상의 표면 라이신을 통해, 항체 상에서 산화된 탄수화물에 대한 환원성-결합을 통해, 또는 쇄간 이황화결합을 환원시킴으로써 유리되는 항체 상의 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, 항체에 대한 링커의 부착은 부위-특이적 접합을 가능하게 하도록 추가적인 시스테인 잔기(예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호; 제8,455,622호 및 제9,000,130호 참조), 또는 반응성 핸들, 예컨대 셀레노메티오닌, p-아세틸페닐알라닌, 폼일글리신 또는 p-아지도메틸-L-페닐알라닌을 제공하는 비천연 아미노산(예를 들어, 문헌[Hofer et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101-16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106:3000-3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem., 25:351-361(2014)] 참조)을 포함시키는 항체의 변형에 의해 달성될 수 있다.
링커는 항체 상의 표적기 또는 기들과 반응할 수 있는 작용기, 및 독소 상의 표적기와 반응할 수 있는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 적합한 작용기는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press)]에 기재된 것을 포함한다.
유리 시스테인 또는 티올과 반응하기 위한 작용기의 비제한적 예는 말레이미드, 할로아세트아마이드, 할로아세틸, 활성화된 에스터, 예컨대 석신이미드 에스터, 4-나이트로페닐 에스터, 펜타플루오로페닐 에스터, 테트라플루오로페닐 에스터, 무수물, 산 염화물, 염화설폰일, 아이소사이아네이트 및 아이소티오사이아네이트를 포함한다. 또한 이와 관련하여 문헌[Lyon et al., Nat. Biotechnol., 32:1059-1062 (2014)]에 기재된 바와 같은 "자가-안정화(self-stabilizing)" 말레이미드가 유용하다.
항체 상의 표면 라이신 및 독소 상의 유리 아민과 반응하기 위한 작용기의 비제한적 예는 활성화된 에스터, 예컨대 N-하이드록시석신아마이드(NHS) 에스터, 설포-NHS 에스터, 이미도 에스터, 예컨대 트라우트(Traut) 시약, 아이소티오사이아네이트, 알데하이드 및 산 무수물, 예컨대 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산 무수물(DTPA)을 포함한다. 다른 예는 석신이미도-1,1,3,3-테트라-메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU) 및 벤조트라이아졸-1-일-옥시트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP)를 포함한다.
항체 또는 독소 상의 친전자성기(예컨대 알데하이드 또는 케톤 카보닐기)와 반응할 수 있는 작용기의 비제한적 예는 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴하이드라자이드를 포함한다.
다른 링커는 항체 상의 2개의 쇄간 시스테인의 브리지를 허용하는 작용기를 갖는 것, 예컨대 티오브리지(ThioBridge)(상표명) 링커(Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25:1124-1136 (2014)), 다이티오말레이미드(DTM) 링커(Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986-3998 (2015)), 다이티오아릴(TCEP)피리다진다이온 기반 링커(Lee et al., Chem. Sci., 7:799-802 (2016)), 다이브로모피리다진다이온 기반 링커(Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)) 및 당업계에 공지된 기타를 포함한다.
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 링커는 둘 이상의 링커 성분을 포함할 것이다. 예시적인 링커 성분은 항체와 반응하는 작용기, 독소와 반응을 위한 작용기, 스트레처(stretcher), 펩타이드 성분, 자가-희생기(self-immolative group), 자가-제거기(self-elimination group), 친수성 모이어티 등을 포함한다. 다양한 링커 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 이 중 일부는 이하에 기재되어 있다.
특정 유용한 링커 성분은 다양한 상업적 공급원, 예컨대 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.)(현재 매사추세츠주 월섬에 소재한 써모피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 및 몰레큘러 바이오사이언시즈 인코포레이티드(Molecular Biosciences Inc.)(콜로라도주 볼더에 소재)로부터 얻을 수 있거나, 또는 당업계에 기재된 절차에 따라 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Toki et al., J. Org. Chem., 67:1866-1872 (2002); Dubowchik, et al., Tetrahedron Letters, 38:5257-60(1997); Walker, M. A., J. Org. Chem., 60:5352-5355 (1995); Frisch, et al., Bioconjugate Chem., 7:180-186 (1996)]; 미국 특허 제6,214,345호 및 제7,553,816호, 및 국제 특허 출원 공개 WO 02/088172 참조).
링커 성분의 예는 N-(β-말레이미도프로필옥시)-N-하이드록시 석신이미드 에스터(BMPS), N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 석신이미드 에스터(EMCS), N-[γ-말레이미도뷰티릴옥시]석신이미드 에스터(GMBS), 1,6-헥산-비스-비닐설폰(HBVS), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)뷰티르산 하이드라자이드(MPBH), 석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP), 석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), 석신이미딜 (4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(STAB), N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)뷰티레이트(SMPB), 석신이미딜 6-[(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트](SMPH), 이미노티올란(IT), 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB 및 석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트(SVSB)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
추가적인 예는 비스-말레이미드 시약, 예컨대 다이티오비스말레이미도에탄(DTME), 비스-말레이미도-트라이옥시에틸렌 글리콜(BMPEO), 1,4-비스말레이미도부탄(BMB), 1,4 비스말레이미딜-2,3-다이하이드록시부탄(BMDB), 비스말레이미도헥산 (BMH), 비스말레이미도에탄(BMOE), BM(PEG)2 및 BM(PEG)3; 이미도에스터의 2작용성 유도체(예컨대 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 포함한다.
적합한 링커는 전형적으로 세포 내의 조건에 대해서보다 바깥의 조건에 대해 더 화학적으로 안정하지만, 덜 안정한 링커가 특정 상황에서, 예컨대 독소가 선택적이거나 표적화될 때 그리고 정상세포에 대해 낮은 독성을 가질 때 상정될 수 있다. 링커는 "절단성 링커" 또는 "비-절단성 링커"일 수 있다. 절단성 링커는 전형적으로 세포내 조건 하에, 예를 들어, 리소좀 과정을 통해 절단되기 쉽다. 예는 프로테아제-민감성, 산-민감성, 환원-민감성 또는 광불안정성인 링커를 포함한다. 비-절단성 링커는 대조적으로 아미노산-링커-독소 모이어티의 방출을 초래하는 세포 내 항체의 분해에 전형적으로 의존한다.
적합한 절단성 링커는, 예를 들어, 둘 이상의 아미노산을 포함하며 세포내 프로테아제, 예컨대 라이소좀 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단성인 펩타이드 성분을 포함하는 링커를 포함한다. 펩타이드 성분은 천연 유래 아미노산 잔기 및/또는 부수적 아미노산 및/또는 비천연 유래 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함할 수 있다. 펩타이드 성분은 특정 효소, 예를 들어, 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 또는 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 절단을 위해 설계되고 최적화될 수 있다.
특정 실시형태에서, ADC에 포함된 링커는 다이펩타이드-함유 링커, 예컨대 발린-시트룰린(Val-Cit) 또는 페닐알라닌-라이신(Phe-Lys)을 함유하는 링커일 수 있다. 링커에 포함시키기 위한 적합한 다이펩타이드의 다른 예는 Val-Lys, Ala-Lys, Me-Val-Cit, Phe-호모Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys 및 Met-(D)Lys을 포함한다. 절단성 링커는 또한 더 긴 펩타이드 성분, 예컨대 트라이펩타이드, 테트라펩타이드 또는 펜타펩타이드를 포함할 수 있다. 예는 트라이펩타이드 Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys 및 (D)Ala-Phe-Lys, 및 테트라펩타이드 Gly-Phe-Leu-Gly 및 Ala-Leu-Ala-Leu을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
절단성 링커의 추가적인 예는 이황화물-함유 링커, 예를 들어, N-석신이미딜-4-(2-피리딜다이티오) 부타노에이트(SPBD) 및 N-석신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)-2-설포 부타노에이트(설포-SPBD)를 포함한다. 이황화물-함유 링커는 선택적으로 링커, 예를 들어, 같은 자리(geminal) 다이메틸기의 포함의 세포외 안정성을 개선시키기 위해 이황화결합에 인접한 입체장애를 제공하는 추가적인 기를 포함할 수 있다. 다른 적합한 링커는 특정 pH에서 또는 pH 범위에서 가수 분해 가능한 링커, 예컨대 하이드라존 링커를 포함한다. 이들 작용기의 조합을 포함하는 링커가 또한 유용할 수 있으며, 예를 들어, 하이드라존과 이황화물을 둘 다 포함하는 링커는 당업계에 공지되어 있다.
절단성 링커의 추가적인 예는 라이소좀 및 사이질 종양에 존재하는 효소인 β-글루쿠로니다제에 의해 절단성인 β-글루쿠로나이드를 포함하는 링커이다(예를 들어, 문헌[De Graaf et al., Curr. Pharm. Des., 8:1391-1403 (2002)] 참조).
절단성 링커는 선택적으로 하나 이상의 추가적인 성분, 예컨대 자가-희생기 및 자가-제거기, 스트레처 또는 친수성 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
링커에서의 용도를 발견한 자가-희생기 및 자가-제거기는, 예를 들어, p-아미노벤질옥시카보닐(PABC) 및 p-아미노벤질 에터(PABE) 기, 및 메틸화된 에틸렌 다이아민(MED)을 포함한다. 자가-희생기의 다른 예는 PABC 또는 PABE 기, 예컨대 복소환식 유도체, 예를 들어 미국 특허 제7,375,078호에 기재된 바와 같은 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체와 전자적으로 유사한 방향족 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 예는 치환 및 비치환된 4-아미노뷰티르산 아마이드(Rodrigues et al., Chemistry Biology, 2:223-227 (1995)) 및 2-아미노페닐프로피온산 아마이드(Amsberry, et al., J. Org. Chem., 55:5867-5877 (1990))와 같은 아마이드 결합 가수분해 시 고리화를 겪는 기를 포함한다.
ADC에 대한 링커에서의 용도를 발견하는 스트레처는, 예를 들어, 지방족 산, 2산, 아민 또는 다이아민, 예컨대 다이글리콜레이트, 말로네이트, 카프로에이트 및 카프로아마이드에 기반한 알킬렌기 및 스트레처를 포함한다. 다른 스트레처는, 예를 들어, 글리신-기반 스트레처, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스트레처 및 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 스트레처를 포함한다. PEG 및 mPEG 스트레처는 또한 친수성 모이어티로서 작용한다.
본 개시내용의 ADC에서의 용도를 발견할 수 있는 절단성 링커에서 통상적으로 발견되는 성분의 예는 일부 실시형태에서 SPBD, 설포-SPBD, 하이드라존, Val-Cit, 말레이도카프로일(MC 또는 mc), mc-Val-Cit, mc-Val-Cit-PABC, Phe-Lys, mc-Phe-Lys, mc-Phe-Lys-PABC, 말레이미도 트라이에틸렌 글리콜레이트(MT), MT-Val-Cit, MT-Phe-Lys 및 아디페이트(AD)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 ADC에 포함된 링커는 일반식 (VI)를 갖는 펩타이드-기반 링커이다:
Figure pct00058
식 중,
Z는 항체 상의 표적 기와 반응할 수 있는 작용기이고;
Str은 스트레처이며;
AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 아미노산이고, AA1-[AA2]m은 프로테아제 절단 부위를 형성하고;
X는 자가-희생기이며;
D는 아우리스타틴 유사체에 대한 부착 지점이고;
s는 0 또는 1이며;
m은 1 내지 4의 정수이고, 그리고
o는 0, 1 또는 2이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, Z는
Figure pct00059
이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, Str는
Figure pct00060
로부터 선택되며,
식 중,
R은 H 또는 C1-C6 알킬이고;
p는 2 내지 10의 정수이며, 그리고
q는 1 내지 10의 정수이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, Str은
Figure pct00061
이며,
식 중, p 및 q는 상기 정의한 바와 같다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, Str은
Figure pct00062
이며,
식 중, p는 2 내지 6의 정수이고, 그리고
q는 2 내지 8의 정수이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, AA1-[AA2]m은 Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys, (D)Ala-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly 및 Ala-Leu-Ala-Leu로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, m은 1이다(즉, AA1-[AA2]m은 다이펩타이드이다).
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, AA1-[AA2]m은 Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit 및 Trp-Cit로부터 선택된 다이펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, 각각의 X는 p-아미노벤질옥시카보닐(PABC), p-아미노벤질 에터(PABE) 및 메틸화된 에틸렌 다이아민(MED)으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, m은 1, 2 또는 3이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, s는 1이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서, o는 0이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VI)에서:
Z는
Figure pct00063
이고;
Str는 또는
Figure pct00064
이며, p는 2 내지 6의 정수이며, q는 2 내지 8의 정수이고;
m은 1이고, AA1-[AA2]m은 Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit 및 Trp-Cit로부터 선택된 다이펩타이드이며;
s는 1이고, 그리고
o는 0이다.
일부 실시형태에서, 링커는 이황화물-함유 링커이고, ADC는 하기 일반식 (VII)을 갖는다:
Figure pct00065
식 중,
A는 항체이고;
D는 아우리스타틴 유사체이며;
Y는 -(CH2)p- 또는 -(CH2CH2O)q-이되, p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이고;
각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;
r은 1, 2 또는 3이고, 그리고
Figure pct00066
는 항체 상의 표면 라이신의 ε-아미노기와 링커 사이에 형성된 아마이드 결합을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VII)에서, p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VII)에서, Y는 -(CH2)p-이고, p는 1 내지 4의 정수이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VII)에서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 Me이다.
일부 실시형태에서, 일반식 (VII)에서, r은 1 또는 2이다.
다양한 비-절단성 링커는 항체에 약물을 연결하는 것에 대해 당업계에 공지되어 있고, 특정 실시형태에서 본 개시내용의 ADC에서 유용할 수 있다. 비-절단성 링커의 예는 항체와의 반응을 위해 N-석신이미딜 에스터 또는 N-설포석신이미딜 에스터 모이어티뿐만 아니라 독소와의 반응을 위해 말레이미도- 또는 할로아세틸-기반 모이어티를 갖거나, 또는 그 반대인 링커를 포함한다. 이러한 비-절단성 링커의 예는 설포석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)에 기반한다. 이러한 링커의 다른 비제한적 예는 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)("장쇄" SMCC 또는 LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA), γ-말레이미도뷰티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프론산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)아이소사이아네이트(PMPI)에 기반한 것을 포함한다. 다른 예는 할로아세틸-기반 작용기, 예컨대 N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA) 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)를 포함하는 것을 포함한다.
비-절단성 링커의 다른 예는 말레이미도카복실산, 예컨대 말레이미도카프로일(MC)을 포함한다.
주어진 ADC에 대한 적절한 링커의 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있고, 적절한 인자, 예컨대 항체에 대한 부착 부위, 독소의 임의의 구조적 제약 및 독소의 소수성을 고려할 수 있다(예를 들어, 문헌[Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed.), Springer]의 검토 참조).
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 ADC에 포함된 링커는 하기 일반식 (VIII)을 갖는다:
Figure pct00067
식 중,
A-S-는 항-HER2 2파라토프 항체의 부착 지점이고;
Y는 하나 이상의 추가적인 링커 성분이거나, 존재하지 않고, 그리고
D는 아우리스타틴 유사체에 대한 부착 지점이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 ADC에 포함된 링커는 하기 일반식 (IX)을 갖는다:
Figure pct00068
식 중,
A-S-는 항-HER2 2파라토프 항체의 부착 지점이고;
Y는 하나 이상의 추가적인 링커 성분이거나, 존재하지 않고, 그리고
D는 아우리스타틴 유사체에 대한 부착 지점이다.
항체 약물 접합체의 제조
본 개시내용의 ADC는 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 당업계에 공지된 몇몇 경로 중 하나에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press], 및 본 명세서에 제공된 실시예 참조). 예를 들어, 접합은 (1) 항체-링커 중간체 Ab-L를 형성하기 위한 공유 결합을 통한 항체의 친핵성기 또는 친전자성기와 2작용성 링커의 반응, 다음에 활성화된 아우리스타틴 유사체(D)와의 반응, 또는 (2) 링커-독소 D-L을 형성하기 위한 공유 결합을 통한 아우리스타틴 유사체의 친핵성기 또는 친전자성기와 링커와의 반응 다음에 항체의 친핵성기 또는 친전자성기와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 접합 방법(1) 및 (2)는 본 명세서에 기재된 ADC를 제조하기 위해 다양한 항체, 아우리스타틴 유사체 및 링커와 함께 사용될 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, 아우리스타틴 유사체는 ADC를 제공하기 위해 적절한 링커를 통해 항체 상의 다양한 기에 접합될 수 있다. 예를 들어, 접합은 표면 라이신을 통하거나, 산화된 탄수화물을 통하거나, 또는 하나 이상의 쇄간 이황화결합을 환원시킴으로써 유래된 시스테인 잔기를 통할 수 있다. 대안적으로, 항체는 반응성 핸들, 예컨대 셀레노메티오닌, p-아세틸페닐알라닌, 폼일글리신 또는 p-아지도메틸-L-페닐알라닌을 제공하는 추가적인 시스테인 잔기 또는 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호; 제8,455,622호 및 제9,000,130호; 문헌[Hofer et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101-16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106:3000-3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem., 25:351-361(2014)] 참조).
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 ADC는 적절한 링커를 통해 하나 이상의 쇄간 이황화결합을 환원시킴으로써 유리된 시스테인 잔기에 접합된 아우리스타틴 유사체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 ADC에서, 항-HER2 2파라토프 항체는, 특정 실시형태에서, 낮은 평균 약물-대-항체비(DAR)에서, 구체적으로는 3.9 미만이지만 0.5 초과, 예를 들어, 약 1.5 내지 약 2.5의 평균 DAR에서 링커를 통해 독소에 접합된다.
낮은 평균 DAR을 갖는 ADC를 제조하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[McCombs and Owen, The AAPS Journal, 17(2):339-351(2015) 및 이의 참고문헌; Boutureira & Bernardes, Chem. Rev., 115:2174-2195 (2015)]의 검토를 참조).
예를 들어, 시스테인 잔기에 대한 접합에 대해, 항체 쇄간 이황화결합의 부분적 환원이 수행된 후에 링커-독소에 대한 접합이 이어질 수 있다. 환원 반응에서 사용되는 환원제의 양을 제한함으로써 부분적 환원이 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lyon et al., Methods in Enzymology, 502:123-138 (2012)]및 이의 실시예, 및 본 명세서에 제공된 실시예를 참조). 적합한 환원제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 다이티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 2-머캅토에탄올, 시스테아민 및 다수의 수용성 포스핀을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 낮은 평균 DAR을 얻기 위해 더 소수 등가의 링커-독소가 사용될 수 있다.
대안적으로, 쇄간 이황화결합을 구성하는 시스테인 잔기 중 하나 이상이 세린 잔기로 대체되어, 접합을 위한 소수의 이용 가능한 시스테인 잔기를 생성하는 조작된 항체가 사용될 수 있다(문헌[McDonagh et al., Protein Eng. Des. Sel. PEDS, 19(7):299-307] 참조). 이어서, 조작된 항체는 환원제로 처리되고, 링커-독소에 접합될 수 있다.
다른 접근은 쇄간 이황화결합을 정상적으로 구성하는 2개의 시스테인을 브리지하는 비스-티올 링커를 사용하는 것이다. 모두 4개의 쇄간 이황화결합이 환원되고 비스-티올 링커로 대체된다면, 하나의 독소 분자만을 운반하는 비스-티올 링커의 사용은 전체-크기 항체에 대해 최대 DAR4를 갖는 ADC를 생성할 것이다. 쇄간 이황화결합 및/또는 소수의 동등한 링커의 부분적 환원은 DAR을 추가로 환원시키기위해 비스-티올 링커와 함께 사용될 수 있다. 다양한 비스-티올 링커는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25(6):1124-1136 (2014); Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986-3998 (2015); Lee et al., Chem. Sci., 7:799-802 (2016); Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)] 참조).
낮은 평균 DAR을 갖는 ADC를 생성하기 위해 시스테인 조작 접근이 또한 사용될 수 있다. 접합을 위한 부위-특이적 핸들을 제공하기 위해 이러한 접근은 용매-접근성 시스테인을 항체 내로 조작하는 것을 수반한다. 시스테인 잔기의 도입을 위한 다수의 적절한 부위는 IgG 구조를 갖는 것이 확인되었고, 문헌[Junutula, et al., J. Immunol Methods, 332(1-2):41-52 (2008); Junutula, et al., Nat. Biotechnol., 26(8), 925-932 (2008)] 및 미국 특허 제9,315,581호; 제9,000,130호; 제8,455,622호; 제8,507,654호 및 제7,521,541호에 기재된 것을 포함한다.
낮은 평균 DAR ADC는 또한 활성화된 링커-독소의 양을 제한하는 것을 사용하는 라이신 접합에 의해 제조될 수 있다. 항체 N-말단의 아미노산에서 선택적 반응이 또한 사용될 수 있다.　예를 들어, N-말단의 세린은 과요오드산염을 갖는 알데하이드로 산화될 수 있고, 이어서, 링커-독소와 반응된다(예를 들어, 문헌[Thompson, et al., Bioconjug. Chem., 26(10):2085-2096 (2015)] 참조). 유사하게, N-말단의 시스테인 잔기는 선택적으로 알데하이드와 반응되어 티아졸리다이논을 제공할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bernardes, et al., Nature Protocols, 8:2079-2089] 참조).
추가적인 접근은 하나 이상의 비천연 아미노산, 예컨대 p-아세틸페닐알라닌(pAcPhe) 또는 셀레노시스테인(Sec)을 포함하기 위해 항체를 조작하는 것을 포함한다. pAcPhe의 케토기는 말단의 아록시아민 또는 하이드라자이드를 포함하는 링커-독소와 반응하여 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Axup, et al., PNAS USA, 109:16101-16106 (2012)] 참조). Sec-함유 항체는 말레이미드- 또는 아이오도아세트아마이드 함유 링커-독소와 반응하여 셀레노에터 접합체를 형성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Hofer, et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009)] 참조).
항체는 또한 효소-촉매된 접합을 가능하게 하기 위해 특정 효소에 의해 인식되는 펩타이드 태그를 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 솔타제-A(SortA)는 서열 LPXTG를 인식한다. SortA-매개된 접합을 가능하게 하기 위해 이 펜타펩타이드는 항체의 N- 또는 C-말단으로 조작될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2016/0136298호; 문헌[Kornberger and Skerra, mAbs, 6(2):354-366 (2014)]). 위치 N297에서 탈글리코실화된(효소적 접합을 위해 Q295를 노출하는) 항체를 이용함으로써 또는 "글루타민 태그"(LLQG)를 포함하도록 항체를 조작함으로써 트랜스글루타미나제는 또한 DAR2 ADC를 생성하는 데 사용되었다(Jeger, et al., Angew. Chem., 49:9995-9997 (2010); Strop, et al., Chem. Biol., 20(2):161-167 (2013)). 다른 접근에서, 적절한 공통 서열을 항체 내로 조작하고 조작된 항체를 폼일글리신-생성 효소(FGE)와 공동 발현시킴으로써 폼일글리신 잔기는 항체 내로 도입될 수 있다. 이어서, 도입된 폼일글리신의 알데하이드 작용기는 독소 접합을 위한 핸들로서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Drake, et al., Bioconjug. Chem., 25(7):1331-1341(2014)] 참조).
DAR2 ADC를 생성하기 위해 사용되는 다른 접근은 글리코실화된 항체 상에서 발견되는 천연 항체에 대한 링커-독소의 접합에 의한다. 글리코실화된 항체에 대한 접합은, 예를 들어, 말단의 당 잔기의 과요오드산염 산화에 의해 알데하이드(이후에 적절한 링커-독소에 접합될 수 있음)를 수득함으로써, 또는 천연 당이 말단의 시알산 잔기(이후에 산화되어 링커-독소에 대한 접근을 위한 알데하이드를 수득할 수 있음)에 의해 변형되는 당조작 접근에 의해 달성될 수 있다(Zhou, et al., Bioconjug. Chem., 25(3):510-520(2014)).
항체에 대한 활성 모이어티의 접합을 위한 UV 가교의 사용이 또한 보고되었다. 본 방법은 반응성 티올 모이어티를 갖는 항체의 부위-특이적 공유 작용기화를 위해 뉴클레오타이드 결합 부위(nucleotide binding site: NBS)를 사용한다. 시스테인의 인돌-3-뷰티르산(IBA) 접합 형태는 NBS에서 항체에 대한 반응성 티올 모이어티를 부위-특이적으로 광-가교하는데(photo-cross-link) 사용되었다. 이어서, 티올 모이어티는 티올 반응성 기를 갖는 링커-독소를 접합하는 데 사용될 수 있다(Alves, et al., Bioconjug. Chem., 25(7):1198-1202 (2014)).
대안적으로, 낮은 평균 DAR를 갖는 ADC는 크로마토그래피 분리 기법, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 DAR 종의 혼합물을 함유하는 ADC 제제로부터 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063-7070(2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371-81(2017)]; 미국 특허 출원 공개 제 2014/0286968호).
낮은 평균 DAR를 갖는 ADC 제제는 또한 평균 DAR이 3.9 이상인 ADC의 제제에 비접합(즉, DAR0) 항체를 첨가함으로써 생성될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대다수의 접합 방법은 다양한 DAR 종을 포함하는 ADC 제제를 수득하며, 보고된 DAR은 개개 DAR 종의 평균이다. 특정 실시형태에서, DAR0 종의 비율을 포함하는 ADC 제제가 유리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 평균 DAR이 3.9 미만인 ADC 제제는 적어도 5%의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC 제제는 적어도 10%의 DAR0 종, 예를 들어, 적어도 15%의 DAR0 종 또는 적어도 20%의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC 제제는 약 5% 내지 약 50%의 DAR0 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC 제제는 약 10% 내지 약 50%의 DAR0 종, 예를 들어, 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 10% 내지 약 30%의 DAR0 종을 포함할 수 있다.
ADC에 대한 평균 DAR은 표준 기법, 예컨대 UV/VIS 스펙트럼 분석법, ELISA-기반 기법, 크로마토그래피 기법, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), UV-MALDI 질량 분석법(MS) 및 MALDI-TOF MS에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 약물-연결 형태(예를 들어, DAR0, DAR1, DAR2 등 종의 분획)의 분포는 또한 MS(수반하는 크로마토그래피 분리 단계가 있거나 없음), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 HPLC 또는 등전점 포커싱 겔 전기영동(IEF)을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 기법에 의해 분석될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sun et al., Bioconj Chem., 28:1371-81(2017); Wakankar et al., mAbs, 3:161-172 (2011)] 참조).
특정 실시형태에서, ADC의 평균 DAR은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 기법에 의해 결정된다.
접합 후에, ADC는 당업계에 공지된 정제 방법에 의해 비접합 반응물 및/또는 임의의 접합 응집물로부터 정제되고 분리될 수 있다. 이러한 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), 한외여과, 원심분리 한외여과 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
시험
HER2-발현 암세포 내 ADC에서의 항암 활성은 표준 기법을 이용하여 시험관내에서 및/또는 생체내에서 시험될 수 있다.
예를 들어, 세포 배양물 배지에서 ADC에 HER2-발현 암세포를 노출시키고, 적절한 기간의 시간(예를 들어, 약 6시간 내지 약 7일) 동안 세포를 배양시키고, 이어서, 세포 생존도를 측정함으로써, ADC의 세포독성 활성이 측정될 수 있다. 비-HER2 발현 세포는 대조군으로서 포함될 수 있다.
ADC를 시험하기 위해 사용될 수 있는 다양한 수준에서 HER2를 발현시키는 다양한 암 세포주는 당업계에 공지되어 있고, 다수는 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, 버지니아주 매너서스에 소재한 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection); 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 아덱스바이오 테크놀로지즈(Addexbio Technologies); 독일 브라운슈바이크에 소재한 DSMZ). 예는 BT-474 (3+), SK-BR-3 (3+), HCC1954 (3+), JIMT-1(2+) 및 ZR-75-1(1+) 세포주를 포함한다. 이들 및 다른 예는 표 8에 요약한다.
Figure pct00069
생체내 종양 성장을 저해하는 ADC의 능력은 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여 적절한 동물 모델에서 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Enna, et al., Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc., New York, NY] 참조). 일반적으로, 항-종양 화합물을 선별하기 위한 현재의 동물 모델은 인간 종양이 동물, 전형적으로 설치류에게 이식된 이종이식 모델이다.
예를 들어, ADC는 제0일에, 종양 단편을 피하로 생착시키거나, 적절한 수의 암 세포를 이식한 마우스를 이용하여 생체내에서 HER2-발현 종양 상에서 시험될 수 있다. 종양은 목적하는 크기로 발생되도록 허용되며, 불충분하게 발생된 종양을 갖는 동물은 제거된다. ADC 치료는 일반적으로 종양 유형에 따라서 생착 후에 3 내지 22일에 시작된다. ADC는, 예를 들어, 정맥내(i.v.) 주사에 의해 동물에 투여될 수 있다. 종양은, 예를 들어, 종양이 사전 결정된 크기 또는 중량에 도달될 때 연구의 사전 결정된 종점까지, 사전 결정된 시간 기간 후에 또는 지속적으로(예를 들어, 1주에 2 또는 3회) 측정될 수 있다. 다양한 수준으로 HER2를 발현시키는 종양이 이종이식 모델에서 사용될 수 있다. 환자-유래 이종이식편(PDX)이 특히 유용하다.
ADC의 생체내 독성 효과는 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서, 치료 동안 동물 체중에 대한 이들의 효과를 측정함으로써 초기에 평가될 수 있다. 또한 동물로부터 취한 혈액 샘플에 대해 혈액학적 프로파일 및 간 효소 분석이 수행될 수 있다.
생체내 독성 및 약물동태학은 표준 프로토콜 후에 적절한 동물 모델, 예를 들어, 래트 또는 비인간 영장류에서 추가로 분석될 수 있다. 사이노몰거스 원숭이는 이와 관련하여 특히 유용한다 인간 및 사이노몰거스 원숭이 HER2가 98%의 서열 상동성을 공유하기 때문이다.
본 명세서에 기재된 ADC는 동일한 독소 용량으로 투여할 때 DAR이 3.9 이상인 대응하는 ADC에 비해 개선된 내약성 및 낮은 독성을 가진다. 특정 실시형태에서, ADC는 동일한 독소 용량으로 투여할 때 DAR이 3.9 이상인 대응하는 ADC의 내약성보다 2× 초과의 내약성의 개선을 나타낸다. 일부 실시형태에서, ADC는 동일한 독소 용량으로 투여할 때 DAR이 3.9 이상인 대응하는 ADC의 내약성보다 2.2× 초과, 예를 들어, 2.3×, 2.4× 또는 2.5×의 내약성의 개선을 나타낸다. 내약성의 개선은, 예를 들어, DAR이 3.9 이상인 본 개시내용의 ADC 및 대응하는 ADC에 대한 최대 내약 용량(maximal tolerated dose: MTD), 관찰된 유해 효과 수준 없음(no observed adverse event level: NOAEL) 또는 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(highest non-severely toxic dose: HNSTD)의 비교에 의해 결정될 수 있다. MTD, NOAEL 및/또는 HNSTD는 적절한 동물 모델, 예를 들어, 설치류 또는 비인간 영장류에서 표준 기법에 의해 측정될 수 있다.
약제학적 조성물
치료적 용도를 위해, ADC는 ADC 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 잘 공지되고 용이하게 입수 가능한 성분을 이용하여 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은, 예를 들어, 경구(예를 들어, 협측 또는 설하를 포함), 국소, 비경구, 직장 또는 질 경로에 의해 또는 흡입 또는 스프레이에 의해 대상체에 대한 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 피하 주사, 및 진피내, 관절내, 정맥내, 근육내, 혈관내, 흉골내, 초내 주사 또는 주입을 포함한다. 약제학적 조성물은 전형적으로, 예를 들어, 시럽, 엘릭시르, 정제, 트로키, 로젠지, 경질 또는 연질 캡슐, 알약, 좌약, 유성 또는 수성 현탁액, 분산 가능한 분말 또는 과립, 에멀션, 주사용 또는 용액으로서 대상체에게 투여하기에 적합한 형식으로 제형화될 것이다. 약제학적 조성물은 단위 투약 제형으로서 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, ADC를 포함하는 약제학적 조성물은 단위 투약 주사 가능 형태로, 예를 들어, 동결건조 제형 또는 수용액으로서 비경구 투여를 위해 제형화된다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 일반적으로 비독성이다. 이러한 담체의 예는 완충제, 예컨대 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제, 예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 뷰틸 알코올, 벤질 알코올, 알킬 파라벤(예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤), 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물, 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, ADC를 포함하는 조성물은 멸균 주성 또는 유성 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 당업계에 공지되어 있는 적합한 분산제 또는 습윤제 및/또는 현탁제를 이용하여 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액 또는 현탁액은 비독성의 비경구로 허용 가능한 희석제 또는 담체에 ADC를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 희석제 및 담체는, 예를 들어, 1,3-부탄다이올, 물, 링거 용액 또는 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 추가로, 멸균, 고정유가 담체로서 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 다이글리세라이드를 포함하는 다양한 완하성 지방유가 사용될 수 있다. 추가로, 지방산, 예컨대 올레산은 주사 가능 제제에서의 용도를 발견한다. 아주반트, 예컨대 국소 마취제, 보존제 및/또는 완충제가 또한 주사용 용액 또는 현탁액에 포함될 수 있다.
특정 실시형태에서, ADC를 포함하는 조성물은 인간에 정맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제에서의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및/또는 국소 마취제, 예컨대 주사 부위에서 통증을 낮추기 위한 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 별개로, 또는 활성제 양을 나타내는 단위 투약 형태, 예를 들어, 밀봉 용기, 예컨대 앰플 또는 사쉐 내 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물과 함께 혼합하여 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이는 멸균 약제학적 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입 보틀에 의해 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있으며, 따라서 성분은 투여 전에 혼합될 수 있다.
다른 약제학적 조성물 및 약제학적 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (formerly "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)]에 기재되어 있다.
사용 방법
본 명세서에 기재된 ADC는 HER2-발현 종양 세포의 성장을 저해하는 방법에서 사용될 수 있다. 세포는 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 특정 실시형태에서, ADC는 대상체에서 HER2-발현 암 또는 종양을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
HER2-발현 암의 치료는 증상의 완화, 종양 크기의 수축, 종양 성장의 저해, 질환의 하나 이상의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 경감, 생존의 개선, 무진행 생존의 증가, 관해 및/또는 예후의 개선 중 하나 이상을 초래할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADC를 이용하는 HER2-발현 암의 치료는 질환의 진행을 늦춘다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADC를 이용하는 HER2-발현 암의 치료는 종양 퇴행을 초래한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADC를 이용하는 HER2-발현 암의 치료는 종양 성장의 저해를 초래한다.
HER2-발현 암은 전형적으로 고형 종양이다. HER2-발현 고형 종양의 예는 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 식도암, 결장직장암, 요로상피암, 췌장암, 침샘암 및 뇌암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. HER2-발현 유방암은 에스트로겐 수용체 음성(ER-) 및/또는 프로게스테론 수용체 음성(PR-) 유방암 및 삼중 음성(ER-, PR-, 낮은 HER2) 유방암을 포함한다. 　HER2-발현 폐암은 비소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 HER2-발현 유방암, 난소암, 폐암 또는 위암의 치료에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 HER2-발현 유방암의 치료에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 또한 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체 음성인 HER2-발현 유방암의 치료에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 HER2-발현 삼중 음성 유방암(TNBC)의 치료에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 뇌에 전이된 HER2-발현 유방암의 치료에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 HER2-발현 난소암의 치료에서 사용될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, HER2-발현 암은 이들이 발현시키는 HER2 수준에 의해(즉, "HER2 상태"에 의해) 특성규명될 수 있다. HER2 상태는, 예를 들어, 면역조직화학(IHC), 형광 인시추 혼성화(fluorescent in situ hybridization: FISH) 및 색소생산성 인시추 혼성화(chromogenic in situ hybridization: CISH)에 의해 평가될 수 있다.
IHC는 세포막 상의 HER2 단백질 발현을 확인한다. 종양 생검으로부터의 파라핀-포매 조직 절편에 IHC 분석을 실시할 수 있고, 다음과 같은 HER2 염색 강도 기준에 따른다:
스코어 0: 종양 세포의 10% 미만; 전형적으로 20,000개 미만의 수용체/세포에서 관찰된 염색 없음 또는 막 염색이 관찰됨.
스코어 1+: 종양 세포의 10% 초과에서 희미한/거의 인지할 수 없는 막 염색이 검출됨. 세포는 이들의 막의 일부에서만 염색된다. 전형적으로 약 100,000개의 수용체/세포.
스코어 2+: 종양 세포의 10% 초과; 전형적으로 약 500,000개의 수용체/세포에서 약한 내지 중간의 완전한 막 염색이 관찰됨.
스코어 3+: 종양 세포의 10% 초과; 전형적으로 약 2,000,000개의 수용체/세포에서 중간 내지 강한 완전한 막 염색이 관찰됨.
HER2 발현에 대해 0 또는 1+ 스코어를 갖는 종양은 HER2 음성으로서 특성규명되는 반면, 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 해당 종양은 HER2 양성으로서 특성규명된다.
IHC를 이용하는 HER2 검출을 위해 입수 가능한 FDA-승인 상업적 키트의 예는 허셉테스트(HercepTest)(상표명)(다코 덴마크 에이/에스(Dako Denmark A/S)); 패스웨이(PATHWAY)(벤타나 메디칼 시스템즈 인코포레이티드(Ventana Medical Systems, Inc.)); 인사이트(InSite)(상표명)HER2/NEU 키트(바이오게넥스 래버러토리즈 인코포레이티드(Biogenex Laboratories, Inc.)) 및 본드 오라클(Bond Oracle) HER2 IHC 시스템(레이카 바이오시스템즈(Leica Biosystems))을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 ADC는 다양한 수준에서 HER2를 발현시키는 암 치료에서 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, ADC는 고수준의 HER2(IHC 3+)를 발현시키는 암 치료에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC는 고수준의 HER2(3+ IHC) 또는 중간 수준의 HER2(2+ IHC 또는 2+/3+ IHC)를 발현시키는 암 치료에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC는 고수준의 HER2(3+ IHC), 중간 수준의 HER2(2+ IHC 또는 2+/3+ IHC), 또는 저수준의 HER2(1+ IHC 또는 1+/2+ IHC)를 발현시키는 암 치료에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 IHC에 의해 HER2 음성으로서 스코어링되는(scored) 암 치료에서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, ADC를 이용하여 치료될 암의 HER2 수준은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, ADC를 이용하여 치료될 암의 HER2 수준은 허셉테스트(상표명) 분석을 이용하여 수행된 IHC에 의해 결정된다.
HER2-발현 암은 천연에서 동질일 수 있거나(즉, 종양 세포의 대다수가 유사한 양의 HER2를 발현시킴) 또는 그들은 천연에서 이질일 수 있다(즉, 상이한 수준의 HER2를 발현시키는 상이한 종양 세포 집단을 포함함). ADC는 HER2 수준에 관해 동질이거나 이질인 HER2-발현 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것이 상정된다.
　특정 실시형태에서, ADC는 다른 표준 치료 요법에 대해 내성이 있거나 내성이 되는 HER2-발현 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, ADC는 하나 이상의 현재의 요법, 예컨대 트라스투주맙(허셉틴(등록상표)), 퍼투주맙(퍼제타(등록상표)), T-DM1(캐사일라(Kadcyla)(등록상표) 또는 트라스투주맙 엠탄신) 또는 탁산(예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀 등)에 반응성인 HER2-발현 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, ADC는 트라스투주맙에 내성인 HER2-발현 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, ADC는 퍼투주맙에 내성인 HER2-발현 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, ADC는 T-DM1에 내성인 HER2-발현 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, ADC는 환자에게 선행 항-HER2 요법을 진행시켰을 때 전이성 암의 치료에서의 용도를 발견한다.
ADC가 다른 치료제에 대해 내성이고/이거나 난치성이고/이거나 재발된 HER2-발현 암을 갖는 대상체의 치료에서 사용될 때, 대상체가 받은 선행 치료 수에 따라서, ADC는 2선 요법, 또는 3선 또는 4선 요법의 부분일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 HER2-발현 암을 갖는 대상체의 치료에서 추가적인 항-종양제와 함께 사용될 수 있다. 추가적인 항-종양제는 치료적 항체, 예컨대 상기 언급한 것 또는 화학치료제일 수 있다. HER2-발현 암의 치료를 위해 통상적으로 사용되는 화학치료제는, 예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 파클리탁셀, 알부민-결합 파클리탁셀 아브락산(Abraxane)(등록상표), 도세탁셀, 겜시타빈, 비노렐빈, 이리노테칸, 에토포사이드, 빈블라스틴, 페메트렉세드, 5-플루오로유라실(폴리닌산(folinic acid)이 있거나 없음), 카페시타빈, 카보플라틴, 에피루비신, 옥살리플라틴, 폴피리녹스, 사이클로포스파마이드 및 당업계에 공지된 바와 같은 이들 제제의 다양한 조합을 포함한다. 추가적인 제제(들)는 ADC와 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADC는 임의의 선행 항암 치료를 받지 않은 HER2-발현 암을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것이 상정된다(즉, ADC는 1선 요법으로서 사용될 수 있다).
특정 실시형태에서, 상기 방법에서 ADC를 이용하여 치료 중인 대상체는 인간, 비인간 영장류 또는 다른 동물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 ADC를 이용하여 치료 중인 대상체는 인간 대상체이다.
대상체에게 투여될 ADC의 양은 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물, 개개 대상체의 연령, 체중 및 반응 및 대상체 증상의 중증도를 비롯한 적절한 상황에 비추어 다를 것이지만, 치료적 유효량이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 열거된 방법 목표, 예를 들어, 치료 중인질환 증상 중 하나 이상의 개선을 달성하기 위해 투여될 것이 요구되는 ADC의 양을 지칭한다. HER2-발현 암의 치료에서 유효한 본 명세서에 기재된 ADC의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 분석은 최적의 투약 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 유효 용량은 시험관내에서 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추론된다.
약제학적 키트
특정 실시형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 약제학적 키트를 제공한다.
키트는 전형적으로 용기 및 용기 상에 또는 용기에 결합된 라벨 및/또는 포장 삽입물을 포함할 것이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 이러한 치료적 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투약량, 투여, 금기사항 및/또는 경고에 관한 정보를 제공하는, 치료적 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 설명서를 포함한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시되는 형태의 안내문을 추가로 포함할 수 있으며, 이 안내문은 인간 또는 동물 투여를 위한 사용 또는 판매를 위한, 제조 기관에 의한 승인을 반응한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 또한 ADC가 HER2-발현 암을 치료하기 위한 용도라는 것을 나타낸다. 용기는 ADC를 포함하는 조성물을 보유하며, 일부 실시형태에서 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알일 수 있다).
ADC를 포함하는 조성물을 함유하는 용기에 추가로, 키트는 키트의 다른 구성성분을 포함하는 하나 이상의 추가적인 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액; 기타 완충제 또는 희석제.
적합한 용기는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 주사기, 정맥내 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 적절하다면, 키트의 하나 이상의 구성성분은 동결건조되거나 건조 형태, 예컨대 분말 또는 과립으로 제공될 수 있고, 키트는 동결건조 또는 건조 성분(들)의 재구성을 위한 적합한 용매를 추가로 함유할 수 있다.
키트는 상업적 또는 사용자 견지로부터 바람직한 다른 물질, 예컨대 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.　
다음의 실시예는 예시적 목적을 위해 제공되며, 임의의 방법으로 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 링커-독소의 합성
다음의 실시예는 다음의 아우리스타틴 유사체(화합물 9)를 포함하는 예시적 링커-독소(링커-독소 001)의 제조를 기재한다:
Figure pct00070
다음의 예시적 화합물을 포함하는 다른 아우리스타틴 유사체를 포함하는 링커-독소를 제조하기 위해 유사한 프로토콜을 사용할 수 있다(또한 국제 특허 출원 공개 WO 2016/041082 참조):
Figure pct00071
1.1 에틸(2R,3R)-3-메톡시-2-메틸-3-((S)-피롤리딘-2-일)프로파노에이트(화합물 1)
Figure pct00072
무수 에탄올(27.0㎖)에서 (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-뷰톡시카보닐)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산(Boc-Dap-OH, 4.31g, 15.0m㏖)의 교반 용액에 0℃에서 염화티오닐(3.0㎖)을 적가시켰다. 얻어진 용액을 실온으로 가온시키고 나서, HPLC-MS에 의해 진행을 모니터링하였다. 18시간 후에, 남은 출발 물질이 검출되지 않았고, 용액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 얻어진 오일을 톨루엔(10㎖)에서 현탁시키고, 감압 하에 2회 농축시키고, 이어서, 다이에틸 에터(5㎖)에서 현탁시키고, 감압 하에 2회 농축시켜 백색 고체 폼(foam)(3.78g, 정량적 수율%)을 얻었다. MS m/z 실측치 = 216.5 (M+1).
1.2 (3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-N,3-다이메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄산(화합물 3)
Figure pct00073
화합물 2를 국제 특허 출원 공개 WO 2016/041082에 기재한 바와 같이 제조하였다.
다이클로로메탄(20㎖)에서 화합물 2(6.965g, 14.14m㏖)의 교반 용액에 트라이플루오로아세트산(5.0㎖)을 첨가하였다. 반응물을 HPLC-MS에 의해 완료에 대해 모니터링하였고, 40시간 후에 출발 물질은 남아있지 않았다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 나서, 톨루엔(2×10㎖) 및 다이클로로메탄(2×10㎖)과 함께 공증발시켜 거품 같은 백색 고체(6.2g, 잔여 TFA에 의한 정량적 수율)를 얻었다. 이 물질을 200㎖의 뜨거운 1:3 EtOAc:헥산에 용해시키고, 실온으로 냉각시켰다. 냉각 동안에, 침전물뿐만 아니라 일부 작은 결정이 형성되었다. 5㎖의 EtOAc를 첨가하고 나서, 일단 다시 현탁액을 가열하여 침전물을 완전히 용해시켰다. 실온으로 냉각 시 더 많은 결정이 형성되고, 플라스크를 -30℃에서 밤새 두었다. 다음날 아침 모액을 디캔팅시키고 나서, 결정을 2×50㎖ 헥산으로 린스하고, 고진공 하에 건조시켰다. 5.67g의 결정질 생성물을 회수하였다. MS m/z 실측치 = 405.7 (M+1).
1.3 에틸 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-N,3-다이메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트(화합물 4)
Figure pct00074
다이클로로메탄(5.0㎖)과 N,N-다이메틸폼아마이드(5.0㎖)의 혼합물에서 화합물 3(6.711g, 15.37m㏖, 1.025 당량)의 교반 용액에 실온에서 HATU(5.732g, 15.07m㏖, 1.005 당량) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민(7.84㎖, 3 당량)을 첨가하였다. 30분 동안 실온에서 교반시킨 후에, 다이클로로메탄(1.0㎖)과 N,N-다이메틸폼아마이드(1.0㎖)의 혼합물에서 화합물 1(3.776g, 15.00m㏖, 1.0 당량)의 용액을 적가시키고, 잔여 화합물 1을 추가적인 3㎖의 1:1 다이클로로메탄:N,N-다이메틸폼아마이드로 린스하였다. 반응물을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였고, 15분 후에 남아있는 화합물 1은 관찰되지 않았다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 나서, 에틸 아세테이트(대략 125㎖)로 희석시키고, 유기상을 1M HCl(2×50㎖), 1×dH2O(1×50㎖), 포화 NaHCO3(3×50㎖), 염수(25㎖)로 추출하였다. 산성 및 염기성 수성층을 둘 다 25㎖ EtOAc로 세척하였다. 이어서, 모든 유기층을 모으고, MgSO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켜 적색 오일을 제공하였다. 잔사를 최소량의 다이클로로메탄(대략 10㎖)에 용해시키고 나서, 정제(10개 칼럼 용적에 대해 헥산 중의 20 내지 100% EtOAc)를 위해 바이오티지(Biotage)(등록상표) SNAP 울트라 360g 실리카겔 칼럼(아이소레라(Isolera)(상표명) 플래시 시스템(Flash System); 스웨덴에 소재한 바이오티지 AB)상에 장입시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 모아서 7.9g의 거품같은 백색 고체를 회수하였다. 불순물 분획을 바이오티지(등록상표) SNAP 울트라 100g 실리카겔 칼럼 상에서 제2 정제를 실시하여, 순수한 생성물을 모아서 백색 거품 고체를 회수하였다(8.390g, 88.3%). MS m/z 실측치 = 634.7 (M+1).
1.4 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-N,3-다이메틸 부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (화합물 5)
Figure pct00075
1,4-다이옥산(158㎖) 중의 화합물 4(8.390g, 13.24㎜ol)의 교반 용액에 dH2O(39.7㎖) 및 수산화리튬 일수화물(H2O 중의 1 M, 39.7㎖, 3 당량)을 첨가하였다. 반응물을 4℃에서 교반시키고, 출발 물질의 소모에 대해 HPLC-MS에 의해 모니터링하였고, 미량의 화합물 4만이 남을 때까지 3일이 걸렸다. 반응 과정 동안에, 메탄올(β-제거, 2% 미만)의 상실에 대응하는 새로운 생성물이 목적하는 물질에 추가로 적은 백분율로 형성되었다. 1M 수성 HCl(50㎖)의 첨가에 의해 반응물을 산성화시키고, 감압 하에 농축시켜 다이옥산을 제거하였다. 남아있는 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(4×50㎖)로 추출하고 나서, 유기상을 모으고, 염수(15㎖ + 2㎖ 2M HCl)로 세척하고 나서, MgSO4로 건조시키고, 여과 후 감압 하에 농축시켜 밝은 색의 오일을 수득하였다. 오일을 다이에틸 에터(대략 50㎖)에 재용해시키고, 감압 하에(3×) 농축시켜 잔여 다이옥산의 제거를 용이하게 하였고, 뻑뻑한 오일로서 표제 생성물을 얻었다(일부 잔여 다이옥산 및 화합물 4와 함께 7.81g, 97% 수율). MS m/z 실측치 = 606.7 (M+1).
1.5 벤질 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((4-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)페닐)설폰아미도)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트(화합물 7)
Figure pct00076
화합물 6을 국제 특허 출원 공개 WO 2016/041082에 기재한 바와 같이 제조하였다).
다이클로로메탄(20㎖)에서 화합물 5(7.12g, 11.754m㏖)의 교반 용액에 2,2,2-트라이플루오로-N-(4-설파모일페닐)아세트아마이드(화합물 6, 4.095g, 1.3 당량, 3㎖ DMF에서 용해시킴), N,N-다이메틸피리딘(1.867g, 1.3 당량) 및 N,N-다이메틸폼아마이드(1.5㎖)를 첨가하여 밝은 황색 현탁액을 생성하였다. 5㎖의 DMF의 추가적인 첨가는 용액을 정화시키지 않았다. N-(3-다이메틸아미노프로필)-N′에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDCI)(2.817g, 1.25 당량)를 단일 부분에 첨가하고 나서, 반응물을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 48시간 후에, 반응은 더 이상 진행되지 않았고, 추가적인 400㎎의 EDCI를 첨가하였다. 18시간 후에, 남아있는 출발 물질은 관찰되지 않았고, 반응물을 감압 하에 농축시켜 황색 오일을 제공하였다. 오일을 에틸 아세테이트(대략 150㎖) 및 1M HCl(20㎖)에 용해시키고 나서, 유기상을 찬 2M HCl(2×10㎖), 포화 NaHCO3(1×10㎖), 염수(20㎖ + 5㎖ 2M HCl)로 세척하였다. 산성 및 염기성 수성 분획을 EtOAc(1×20㎖)로 추출하고 나서, 모든 유기 분획을 모으고 나서, MgSO4로 건조시키고 나서, 감압 하에 농축시켜 유성의 조질 고체(13g)를 수득하였다. 잔사를 다이클로로메탄(대략 10㎖)에 용해시키고 나서, 바이오티지(등록상표) SNAP 울트라 360g 실리카겔 칼럼 상에 장입시키고, 50% EtOAc에서 3-컬럼 용적 정체기와 함께 12개의 칼럼 용적에 대해 헥산 구배에서 10 내지 100%의 EtOAc(2% AcOH) 하에 정제하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 모으고 나서, 감압 하에 농축시키고, 용해시키고 나서 톨루엔(2×10㎖) 및 다이에틸 에터(2×10㎖)로부터 농축시켜 목적하는 생성물인 7.1g의 백색 거품 고체를 얻었다. 불순물 분획은 아이소레라(Isolera)(상표명) 기기 상의 바이오티지(Biotage)(등록상표) SNAP 울트라 100g 실리카겔 칼럼을 이용하는 얕은 구배 조건 하에서 반복 정제를 실시하였다. 모든 순수한 분획을 모아서 백색 거품 고체(8.60g, 86%)로서 순수한 생성물을 회수하였다. MS m/z 실측치 = 856.7 (M+1).
1.6 (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((4-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)페닐)설폰아미도)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-다이메틸부탄아마이드(화합물 7a)
Figure pct00077
화합물 7(3.71g, 4.33m㏖)를 자기 교반기를 포함하는 둥근 바닥 플라스크에서 에틸 아세테이트(30㎖) 중의 10% N,N-다이메틸폼아마이드에 용해시키고, 3-원 가스 라인 어댑터로 적합화시켰다. 용기를 감압 하에 2회 비우고 나서, 질소 기체로 채웠다. 10% 탄소상 팔라듐(0.461g, 0.1 당량)을 단일 부분에 첨가하고 나서, 3-원 어댑터를 플라스크에 끼우고, 수소 풍선을 어댑터에 끼우고 나서, 용기를 감압 하에 2회 비우고, 수소로 채웠다. 반응물을 2일 동안 교반시키고 나서, 시간에 따라 수소 풍선을 가끔씩 다시 채웠다. 대략 48시간 후에, HPLC-MS 분석은 출발 물질이 남아있지 않다는 것을 나타내었다. 반응물을 메탄올(20㎖)로 희석시키고 나서, 셀라이트 플러그(plug of celite)를 통해 여과시켰다. 셀라이트를 메탄올(2×50㎖)로 세척하였다. 모든 여과액을 모으고 나서, 감압 하에 농축시키고, 얻어진 오일을 용리시키고 나서, 다이클로로메탄으로부터 농축시켰다. 감압 하에 건조시킨 후에, 표제 화합물을 무색 분말(3.10g, 99%)로서 단리시켰다. MS m/z 실측치 = 722.6 (M+1).
1.7 (S)-2-((S)-2-(다이메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((4-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)페닐)설폰아미도) 프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-다이메틸부탄아마이드(화합물 8)
Figure pct00078
N,N-다이메틸폼아마이드(10㎖) 중의 N,N-(L)-다이메틸발린 (1.696g, 9.35m㏖)의 교반 용액에 HATU(3.216g, 8.46m㏖) 및 다이-아이소프로필에틸아민(3.10㎖, 17.8m㏖)을 첨가하였다. 5분 후에 맑은 황색 용액이 생성되었다. 추가 10분 동안 교반을 지속하였고, 이어서, 화합물 7a(3.213g, 4.45m㏖)를 단일 부분에 첨가하였다. 추가 1시간의 교반 후에, HPLC-MS는 미량의 화합물 7a가 남아있다는 것을 나타내었고, 반응은 16시간 동안이었다. 이어서, 반응물을 감압 하에 농축시키고, 에틸 아세테이트(120㎖) 및 40㎖ 1:1 NaHCO3(포화): 5% LiCl로 희석시키고 나서, 분별 깔때기에 옮겼다. 수층을 제거하고 나서, 유기상을 LiCl(1×20㎖), NaHCO3(포화, 2×20㎖)로 세척하였다. 수층을 모으고 나서, EtOAc(3×50㎖)로 추출하였다. 유기층을 모으고 나서, 염수(1×20㎖)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켜 DMF가 가득한 오일을 제공하고, 이를 회전 증발기를 통해 농축시켜 잔여 DMF를 제공하여, 7g의 조질의 볏짚색 오일을 수득하였다. 오일을 다이클로로메탄(대략 11㎖) 중의 최소량의 10% 메탄올에 용해시키고 나서, 정제(15개 칼럼 용적에 대해 CH2Cl2 중의 2 내지 20% MeOH, 생성물을 대략 10 내지 13%에서 용리)를 위해 바이오티지(등록상표) SNAP 울트라 360g 실리카겔 칼럼 상에 장입시켰다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 모으고 나서, 감압 하에 농축시켜 무색 거품으로서 표제 화합물을 얻었다. 불순물 분획을 합하고 나서, 증발시키고, 아이소레라(상표명) 기기 상의 바이오티지(등록상표) SNAP 울트라 100g 실리카겔 칼럼 상에서 반복 정제를 실시하고, 제1 칼럼으로부터의 순수한 생성물과 합하여 무색의 거품 고체(3.78g)를 수득하였다. MS m/z 실측치 = 850.6 (M+1).
1.8 (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-아미노페닐)설폰아미도)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(다이메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-다이메틸부탄아마이드(화합물 9)
Figure pct00079
1,4-다이옥산(15㎖) 중의 화합물 8(0.980g, 1.154m㏖)의 교반 용액에 물(3.5㎖) 및 1M 수산화리튬 일수화물(3 당량, 3.46㎖)을 첨가하였다. 얻어진 밝은 현탁액을 4℃에서 교반시키고 나서, 출발 물질의 소모에 대해 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 전환이 완료되었을 때(대략 5일), 반응물을 3.46㎖의 1M HCl로 중화시키고 나서, 감압 하에 농축시켜 다이옥산을 제거하였다. 얻어진 수성상을 60㎖ EtOAc 및 5㎖ 염수로 희석시키고, 이어서, 에틸 아세테이트(2×30㎖)로 추출하였다. 유기 분획을 모으고 나서, Na2SO4로 건조시키고, 여과 후 증발시켜 황갈색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다(0.930g). Rf = 0.5 (CH2Cl2 중의 8% MeOH). MS m/z 실측치 = 753.7 (M+1).
1.9 2,3,5,6-테트라플루오로페닐 3-(2-(2-(2-(2,5-다이옥소-2,5-다이하이드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)프로파노에이트(화합물 15)
Figure pct00080
건조시킨 50㎖ 삼각 플라스크에서, 3-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시)프로판산 (화합물 14, 1.000g, 4.52m㏖) 및 말레산 무수물(0.443g, 4.52m㏖)을 무수 N,N-다이메틸폼아마이드(5㎖)에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 6시간 동안 N2 하에 교반시키고, 이 시점에 이를 0℃로 냉각시키고 나서, syn-콜리딘(1.263㎖, 2.1 eq)을 적가시켰다. 별개의 건조시킨 50㎖ 삼각 플라스크에서, 테트라플루오로페놀(3.002g, 4 eq)을 무수 N,N-다이메틸폼아마이드(10㎖)에 용해시켰다. 플라스크를 빙욕에서 0℃로 냉각시키고 나서, 트라이플루오로아세트산 무수물(2.548㎖, 4 eq)을 적가시켰다. 이 플라스크를 15분 동안 교반시키고, 이 시점에 syn-콜리딘(2.407㎖, 4 eq)을 적가시켰다. 플라스크를 다시 15분 동안 교반시키고, 이어서, 내용물을 주사기를 통해 제1 플라스크에 적가시켰다. 반응물을 실온으로 가온시키고 나서, N2 하에 교반을 지속하였다. 출발 물질의 소모에 대해 HPLC-MS에 의해 반응물을 모니터링하였다. 6일 후에, 반응은 화합물 14 전체의 소모로 완료되어, 화합물 15 및 소량의 (대략 5%) 비스-TFP 말레산 아마이드 중간체만을 남겼다. 반응물을 분별 깔때기에 옮기고 나서, 다이에틸 에터(75㎖)로 희석시키고, 5% LiCl(1×20㎖), 1M HCl(2×20㎖), 포화 NaHCO3(5×20㎖) 및 염수(1×20㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후에 증발시켜 잔여 DMF와 함께 갈색 조질의 오일을 제공하였다. 조질의 오일을 8㎖의 1:1 DMF:H2O + 0.1% TFA에 용해시키고, 60g 바이오티지(등록상표) SNAP 울트라 C18 칼럼(스웨덴 웁살라에 소재한 바이오티지 AB) 상에 장입시키고 나서, 8개의 칼럼 용적에 대해 ACN/H2O + 0.1% TFA의 선형 30 내지 100% 구배 하에 정제하였다. 순수한 분획을 모으고 나서, 염수(20㎖)로 희석시키고, 이어서, 3×50㎖ Et2O로 추출하였다. 모은 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 증발시켜 밝은 황색 오일을 회수하였다(1.34g, 66% 수율).
1.10 Tert-뷰틸((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(다이메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-다이메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)설파모일)페닐)아미노)-1-옥소-5-유레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트(화합물 12)
Figure pct00081
화합물 11을 국제 특허 출원 공개 WO 2016/041082에 기재한 바와 같이 제조하였다.
비어 있는 25㎖의 배 모양 플라스크에, 화합물 11(1.342g, 3.58m㏖, 3.0 당량), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드(0.664g, 3.46m㏖, 2.9 당량) 및 7-하이드록시-아자벤조트라이아졸(HOAT)(0.472g, 3.46m㏖, 2.9 당량)을 첨가하였다. 이들 고체를 N,N-다이메틸폼아마이드(0.5㎖)와 다이클로로메탄(4.5㎖)의 혼합물에 30분에 걸쳐 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. 별개로, 화합물 9(0.900g, 1.20m㏖)를 N,N-다이메틸폼아마이드(0.2㎖)와 다이클로로메탄(1.8㎖)의 혼합물에 용해시키고 나서, 배 모양 플라스크에 첨가하고, 다이클로로메탄(1.0㎖)으로 린스하였다. 교반 속도를 1000 rpm으로 증가시켜, 소용돌이를 만들었다. 화합물 9를 첨가하고 2분 이내에, 염화구리(II)(0.514g, 3.83m㏖, 3.2 당량)를 좁은 파우더 깔때기를 통해 소용돌이의 중심에 직접 한 번에 첨가하였다. 처음에 밝은 황색 용액은 진한-갈색 현탁액으로 바뀌었고, 이는 10분에 걸쳐 진한-녹색의 현탁액으로 변하였다. 반응을 HPLC-MS에 의해 완료에 대해 모니터링하였고, 30분 내지 1시간(대략 95% 완료)에 취한 샘플 간에 관찰된 반응 진행에 대한 변화는 없었다. 반응물을 밤새 실온에서 교반시키고, 이어서, 2-(2-아미노에틸아미노)에탄올(0.483㎖, 4.781m㏖, 4 당량), EtOAc(10㎖) 및 dH2O(5㎖)를 교반 현탁액에 첨가하였고, 이는 진한 청색으로 색 변화되었다. 현탁액을 4시간 동안 격렬하게 교반시켰고 현탁된 고체는 2상 혼합물에 점진적으로 용해되었다. 이 혼합물을 분별 깔때기에 옮기고 나서, EtOAc(100㎖) 및 염수(10㎖)로 희석시키고, 수층을 10% IpOH/EtOAc(4×50㎖)로 추출하였다. 유기층을 모으고 나서, 염수(10㎖)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 나서 증발시켜 희미하게 청색인 조질의 고체를 수득하였다. 이 조질의 고체를 메탄올(0.5㎖)과 다이클로로메탄(6㎖)의 혼합물에 용해시키고 나서, 바이오티지(등록상표) SNAP 울트라 100g 실리카겔 칼럼(10개의 칼럼 용적에 대해 CH2Cl2 중의 2 내지 20% MeOH, 다음에 20% MeOH에서 8개 칼럼 용적 정체기) 상에 정제하였다. 생성물은 CH2Cl2 중의 대략 20% MeOH에서 1 내지 2개의 칼럼 용적 다음에 넓은 피크로서 용리되었다. 목적하는 물질을 함유하는 분획을 모으고 나서, 감압 하에 농축시켜 백색 고체로서 표제 화합물(1.105g, 83%)을 제공하였다. MS m/z 실측치 = 555.9((M+2)/2), 1109.8 (M+1).
1.11(S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(다이메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-다이메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)설파모일)페닐)-5-유레이도펜탄아마이드(화합물 13)
Figure pct00082
화합물 12(0.926g, 0.834㎜ol)의 용액에 다이클로로메탄(10㎖)과 트라이플루오로아세트산(2.0㎖)의 혼합물을 첨가하였다. 출발 물질의 소모(대략 45분)에 대해 HPLC-MS에 의해 반응물을 모니터링하였다. 반응물을 아세토나이트릴(2×10㎖) 및 다이클로로메탄(2×10㎖)과 함께 감압 하에 공증발시켜 과량의 트라이플루오로아세트산을 제거하였다. 얻어진 잔사를 최소량의 다이클로로메탄 및 메탄올(3:1, v/v, 대략 2㎖)에 용해시키고 나서, 피펫을 통해 다이에틸 에터(200㎖) 및 헥산(100㎖)의 교반 용액에 첨가하여, 밝은 백색 고체의 현탁액을 생성하였다. 고체를 여과시키고 나서, 진공 하에 건조시켜 트라이플루오로아세트산염으로서 백색 분말 형태의 표제 화합물(1.04g, 일부 잔여 용매에 의한 정량적 수율)을 얻었다. MS m/z 실측치 = 505.8 ((M+2)/2).
1.12 (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(다이메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-다이메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)설파모일)페닐)-2-((S)-1-(2,5-다이옥소-2,5-다이하이드로-1H-피롤-1-일)-14-아이소프로필-12-옥소-3,6,9-트라이옥사-13-아자펜타데칸아미도)-5-유레이도펜탄아마이드(링커-독소 001)
Figure pct00083
N,N-다이메틸폼아마이드(4㎖) 중의 화합물 13(0.722g, 0.584m㏖)의 교반 용액에 15(0.314g, 1.2 당량) 및 다이아이소프로필에틸아민(0.305㎖, 3.0 당량)을 첨가하였다. 2시간 동안 HPLC-MS 분석은 남아있는 출발 물질이 없다는 것을 나타내었다. 반응물을 TFA(300㎕)로 산성화시키고, 이어서, diH2O + 0.1% TFA(9㎖)로 희석시켰다. 얻어진 용액을 120g 바이오티지(등록상표) SNAP 울트라 C18 칼럼(스웨덴 웁살라에 소재한 바이오티지) 상에 장입시키고, ACN/H2O + 0.1% TFA 구배 하에 정제하였다: 10개 칼럼에 대해 20 내지 60% ACN, 5개 칼럼 용적에 대해 60 내지 100% ACN. 생성물을 거의 40% ACN로 용리시켰다. LCMS에 의해 확인된 순수한 분획을 모으고 나서, 동결건조시켰다. 백색의 분말 고체를 동결건조기로부터 회수하였다. 바이알 내로 더 높은 농도(2:1 H2O/ACN에서 대략 50㎎/㎖)에서 동결건조를 반복하여 밀집한, 덜 응집된 동결건조 고체(754.2㎎, 91%)를 생성하였다. MS m/z 실측치 = 647.4 ((M+2)/2), 1292.8 (M+1).
실시예 2: 2파라토프 항체에 대한 링커-독소의 접합
2파라토프 항-HER2 mAb, v10000 및 링커-독소 001의 항체-약물 접합체(ADC)를 항체 쇄간 이황화결합의 부분적 감소에 의해 생성된 후에, 링커-독소의 말레이미드 성분과의 반응에 의해 유리 시스테인 잔기의 캡핑에 의해 생성하였다. 항체를 감소시키기 위해 사용되는 TCEP 양의 변화에도 불구하고, 평균 약물-대-항체비가 0 내지 6인 ADC를 얻을 수 있다. ADC를 정제하여 오염된 소분자를 제거하고 나서, DAR, 순도, 단량체 함량, 내독소 수준 및 항원 양성 종양 세포에 대한 결합을 입증하도록 특성규명하였다.
v10000의 제조는 국제 특허 출원 공개 WO 2015/077891에 기재되어 있다. 이 항체의 상세한 설명은 이하의 표 9에 제공한다. 서열을 서열 표에 제공한다.
Figure pct00084
2.1 쇄간 이황화결합의 부분적 환원에 의한 항-HER2 항체의 접합(v17597; DAR 3.9)
10mM 아세트산나트륨, 9%(w/v) 수크로스, pH 4.5에서 항체 v10000(2.0g)의 용액(138.9㎖)을 200mM Na2HPO4, pH 8.9(15.4㎖), 5mM DTPA 용액(PBS에서 39.5㎖, pH 7.4)과 10mM TCEP 용액(3.68㎖, 2.3 eq.)의 새로 제조한 혼합물의 첨가에 의해 환원시켰다. 37℃에서 90분 후에, 반응물을 얼음 상에서 냉각시킨 후에 20mM DMSO 저장액으로부터 과량의 링커-독소 001(6.41㎖; 8 eq)를 첨가하였다. 과량의 20mM N-아세틸 시스테인 용액(4.81㎖; 6 eq.)의 첨가에 희애 90분 후에 접합 반응을 중단시켰다.
2.2 쇄간 이황화결합의 부분적 환원에 의한 항-HER2 항체의 접합(v21252; DAR 2.1)
10mM 아세트산나트륨, 9%(w/v) 수크로스, pH 4.5에서 항체 v10000(2.0g)의 용액(138.9㎖)을 200mM Na2HPO4, pH 8.9(15.4㎖)의 첨가에 의해 pH-조절하였다. DTPA 용액(PBS에서 44㎖, pH 7.4, 최종 농도 1.0mM)의 첨가 후에, 쇄간 이황화물의 환원을 수성 10mM TCEP 용액(1.68㎖, 1.05 eq.)의 첨가에 의해 개시하였다. 37℃에서 90분 후에, 반응물을 얼음 상에서 냉각시킨 후에 20mM DMSO 저장액으로부터 과량의 링커-독소 001(4.81㎖; 6 eq)을 첨가하였다. 과량의 20mM N-아세틸 시스테인 용액(4.81㎖; 6 eq.)의 첨가에 의해 90분 후에 접합 반응을 중단시켰다.
2.3 항체 약물 접합체 v17597 및 v21252의 정제
중단된 항체 약물 접합체(ADC) 용액을 펠리컨(Pellicon)(등록상표) XL 한외여과 모듈(울트라셀(Ultracel)(등록상표) 30kDa 0.005㎡; 밀리포어 시그마(Millipore Sigma))를 이용하는 밀리포어 랩스케일(Millipore Labscale)(상표명) 접선흐름여과(Tangential Flow Filtration) 기기 상에서 10mM 아세트산나트륨, 9%(w/v) 수크로스, pH 4.5의 9 내지 15의 디아볼륨(diavolume)으로 정제하였다. 용리된 ADC를 멸균 여과(0.22㎛)시켰다. 작은 규모로 생성된 ADC를 40KDa MWCO 제바(Zeba)(상표명) 칼럼(매사추세츠주 월섬에 소재한 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))으로 정제하고 나서, PBS 또는 10mM 아세트산나트륨, 9%(w/v) 수크로스, pH 4.5로 미리 조정하였다.
정제 후에, ADC의 농도를 v10000으로부터 생성된 표준 곡선을 참조로 하여 BCA 분석에 의해 결정하였다. 대안적으로, 농도를 280㎚에서의 흡수(ε = 195065M-1　㎝-1) 측정에 의해 추정하였다.
ADC의 샘플을 비환원성 및 환원성 SDS-PAGE에 의해 평가하였다(도 1 참조). 관련 없는 밴드는 관찰되지 않았다.
2.4 소수성 상호작용 크로마토그래피
항체 및 ADC를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 분석하여 약물-대-항체비(DAR)를 추정하였다. 크로마토그래피는 1㎖/분의 유속으로 13.5분의 기간에 걸쳐 80% MPA/20% MPB 내지 35% MPA/65% MPB의 구배(MPA = 1.5M (NH4)2SO4, 25mM NaxPO4, 및 MPB = 75% 25mM NaxPO4, 25% 아이소프로판올)를 사용하는 프로테오믹스(Proteomix)(등록상표) HIC 에틸 칼럼(7.8×50㎜, 5㎛)(델라웨어주 뉴어크에 소재한 세팍스 테크놀로지즈 인코포레이티드(Sepax Technologies Inc.)) 상에서이다.
ADC의 평균 약물 대 항체비(DAR)는 항체의 감소 동안 유리된 이황화결합 수에 따라 달라질 수 있다. 특정 평균 DAR을 갖는 ADC를 수득하는 단일 접합 반응은 종의 혼합물을 포함한다. v17597 및 v21252에 대해, 4가지 종의 혼합물을 생성하였다: 비접합 항체, DAR이 2인 ADC, DAR이 4인 ADC 및 DAR이 6인 ADC.
HIC의 결과를 도 2에 나타내고, v17597은 평균 DAR이 3.92이며(도 2A), v21252는 평균 DAR이 2.07(도 2B)이라는 것을 나타낸다.
정제된 ADC의 평균 DAR에 대한 DAR0, DAR2, DAR4 및 DAR6 종의 개개 기여를 HPLC-HIC 크로마토그램의 통합에 의해 평가하였다. HIC 크로마토그램에서의 각각의 피크를 분취 크로마토그래피에 의해 단리시켰고, 피크의 동일성을 LC-MS에 의해 확인하였다. 각각의 변이체에 대한 개개 DAR 종의 함량%(HIC에 의해 결정한 바와 같음)를 표 10 및 도 2D에 나타낸다. 표 10 및 도 2D로부터 알 수 있는 바와 같이, v17597은 v21252보다 유의하게 더 많은 DAR6 종을 함유하고, v21252는 v17597보다 유의하게 더 많은 DAR0 종을 함유한다.
도 2E는 평균 DAR 값이 0.5 내지 6의 범위에 있는 일련의 ADC 제제에 대해 v10000-링커 독소 001 내에서 DAR 0, 2, 4 및 6 종의 상대적 양의 변화를 도시한다.
Figure pct00085
2.5 크기 배제 크로마토그래피
항체 및 ADC(대략 15㎍, 5㎕ 주사 용적)의 응집 정도를 150mM 인산염, pH 6.8 및 400㎕/분의 유속으로 이루어진 이동상을 이용하여 액퀴티(ACQUITY) UPLC(등록상표) 단백질 BEH SEC 칼럼(200　옹스트롬, 1.7㎛, 4.6×150㎜)(매사추세츠주 밀포드에 소재한 워터스 코포레이션(Waters Corporation)) 상의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 평가하였다. 검출은 280㎚에서의 흡광도에 의한다.
결과를 도 3에 나타내고 표 11에서 요약한다. mAb v10000은 SEC 분석에 의하면 대부분 단량체이다. 링커-독소 001에 대한 접합 시 응집의 유의한 증가는 관찰되지 않았다. v21252 및 v17597의 비교는 응집 정도가 DAR을 2로부터 4까지 증가시키는 것에 의해 영향받지 않는다는 것을 나타낸다.
Figure pct00086
2.6 LC-MS-MS에 의한 유리 독소 및 링커-독소의 정량화
ADC 제형에서 유리 독소(화합물 9), 링커-독소 001, 및 퀀칭된 약물 링커 N-아세틸 시스테인-링커-독소 001의 잔여 농도를 각각의 분석물에 대한 표준 곡선을 참조로 하여 액체 크로마토그래피(LC) 분리 및 질량 검출에 의해 평가하였다. 폴리머X(PolymerX)(상표명) RP-1 칼럼(3㎛, 100 옹스트롬, 50×4㎜)(캘리포니아주 토런스에 소재한 페노메넥스 인코포레이티드(Phenomenex Inc.)) 상에서 0.4㎖/분의 유속, 30℃의 칼럼 온도, 및 7.8분에 걸쳐 75% MPA/25% MPB 내지 60% MPA/40% MPB의 구배(MPA = 0.1% 수성 폼산, 및 MPB = 아세토나이트릴에서 0.1% 폼산)를 사용하여 분리를 수행하였다. 애질런트 6470 삼중 사중극자 질량분석기(Triple Quadrupole mass spectrometer)(캘리포니아주 산타클라라에 소재한 애질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies)) 상에서 포지티브 방식 ESI-MRM 질량 검출을 달성하였다.
모든 샘플은 총 접합 페이로드에 대해 0.1㏖% 미만의 분석물을 함유하였다.
2.7 항원-양성 세포에 대한 유세포 분석 결합 분석
항원-양성 종양 세포주 JIMT-1(유방 암종, 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 아덱스바이오 테크놀로지즈(Addexbio Technologies)) 및 RT-112/84(방광 암종, 미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 대한 ADC의 결합을 유세포 분석기에 의해 모 항체(v10000) 결합과 비교하였다. 세포를 공급업자의 설명서에 따라 배양시켰다. 간략하게, 세포(50,000개의 세포/웰)를 얼음 상에서 90분 동안 항체 또는 ADC 연속 희석물과 함께 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 후에, 세포를 2회 세척하고, 이어서, 알렉사플루오르(AlexaFluor)(등록상표) 647 접합 항-hIgG(펜실베니아주 웨스트그루브에 소재한 잭슨이뮤노리서치 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Inc.)) 2차 시약과 함께 60분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 2회 세척하고 나서, 유세포분석(캘리포니아주 산호세에 소재한 LSRFortessa(상표명) X-20 유세포분석기, BD)에 의해 형광을 분석하였다.
결과를 도 4에 나타내고, 항원-양성 세포에 대한 v17597 및 v21252의 결합이 독소에 대한 접합에 의해 영향받지 않으며, ADC는 둘 다 모 항체 v10000에 대해 유사한 결합을 나타낸다는 것을 입증한다.
2.8 내독소 시험
제형화된 ADC의 내독소 수준을 0.125 EU/㎖ 역치로 투구게 변형세포 용해질(Limulus Amebocyte Lysate: LAL) 겔화 및 종점 분석(젠스크립트 톡신센서(Genscript ToxinSensor)(상표명) 단일 검사 키트; 뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 젠스크립트(GenScript))을 이용하여 평가하였다. 생체내 실험(이하)에서 사용한 모든 ADC를 킬로그램 체중당 5 미만의 내독소 단위를 투약하였다.
실시예 3: 2파라토프 ADCS의 시험관내 활성
v17597 및 v21252의 시험관내 효능을 항원-양성 종양 세포 BT-474(관 암종, 버지니아주 매너서스에 소재한 ATCC(HTB-20)), SK-BR-3(유방 암종, 버지니아주 매너서스에 소재한 ATCC(HTB-30)), HCC-1954(유방 암종, ATCC(CRL-2338)), JIMT-1(유방 암종, 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 아덱스바이오 테크놀로지즈(C0006005)), ZR-75-1(유방 암종, ATCC (CRL-1500)) 및 항원-음성 종양 세포 MDA-MB-468 (유방 암종, 아덱스 테크놀로지즈(C0006003))에 대한 세포 증식 분석에 의해 측정하였다. 세포를 공급업자의 설명서에 따라 배양시켰다. 간략하게, ADC를 첨가하기 전날에, 세포(50㎕/웰, 1000개의 세포/웰)를 멸균, 조직 배양물(TC) 처리된, 384-웰 플레이트(매사추세츠주 월섬에 소재한 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))에 첨가하였고, 밤새 37℃/5% CO2에서 인큐베이션시켜서 세포를 플레이트 표면에 부착시켰다. 멸균, U-바닥, 96-웰 플레이트에서, ADC를 목적하는 최대 농도의 4.3배에서 완전 성장 배지에 희석시키고, 동일 배지에서 1:3으로 적정하여, 10점 용량 반응 적정을 생성하였다. ADC가 없는 대조군 웰(성장 배지 단독)을 각각의 마이크로타이터 96-웰 플레이트 상에 포함시켰다. 10-점 용량 반응 적정으로부터의 15㎕를 파종 세포를 함유하는 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 3회 반복해서 첨가하고, 플레이트를 37℃/5% CO2에서 5일 밤 동안 인큐베이션시켰다. 5일 밤의 인큐베이션 후에, 세포 생존도를 20㎕/웰의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(등록상표)(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가(Promega))의 첨가 및 30분 동안 실온에서 인큐베이션에 의해 정량화하였다. 마이크로플레이트 루미노미터(microplate luminometer)를 이용하여 발광을 측정하였다. 수집한 상대적 광단위(relative light unit: RLU)를 상기 언급한 성장 배지 단독 대조군을 이용하여 세포독성%(세포독성% = 1[웰 RLU/평균 배지 단독 대조군 RLU])로 전환시켰다. 프리즘(Prism)(등록상표) 소프트웨어(캘리포니아주 라 욜라에 소재한 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))를 이용하는 입수 가능한 비선형 회귀 방법을 이용하여 데이터를 곡선에 적합화시켰다.
결과를 도 5에 나타내고 표 12에 요약한다. 결과는 v17597과 v21252가 둘 다 선택적 세포 사멸을 보여준다는 것을 나타낸다. 세포주 BT-474, SK-BR-3, HCC1954, JIMT-1 및 ZR-75-1을 발현시키는 HER2(도 5A 내지 도 5E)는 v17597과 v21252 둘 다에 대해 민감하였다. v17597과 v21252는 둘 다 HER2 음성 유방 암종 세포주인 MDA-MB-468 세포에 대해 비효과적이었다(도 5F).
Figure pct00087
실시예 4: 상이한 평균 DAR에서 v10000-링커-독소 001의 시험관내 증식 분석
환원 반응에서 이용하는 TCEP의 양(0.5 내지 10 몰 당량)을 달리함으로써 평균 DAR이 0.7 내지 3.9 범위에 있는 링커-독소 001에 접합된 v10000을 포함한 ADC를 제조하였다. 실시예 2에 약술한 절차에 따라 접합 반응을 수행하였고 얻어진 ADC를 40kDa 제바(Zeba)(상표명) 칼럼을 이용하여 정제하고 나서, PBS pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만들었다.
항원-양성 종양 세포 SK-OV-3(난소 암종, 버지니아주 매너서스에 소재한 ATCC(HTB-77)), JIMT-1(유방 암종, DSMZ, 독일에 소재한 브라운슈바이크(ACC 589)) 및 ZR-75-1(유방 암종, ATCC(CRL-1500)) 상의 세포 증식에 의해 ADC의 시험관내 효능을 측정하였다. 세포를 공급업자의 설명서에 따라 배양시켰다. 간략하게, ADC를 첨가하기 전날에, 세포(100㎕/웰, 2500개의 세포/웰)을 멸균, TC 처리된, 96-웰 불투명-벽 플레이트(코닝(Corning) 3904)에 첨가하고 나서, 밤새 37℃/5% CO2에서 인큐베이션시켜서 세포를 플레이트 표면에 접착시켰다. 다음 날에, ADC를 목적하는 최종 최대 농도의 5배에서 완전 성장 배지(96웰 U 바닥 플레이트)에 희석시키고 나서, 동일한 배지에서, 8단계로 1:3으로 적정하였다(총 9종 화합물의 적정 지점). 성장 배지 단독을 함유하는 대조군 적정 지점을 또한 포함시켜, 총 10점의 용량 반응 적정을 생성하였다. 10-점 용량 반응 적정으로부터의 25㎕를 파종 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 3회 반복해서 첨가하고, 플레이트를 37℃/5% CO2에서 5번의 밤 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 세포 생존도를 25㎕/웰의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(등록상표)(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가 코포레이션)의 첨가 및 30분 동안 실온에서 인큐베이션에 의해 정량화하였다. 이어서, 마이크로플레이트 루미노미터를 이용하여 발광을 측정하였고, 수집된 상대적 광단위(RLU)를 실시예 3에 기재한 세포독성%로 전환시켰다.
결과를 도 6에 나타낸다. 평균 DAR이 3.9 내지 1.6인 ADC는 3가지 세포주에 대해 비슷한 효능을 나타내었지만, 평균 DAR0.7을 갖는 ADC는 효능의 유의한 감소를 나타내었다. DAR0.7, DAR2.2 및 DAR3.9 ADC를 구성하는 개개 DAR 종의 대략의 양을 표 13 및 도 6D에 나타낸다. DAR0.7 ADC가 DAR1.9 ADC보다 대략 3배만큼의 DAR0 종(대략 65% 대 대략 20%)을 함유한다는 것을 알 수 있다. DAR2.2 ADC는 결국 DAR3.9 종(대략 20% 대 3% 미만)보다 유의하게 더 많은 DAR0 종을 함유하지만, 그러나, DAR2.2 ADC는 DAR3.9 ADC와 비슷한 시험관 효능을 나타내었다. 이들 결과는 ADC의 효능이 영향을 받기 전에 ADC 제제가 함유할 수 있는 DAR0 종의 비율에 대한 역치가 있을 수 있다는 것을 시사한다.
Figure pct00088
실시예 5: HER2-발현 세포 내로의 2파라토프 ADC의 내재화
v21252의 내재화를 결정하기 위해, pHAb 염료(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가 코포레이션(Promega Corporation))를 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 v21252, 트라스투주맙-링커-독소 001 및 음성 대조군 ADC의 아민 잔기에 결합시켰다. 음성 대조군 ADC는 링커-독소 001에 접합된 항-RSV 단백질 F 항체였다.
pHAb-접합 항체를 사용하여 수용체-매개 항체 내재화를 모니터링할 수 있다. 세포막 상의 항원에 결합된 pHAb 염료와 접합된 항체는 최소 형광을 나타내지만, 엔도솜 및 라이소좀 시스템을 통한 수용체-매개 내재화 및 수송 후에, 항체-pHAb 접합체는 더 산성의 pH에 노출되어, 항체-pHAb가 형광에 접합되는 것을 야기한다.
pHAb 접합 v21252, pHAb 접합 트라스투주맙-링커-독소 001 및 pHAb 접합된 대조군을 HER2 발현 세포주 SKBR3 및 JIMT-1과 함께 인큐베이션시켰다. 간략하게, SKBR3 및 JIMT-1 HER2+ 종양 세포를 분석 배지에서 5,000개의 세포/웰로 384-웰 블랙 옵티컬 바텀 플레이트(optical bottom plate)(매사추세츠주 월섬에 소재한 써모피셔 사이언티픽)에 파종시켰다. 플레이트를 37℃ + 5% CO2에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, pHAb-접합 항체를 분석 매질에서 최종 10㎍/㎖ 및 1㎍/㎖로 플레이트에 첨가하였다. 바이브런트(Vybrant)(등록상표) 다이사이클(DyeCycle)(상표명) 바이올렛 염색(매사추세츠주 월섬에 소재한 써모피셔 사이언티픽)을 함유하는 배지를 2μM의 최종 농도로 첨가하여 핵을 시각화시켰다. 플레이트를 시점 간에 37℃ + 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 샘플 웰을 셀인사이트(CellInsight)(상표명) CX5 고함량 선별(High Content Screening: HCS) 플랫폼(매사추세츠주 월섬에 써모피셔 사이언티픽) 상에서 다양한 시점에 스캐닝하였다. 2개의 채널을 갖는 스팟어날리시스 바이오어플리케이션(SpotAnalysis Bioapplication) 상에서 20× 대물렌즈를 이용하여 플레이트를 스캐닝하였다. 채널 1(385㎚, 비브런트 염료 사이클 바이올렛(Vybrant Dye Cycle Violet))을 포커스 채널로서 사용하였고, 채널 2(560㎚, pHAb)를 사용하여 내재화 데이터를 얻었다. 파라미터 "평균 총 스팟 강도"를 이용하여 내재화된 pHAb-접합 항체의 형광을 측정하였다.
결과를 도 13 및 도 14에 나타내고, v21252는 단일특이성 트라스투주맙-링커-독소 001보다 더 큰 수준으로 HER2 발현 세포 내 라이소좀에 수송한다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 2파라토프 ADCS의 생체내 활성
6.1 ADC v17597 및 v21252는 HBCx-13b 유방암 환자 유래 이종이식 성장을 저해한다
암컷 무흉선 마우스(영국 헌팅던에 소재한 엔비고(Envigo))에 20㎣ 종양 단편(그룹당 n=7)을 피하로 이식하였다. 일단 종양이 75 내지 200㎣의 크기에 도달되면, 동물을 처리군에 배정하고, v17597, v21252 또는 비히클을 도 7에 나타낸 바와 같이 제1일 및 제15일(q14d x2)에 총 2회 용량에 대한 정맥내 주사에 의해 투약하였다. 2주마다 캘리퍼를 이용하여 종양 측정을 수행하였다. 종양이 1764㎣의 크기에 도달되었을 때, 마우스를 윤리적으로 희생시켰다. 각각의 그룹에 대해 종양 용적을 평균 ± SEM으로서 보고한다.
도 7a는 비히클 또는 v17597의 i.v. 투여 후에 HBCx-13b 종양 단편을 피하로 이식한 마우스에서의 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 도 7b는 비히클 또는 v21252의 i.v. 투여 후에 HBCx-13b 종양 단편을 피하로 이식한 마우스에서의 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 이들 결과는 HBCx-13b 생착 마우스의 v17597 또는 v21252 중 하나에 의한 처리가 용량-의존적 방식으로 종양 용적 감소를 초래한다는 것을 나타낸다.
6.2 ADC v17597 및 v21252는 ST-910 유방암 환자 유래 이종이식 성장을 저해한다
암컷 무흉선 누드 마우스(매사추세츠주 윌밍턴에 소재한 찰스 리버 래버러토리즈)에 대략 70㎎의 종양 단편(그룹당 n=6)을 피하로 이식하였다. 일단 종양이 125 내지 250㎣의 크기에 도달되면, 동물을 처리군에 배정하고, v17597, v21252 또는 비히클을 도 8에 나타낸 바와 같이 정맥내 단일 주사에 의해 투약하였다. 2주마다 디지털 캘리퍼를 이용하여 종양 측정을 수행하였다. 종양이 2000㎣의 크기에 도달되었을 때, 마우스를 윤리적으로 희생시켰다. 각각의 그룹에 대해 종양 용적을 평균 ± SEM으로서 보고한다.
도 8a는 비히클 또는 v17597의 i.v. 투여 후에 ST-910 종양 단편을 피하로 이식한 마우스에서의 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 도 8b는 비히클 또는 v21252의 i.v. 투여 후에 ST-910 종양 단편을 피하로 이식한 마우스에서의 종양 반응에 대한 결과를 제공한다. 이들 결과는 ST-910 생착 마우스의 v17597 또는 v21252 중 하나에 의한 처리가 용량-의존적 방식으로 종양 용적 감소를 초래한다는 것을 나타낸다.
　ST-910은 HER2 1+ 유방암을 나타내는 환자 유래 이종이식편(patient derived xenograft: PDX)인 반면, HBCx-13b(실시예 6.1에서 사용)는 HER2 3+ 유방암을 나타내는 PDX이다. 따라서 실시예 6.1 및 6.2는 v17597과 v21252가 둘 다 HER2 3+과 HER2 1+ 종양 둘 다에서 활성이라는 것을 입증한다.
6.3 약물동태학적 분석
환자 유래 이종이식편, HBCx-13b 및 ST-910에 대해, 총 항체(비접합 및 접합 항체)에 대한 약물동태학적 샘플을 미리 특정된 시점에 수집하였고, 총 항체 정량화를 위한 ELISA-기반 분석을 이용하여 평가하였다. v21252 또는 v17597 중 하나에 대한 총 항체에 대한 혈청 농도를 PBS pH 7.4에서 염소 항-인간 IgG Fc 항체(펜실베니아 웨스트 그로브에 소재한 잭슨 이뮤노리서치)와 함께 384-웰 ELISA 플레이트를 처음 코팅함으로써 그리고 4℃에서 밤새 인큐베이션시킴으로써 분석하였다. 다음 날, 플레이트를 세척하고 나서, 분석 희석제를 이용하여 차단시키고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 차단시킨 후에, 표준 곡선 샘플, 대조군 및 희석 혈청 샘플을 플레이트에 첨가하였고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 검출 항체인 HRP-염소 항-인간 IgG F(ab')2 접합체(잭슨 이뮤노리서치)를 플레이트에 첨가하고, RT에서 1시간의 인큐베이션 후에, HRP 기질, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 플레이트에 첨가하였다. HCl을 이용하여 TMB를 퀀칭시키고, 플레이트 판독기를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 도 15는 HBCx-13b (A) 및 ST-910(B)에 대한 총 항체 혈청 농도-시간 프로파일을 나타낸다.
실시예 7: 사이노몰거스 원숭이에서 v17597 및 v21252의 단일-용량 약물동태학/내약성 연구
이 연구의 목적은 단일 정맥내(IV) 주입 투여 후에 사이노몰거스 원숭이에서의 v17597 및 v21252의 약물동태학(PK) 및 내약성을 특성규명하는 것이다. 서열 상동성 및 결합 친화도에 기반하는 v17597과 v21252 둘 다의 비임상 안전성 평가를 위해 사이노몰거스 원숭이를 선택하였다. 인간 및 사이노몰거스 원숭이 HER2는 98%의 서열 상동성을 공유하는 반면, 개 및 마우스/래트 HER2에 대한 서열 상동성은 각각 93% 및 88%이다. 추가로, v17597 및 v21252는 인간 HER2와 유사한 친화도로 사이노몰거스 원숭이 HER2에 결합하고(원숭이 KD = 0.55×10-9; 인간 KD = 0.83×10-9), 개, 마우스 또는 래트 HER2에 결합하지 않는다.
연구는 3, 6 또는 9㎎/㎏ 용량에서 v17597의 단일 용량이 잘 용인되었고, 9 또는 12㎎/㎏ 용량에서 v21252의 단일 용량이 잘 용인되었다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
내약성
v17597(3, 6 또는 9㎎/㎏) 또는 v21252(9㎎/㎏ 또는 12㎎/㎏)의 단일 용량은 암컷 사이노몰거스 원숭이(N=3)에서 60분에 걸쳐 IV 주입에 의해 투여하였다. 일반적 내약성을 임상 관찰, 체중, 식품 소모 및 임상 병리(혈액학및 임상 화학)로 평가하였다. v17597 또는 v21252, 총 항체 및 유리 독소의 생분석(bioanalytical)을 위해 연구 내내 혈액을 수집하였다(화합물 9). 연구 설계를 표 14에 요약한다.
Figure pct00089
생분석 방법
v17597 및 v21252: 포획제로서 항-독소 마우스 IgG 및 검출제로서 항-퍼투주맙 설포-TAG를 이용하는 메조 스케일 디스커버리 플랫폼(Meso Scale Discovery platform)(ECL/MSD)(메릴랜드주 락빌에 소재한 메조 스케일 다이아그노스틱스 엘엘씨(Meso Scale Diagnostics, LLC))을 이용하여 v17597 또는 v21252(1 이상의 DAR)의 혈청 농도를 분석하였다.
총 항체: 총 항체 생분석은 항체 성분이 (모든 DAR에서) 독소와 접합되는지의 여부와 상관없이 v17597 또는 v21252의 항체 성분을 측정하였다. 총 항체의 혈청 농도를 포획제로서 항-퍼투주맙 항체 및 검출제로서 항-트라스투주맙 설포-TAG를 이용하는 메조 스케일 디스커버리 플랫폼(ECL/MSD)을 이용하여 분석하였다.
독소(화합물 9): LC-MS/MS 방법을 이용하여 독소의 혈청 농도를 분석하였다. 혈청 샘플을 아세토나이트릴/메탄올(50:50, v/v)로 침전시켰고, 상청액을 분석하였다. 사용한 액체 크로마토그래피는 물/아세트산(100/0.05, v/v) 및 아세토나이트릴로 이루어진 구배 흐름을 갖는 역상 칼럼이었다. 양이온 모드에서 작동하는 전자분무이온화(ESI) 소스를 구비한 삼중 사중극자 질량분석기를 이용하여 독소 및 내부 표준(독소-d4; 중수소화된 화합물 9)을 검출하였다.
약물동태학적 분석
PK 파라미터(최대 혈청 농도[Cmax], 최종 반감기[T1/2], 클리어런스[CL] 및 겉보기 분포 용적[Vss])을 유도하기 위해 혈청 샘플 생분석 결과의 비구획 분석을 사용하였다.
결과
약물동태학
v17597: v17597 노출은 일반적으로 3 내지 9㎎/㎏으로 용량 비례하였다. Cmax는 60분 주입(중앙값 Tmax)의 마지막에 달성되었고, 용량-비례 방식으로 증가되었다. 전신 노출(AUC0-∞)은 용량-비례 방식보다 약간 더 증가되었다. 예비 평균 최종 반감기(T1/2)는 일반적으로 용량이 증가함에 따라 증가되는 것으로 나타났고, 클리어런스(CL)는 일반적으로 용량이 증가함에 따라 감소되는 것으로 나타났으며, 겉보기 분포 용적(Vss)은 일반적으로 용량에 의해 변하는 것으로 나타나지 않았다.
v21252: v21252 노출은 일반적으로 9 내지 12㎎/㎏으로 용량 비례하였다. Cmax는 60분 주입(중앙값 Tmax)의 마지막에 달성되었고, 용량-비례 방식으로 증가되었다. v21252 혈청 농도 - 시험 프로파일을 도 9A에 나타낸다. 전신 노출(AUC0-∞)은 용량-비례 방식보다 약간 더 증가되었다. 예비 평균 최종 반감기(T1/2), 클리어런스(CL) 및 겉보기 분포 용적(Vss)은 일반적으로 용량에 의해 변하는 것으로 나타나지 않았다.
총 항체(접합 및 비-접합): 총 항체의 최대 혈청 농도(Cmax)는 60분 주입의 마지막(중앙값 Tmax)에 달성되었다. 총 항체 혈청 농도 - v21252의 시간 프로파일을 도 9B에 나타낸다. 비구획 모델을 사용하여 PK 파라미터를 추론하였다. Cmax는 용량 비례 방식으로 증가된 반면, AUC0-∞는 v17597과 v21252 둘 다에 대해 용량-비례 방식보다 약간 더 크게 증가되었다. v17597의 평균 최종 반감기는 용량이 증가함에 따라 증가된 반면, 총 항체의 혈청 클리어런스(CL) 및 총 겉보기 분포 용적(Vss)은 용량이 증가함에 따라 감소되었다. v21252의 평균 최종 반감기 및 총 겉보기 분포 용적(Vss)은 용량이 증가함에 따라 증가된 반면, 총 항체의 혈청 클리어런스(CL)는 용량이 증가함에 따라 감소되었다.
독소(화합물 9): v17597(3, 6 또는 9㎎/㎏) 또는 v21252(9㎎/㎏ 또는 12㎎/㎏)의 단일 용량의 투여 후에, 모든 독소 혈청 농도는 정량 하한 미만(LLOQ, 5.00ng/㎖ 미만).
내약성
9 또는 12㎎/㎏의 용량에서 v17597(3, 6 또는 9㎎/㎏) 또는 v21252의 단일-용량은 잘 용인되었다. 연구 과정 동안 사망은 없었다. 임상 관찰, 식품 소모 또는 체중에서의 치료-관련 효과는 언급되지 않았다.
일부 동물에서 치료-관련으로 간주된 임상 병리 파라미터의 최소 내지 약간의 변화가 관찰되었다. 임의의 치료군에서의 혈액학 종점에서 시험 항목-관련 효과는 없었다. 개개 값 중에 임의의 분명한 차이에도 불구하고 생물학적 및/또는 절차-관련된 변동에 대해 예상된 범위 내의 모든 변동을 고려하였다.
실시예 8: 사이노몰거스 원숭이에서의 v17597의 비-GLP 독성 연구
비-GLP 독성 연구를 수행하여 사이노몰거스 원숭이에서의 v17597의 독성동태학 및 독성을 연구하였다. 암컷 사이노몰거스 원숭이에서의 단일 용량 약물동태학/내약성 연구로부터의 결과에 기반하여 연구를 설계하였다(실시예 6).
연구는 2.25 및 4.5㎎/㎏의 용량으로 매주, 그리고 4.5 및 9㎎/㎏의 용량으로 2주마다 v17597의 투여는 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이에서 잘 용인되지 않았다는 것을 입증하였다. 최대 6주 동안 매주 또는 2주마다의 투여 후 v17597에 대한 유해 효과 수준 없음(NOAEL) 및 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(HNSTD)은 매주 2.25㎎/㎏ 미만으로 투여되거나 또는 2주마다 4.5㎎/㎏으로 투여하는 것으로 간주하였다.
물질 및 방법
비히클 또는 v17597을 제1일, 제8일, 제15일, 제22일, 제29일 및 제36일에 0, 2.25 및 4.5㎎/㎏의 용량으로 매주 1시간 IV 주입, 및 제1일, 제15일 및 제29일에 4.5 및 9㎎/㎏의 용량으로 격일로 1회 투여하였다. 모든 동물을 임상 징후의 변화, 식품 소비, 체중, 혈압, ECG, 호흡 속도(시각적), 임상 병리(혈액학, 임상 화학, 응집, 요검사), 장기 중량 및 조직의 거시적/미시적 시험 변화에 대해 평가하였다. 독성동태학적 분석 및 항-약물 항체(ADA) 분석을 위해 혈액을 수집하였다. 매주 투약한 동물은 제42일에 종결시키고, 격주로 투약한 동물은 제36일에 종결시켰다. 연구 설계를 표 15에 제시한다.
Figure pct00090
결과
체중, 임상 관찰 및 임상 병리에 기반하여, v17597은 이 연구에서 시험한 모든 용량에서 유해한 것으로 간주하였다. 9㎎/㎏/용량(2주마다)의 동물 및 4.5㎎/㎏/용량(2주마다)의 한 마리 암컷은 조기에 종결되었고, 제1일 및 제15일에만 투약을 받았다.
본 연구에 기반하여, 최대 6주 동안 매주 또는 2주마다의 투여 후 v17597에 대한 유해 효과 수준 없음(NOAEL) 및 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(HNSTD)은 매주 2.25㎎/㎏ 미만으로 투여되거나 또는 2주마다 4.5㎎/㎏으로 투여하는 것으로 간주하였다.
실시예 9: 사이노몰거스 원숭이에서의 v21252의 비-GLP 독성 연구
본 연구의 목적은 v21252의 독성동태학 및 독성을 추가로 특성규명하는 것이었다.
연구는 제1일, 제15일 및 제29일에 v21252의 최대 12㎎/㎏의 용량의 투여가 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이에서 임상적으로 잘 용인된다는 것을 입증하였다. 관찰된 유해 사건 수준 없음(NOAEL)은 12㎎/㎏이었고, 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(HNSTD)은 12㎎/㎏보다 더 컸다.
물질 및 방법
본 연구에서, 비히클 또는 v21252를 0, 9 및 12㎎/㎏(각각의 용량 수준에서 성별당 3마리의 동물)의 용량으로 제1일, 제15일 및 제29일에 격주로 1회 1시간 IV 주입에 의해 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 투여하였다. 모든 동물을 임상 징후의 변화, 식품 소비, 체중, 혈압, ECG, 호흡 속도(시각적), 임상 병리(혈액학, 임상 화학, 응집, 요검사), 장기 중량 및 조직의 거시적/미시적 시험 변화에 대해 평가하였다. 혈액을 독성동태학(TK) 분석(v21252, 총 항체 및 유리 독소(화합물 9)), 항-약물 항체(ADA) 분석에 대해 수집하였고, 동물을 제36일에 종결시켰다. 동물의 다른 그룹에 제1일에 12㎎/㎏ v21252의 단일 용량을 투여하고 나서, 투약 후 제4일, 제8일 및 제15일에 종결시켰다(시점당 n=2). 연구 설계를 표 16에 제시한다.
Figure pct00091
결과
약물동태학
v21252: v21252의 반복 투여 후에 약물동태학을 계산하였다. 60분 주입 종료 또는 주입 종료 후 60분(중앙값 Tmax)에 Cmax가 달성되었다. v21252 혈청 농도 - 시험 프로파일을 도 10에 나타낸다. 제1일에, Cmax 및 전신 노출(AUC0-168h)은 용량 비례 방식보다 약간 더 증가되었다. 제29일에, Cmax 및 AUC0-168h는 거의 용량-비례 방식으로 증가되었다. 전신 노출 및 AUC0-168h는 변화가 나타나지 않았고 반복 투여 후 축적을 나타내지 않았다. 평균 제거 반감기(T1/2)는 9㎎/㎏ 그룹으로부터 12㎎/㎏ 그룹까지 증가되었다. v21252에 대해 포화 가능한 클리어런스 메커니즘은 T1/2의 차이 및 낮은(9㎎/㎏) 용량 그룹과 높은(12㎎/㎏) 용량 그룹 간의 클리어런스를 설명할 수 있다.
총 항체(접합 및 비접합): v21252의 반복 투여 후에 사이노몰거스 원숭이에서 총 항체를 측정하였다. 60분 주입의 마지막(중앙값 Tmax)에 총 항체에 대한 Cmax를 달성하였다. 총 항체 혈청 농도 - 시험 프로파일을 도 11에 나타낸다. 제1일에, Cmax 및 전신 노출(AUC0-168h)은 용량 비례 방식보다 약간 더 증가되었다. 제29일에, Cmax 및 AUC0-168h는 거의 용량-비례 방식으로 증가되었다. 전신 노출 AUC0-168h는 변화되지 않았고, 반복 투여 후 축적을 나타내지 않았다. v21252와 유사하게, 총 항체에 대한 평균 제거 반감기(T1/2)는 9㎎/㎏ 그룹으로부터 12㎎/㎏ 그룹으로 증가되었다.
v21252 및 총 항체의 혈청 농도-시간 프로파일로 나타내는 바와 같은 v21252의 약물동태학은 생체내 v21252로부터의 최소 링커-독소 상실을 나타낸다(도 12 참조).
독소(화합물 9): v21252의 반복 투여 후에 사이노몰거스 원숭이에서 유리 독소를 측정하였다. 모든 페이로드(화합물 9) 혈청 농도는 제1일에 12㎎/㎏에서 한 마리의 암컷, 제29일에 9㎎/㎏에서 한 마리의 암컷 및 제29일에 12㎎/㎏에서 한 마리의 수컷을 제외하고 정량하한 미만(0.500ng/㎖ 미만)이었다.
항-약물 항체(ADA): v21252의 반복 투여 후에 사이노몰거스 원숭이에서 항-v21252 항체를 선별하였다. 9㎎/㎏ 투약 코호트 내 단일 암컷의 혈청에서 ADA를 검출하였다.
독성
전반적으로, v21252의 투여는 시험한 모든 용량에서 임상적으로 잘 용인되었다. 소변검사, ECG 파라미터, 또는 호흡속도의 치료 관련 변화는 관찰되지 않았다.
12㎎/㎏/용량으로 v21252의 반복 투여를 받는 동물에서 개개 체중에 대한 산발적, 최소 효과를 주목하였다. 이들 동물은 모두 제35일에 부분적으로 또는 완전히 회수하였다. 모든 다른 동물은 연구 내내 체중이 유지되거나 증가되었다.
일부 동물에서 임상 징후, 임상 병리, 장기 중량 또는 조직의 거시적/미시적 검사에서 최소 내지 약간의 변화가 관찰되었다. v21252와 관련된 것으로 간주되는 거시적 관찰 대조군을 포함하는 모든 동물에서의 주입 부위에서 관찰되는 붉은 얼룩으로 제한되었다. 시험 항목-관련 장기 중량 변화는 비장으로 제한되었다. 3회의 2주마다의 투약 후 제36일에 종결시킨 동물에서, 미시적 치료-관련 효과는 위장관, 간, 비장, 림프절, 췌장, 피부 및 IV 주입 부위의 변화를 포함하였다. 모두 최소 또는 약함으로서 분류하였다. 12㎎/㎏의 단일 용량 후 다양한 시간에 종결시킨 동물에서, 유사한 최소 내지 약한 시험 항목-관련 효과가 관찰되었다.
PK 분석은 v21252 및 총 항체에 대해 용량 비례 방식으로 용량이 증가함에 따라 v21252-처리 동물에서의 전신 노출 및 증가된 평균 전신 노출을 확인한 반면, 유리 독소(화합물 9)에 대한 노출은 소수의 동물에서 낮은 수준으로만 보였다.
표 17 내지 표 20은 PK/내약성 연구 및 v17597 및 v21252에 대한 비-GLP 반복 용량 연구로부터의 결과 비교를 나타낸다.
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
결론
일반식 (I)의 아우리스타틴 유사체는 마우스에게 투여될 때 양호한 생체내 내약성을 갖는 것으로 나타났다. 평균 DAR4에서 단일특이성 항-HER2 항체 트라스투주맙에 대한 화합물 9의 접합은 18㎎/㎏의 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(HNSTD)에 의해 사이노몰거스 원숭이에서 우수한 내약성을 나타낸 ADC를 생성하였다. 대조적으로, 평균 DAR4(v17597)에서 항-HER2 2파라토프 항체, v10000에 접합된 화합물 9를 포함하는 ADC는 4.5㎎/㎏ 미만의 HNSTD에 의해 크게 감소된 내약성을 나타내었다(실시예 8). 임의의 특정 이론으로 제한되는 일 없이, v17597에 대해 관찰된 감소된 내약성은 단일특이성 트라스투주맙에 비해 2파라토프 항체의 증가된 표적 상의 결합 및 내재화에 부분적으로 기인하여, 증가된 표적 상의 독성, 및/또는 더 고차의 DAR 종(DAR2, DAR4 및 DAR6)과 연관된 독성을 증가시키는 평균 DAR2(v21252)에 비해 DAR0 또는 평균 DAR4(v17597)의 네이키드 종의 감소된 비율, 및/또는 가장 높은 DAR 종과 연관된 독성을 증가시키는 평균 DAR2에 비해 평균 DAR4에서의 DAR6의 증가된 비율을 야기할 수 있다는 것이 제안된다.
그러나, 놀랍게도, 평균 DAR2(v21252)에서 v10000에 접합된 화합물 9를 포함하는 ADC는 12㎎/㎏의 HNSTD에 의해 훨씬 더 개선된 내약성을 나타내었다(실시예 9). 이 결과는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 또는 메이탄시노이드 중 하나를 포함하는 ADC의 독성이 항체에 부착된 총량과 직접적으로 상관관계가 있으며, 즉, DAR과 최대 내약 용량 간의 관계는 ADC에 대해 선형인 것으로 이전에 나타났기 때문에 예상치 못한 것이다(Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063-7070(2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371-81(2017)). 구체적으로, 항체당 8개 약물 분자를 갖는 ADC의 최대 내약 용량은 50㎎/㎏이었고, 항체당 4개의 약물 분자를 갖는 ADC의 최대 내약 용량(즉, 독소량의 절반)은 100㎎/㎏이었다(Hamblett, et al., 이하 참조). 즉, DAR8 ADC의 독소량의 절반을 갖는 ADC는, 동일한 항체 용량으로 투여하였을 때, DAR8 ADC의 2배인 MTD를 나타내었다.
v21252는 DAR이 2이며, 따라서 동일한 항체 용량으로 투여하였을 때 v17597로서 독소량의 절반이다. v17597을 이용하는 이전의 연구에 기반하여, 따라서, 용인되는 v21252의 양은 9㎎/㎏ 미만(즉, v17597에 대해 용인되는 최대 용량의 2x)인 것으로 예상되었다. 그러나, 실시예 9에 나타내는 바와 같이, 2주마다 3회 용량에 대해 9 또는 12㎎/㎏ 중 하나의 용량으로 사이노몰거스 원숭이에게 투여된 v21252가 용인되었고, 12㎎/㎏은 관찰된 유해 사건 수준 없음으로서 표기되었다(NOAEL).
중요하게는, v21252는, 더 큰 노출이 있다고 해도, 2주마다 투약될 때 v17597에 비해 더 적은 독성 및 더 큰 내약성을 가진다는 것이 주목되어야 한다.　　 사이노몰거스 원숭이에서의 비-GLP 독성학 연구에 기반하여(실시예 8), v17597은 4.5와 9㎎/㎏의 2주마다의 투약에서 유해 소견을 갖는 것으로 간주하였다.　 그러나, 유사한 비-GLP 연구에서(실시예 9), 4.5㎎/㎏의 v17597에 비해 노출 시 대략　1.8　내지 4.6배 증가를 가짐에도 불구하고(제1 투약 후 AUC0-336hr　또는 마지막 투약 후 AUC0-168hr), v21252는 9㎎/㎏과 12㎎/㎏ 둘 다의 2주마다의 투약에서 유해한 소견을 갖는 것으로 간주되지 않았다(표 19 및 표 20에서 요약).
추가로, v21252는 노출 수준에서 생체내 효능이 사이노몰거스 원숭이에서 용인되는 것으로 나타났다는 것을 입증하였다. 구체적으로, 도 15에서 요약한 바와 같이 사이노몰거스 원숭이에서의 용인된 노출 시 높은 HER2와 낮은 HER2 둘 다의 환자 유래 이종이식 모델에서 완전한 반응이 달성되었다(또한 실시예 6 참조).
실시예 10: 사이노몰거스 원숭이에서의 v21252의 GLP 독성 연구
후속적 GLP 독성 연구에서, 4회 용량에 대해 0, 6, 12 및 18㎎/㎏ 2주마다, 6주 회복 기간으로 사이노몰거스 원숭이에게 v21252를 투여하였다. 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(HNSTD)은 18㎎/㎏이 되는 것으로 결정하였다.　　v21252는 모든 용량에서 잘 용인되었다. 임상 관찰은 유해한 것으로 간주되지 않았으며, 이 GLP 연구에서 사망은 관찰되지 않았다.　 유일한 지속적인 임상 관찰은 증가된 설사였다.　 모든 용량에서 체중의 변화는 관찰되지 않았고, 임상적 병리 소견(간 기능 - 아스파테이트 트랜스아미나제 및 알라닌 트랜스아미나제 및 혈액학 - 호중구, 혈소판, 헤모글로빈 및 림프구)은 유해하게 간주되지 않았다.　 v21252의 노출(Cmax　및 AUC0-168hr)은 v10000(항체 단독)과 사실상 동일하였다.　 연구의 상세한 설명을 이하에 제공한다.
이 GLP 연구의 목적은 사이노몰거스 원숭이에게 정맥내로 4회 투여한 v21252의 독성동태학 및 독성을 추가로 특성규명하는 것이었다.
GLP 독성 연구에서, v21252는 0, 6, 12 및 18㎎/㎏의 용량으로 제1일, 제15일, 제29일 및 제43일에, 6주 회복 기간으로 수컷 및 암컷 사이노몰거스에게 투여하였다. 관찰된 유해 사건 수준 없음(NOAEL)은 12㎎/㎏이었고, 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(HNSTD)은 18㎎/㎏이었다.
물질 및 방법
본 연구에서, 비히클 또는 v21252는 0, 6, 12 및 18㎎/㎏의 용량으로 제1일, 제15일, 제29일 및 제43일에 격주로 1회 1시간 IV 주입에 의해 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 투여하였다(각각의 용량 수준에서 성별당 4마리의 동물 및 회복 평가를 위해 0, 12 및 18㎎/㎏에서 성별당 추가 2마리의 동물). 모든 동물을 임상 징후의 변화, 식품 소비, 체중, 혈압, ECG, 호흡 속도(시각적), 임상 병리(혈액학, 임상 화학, 응집, 요검사), 장기 중량 및 조직의 거시적/미시적 시험 변화에 대해 평가하였다. 혈액을 독성동태학(TK) 분석(v21252, 총 항체 및 유리 독소(화합물 9)), 항-약물 항체(ADA) 분석에 대해 수집하였고, 동물을 제50일에, 그리고 제92일에 6주의 회복 후에 종결시켰다. 연구 설계를 표 21에 제시한다.
Figure pct00096
결과
약물동태학
v21252: 제1일 및 제43일에 주입의 시작 후(start of infusion: SOI) 1시간까지 중앙값 피크 v21252 혈청 농도를 관찰하였다. v21252의 2주마다의 투여 후에, v21252에 대한 평균 Cmax 및 AUC 값은 용량이 증가함에 따라 증가되었다. Cmax의 증가는 제1일에 용량에 거의 비례하였다. 제1일에, v21252 용량의 1:2:3배 증가는 Cmax 값의 대략 1:2.3:3.3배 증가, 평균 AUC0-168hr 값의 대략 1:2.6:3.8배 증가, 및 AUC0-336hr 값의 대략 1:2.9:4.5배 증가를 초래하였다. 제43일에, Cmax 및 AUC0-168hr은 거의 용량 비례하였다. 제43일에, v21252 용량의 1:2:3배 증가는 Cmax 값의 대략 1:2.5:3.5배 증가 및 AUC0-168hr 값의 대략 1:3.2:4.7배 증가를 초래하였다. v21252에 대한 전신 노출은 6㎎/㎏로 반복된 2주마다의 IV 주입 후에 변화가 나타나지 않았지만, 그러나, 노출은 일반적으로 12 및 18㎎/㎏에서 2주마다의 IV 주입 후에 증가하는 것으로 나타났다. 평균 AUC0-168hr 축적비는 6, 12 및 18㎎/㎏에서 각각 1.20, 1.47 및 1.50이었다. 개개 AUC0-168hr 축적비는 6㎎/㎏에서 1.01 내지 1.64, 12㎎/㎏에서 1.17 내지 1.95, 및 18㎎/㎏에서 0.983 내지 2.08의 범위에 있었다.
총 항체(접합 및 비접합): 제1일 및 제43일에 v21252의 SOI 후 1시간까지 중앙값 피크 총 항체 혈청 농도를 관찰하였다. v21252의 2주마다의 투여 후에, 총 항체에 대한 평균 Cmax 및 AUC0-168hr 값은 용량이 증가함에 따라 증가되었다. 제1일에, v21252 용량의 1:2:3배 증가는 Cmax 값의 대략 1:2.1:3.3 배 증가, 평균 AUC0-168hr 값의 대략 1:2.4:3.8배 증가, 및 AUC0-336hr 값의 대략 1:2.8:4.5배 증가를 초래하였다. 제43일에, v21252 용량의 1:2:3배 증가는 Cmax 값의 대략 1:2.6:3.9배 증가 및 AUC0-168hr 값의 대략 1:3.1:4.8배 증가를 초래하였다. 총 항체에 대한 전신 노출은 6㎎/㎏에서 v21252의 반복된 2주마다의 IV 주입 후에 변화가 나타나지 않았지만, 그러나, 12 및 18㎎/㎏에서 v21252의 반복된 2주마다의 IV 주입 후에 증가가 나타나지 않았다. 평균 AUC0-168hr 축적비는 6, 12 및 18㎎/㎏에서 각각 1.20, 1.47 및 1.50이었다.
독소(화합물 9): v21252의 반복 투여 후에 유리 독소를 측정하였다. 대부분의 독소(화합물 9) 혈청 농도는 정량하한 미만(0.500ng/㎖ 미만)이었다. 다음의 예외를 주목하였다: 제43일에 12㎎/㎏에서 한 마리의 수컷은 단일 정량화 독소(화합물 9) 농도(투약 후 72시간에 0.513ng/㎖)를 가졌고; 제29일에 18　㎎/㎏에서 한 마리의 수컷은 단일 정량화 가능한 독소(화합물 9) 농도(SOI 후 1시간에 0.532　ng/㎖)를 가졌으며; 제43일에 18㎎/㎏에서 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷은 각각 단일 정량화 가능한 독소(화합물 9) 농도(SOI 후 24시간에 각각 0.555, 0.505, 0.556 및 0.653ng/㎖)를 가졌고; 제43일에 18㎎/㎏에서 한 마리의 수컷은 125　hr*ng/㎖의 AUC0-168hr 값을 갖는 4가지의 연속적 정량화 가능한 독소(화합물 9) 농도를 가졌다.
항-약물 항체(ADA): 모든 투약 코호트로부터의 총 144개의 샘플을 ADA에 대해 선별하였다. 한 마리의 대조군 동물 및 처리 동물로부터의 사전시험 샘플을 포함하는, 확인적/면역고갈 분석(confirmatory/immunodepletion assay)에서 양성인 7종의 샘플을 확인하였다. 이들 후자의 두 샘플은 이미 존재하는 반응성 항체에 기인하는 것으로 여겨지며, v21252 노출과 관련되지 않는다. 5종의 남아있는 양성 샘플에 대해, 18㎎/㎏로 투약한 한 마리의 암컷은 제43일에 검출 가능한 역가를 갖지만, 남아있는 4마리의 동물(12㎎/㎏에서 투약한 2마리의 암컷 및 18㎎/㎏에서 투약한 한 마리의 수컷 및 한 마리의 암컷)은 제92일의 회복 지점에서 검출 가능하였다. 실제 항-v21252 항체 결과는 대부분의 동물에서 강한 면역원성 반응을 시사하지 않았지만, 순환성 v21252는 이 분석 형식 내에서 항체 검출을 제안하는 항-v21252 항체와 결합할 수 있었다. 그러나, 제1일의 투약에 비해 제43일의 투약 시 혈청 농도 시간 데이터의 변화가 관찰되지 않았기 때문에 ADA가 v21252의 PK에 유의하게 영향을 미칠 가능성은 없다.
독성
v21252의 반복-용량 투여(격주로 ×4)는 일반적으로 잘 용인되었다. v21252-관련 사망이 없었고, 안과적 및 심전도 평가, 시각적 호흡 속도, 소변검사, 또는 트로포닌 I 평가에서 주목되는 효과가 없었다. v21252의 투여 후 치료 또는 회복 기간 동안 주목한 체중 파라미터의 v21252-관련 변화는 없었다.
부드러운/묽은 변의 증가된 발생은 6㎎/㎏ 이상에서 v21252의 반복된 용량을 투여한 동물에서 주목하였다. 추가로, 18㎎/㎏의 수컷 및 암컷 동물에서 산발적 식욕부진이 주목되었고, 18㎎/㎏의 암컷 동물에서 등이 굽어진 자세가 산발적으로 주목되었다. 회복 기간 후에, 식욕부진 및 등이 굽어진 자세는 없었지만, 부드러운/묽은 변의 발생은 감소되거나 해결되었고, 이는 v21252-관련 효과의 반전을 시사한다. 연구 동안, 동물에게 부드러운/액체 변의 반복된 관찰 때문에 유체/영양소 보충(냉동된 게토레이(Gatorade) 및 펩토프로(PeptoPro)(등록상표) 규정식)을 제공하였다. v21252의 반복된 투여를 받는 암컷은 치료 기간의 종료까지 제4일(6 및 18㎎/㎏) 또는 제8일(12㎎/㎏)의 유체 및/또는 영양소 보충을 받았다. 유사하게, v21252의 반복된 투여를 받는 수컷은 치료 기간의 종료까지 제8일(12㎎/㎏) 또는 제7일(18㎎/㎏)의 유체 및/또는 영양소 보충을 받았다. 회수 동안에 유체 또는 보충물은 제공되지 않았다.
임상 병리 소견은 제한된 중증도 및 소견의 가역성 때문에 유해한 것으로 간주되지 않았다. 시험 항목-관련 혈액학 변화는 단핵구 계수의 증가, 호중구의 형태학적 변경, 망상적혈구 계수 및 적혈구 질량(RBC, 헤모글로빈 및 헤마토크릿(hematocrit))의 감소와 함께 적혈구 분포 폭의 수반되는 증가를 포함하였다. 18㎎/㎏의 수컷에서 그리고 12㎎/㎏ 이상의 암컷에서 제8일 내지 제50일에 기준 평균에 비해 평균 피브리노겐 농도의 최소 내지 약간의 증가가 있었다. 이들 변화는 시험 항목-관련되며, 면역 또는 염증 자극을 나타내었다. 이들 변화는 제92일에 해결되었다. 치료-관련 변화는 AST, 인, 총 단백질, 알부민, 글로불린 및 시트룰린에서 관찰되었다.
표 22 내지 표 25는 v17597 및 v21252에 대한 비-GLP 반복 용량 연구 및 v21252에 대한 GLP 연구로부터의 결과 비교를 나타낸다.
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Figure pct00098
Figure pct00099
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결론
v21252의 가장 높은 심하지 않은 독성 용량(HNSTD)은 18㎎/㎏이 되는 것으로 결정하였다.　　v21252는 모든 용량에서 잘 용인되었다. 임상 관찰은 유해한 것으로 간주되지 않았으며, 이 GLP 연구에서 사망은 관찰되지 않았다.　 유일한 지속적인 임상 관찰은 증가된 설사였다.　 모든 용량에서 체중의 변화는 관찰되지 않았고, 임상적 병리 소견(간 기능 - 아스파테이트 트랜스아미나제 및 알라닌 트랜스아미나제 및 혈액학 - 호중구, 혈소판, 헤모글로빈 및 림프구)은 유해하게 간주되지 않았다.　 이들 GLP 독성 결과는 인간에서 예측된 효능 있는 용량 초과의 임상 투약을 뒷받침한다.
놀랍게도, 평균 DAR2(v21252)에서 v10000에 접합된 화합물 9를 포함하는 ADC는 18㎎/㎏의 HNSTD와 함께 평균 DAR4(v17597)를 갖는 ADC에 비해 개선된 내약성을 나타내었다. 0.36㎎/㎏의 독소 용량으로 투여될 때 평균 DAR4 (v17597)에서 v10000에 접합된 독소 화합물 9는 급격하게(9㎎/㎏의 단일 용량으로) 또는 준 만성적으로(sub-chronically)(2주만큼 분리되는 4.5㎎/㎏의 2회 용량) 투약될 때(실시예 8) 사망률과 연관된다는 것이 이전에 나타났기 때문에, 이 결과는 예상치 못한 것이었다. 대조적으로, v21252(DAR2)가 4회 용량(1.44㎎/㎏의 누적 독소 용량)에 대해 0.36㎎/㎏ 용량의 독소(화합물 9)로 투여될 때, 사망은 없었고 v17597에 비해 독성이 실질적으로 감소되었다. 예를 들어, 0.96㎎/㎏의 독소(화합물 9) 누적 용량으로 투여된 v21252는 유해 소견 없음과 연관되었고, 관찰된 유해 사건 수준 없음(NOAEL)으로서 표기하였다. 더 나아가, 독소(화합물 9)의 1.44㎎/㎏ 누적 용량은 4회 용량에 대해 18㎎/㎏의 v21252로 투여되었고, 용인되었다. 이는 사망과 연관된 v17597의 용량(0.36㎎/㎏)보다 4배 더 높다.
중요하게는, 독소-매칭 용량(4.5㎎/㎏의 v17597 대 9㎎/㎏의 v21252 및 9㎎/㎏의 v17597 및 18㎎/㎏의 v21252)에서 비교할 때 제1 용량 후 대략 2회 초과의 노출(제1 용량 후 AUC0-336hr) 및 2배 더 긴 반감기를 갖지만, v21252는 2주마다 투약될 때 v17597에 비해 더 적은 독성 및 더 많은 내약성을 가진다(표 24 및 표 25에 요약함).
실시예 11: v21252는 생체내 낮은 HER2 환자 유래 이종이식편 성장을 저해한다
LTL-654는 난소 장액성 암종 환자 전이로부터 유래되며, HER2 음성으로서 면역조직화학(IHC)에 의해 스코어링하였다. 더 조기의 생검은 IHC에 의해 HER2 불분명으로서 스코어링하였다.
암컷 NOD Rag 감마(NRG) 마우스는 각각 대략 15㎣인 2개의 LTL-654 종양 단편을 갖는 신장 캡슐을 통해 피하로 이식하였다. 평균 종양 용적이 70.3 내지 77.8㎣에 도달되었을 때 6마리 동물의 두 맹검 처리군 중 하나에 동물을 무작위 배정하였다.
동물을 4회의 총 주사에 대해 매주 1회(qwx4) 정맥내로 투여한 비히클 또는 3㎎/㎏ v21252 중 하나로 처리하였다(표 21). 삼차원(3D) 모드를 이용하는 베보(Vevo)(등록상표) 3100 이미징 시스템(캐나다 토론토에 소재한 후지필름 비주얼소닉스 인코포레이티드(FUJIFILM VisualSonics, Inc.))를 이용하여 종양 크기를 측정하였다. 전체 종양에 전체적으로 다수의 이미지(종양당 70 내지 100)를 기록하였고, 베보(등록상표) LAB 소프트웨어 v2.1.0(후지필름 비주얼소닉스 인코포레이티드)를 이용하여 분석하였다. 최대 제24일의 무작위화 후에 매주 1회 종양 크기를 측정하였다. 개개 종양이 1500㎣의 크기에 도달되었을 때, 마우스를 윤리적으로 희생시켰다. 각각의 그룹에 대해 종양 용적을 평균 ± SEM으로서 보고한다.
도 16은 비히클 또는 v21252의 i.v. 투여 후에 LTL-654 종양 단편을 피하로 이식한 마우스에서의 종양 반응에 대한 결과를 제공하는데, 이는 v21252를 이용한 LTL-654 생착 마우스의 치료가 LTL-654 종양 이종이식편의 성장 속도를 저해하였다는 것을 입증한다.
본 실시예는 HER2 발현이 HER2 음성으로서 IHC에 의해 스코어링되기에 충분히 낮은 환자 유래 이종이식편에서 v21252가 효과적이라는 것을 입증한다.
[표 21]
Figure pct00101
실시예 12: v21252는 두개내로 이식된 생체내 인간 유방 종양을 보유하는 마우스의 생존을 연장시킨다
본 실시예에서 사용한 작제물은 대조군 접합체(링커-독소 001에 접합된 호흡기 세포융합 바이러스에 대해 인간화된 항체), v21252, v7155(T-DM1, DAR3.5) 및 v24029(DAR8에서 엑사테칸(exatecan)-유도체 토포아이소머라제 I 저해제(DXd)에 접합된 트라스투주맙)였다. 본 실시예에서 이용한 두개내로 이식된 BT-474 인간 유방 종양은 HER2 양성 유방암 뇌 전이 모델로서 작용한다.
암컷 Balb/c 누드 마우스(CByJ.Cg-Foxn1nu/J) 마우스를 γ-소스(2 Gy, 60Co, 프랑스 브르트니에르에 소재한 바이오멥(BioMep))로 조사하였다. 마취된 마우스는 페놀 레드 없이 2 마이크로리터의 RPMI 1640 배지에서 1x105개의 BT-474 세포를 정위주사하였다. 동물을 처리군에 무작위화시키고 나서, 제8일에 시작해서, 12회의 총 주사에 대해 매주 6㎎/㎏으로 비히클, 대조군 접합체, v21252, v7155 또는 v24029를 정맥내로 투여하였다(표 26). 제18일까지 체중을 매주 2회 기록하였고, 이후에 매일 기록하였다. 연속 3일 동안 체중손실이 충족되거나 20%를 초과하였을 때, 마우스를 윤리적으로 희생시켰다.
도 17은 비히클, 대조군 접합체, v21252, v7155 또는 v24029의 i.v. 투여 후 BT-474 종양 세포를 두개내로 이식한 마우스의 생존 결과를 제공한다.
BT-474 세포를 두개내로 이식한 동물의 2개의 추가적인 코호트를 또한 처리군으로 무작위화시키고, 제8일에 시작해서, 총 6회의 주사에 대해 2주마다 6㎎/㎏으로 v21252 또는 v24029 중 하나를 정맥내로 투여하였다. 제18일까지 체중을 매주 2회 기록하였고, 이후에 매일 기록하였다. 연속 3일 동안 체중손실이 충족되거나 20%를 초과하였을 때, 마우스를 윤리적으로 희생시켰다.
도 18은 매주(qw) 비히클, 대조군 접합체 또는 v7155의 i.v. 투여, 또는 v21252 또는 v24029 중 하나의 2주마다(q2w)의 i.v. 투여 후 BT-474 종양 세포를 두개내로 이식한 마우스에 대한 생존 결과를 제공한다.
본 실시예는 v21252가 BT-474 유방 종양 세포를 두개내로 이식한 마우스의 생존을 연장시킴에 있어서 효과적이라는 것을 입증한다.
Figure pct00102
본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이터베이스 항목의 개시내용은, 각각의 이러한 개개 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이터베이스 항목이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개개로 나타내는 것과 동일한 정도로 이들의 전문이 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된다.
당업자에게 분명한 본 명세서에 기재된 구체적 실시형태의 변형은 다음의 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
서열 표
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Figure pct00104
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SEQUENCE LISTING <110> ZYMEWORKS INC. <120> Anti-HER2 Biparatopic Antibody-Drug Conjugates and Methods of Use <130> WO/2019/173911 <140> PCT/CA2019/050303 <141> 2019-03-12 <150> US 62/642,483 <151> 2018-03-13 <150> US 62/658,477 <151> 2018-04-16 <150> US 62/743,884 <151> 2018-10-10 <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 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315 320 Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser 325 330 335 Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu 340 345 350 Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 355 360 365 Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile 370 375 380 Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu 385 390 395 400 Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn 405 410 415 Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly 420 425 430 Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His 435 440 445 Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe 450 455 460 Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly 485 490 495 His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe 500 505 510 Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu 515 520 525 Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu 530 535 540 Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp 545 550 555 560 Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala 565 570 575 Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp 580 585 590 Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn 595 600 605 <210> 3 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr 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Lys 245 250 255 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 260 265 270 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 275 280 285 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 290 295 300 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 305 310 315 320 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 325 330 335 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 340 345 350 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 355 360 365 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val 370 375 380 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu 385 390 395 400 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 405 410 415 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu 420 425 430 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 435 440 445 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 450 455 460 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 475 480 <210> 64 <211> 1440 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 64 gacattcaga tgacacagag ccccagctcc ctgagtgctt cagtcggcga cagggtgact 60 atcacctgcc gcgcatccca ggatgtcaac accgctgtgg catggtacca gcagaagcct 120 ggaaaagccc caaagctgct gatctacagc gcttccttcc tgtattctgg cgtgccaagt 180 cggttttctg gaagtagatc aggcactgac ttcacactga ctatctctag tctgcagccc 240 gaagattttg ccacctacta ttgccagcag cactatacca caccccctac attcggacag 300 ggcactaaag tggagattaa gggcgggtca ggcggaggga gcggaggagg gtccggagga 360 gggtctggag gagggagtgg agaggtccag ctggtggaat ctggaggagg actggtgcag 420 cctggaggct cactgcgact gagctgtgcc gcttccggct ttaacatcaa agacacatac 480 attcattggg tcaggcaggc accagggaag ggactggaat gggtggcccg catctatccc 540 acaaatgggt acactcgata tgccgacagc gtgaaaggac ggtttaccat ttctgctgat 600 accagtaaga acacagcata cctgcagatg aacagcctgc gcgcagagga tacagccgtg 660 tactattgca gtcgatgggg gggagacggc ttctacgcca tggattattg gggccagggg 720 actctggtca ccgtgtcaag cgcagccgaa cctaaatcct ctgacaagac ccacacatgc 780 ccaccctgtc ctgctccaga gctgctggga ggaccatccg tgttcctgtt tcctccaaag 840 cctaaagata cactgatgat tagccgcact cccgaagtca cctgtgtggt cgtggacgtg 900 tcccacgagg accccgaagt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtcga ggtgcataat 960 gccaagacta aaccaagaga ggaacagtac aattcaacct atagggtcgt gagcgtcctg 1020 acagtgctgc atcaggattg gctgaacggc aaggagtata agtgcaaagt gtctaacaag 1080 gccctgcccg ctcctatcga gaagactatt agcaaggcaa aagggcagcc acgggaaccc 1140 caggtctacg tgctgccccc tagcagagac gagctgacca aaaaccaggt ctccctgctg 1200 tgtctggtga agggctttta tcctagtgat atcgctgtgg agtgggaatc aaatgggcag 1260 ccagaaaaca attacctgac atggccaccc gtgctggaca gcgatgggtc cttctttctg 1320 tattccaaac tgactgtgga caagtctaga tggcagcagg gaaacgtctt cagctgttcc 1380 gtgatgcacg aggccctgca caatcattac acccagaagt ctctgagtct gtcacccggc 1440 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 66 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 67 Gln Asp Val Asn Thr Ala 1 5 <210> 68 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 68 Ser Ala Ser <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 69 Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 70 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 71 Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr 1 5 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 72 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 73 Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 74 Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr Thr 1 5 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 75 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 76 Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Gly Thr 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 77 Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr Thr 1 5 <210> 78 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 79 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 80 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 81 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 82 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 83 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 84 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Trp Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Gly 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 86 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 87 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 88 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Trp Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 89 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (71)

  1. 항체-약물 접합체로서, 낮은 평균 약물-대-항체비(drug-to-antibody ratio: DAR)로 링커(L)를 통해 아우리스타틴(auristatin) 유사체에 접합된 항-HER2 2파라토프(biparatopic) 항체를 포함하되,
    상기 항-HER2 2파라토프 항체는 제1 HER2 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 HER2 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하며, 상기 제1 HER2 에피토프와 상기 제2 HER2 에피토프는 상이한 에피토프이고, 그리고
    상기 낮은 평균 DAR은 평균 DAR이 3.9 미만인, 항체-약물 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아우리스타틴 유사체-링커는, 하기 일반식 (II)를 갖는, 항체-약물 접합체:
    Figure pct00120

    식 중,
    X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-이거나, X는 존재하지 않고;
    R1은
    Figure pct00121
    로부터 선택되며;
    L은 링커이고, 그리고
    Figure pct00122
    는 항-HER2 2파라토프 항체에 대한 아우리스타틴 유사체-링커의 부착지점을 나타낸다.
  3. 제2항에 있어서, R1은
    Figure pct00123
    인, 항체-약물 접합체.
  4. 제2항에 있어서, X는 존재하지 않는, 항체-약물 접합체.
  5. 제4항에 있어서, R1은
    Figure pct00124
    인, 항체-약물 접합체.
  6. 제2항에 있어서, X는 -C(O)NHCH(CH2R2)-인, 항체-약물 접합체.
  7. 제6항에 있어서, R1은
    Figure pct00125
    인, 항체-약물 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평균 DAR은 0.5 내지 3.5인, 항체-약물 접합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평균 DAR은 0.5 내지 2.5인, 항체-약물 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 5% 이상의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 15% 이상의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 약 5% 내지 약 50%의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 약 10% 내지 약 30%의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 약 10% 내지 약 25%의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 약 15% 내지 약 25%의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 25% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 15% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 0% 내지 약 15%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 약 0% 내지 약 10%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, L은 절단성 링커인, 항체-약물 접합체.
  21. 제20항에 있어서, L은 프로테아제-절단성 링커인, 항체-약물 접합체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, L은 하기 일반식 (VI)을 갖는, 항체-약물 접합체:
    Figure pct00126

    식 중,
    Z는 항-HER2 2파라토프 항체 상의 표적 기와 반응할 수 있는 작용기이고;
    Str은 스트레처(stretcher)이며;
    AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 아미노산이고, AA1-[AA2]m은 프로테아제 절단 부위를 형성하고;
    X는 자가-희생기(self-immolative group)이며;
    D는 상기 아우리스타틴 유사체에 대한 부착 지점이고;
    s는 0 또는 1이며;
    m은 1 내지 4의 정수이고, 그리고
    o는 0, 1 또는 2이다.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, L은 하기 일반식 (VIII)을 갖는, 항체-약물 접합체:
    Figure pct00127

    식 중,
    A-S-는 상기 항-HER2 2파라토프 항체의 부착 지점이며;
    Y는 하나 이상의 추가적인 링커 성분이거나, 존재하지 않고, 그리고
    D는 상기 아우리스타틴 유사체에 대한 부착 지점이다.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, L은 하기 일반식 (IX)을 갖는, 항체-약물 접합체:
    Figure pct00128

    식 중,
    A-S-는 상기 항-HER2 2파라토프 항체의 부착 지점이며;
    Y는 하나 이상의 추가적인 링커 성분이거나, 존재하지 않고, 그리고
    D는 상기 아우리스타틴 유사체에 대한 부착 지점이다.
  25. 제1항에 있어서, 상기 아우리스타틴 유사체-링커는 하기 구조를 갖는, 항체-약물 접합체:
    Figure pct00129

    식 중, A-S-는 상기 항-HER2 2파라토프 항체의 부착 지점이다.
  26. 제25항에 있어서, 상기 평균 DAR은 0.5 내지 2.5인, 항체-약물 접합체.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 접합체는 5% 이상의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 접합체는 약 5% 내지 약 50%의 DAR0 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 접합체는 25% 이하의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 접합체는 0% 내지 약 15%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 2가 단일특이성 항체에 비해 더 큰 친화도로 HER2에 결합하는, 항체-약물 접합체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-HER2 2파라토프 항체는 대응하는 2가 단일특이성 항체에 비해 HER2-발현 세포 내로 더 큰 내재화를 나타내는, 항체-약물 접합체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 독립적으로 scFv, Fab, Fab' 또는 sdAb인, 항체-약물 접합체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 독립적으로 scFv 또는 Fab인, 항체-약물 접합체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 scFv이고, 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab인, 항체-약물 접합체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 HER2 에피토프와 제2 HER2 에피토프는 비중복 에피토프인, 항체-약물 접합체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 HER2 에피토프와 제2 HER2 에피토프는 HER2의 상이한 도메인 상에 있는, 항체-약물 접합체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 제1 HER2 에피토프는 HER2의 ECD4 상에 있고, 상기 제2 HER2 에피토프는 HER2의 ECD2 상에 있는, 항체-약물 접합체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 대한 결합에 대해 트라스투주맙과 경쟁하는, 항체-약물 접합체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 대한 결합에 대해 퍼투주맙과 경쟁하는, 항체-약물 접합체.
  41. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 또는 v6717 중 어느 하나의 상기 ECD4-결합 아암(arm)으로부터의 CDR 서열을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  42. 제1항 내지 제38항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, v6717, v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 또는 v15085 중 어느 하나의 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  43. 제1항 내지 제38항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v10000의 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  44. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v10000의 상기 ECD4-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v10000의 상기 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 서열을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  45. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v10000의 ECD4-결합 아암으로부터의 CDR의 세트에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 6개의 CDR의 세트를 포함하되, 상기 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD4에 결합하는 능력을 보유하는, 항체-약물 접합체.
  46. 제1항 내지 제38항 및 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 v10000의 ECD2-결합 아암으로부터의 CDR 세트에 대해 90% 이상의 서열을 갖는 6개의 CDR의 세트를 포함하되, 상기 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 ECD2에 결합하는 능력을 보유하는, 항체-약물 접합체.
  47. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 서열번호 27, 28, 29, 39, 40 및 41에 제시된 CDR 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 서열번호 67, 68, 69, 70, 71 및 72에 제시된 CDR 서열을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-HER2 2파라토프 항체는 스캐폴드를 추가로 포함하고, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 상기 스캐폴드에 작동 가능하게 연결된, 항체-약물 접합체.
  49. 제48항에 있어서, 상기 스캐폴드는 IgG Fc 영역인, 항체-약물 접합체.
  50. 제49항에 있어서, 상기 IgG Fc 영역은 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc 영역인, 항체-약물 접합체.
  51. 제49항에 있어서, 상기 IgG Fc 영역은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하고 선택적으로 위치 L351에서 아미노산 변형을 더 포함하는 제1 폴리펩타이드 서열 및 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하고 선택적으로 위치 K392에서 아미노산 변형을 더 포함하는 제2 폴리펩타이드 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc 영역이되, 위치 F405에서의 상기 아미노산 변형은 F405A, F405S, F405T 또는 F405V이고; 위치 Y407에서의 상기 아미노산 변형은 Y407I 또는 Y407V이며; 위치 T366에서의 상기 아미노산 변형은 T366I, T366L 또는 T366M이고; 위치 T394에서의 상기 아미노산 변형은 T394W이며; 위치 L351에서의 상기 아미노산 변형은 L351Y이고, 위치 K392에서 상기 아미노산 변형은 K392F, K392L 또는 K392M인, 항체-약물 접합체.
  52. 제51항에 있어서,
    (a) 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T366L, K392M 및 T394W를 포함하거나; 또는
    (b) 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T366L, K392L 및 T394W를 포함하거나; 또는
    (c) 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T350V, T366L, K392M 및 T394W를 포함하거나; 또는
    (d) 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T350V, T366L, K392L 및 T394W를 포함하거나; 또는
    (e) 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제1 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400E, F405A 및 Y407V를 포함하고, 상기 변형된 CH3 도메인의 상기 제2 폴리펩타이드 서열은 상기 아미노산 변형 T350V, T366L, N390R, K392M 및 T394W를 포함하는, 항체-약물 접합체.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  54. HER2-발현 암세포의 성장 저해 방법으로서, 상기 암세포를 유효량의 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, HER2-발현 암세포의 성장 저해 방법.
  55. HER2-발현 암의 치료 방법으로서, HER2-발현 암을 갖는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, HER2-발현 암의 치료 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 유방암, 난소암, 폐암 또는 위암인, HER2-발현 암의 치료 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 유방암인, HER2-발현 암의 치료 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 난소암인, HER2-발현 암의 치료 방법.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 면역조직화학에 의해 HER2 음성으로서 스코어링되는(scored), HER2-발현 암의 치료 방법.
  60. 요법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체.
  61. HER2-발현 암의 치료가 필요한 대상체에서 HER2-발현 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체.
  62. 제61항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 유방암, 난소암, 폐암 또는 위암인, 항체-약물 접합체.
  63. 제61항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 유방암인, 항체-약물 접합체.
  64. 제61항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 난소암인, 항체-약물 접합체.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 면역조직화학에 의해 HER2 음성으로서 스코어링되는, 항체-약물 접합체.
  66. HER2-발현 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체의 용도.
  67. 제66항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 유방암, 난소암, 폐암 또는 위암인, 항체-약물 접합체의 용도.
  68. 제66항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 유방암인, 항체-약물 접합체의 용도.
  69. 제66항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 난소암인, 항체-약물 접합체의 용도.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2-발현 암은 면역조직화학에 의해 HER2 음성으로서 스코어링되는, 항체-약물 접합체의 용도.
  71. 항체-약물 접합체 조성물로서, 링커(L)를 통해 아우리스타틴 유사체에 접합된 항-HER2 2파라토프 항체를 포함하되, 상기 아우리스타틴 유사체-링커는 하기 일반식 (II)을 갖는, 항체-약물 접합체 조성물:
    Figure pct00130

    식 중,
    X는 존재하지 않고;
    R1은
    Figure pct00131
    로부터 선택되며;
    L은 링커이고, 그리고
    Figure pct00132
    는 항-HER2 2파라토프 항체에 대한 아우리스타틴 유사체-링커의 부착지점을 나타내며;
    상기 항-HER2 2파라토프 항체는 HER2의 ECD4 상의 제1 HER2 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 HER2의 ECD2 상의 제2 HER2 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하며, 그리고
    상기 항체-약물 접합체 조성물은 평균 DAR이 0.5 내지 2.5이고, 약 10% 내지 약 30%의 DAR0 종 및 0% 내지 약 15%의 DAR6 또는 더 큰 종을 포함한다.
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