KR101529810B1 - 항체-약물 접합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-5T4 항체 약물 접합체 및 이를 제조 및 사용하는 방법을 개시한다.
Description
본 발명은 일반적으로 암 치료용 항-5T4 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 단일클론 항체의 결합 특이성을 화학요법제의 효능과 조합한 것이다. 종양 관련 표적 분자에 대한 단일클론 항체 개발, 효과가 더욱 큰 세포독성제의 용도, 및 이들 성분에 공유 결합하는 화학 링커의 디자인과 관련된 기술은 최근 빠르게 진보되었다 (문헌 [Ducry L., et al. Bioconjugate Chemistry, 21:5-13, 2010]).
유망한 ADC, 예컨대 SGN-75 (US2009/148942) 및 트라스트주맙-DM1 (US2009/0226465)은 현재 임상 시험 중에 있다. 그러나, 다른 종양 관련 항원이 표적으로 고려되고 있는 바, 많은 도전 과제들이 남아있다. 각각의 단일클론 항체는 별개로 특징 규명되어야 하고, 적절한 링커는 디자인되어야 하며, 종양 세포로의 전달시 그의 효능을 보유하는 적합한 세포독성제의 확인이 이루어져야 한다. 암 표적 상의 항원 밀도, 및 정상 조직이 표적 항원을 발현하는지 여부를 고려하여야 한다. 다른 고려 사항으로는 전체 ADC가 표적과의 결합시 내재화되는지 여부; 가능한 정상 조직 노출 및/또는 치료되는 암의 유형 및 병기를 고려할 때, 세포 증식 억제 약물 또는 세포독성 약물이 바람직한지 여부; 및 항체를 약물 페이로드에 연결하는 링커가 절단가능한 연결부인지 또는 절단불가능한 연결부인지 여부를 포함한다. 추가로, 항체 대 약물 모이어티 접합 비는 항체의 결합 활성 및/또는 약물의 효능을 손상시키지 않는, 충분한 비여야 한다. ADC는 복합 생물 작용제(complex biologics)이며, 효과적인 ADC를 개발하고자 하는 도전은 여전히 중요한 과제로 남아있다는 것은 명확한 일이다.
인간 5T4 종양 관련 항원이 본 발명의 표적 항원이다. 5T4 항원은 종양-개시 세포로도 불리는, 특정의 고도로 종양형성성인 세포 상에서 고수준으로 발현되는 것으로 최근에 밝혀졌다 (WO2010/111659). 종양-개시 세포는 표준 요법에 대해 내성을 보이며, 이것이 종양 재발 및 전이의 원인이 되는 것으로 여겨지고 있으므로, ADC 개발에 있어 추가의 또 다른 장애가 되고 있다.
본 발명의 신규 항-5T4 ADC는 ADC 기술과 관련된 도전 과제들을 극복하고, 5T4 항원을 발현하는 종양 세포에 결합하여, 그 세포에 충분한 세포독성 약물을 전달하는 고도로 특이적이고 효능이 있는 ADC를 제공하는 바, 이로써 혁신적이고 효과적인 암 치료를 제공할 수 있게 되었다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체-약물 접합체는 하기 식: Ab-(LU-D)p 또는 그의 제약상 허용되는 염을 가지는데, 상기 식에서 Ab는 서열 번호 5에 제시된 바와 같은 VH CDR1 영역, 서열 번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR2 영역, 및 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR3 영역을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이고; LU는 말레이미도카프로일 및 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 단위이고; p는 정수 약 1 내지 약 8이고; D는 MMAE, MMAF, 및 MMAD로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물 단위이다.
본 발명은 추가로 상기 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 (a) 서열 번호 5에 제시된 바와 같은 VH CDR1 영역, (b) 서열 번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR2 영역, 및 (c) 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR3 영역을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 (a) 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 VL CDR1 영역, (b) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR2 영역, 및 (c) 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR3 영역을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 (a) 서열 번호 5에 제시된 바와 같은 VH CDR1 영역, (b) 서열 번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR2 영역, 및 (c) 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR3 영역을 가지는 중쇄 가변 영역, 및 (a) 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 VL CDR1 영역, (b) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR2 영역, 및 (c) 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR3 영역을 가지는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 것인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 서열 번호 3의 VH 영역 및 서열 번호 4의 VL 영역을 포함하는 것인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 항-5T4 항체가 서열 번호 1을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성된 것인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로
(a) 상기 항-5T4 항체는 서열 번호 1을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성되고, (b) 상기 LU는 말레이미도카프로일이고, (c) 상기 약물은 MMAF이고, (d) p는 정수 약 4인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로
(a) 상기 항-5T4 항체는 서열 번호 1을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성되고, (b) 상기 LU는 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA이고, (c) 상기 약물은 MMAE이고, (d) p는 정수 약 4인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로
(a) 상기 항-5T4 항체는 서열 번호 1을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성되고, (b) 상기 LU는 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA이고, (c) 상기 약물은 MMAD이고, (d) p는 정수 약 1 내지 약 8인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로
(a) 상기 항-5T4 항체는 서열 번호 15를 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성되고, (b) 상기 LU는 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA이고, (c) 상기 약물은 MMAE이고, (d) p는 정수 약 1 내지 약 8인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 항체가 인간 5T4 항원 상의 에피토프를 인식하고, 여기서 상기 에피토프는 서열 번호 11의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 173-258 및 282-361을 포함하는 것인 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 상기 명시된 항체-약물 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 5T4-양성 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 명시된 항체-약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 5T4-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 방광암종, 유방암종, 자궁경부암종, 결장암종, 자궁내막암종, 신장암종, 폐암종, 식도암종, 난소암종, 전립선암종, 췌장암종, 간암종, 피부암종, 위암종, 및 고환암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 5T4-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다.
더욱 바람직하게, 본 발명은 결장직장암종, 유방암종, 췌장암종, 및 비-소세포폐암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 5T4-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 요법에서 사용하기 위한 상기 명시된 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 추가로 의약의 제조를 위한 상기 명시된 항체-약물 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 용도가 5T4-양성 암의 치료를 위한 것이고, 여기서 상기 암은 방광암종, 유방암종, 자궁경부암종, 자궁내막암종, 신장암종, 폐암종, 식도암종, 난소암종, 전립선암종, 췌장암종, 피부암종, 위암종, 및 고환암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 명시된 용도를 제공한다.
더욱 바람직하게, 본 발명은 추가로 용도가 5T4-양성 암의 치료를 위한 것이고, 여기서 상기 암은 결장직장암종, 유방암종, 췌장암종, 및 비-소세포폐암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 명시된 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 항-5T4 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 언급된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항-5T4 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-5T4 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 (a) 세포 배양물로부터 회수된 항체를 취하는 단계, (b) 말레이미도카프로일 또는 말레이미도카프로일-Val-Cit로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 단위를 통해 상기 항체를, MMAE, MMAD, 또는 MMAF로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물 단위에 화학적으로 연결시키는 단계, 및 (c) 항체-약물 접합체를 정제하는 단계를 포함하는, 항-5T4 항체-약물 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 암 치료용 항-5T4 항체-약물 접합체를 제공한다. 본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어를 정의한다.
본 개시내용에서 사용되는 아미노산 약칭은 모두 37 C.F.R. § 1.822 (B)(I)에 기술되어 있는 바와 같이, 미국 특허청(United States Patent and Trademark Office) 승인을 받은 것이다.
5T4는 42 kDa 비-당화된 코어를 포함하는, 72 kDa의 고도로 당화된 막횡단 당단백질인, 5T4 종양 태아성 항원을 지칭한다 (US 5,869,053 참조). 인간 5T4는 방광암종, 유방암종, 자궁경부암종, 결장암종, 자궁내막암종, 신장암종, 폐암종, 식도암종, 난소암종, 전립선암종, 췌장암종, 간암종, 피부암종, 위암종, 및 고환암종을 비롯한, 다수의 암 유형에서 발현된다. 암 줄기 세포 또는 종양-개시 세포로도 불리는, 고도로 종양형성성인 세포에서는 5T4가 고수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다 (WO2010/111659). 본 발명의 항-5T4 항체는 인간 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다 (US 2007/0231333 참조).
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 1개 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 온전한 다중클론 또는 단일클론 항체 뿐만 아니라, 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 쇄, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열을 포함하며, 이는 예를 들어, 제한 없이, Fab, Fab', F(ab')2, VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), scFv, 단일 도메인 항체 (예컨대, 상어 및 카멜리드 항체), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv를 포함한다.
항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 서브부류)을 포함하고, 항체가 어느 특정 부류일 필요는 없다. 면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5가지의 주요 면역글로불린 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하며, 이중 수개는 서브부류 (이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 배열은 주지되어 있다.
항체의 "가변 영역"이란 단독으로 또는 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 알려져 있는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결되어 있는 4개의 골격 영역 (FR)으로 구성되고, 이는 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 데 기여한다. 대상 가변 영역의 변이체가 바람직한 경우, 특히, CDR 영역 바깥쪽 (즉, 골격 영역내) 아미노산 잔기 치환을 가지는 것이 바람직한 경우, 대상 가변 영역과 동일한 정규 부류 중 CDR1 및 CDR2 서열을 포함하는 다른 항체의 가변 영역과 대상 가변 영역을 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 바람직하게, 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (문헌 [Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987]). 대상 CDR 측면에 위치하는 FR을 선택할 때, 예컨대 항체를 인간화하거나, 최적화시킬 때, 동일한 정규 부류 중 CDR1 및 CDR2 서열을 포함하는 항체로부터의 FR이 바람직하다.
가변 도메인의 "CDR"은 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 카바트 및 코티아 둘 모두의 누적 정의, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태 정의 또는 당업계에 주지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인되는 가변 영역 내의 아미노산 잔기이다. 항체 원래 CDR은 카바트 등에 의해 정의된 초가변 영역으로서 확인될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington, D.C]를 참조할 수 있다. CDR의 위치는 또한 원래 코티아 등에 의해 기술된 구조적 루프 구조로서 확인할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883]을 참조할 수 있다. CDR을 확인하는 다른 접근법으로는 카바트와 코티아의 절충안으로서, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현 액셀리스(Accelrys)®를 이용하여 유도된 "AbM 정의", 또는 문헌 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745]에 기술되어 있는, 관찰된 항원 접촉에 기초한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본원에서 CDR의 "입체형태 정의"로서 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 엔탈피에 의해 항원 결합에 기여하는 잔기로서 확인될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166]을 참조할 수 있다. 추가의 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지는 않지만, 그럼에도 불구하고, 비록 특정 잔기 또는 잔기 군, 또는 심지어는 전체 CDR이 항원 결합에 유의적인 영향을 주지 않는다는 실험상의 관찰 결과 또는 예측을 고려하여 단축되거나, 연장될 수 있지만, 카바트 CDR의 적어도 일부와는 중복되는 점이 있을 것이다. 본원에서 사용되는 바, CDR은 접근법들의 조합을 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 것에 대한 임의의 주어진 실시양태의 경우, CDR은 카바트, 코티아, 확장형, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
"단일클론 항체" (Mab)라는 용어는 그를 제조하는 방법이 아닌, 예컨대 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 비롯한, 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 단일클론 항체는 균질성 또는 실질적으로 균질성 집단으로 존재한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 최소로 함유하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열)인 비-인간 (예컨대, 뮤린) 항체 형태를 의미한다. 바람직하게, 인간화된 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 또는 토끼로부터의 잔기로 대체되고, 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가지는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
"키메라 항체"라는 용어는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래된 것이고, 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 것인 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래된 것이고, 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 것인 항체를 의미하는 것으로 한다.
본 발명의 항체는 당업계에 주지된 기술, 예컨대 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 상기 기술들의 조합 또는 당업계에게 쉽게 알 수 있는 다른 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999)] 및 [Fellouse, F.A., et al., J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)] 참조).
하기 표 1 및 2에는 본 발명의 항체에 대해 바람직한 CDR이 기술되어 있다.
본 발명은
a) i) 서열 번호 8 및 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 LCDR1;
ii) 서열 번호 9 및 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 LCDR2; 및
iii) 서열 번호 10 및 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b) i) 서열 번호 5 및 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 HCDR1;
ii) 서열 번호 6 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 HCDR2; 및
iii) 서열 번호 7 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다.
본 발명의 바람직한 항체 또는 그의 항원 결합 부분은
a) 서열 번호 8의 LCDR1, 서열 번호 9의 LCDR2, 및 서열 번호 10의 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및
b) 서열 번호 5의 HCDR1, 서열 번호 6의 HCDR2, 및 서열 번호 7의 HCDR3을 포함하는 HCVR을 포함한다.
본 발명의 바람직한 단일클론 항체는 본원에서 A1 (인간화된 항-5T4 IgG1 항체); A1-IgG4 (인간화된 항-5T4 IgG4 항체); A3 (마우스/인간 키메라 항체); 및 A3hu (인간화된 항-5T4 IgG1 항체)로 지칭된다. Mab A1, A1-IgG4 및 A3을 코딩하는 아미노산 서열의 서열 번호는 하기 표 3에 제공되어 있다:
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 함께 상호교환적으로 사용된다.
항-5T4 항체-약물 접합체는 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 링커 단위 분자 (LU)를 통해 세포독성 약물 모이어티 (D)에 연결되어 있는 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 의미한다.
링커 단위 (LU): LU는 항체를 약물에 연결시키는 직접 또는 간접 연결부를 기술한다. 링커를 mAb에 부착시키는 것은 다양한 방법으로, 예컨대 표면 리신을 통해, 산화된 탄수화물로의 환원적 커플링, 및 쇄간 이황화물 연결부 환원에 의해 유리된 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 히드라존-, 이황화물- 및 펩티드-기반 연결부를 비롯한 다양한 ADC 연결부 시스템이 당업계에 공지되어 있다.
약물 (D): 약물은 생물학적 또는 검출가능한 활성을 가지는 임의의 물질, 예를 들어, 치료제, 검출가능한 표지, 결합제 등, 및 생체내에서 활성제로 대사되는 프로드럭이다. 약물 및 페이로드라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 약물은 아우리스타틴, 예컨대 아우리스타틴 E (이는 또한 당업계에서 돌라스타틴-10의 유도체로도 알려져 있다) 또는 그의 유도체이다. 아우리스타틴은 예를 들어, 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E를 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응시켜 각각 AEB 및 AEVB를 수득할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴으로는 AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 예시적인 아우리스타틴의 합성법 및 구조는 미국 특허 번호 제6,884,869호, 제7,098,308호, 제7,256,257호, 제7,423,116호, 제7,498,298호, 및 제7,745,394호 (이들은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.
아우리스타틴은 미세소관 동적 작용, 및 핵 및 세포 분열을 방해하고, 항암 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 아우리스타틴은 튜불린에 결합하고, 5T4를 발현하는 세포 또는 세포주에 대해 세포독성 또는 세포 증식 억제 효과를 발휘할 수 있다. 아우리스타틴 또는 생성된 항체-약물 접합체가 원하는 세포 또는 세포주에 대해 세포 증식 억제 또는 세포독성 효과를 발휘하는지 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있는 다수의 상이한 검정법이 당업계에 공지되어 있다. 화합물이 튜불린에 결합하는지 여부를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Muller et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397]; [Hamel et al., Molecular Pharmacology, 1995 47: 965-976]; 및 [Hamel et al., The Journal of Biological Chemistry, 1990 265:28, 17141-17149]를 참조할 수 있다.
약물 또는 페이로드의 예는 DM1 (메이탄신, N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)- 또는 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신), mc-MMAD (6-말레이미도카프로일-모노메틸아우리스타틴-D 또는 N-메틸-L-발릴-N-[(1S,2R)-2-메톡시-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-[[(1S)-2-페닐-1-(2-티아졸릴)에틸]아미노]프로필]-1-피롤리디닐]-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸]-N-메틸-(9CI)-L-발린아미드), mc-MMAF (말레이미도카프로일-모노메틸아우리스타틴 F 또는 N-[6-(2,5-디히드로-2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)-1-옥소헥실]-N-메틸-L-발릴-L-발릴-(3R,4S,5S)-3-메톡시-5-메틸-4-(메틸아미노)헵타노일-(αR,βR,2S)-β-메톡시-α-메틸-2-피롤리딘프로파노일-L-페닐알라닌) 및 mc-Val-Cit-PABA-MMAE (6-말레이미도카프로일-ValcCit-(p-아미노벤질옥시카르보닐)-모노메틸아우리스타틴 E 또는 N-[[[4-[[N-[6-(2,5-디히드로-2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)-1-옥소헥실]-L-발릴-N5-(아미노카르보닐)-L-오르니틸]아미노]페닐]메톡시]카르보닐]-N-메틸-L-발릴-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-히드록시-1-메틸-2-페닐에틸]아미노]-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]-1-피롤리디닐]-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸]-N-메틸-L-발린아미드)로 이루어진 군으로부터 선택된다. DM1은 튜불린 억제제인 메이탄신의 유도체인 반면, MMAD, MMAE, 및 MMAF는 아우리스타틴 유도체이다. 본 발명의 바람직한 페이로드는 mc-MMAF 및 mc-Val-Cit-PABA-MMAE로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"에피토프"라는 용어는 하나 이상의 항체의 항원 결합 영역에서 항체에 의해 인식되고, 항체에 의해 결합이 이루어질 수 있는 분자의 일부를 의미한다. 에피토프는 대개 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 된 화학상 계면 활성기로 이루어져 있고, 특이적인 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라, 특이적인 전하 특징을 가진다. 본원에서 사용되는 바, "항원성 에피토프"라는 용어는 당업계에 주지된 임의의 방법, 예를 들어, 종래 면역검정법에 의해 측정되는 바, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부로서 정의된다. "비선형 에피토프" 또는 "입체형태 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질 내의 비연속된 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "결합 친화도 (KD)"라는 용어는 특정 항원-항체 상호작용의 해리 속도를 의미하는 것으로 한다. KD는 회합 속도, 또는 "온-속도(k온)"에 대한 "오프-속도 (k오프)"로도 불리는 해리 속도의 비이다. 따라서, KD는 k오프/k온과 같고, 이는 몰 농도 (M)로 표현된다. KD가 작을수록, 결합 친화성은 강해진다는 것을 따른다. 그러므로, KD=1 nM인 것과 비교하여 KD=1 μM인 것은 결합 친화성이 약하다는 것을 나타낸다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립되어 있는 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 항체의 KD를 측정하기 위한 한가지 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여, 전형적으로는, 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)® 시스템을 사용하여 이루어진다.
본원에서 사용되는 바, 항체와 5T4 항원 사이의 결합과 관련하여 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 25℃에서 SPR에 의해 측정되는 바, 항체가 약 30 nM 미만인 KD로 5T4 항원에 결합한다는 것이다.
본원에서 사용되는 바, 제약상 허용되는 염이란 분자 또는 거대분자의 제약상 허용되는 유기염 또는 무기염을 의미한다.
"효능"이라는 용어는 생물학적 활성의 척도이며, 이는 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같이, IC50, 또는 5T4 양성 세포주의 성장을 50% 억제시키는 데 필요한 항체의 유효 농도로서 표시될 수 있다. 별법으로, 효능은 실시예 4에 제시되어 있는 바와 같이, 생체내 종양 이종이식 모델에서 측정되는 바, 항-종양 활성을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함할 수 있다: 오직 변이체에 대한 코딩 서열만, 변이체에 대한 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예컨대 기능적 폴리펩티드, 또는 신호 또는 분비 서열 또는 프로단백질 서열; 항체에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 항체에 대한 코딩 서열의 인트론 또는 비-코딩 서열 5' 및/또는 3'. "항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 변이체에 대한 추가의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다. 특이 숙주 세포/발현 시스템에 대해 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 원하는 단백질의 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다 (진아트® 아게(GENEART® AG: 독일 레겐스부르크) 참조).
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 당업계에 공지되어 있는, 천연적으로 회합된 프로모터 또는 이종성 프로모터를 비롯한, 항체 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 바람직하게, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터내 진핵 프로모터 시스템이지만, 원핵 숙주에 대한 제어 서열 또한 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 세포주 내로 도입되고 나면, 숙주 세포는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 데, 및 원하는 경우, 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에서 증식된다. 바람직한 진핵 세포주로는 CHO 세포주, 각종 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포, 또는 인간 배아 신장 세포주를 포함한다. 가장 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포주이다.
본 발명은 5T4 항원 상의 특이적인 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 확인된 에피토프는 아미노산 잔기 173 내지 252 사이의 인간 5T4 항원 (서열 번호 11)을 포함하는 제1 접촉부를 포함하고, 아미노산 잔기 276 내지 355 사이의 제2 접촉부를 포함하는 비선형 또는 입체형태 에피토프이다 (실시예 7 참조). 따라서, 본원에 기술된 CDR 및 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 전장의 항체 뿐만 아니라, 상기 언급된 5T4 항원의 에피토프에 특이적인 CDR을 사용하여 단백질의 결합 친화성을 유지하는 기능성 단편 및 유사체를 제조하는 데에도 사용된다.
본 발명의 항체의 결합 친화도는 SPR을 사용하여 측정된다 (실시예 6). 본 실험에서, 5T4 항원을 비아코어® 칩 상에 저밀도로 고정화시키고, 항체를 유동시킨다. 칩 표면에서 질량 증가를 측정한다. 이러한 분석 방법을 통해 실시간으로 온 및 오프 속도 둘 모두를 측정할 수 있고, 이로써 결합 친화도 (KD)를 얻을 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체의 KD는 약 0.30 내지 약 30 nM; 약 0.30 내지 약 20 nM; 약 0.30 내지 약 10 nM; 약 0.5 내지 약 7 nM; 약 1.0 내지 약 5 nM; 내지 약 1.0 내지 약 3 nM이다.
약물의 항체에의 접합
약물은 항체 상에 접합 지점과 반응성인 기를 가지거나, 또는 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 약물은 (예컨대, 항체의 엡실론-아미노기 리신 또는 N-말단에서의) 알킬화, 산화된 탄수화물의 환원적 아민화, 히드록실기와 카르복실기 사이의 에스테르교환, 아미노기 또는 카르복실기에서의 아미드화, 및 티올에의 접합에 의해 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 분자 1개당 접합되는 약물 모이어티의 개수, p 범위는 평균 1 내지 8; 1 내지 7개, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2이다. 일부 실시양태에서, p 범위는 평균 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3이다. 다른 실시양태에서, p는 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 일부 실시양태에서, p 범위는 평균 약 1 내지 약 8; 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1 내지 약 2이다. 일부 실시양태에서, p 범위는 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4 or 약 2 내지 약 3이다. 접합을 위해 사용될 수 있는 화학법에 대한 예에 대해서는, 예컨대 문헌 [Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 15 (Chemical Modifications of Proteins)] (상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다)을 참조할 수 있다.
예를 들어, 단백질의 화학적 활성화를 통해 유리 티올기가 형성될 때, 단백질은 술프히드릴 반응제와 접합될 수 있다. 한 측면에서, 상기 반응제는 유리 티올기에 실질적으로 특이적인 것이다. 그러한 반응제로는 예를 들어, 말레이미드, 할로아세트아미드 (예컨대, 아이오도, 브로모, 또는 클로로), 할로에스테르 (예컨대, 아이오도, 브로모, 또는 클로로), 할로메틸 케톤 (예컨대, 아이오도, 브로모, 또는 클로로), 벤질 할라이드 (예컨대, 아이오다이드, 브로마이드 또는 클로라이드), 비닐 술폰 및 피리딜티오를 포함한다.
링커
약물은 링커에 의해 항체에 연결될 수 있다. 적합한 링커로는 예를 들어, 절단가능한 링커 및 절단불가능한 링커를 포함한다. 절단가능한 링커는 전형적으로 세포내 조건하에서 쉽게 절단된다. 적합한 절단가능한 링커로는 예를 들어, 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 링커를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 링커는 디펩티드 링커, 예컨대 발린-시트룰린 (val-cit), 페닐알라닌-리신 (phe-lys) 링커, 또는 말레이미도카프로닉-발린-시투룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (mc-Val-Cit-PABA) 링커일 수 있다. 또 다른 링커는 술포숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트 (smcc)이다. 술포-smcc 접합은 술프히드릴 (티올, -SH)과 반응성이지만, 그의 술포-NHS 에스테르는 (리신 및 단백질 또는 펩티드 N-말단에서 발견되는) 1급 아민에 대해 반응성인 말레이미드기를 통해 이루어진다. 추가의 또 다른 링커는 말레이미도카프로일 (mc)이다. 다른 적합한 링커로는 특정 pH 또는 pH 범위에서 가수분해 가능한 링커, 예컨대 히드라존 링커를 포함한다. 추가의 적합한 절단가능한 링커로는 이황화물 링커를 포함한다. 링커는 예컨대, mc 링커 등과 같이, 약물이 유리될 수 있도록 하기 위해 항체가 세포내에서 분해되어야 하는 정도로 항체에 공유 결합될 수 있다.
링커는 항체에 연결시키기 위한 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 아미노, 히드록실, 카르복실 또는 술프히드릴 반응성 기 (예컨대, 말레이미드, 할로아세트아미드 (예컨대, 아이오도, 브로모, 또는 클로로), 할로에스테르 (예컨대, 아이오도, 브로모, 또는 클로로), 할로메틸 케톤 (예컨대, 아이오도, 브로모, 또는 클로로), 벤질 할라이드 (예컨대, 아이오다이드, 브로마이드 또는 클로라이드), 비닐 술폰 및 피리딜티오)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking; CRC Press, Inc., Boca Raton, 1991]을 참조할 수 있다.
면역요법
면역요법을 위해, 항체는 적합한 약물, 예컨대 세포독성제, 또는 세포 증식 억제제, 면역억제제, 방사성 동위 원소, 독소 등에 접합될 수 있다. 접합체는 종양 세포 또는 암 세포를 억제시킴으로써 종양 또는 암 세포의 아폽토시스를 유발하는 데, 또는 환자에서 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 접합체는 동물의 암을 치료하기 위해 다양한 설정하에서 사용될 수 있다. 접합체는 종양 세포 또는 암 세포에게 약물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 이론으로 제한하지 않으면서, 일부 실시양태에서, 접합체는 암-세포 또는 종양-관련 항원에 결합하거나, 그와 회합되고, 접합체 및/또는 약물은 수용체-매개 세포내이입을 통해 종양 세포 또는 암 세포 내부로 흡수될 수 있다. 항원은 종양 세포 또는 암 세포에 부착되어 있을 수 있거나, 종양 세포 또는 암 세포와 회합되는 세포외 기질 단백질일 수 있다. 일단 세포 내부로 이입되고 나면, 접합체 내의 (예컨대, 링커 중에 있는) 하나 이상의 특이 펩티드 서열은 하나 이상 종양-세포 또는 암-세포-회합된 프로테아제에 의해 가수분해적으로 절단되고, 이로써 약물이 유리된다. 이어서, 유리된 약물은 세포 내에서 자유롭게 이동하여 세포독성 또는 세포 증식 억제 또는 다른 활성을 유도한다. 일부 실시양태에서, 약물은 종양 세포 또는 암 세포 외부에서 항체로부터 절단된 후, 이어서, 약물은 세포로 침투하거나, 또는 표면에서 작용한다.
암 치료를 위한 요법
상기 논의된 바와 같이, 종양, 전이, 또는 비조절성 세포 성장을 특징으로 하는 다른 질환 또는 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는 암은 단백질-약물 접합체 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있다.
다른 실시양태에서, 암 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 유효량의 접합체 및 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 그를 이용한 암 치료가 불응성이 아닌 것으로 밝혀진 것이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 그를 이용한 암 치료가 불응성인 것으로 밝혀진 것이다. 접합체는 예컨대, 암 치료 수술과 같은 치료 또한 받은 적이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 추가의 치료 방법으로는 방사선 요법이 있다.
암 치료를 위한 다중 약물 요법
암을 치료하는 방법은 암 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 항체-약물 접합체, 및 항암제인 또 다른 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 적합한 항암제로는 메토트렉세이트, 탁솔, L-아스파라기나제, 머캅토퓨린, 티오구아니딘, 히드록시우레아, 시타라빈, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 시스플라틴, 카르보플라틴, 미토마이신, 다카르바진, 프로카르바진, 토포테칸, 질소 머스타드, 시톡산, 에토포시드, 5-플루오로우라실, BCNU, 이리노테칸, 캄프토테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신, 미톡산트론, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파클리탁셀, 사이클, 및 도세탁셀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 ADC는 선택된 투여 모드, 및 제약상 허용되는 희석제 또는 부형제, 예컨대 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 담체 등에 적절하게 제제화된 투여용 제약 조성물 형태일 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18th ed., 1995] (이는 본원에 참고로 포함된다)는 일반적으로 전문가에게 알려져 있는 바와 같은 제제화 기법의 개요를 제공한다.
본 제약 조성물은 암을 치료하고자 하는 일반적인 목적을 달성하기 위한, 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되지 않는 투여 모드를 언급하는 것으로 본원에서 정의되는 바와 같이, 바람직한 투여 경로는 비경구 투여이다. 투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 상태, 및 체중, 동시 치료 종류, 존재할 경우, 치료 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 범주 내에 있는 조성물은, ADC가 암 치료를 위해 원하는 의학적 효과를 발휘하는 데 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물을 포함한다. 개인별로 개별 필요량은 달라질 수 있지만, 모든 성분의 유효량에 대해 최적인 범위를 결정하는 것은 임상의의 숙련된 기술 능력 안에 있다.
실시예 1
항-5
T4
ADC
제조
mAb를 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)으로 부분적으로 환원시킨 후, 환원된 Cys 잔기를 원하는 말레이미드 말단형 링커-페이로드와 반응시켜 5T4-A1 항체 약물 접합체 (ADC)를 제조하였다. 특히, 37℃에서 2 h 동안 100 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충제) (pH 7.0) 중의 2.8 몰 과량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 및 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)을 첨가함으로써 5T4-A1 mAb를 부분적으로 환원시켰다. 이어서, 원하는 링커-페이로드를 5.5 (말레이미도카프로닉-모노메틸아우리스타틴 F [mc-MMAF]) 또는 8 (말레이미도카프로닉-발린-시투룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-모노메틸아우리스타틴 E [mc-Val-Cit-PABA-MMAE])의 링커-페이로드/mAb-티올 몰비로 반응 혼합물에 첨가하고, 15% v/v의 디메틸아세트아미드 (DMA)의 존재하에 25℃에서 추가로 1 h 동안 반응시켰다. 1 h 동안의 인큐베이션 기간이 경과한 후, N-에틸말레이미드 (mc-MMAF의 경우, 4.5배 과량, 및 mc-Val-Cit-PABA-MMAE의 경우, 2배 과량)를 첨가하여 비반응 티올을 캡핑하고, 15분 동안 반응시킨 후, 6배 과량의 L-Cys를 첨가하여 임의의 비반응 링커-페이로드를 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 4℃에서 밤새도록 포스페이트 완충 처리된 염수 (PBS) (pH 7.4) 중에서 투석시키고, SEC (AKTA 익스플로러(AKTA explorer), 수퍼덱스(Superdex) 200 10/30 GL 칼럼)를 통해 정제하였다. 순도에 대해서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 및 로딩을 계산하기 위한 액체 크로마토그래피 전자 분무 이온화 직렬 질량 분석법 (LC-ESI MS)을 통해 ADC의 특징을 추가로 규명하고, UV 분광광도계를 통해 농도를 측정하였다.
실시예
2
결합 연구
5T4 항원을 발현하는 세포, 및 음성 대조군 Raji 세포를 비-조직 배양물 처리된 96 웰 플레이트 상에 500,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 얼음상에서 유지시켰다. 둘베코스(Dulbecco's) 포스페이트 완충 처리된 염수 (DPBS) 중 3% 우혈청 알부민 BSA 중에서 A1 및 A1-IgG4 항체 또는 A1-mcMMAF ADC의 희석액을 제조하고, 10 ㎍/mL의 최종 농도로 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 얼음상에서 인큐베이션시킨 후, 2회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체인 PE (피코에리트린) 접합된 염소 항-인간 IgG Fc를 웰에 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서 유세포 분석기를 이용하여 평균 형광 강도를 측정하였다.
하기 표 4에 제시되어 있는 데이터는 A1 항체가 다양한 5T4 양성 세포주 패널에 결합한다는 것을 나타낸다. 하기 표 5에 제시되어 있는 데이터는 여러 상이한 세포주 상에서 A1 및 A1-IgG4 항체 뿐만 아니라, A1-mcMMAF ADC에 대해 유사한 결합이 관찰되었다는 것을 나타낸다.
실시예
3
세포독성 검정
5T4를 발현하는 세포주, 및 음성 대조군 Raji 세포주를 ADC의 농도를 증가시켜 가면서 ADC와 함께 배양하였다. 4일 경과 후, 각 배양물의 생존가능성을 평가하였다. 로지스틱 비-선형 회귀에 의해 IC50 값을 계산하고, (ng Ab/mL)로 나타내었다. A1-mcMMAF, A1-vcMMAE, A3-mcMMAF 및 A3-mcMMAE는 5T4를 발현하는 세포주 (MDAMB435/5T4, MDAMB468, 및 MDAMB361DYT2)의 성장을 억제시키는 반면, 5T4 음성 세포 (Raji) 상에서 불활성인 것으로 밝혀졌다 (하기 표 6).
추가로, 5T4+ 원발성 폐 종양 37622a 세포를 단리시키고, 배양물 중에서 성장시켰다. 세포를 ADC의 농도를 증가시켜 가면서 ADC와 함께 배양하였다. 10일 경과 후, MTS 방법을 사용하여 각 배양물의 생존가능성을 평가하였다. 로지스틱 비-선형 회귀에 의해 IC50 값을 계산하고, (ng Ab/mL)로 나타내었다. A1-mcMMAF, A1-vcMMAE, A3-mcMMAF, 및 A3-vcMMAE는 원발성 폐 종양 세포의 성장을 억제시켰다 (하기 표 7).
실시예
4
피하 이종이식 모델
무흉선 (누드) 암컷 마우스 (또는 또 다른 면역억제된 마우스 계통)에 MDAMB435/5T4, MDAMB361DYT2, 또는 H1975 종양 세포를 s.c.로 주사하였다. 대략 0.1 내지 0.3 g의, 병기별 종양을 앓는 마우스 (1처리군당 n=6 내지 10마리의 마우스)에 생리 식염수 (비히클), A1-mcMMAF, A1-vcMMAE, A1-mcMMAD, A1-smccDM1, A3-mcMMAF, A3-vcMMAE, 또는 mcMMAF 또는 vcMMAE에 접합된 비결합 대조군 항체를 3 mg Ab/kg의 용량으로 Q4Dx4로 하여 정맥내로 투여하였다. 모든 ADC는 Ab 함량에 기초하여 투여하였다. 주 1회 이상 종양을 측정하고, 그의 크기 (㎟ ± SEM)는 ㎟ = 0.5 x (종양의 너비2) x (종양의 길이)로 계산하였다.
하기 표 8에 제시된 데이터는 A1-mcMMAF, A1-vcMMAE, A1-vcMMAD, A3- mcMMAF, 및 A3-vcMMAE가 MDAMB435/5T4 이종이식 모델의 성장을 억제시키는 반면, A1-mcMMAD 및 A1-smccDM1은 상기 모델에서 활성을 띠지 않았다는 것을 나타낸다.
하기 표 9에 제시된 데이터는 A1-mcMMAF, A1-vcMMAE, A1-vcMMAD, A1-smccDM1, A3-mcMMAF, 및 A3-vcMMAE가 MDAMB361DYT2 이종이식 모델의 성장을 억제시키는 반면, A1-mcMMAD는 상기 모델에서 활성을 띠지 않았다는 것을 나타낸다.
하기 표 10에 제시된 데이터는 A1-mcMMAF, A1-vcMMAE, A1-vcMMAD, A3- mcMMAF, 및 A3-vcMMAE가 H1975 이종이식 모델의 성장을 억제시키는 반면, A1-mcMMAD 및 A1-smccDM1은 상기 모델에서 활성을 띠지 않았다는 것을 나타낸다.
별법으로, 37622a 원발성 종양 세포 이종이식편이 피하로 확립된 누드 마우스를 3 mg Ab/kg 용량의 A1-mcMMAF, A1-mcMMAD, A1-vcMMAD, 또는 A3-mcMMAF로 Q4Dx4로 하여 iv로 처리하고, 96일 동안에 걸쳐 종양 성장을 모니터링하였다. 비히클 대조군 처리된 동물과 비교해 볼 때, A1-mcMMAF, A1-vcMMAD 및 A3-mcMMAF는 37622a 원발성 종양 이식편의 성장을 억제시킨 반면, A1-mcMMAD은 상기 모델에서 활성을 띠지 않았다는 것이 하기 표 11을 통해 입증된다.
예상외로, 표 8-11에 제시된 데이터는 4개의 모든 이종이식 모델에서 항체 및 약물 페이로드는 같지만, 링커가 다른 ADC의 경우, 즉, A1-mcMMAD 대 A1-vcMMAD와 같은 경우, 그 효능 프로파일은 다르게 나타났다는 것을 보여준다. 추가로, 상기 데이터는 4개의 모든 이종이식 모델에서 항체 및 링커는 같지만, 약물 페이로드가 다른 ADC의 경우, 즉, A1-mcMMAF 대 A1-mcMMAD와 같은 경우에도 또한 그 효능 프로파일은 다르게 나타났다는 것을 보여준다. 따라서, 약물 MMAD는 vc 링커에 의해 A1 항체 연결된 경우에 4개의 모든 이종이식 모델에서 유효하였지만, mc 링커에 의해 연결된 경우에는 시험된 이종이식 모델 중 어느 것에서도 활성을 보이지 않았다. 대조적으로, 약물 MMAF는 mc 링커로 A1 항체에 연결된 경우에는 4개의 모든 이종이식 모델에서 고도로 유효한 반면, 화학적으로 관련된 약물 MMAD는 같은 링커에 의해 같은 항체에 연결된 경우에는 4개의 모든 이종이식 모델에서 활성을 보이지 않았다.
ADC A1-smccDM1의 경우에도 예상 밖의 추가의 또 다른 관찰 결과가 관찰되었다 (표 8-10). 상기 ADC는 비록 모든 이종이식편이 5T4 표적 항원을 고도로 발현하였지만, MDAMB361DYT2 이종이식편에 대해서는 매우 효과적인 반면, MDAMB435/5T4 및 H1975 이종이식편에 대해서는 본질적으로 어떤 효과도 없었다. 상기 데이터는 링커-페이로드의 유효성은 심지어 같은 고친화성 항체를 사용한 경우에도, 또는 심지어 같은 ADC를 사용한 경우에도 예측할 수 없다는 것을 설명한다.
실시예
5
항체 의존성 세포-매개 세포독성 (
ADCC
)
ADCC 검정:
건강한 지원자로부터의 혈액을, 헤파린 나트륨을 포함하는 BD 배큐테이너(Vacutainer) CPT 세포 제조 튜브로 수집하였다. 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 수거하고, 2.5 x 107개의 세포/ml로 검정 완충제 (10 mM HEPES로 보충된 RPMI 1640) 중에 재현탁시켰다. 표적 세포 (MDAMB435/5T4 또는 MDAMB435/neo)를 96 웰 검정 플레이트에 1 x 104개의 세포/웰인 밀도로 시딩하였다. A1 항체 또는 A1-mcMMAF를 첨가한 후, 인간 PBMC 이펙터 세포 (5 x 105개)를 50:1의 이펙터:표적 세포 비 (E:T)가 되도록 웰에 분배하였다. ADCC 활성을 위해 검정 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 동량의 시토톡스-원(CytoTox-One) 시약 (프로메가(Promega))을 첨가하여 플레이트를 수거하였다. 정지액 (프로메가; 50 ul)을 각 웰에 첨가하고, 형광 강도를 측정함으로써 락테이트 데히드로게나제 방출량을 정량화하였다. 양성 대조군으로서, 웰당 2 ㎕씩의 용해 완충제를 첨가하여 대조군 웰에서 최대 LDH 방출량 (100% 세포독성)을 얻었다. 하기 식을 사용하여 세포독성(%)을 계산하였다:
여기서, "실험치"는 실험 조건들 중 한 조건하에서 측정된 신호에 상응하고, "이펙터 자발적"은 PBMC만이 단독으로 존재하는 조건하에서 측정된 신호에 상응하고, "표적 자발적"은 표적 세포만이 단독으로 존재하는 조건하에서 측정된 신호에 상응하고, "표적 최대치"는 계면활성제로 용해된 표적 세포만이 단독으로 존재하는 조건하에서 측정된 신호에 상응한다.
A1-IgG4 Ab와 비교한, A1-IgG1 Ab 및 A1-mcMMAF의 ADCC 활성을 하기 표 12에 제시한다. A1 항체 및 A1-mcMMAF 둘 모두는 유사한 ADCC 활성을 보였는데, 이는 A1-mcMMAF의 ADCC 활성이 그의 항종양 활성에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
6
결합 친화성
비아코어®를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 수행함으로써 pH 6.0 및 pH 7.4에서 인간 또는 시노몰구스 5T4에 결합하는 A1-IgG1 및 A1-IgG4에 대한 친화도 상수를 측정하였다. 비아코어® 기술은 huA1 항체 변이체가 표면층 상에서 고정화되어 있는 인간 5T4 단백질에 결합할 때, 표면층에서의 굴절률 변화를 이용한다. 결합은 표면으로부터 굴절되는 레이저 광의 SPR에 의해 검출된다. 신호 동역학적 성질 온-속도 및 오프-속도에 대해 분석함으로써 비-특이 상호작용과 특이 상호작용을 구별할 수 있다. 본 분석에 사용된 5T4 단백질은 인간 IgG1-Fc 도메인에 융합된 인간 또는 시노몰구스 5T4 엑토도메인으로 구성되었고, 저밀도 (인간 및 시노몰구스의 경우에 각각 45.1 및 45.4 RU)로 CM5 칩 상에 고정화시켜 친화도 상수를 정확하게 측정하였다.
오직 같은 밀도로 CM5 칩 상에 고정화된 인간 IgG1-Fc 단백질만을 포함하는 참조 표면에의 결합량에서 5T4-Fc 표면상의 값을 감산함으로써 5T4 엑토도메인에의 특이적인 결합을 측정할 수 있었다. 이어서, HBS-EP pH 7.4 또는 MES-EP pH 6.0 완충제 중의 다양한 농도의 A1, A1-IgG4, 또는 A3 항체를 표면 상에 주입하였다. 주입 사이클 사이에 글리신 (pH 1.7) + 0.05% 계면활성제 P20 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare), BR-1000-54)을 이용하여 2회에 걸쳐 표면을 재생시켰다.
그 결과, A1-IgG4에 비하여 A1이 pH 6.0 및 pH 7.4 둘 모두에서 저밀도 5T4 표면을 사용하였을 때, 인간 5T4에 대해 친화도가 약간 더 높은 것으로 나타났다 (각각 1.5배 및 1.2배, 하기 표 13). 추가로, A1은 A1-IgG4와 비교하였을 때, pH 6.0 및 pH 7.4 둘 모두에서 시노몰구스 5T4에 대해 약간 더 잘 결합하는 것으로 나타났고 (각각 1.7배 및 1.2배), A1 및 A1-IgG4 모두 시노몰구스 5T4보다 인간 인간 5T4에 대해 3-4배 더 잘 결합하였다 (하기 표 13).
A1 항체와 A3 항체를 비교해 볼 때, A1 항체는 pH 6.0에 비하여 pH 7.4에서 인간 및 시노몰구스 5T4에 더욱 잘 결합하는 반면, A3 항체는 pH 7.4에 비하여 pH 6.0에서 결합이 증강된 것으로 나타났다는 것은 자명한 것이다 (하기 표 14).
실시예
7
5
T4
키메라를
사용한
에피토프
지도화
각각의 A1 및 A3 항체가 결합하는 에피토프를 확인하기 위해, COS-1 세포에서 일시적으로 발현되는 (1) 5T4 엑토도메인 Fc 구축물, 및 (2) 인간/마우스 5T4 키메라 구축물을 이용하여 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 수행하였다. 엑토도메인은 아미노-말단 영역, 2개의 류신이 풍부한 반복부, 및 개재 소수성 영역을 포함하였고, 마우스 및 래트 5T4 엑토도메인은 그의 소수성 영역 내에 6개의 아미노산으로 된 동향 반복부(direct repeat)를 함유하였다.
인간 5T4 (아미노산 1-355), 마우스 5T4 (아미노산 1-361), 래트 5T4 (아미노산 1-361), 시노몰구스 원숭이 5T4 (아미노산 1-355), 침팬지 5T4 (아미노산 1-355), 및 검은 꼬리 마모셋 (아미노산 1-355)을 이용하여 5T4 엑토도메인 및 인간 IgG1로부터의 Fc 불변 영역을 함유하는 융합 단백질을 제조하였다. 인간/마우스 5T4 키메라 구축물을 이용하여 얻은 결합 결과는, A1 및 A3 항체에 의한 특이적인 결합, 부분적인 결합, 또는 결합 부족을 보여주는 표 14에 요약되어 있다.
하기 표 15는 다양한 인간/마우스 키메라에 대한 항체의 결합능을 나타내고 있으며, 명명법은 마우스 5T4 콘텐츠에 의해 지정된 것이다. 어떤 결합도 일어나지 않은 경우, 이는 항체가 마우스 5T4에 결합하지 않았기 때문에, 항체는 인간 5T4에 결합한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, A3 항체가 (83-163 사이에) 가장 많은 N-말단 결합 에피토프를 가지고 있고, 이는 잔기 83-163이 마우스 5T4로 치환된 5T4 키메라에는 결합하지 못하는 것으로 나타났으며, 따라서, A3은 더 이상 결합이 불가능하였다. 상기 결과에 기초하여, 인간화된 A1 항체는 먼저 아미노산 잔기 173 내지 252 사이의 인간 5T4와 접촉하고, 아미노산 잔기 276 내지 355 사이의 인간 5T4와 두번째 접촉을 한다는 것을 확인할 수 있었다. A3 항체는 먼저 아미노산 잔기 83 내지 163 사이의 인간 5T4의 류신이 풍부한 반복부 영역에 결합하였다. 아미노산 잔기 번호는 서열 번호 11의 인간 5T4 항원 아미노산 서열에 상응한다.
실시예
8
A1-
mcMMAF
ADC
와 A1-
IgG4
-
CM
ADC
비교
안전성 및 효능 둘 모두에 대해서 A1-mcMMAF를 A1-IgG4-AcBut 칼리키아미신 (A1-IGG4-CM)과 비교하였다. A1-4-CM은 링커, AcBut [-(4' 아세틸 페녹시) 부탄산]를 이용하여 칼리키아미신 페리로드에 접합된 A1-IgG4로 구성된 것이다. 칼리키아미신은 마이크로모노스포라 에키노스포라(Micromonospora echinospora) 박테리아로부터 유래된 엔다이인 부류의 항생제인 강력한 항종양제이다.
여러 5T4 양성 세포주를 사용하여 A1 Ab, A1-IgG4 Ab, A1-mcMMAF ADC 및 A1-IgG4-CM ADC의 세포 결합 활성을 비교하였다 (실시예 2, 표 5 참조). 데이터는 A1 및 A1-IgG4 항체 뿐만 아니라, A1-mcMMAF ADC 경우, 유사한 결합이 관찰되었으며, 이들 모두는 시험된 모든 5T4 양성 세포주에 있어서 A1-IgG4-CM보다 더 높은 평균 형광 강도를 가지는 것으로 나타났다.
MDAMB435/5T4 피하 이종이식 모델에서 A1-mcMMAF 및 A1-IgG4-CM을 나란히 시험하였다. 종양 크기가 대략 200 ㎟에 도달하였을 때 상기 두 ADC 모두를 iv로 (Q4dx2로 하여) 투여하였다. 3 mg/kg 용량의 A1-IgG4-CM의 항-종양 활성은 10 mg/kg의 용량으로 투여된 A1-mcMMAF의 항-종양 활성과 유사하였다 (하기 표 16). 상기 결과에 기초하면, A1-IgG4-CM의 항-종양 활성은 A1-mcMMAF의 활성보다 대략 3.3배 더 강력하였다.
예측컨대, A1-mcMMAF의 효능에 비하여 A1-IgG4-CM이 3.3배 증강된 효능을 가진다는 것은 동물 독성 연구에서 A1-IgG4-CM의 안전역에 비하여 A1-mcMMAF이 3.3배 증강된 안전역을 가진다는 것으로 해석될 수 있다. 그러나, 시노몰구스 마카쿠에서 A1-IgG4-CM의 안전성 프로파일을 검토해 보았을 때, 시노몰구스 마카쿠에서 A1-IgG4-CM이 A1-mcMMAF보다 100배 이상 독성이 더 크다는 것을 확인할 수 있었다. A1-IgG4-CM을 0.032, 0.095 및 0.32 mg Ab/kg/사이클 (2, 6, 20 ㎍ 사이클/kg/사이클)로 수컷 (n=3) 및 암컷 (n=3) 시노몰구스 마카쿠에 투여하였을?, 각 용량 수준에서 독성이 관찰되었다. 2회 사이클 후 (2회 투여 후), 0.095 처리군에서 6마리 중 4마리는 안락사하거나, 또는 사망한 것으로 나타났다. 한편, A1-mcMMAF (247 ㎍ mcMMAF/kg/사이클)를 최대 10 mg/kg까지의 투여량으로 동일하게 4주간의 기간에 걸쳐 2회 사이클 후 (2회 투여 후), 어느 것도 사망하지 않은 것으로 관찰되었다. 요약컨대, 하기 둘 모두를 4주간의 관찰 기간 동안 시노몰구스 마카쿠에게 2회에 걸쳐 투여하였을 때, A1-mcMMAF 10 mg/kg의 투여량 군은 안전한 반면, A1-IgG4-CM 0.096 mg/kg의 투여량 군은 독성인 것으로 간주되었다.
예상외로, 각 ADC의 상대적인 항-종양 효능에 기초하여 예상해 보았을 때 안전역이 3.3배 더 크다고 한 것보다는, 본 결과를 통해 볼 때, A1-mcMMAF의 안전역은 A1-IgG4-CM의 안전역의 105배 (10/0.095=105)가 된다는 것이 입증되었다. 본 데이터를 통해 동일한 항원 표적에 대한 항체를 이용하지만, 상이한 약물 페이로드에 접합된 항체-약물 접합체의 예측불가능한 성질이 밝혀졌다.
실시예
9
A1-
mcMMAF
마우스
PK
/
PD
모델링
및 임상 용량 예측
전체 세포주에 대해 유효한 농도를 측정하기 위해 마우스 이종이식 연구에서 는 PK/PD 모델링을 사용하여 A1-mcMMAF의 종양 반응을 정량화하였다. 사용된 전이 구획 종양 사멸 PK/PD 모델은 앞서 시메오니(Simeoni) 등에 의해 기술된 바 있다 (문헌 [Simeoni et al , Cancer Res , 64:1094, (2004)]). 종양의 선형, 지수적 및 로지스틱 성장, 및 약물에 의한 포화 사멸을 설명하기 위해 모델을 변형시켰다. PK/PD 모델 파라미터은 하기를 포함한다:
k
g
ex
지수적
성장
k
g
로지스틱
성장
w
0
초기 종양 부피
tau
변환 속도
k
최대
최대
사멸 속도
kC
50
최대 사멸 속도가 ½이 될 때의 속도
PK/PD 모델링 결과를 사용하여 종양 정적 속도 (TSC, 식 1)를 계산하였다. 이는 종양 성장이 종양 사멸 속도와 같고, 종양 부피는 변함없이 그대로 유지되는 약물 농도이다. TSC는 효능에 필요한 최소 농도로서 정의될 수 있다. TSC는 임상 용량 선택에 대한 가이던스를 제공하는 데 사용되며, 농도는 진료소에서의 효능을 위해 필요한 TSC보다 크다 (>TSC).
A1-mcMMAF의 경우, 별개의 연구에서 마우스 PK를 측정하였다 (3 mg/kg IV, 암컷 무흉선 nu/nu 마우스). 매 4일마다 1 내지 30 mg/kg의 용량 수준으로 A1-mcMMAF를 투여받은 3개의 상이한 5T4 세포주를 사용하여 마우스 이종이식 연구를 완료하였다: 세포주 MDAMB435/5T4 (1, 3, 10, 및 30 mg/kg으로 투여받음), 세포주 H1975 (1, 3, 및 10 mg/kg으로 투여받음) 및 세포주 37622A (1 및 10 mg/kg으로 투여받음). 기술된 바와 같이 PK/PD 모델링을 수행하고, TSC를 하기 표 17에 기록하였다.
각 이종이식 세포주에 대한 마우스 PK/PD 파라미터를 예측된 A1-mcMMAF의 인간 PK와 조합하여 진료소에서의 효능을 위해 필요한 용량을 모의하였다. 이러한 방법을 이용하였을 때, A1-mcMMAF의 최소 유효 임상 용량은 약 0.22 내지 약 2.3 mg/kg Q3 주 [매 3주마다]인 것으로 예측되었다 (하기 표 17).
본 발명의 한 실시양태에서, 용량 범위는 약 0.18 mg/kg 내지 약 2.7 mg/kg, 약 0.22 mg/kg 내지 약 2.6 mg/kg, 약 0.27 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 0.32 mg/kg 내지 약 2.3 mg/kg, 약 0.37 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.42 mg/kg 내지 약 2.10 mg/kg, 약 0.47 mg/kg 내지 약 2.05 mg/kg, 약 0.52 mg/kg 내지 약 2.00 mg/kg, 약 0.57 mg/kg 내지 약 1.95 mg/kg, 약 0.62 mg/kg 내지 약 1.90 mg/kg, 약 0.67 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 0.72 mg/kg 내지 약 1.80 mg/kg, 약 0.82 mg/kg 내지 약 1.70 mg/kg, 약 0.92 mg/kg 내지 약 1.60 mg/kg, 약 1.02 mg/kg 내지 약 1.50 mg/kg, 약 1.12 mg/kg 내지 약 1.40 mg/kg, 또는 약 1.20 mg/kg 내지 약 1.30 mg/kg 범위일 수 있고, Q3 주로 투여된다. 바람직하게, 용량 범위는 약 0.22 mg/kg 내지 약 2.3 mg/kg 범위일 수 있다.
<식 1>
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> PFIZER
GERBER, HANS-PETER
<120> ANTIBODY-DRUG CONJUGATES
<130> PC71762
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> "Synthetic Sequence Humanized A1 human IgG1 heavy chain
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Asp Gly Ala Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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165 170 175
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50 55 60
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65 70 75 80
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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<400> 24
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<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence Humanized A3 human IgG1 heavy chain
<400> 25
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65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence Humanized A3 VH
<400> 26
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50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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20 25 30
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
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100 105 110
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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20 25 30
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<223> Synthetic Sequence Humanized A3 VL-CDR3
<400> 34
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
Claims (21)
- 하기 식의 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염:
Ab-(LU-D)p
상기 식에서,
(a) Ab는
(i) 서열 번호 5에 제시된 바와 같은 VH CDR1 영역,
(ii) 서열 번호 6에 제시된 바와 같은 VH CDR2 영역, 및
(iii) 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 VH CDR3 영역
을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이고,
(b) LU는 말레이미도카프로일 및 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 단위이고,
(c) p는 정수 1 내지 8이고,
(d) D는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 D (MMAD) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물 단위이다. - 제1항에 있어서, 상기 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이
(a) 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 VL CDR1 영역,
(b) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 VL CDR2 영역, 및
(c) 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 VL CDR3 영역
을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체. - 제1항에 있어서, 상기 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 서열 번호 3의 VH 영역 및 서열 번호 4의 VL 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
- 제1항에 있어서, 상기 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 서열 번호 1을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성된 것인 항체-약물 접합체.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 인간 5T4 항원 상의 에피토프를 인식하고, 여기서 상기 에피토프는 서열 번호 11의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 173-258 및 282-361을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 LU가 말레이미도카프로일인 항체-약물 접합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약물이 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)인 항체-약물 접합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, p가 정수 1 내지 4인 항체-약물 접합체.
- 제1항에 있어서,
(a) 상기 항-5T4 항체가 서열 번호 1을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성되고,
(b) 상기 LU가 말레이미도카프로일이고,
(c) 상기 약물이 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)이고,
(d) p가 정수 1 내지 8인
항체-약물 접합체. - 제1항에 있어서,
(a) 상기 항-5T4 항체가 서열 번호 1을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2를 가지는 경쇄로 구성되고,
(b) 상기 LU가 말레이미도카프로일이고,
(c) 상기 약물이 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)이고,
(d) p가 정수 1 내지 4인
항체-약물 접합체. - 제1항 내지 제5항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는, 5T4-양성 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 암이 결장직장암종, 유방암종, 췌장암종, 및 비-소세포폐암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
- (a) 말레이미도카프로일 또는 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 단위를 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 D (MMAD) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물 단위에 화학적으로 연결시키는 단계;
(b) 상기 링커-약물을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항-5T4 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 접합시키는 단계; 및
(c) 항체-약물 접합체를 정제하는 단계
를 포함하는, 항-5T4 항체-약물 접합체를 제조하는 방법. - 삭제
- 삭제
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