BR112020001345A2 - método inovador para síntese de amanitinas - Google Patents

Abstract

MÉTODO INOVADOR PARA SÍNTESE DE AMANITINAS A invenção refere-se a métodos inovadores para sintetizar derivados de amanitina que têm um grupo hidróxi fixado à porção química central de triptofano. Além disso, a invenção se refere a derivados de amanitina inovadores que têm um grupo hidróxi fixado à posição 4?, 5? ou 7? da porção química central de triptofano, conjugados inovadores de tais derivados de amanitina e composições farmacêuticas que compreendem tais conjugados.

Description

“MÉTODO INOVADOR PARA SÍNTESE DE AMANITINAS” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se a métodos inovadores para sintetizar derivados de amanitina que têm um grupo hidróxi fixado à porção química central de triptofano. Além disso, a invenção se refere a derivados de amanitina inovadores que têm um grupo hidróxi fixado à posição 4’, 5’ ou 7’ da porção química central de triptofano, conjugados inovadores de tais derivados de amanitina e composições farmacêuticas que compreendem tais conjugados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Amatoxinas são peptídeos cíclicos compostos por 8 aminoácidos que são encontrados em cogumelos Amanita phalloides (consultar Figura 1). Amatoxinas inibem especificamente a RNA polimerase II dependente de DNA de células de mamíferos e, assim, também a transcrição e biossíntese de proteínas das células afetadas. A inibição de transcrição em uma célula provoca a interrupção do crescimento e da proliferação. Embora não covalentemente ligado, o complexo entre amanitina e RNA-polimerase II é muito estreito (KD = 3 nM). A dissociação de amanitina da enzima é um processo muito lento, tornando improvável, desse modo, a recuperação de uma célula afetada. Quando a inibição de transcrição tiver uma longa duração, a célula sofrerá morte celular programada (apoptose).

[0003] O uso de amatoxinas como porções químicas citotóxicas para terapia tumoral já havia sido explorado em 1981, acoplando-se anticorpo anti-Thy 1.2 à -amanitina com o uso de um ligante fixado ao anel indol de Trp (aminoácido 4; consultar Figura 1) por meio de diazotação (Davis & Preston, Science 213 (1981) 1.385 a 1.388). Davis & Preston identificaram o sítio de fixação como a posição 7’. Morris & Venton demonstraram também que a substituição na posição 7’ resulta em um derivado, que mantém atividade citotóxica (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) 419 a 430).

[0004] O pedido de patente no EP 1 859 811 A1 (publicado em 28 de novembro de 2007) descreveu conjugados em que o átomo de C do aminoácido amatoxina 1 da -amanitina foi diretamente acoplado, isto é, sem uma estrutura ligante, à albumina ou ao anticorpo monoclonal HEA125, OKT3 ou PA-1. Além disso, o efeito inibitório desses conjugados na proliferação de células de câncer de mama (MCF-7), células de linfoma de Burkitt (Raji) e células de linfoma T (Jurkat) foi mostrado. Sugeriu-se o uso de ligantes, incluindo ligantes que compreendem elementos, tais como porções químicas amida, éster, éter, tioéter, dissulfeto, ureia, tioureia, hidrocarboneto e semelhantes, mas nenhum desses construtos foram realmente mostrados e nenhum outro detalhe, tal como sítios de fixação nas amatoxinas, foi fornecido.

[0005] Os pedidos de patente nos WO 2010/115629 e WO 2010/115630 (ambos publicados em 14 de outubro de 2010) descrevem conjugados em que anticorpos, tais como anticorpos anti-EpCAM, tais como o anticorpo humanizado huHEA125, são acoplados às amatoxinas por meio (i) do átomo de C do aminoácido amatoxina 1, (ii) do átomo C 6’ do aminoácido amatoxina 4 ou (iii) por meio do átomo de C do aminoácido amatoxina 3, em cada caso diretamente ou por meio de um ligante entre o anticorpo e as amatoxinas. Os ligantes sugeridos compreendem elementos, tais como porções químicas amida, éster, éter, tioéter, dissulfeto, ureia, tioureia, hidrocarboneto e semelhantes. Além disso, os efeitos inibitórios desses conjugados na proliferação de células de câncer de mama (linhagem celular MCF-7), carcinoma pancreático (linhagem celular Capan-1), câncer de cólon (linhagem celular Colo205) e colangiocarcinoma (linhagem celular OZ) são mostrados.

[0006] O pedido de patente no WO 2012/119787 descreve que porções químicas de ligação ao alvo podem ser fixadas às amatoxinas por meio de ligantes em sítios de fixação adicionais no aminoácido triptofano 4, a saber, posições 1’-N, sem interferência com a interação de tais amatoxinas com seu alvo, a RNA polimerase II dependente de DNA de células de mamíferos.

[0007] O pedido de patente no WO 2014/009025 descreve a síntese total de derivados de amanitina com o uso de um sínton inovador para , -di- hidroxi-isoleucina como um dos materiais de partida. Além disso, o pedido de patente no PCT/EP2016/078984 [publicado como WO 2017/089607] descreve a síntese total de derivados de - e -amanitina com o uso de (2S,3R,4S)-L-4- hidroxi-isoleucina prontamente disponível como um dos materiais de partida. Entretanto, essas abordagens, e todas as outras abordagens completa ou parcialmente sintéticas adotadas até agora, incorporam a porção química central de triptofano no núcleo da amatoxina com o uso do método de acordo com Savige-Fontana. Nesse método, cis-2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexa- hidropirrolo[2,3-b]indol (“Hpi”) é incorporado em uma estrutura linear do precursor de amanitina. Em uma reação de acoplamento de Hpi-cisteína catalisada por ácido, o sistema de anel amanitina com a porção química central de triptofano é formado.

[0008] Entretanto, Hpi não possui qualquer porção química funcional fixada ao anel fenila da porção química indol do Hpi. Desse modo, os produtos de amanitina resultantes do método de acordo com Savige-Fontana contêm uma porção química central de triptofano sem quaisquer substituintes adicionais. Entretanto -, , e -amanitinas de ocorrência natural contêm uma porção química central de 6’-hidoxi-triptofano, e esse grupo 6’-hidróxi tem sido usado com sucesso como grupo funcional para a funcionalização de amanitinas, por exemplo, fixando-se porções químicas de alvejamento, diretamente ou por meio de ligantes (consultar, por exemplo, os documentos nos WO 2010/115629, WO 2010/115630 e WO 2012/041504). Desse modo, no caso de amanitinas sintéticas, a funcionalização teve que ser realizada por meio (i) do átomo de C do aminoácido amatoxina 1, ou (ii) por meio do átomo de C do aminoácido amatoxina 3, conforme descrito acima, ou por meio do átomo de nitrogênio da porção química triptofano, conforme descrito no documento no WO 2012/119787.

[0009] Hpi pode ser obtido reagindo-se triptofano com ácido peracético ou fotoquimicamente com oxigênio singleto. Entretanto, nenhum derivado com substituintes fixados ao anel fenila da porção química indol do Hpi foi descrito até agora.

[0010] Embora o uso de vias totalmente sintéticas para amatoxinas possa oferecer uma opção para o fornecimento de grandes quantidades de amatoxinas necessárias para usos terapêuticos e possa oferecer a construção de uma variedade de variantes inovadores de amatoxina com o uso de materiais de partida adequados como blocos de construção, as abordagens adotadas no passado foram limitadas pelo fato de que a estrutura nativa -, , e/ou - amanitina ainda não podia ser obtida, visto que a porção química 6’-hidróxi fixada à porção química do núcleo de triptofano nessas amanitinas não podia ser incorporada. Desse modo, as opções para a funcionalização de amanitinas sintéticas foram bastante limitadas até agora. Além disso, seria altamente desejável expandir a gama de opções disponíveis para a funcionalização, visto que fatores, tais como impedimento estérico e reatividade podem ter um forte impacto na reatividade, atividade biológica e/ou estabilidade de amanitinas sintéticas e de conjugados das mesmas. Entretanto, a estabilidade e a eficácia de conjugados que compreendem amanitinas altamente tóxicas são de extrema importância para o uso pretendido como moléculas terapêuticas param administração a seres humanos.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0011] Desse modo, ainda havia uma grande necessidade de uma forma econômica e robusta para sintetizar amatoxinas com um grupo hidróxi fixado ao anel fenila da porção química central de triptofano. Em particular, há uma forte necessidade de identificar materiais de partida que poderiam ser usados na reação Savige-Fontana estabelecida e que sejam configurados de uma forma que possam provocar a incorporação de tais grupos hidróxi.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0012] A presente invenção se baseia na observação inesperada de que variantes de Hpi podem ser sintetizadas, o que permite a introdução de grupos hidroxila durante a síntese de derivados de amanitina.

[0013] Desse modo, em um aspecto, a presente invenção refere-se a um derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexa- hidropirrolo[2,3-b]indol de acordo com a Fórmula I

I

[0014] sendo que R1 é selecionado dentre alquila, arila, heteroarila, alquila substituída, arila substituída e heteroarila substituída;

[0015] P1 é hidrogênio ou um grupo protetor, particularmente a grupo protetor selecionado dentre Boc, PhCH2OCO-, CH2=CHCH2O-CO- e tritila;

[0016] P2 é hidrogênio ou um grupo protetor, particularmente a grupo protetor, particularmente a grupo protetor selecionado dentre Boc, PhCH2OCO-, CH2=CHCH2O-CO- e tritila; e

[0017] R2 é selecionado dentre OH, OR1 e uma cadeia de polipeptídeo que consiste em 1 a 7 resíduos de aminoácido.

[0018] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a síntese de um precursor linear que compreende oito resíduos de aminoácido de um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, sendo que compreende a etapa de usar um derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexa- hidropirrolo[2,3-b]indol de qualquer um da presente invenção na síntese peptídica do dito precursor.

[0019] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um método para a síntese de um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, sendo que compreende as etapas de:

[0020] (i) provocar ou permitir a formação de uma ligação entre o resíduo cisteína e a porção química triptofano do precursor linear da presente invenção; e

[0021] (ii) provocar ou permitir a formação do dito derivado de amanitina reagindo-se a terminação N do precursor linear da presente invenção com a terminação C do dito precursor.

[0022] Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, que é selecionada dentre (i) S-desoxi-4’-hidroxi-amanina, 4’-hidroxi-amanina, S- desoxi-5’-hidroxi-amanina, 5’-hidroxi-amanina, S-desoxi-7’-hidroxi-amanina, 7’- hidroxi-amanina, (ii) S-desoxi-4’-hidroxi-amaninamida, 4’-hidroxi-amaninamida, S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida, 5’-hidroxi-amaninamida, S-desoxi-7’-hidroxi- amaninamida e 7’-hidroxi-amaninamida, (iii) um derivado da amanitina de acordo com (i), sendo que a porção química ácido carboxílico livre do aminoácido 1 é convertida em um éster carboxílico –C(=O)OR1 ou em uma porção química – C(=O)NH-OR1, sendo que R1 é selecionado dentre alquila, arila, heteroarila, alquila substituída, arila substituída e heteroarila substituída.

[0023] Em um quinto aspecto, a invenção refere-se a um conjugado que compreende (a) um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado da presente invenção; (b) uma porção química de ligação ao alvo; e (c) opcionalmente um ligante que liga o dito derivado de amanitina e a dita porção química de ligação ao alvo.

[0024] Em um sexto aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a amanitina da presente invenção ou o conjugado da presente invenção.

[0025] Em um sétimo aspecto, a invenção refere-se a um derivado de amanitina da presente invenção, ao conjugado da presente invenção ou à composição farmacêutica da presente invenção para uso no tratamento de câncer em um paciente, sendo que, particularmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pancreático, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer dos ovários, câncer de próstata, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia e linfoma maligno.

[0026] Em um oitavo aspecto, a invenção refere-se a um construto que compreende (a) um derivado de amanitina da presente invenção; e (b) uma porção química ligante que transporta um grupo reativo Y para ligar o dito derivado de amanitina a uma porção química de ligação ao alvo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] A Figura 1 mostra as fórmulas estruturais de diferentes amatoxinas. Os números em negrito (1 a 8) designam a numeração padrão dos oito aminoácidos que formam a amatoxina. As designações padrão dos átomos nos aminoácidos 1, 3 e 4 também são mostradas (letras gregas a , letras gregas a , e números de 1’ a 7’, respectivamente).

[0028] A Figura 2 mostra a estrutura do composto S-desoxi- - amanitina (HDP 30.0735) e de -amanitina.

[0029] A Figura 3 mostra que Hpi (HDP 30.0079) é gerado em uma síntese de uma etapa a partir de Boc-L-triptofano.

[0030] A Figura 4 mostra que o composto S-desoxi- -amanitina (HDP 30.0735) é gerado por síntese peptídica em fase sólida, incorporando o derivado de Hpi HDP 30.2555.

[0031] A Figura 5 mostra a citotoxicidade de S-desoxi- -amanitina (HDP 30.0735) e S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida HDP 30.2548 em células HEK293 e em células HEK293 OATP1B3.

[0032] A Figura 6 mostra um construto com base na S-desoxi- - amanitina (HDP 30.0735) com um ligante clivável fixado ao grupo 6’-hidróxi e um grupo maleimida terminal como um exemplo de um grupo reativo Y para ligar o dito construto a uma porção química de ligação ao alvo.

[0033] A Figura 7 mostra um construto alternativo com base na S- desoxi- -amanitina (HDP 30.0735) com um ligante clivável fixado ao grupo carboxila do resíduo de aminoácido 1 e um grupo maleimida terminal como um exemplo de um grupo reativo Y para ligar o dito construto a uma porção química de ligação ao alvo.

[0034] A Figura 8 mostra que o derivado de Hpi hidroxilado HDP

30.2536 é gerado em uma síntese de múltiplas etapas a partir de 5’-hidroxi-L-

triptofano.

[0035] A Figura 9 mostra que o composto, o precursor de amanitina HDP 30.2544, é gerado pela síntese peptídica em fase sólida, incorporando o derivado de Hpi HDP 30.2536.

[0036] A Figura 10 mostra que o composto, o derivado de amanitina HDP 30.2546, é gerado pelo fechamento do anel a partir do precursor de amanitina HDP 30.2544.

[0037] A Figura 11 mostra que o derivado de amanitina HDP

30.2548 (S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida) é gerado pela remoção de grupos protetores do derivado de amanitina HDP 30.2546.

[0038] A Figura 12 mostra um construto com base no derivado de amanitina HDP 30.2548 (S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida) com um ligante clivável fixado ao grupo 5’-hidróxi e um grupo maleimida terminal como um exemplo de um grupo reativo Y para ligar o dito construto a uma porção química de ligação ao alvo.

[0039] A Figura 13 mostra a citotoxicidade de ADCs HDP 30.2347, HDP 30.2371 e HDP 30.2602 que alvejam A) HER-2/neu em células SKBR-3 (HER-2/neu+++) e células JIMT-1 (HER-2/neu+), B) PSMA em células LnCap (PSMA+++) e células 22rv1 (PSMA++) e C) CD19 em células Raji (CD19+++) e células Nalm-6 (CD19++) em comparação com ADCs HDP 30.1699 (contendo o mesmo ligante clivável como HDP 30.2347, HDP 30.2371 e HDP 30.2602, mas alfa-amanitina em vez dos derivados de amanitina descritos acima)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0040] Antes de a presente invenção ser descrita em detalhes abaixo, deve-se compreender que esta invenção não se limita à metodologia, protocolos e reagentes específicos descritos no presente documento, pois estes podem variar. Também se deve compreender que a terminologia usada no presente documento tem apenas o propósito de descrever modalidades específicas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados que os comumente compreendidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[0041] Particularmente, os termos usados no presente documento são definidos conforme descrito em “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. e Kölbl, H., edições (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça.

[0042] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra “compreender” e variações, tais como “compreende” e “compreendendo”, serão compreendidas como implicando a inclusão de um número inteiro, composição ou etapa indicado, ou grupo de números inteiros ou etapas, embora qualquer número inteiro, composição ou etapa adicional, ou grupo de números inteiros, composições ou etapas, possa também estar opcionalmente presente, incluindo modalidades em que nenhum número inteiro, composição ou etapa adicional, ou grupo de números inteiros, composições ou etapas, está presente. Em tais modalidades posteriores, o termo “compreendendo” é usado conterminantemente com “consistindo em”.

[0043] Diversos documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos citados no presente documento (incluindo todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, submissões da sequência de números de acesso ao Genbank, etc.), supra ou infra, é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade, na medida do possível sob a respectiva lei de patentes. No presente documento, nada deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está habilitada a anteceder tal revelação em virtude da invenção anterior.

[0044] A presente invenção será agora descrita em mais detalhes. Nas passagens a seguir, diferentes aspectos da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, a menos que claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer recurso indicado como sendo preferencial ou vantajoso pode ser combinado com qualquer outro recurso ou recursos indicados como sendo preferenciais ou vantajosos.

[0045] A presente invenção se baseia na observação inesperada de que variantes de Hpi podem ser sintetizadas, o que permite a introdução de grupos hidroxila durante a síntese de derivados de amanitina.

[0046] Desse modo, em um aspecto, a presente invenção refere-se a um derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexa- hidropirrolo[2,3-b]indol de acordo com a Fórmula I

I

[0047] sendo que R1 é selecionado dentre alquila, arila, heteroarila, alquila substituída, arila substituída e heteroarila substituída;

[0048] P1 é hidrogênio ou um grupo protetor;

[0049] P2 é hidrogênio ou um grupo protetor; e

[0050] R2 é selecionado dentre OH, OR1 e uma cadeia de polipeptídeo que consiste em 1 a 7 resíduos de aminoácido.

[0051] No contexto da presente invenção, o termo “grupo protetor” refere-se a um grupo que é fixado a um átomo de nitrogênio nas posições 1 ou 8 da porção química central de hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol a fim de impedir que o átomo de nitrogênio reaja com outros reagentes usados para sintetizar e/ou, adicionalmente, funcionalizar compostos de acordo com a Fórmula I. Uma pessoa de habilidade comum na técnica está bem familiarizada com os diferentes grupos protetores que estão disponíveis na técnica e que podem ser fixados ao átomo de nitrogênio correspondente quando for necessário proteger o átomo de nitrogênio, e que podem ser clivados subsequentemente, quando a proteção de N não é mais necessária. Em modalidades específicas, a proteção de N usa um reagente N-acilante. Desse modo, em tais modalidades, P1 e/ou P2 são grupos acila. Em outras modalidades específicas, a proteção de N usa um reagente N-alquilante. Desse modo, em tais modalidades, P1 e/ou P2 é um grupo alquila.

[0052] Em modalidades específicas, o grupo protetor P1 ou P2, quando presente, é independentemente selecionado dentre Boc, PhCH2OCO-, CH2=CHCH2O-CO- e tritila.

[0053] Em uma modalidade específica, o grupo hidróxi na posição 3a e o átomo de hidrogênio na posição 8a estão em configuração cis em relação ao grupo funcional fixado à posição 2. Em uma outra modalidade específica, o grupo hidróxi na posição 3a e o átomo de hidrogênio na posição 8a estão em configuração trans em relação ao grupo funcional fixado à posição 2. Em uma modalidade específica, o derivado aminossubstituído de acordo com a presente invenção é uma mistura de compostos com configuração cis e trans.

[0054] Em uma modalidade específica, o substituinte R1-C(=O)-O- é fixado à posição 4 na Fórmula I.

[0055] Em uma modalidade específica, o substituinte R1-C(=O)-O- é fixado à posição 5 na Fórmula I.

[0056] Em uma modalidade específica, o substituinte R1-C(=O)-O- é fixado à posição 6 na Fórmula I.

[0057] Em uma modalidade específica, o substituinte R1-C(=O)-O- é fixado à posição 7 na Fórmula I.

[0058] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a síntese de um precursor linear que compreende oito resíduos de aminoácido de um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, sendo que compreende a etapa de usar um derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexa-

hidropirrolo[2,3-b]indol da presente invenção na síntese peptídica do dito precursor.

[0059] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um método para a síntese de um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, sendo que compreende as etapas de:

[0060] (i) provocar ou permitir a formação de uma ligação entre o resíduo cisteína e a porção química triptofano do precursor linear da presente invenção; e

[0061] (ii) provocar ou permitir a formação do dito derivado de amanitina reagindo-se a terminação N do precursor linear da presente invenção com a terminação C do dito precursor.

[0062] Em aspectos adicionais, a invenção refere-se a precursores de amanitina individuais sintetizados conforme mostrado nos exemplos, em particular, compostos HDP 30.2569, HDP 30.2572 e os intermediários com base em fase sólida sintetizados de acordo com [00145].

[0063] Em uma modalidade específica, o método da presente invenção compreende, ainda, a oxidação do átomo de enxofre da porção química cisteína para formar um sulfóxido ou uma sulfona, particularmente um sulfóxido.

[0064] Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, que é selecionada dentre (i) S-desoxi-4’-hidroxi-amanina, 4’-hidroxi-amanina, S- desoxi-5’-hidroxi-amanina, 5’-hidroxi-amanina, S-desoxi-7’-hidroxi-amanina, 7’- hidroxi-amanina, (ii) S-desoxi-4’-hidroxi-amaninamida, 4’-hidroxi-amaninamida, S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida, 5’-hidroxi-amaninamida, S-desoxi-7’-hidroxi- amaninamida e 7’-hidroxi-amaninamida, (iii) um derivado da amanitina de acordo com (i), sendo que a porção química ácido carboxílico livre do aminoácido 1 é convertida em um éster carboxílico –C(=O)OR1 ou em uma porção química – C(=O)NH-OR1, sendo que R1 é selecionado dentre alquila, arila, heteroarila, alquila substituída, arila substituída e heteroarila substituída.

[0065] Em uma modalidade específica, o derivado de amanitina da presente invenção é selecionado dentre S-desoxi-5’-hidroxi-amanina, 5’-hidroxi- amanina, S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida e 5’-hidroxi-amaninamida

[0066] Em um quinto aspecto, a invenção refere-se a um conjugado que compreende (a) um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado da presente invenção; (b) uma porção química de ligação ao alvo; e (c) opcionalmente um ligante que liga o dito derivado de amanitina e a dita porção química de ligação ao alvo.

[0067] Em um sexto aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a amanitina da presente invenção ou o conjugado da presente invenção.

[0068] Em um sétimo aspecto, a invenção refere-se a um derivado de amanitina da presente invenção, ao conjugado da presente invenção ou à composição farmacêutica da presente invenção para uso no tratamento de câncer em um paciente, sendo que, particularmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pancreático, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer dos ovários, câncer de próstata, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia e linfoma maligno.

[0069] Em um oitavo aspecto, a invenção refere-se a um construto que compreende (a) um derivado de amanitina da presente invenção; e (b) uma porção química ligante que transporta um grupo reativo Y para ligar o dito derivado de amanitina a uma porção química de ligação ao alvo.

[0070] No contexto da presente invenção, o termo “amanitina” refere-se a um grupo específico de amatoxinas. No contexto da presente invenção, o termo “amatoxina” inclui todos os peptídeos cíclicos compostos por 8 aminoácidos isolados do gênero Amanita e descritos em Wieland, T. e Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 5 (1978) 185 a 260). No contexto da presente invenção, o termo “amanitinas” refere-se à estrutura bicíclica que se baseia em um ácido aspártico ou resíduo asparagina na posição 1, um resíduo prolina, particularmente um resíduo hidroxiprolina na posição 2, uma isoleucina, hidroxi-isoleucina ou di-hidroxi-isoleucina na posição 3, um resíduo hidroxitriptofano na posição 4, resíduos glicina nas posições 5 e 7, um resíduo isoleucina na posição 6 e um resíduo cisteína na posição 8, particularmente um derivado de cisteína que é oxidado em um derivado de sulfóxido ou sulfona (para a numeração e exemplos representativos de amanitinas, consultar a Figura 1) e, além disso, inclui todos os derivados químicos dos mesmos; adicionalmente, todos os análogos semissintéticos dos mesmos; adicionalmente, todos os análogos sintéticos dos mesmos construídos a partir de blocos de construção de acordo com a estrutura principal dos compostos naturais (cíclicos, 8 aminoácidos), adicionalmente, todos os análogos sintéticos ou semissintéticos que contêm aminoácidos não hidroxilados em vez dos aminoácidos hidroxilados (desde que haja pelo menos um grupo hidróxi presente no anel fenila da porção química triptofano), adicionalmente, todos os análogos sintéticos ou semissintéticos, em cada caso em que qualquer tal derivado ou análogo seja funcionalmente ativo inibindo-se a RNA polimerase II em mamíferos.

[0071] Desse modo, no contexto da presente invenção, o termo “oito resíduos de aminoácido de um derivado de amanitina” refere-se aos aminoácidos específicos que formam a estrutura bicíclica do polipeptídeo amanitina.

[0072] Funcionalmente, amatoxinas são definidas como peptídeos ou depsipeptídeos que inibem RNA polimerase II em mamíferos. Amatoxinas preferenciais são aquelas com um grupo funcional (por exemplo, um grupo carboxílico ou derivado de ácido carboxílico, tal como uma carboxamida ou ácido hidroxâmico, um grupo amino, um grupo hidróxi, um tiol ou um grupo capturador de tiol) que pode ser reagido com moléculas ligantes ou porções químicas de ligação ao alvo conforme definido acima. Amatoxinas que são particularmente adequadas para os conjugados da presente invenção são variantes de di-desóxi de -amanitina, -amanitina, -amanitina, -amanitina, amanulina ou ácido amanulínico, ou variantes de mono-desóxi de amanina, amaninamida, -

amanina ou -amaninamida, conforme mostrado na Figura 1, bem como sais, derivados químicos, análogos semissintéticos e análogos sintéticos das mesmas.

[0073] Em uma modalidade específica, o derivado hidroxissubstituído, o derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado e/ou o conjugado da presente invenção tem uma pureza maior que 90%, particularmente, maior que 95%, mais particularmente, maior que 98% ou ainda maior que 99%.

[0074] No contexto da presente invenção, o termo “pureza” refere- se à quantidade total de, por exemplo, conjugados presentes. Uma pureza maior que 90%, por exemplo, significa que em 1 mg de uma composição que compreende um conjugado da presente invenção, há mais de 90%, isto é, mais de 900 µg, de tal conjugado. A parte restante, isto é, as impurezas, pode incluir material de partida não reagido e outros reagentes, solventes, produtos de clivagem e/ou produtos secundários.

[0075] Em uma modalidade específica, uma composição que compreende o derivado hidroxissubstituído, o derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado e/ou o conjugado da presente invenção compreende mais de 100 mg, em particular, mais de 500 mg e, mais particularmente, mais de 1 g de tal derivado hidroxissubstituído, derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado e/ou conjugado. Desse modo, a quantidade-traço de, por exemplo, um conjugado da presente invenção que possivelmente pode estar presente em preparações complexas de conjugados da técnica anterior é explicitamente excluída.

[0076] O termo “porção química de ligação ao alvo”, conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer molécula ou parte de uma molécula que pode se ligar especificamente a uma molécula-alvo ou epítopo- alvo. Porções químicas de ligação ao alvo preferenciais no contexto do presente pedido são (i) anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos; (ii) proteínas semelhantes a anticorpo; e (iii) aptâmeros de ácido nucleico. “Porções químicas de ligação ao alvo” adequadas para uso na presente invenção têm tipicamente uma massa molecular de 40.000 Da (40 kDa) ou mais.

[0077] Conforme usado no presente documento, considera-se que um primeiro composto (por exemplo, um anticorpo) “se ligue especificamente” a um segundo composto (por exemplo, um antígeno, tal como uma proteína-alvo) se o mesmo tiver uma constante de dissociação KD com o dito segundo composto de 100 M ou menos, particularmente, 50 M ou menos, particularmente, 30 M ou menos, particularmente, 20 M ou menos, particularmente, 10 µM ou menos, particularmente, 5 µM ou menos, mais particularmente, 1 µM ou menos, mais particularmente, 900 nM ou menos, mais particularmente, 800 nM ou menos, mais particularmente, 700 nM ou menos, mais particularmente, 600 nM ou menos, mais particularmente, 500 nM ou menos, mais particularmente, 400 nM ou menos, mais particularmente, 300 nM ou menos, mais particularmente, 200 nM ou menos, ainda mais particularmente, 100 nM ou menos, ainda mais particularmente, 90 nM ou menos, ainda mais particularmente, 80 nM ou menos, ainda mais particularmente, 70 nM ou menos, ainda mais particularmente, 60 nM ou menos, ainda mais particularmente, 50 nM ou menos, ainda mais particularmente, 40 nM ou menos, ainda mais particularmente, 30 nM ou menos, ainda mais particularmente, 20 nM ou menos e, ainda mais particularmente, 10 nM ou menos.

[0078] No contexto do presente pedido, os termos “molécula-alvo” e “epítopo-alvo”, respectivamente, referem-se a um antígeno e a um epítopo de um antígeno, respectivamente, que são especificamente ligados por uma porção química de ligação ao alvo. Particularmente, a molécula-alvo é um antígeno associado ao tumor, em particular, um antígeno ou um epítopo que está presente na superfície de um ou mais tipos de célula tumoral em uma maior concentração e/ou em uma configuração estérica diferente em comparação com a superfície de células não tumorais. Particularmente, o dito antígeno ou epítopo está presente na superfície de um ou mais tipos de célula tumoral, mas não na superfície de células não tumorais. Em modalidades específicas, a porção química de ligação ao alvo se liga especificamente a um epítopo de um antígeno selecionado dentre: PSMA, CD19, CD269, sialil Lewisa, HER-2/neu e molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM). Em outras modalidades, o dito antígeno ou epítopo é preferencialmente expresso em células envolvidas em doenças autoimunes. Em tais modalidades específicas, a porção química de ligação ao alvo se liga especificamente a um epítopo do receptor IL-6 (IL-6R).

[0079] O termo “anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo”, conforme usado no presente documento, refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno. Desse modo, o termo “fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo” refere-se a um fragmento de um anticorpo que compreende pelo menos um domínio funcional de ligação ao antígeno. Também são compreendidas proteínas semelhantes a imunoglobulina que são selecionadas através de técnicas, incluindo, por exemplo, exibição de fagos para se ligar especificamente a uma molécula-alvo, por exemplo, a uma proteína-alvo selecionada dentre: PSMA, CD19, CD269, sialil Lewisa, HER-2/neu e EpCAM. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. “Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos” adequados para uso na presente invenção incluem, porém sem limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados (em particular, enxertado com CDR), desimunizado ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, diacorpos ou tetracorpos (Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci EUA. 90 (1993), 6.444 a 6.448), nanocorpos, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para os anticorpos da invenção) e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos dispostos acima.

[0080] Em algumas modalidades, os fragmentos de ligação ao antígeno são fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno humanos da presente invenção e incluem, porém sem limitação, Fab, Fab’ e F(ab’)2, Fd, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligado a dissulfeto (dsFv) e fragmentos que compreendem um domínio VL ou VH. Fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender o domínio variável (ou domínios variáveis) isoladamente ou em combinação com a totalidade ou uma porção do seguinte: região de articulação, domínios CL, CH1, CH2 e CH3. Também estão incluídos na invenção os fragmentos de ligação ao antígeno que também compreendem qualquer combinação de domínio variável (ou domínios variáveis) com uma região de articulação, domínios CL, CH1, CH2 e CH3.

[0081] Anticorpos utilizáveis na invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos. Particularmente, os anticorpos são de origem humana, roedora (por exemplo, camundongo, rato, porquinho da índia ou coelho), frango, porco, ovelha, cabra, camelo, vaca, cavalo, burro, gato ou cão. É particularmente preferencial que os anticorpos tenham origem humana ou murina. Conforme usado no presente documento, “anticorpos humanos” incluem anticorpos que têm a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para um ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito, por exemplo, na patente U.S. no 5.939.598 de Kucherlapati & Jakobovits.

[0082] O termo “proteína semelhante a anticorpo” refere-se a uma proteína que foi modificada geneticamente (por exemplo, por mutagênese de alças) para se ligar especificamente a uma molécula-alvo. Tipicamente, tal proteína semelhante a anticorpo compreende pelo menos uma alça peptídica variável fixada em ambas as extremidades a um arcabouço de proteína. Essa restrição estrutural dupla aumenta bastante a afinidade de ligação da proteína semelhante a anticorpo a níveis comparáveis com o de um anticorpo. O comprimento da alça peptídica variável consiste tipicamente em 10 a 20 aminoácidos. A proteína em arcabouço pode ser qualquer proteína que tenha boas propriedades de solubilidade. Particularmente, a proteína em arcabouço é uma pequena proteína globular. Proteínas semelhantes a anticorpo incluem, sem limitação, aficorpos, anticalinas e proteínas de repetição de anquirina projetadas (para revisão, consultar: Binz et al., Nat Biotechnol. 2005, 1.257 a

1.268). Proteínas semelhantes a anticorpo podem ser derivadas de grandes bibliotecas de mutantes, por exemplo, ser filtradas de grandes bibliotecas de exibição de fagos e podem ser isoladas em analogia a anticorpos regulares. Além disso, proteínas de ligação semelhantes a anticorpo podem ser obtidas por mutagênese combinatória de resíduos expostos à superfície em proteínas globulares.

[0083] O termo “aptâmero de ácido nucleico” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi modificada geneticamente através de repetidos ciclos de seleção in vitro ou SELEX (evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial) para se ligar a uma molécula-alvo (para uma revisão, consultar: Brody e Gold, J Biotechnol. 74 (2000) 5 a 13). O aptâmero de ácido nucleico pode ser uma molécula de DNA ou RNA. Os aptâmeros podem conter modificações, por exemplo, nucleotídeos modificados, tais como pirimidinas substituídas por 2’-flúor.

[0084] Um “ligante”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma estrutura que conecta dois componentes, sendo que cada um é fixado a uma extremidade do ligante. No caso de o ligante ser uma ligação, uma ligação direta da amatoxina ao anticorpo pode diminuir a capacidade da amatoxina para interagir com a RNA polimerase II. Em modalidades específicas, o ligante aumenta a distância entre dois componentes e alivia a interferência estérica entre esses componentes, tal como, no presente caso, entre o anticorpo e a amatoxina. Em modalidades específicas, o ligante tem uma cadeia contínua entre 1 e 30 átomos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 átomos) em sua cadeia principal, isto é, o comprimento do ligante é definido como a conexão mais curta medida pelo número de átomos ou ligações entre a porção química amatoxina e o anticorpo, sendo que um lado da cadeia principal do ligante foi reagido com a amatoxina e o outro lado está disponível para reação, ou foi reagido, com um anticorpo. No contexto da presente invenção, um ligante é particularmente um grupo C1-20-alquileno, C1-20-heteroalquileno, C2-20-alquenileno, C2-20- heteroalquenileno, C2-20-alquinileno, C2-20-heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno ou heteroaralquileno opcionalmente substituído. O ligante pode conter um ou mais elementos estruturais, tais como porções químicas carboxamida, éster, éter, tioéter, dissulfeto, ureia, tioureia, hidrocarboneto e semelhantes. O ligante também pode conter combinações de dois ou mais desses elementos estruturais. Cada um desses elementos estruturais pode estar presente no ligante mais de uma vez, por exemplo, duas, três, quatro, cinco ou seis vezes. Em algumas modalidades, o ligante pode compreender uma ligação dissulfeto. Compreende-se que o ligante tem que ser fixado em uma única etapa ou em duas ou mais etapas subsequentes à amatoxina e ao anticorpo. Para essa finalidade, o ligante objetivado transportará dois grupos, particularmente em uma extremidade proximal e distal, que podem (i) formar uma ligação covalente com um grupo presente em um dos componentes a ser ligado, particularmente no grupo ativado em uma amatoxina ou o peptídeo de ligação ao alvo, ou que são ou podem (ii) ser ativados para formar uma ligação covalente com um grupo em uma amatoxina. Consequentemente, é preferencial que grupos químicos estejam na extremidade distal e proximal do ligante, que são o resultado de tal reação de acoplamento, por exemplo, um éster, um éter, um uretano, uma ligação peptídica etc.

[0085] Em modalidades específicas, o ligante L é uma cadeia linear entre 1 e 20 átomos independentemente selecionados dentre C, O, N e S, particularmente, entre 2 e 18 átomos, mais particularmente, entre 5 e 16 átomos e, ainda mais particularmente, entre 6 e 15 átomos. Em modalidades específicas,

pelo menos 60% dos átomos na cadeia linear trata-se de átomos de C. Em modalidades específicas, os átomos na cadeia linear são ligados por ligações simples.

[0086] Em modalidades específicas, o ligante L é um grupo alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno ou heteroaralquileno que compreende de 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre N, O e S, sendo que o dito ligante é opcionalmente substituído.

[0087] O termo “alquileno” refere-se a grupos hidrocarboneto saturados de cadeia reta bivalentes que têm de 1 a 20 átomos de carbono, incluindo grupos que têm de 1 a 10 átomos de carbono. Em certas modalidades, grupos alquileno podem ser grupos alquileno inferior. O termo “alquileno inferior” refere-se a grupos alquileno que têm de 1 a 6 átomos de carbono e, em certas modalidades, de 1 a 5 ou 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquileno incluem, porém sem limitação, metileno (-CH2-), etileno (-CH2-CH2-), n- propileno, n-butileno, n-pentileno e n-hexileno.

[0088] O termo “alquenileno” refere-se a grupos bivalentes de cadeia reta que têm 2 a 20 átomos de carbono, sendo que pelo menos uma das ligações carbono-carbono é uma ligação dupla, enquanto outras ligações podem ser ligações simples ou ligações duplas adicionais. O termo “alquinileno” no presente documento refere-se a grupos que têm 2 a 20 átomos de carbono, sendo que pelo menos uma das ligações carbono-carbono é uma ligação tripla, enquanto outras ligações podem ser ligações simples, duplas ou triplas adicionais. Exemplos de grupos alquenileno incluem etenileno (-CH=CH-), 1- propenileno, 2-propenileno, 1-butenileno, 2-butenileno, 3-butenileno e semelhantes. Exemplos de grupos alquinileno incluem etinileno, 1-propinileno, 2-propinileno, e assim por diante.

[0089] Conforme usado no presente documento, “cicloalquileno” pretende se referir a um anel bivalente que faz parte de qualquer sistema monocíclico ou policíclico estável, em que tal anel tem entre 3 e 12 átomos de carbono, mas nenhum heteroátomo, e em que tal anel é completamente saturado, e o termo “cicloalquenileno” pretende se referir a um anel bivalente que faz parte de qualquer sistema monocíclico ou policíclico estável, em que tal anel tem entre 3 e 12 átomos de carbono, mas nenhum heteroátomo, e em que tal anel é pelo menos parcialmente insaturado (mas excluindo qualquer anel arileno). Exemplos de cicloalquilenos incluem, porém sem limitação, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclo-hexileno e ciclo-heptileno. Exemplos de cicloalquenilenos incluem, porém sem limitação, ciclopentenileno e ciclo-hexenileno.

[0090] Conforme usado no presente documento, os termos “heterocicloalquileno” e “heterocicloalquenileno” pretendem se referir a um anel bivalente que faz parte de qualquer sistema de anel monocíclico ou policíclico estável, em que tal anel tem entre 3 e cerca de 12 átomos, e em que tal anel consiste em átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo, particularmente pelo menos um heteroátomo independentemente selecionado dentre o grupo que consiste em N, O e S, sendo que heterocicloalquileno se refere a tal anel que é completamente saturado, e sendo que heterocicloalquenileno se refere a um anel que é pelo menos parcialmente insaturado (mas excluindo qualquer anel arileno ou heteroarileno).

[0091] O termo “arileno” se destina a significar um anel bivalente ou sistema de anel que faz parte de qualquer sistema monocíclico ou policíclico estável, em que tal anel ou sistema de anel tem entre 3 e 20 átomos de carbono, mas não tem heteroátomo, cujo anel ou sistema de anel consiste em uma porção química aromática, conforme definido pela regra do elétron “4n+2” , incluindo fenileno.

[0092] Conforme usado no presente documento, o termo “heteroarileno” refere-se a um anel bivalente ou sistema de anel que faz parte de qualquer sistema mono ou policíclico estável, em que tal anel ou sistema de anel tem entre 3 e 20 átomos, cujo anel ou sistema de anel consiste em uma porção química aromática, conforme definido pela regra do elétron “4n+2” e contém átomos de carbono e um ou mais heteroátomos de nitrogênio, enxofre e/ou oxigênio.

[0093] No contexto da presente invenção, o termo “substituído” pretende indicar que um ou mais hidrogênios presentes na cadeia principal de um ligante são substituídos por uma seleção a partir do grupo indicado (ou grupos indicados), desde que a valência normal do átomo indicada, ou do átomo adequado do grupo que é substituído, não seja excedida, e que a substituição resulte em um composto estável. O termo “opcionalmente substituído” se destina a significar que o ligante é não substituído ou substituído, conforme definido no presente documento, por um ou mais substituintes, conforme definido no presente documento. Quando um substituinte for um grupo ceto (ou oxo, isto é, =O), um grupo tio ou imino ou semelhantes, então, dois hidrogênios no átomo da cadeia principal do ligante são substituídos. Substituintes exemplificativos incluem, por exemplo, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, acila, aroíla, heteroaroíla, carboxila, alcóxi, arilóxi, acilóxi, aroilóxi, heteroaroilóxi, alcoxicarbonila, halogênio, (tio)éster, ciano, fosforila, amino, imino, (tio)amido, sulfidrila, alquiltio, aciltio, sulfonila, um sulfato, um sulfonato, a sulfamoíla, um sulfonamido, nitro, azido, haloalquila, incluindo perfluoroalquila (tal como trifluorometila), haloalcóxi, alquilsulfanila, alquilsulfinila, alquilsulfonila, alquilsulfonilamino, arilsulfonoamino, fosforila, fosfato, fosfonato, fosfinato, alquilcarbóxi, alquilcarboxiamida, oxo, hidróxi, mercapto, amino (opcionalmente mono ou dissubstituído, por exemplo, por alquila, arila ou heteroarila), imino, carboxamida, carbamoíla (opcionalmente mono ou dissubstituída, por exemplo, por alquila, arila ou heteroarila), amidino, aminossulfonila, acilamino, aroilamino, (tio)ureído, (ariltio)ureído, alquil(tio)ureído, cicloalquil(tio)ureído, arilóxi, aralcóxi ou -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n- NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR ou - N(R)S(O)2R, sendo que n é 1 a 4, e R é independentemente selecionado dentre hidrogênio, -alquila, -alquenila, –alquinila, -cicloalquila, -cicloalquenila, -

(heterocicloalquila ligada a C), -(heterocicloalquenila ligada a C), –arila e – heteroarila, sendo que múltiplos graus de substituição são permitidos. Será compreendido por aquele versados na técnica que os próprios substituintes, tais como heterocicloalquila, arila, heteroarila, alquila, etc., ou grupos funcionais, tais como –OH, -NHR etc., podem ser substituídos, se adequado. Também será compreendido por aquele versados na técnica que as próprias porções químicas substituídas também podem ser substituídas, quando adequado.

[0094] Em modalidades específicas, o ligante L compreende uma porção química selecionada dentre uma das seguintes porções químicas: uma porção química dissulfeto (-S-S-), éter (-O-), tioéter (-S-), amina (-NH-), éster (- O-C(=O)- ou –C(=O)-O-), carboxamida (-NH-C(=O)- ou –C(=O)-NH-), uretano (- NH-C(=O)-O- ou –O-C(=O)-NH-) e ureia (-NH-C(=O)-NH-).

[0095] Em modalidades específicas da presente invenção, o ligante L compreende um número de m grupos selecionados dentre a lista de: grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno e heteroaralquileno, sendo que cada grupo pode, opcionalmente, ser independentemente substituído, o ligante compreende, ainda, um número de n porções químicas independentemente selecionadas dentre uma das seguintes porções químicas: porção química dissulfeto (-S-S-), éter (-O-), tioéter (-S-), amina (-NH-), éster (-O-C(=O)- ou –C(=O)-O-), carboxamida (-NH-C(=O)- ou –C(=O)-NH-), uretano (-NH-C(=O)-O- ou –O- C(=O)-NH-) e ureia (-NH-C(=O)-NH-), sendo que m = n+1. Em modalidades específicas, m é 2 e n é 1, ou m é 3 e n é 2. Em modalidades específicas, o ligante compreende 2 ou 3 grupos alquileno não substituídos, e 1 ou 2, respectivamente, porções químicas dissulfeto, éter, tioéter, amina, éster, carboxamida, uretano ou ureia que ligam os grupos alquileno não substituídos.

[0096] Em uma modalidade específica, o ligante L não compreende um grupo heteroarileno.

[0097] Em modalidades específicas, os átomos de C na cadeia linear são independentemente parte de grupos metileno opcionalmente substituídos (-CH2-). Em tais modalidades específicas, os substituintes opcionais são independentemente selecionados dentre halogênio e C1-6-alquila, particularmente metila.

[0098] Em modalidades específicas, o ligante L é um ligante estável.

[0099] No contexto da presente invenção, o termo “ligante estável” refere-se a um ligante que é estável (i) na presença de enzimas e (ii) em um ambiente de redução intracelular.

[00100] Em modalidades específicas, o ligante estável não contém (i) uma subestrutura clivável por enzima e/ou (ii) um grupo dissulfeto. Em tais modalidades específicas, o ligante tem um comprimento de até 12 átomos, particularmente, de 2 a 10, mais particularmente, de 4 a 9 e, com a máxima particularidade, de 6 a 8 átomos.

[00101] Em outras modalidades específicas, o ligante é um ligante clivável.

[00102] No contexto da presente invenção, o termo “ligante clivável” refere-se a um ligante que é (i) clivável por uma enzima ou (ii) um ligante redutível. Em modalidades específicas, o termo apenas se refere a um ligante que é clivável por uma enzima (não a um ligante redutível).

[00103] No contexto da presente invenção, o termo “ligante que é clivável … por uma enzima” refere-se a um ligante que pode ser clivado por uma enzima, particularmente por uma peptidase lisossomal, tal como catepsina B, resultando na liberação intracelular da carga de toxina conjugada com o anticorpo de alvejamento após a internalização (consultar Dubowchik et al., Bioconjug Chem. 13 (2002) 855 a 869). Em modalidades específicas, o ligante clivável compreende um dipeptídeo selecionado dentre: Phe-Lys, Val-Lys, Phe- Ala, Val-Ala, Phe-Cit e Val-Cit, sendo que, particularmente, o ligante clivável compreende, ainda, um espaçador de p-aminobenzila (PAB) entre os dipeptídeos e a amatoxina.

[00104] Em tais modalidades específicas, o ligante clivável compreende uma estrutura L1-L*-L2, sendo que L* é a porção química dipeptídica p-aminobenzila, L1 é uma parte do ligante que conecta L* à amatoxina, em particular, sendo que L1 é conectado a L* por meio de um grupo –NH- ou –O-, particularmente um grupo –C(=O)-NH-, –C(=O)-NH-O- ou –C(=O)-O- grupo, e

[00105] sendo que L2 é uma parte do ligante que conecta L* à porção química de ligação ao alvo, em particular, sendo que L2 é conectado a L* por meio de uma porção química –(CH2)m-, sendo que m é um número inteiro selecionado de 1 a 8, em particular, de 1 a 5, ou por meio de uma porção química –(CH2 CH2O)n-, sendo que n é um número inteiro selecionado de 1 a 3, em particular, de 1 a 2. Por exemplo, no caso do ligante clivável que compreende o dipeptídeo Val-Ala, a estrutura de L1-L*-L2 é da seguinte forma:

[00106] Em outras tais modalidades específicas, L* compreende o dipeptídeo Val-Lys e tem a seguinte estrutura: .

[00107] Em modalidades específicas, o ligante L1 é uma cadeia linear entre 1 e 4 átomos independentemente selecionados dentre C, O, N e S,

particularmente, entre 1 e 3 átomos, mais particularmente, entre 1 e 2 átomos e, ainda mais, apenas 1 átomo. Em modalidades específicas, pelo menos 50% dos átomos na cadeia linear trata-se de átomos de C. Em modalidades específicas, os átomos na cadeia linear são ligados por ligações simples.

[00108] Em uma modalidade específica, L1 é um grupo –NH- ou –O- que faz parte da amatoxina. Em modalidades específicas, L1 é um grupo –O- que tem origem em um grupo hidróxi fixado à posição 4’, 5’, 6’ ou 7’ da porção química central de triptofano. Em modalidades específicas, L1 é um grupo –O- que tem origem no grupo hidroxila que faz parte do grupo ácido carboxílico do resíduo de aminoácido 1 de um derivado de amanina de acordo com a presente invenção. Em modalidades específicas, L1 é um grupo –NH- que tem origem no grupo amino que faz parte do grupo carboxamida do resíduo de aminoácido 1 de um derivado de amaninamida de acordo com a presente invenção. Em modalidades específicas, L1 é um grupo –O- que tem origem em um grupo hidroxila que faz parte do resíduo de aminoácido 3 de um derivado de amanina ou amaninamida de acordo com a presente invenção.

[00109] No contexto da presente invenção, o termo “ligante redutível” refere-se a um ligante que pode ser clivado no ambiente de redução intracelular, particularmente, um ligante que contém grupos dissulfeto, resultando na liberação intracelular da carga de toxina conjugada com a porção química de ligação ao alvo após a internalização pelo ambiente de redução intracelular (consultar Shen et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 10.905 a 10.908). Em modalidades específicas, o ligante redutível compreende uma porção química

[00110] sendo que R1 a R4 são independentemente selecionados dentre H e metila.

[00111] Em tais modalidades específicas, tal ligante clivável tem um comprimento de até 20 átomos, particularmente, de 6 a 18, mais particularmente, de 8 a 16 e, com a máxima particularidade, de 10 a 15 átomos. Em tais modalidades específicas, a parte do ligante que liga a amatoxina de acordo com a presente invenção e o grupo dissulfeto clivável é uma cadeia linear de 3 ou 4 átomos de C, particularmente, 3 átomos de C. Em modalidades específicas, os 3 ou 4 átomos de C na cadeia linear são ligados por ligações simples. Em modalidades específicas, o ligante é um grupo n-propileno.

[00112] Em modalidades específicas, o dito ligante está presente e é conectado, em um lado, ao grupo hidroxila fixado ao anel fenila da porção química central de triptofano, isto é, a um substituinte hidróxi 4’, 5’ ou 7’.

[00113] Em outras modalidades específicas, o dito ligante está presente e é conectado, em um lado, a uma posição no derivado de amanitina da presente invenção, sendo que a dita posição é selecionada dentre

[00114] (i) no caso de S-desoxi-4’-hidroxi-amaninamida, 4’-hidroxi- amaninamida, S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida, 5’-hidroxi-amaninamida, S- desoxi-7’-hidroxi-amaninamida e 7’-hidroxi-amaninamida, o átomo de nitrogênio do grupo carboxamida no átomo de C do aminoácido amatoxina 1 (ligação amida);

[00115] (ii) no caso de S-desoxi-4’-hidroxi-amanina, 4’-hidroxi- amanina, S-desoxi-5’-hidroxi-amanina, 5’-hidroxi-amanina, S-desoxi-7’-hidroxi- amanina, 7’-hidroxi-amanina, o átomo de oxigênio do grupo ácido no átomo de C do aminoácido amatoxina 1 (ligação éster);

[00116] (iii) no caso de um derivado da amanitina da presente invenção, em que a porção química ácido carboxílico livre do aminoácido 1 foi convertida em uma porção química –C(=O)NH-OR1, o átomo de oxigênio do grupo ácido hidroxâmico no átomo de C do aminoácido amatoxina 1;

[00117] (iv) o átomo de oxigênio do grupo hidróxi no átomo de C do aminoácido amatoxina 3, particularmente por meio de uma ligação éster, uma ligação éter ou uma ligação uretano; ou

[00118] (v) o nitrogênio do anel do aminoácido 4.

[00119] O acoplamento do ligante à porção química de ligação ao alvo pode ser alcançado por uma variedade de métodos bem conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica, particularmente na técnica de conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs).

[00120] Em modalidades específicas, o dito ligante é conectado à porção química de ligação ao alvo por meio de uma porção química ureia (…- ligante-NH-C(=O)-NH-porção química de ligação ao alvo). Em tais modalidades específicas, a porção química ureia resulta de uma reação de uma amina primária originalmente presente na porção química de ligação ao alvo, tal como um grupo amino de uma cadeia lateral de lisina, com um derivado de ácido carbâmico …-ligante-NH-C(O)-Z, sendo que Z é um grupo de saída que pode ser substituído por uma amina primária.

[00121] Em outras modalidades específicas, o dito ligante está presente e é conectado à porção química de ligação ao alvo por meio de uma porção química tioéter (…-ligante-S-porção química de ligação ao alvo). Desse modo, em tais modalidades, a presente invenção refere-se a um conjugado de fórmula genérica: Amanitina – L – X* – S – Tbm,

[00122] sendo que amanitina é um derivado de amanitina de acordo com a presente invenção, L é um ligante, X* é uma porção química resultante do acoplamento de um grupo tiol a um grupo reativo a tiol, S é o átomo de enxofre do dito grupo tiol, particularmente, o grupo tiol de um resíduo do aminoácido cisteína e Tbm é uma porção química de ligação ao alvo, particularmente, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo funcional que compreende o dito resíduo do aminoácido cisteína. Em modalidades específicas, o dito resíduo do aminoácido cisteína (i) está localizado em um domínio de anticorpo selecionado dentre CL, CH1, CH2 e CH3; (ii) está localizado em uma posição, em que a sequência de linhagem germinativa que exibe a homologia mais próxima à sequência do dito domínio de anticorpo contém um resíduo de aminoácido diferente de cisteína; e (iii) está localizado em uma posição que é exposta ao solvente.

[00123] No contexto da presente invenção, o termo “grupo reativo a tiol” refere-se a um grupo que reage seletivamente com o grupo tiol de, por exemplo, uma cisteína livre de um anticorpo, particularmente em um valor de pH na faixa entre 6,0 e 8,0, mais particularmente, em um valor de pH na faixa entre 6,5 e 7,5. Em particular, o termo “seletivamente” significa que menos de 10% das reações de acoplamento de uma molécula que compreende um grupo reativo a tiol com um anticorpo que compreende pelo menos um resíduo cisteína livre trata-se de reações de acoplamento com resíduos não cisteína do anticorpo, tal como resíduos lisina, particularmente, menos de 5%, mais particularmente, menos de 2%. Em modalidades específicas, o grupo reativo a tiol é selecionado dentre bromoacetamida, iodoacetamida, maleimida, uma maleimida que tem um grupo de saída na posição 3, em particular, um grupo de saída selecionado dentre –Br e tiol substituído (consultar, por exemplo, documento no US

9.295.729), uma 1,2-di-hidropiridazina-3,6-diona que tem um grupo de saída na posição 4, em particular, um grupo de saída selecionado dentre –Br e tiol substituído (consultar, por exemplo, o documento no US 9.295.729), metilsulfonil benzotiazol, metilsulfonil feniltetrazol, metilsulfonil feniloxadiazol (consultar Toda et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 52 (2013) 12.592 a 12.596), uma 3- arilpropionitrila (consultar Kolodych et al, Bioconjugate Chem. 2015, 26, 197 a 200) e 5-nitro-piridin-2-il-dissulfeto (…-L-S-S-(5-nitro-piridina-2-ila).

[00124] Em modalidades específicas, a dita posição ou grupo funcional, que está, em um lado, conectado ao ligante e que pode direta ou indiretamente ser conectado a uma posição ou grupo funcional presente em uma porção química de ligação ao alvo, é uma porção química que pode reagir com dois grupos tiol presentes em uma porção química de ligação ao alvo ou em duas porções químicas de ligação ao alvo. Em modalidades específicas, os grupos reativos a tiol são uma maleimida que tem dois grupos de saída nas posições 3 e 4, em particular, selecionados dentre 3,4-dibromomaleimida, 3,4-bis(ariltio)- maleimida, em particular, 3,4-difeniltio-maleimida e 3,4-bis(heteroariltio)-

maleimida, em particular, 3,4-bis(2-piridinil-sulfanil)-maleimida. Em outras modalidades específicas, os grupos reativos a tiol são uma 1,2-di- hidropiridazina-3,6-diona que tem dois grupos de saída nas posições 4 e 5, em particular, selecionados dentre 4,5-bromo-1,2-di-hidropiridazina-3,6-diona, 4,5- bis(ariltio)-1,2-di-hidropiridazina-3,6-diona, em particular, 4,5-difeniltio-1,2-di- hidropiridazina-3,6-diona e 4,5-bis(heteroariltio)-1,2-di-hidropiridazina-3,6-diona, em particular, 4,5-bis(2-piridinil-sulfanil)-1,2-di-hidropiridazina-3,6-diona.

[00125] Em modalidades específicas, a porção química resultante do acoplamento de um grupo tiol a um grupo reativo a tiol é selecionada dentre: acetamida substituída por tiol; succinimida substituída por tiol; ácido succinâmico substituído por tiol; heteroarila substituída por tiol, particularmente, benzotiazol substituído por tiol, feniltetrazol substituído por tiol e feniloxadiazol substituído por tiol; e um dissulfeto, sendo que um átomo de enxofre é derivado de um resíduo cisteína do anticorpo. Em modalidades específicas, a porção química resultante do acoplamento de um grupo tiol a um grupo reativo a tiol é uma succinimida substituída por tiol.

[00126] Em modalidades específicas, o ligante L na porção química L-X*-S presente na fórmula genérica da seção [00101] é selecionado dentre o seguinte grupo de porções químicas: (lado da amanitina) -(CH2)2-S-S-(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -(CH2)3-S-S-(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -(CH2)3-S-S-(CH2)3-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -(CH2)4-S-S-(CH2)4-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -(CH2)3-S-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S- (lado de Tbm) (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm);

(lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); (lado da amanitina) -CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S- (lado de Tbm); e

[00127] sendo que –NH- e –CO-, que flanqueiam as sequências dipeptídicas, representam porções químicas amino e carbonila do ligante que forma ligações amida com a terminação carbóxi e amino do dipeptídeo, respectivamente.

[00128] No contexto da presente invenção, o termo “uma porção química resultante do acoplamento de um grupo tiol a um grupo reativo a tiol” refere-se a uma estrutura que resulta (i) da substituição nucleofílica de um grupo de saída Y presente em um grupo reativo a tiol pelo átomo de enxofre de um resíduo cisteína, por exemplo, um grupo bromo acetamida, uma iodo acetamida, um grupo 4,6-dicloro-1,3,5-triazin-2-ilamino, uma alquilsulfona ou uma heteroarilsulfona; (ii) da adição do grupo HS de um resíduo cisteína a uma ligação dupla ativada de um grupo reativo a tiol, por exemplo, maleimida, ou (iii) de uma troca dissulfeto de um dissulfeto ou metanotiossulfonato ativado com o átomo de enxofre de um resíduo cisteína, por exemplo, com piridina-2-tiol, 5- nitropiridina-2-tiol ou metanossulfinato como grupo de saída; ou (iv) de qualquer outra reação química que resulte em uma ligação estável entre o átomo de enxofre de um resíduo cisteína e uma porção química reativa que faz parte do grupo reativo a tiol.

[00129] A porção química primária resultante do acoplamento do grupo tiol pode ser opcionalmente, ainda, derivada, por exemplo, o tioéter succinimidílico resultante de uma maleimida pode ser hidrolisado em tioéteres de ácido succinâmico das seguintes estruturas genéricas

O Ama-L S O OH N Ab

O H

O Ama-L Ab

N S H ou OH .

[00130] Em outras modalidades específicas, o acoplamento sitioespecífico pode ser alcançado reduzindo-se uma ponte dissulfeto presente na porção química de ligação ao alvo e reagindo-se os dois resíduos cisteína com uma porção química em ponte X* presente em um construto amanitina – L – X* (consultar Badescu et al. Bridging disulfides for stable and defined antibody drug conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (2014) 1.124 a 1.136).

[00131] Em uma modalidade similar, o acoplamento sitioespecífico pode ser alcançado reduzindo-se uma ponte dissulfeto presente na porção química de ligação ao alvo e reagindo-se os dois resíduos cisteína com uma porção química em ponte X* presente em um construto amanitina – L – X*, sendo que, particularmente, X* é Ph

S O

S N Ph

O

[00132] (consultar Bryden et al., Bioconjug Chem, 25 (2014) 611 a 617; Schumacher et al., Org Biomol Chem, 2014, 7.261 a 7.269)

[00133] Em uma outra modalidade específica, o acoplamento é alcançado por meio de acoplamento regioespecífico de um grupo amino presente no ligante a um resíduo glutamina presente na porção química de ligação ao alvo por meio de uma transaminase, particularmente, por meio do acoplamento à glutamina Q295 de um anticorpo.

[00134] Em uma modalidade específica, o acoplamento é alcançado por conjugação sitioespecífica com porções químicas de ligação ao alvo que compreendem cadeias laterais de N-glicano. Em particular, a cadeia lateral de N-glicano pode ser degradada enzimaticamente, seguido por trans-glicosilação com uma azido-galactose. Com o uso de química click, tal porção química de ligação ao alvo modificada pode ser acoplada a construtos adequadamente modificados amanitina – L – X*, sendo que X* é, por exemplo, uma dibenzo-ciclo- octina (DIBO) ou uma porção química análoga que compreende uma ligação tripla C-C. Por exemplo, um construto amanitina –L–NH2 pode ser acoplado a DIBO-SE

O O O O N N H O O DIBO-SE

[00135] por substituição nucleofílica da porção química hidroxi succinimida. O construto do ligante modificado com DIBO resultante pode, então, ser acoplado ao derivado de azido mencionado acima. Em uma modalidade alternativa, a porção química de ligação ao alvo pode ser modificada por incorporação de um aminoácido não natural que permite química click, em particular, por incorporação de uma para-azidometil-L-fenilalanina (pAMF).

[00136] Em modalidades específicas, o ligante L em – L – X* é uma cadeia linear de pelo menos 5, particularmente, pelo menos 10, mais particularmente, entre 10 e 20 átomos independentemente selecionados dentre C, O, N e S, particularmente, entre 10 e 18 átomos, mais particularmente, entre 10 e 16 átomos e, ainda mais particularmente, entre 10 e 15 átomos. Em modalidades específicas, pelo menos 60% dos átomos na cadeia linear trata-se de átomos de C. Em modalidades específicas, os átomos na cadeia linear são ligados por ligações simples.

[00137] Em modalidades alternativas, a posição ou grupo funcional, que pode direta ou indiretamente ser conectado a uma posição ou grupo funcional presente em uma porção química de ligação ao alvo, não é um grupo etinila ou, mais geralmente, não é um grupo alquinila, ou não é um grupo que pode ser reagido com um 1,3 dipolo em uma cicloadição 1,3-dipolar (química click).

[00138] Em outras modalidades específicas, o acoplamento sitioespecífico de um construto amanitina – L – X* a uma porção química de ligação ao alvo pode ser alcançado por incorporação de um aminoácido não natural que compreende um grupo ceto, em particular, p-acetilfenilalanina (pAcPhe), na porção química de ligação ao alvo e reagindo-se tal porção química de ligação ao alvo modificada com um construto amanitina – L – X*, sendo que X* é uma porção química hidroxilamina.

[00139] Em uma modalidade adicional, um grupo formila pode ser introduzido por enzima geradora de formilglicina (FGE), que é altamente seletiva para um grupo cisteína em uma sequência de reconhecimento CxPxR para gerar uma etiqueta de aldeído. Tal etiqueta de aldeído pode ser reagida com um grupo adequado X* presente em um construto amanitina – L – X*, em particular, em que X* é

[00140] (consultar Agarwal et al., Bioconjugate Chem 24 (2013) 846 a 851).

[00141] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende o conjugado da presente invenção.

[00142] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um conjugado da presente invenção para uso no tratamento de câncer em um paciente, sendo que, particularmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pancreático, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer dos ovários, câncer de próstata, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia e linfoma maligno.

[00143] Conforme usado no presente documento, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” de uma doença ou distúrbio significa realizar um ou mais dentre os seguintes: (a) reduzira a gravidade do distúrbio; (b) limitar ou prevenir o desenvolvimento de sintomas característicos do distúrbio (ou distúrbios) a ser tratado; (c) inibir a piora dos sintomas característicos do distúrbio (ou distúrbios) a ser tratado; (d) limitar ou prevenir a recorrência do distúrbio (ou distúrbios) em pacientes que já tiveram o distúrbio (ou distúrbios); e (e) limitar ou prevenir a recorrência de sintomas em pacientes que eram anteriormente sintomáticos para o distúrbio (ou distúrbios).

[00144] Conforme usado no presente documento, o tratamento pode compreender a administração de um conjugado ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção a um paciente, sendo que a “administração” inclui administração in vivo, bem como administração diretamente ao tecido ex vivo, tal como enxertos venosos.

[00145] Em modalidades específicas, uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado da presente invenção é usada.

[00146] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade de um agente terapêutico suficiente para alcançar o propósito pretendido. A quantidade eficaz de um determinado agente terapêutico variará com os fatores, tais como a natureza do agente, a via de administração, o tamanho e a espécie do animal a receber o agente terapêutico e o propósito da administração. A quantidade eficaz, em cada caso individual, pode ser determinada empiricamente por um especialista de acordo com os métodos estabelecidos na técnica.

[00147] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se à composição farmacêutica que compreende um derivado de amanitina de acordo com a presente invenção, ou um conjugado da presente invenção de um derivado de amanitina com uma porção química de ligação ao alvo, e que compreende, ainda, um ou mais diluentes, carreadores, excipientes, cargas, aglutinantes, lubrificantes, deslizantes, desintegrantes, adsorventes e/ou conservantes farmaceuticamente aceitáveis.

[00148] “Farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos.

[00149] Em modalidades específicas, a composição farmacêutica é usada sob a forma de um medicamento sistemicamente administrado. Isso inclui parentéricos que compreendem, entre outros, injetáveis e infusões. Injetáveis são formulados sob a forma de ampolas ou como os chamados injetáveis prontos para uso, por exemplo, seringas prontas para uso ou seringas de uso único e, além desses, em frascos perfuráveis para múltiplas extrações. A administração de injetáveis pode ser sob a forma de aplicação subcutânea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) ou intracutânea (i.c.). Em particular, é possível produzir as formulações de injeção respectivamente adequadas como uma suspensão de cristais, soluções, sistemas dispersos nanoparticulares ou coloidais como, por exemplo, hidrolatos.

[00150] Formulações injetáveis podem ser, ainda, produzidas como concentrados, que podem ser dissolvidos ou dispersos com diluentes isotônicos aquosos. A infusão também pode ser preparada sob a forma de soluções isotônicas, emulsões graxas, formulações lipossomais e microemulsões. De modo similar aos injetáveis, formulações de infusão também podem ser preparadas sob a forma de concentrados para diluição. Formulações injetáveis também podem ser aplicadas sob a forma de infusões permanentes na terapia tanto hospitalar quanto ambulatorial, por exemplo, por meio de minibombas.

[00151] É possível adicionar formulações de fármaco parentéricas, por exemplo, albumina, plasma, expansor, substâncias tensoativas, diluentes orgânicos, substâncias que influenciam o pH, substâncias complexantes ou substância poliméricas, em particular, como substâncias que influenciam a adsorção dos conjugados de toxina da porção química de ligação ao alvo da invenção a proteínas ou polímeros, ou os mesmos também podem ser adicionados com o objetivo de reduzir a adsorção dos conjugados de toxina da porção química de ligação ao alvo da invenção a materiais como instrumentos de injeção ou materiais de embalagem, por exemplo, plástico ou vidro.

[00152] Os derivados de amanitina da presente invenção que compreendem uma porção química de ligação ao alvo podem ser ligados a microcarreadores ou nanopartículas em parentéricos como, por exemplo, partículas finamente dispersas à base de poli(met)acrilatos, polilactatos, poliglicolatos, poliaminoácidos ou uretanos de poliéter. Formulações parentéricas também podem ser modificadas como preparações de depósito, por exemplo, com base no “princípio de unidade múltipla”, se os conjugados de toxina da porção química de ligação ao alvo da invenção forem introduzidos em forma finamente dispersa, dispersa e suspensa, respectivamente, ou como uma suspensão de cristais no medicamente ou com base no “princípio de unidade única”, se o conjugado de toxina da porção química de ligação ao alvo da invenção for envolvido por uma formulação, por exemplo, em um tablete ou uma bastão que é subsequentemente implantado. Esses implantes ou medicamentos de depósito em formulações de unidade única e unidade múltipla frequentemente consistem nos chamados polímeros biodegradáveis como, por exemplo, poliésteres de ácido láctico e ácido glicólico, uretanos de poliéter, poliaminoácidos, poli(met)acrilatos ou polissacarídeos.

[00153] Adjuvantes e carreadores adicionados durante a produção das composições farmacêuticas da presente invenção formuladas como parentéricos são particularmente água esterilizada, substâncias que influenciam o valor do pH como, por exemplo, ácidos ou bases orgânicos ou inorgânicos, bem como sais dos mesmos, substâncias de tamponamento para justar os valores de pH, substâncias para isotonização como, por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de hidrogênio sódico, glicose e frutose, tensoativos e surfactantes, respectivamente, e emulsificantes como, por exemplo, ésteres parciais de ácidos graxos de sorbitanos de polioxietileno (por exemplo, Tween®) ou, por exemplo, ésteres de ácidos graxos de polioxietilenos (por exemplo, Cremophor®), óleos graxos como, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja ou óleo de rícino, ésteres sintéticos de ácidos graxos como, por exemplo, oleato de etila, miristato de isopropila e óleo neutro (por exemplo, Miglyol®), bem como adjuvantes poliméricos como, por exemplo, gelatina, dextrano, polivinilpirrolidona, aditivos que aumentam a solubilidade de solventes orgânicos como, por exemplo, propilenoglicol, etanol, N,N-dimetilacetamida, propilenoglicol ou substâncias formadoras de complexos como, por exemplo, citrato e ureia, conservantes como, por exemplo, éster hidroxipropílico e éster metílico de ácido benzoico, álcool benzílico, antioxidantes como, por exemplo, sulfito de sódio e estabilizantes como, por exemplo, EDTA.

[00154] Ao formular as composições farmacêuticas da presente invenção como suspensões em uma modalidade preferencial, agentes espessantes para impedir a fixação dos conjugados de toxina da porção química de ligação ao alvo da invenção ou tensoativos e polieletrólitos para assegurar a ressuspensabilidade de sedimentos e/ou agentes formadores de complexo como, por exemplo, EDTA, são adicionados. Também é possível alcançar complexos do ingrediente ativo com vários polímeros. Exemplos de tais polímeros são polietilenoglicol, poliestireno, carboximetilcelulose, Pluronics® ou éster de sorbitano-ácido graxo de polietilenoglicol. Os conjugados de toxina da porção química de ligação ao alvo da invenção também podem ser incorporados em formulações líquidas sob a forma de compostos de inclusão, por exemplo, com ciclodextrinas. Em modalidades específicas, agentes dispersantes podem ser adicionados como adjuvantes adicionais. Para a produção de liofilizados, agentes em arcabouço como manita, dextrano, sacarose, albumina humana, lactose, PVP ou variedades de gelatina podem ser usados.

EXEMPLOS

[00155] A seguir, a invenção é explicada em mais detalhes por meio de exemplos não limitadores: A. SÍNTESE TOTAL DE S-DESOXI- -AMANITINA HDP 30.0735

OH HO O H N O HN N O H O HN S N HO N O HO H O H N NH O N H O

O NH2 HDP 30.0735

1. PREPARAÇÃO DE N-(terc-BUTOXICARBONIL)-L-6-ACETOXI- TRIPTOFANO HDP 30.2550

O O O

HO OH O OH NH2 HN O

N N H H

O HDP 30.2550

[00156] 590,0 mg (2,68 mmol) de 6-hidroxi-L-triptofano (número

CAS: 13567-14-1) foram suspensos em uma mistura de 30 ml de 1,4- dioxano/água 1:1 (v,v). Sob argônio, 2,68 ml (2,68 mmol) de NaOH 1 N foram adicionados de uma vez à temperatura ambiente. A solução amarela resultante foi, então, tratada com 574,6 µl (2,68 mmol) de Boc anidrido (Boc2O) e agitada por 24 h à temperatura ambiente. A solução foi acidificada com ácido clorídrico 1 N até pH 2,4 e extraída 3 vezes com 25 ml de acetato de etila. Os extratos de acetato de etila combinados foram lavados com solução de NaCl saturada e secos em MgSO4. A filtração e evaporação até secura gerou 785,0 mg de material bruto. O N-Boc-6-hidroxi-L-triptofano bruto foi dissolvido em 4,91 ml (4,91 mmol) de NaOH 1 N e tratado com 463,2 ml (500,3 mg, 4,90 mmol) de acetanidrido. A mistura de reação foi agitada por 3 h sob argônio e acidificada com ácido cítrico a 5%. A fase aquosa foi extraída três vezes com 25 ml de acetato de etila, lavada com NaCl saturado e seca em MgSO4. A filtração e evaporação gerou 635 mg de um sólido bruto.

[00157] O produto bruto foi purificado por cromatografia em modo flash em uma coluna de 330 g de gel de sílica (comprimento de onda de detecção 254 nm) com um gradiente de CH2Cl2 + ácido acético a 1% para CH2Cl2/MeOH (15:1) + ácido acético a 1% e gerou, após coevaporação com tolueno, 564,4 mg (56% de rendimento) de um pó branco.

[00158] MS (ESI-) encontrado: 361,08 [M-H]-; calculado: 362,15 (C18H22N2O6)

2. PREPARAÇÃO DE CIS,TRANS-1-(TERC-BUTOXICARBONIL)- 2-CARBOXI-3A-HIDROXI-6-ACETOXI-1,2,3,3A,8,8A-HEXA- HIDROPIRROLO[2,3-B]INDOL CIS-HDP 30.2555 E TRANS HDP 30.2555 (CIS,TRANS-6-ACETOXI-HPI)

FOTO-OXIGENAÇÃO

[00159] A foto-oxigenação foi realizada com uma lâmpada de vapor de sódio de alta pressão de 400 W (lâmpada Sirius X400, 230 V, 400 W; 55.000 lúmens a uma distância de 1,3 m) ou, alternativamente, com uma lâmpada de tungstênio-halogênio (500 W). Uma solução filtrante (CuCl2-CaCO3) que corta a luz com < 490 nm é usada para uma lâmpada de tungstênio-halogênio.

[00160] Azul de metileno ou rosa bengala é usado como um sensibilizador de corante.

[00161] A reação foi realizada em um vaso de reação cilíndrico de 500 ml com camisa de troca de calor produzida a partir de vidro de borossilicato DURAN®, fundo plano e flange de laboratório plano (DN) com dois conectores com rosca GL 18. A distância da lâmpada ao vaso de reação foi de 15 cm, e a temperatura de reação estava em uma faixa de 3 a 4 °C.

[00162] O produto final foi purificado em um sistema de cromatografia Teledyne ISCO Flash com uma coluna de 330 g de sílica Redi

Sept Flash (Teledyne ISCO cat. 69-2203-330). Os solventes CH2Cl2, CH3OH, CH3COOH eram HPLC padrão ou grau BP.

[00163] Oxigênio seco (99,5% de pureza) foi levado ao borbulhamento através da mistura de reação com uma taxa de 2 a 4 l por minuto.

[00164] 943,0 mg (2,60 mmol) de N-(terc-butoxicarbonil)-L-6- acetoxi-triptofano HDP 30.2550 e 100 mg de rosa bengala foram dissolvidos em 500 ml de metanol e resfriados a 3 °C com o uso de um criostato Huber com glicol/água como meios de resfriamento. A solução de reação foi irradiada com a lâmpada de vapor de sódio de alta pressão de 400 W. Durante a irradiação, uma corrente de oxigênio lenta foi levada ao borbulhamento através da solução de reação. Após 5 horas de irradiação, a oxigenação e o resfriamento foram interrompidos e os meios de reação foram tratados com 10 ml de sulfeto de dimetila. A mistura foi agitada por 2 horas e evaporada até secura com o uso de um evaporador giratório com uma temperatura de banho de água de 35 °C. O resíduo vermelho escuro foi seco novamente em alto vácuo até um sólido cristalizado de 1,20 g. O produto bruto foi purificado em uma coluna de 330 g de gel de sílica (comprimento de onda de detecção 254 nm) com um gradiente de CH2Cl2 + ácido acético a 5% para CH2Cl2/MeOH (30:1) + ácido acético a 5%. 380 mg de cis-HDP 30.2555 e 290 mg de trans- HDP 30.2555 foram eluídos e coevaporados com tolueno. Após a liofilização em terc-butanol, ambos os isômeros foram obtidos como pós esbranquiçados.

[00165] cis-1-(terc-butoxicarbonil)-2-carboxi-3a-hidroxi-6-acetoxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol (cis-HDP 30.2555)

[00166] 380 mg de cis-HDP 30.2555 rendeu: 39%

[00167] RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, = ppm)

[00168] = 1,22, 1,44, 1,54 [s, 9H, C(CH3)3]; 2,23 (s, 3H, OCOCH3); 2,46-2,63 (m, 2H, CH2); 4,14-4,29 (m, 1H, 2-H); 5,35 (s, 1H, 8a-H); 6,39-6,46 (m, 2H, 7-H, 5-H); 7,20- 7,24 (m, 1H, 4-H)

[00169] RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, =ppm)

[00170] = 20,93, 28,45, 31,12, 42,80, 61,12, 69,44, 82,21, 85,82,

87,93, 104,97, 112,98, 124,84, 129,42, 151,51, 154,04, 155,97, 171,34, 175,79

[00171] MS (ESI+) encontrado: 378,92 [MH]+; calculado: 378,14 (C18H22N2O7)

[00172] MS (ESI+) encontrado: 401,17 [M+Na]+; calculado: 401,14 (C18H22N2NaO7)

[00173] UV/VIS (CH3OH): max = 296 nm, 239 nm, 215 nm

[00174] min = 266 nm, 227 nm

[00175] trans-1-(terc-butoxicarbonil)-2-carboxi-3a-hidroxi-6-acetoxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol (trans-HDP 30.2555)

[00176] 290 mg de trans-HDP 30.2555 rendeu: 30%

[00177] RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, =ppm)

[00178] = 1,22, 1,45, 1,54 [s, 9H, C(CH3)3]; 2,22 (s, 3H, OCOCH3); 2,55-2,73 (m, 2H, CH2); 4,51-4,57 (m, 1H, 2-H); 5,21-5,24 (s, 1H, 8a-H); 6,36- 6,41 (m, 2H, 7-H, 5-H); 7,17- 7,18 (m, 1H, 4-H)

[00179] RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, =ppm)

[00180] = 20,95, 28,50, 31,12, 42,47, 60,97, 69,44, 82,06, 84,84, 87,54, 104,74, 112,67, 125,03, 128,70, 152,31, 154,22, 156,00, 171,23, 174,67

[00181] MS (ESI+) encontrado: 379,00 [MH]+; calculado: 378,14 (C18H22N2O7)

[00182] MS (ESI+) encontrado: 401,17 [M+Na]+; calculado: 401,14 (C18H22N2NaO7)

[00183] MS (ESI+) encontrado: 779,00 [2M+Na]+; calculado: 779,28 (C36H44N4Na2O14)

[00184] UV/VIS (CH3OH): max = 299 nm, 241 nm, 215 nm

[00185] min = 268 nm, 228 nm

3. PREPARAÇÃO DE S-DESOXI- -AMANITINA HDP 30.0735 ETAPA 1: HDP 30.0013

O OH O O O O

1. Cs2CO3 N O 85% MeOH N

O RT HO HO

2. AllBr

DMF

RT Com. Source HDP 30.0013

353.38 393.44 C20H19NO5 C23H23NO5

[00186] FmocHypOH (10,0 g, 28,3 mmol) foi suspenso em 100 de MeOH a 80%, e Cs2CO3 (4,6 g, 14,1 mmol) foi adicionado. A suspensão foi agitada a 50 °C por 30 minutos até dissolução completa. A mistura de reação foi concentrada até secura e redissolvida em 100 ml de DMF. Brometo de alila (1,6 ml, 3,6 g, 29,7 mmol) foi adicionado por gotejamento, e a reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. DMF foi removido por destilação, e o resíduo dissolvido em éter terc-butilmetílico. Os precipitados foram filtrados, e a solução transparente foi absorvida em celite antes da cromatografia de coluna. O composto foi purificado em 220 g de gel de sílica com gradiente de n- hexano/acetato de etila.

[00187] Rendimento: 11,5 g, 100% ETAPA 2: HDP 30.0400 g

[00188] HDP 30.0013 (5,0 g, 14,1 mmol) e 4-toluenossulfonato de piridínio (1,33 g, 5,3 mmol) foram adicionados a uma suspensão de resina de 1,3-di-hidro-2H-piran-2-il-metoximetila (5,0 g, 1,0 mmol/g de resina THP) em 40 ml de dicloroetano. A reação foi agitada a 80 °C durante a noite. Após o resfriamento, a resina foi filtrada e extensivamente lavada com dicloroetano, dimetilformamida, acetonitrila, diclorometano e éter terc-butilmetílico.

[00189] O carregamento foi de 0,62 mmol/g (determinado por espectroscopia UV do grupo fluorenometila após desproteção) ETAPA 3: HDP 30.2569 (SÍNTESE EM FASE SÓLIDA)

O O O O O

O OH O H2N O

PS N O N O O NH H O HN O O O S O N N O O H O O NH O N HO O N H

H H2N HDP 30.2569

1047.12 C45H62N10O17S PRÉ-TRATAMENTO DE RESINA:

[00190] HDP 30.0400 (0,31 g, 0,25 mmol) foi tratado com ácido N,N-

dimetilbarbitúrico (241 mg, 1,55 mmol) e Pd(PPh3)4 (35 mg, 0,03 mmol). A resina foi chacoalhada durante a noite à temperatura ambiente. Depois disso, a resina foi extensivamente lavada com diclorometano, DMF, acetonitrila, diclorometano e éter terc-butilmetílico e seca sob pressão reduzida. PROCEDIMENTO DE ACOPLAMENTO:

[00191] Todos os agentes de reação e reagentes foram dissolvidos em diclorometano/DMF (1:1, v/v). HDP 30.0477 [consultar o documento no WO 2014/009025] (102 mg, 0,30 mmol) foi dissolvido em 6,0 ml de diclorometano/N,N-dimetilformamida e tratado com 4,0 ml de uma solução 0,2 N de PyBOP/ HOBt e 2 ml de DIEA (40% em DMF). Após a adição de 2,0 ml de N,N-dimetilformamida, a reação foi aquecida a 50 °C durante 8 minutos por irradiação de micro-ondas (20 W, reator de micro-ondas CEM) e foi lavada com N,N-dimetilformamida após o acoplamento. Desproteção de FMOC:

[00192] A desproteção foi realizada por adição de 6,0 ml de piperidina a 20% em N,N-dimetilformamida a 50 °C por 10 minutos. A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (sem desproteção após o acoplamento do aminoácido final).

[00193] Todos os outros aminoácidos foram acoplados seguindo o protocolo acima, e as ponderações são mostradas abaixo: (0,102 g, 0,30 MW: 339,6, 1,5 eq HDP 30.0477 mmol consultar acima) 0,72 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocAsn(Trt)OH MW: 599,7 0,71 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocCys(OTrt)OH MW: 586,7 0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocGlyOH MW: 297,3 0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocIleOH MW: 353,4 0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocGlyOH MW: 297,3 0,114 g, 0,30 mmol 1,5 eq HDP 30.2555 MW: 378,4

[00194] Após a conclusão, a resina foi finalmente transferida para uma seringa com fundo frito, lavada com DCM e seca sob pressão reduzida.

LIBERAÇÃO DE RESINA E FORMAÇÃO DO ANEL B

[00195] Uma solução de 5 ml de TFA, 5 ml de DCM mais MeOH a 10% foi aspirada para a resina e chacoalhada por 15 min à temperatura ambiente. A solução foi dispensada em um frasco de reação de 50 ml, e a resina lavada com TFA/DCM 1:1 mais MeOH a 10% uma vez e vertida no mesmo frasco. O frasco de reação foi agitado por 16 h. Tri-isopropilsilano (0,5 ml) foi adicionado, e a reação concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em 500 µl de MeOH, e o peptídeo precipitado em 50 ml de TBME gelado. Após a centrifugação, o sobrenadante foi decantado, e o precipitado lavado uma vez com 50 ml de TBME e seco sob pressão reduzida.

[00196] O precipitado foi solubilizado em 2 ml de metanol e purificado por cromatografia de coluna preparativa de fase reversa. Metanol foi removido por destilação sob pressão reduzida, e a fase aquosa restante foi seca por congelamento.

[00197] Rendimento: 136,5 mg, 62,5%

[00198] MS (ESI+) encontrado: 1.047,4 [M+H]+; calculado: 1.047,4 (C45H63N10O17S)

[00199] HPLC: 91,9% de área Etapa 4: CICLIZAÇÃO (FORMAÇÃO DE ANEL A, HDP 30.2572)

O O O O O O

OH O H O H2N O N O

O N O N O NH H HN O NH H HN O S O S O O N N O O H O O N N O O H O O NH NH O N O N HO O N H HO O N H

H H H2N H2N HDP 30.2569 HDP 30.2572

1047.12 1029.10 C45H62N10O17S C45H60N10O16S

[00200] O intermediário monocíclico seco por congelamento acima (136 mg, 130 µmol) foi dissolvido em 16 ml de DMF e tratado com difenilfosforilazida (DPPA, 131 µl, 1.300 µmol, 10 eq) e di-isopropiletilamina (DIEA, 162 µl, 1.300 µmol, 10 eq). A reação foi agitada por 16 h e arrefecida bruscamente com 500 µl de água após a conclusão. A conversão foi monitorada por HPLC. A mistura foi concentrada por pressão reduzida, redissolvida em 1 ml de metanol e purificada por cromatografia de coluna preparativa de fase reversa.

[00201] Rendimento: 55,3 mg, 41%

[00202] MS (ESI+) encontrado: 1.029,33 [M+Na]+; calculado:

1.030,10 (C45H61N10O16S)

[00203] HPLC: 99,2% de área ETAPA 5: DESPROTEÇÃO DE ACETATO (HDP 30.0735)

O OH O O O H O H O N O N O N O OH NH H O N HN O NH H HN HO S O O S N N O O H O O N N O O H O O NH NH N O N HO O N H

HO O N H H H H2N H2N HDP 30.2572 HDP 30.0735

1029.1 902.9 C45H60N10O16S C39H54N10O13S

[00204] HDP 30.2572 (55,3 mg, 53,7 µmol) foi dissolvido em uma solução de NH3 metanólico 7 N (3,0 ml) e agitado. A conversão foi verificada por HPLC/MS. Após a conclusão (6 a 8 h), a reação foi concentrada a vácuo, ressuspensa em 100 µl de MeOH e purificada por HPLC preparativa.

[00205] Rendimento: 14,1 mg, 29%

[00206] HPLC: 100 %

[00207] MS (ESI+) encontrado: 903,3 [M+H]+; calculado: 902,9 (C39H54N10O13S)

[00208] encontrado: 925,33 [M+Na]+

4. PREPARAÇÃO DE 6’-((3-Maleidopropanamido)-Val-Ala-PAB)- S-DESOXI- -AMANITINA (HDP 30.2371)

ETAPA 1: HDP 30.2364 Br O H boc

N N N H O

HO O OH HO Si HO

O O H H N O N O O HN O

N H HDP 30.1690 O

HN O N H HN

586.65 g/mol HN

HO N HO N S

O O C26H44BrN3O5Si HO

N O N S O O H H H H N NH N NH O N O N

O H Cs2CO3 O O

H

O H O DMA boc

N N

N NH2 H NH2

O

O HDP 30.0735 Si HDP 30.2364

902.99 g/mol

1408.72 g/mol C39H54N10O13S C65H97N13O18SSi

[00209] S-Desoxi- -amanitina HDP 30.0735 (30 mg, 33,2 µmol) e HDP 30.1690 (documento no WO 2016/142049, 78 mg, 133 µmol = 4,0 eq.) foram dissolvidos em 1.500 µl de dimetilacetamida seca (DMA). Uma solução de hidrogenocarbonato de césio 0,2 M em água (199 µl, 1,2 eq.) foi adicionada em uma porção, e a mistura é agitada à temperatura ambiente. Após 1,5 e 4 h, porções adicionais de 99 µl (0,6 eq.) de solução de carbonato de césio foram adicionadas.

[00210] Após 18 h, o solvente foi evaporado por alto vácuo.

[00211] O resíduo foi dissolvido em 400 µl de metanol e adicionado por gotejamento a MTBE resfriado com gelo (10 ml). Após permanecer a 0 °C por 10 min, o precipitado resultante foi isolado por centrifugação (4 min, 4.000 × g). O sobrenadante foi descarregado, e o pélete foi ressuspenso em MTBE adicional (10 ml) e repetiu-se a centrifugação. O produto bruto seco a vácuo foi dissolvido em 400 µl de metanol e purificado por HPLC preparativa em um Phenomenex Luna-C18(2), coluna de 10 µm (250 x 21,2 mm) com um gradiente de metanol a 5% a 100% em água. Frações do produto foram combinadas e reduzidas para 23 mg (70%) do produto como sólido amorfo.

[00212] MS (ESI+) [M+Na]+ encontrado: 1.430,58; calculado:

1.430,65 (C65H97N13NaO18SSi)

[00213] Através da evaporação do pico de eluição precoce, 5 mg (17%) do material de partida foram recuperados. ETAPA 2: HDP 30.2366

OH OH HO O HO O H H N O N O HN N HN N O

O H 1. TFA O

O H HN HN

2. NH3

S S N N O N N O HO O H O HO O H O H H N NH N NH O N O N H H O O O O

H O H O boc N N N N H2N N H NH2 H NH2

O O

O HDP 30.2364 HDP 30.2366 Si

1408.72 g/mol 1178.34 g/mol C65H97N13O18SSi C54H75N13O15S TFA salt: 1292.36

[00214] HDP 30.2364 (9,47 mg, 6,72 µmol) foi dissolvido em 750 µl de ácido trifluoroacético (TFA). Após 2 min, os voláteis são removidos a vácuo, e o resíduo foi dissolvido em 750 µl de água, e amônia a 3% é adicionada por gotejamento até que um pH de 10 tenha sido alcançado e a precipitação tenha ocorrido.

[00215] A solução foi seca por congelamento e purificada em HPLC preparativa subsequentemente (Phenomenex Luna-C18(2), coluna de 10 µm 250 x 21,2 mm, gradiente de 5 a 100% de metanol (TFA a 0,05%) em água (TFA a 0,05%) para gerar 7,72 mg (89% com base em sal de TFA) do produto.

[00216] MS (ESI+) [MH]+ encontrado: 1.178,42; calculado: 1.178,53 (C54H76N13O15S) ETAPA 3 HDP 30.2371

[00217] HDP 30.2366 (4,01 mg, 3,10 µmol) foi dissolvido em 500 µl de DMF seco.

[00218] Éster de N-hidroxissuccinimida de ácido 3- (maleimido)propiônico (BMPS, 1,65 mg, 2 eq.), dissolvido em 100 µl de DMF, seguido por 2,1 µl de DIPEA foram adicionados.

[00219] Após agitação por 1 h, a mistura de reação foi despejada em 10 ml de éter metil-terc-butílico resfriado em gelo. O tubo foi mantido em gelo por 10 min e centrifugado a 4.000 × g. O sobrenadante foi removido, e o pélete foi lavado com 10 ml de éter metil-terc-butílico fresco.

[00220] O pélete seco a vácuo foi purificado por RP-18 HPLC com um gradiente de metanol a 5 a 100% em água. As frações puras foram evaporadas até secura e liofilizadas a partir de 1 ml de terc-butanol/água para gerar 2,70 mg (65%) do produto como um pó incolor.

[00221] MS (ESI+) [MH]+ encontrado: 1.329,3; calculado: 1.329,6 (C61H81N14O18S)

[00222] [M+Na]+ encontrado: 1.351,5; calculado: 1.351,5 (C61H80N14NaO18S) B. SÍNTESE TOTAL DE S-DESOXI-5’-HIDROXI-AMANINAMIDA HDP 30.2548

OH HO O H N O HN N O H O HN HO S N N O HO H O H N NH O N H O

O NH2 HDP 30.2548

1. PREPARAÇÃO DE N-(TERC-BUTOXICARBONIL)-L-5- ACETOXI-TRIPTOFANO HDP 30.2531

O HO O O O

OH OH NH2 HN O

N N H H

O HDP 30.2531

[00223] 800,0 mg (3,63 mmol) de 5-hidroxi-L-triptofano (número CAS: 4350-09-8) foram suspensos em uma mistura de 40 ml de 1,4- dioxano/água 1:1 (v:v). Sob argônio, 3,64 ml (3,64 mmol) de NaOH 1 N foram adicionados de uma vez à temperatura ambiente. A solução amarela resultante foi, então, tratada com 779,0 µl (794,0 mg, 3,63 mmol) de Boc anidrido (Boc2O) e agitada por 24 horas à temperatura ambiente. A solução foi acidificada com ácido clorídrico 1 N até pH 2,4 e extraída 3 vezes com 35 ml de acetato de etila. Os extratos de acetato de etila combinados foram lavados com solução de NaCl saturada e secos em MgSO4. A filtração e evaporação até secura gerou 1,26 g de material bruto. O N-Boc-6-hidroxi-L-triptofano bruto foi dissolvido em 7,87 ml (7,87 mmol) de NaOH 1 N e tratado com 743,0 µl (802,4 mg, 7,86 mmol) de acetanidrido. A mistura de reação foi agitada por 3 horas sob argônio e acidificada com ácido cítrico a 5%. A fase aquosa foi extraída três vezes com 25 ml de acetato de etila, lavada com NaCl saturado e seca em MgSO4. Filtração e evaporação.

[00224] O sólido bruto foi purificado por cromatografia em modo flash em uma coluna de 330 g de gel de sílica (comprimento de onda de detecção 254 nm) com um gradiente de CH2Cl2 + ácido acético a 1% para CH2Cl2/MeOH (15:1) + ácido acético a 1% e gerou, após coevaporação com tolueno, 1.020,0 mg (78% de rendimento) de um pó branco.

[00225] MS (ESI-) encontrado: 361,08[M-H]-; calculado: 362,15 (C18H22N2O6)

[00226] RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, = ppm)

[00227] = 1,39 (s, 9H, C(CH3)3); 2,27 (s, 3H, OCOCH3); 3,08-3,31 (m, 2H, CH2); 4,39-4,41 (m, 1H, 2-H); 6,81-6,83; 7,13; 7,24-7,26 (m, 2H, 6-H, 7- H); 7,30- 7,32 (1H, 4-H)

2. PREPARAÇÃO DE CIS,TRANS-1-(TERC-BUTOXICARBONIL)- 2-CARBOXI-3A-HIDROXI-5-ACETOXI-1,2,3,3A,8,8A-HEXA- HIDROPIRROLO[2,3-B]INDOL CIS-HDP 30.2536 E TRANS HDP 30.2536 (CIS,TRANS-5-ACETOXI-HPI)

FOTO-OXIGENAÇÃO

[00228] A foto-oxigenação foi realizada com uma lâmpada de vapor de sódio de alta pressão de 400 W (lâmpada Sirius X400, 230 V, 400 W; 55.000 lúmens a uma distância de 1,3 m) ou, alternativamente, com uma lâmpada de tungstênio-halogênio (500 W). Uma solução filtrante (CuCl2-CaCO3) que corta a luz com < 490 nm é usada para uma lâmpada de tungstênio-halogênio.

[00229] Azul de metileno ou rosa bengala é usado como um sensibilizador de corante. A reação foi realizada em um vaso de reação cilíndrico de 500 ml com camisa de troca de calor produzida a partir de vidro de borossilicato DURAN®, fundo plano e flange de laboratório plano (DN) com dois conectores com rosca GL 18. A distância da lâmpada ao vaso de reação foi de 15 cm, e a temperatura de reação estava em uma faixa de 3 a 4 °C.

[00230] O produto final foi purificado em um sistema de cromatografia Teledyne ISCO Flash com uma coluna de 330 g de sílica Redi Sept Flash (Teledyne ISCO cat. 69-2203-330). Os solventes CH2Cl2, CH3OH,

CH3COOH eram HPLC padrão ou grau BP.

[00231] Oxigênio seco (99,5% de pureza) foi levado ao borbulhamento através da mistura de reação com uma taxa de 2 a 4 l por minuto.

[00232] 1,20 g (3,17 mmol) de N-(terc-butoxicarbonil)-L-5-acetoxi- triptofano HDP 30.2531 e 100 mg de rosa bengala foram dissolvidos em 500 ml de metanol e resfriados a 3 °C com o uso de um criostato Huber com glicol/água como meios de resfriamento. A solução de reação foi irradiada com a lâmpada de vapor de sódio de alta pressão de 400 W. Durante a irradiação, uma corrente de oxigênio lenta foi levada ao borbulhamento através da solução de reação. Após 4 horas de irradiação, a oxigenação e o resfriamento foram interrompidos e os meios de reação foram tratados com 20 ml de sulfeto de dimetila. A mistura foi agitada por 2 horas e evaporada até secura com o uso de um evaporador giratório com uma temperatura de banho de água de 35 °C. O resíduo vermelho escuro foi seco adicionalmente em alto vácuo até um sólido cristalizado. O produto bruto foi purificado em uma coluna de 330 g de gel de sílica (comprimento de onda de detecção 254 nm) com um gradiente de CH2Cl2 + ácido acético a 5% para CH2Cl2/MeOH (30:1) + ácido acético a 5%.

[00233] 178 mg de cis-HDP 30.2536 e 132 mg de trans-HDP

30.2536 foram eluídos e coevaporados com tolueno. Após a liofilização em terc- butanol, ambos os isômeros foram obtidos como pós esbranquiçados.

[00234] cis-1-(terc-butoxicarbonil)-2-carboxi-3a-hidroxi-5-acetoxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol ( cis-HDP 30.2536 )

[00235] 178 mg de cis-HDP 30.2536 rendeu: 15%

[00236] RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, =ppm)

[00237] = 1,44, 1,54 ( s, 9H, C(CH3)3 ); 2,23 (s, 3H, OCOCH3); 2,45- 2,62 (m, 2H, CH2); 4,18-4,33 (m, 1H, 2-H); 5,37 (s, 1H, 8a-H); 6,63-6,67; 6,82- 6,84; (m, 2H, 7-H, 6-H); 6,96- 6,98 (m, 1H, 4-H)

[00238] RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, = ppm)

[00239] = 20,86, 28,46, 31,12, 42,81, 61,21, 82,14, 85,60, 111,49, 117,83, 123,98, 132,77, 144,99, 148,03, 156,07, 172,01, 175,89

[00240] MS (ESI+) encontrado: 379,00 [MH]+; calculado: 378,14 (C18H22N2O7)

[00241] MS (ESI+) encontrado: 401,17 [M+Na]+; calculado: 401,14 (C18H22N2NaO7)

[00242] MS (ESI-) encontrado: 377,17 [M-H]-; calculado: 378,14 (C18H22N2O7)

[00243] UV/VIS ( CH3OH ): max = 299 nm, 242 nm, 207 nm

[00244] min = 270 nm, 222 nm

[00245] trans-1-(terc-butoxicarbonil)-2-carboxi-3a-hidroxi-5-acetoxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol (trans-HDP 30.2536)

[00246] 132 mg de trans-HDP 30.2536 rendeu: 11%

[00247] RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, = ppm)

[00248] = 1,47, 1,54 [s, 9H, C(CH3)3]; 2,21 (s, 3H, OCOCH3); 2,50- 2,70 (m, 2H, CH2); 4,51-4,56 (m, 1H, 2-H); 5,22-5,26 (s, 1H, 8a-H); 6,58-6,63; 6,80-6,81 (m, 6-H, 7-H); 6,92 ( s, 1H, 4-H )

[00249] RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, = ppm)

[00250] = 20,88, 28,50, 31,12, 42,60, 61,11, 82,05, 85,38, 111,26, 117,88, 124,07, 131,94 144,66, 148,95, 156,11, 172,01, 174,81

[00251] MS (ESI+) encontrado: 379,00 [MH]+; calculado: 378,14 (C18H22N2O7)

[00252] MS (ESI+) encontrado: 401,17 [M+Na]+; calculado: 401,14 (C18H22N2NaO7)

[00253] MS (ESI-) encontrado: 377,17 [M-H]-; calculado: 378,14 (C18H22N2O7)

[00254] UV/VIS (CH3OH): max = 302 nm, 244 nm, 208 nm

[00255] min = 272 nm, 224 nm

3. PREPARAÇÃO DE S-DESOXI-5’-HIDROXI-AMANINAMIDA HDP 30.2548 ETAPA 1: HDP 30.0013

O OH O O O O

1. Cs2CO3 N O 85% MeOH N

O RT HO HO

2. AllBr

DMF

RT Com. Source HDP 30.0013

353.38 393.44 C20H19NO5 C23H23NO5

[00256] FmocHypOH (10,0 g, 28,3 mmol) foi suspenso em 100 de MeOH a 80%, e Cs2CO3 (4,6 g, 14,1 mmol) foi adicionado. A suspensão foi agitada a 50 °C por 30 minutos até dissolução completa. A mistura de reação foi concentrada até secura e redissolvida em 100 ml de DMF. Brometo de alila (1,6 ml, 3,6 g, 29,7 mmol) foi adicionado por gotejamento, e a reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. DMF foi removido por destilação, e o resíduo dissolvido em éter terc-butilmetílico. Os precipitados foram filtrados, e a solução transparente foi absorvida em celite antes da cromatografia de coluna. O composto foi purificado em 220 g de gel de sílica com gradiente de n- hexano/acetato de etila. RENDIMENTO: 11,5 g, 100% ETAPA 2: HDP 30.0400

O O O O O O

N PS N O THP-Resin O

PPTS O

HO O O 80°C HDP 30.0013 HDP 30.0400

393.44 393.44 C23H23NO5 C23H23NO5

[00257] HDP 30.0013 (5,0 g, 14,1 mmol) e 4-toluenossulfonato de piridínio (1,33 g, 5,3 mmol) foram adicionados a uma suspensão de resina de 1,3-di-hidro-2H-piran-2-il-metoximetila (5,0 g, 1,0 mmol/g de resina THP) em 40 ml de dicloroetano. A reação foi agitada a 80 °C durante a noite. Após o resfriamento, a resina foi filtrada e extensivamente lavada com dicloroetano, dimetilformamida, acetonitrila, diclorometano e éter terc-butilmetílico.

[00258] O carregamento foi de 0,62 mmol/g (determinado por espectroscopia UV do grupo fluorenilmetila após desproteção) ETAPA 3: HDP 30.2544 (SÍNTESE EM FASE SÓLIDA)

O O O O O

O OH O H2N O

PS N O N O O NH H O O HN O O O S O N N O O H O O NH N HO O N H

H H2N HDP 30.2544

1047.12 C45H62N10O17S PRÉ-TRATAMENTO DE RESINA:

[00259] HDP 30.0400 (0,31 g, 0,25 mmol) foi tratado com ácido N,N- dimetilbarbitúrico (241 mg, 1,55 mmol) e Pd(PPh3)4 (35 mg, 0,03 mmol). A resina foi chacoalhada durante a noite à temperatura ambiente. Depois disso, a resina foi extensivamente lavada com diclorometano, DMF, acetonitrila, diclorometano e éter terc-butilmetílico e seca sob pressão reduzida. PROCEDIMENTO DE ACOPLAMENTO:

[00260] Todos os agentes de reação e reagentes foram dissolvidos em diclorometano/DMF (1:1, v/v). HDP 30.0477 [consultar o documento no WO 2014/009025] (102 mg, 0,30 mmol) foi dissolvido em 6,0 ml de diclorometano/N,N-dimetilformamida e tratado com 4,0 ml de uma solução 0,2 N de PyBOP/HOBt e 2 ml de DIEA (40% em DMF). Após a adição de 2,0 ml de N,N-dimetilformamida, a reação foi aquecida a 50 °C durante 8 minutos por irradiação de micro-ondas (20 W, reator de micro-ondas CEM) e foi lavada com N,N-dimetilformamida após o acoplamento. Desproteção de FMOC:

[00261] A desproteção foi realizada por adição de 6,0 ml de piperidina a 20% em N,N-dimetilformamida a 50 °C por 10 minutos. A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (sem desproteção após o acoplamento do aminoácido final).

[00262] Todos os outros aminoácidos foram acoplados seguindo o protocolo acima, e as ponderações são mostradas abaixo: (0,102 g, 0,30 MW: 339,6, 1,5 eq HDP 30.0477 mmol consultar acima) 0,72 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocAsn(Trt)OH MW: 599,7 0,71 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocCys(OTrt)OH MW: 586,7 0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocGlyOH MW: 297,3 0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocIleOH MW: 353,4 0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq FmocGlyOH MW: 297,3 0,114 g, 0,30 mmol 1,5 eq HDP 30.2536 MW: 378,4

[00263] Após a conclusão, a resina foi finalmente transferida para uma seringa com fundo frito, lavada com DCM e seca sob pressão reduzida.

LIBERAÇÃO DE RESINA E FORMAÇÃO DO ANEL B

[00264] Uma solução de 5 ml de TFA, 5 ml de DCM mais MeOH a 10% foi aspirada para a resina e chacoalhada por 15 min à temperatura ambiente. A solução foi dispensada em um frasco de reação de 50 ml, e a resina lavada com TFA/DCM 1:1 mais MeOH a 10% uma vez e vertida no mesmo frasco. O frasco de reação foi agitado por 16 h. Tri-isopropilsilano (0,5 ml) foi adicionado, e a reação concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em 500 µl de MeOH, e o peptídeo precipitado em 50 ml de TBME gelado. Após a centrifugação, o sobrenadante foi decantado, e o precipitado lavado uma vez com 50 ml de TBME e seco sob pressão reduzida.

[00265] O precipitado foi solubilizado em 2 ml de metanol e purificado por cromatografia de coluna preparativa de fase reversa. Metanol foi removido por destilação sob pressão reduzida, e a fase aquosa restante foi seca por congelamento.

[00266] Rendimento: 75,1 mg, 35,9%

[00267] MS (ESI+) encontrado: 1.047,4 [M+H]+; calculado: 1.047,4 (C45H63N10O17S)

[00268] HPLC: 99,3% de área ETAPA 4: CICLIZAÇÃO (FORMAÇÃO DE ANEL A, HDP 30.2546)

O O O O O O

OH O H O H2N O N O

O N O N O O NH H HN O O NH H HN O S O S O N N O O H O O O N N O O H O O NH NH N N HO O N H HO O N H

H H H2N H2N HDP 30.2544 HDP 30.2546

1047.12 1029.10 C45H62N10O17S C45H60N10O16S

[00269] O intermediário monocíclico seco por congelamento acima (49,4 mg, 47,2 µmol) foi dissolvido em 3 ml de DMF e tratado com difenilfosforilazida (DPPA, 13 µl, 237 µmol, 5 eq) e di-isopropiletilamina (DIEA, 40 µl, 237 µmol, 5 eq). A reação foi agitada por 16 h e arrefecida bruscamente com 500 µl de água após a conclusão. A conversão foi monitorada por HPLC. A mistura foi concentrada por pressão reduzida, redissolvida em 1 ml de metanol e purificada por cromatografia de coluna preparativa de fase reversa.

[00270] Rendimento: 32,5 mg, 67,9%

[00271] MS (ESI+) encontrado: [M+H]+ 1.029,33 [MH]+ 1.051,3 [M+Na]+; calculado: 1.029,39; 1051.42 (C45H61N10O16S; C45H60N10O16SNa)

[00272] HPLC: 88,3% de área ETAPA 5: DESPROTEÇÃO DE ACETATO (HDP 30.2548)

O OH O O O H O H O N O N N O O H N OH NH HN O H O NH HN HO S O O S N N O O H O O N N O O H O O NH NH N O N HO O N H HO O N H H

H H2N H2N HDP 30.2546 HDP 30.2548

1029. 1 902. 9 C45H60N10O16S C39H54N10O13S

[00273] HDP 30.2546 (23,4 mg, 22,7 µmol) foi dissolvido em uma solução de NH3 metanólico 7 N (2,3 ml) e agitado. A conversão foi verificada por HPLC/MS. Após a conclusão (6 a 8 h), a reação foi concentrada a vácuo, ressuspensa em 100 µl de MeOH e purificada por HPLC preparativa.

[00274] Rendimento: 12,5 mg, 53,3%

[00275] HPLC: 99%

[00276] MS (ESI+) encontrado: 903,4 [M+H]+; calculado: 902,9 (C39H54N10O13S)

[00277] encontrado: 925,4 [M+Na]+

5. PREPARAÇÃO DE 5’-((3-MALEIDOPROPANAMIDO)-VAL- ALA-P-AMININOBENZILOXI)-S-DESOXI-AMANINAMIDA (HDP 30.2602) ETAPA 1: HDP 30.2563 Si

HO O OH O H

N N boc N HO

HO O H O H

N O Cs2CO3 O H

N O HN N HN N O O H HN DMA O O O H HN HO S S N N O N N O HO O HO H O H H H N NH N NH

O N O N Br O H

H H O O boc O

O N N N H

O NH2 NH2

O HDP 30.2548 Si HDP 30.1690 HDP 30.2563

902.99 g/mol 586.65 g/mol 1408.72 g/mol C39H54N10O13S C26H44BrN3O5Si C65H97N13O18SSi

[00278] S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida HDP 30.2548 (9,66 mg, 10,7 µmol) e HDP 30.1690 (documento no WO 2016/142049, 50,2 mg, 85,6 µmol

= 8,0 eq.) foram dissolvidos em 500 µl de dimetilacetamida seca (DMA). Uma solução de hidrogenocarbonato de césio 1,0 M em água (17,12 µl, 1,6 eq.) foi adicionada em uma porção, e a mistura é agitada à temperatura ambiente.

[00279] Após 1,5 h, porções adicionais de 17,12 µl (1,6 eq.) de solução de carbonato de césio foram adicionadas.

[00280] Após 8 h, a mistura de reação foi neutralizada com ácido acético, passada através de um filtro centrifugo (0,2 µm) e purificada por HPLC em um Phenomenex Luna-C18(2), coluna de 10 µm (250 x 21,2 mm) com um gradiente (5 a 100%) de acetonitrila em água. Frações do produto foram combinadas e reduzidas para 4,00 mg (26%) do produto como sólido amorfo.

[00281] MS (ESI+) [M+Na]+ encontrado: 1.430,58; calculado:

1.430,65 (C65H97N13NaO18SSi) ETAPA 2: HDP 30.2378

[00282] HDP 30.2563 (7,53 mg, 5,34 µmol) foi dissolvido em 500 µl de uma mistura de ácido trifluoroacético/água/tri-isopropilsilano 95:5:5. Após 5 min, os voláteis foram removidos a vácuo, e o resíduo foi dissolvido em 1.000 µl de água, e amônia a 3% foi adicionada por gotejamento até que um pH de 10 tenha sido alcançado.

[00283] A solução foi seca por congelamento e purificada em HPLC preparativa subsequentemente (Phenomenex Luna-C18(2), coluna de 10 µm 250 x 21,2 mm, gradiente de 20 a 30% em 16 min de acetonitrila em água (TFA a

0,05%) para gerar 3,95 mg (57% com base em sal de TFA) do produto.

[00284] MS (ESI+) [M+H]+ encontrado: 1.178,50; calculado: 1.178,53 (C54H76N13O15S) ETAPA 3 HDP 30.2602

[00285] HDP 30.2578 (3,95 mg, 3,06 µmol) foi dissolvido em 400 µl de DMF seco.

[00286] Éster de N-hidroxissuccinimida de ácido 3- (maleimido)propiônico (BMPS, 1,63 mg, 2 eq.), dissolvido em 81,4 µl de DMF, seguido por 2,1 µl (2 eq.) de DIPEA foram adicionados.

[00287] Após agitação por 2 h, a mistura de reação foi passada através de um filtro centrifugo (0,2 µm) e purificada por RP-18 HPLC com um gradiente de acetonitrila a 5 a 70% em água + TFA a 0,05%. As frações puras foram evaporadas até secura e liofilizadas a partir de 2 ml de acetonitrila/água 1:1 para gerar 2,73 mg (67%) do produto como um pó incolor.

[00288] MS (ESI+) [M+H]+ encontrado: 1.329,33; calculado: 1.329,56 (C61H81N14O18S) C. SÍNTESE TOTAL DE S-DESOXI-4’-HIDROXI-AMANINAMIDA

OH O H O N O O OH N HO NH H HN S N N O O H O O NH N HO O N H

H H2N

1. VISTA ESQUEMÁTICA DA SÍNTESE DE CIS,TRANS-1-(TERC- BUTOXICARBONIL)-2-CARBOXI-3A-HIDROXI-4-ACETOXI-1,2,3,3A,8,8A- HEXA-HIDROPIRROLO[2,3-B]INDOL; CIS E TRANS (CIS,TRANS-4- ACETOXI-HPI)

2. VISTA ESQUEMÁTICA DA SÍNTESE DE S-DESOXI-4’- HIDROXI-AMANINAMIDA

O O O HO OH O N O O O N H O O OH

H O O O H2N

O PS N O OAc N

O O NH H HN O O O O S SPPS N N O O H O O NH N HO O N H

H H2N

O OH O H O O O N H O O N

O OH N O HO NH H O OAc N

HN O NH H HN S N O O O S N O O H NH N N O O H O O N NH HO O N H N H HO O N H

H H2N H2N D. SÍNTESE TOTAL DE S-DESOXI-7’-HIDROXI-AMANINAMIDA

1. SÍNTESE DE CIS,TRANS-1-(TERC-BUTOXICARBONIL)-2- CARBOXI-3A-HIDROXI-4-ACETOXI-1,2,3,3A,8,8A-HEXA- HIDROPIRROLO[2,3-B]INDOL; (CIS,TRANS-4-ACETOXI-HPI)

[00289] A síntese de cis,trans-7-acetoxi-Hpi é realizada em analogia à síntese de cis,trans-4-acetoxi-Hpi a partir de 7-hidroxi-L-triptofano comercialmente disponível, em vez de 4-hidroxi-L-triptofano.

2. VISTA ESQUEMÁTICA DA SÍNTESE DE S-DESOXI-7’- HIDROXI-AMANINAMIDA

[00290] A síntese de S-desoxi-7’-hidroxi-amaninamida é realizada em analogia à síntese de S-desoxi-4’-hidroxi-amaninamida com o uso de cis,trans-7-acetoxi-Hpi em vez de cis,trans-4-acetoxi-Hpi.

O HO OH O N O O O O O OH

O N H O H O H2N

O PS N O OAc O

N O NH H O HN O O S O SPPS N O H

N O O OAc NH

N HO OO N H

H H2N

O OH O H O O O N H O O N N O O H N OH NH HN O H O NH HN S N N O O O S O H NH N O H N O O

OH NH N OAc

HO OO N H N H HO OO N H

H H2N H2N

6. CITOTOXICIDADE IN VITRO DE S-DESOXI- -AMANITINA HDP

30.0735 E S-DESOXI-5’-HIDROXI-AMANINAMIDA HDP 30.2548 Ensaio de PROLIFERAÇÃO CELULAR BRDU EM células HEK293 e HEK293 OATP1B3.

[00291] Placas de cultura celular HEK293-OATP1B3 foram revestidas com poli-D-lisina. REVESTIMENTO COM POLI-D-LISINA:

[00292] 5 mg de poli-D-lisina em 50 ml de água estéril

[00293] 50 µl em cada poço de uma placa de 96 poços

[00294] Incubação por 1 h a TA

[00295] Lavagem de poços duas vezes com 200 µl de água estéril

[00296] Secagem por pelo menos 2 h (TA)

[00297] Placas pretas de 96 poços com fundo transparente com 2,0x103 células HEK293 e HEK293 OATP1B3/poço e 90 µl de meio de crescimento por poço, incluindo FCS a 10% e suplementos, foram preparadas. Controles: O “bloco bruto” foi configurado com 100 µl de meio sem células, “Plano de fundo” e “100%” foi configurado com células em 100 µl de meio.

[00298] • Incubação por 24 h a 37 °C e CO2 a 5%. ESQUEMA DE DILUIÇÃO DE HDP 30.0735, HDP 30.2548 E ALFA- AMANITINA:

[00299] As soluções de estoque foram diluídas 1:1.000 (diluição de 1:10 e 1:100) no meio:

[00300] 10 µl de solução de estoque de derivado de amanitina (1,0 x 10-2 M) + 90 µl de PBS =

[00301] 100 µl 1,0 x 10-3 M

[00302] 2 µl de diluição + 198 µl de meio = 200 µl 1x10-5 M

[00303] Diluições adicionais:

[00304] A: 200 µl 1,0x10-5 M

[00305] B: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução A (diluição de 1:5)

[00306] C: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução B (diluição de 1:5)

[00307] D: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução C (diluição de 1:5)

[00308] E: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução D (diluição de 1:5)

[00309] F: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução E (diluição de 1:5)

[00310] G: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução F (diluição de 1:5)

[00311] H: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução G (diluição de 1:5)

[00312] 10 µl de cada solução foram adicionados às triplicatas do poço.

[00313] Volume final: 100 µl/poço

[00314] Dose final: a partir de 1x10-6 M; série de diluição de 1:5.

[00315] • Incubação por 96 h a 37 °C e CO2 a 5%.

[00316] • Após 96 h: Ensaio de proliferação celular Roche, luminescente de acordo com as instruções do fabricante.

[00317] • Concentrações de EC50 foram determinadas com software de análise de dados Graphpad Prism 4.0.

7.: SÍNTESE DE conjugados HDP 30.2347, HDP 2371 E 30.2602 EXEMPLO: SÍNTESE DE T-D265C-30.2371:

[00318] 10 mg de Thiomab T-D265C em tampão de PBS foram usados para conjugação com HDP 30.2371.

[00319] Ajustar solução de anticorpo para EDTA 1 mM:

[00320] 2 ml de solução de anticorpo (10,0 mg) + 20 µl de EDTA 100 mM, pH 8,0

[00321] Quantidade de anticorpo: 10 mg = 6,9 x 10-8 mol

[00322] Destampagem de cisteínas por reação de anticorpo com 40 eq. de TCEP:

[00323] - 2 ml de solução de anticorpo (6,9x10-8 mol) + 55,2 µl de solução de TCEP 50 mM (2,76 x 10-6 mol)

[00324] - Incubar por 3 h a 37 °C em um agitador.

[00325] - Duas diálises consecutivas a 4 °C em 2,0 l de 1x PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4 em um cassete de diálise Slide-A-Lyzer 20.000 MWCO, primeira diálise de cerca de 4 h, segunda diálise durante a noite

[00326] Oxidação por reação de anticorpo com 20 eq. de ácido desidroascórbico (dhAA):

[00327] – cerca de 2 ml de solução de anticorpo (6,9 x 10-8 mol) + 27,6 µl de solução fresca de dhAA 50 mM (1,38 x 10-6 mol)

[00328] - Incubar por 3 h a TA em um agitador.

[00329] Conjugação com amanitina com o uso de 6 eq. de HDP

30.2371 e arrefecimento brusco com 25 eq. de N-acetil-L-cisteína:

[00330] Solubilizar 2 mg de HDP 30.2371 em 200 µl de DMSO = 10 µg/µl

[00331] – cerca de 2 ml de solução de anticorpo (= 9,5 mg; 6,53x10- 8 mol) + 52,1 µl de HDP 30.2371 (=520,8 µg; 3,92x10-7 mol).

[00332] - Incubados por 1 h a TÄ.

[00333] - Arrefecer bruscamente por adição de 16,3 µl de N-acetil-L- cisteína 100 mM (1,63 x 10-6 mol).

[00334] - Incubar por 15 min a TA (ou durante a noite a 4 °C).

[00335] - Purificar a mistura de reação com colunas 1x PD-10 equilibradas com 1 x PBS, pH 7,4. Identificar as frações contendo proteína com reagente Bradford em parafilme e unir as frações contendo proteína.

[00336] - Diálise de solução de anticorpo a 4 °C durante a noite em 2,0 l de PBS, pH 7,4 e cassetes de diálise Slide-A-Lyzer 20.000 MWCO.

[00337] Determinação de DAR por análise de LC-ESI-MS.

[00338] Ajustar a concentração de proteína para 5,0 mg/ml (3,4 x 10- 5 M) e levá-las a condições estéreis por filtração. Armazenar a 4 °C.

[00339] ADCs com um anticorpo diferente ou com um derivado de amanitina diferente foram produzidos em conformidade. A quantidade molecular de anticorpo foi calculada de acordo com o MW do respectivo anticorpo. As quantidades de toxina de ligante, TCEP, dhAA, N-acetil-L-cisteína foram ajustadas em conformidade para alcançar os respectivos equivalentes.

8. CITOTOXICIDADE IN VITRO DE conjugados HDP 30.2347, HDP 2371 E 30.2602 Ensaio DE PROLIFERAÇÃO CELULAR BRDU EM células KBR- 3, JIMT-1, LnCap E 22RV1:

[00340] O ensaio foi realizado conforme descrito acima (6.) com as seguintes alterações:

[00341] Placas de cultura celular não foram revestidas com poli-D- lisina.

[00342] • Esquema de diluição de ADCs:

[00343] • As soluções de estoque foram diluídas para 1,0x10-6 M em meio de crescimento

[00344] Diluições adicionais:

[00345] A: 100 µl 1,0 x 10-6 M

[00346] B: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução A (diluição de 1:5)

[00347] C: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução B (diluição de 1:5)

[00348] D: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução C (diluição de 1:5)

[00349] E: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução D (diluição de 1:5)

[00350] F: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução E (diluição de 1:5)

[00351] G: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução F (diluição de 1:5)

[00352] H: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução G (diluição de 1:5)

[00353] • 10 µl de cada solução foram adicionados às triplicatas do poço. Volume final: 100 µl/poço.

[00354] • Dose final: a partir de 1x10-7 M; série de diluição de 1:5

[00355] Ensaio WST-I em células Raji e células Nalm-6:

[00356] • Placas transparentes de 96 poços de fundo F com 2,0 x 103 células/poço e 90 µl do respectivo meio de crescimento por poço, incluindo FCS a 10% e suplementos, foram preparadas. Controles: O “bloco bruto” foi configurado com 100 µl de meio sem células; “apenas células” foram configuradas com células em 100 µl de meio.

[00357] • Incubação por 24 h a 37 °C e CO2 a 5%.

[00358] • Esquema de diluição de ADCs:

[00359] • As soluções de estoque foram diluídas para 1,0 x 10-6 M em meio de crescimento

[00360] Diluições adicionais:

[00361] A: 100 µl 1,0 x 10-6 M

[00362] B: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução A (diluição de 1:5)

[00363] C: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução B (diluição de 1:5)

[00364] D: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução C (diluição de 1:5)

[00365] E: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução D (diluição de 1:5)

[00366] F: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução E (diluição de 1:5)

[00367] G: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução F (diluição de 1:5)

[00368] H: 80 µl de meio de crescimento + 20 µl de solução G (diluição de 1:5)

[00369] • 10 µl de cada solução foram adicionados às triplicatas do poço. Volume final: 100 µl/poço.

[00370] • Dose final: a partir de 1 x 10-7 M; série de diluição de 1:5

[00371] • Incubação por 96 h a 37 °C e CO2 a 5%.

[00372] • Após 96 h: Ensaio de proliferação celular Roche WST-1 de acordo com as instruções do fabricante.

[00373] • Concentrações de EC50 foram determinadas com software de análise de dados Graphpad Prism 4.0.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol caracterizado pelo fato de que é de acordo com a Fórmula I

I sendo que R1 é selecionado dentre alquila, arila, heteroarila, alquila substituída, arila substituída e heteroarila substituída; P1 é hidrogênio ou um grupo protetor; P2 é hidrogênio ou um grupo protetor, particularmente um grupo protetor; e R2 é selecionado dentre OH, OR1 e uma cadeia de polipeptídeo que consiste em 1 a 7 resíduos de aminoácido.

2. Derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor, quando presente, é independentemente selecionado dentre Boc, PhCH2OCO-, CH2=CHCH2O-CO- e tritila.

3. Derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o substituinte R1-C(=O)-O- é fixado à posição 5 na Fórmula I.

4. Derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o substituinte R1-C(=O)-O- é fixado à posição

6 na Fórmula I.

5. Método para a síntese de um precursor linear que compreende oito resíduos de aminoácido de um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de usar um derivado hidroxissubstituído de 2-carboxi-3a-hidroxi- 1,2,3,3a,8,8a-hexa-hidropirrolo[2,3-b]indol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, na síntese peptídica do dito precursor.

6. Método para a síntese de um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) provocar ou permitir a formação de uma ligação entre o resíduo cisteína e a porção química triptofano do precursor linear, de acordo com a reivindicação 5; e (ii) provocar ou permitir a formação do dito derivado de amanitina reagindo-se a terminação N do precursor linear, de acordo com a reivindicação 5, com a terminação C do dito precursor.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, a oxidação do átomo de enxofre da porção química cisteína para formar um sulfóxido ou uma sulfona, particularmente um sulfóxido.

8. Derivado de amanitina caracterizado pelo fato de que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, que é selecionada dentre (i) S-desoxi- 4’-hidroxi-amanina, 4’-hidroxi-amanina, S-desoxi-5’-hidroxi-amanina, 5’-hidroxi- amanina, S-desoxi-7’-hidroxi-amanina, 7’-hidroxi-amanina, (ii) S-desoxi-4’- hidroxi-amaninamida, 4’-hidroxi-amaninamida, S-desoxi-5’-hidroxi- amaninamida, 5’-hidroxi-amaninamida, S-desoxi-7’-hidroxi-amaninamida e 7’- hidroxi-amaninamida, (iii) um derivado da amanitina de acordo com (i), sendo que a porção química ácido carboxílico livre do aminoácido 1 é convertida em um éster carboxílico –C(=O)OR1 ou em uma porção química –C(=O)NH-OR1, sendo R1 é selecionado dentre alquila, arila, heteroarila, alquila substituída, arila substituída e heteroarila substituída.

9. Derivado de amanitina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre S-desoxi-5’-hidroxi- amanina, 5’-hidroxi-amanina, S-desoxi-5’-hidroxi-amaninamida e 5’-hidroxi- amaninamida

10. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende (a) um derivado de amanitina que compreende uma porção química triptofano hidroxilado, de acordo com a reivindicação 8 ou 9; (b) uma porção química de ligação ao alvo; e (c) opcionalmente um ligante que liga o dito derivado de amanitina e a dita porção química de ligação ao alvo.

11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o derivado de amanitina, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, ou o conjugado, de acordo com a reivindicação 10.

12. Derivado de amanitina, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, o conjugado, de acordo com a reivindicação 10, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que se destina ao uso no tratamento de câncer em um paciente, sendo que, particularmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pancreático, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer dos ovários, câncer de próstata, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia e linfoma maligno.

13. Construto caracterizado pelo fato de que compreende (a) um derivado de amanitina, de acordo com a reivindicação 8 ou 9; e (b) uma porção química ligante que transporta um grupo reativo Y para ligar o dito derivado de amanitina a uma porção química de ligação ao alvo.