CN111051310A

CN111051310A - 合成鹅膏蕈碱的新方法

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Publication number: CN111051310A
Application number: CN201880051375.7A
Authority: CN
Inventors: C·卢茨; W·西蒙; S·维尔纳-西蒙; C·米勒; T·黑希勒; M·库尔克
Original assignee: Heidelberg Pharma Research GmbH
Current assignee: Heidelberg Pharma Research GmbH
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: AU2018314668B2; CA3066867A1; RU2020105484A; JP2020529452A; ZA201908158B; WO2019030173A1; CL2020000304A1; KR102674750B1; US20210130412A1; CO2020001259A2; US10961277B2; JP7165720B2; SG11201912224PA; NZ760113A; US20200181200A1; CN111051310B; RU2020105484A3; MX2020001472A; EP3665173A1; US11702451B2

Abstract

本发明涉及用于合成具有连接至中心色氨酸基团的羟基的鹅膏蕈碱衍生物的新方法。本发明还涉及具有连接至中心色氨酸基团的4’、5’或7’位的羟基的新鹅膏蕈碱衍生物、这样的鹅膏蕈碱衍生物的新缀合物以及包含这样的缀合物的药物组合物。

Description

合成鹅膏蕈碱的新方法

发明领域

发明背景

鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的环肽，发现于鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)蕈菌中(参见图1)。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA-依赖性RNA聚合酶II，并且由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白质生物合成。细胞内转录的抑制导致生长和增殖的停止。尽管不是共价结合，但是鹅膏蕈碱与RNA聚合酶II之间的络合是非常紧密的(K_D＝3nM)。将鹅膏蕈碱从酶上解离是一个非常缓慢的过程，因而使得受影响的细胞不大可能恢复。当转录抑制持续太久时，细胞会经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。

已经在1981年通过使用与色氨酸(Trp)(氨基酸4；参见图1)的吲哚环连接的连接基经由重氮化将抗Thy 1.2抗体与α-鹅膏蕈碱偶联而开发了鹅膏毒素作为细胞毒性部分用于肿瘤治疗的用途(Davis&Preston,Science 213(1981)1385-1388)。Davis&Preston确定了连接的位置为7’位。Morris&Venton同样证明了7’位取代产生了衍生物，其保持了细胞毒活性(Morris&Venton,Int.J.Peptide Protein Res.21(1983)419-430)。

专利申请EP 1859811A1(2007年11月28日公开)记载了缀合物，其中β-鹅膏蕈碱的鹅膏毒素氨基酸1的γC原子直接(即无连接基结构)与白蛋白或者单克隆抗体HEA125、OKT3或PA-1偶联。此外，这些缀合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤细胞(Raji)和T淋巴瘤细胞(Jurkat)的增殖具有抑制作用。虽然提议使用连接基，包括包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃基团等元件的连接基，但是实际上并没有给出这样的结构，且没有提供更多的细节，例如在鹅膏毒素上的连接位点。

专利申请WO 2010/115629和WO 2010/115630(均于2010年10月14日公开)记载了缀合物，其中抗体，例如抗EpCAM抗体(如人源化抗体huHEA125)，通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC原子，(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6’C原子或(iii)鹅膏毒素氨基酸3的δC原子与鹅膏毒素偶联，每种情况下直接偶联或通过抗体与鹅膏毒素之间的连接基偶联。所提议的连接基包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃基团等的元件。另外，这些缀合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)、胰腺癌(Capan-1细胞系)、结肠癌(Colo205细胞系)和胆管癌(OZ细胞系)的增殖具有抑制作用。

专利申请WO 2012/119787记载了靶结合基团可以通过连接基在色氨酸氨基酸4上的另外的连接位点(即1’-N)连接至鹅膏毒素，而不影响这样的鹅膏毒素与其靶点(哺乳动物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶II)的相互作用。

专利申请WO 2014/009025记载了鹅膏蕈碱衍生物的全合成，其使用了γ,δ-二羟基异亮氨酸的新合成子作为原料之一。此外，专利申请PCT/EP2016/078984[公开为WO2017/089607]记载了γ-和ε-鹅膏蕈碱的衍生物的全合成，其使用容易获得的(2S,3R,4S)-L-4-羟基异亮氨酸作为原料之一。然而，这些方法以及目前尝试的所有其他全合成方法或部分合成方法均通过使用Savige-Fontana的方法将中心色氨酸基团掺入鹅膏毒素核心。在该方法中，将顺式-2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(“Hpi”)掺入线性鹅膏蕈碱前体结构。在酸催化的Hpi-半胱氨酸偶联反应中，形成具有中心色氨酸基团的鹅膏蕈碱环系。

但是，Hpi不具有连接至Hpi的吲哚基团的苯环的任何官能团。因此，根据Savige-Fontana的方法所得的鹅膏蕈碱包含不具有任何其它取代基的中心色氨酸基团。但是，天然的α-、β-、γ和ε-鹅膏蕈碱包含中心6’-羟基-色氨酸基团，并且该6’-羟基已被成功地用作用于鹅膏蕈碱的官能化(例如通过直接或连接基来连接靶向基团来进行(参见例如WO2010/115629、WO 2010/115630和WO 2012/041504))的官能团。因此，在合成的鹅膏蕈碱的情况下，官能化不得不通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γ-C原子或者(ii)鹅膏毒素氨基酸3的δC-原子(如上文所述)或者通过色氨酸基团的氮原子(如WO 2012/119787中记载)来进行。

Hpi可通过色氨酸与过乙酸反应或者与单线态氧光化学反应来获得。然而，目前为止尚未记载具有连接至Hpi的吲哚基团中苯环的取代基的衍生物。

虽然将全合成路线应用于鹅膏毒素可以提供治疗用途所需的更多数量的鹅膏毒素的供给的选择，并且通过使用合适的原料作为结构单元可以提供多种新的鹅膏毒素变体的构建，但是过去尝试的方法受限于尚不能获得原始结构α-、β-、γ和/或ε-鹅膏蕈碱的事实，因为不能够掺入连接至这些鹅膏蕈碱的核心色氨酸基团的6’-羟基基团。因此，目前用于官能化合成的鹅膏蕈碱的选择相当受限。此外，扩展可用于官能化的选择的范围是高度期望的，因为诸如位阻和反应性的因素对于合成的鹅膏蕈碱及其缀合物的反应性、生物活性和/或稳定性具有巨大影响。然而，包含高毒性的鹅膏蕈碱的缀合物的稳定性和功效对于设想的用作用于向人给药的治疗性分子是最重要的。

发明目的

因此，仍然强烈需要合成具有连接至中心色氨酸基团的苯环的羟基的鹅膏毒素的经济有效且稳健的方法。特别地，具有对于鉴定可以在已建立的Savige-Fontana反应中使用且设计为可导致掺入这样的羟基基团的原料的强烈的需求。

发明概述

本发明基于以下出人意料的发现：可合成Hpi的变体，以能够在鹅膏蕈碱衍生物的合成期间引入羟基基团。

因此，在一个方面中，本发明涉及式I的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物：

其中R1选自烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的芳基和取代的杂芳基；

P₁为氢或保护基，特别是选自Boc、PhCH₂OCO-、CH₂＝CHCH₂O-CO-和三苯甲基的保护基；

P₂为氢或保护基，特别是保护基，特别是选自Boc、PhCH₂OCO-、CH₂＝CHCH₂O-CO-和三苯甲基的保护基；并且

R2选自OH、OR1和由1-7个氨基酸残基组成的多肽链。

在第二方面中，本发明涉及合成包含鹅膏蕈碱衍生物的八个氨基酸残基的线性前体的方法，所述鹅膏蕈碱衍生物含有羟基化色氨酸基团，所述方法包括在所述前体的肽合成中使用本发明中任一项的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物的步骤。

在第三方面中，本发明涉及合成包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物的方法，其包括以下步骤：

(i)导致或使得本发明的线性前体的半胱氨酸残基与色氨酸基团之间形成键；以及

(ii)通过本发明的线性前体的N端与所述前体的C端反应而导致或使得形成所述鹅膏蕈碱衍生物。

在第四方面中，本发明涉及包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物，其选自(i)S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽、4’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽、7’-羟基-三羟鹅膏毒肽，(ii)S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺和7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺，(iii)(i)的鹅膏蕈碱的衍生物，其中氨基酸1的游离羧酸基团转化为羧酸酯–C(＝O)OR1或转化为基团–C(＝O)NH-OR1，其中R1选自烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的芳基和取代的杂芳基。

在第五方面中，本发明涉及缀合物，其包含(a)本发明的包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物；(b)靶结合基团；和(c)任选存在的连接所述鹅膏蕈碱衍生物和所述靶结合基团的连接基。

在第六方面中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的鹅膏蕈碱或本发明的缀合物。

在第七方面中，本发明涉及本发明的鹅膏蕈碱衍生物、本发明的缀合物或者本发明的药物组合物，其用于治疗患者中的癌症，特别地，其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。

在第八方面中，本发明涉及构建体，其包含(a)本发明的鹅膏蕈碱衍生物；和(b)带有反应性基团Y的连接基团，所述反应性基团Y用于将所述鹅膏蕈碱衍生物连接至靶结合基团。

附图简述

图1显示不同鹅膏毒素的结构式。粗体数字(1至8)标示形成鹅膏毒素的八个氨基酸的标准编号。还显示氨基酸1、3和4中原子的标准标示(分别为希腊字母α至γ，希腊字母α至δ和从1’至7’的数字)。

图2显示化合物S-脱氧-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0735)和α-鹅膏蕈碱的结构。

图3显示由Boc-L-色氨酸开始在一步合成中生成Hpi(HDP 30.0079)。

图4显示通过固相肽合成掺入Hpi衍生物HDP 30.2555生成化合物S-脱氧-α-鹅膏蕈碱(HDP30.0735)。

图5显示S-脱氧-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0735)和S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺HDP 30.2548对HEK293细胞和对HEK293 OATP1B3细胞的细胞毒性。

图6显示基于S-脱氧-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0735)具有连接至6’-羟基基团的可裂解连接基和末端马来酰亚胺基团(作为用于将所述构建体连接至靶结合基团的反应性基团Y的实例)的构建体。

图7显示基于S-脱氧-α-鹅膏蕈碱(HDP 30.0735)的其它供选择的构建体，其具有连接至氨基酸残基1的羧基的可裂解连接基和末端马来酰亚胺基团(作为用于将所述构建体连接至靶结合基团的反应性基团Y的实例)。

图8显示由5’-羟基-L-色氨酸开始在多步合成中生成羟基化Hpi衍生物HDP30.2536。

图9显示通过固相肽合成掺入Hpi衍生物HDP 30.2536生成化合物鹅膏蕈碱前体HDP 30.2544。

图10显示通过鹅膏蕈碱前体HDP 30.2544的环合生成化合物鹅膏蕈碱衍生物HDP30.2546。

图11显示通过由鹅膏蕈碱衍生物HDP 30.2546移除保护基生成鹅膏蕈碱衍生物HDP 30.2548(S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺)。

图12显示基于鹅膏蕈碱衍生物HDP 30.2548(S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺)的构建体，其具有连接至5’-羟基基团的可裂解连接基和末端马来酰亚胺基团(作为用于将所述构建体连接至靶结合基团的反应性基团Y的实例)。

图13显示与HDP 30.1699ADC(包含与HDP 30.2347、HDP 30.2371和HDP 30.2602相同的可裂解连接基，但用α-鹅膏蕈碱代替上文描述的鹅膏蕈碱衍生物)相比，靶向A)SKBR-3细胞(HER-2/neu+++)和JIMT-1细胞(HER-2/neu+)上的HER-2/neu，B)LnCap细胞(PSMA+++)和22rv1细胞(PSMA++)上的PSMA，以及C)Raji细胞(CD19+++)和Nalm-6细胞(CD19++)上的CD19的HDP30.2347、HDP 30.2371和HDP 30.2602ADC的细胞毒性。

发明详述

在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

具体地，本文所用的术语如"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和

H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)中所述的进行定义。

除非上下文中另外要求，否则整篇说明书以及其后的权利要求书中，词语“包含(comprise和如“comprises”和“comprising”的变形)”会被理解为意指包含所述的整数、组成或步骤或者整数或步骤的组，而任何另外的整数、组成或步骤或者整数、组成或步骤的组也可以任选地存在，包括不存在另外的整数、组成或步骤或者整数、组成或步骤的组的实施方案。在这样的后面的实施方案中，术语“包含”和“由……组成”的使用一致。

整篇本说明书文本中引用了若干文献。本文所引用的文献中的每一个(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、技术说明书、GenBank登陆号序列提交等)，无论上文或下文中，以分别的专利法可允许的程度以其整体援引加入本文。本文中没有内容可被解释为承认本发明无权依据在先发明而将本公开提前。

现在会进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非有明确的相反说明，否则如此定义的每个方面可以与任何其它一个或多个方面组合。特别地，被指示为优选的或有利的任何特征可以与被指示为优选的或有利的任何其它一个或多个特征组合。

P₁为氢或保护基；

P₂为氢或保护基；并且

R2选自OH、OR1和由1-7个氨基酸残基组成的多肽链。

在本发明的上下文中，术语“保护基”是指连接至中心六氢吡咯并[2,3-b]吲哚基团的1位和8位的氮原子上以阻止所述氮原子与用于合成和/或进一步官能化式I的化合物的其它反应物反应的基团。本领域普通技术人员非常熟悉本领域中可用的不同的保护基，并且可以在需要保护所述氮原子时将保护基连接至相应的氮原子，并且随后可在不再需要N-保护时将其裂解掉。在具体的实施方案中，所述N-保护使用N-酰化试剂。从而，在这样的实施方案中，P1和/或P2为酰基。在具体的其它实施方案中，所述N-保护使用N-烷基化试剂。从而，在这样的实施方案中，P1和/或P2为烷基。

在具体的实施方案中，所述保护基P1或P2当存在时独立地选自Boc、PhCH₂OCO-、CH₂＝CHCH₂O-CO-和三苯甲基。

在具体的实施方案中，3a位的羟基基团和8a位的氢原子相对于连接至2位的官能团为顺式构型。在另一具体的实施方案中，3a位的羟基基团和8a位的氢原子相对于连接至2位的官能团为反式构型。在具体的实施方案中，本发明的氨基取代的衍生物为顺式构型和反式构型的化合物的混合物。

在具体的实施方案中，取代基R1-C(＝O)-O-连接至式I的4位。

在具体的实施方案中，取代基R1-C(＝O)-O-连接至式I的5位。

在具体的实施方案中，取代基R1-C(＝O)-O-连接至式I的6位。

在具体的实施方案中，取代基R1-C(＝O)-O-连接至式I的7位。

在第二方面中，本发明涉及合成包含鹅膏蕈碱衍生物的八个氨基酸残基的线性前体的方法，所述鹅膏蕈碱衍生物含有羟基化色氨酸基团，所述方法包括在所述前体的肽合成中使用本发明的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物的步骤。

在另外的方面中，本发明涉及如实施例中所示合成的各个鹅膏蕈碱前体，特别是化合物HDP30.2569、HDP 30.2572以及根据[00145]合成的基于固相的中间体。

在具体的实施方案中，本发明的方法还包括半胱氨酸基团的硫原子的氧化以形成亚砜和砜，特别是亚砜。

在具体的实施方案中，本发明的鹅膏蕈碱衍生物选自S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺和5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺。

在本发明的上下文中，术语“鹅膏蕈碱”是指鹅膏毒素的具体组。在本发明的上下文中，术语“鹅膏毒素”包括所有从鹅膏菌属分离的由8个氨基酸组成的环肽，并且在Wieland,T.和Faulstich H.(Wieland T,Faulstich H.,CRC Crit Rev Biochem.5(1978)185-260)中记载。在本发明的上下文中，术语“鹅膏蕈碱”是指基于1位的天冬氨酸或天冬酰胺残基、2位的脯氨酸残基(特别是羟脯氨酸残基)、3位的异亮氨酸、羟基异亮氨酸或二羟基异亮氨酸、4位的羟色氨酸残基、5和7位的甘氨酸残基、6位的异亮氨酸残基以及8位的半胱氨酸残基(特别是氧化为亚砜或砜衍生物的半胱氨酸衍生物)的双环结构(对于鹅膏蕈碱的编号和代表性实例参见图1)，并且还包括其所有化学衍生物；进一步的其所有半合成类似物；进一步的根据天然化合物的主要结构(环状，8个氨基酸)从构建单元构建的其所有合成类似物，进一步的含有非羟基化氨基酸而不是羟基化氨基酸的所有合成或半合成类似物(条件是在色氨酸基团的苯环上存在至少一个羟基)，进一步的所有合成或半合成类似物，在各情况下，其中任何这样的衍生物或类似物通过抑制哺乳动物RNA聚合酶II具有功能活性。

因此，在本发明的上下文中，术语“鹅膏蕈碱衍生物的八个氨基酸残基”是指形成双环鹅膏蕈碱多肽结构的具体氨基酸。

功能上，鹅膏毒素被定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或酯肽。优选的鹅膏毒素是具有能够与上文所定义的连接基分子或靶结合基团反应的官能团(例如羧基或羧酸衍生物如甲酰胺或异羟肟酸、氨基、羟基、巯基或巯基捕获基团)的那些。特别适于本发明的缀合物的鹅膏毒素是如图1所示的α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、一羟鹅膏毒肽酰胺或一羟鹅膏毒肽羧酸的二脱氧变体，或者三羟鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽酰胺、γ-三羟鹅膏毒肽或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺的单脱氧变体，以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。

在具体的实施方案中，本发明的羟基取代的衍生物、包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物和/或缀合物具有纯度大于90％，特别地，大于95％，更特别地，大于98％或者甚至大于99％。

在本发明的上下文中，术语“纯度”是指例如存在的缀合物的总量。例如，纯度大于90％表示在1mg包含本发明的缀合物的组合物中，存在超过90％(即超过900μg)的这样的缀合物。剩余部分(即杂质)可包括未反应的原料和其它反应物、溶剂、裂解产物和/或副产物。

在具体的实施方案中，包含本发明的羟基取代的衍生物、包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物和/或缀合物的组合物包含大于100mg，特别地大于500mg，并且更特别地，大于1g的这样的羟基取代的衍生物、包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物和/或缀合物。从而，明确排除现有技术的缀合物的复杂制备物中可能争议性存在的微量的例如本发明的缀合物。

术语“靶结合基团”，如本文中所使用，是指可以特异性结合到靶分子或靶表位的任何分子或分子的部分。在本申请的上下文中优选的靶结合基团是(i)抗体或其抗原结合片段；(ⅱ)抗体样蛋白；和(iii)核酸适配体。适于本发明使用的“靶结合基团”典型地具有40000Da(40kDa)或更高的分子量。

如本文中所使用，如果第一化合物与第二化合物具有100μM或更小、特别是50μM或更小、特别是30μM或更小、特别是20μM或更小、特别是10μM或更小、特别是5μM或更小、更特别是1μM或更小、更特别是900nM或更小、更特别是800nM或更小、更特别是700nM或更小、更特别是600nM或更小、更特别是500nM或更小、更特别是400nM或更小、更特别是300nM或更小、更特别是200nM或更小、甚至更特别是100nM或更小、甚至更特别是90nM或更小、甚至更特别是80nM或更小、甚至更特别是70nM或更小、甚至更特别是60nM或更小、甚至更特别是50nM或更小、甚至更特别是40nM或更小、甚至更特别是30nM或更小、甚至更特别是20nM或更小以及甚至更特别是10nM或更小的解离常数K_D，则所述第一化合物(例如抗体)被认为与所述第二化合物(例如抗原，诸如靶蛋白)“特异性结合”。

在本申请的上下文中，术语“靶分子”和“靶表位”分别是指分别由特定靶结合基团结合的抗原和抗原表位。特别地，靶分子是肿瘤相关抗原，特别是存在于一种或多种肿瘤细胞类型表面上的抗原或表位，其与非肿瘤细胞表面相比具有更高的浓度和/或不同的立体构型。特别地，所述抗原或表位存在于一种或多种肿瘤细胞类型的表面上，但不存在于非肿瘤细胞的表面上。在具体的实施方案中，靶结合基团特异性结合至选自PSMA、CD19、CD269、路易斯抗原(sialyl Lewis^a)、HER-2/neu和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗原的表位。在其他实施方案中，所述抗原或表位优选在参与自身免疫性疾病的细胞中表达。在具体的这样的实施方案中，所述靶结合基团特异性结合至IL-6受体(IL-6R)的表位。

如本文中所使用，术语“抗体或其抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语“其抗原结合片段”是指至少包含功能性抗原结合结构域的抗体片段。还包括通过包括例如噬菌体展示以特异性结合至靶分子(例如结合至选自PSMA、CD19、CD269、路易斯抗原、HER-2/neu和EpCAM的靶蛋白)的技术来选择的免疫球蛋白样蛋白。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。适于在本发明中使用的“抗体和其抗原结合片段”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(特别是CDR移植的)、去免疫的抗体或嵌合抗体、单链抗体(例如scFv)、Fab片段、F(ab')2片段、由Fab表达文库产生的片段、双链抗体(diabodies)或四链抗体(tetrabodies)(Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.90(1993)6444-8)、纳米抗体、抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗-Id抗体)以及上述任一种的表位结合片段。

在一些实施方案中，抗原结合片段是本发明的人抗原结合抗体片段并且包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(dsFv)以及包含VL或VH结构域的片段。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以单独包含可变结构域或包含可变结构域与以下全部或部分组合：铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括的是还包含可变结构域与铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合的抗原结合片段。

可用于本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。特别地，抗体来自于人、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)、鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗来源。特别优选的是抗体是人或鼠来源。如本文中所使用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白文库或从转基因一种或多种人免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，例如Kucherlapati&Jakobovits的美国专利号5,939,598所描述的。

术语“抗体样蛋白”是指已被改造(例如通过循环诱变)以能与靶分子特异性结合的蛋白质。通常，这样的抗体样蛋白包含至少一个可变肽环来连接两端到蛋白支架。这种双重结构约束将抗体样蛋白的结合亲和力极大地提高至与抗体相当的水平。代表性的可变肽环的长度是10至20个氨基酸。支架蛋白可以是有良好的溶解度的任何蛋白。特别地，支架蛋白是小的球状蛋白质。抗体样蛋白包括但不限于亲和体、模拟抗体(anticalin)和设计的锚蛋白重复蛋白质(参见综述：Binz等人，Nat Biotechnol.2005,1257-68)。抗体样蛋白可以源自突变体的大型文库，例如从大的噬菌体展示文库筛选并且可以与常规抗体类似地进行分离。此外，抗体样结合蛋白可以通过球状蛋白中表面暴露残基的组合诱变来获得。

术语“核酸适配体”是指通过反复多轮的体外选择或SELEX(配体指数富集的系统进化)改造出的与靶分子结合的核酸分子(参见综述：Brody和Gold,J Biotechnol.74(2000)5-13)。核酸适配体可以是DNA或RNA分子。适配体可含有修饰，例如经修饰的核苷酸，如2'-氟取代的嘧啶。

在本发明的上下文中，“连接基”是指连接两个组成部分的结构，所述组成部分各自与连接基的一个末端连接。在连接基是键的情况下，鹅膏毒素与抗体的直接键合能减小鹅膏毒素与RNA聚合酶II相互作用的能力。在具体的实施方案中，连接基增加两个组成部分之间的距离并缓解这些组成部分之间(例如在本实例中在抗体与鹅膏毒素之间)的空间干扰。在具体的实施方案中，所述连接基主链上具有1～30个原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个原子)的连续链，即，连接基的长度被定义为由鹅膏毒素部分和抗体之间原子或键的数量测量的最短的连接，其中连接基主链的一侧已经与鹅膏毒素反应而另一侧可以与抗体反应或已经与抗体反应。在本发明的上下文中，连接基具体是C_1-20-亚烷基、C_1-20-亚杂烷基、C_2-20-亚烯基、C_2-20-亚杂烯基、C_2-20-亚炔基、C_2-20-亚杂炔基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基或亚杂芳烷基基团，任选地被取代。所述连接基可含有一个或多个结构元件例如甲酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等。所述连接基还可含有这些结构元件中的两个或更多个的组合。这些结构元件中的每一个可在连接基中存在不止一次，例如两次、三次、四次、五次或六次。在一些实施方案中，所述连接基可包含二硫键。应当理解的是连接基必须在单个步骤或两个或更多个后续步骤中与鹅膏毒素和抗体连接。为了这一目的，连接基会带有两个基团，特别是在近端和远端，其可(i)与有待连接的组成部分中的一个中存在的基团特别是鹅膏毒素或靶结合肽上的活化基团形成共价键或(ii)其被活化或可以被活化以与鹅膏毒素上的基团形成共价键。相应地，优选的是化学基团位于连接基的远端和近端，其可以是这样的偶联反应的结果，例如酯、醚、氨基甲酸酯、肽键等。

在具体的实施方案中，所述连接基L是独立地选自C、O、N和S的1至20个原子(特别是2至18个原子，更特别是5至16个原子，以及甚至更特别是6至15个原子)的线性链。在具体的实施方案中，所述线性链中至少60％的原子是C原子。在具体的实施方案中，所述线性链中的原子通过单键连接。

在具体的实施方案中，所述连接基L是包含1至4个选自N、O和S的杂原子的亚烷基、亚杂烷基、亚烯基、亚杂烯基、亚炔基、亚杂炔基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基或亚杂芳烷基基团，其中所述连接基任选地被取代。

术语“亚烷基”是指具有1至20个碳原子的二价直链饱和烃基团，包括具有1至10个碳原子的基团。在某些实施方案中，亚烷基基团可以是低级亚烷基基团。术语“低级亚烷基”是指具有1至6个碳原子、在某些实施方案中1至5或1至4个碳原子的亚烷基基团。亚烷基基团的实例包括但不限于亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂-CH₂-)、亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基和亚正己基。

术语“亚烯基”是指具有2至20个碳原子的二价直链基团，其中碳碳键中的至少一个是双键而其他的键可以是单键或另外的双键。本文中，术语“亚炔基”是指具有2至20个碳原子的基团，其中碳碳键中的至少一个是三键，而其他的键可以是单键、双键或另外的三键。亚烯基基团的实例包括亚乙烯基(-CH＝CH-)、1-亚丙烯基、2-亚丙烯基、1-亚丁烯基、2-亚丁烯基、3-亚丁烯基等。亚炔基的实例包括亚乙炔基、1-亚丙炔基、2-亚丙炔基等等。

如本文中所使用，“亚环烷基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中这样的环具有3至12个碳原子但是没有杂原子，并且其中这样的环是完全饱和的，而术语“亚环烯基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中这样的环具有3至12个碳原子但是没有杂原子，并且其中这样的环是至少部分不饱和的(但是不包括任何亚芳基环)。亚环烷基的实例包括但不限于环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基和环亚庚基。亚环烯基的实例包括但不限于环亚戊烯基和环亚己烯基。

如本文中所使用，术语“亚杂环烷基”和“亚杂环烯基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中这样的环具有3至约12个原子，并且其中这样的环由碳原子和至少一个杂原子(特别地至少一个独立地选自N、O和S的杂原子)组成，其中，亚杂环烷基是指完全饱和的环，亚杂环烯基是指至少部分不饱和的环(但是不包括任何亚芳基或亚杂芳基环)。

术语“亚芳基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环或环系，其中这样的环或环系具有3至20个碳原子但是没有杂原子，该环或环系由如“4n+2”π电子规则定义的芳族基团组成，包括亚苯基。

如本文中所使用，术语“亚杂芳基”是指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环或环系，其中该环或环系具有3至20个原子，该环或环系由如“4n+2”π电子规则定义的芳香族部分组成并且含有碳原子和一个或多个氮、硫和/或氧杂原子。

在本发明的上下文中，术语“取代的”意指连接基的主链中存在的一个或多个氢被来自所指明的一个或多个基团的选择取代，条件是不超过所指明的原子的正常化合价或被取代的基团的合适的原子的化合价，并且取代产生稳定的化合物。如本文中所定义，术语“任选地取代”意指连接基是未被取代的或被如本文中所定义的一个或多个取代基取代。当取代基是酮(或氧代，即＝O)基团、硫代或亚氨基基团等时，连接基主链原子上的两个氢被代替。示例性的取代基包括例如烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、羧基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、芳酰氧基、杂芳酰氧基、烷氧基羰基、卤素、(硫代)酯、氰基、磷酰基、氨基、亚氨基、(硫代)酰氨基、巯基、烷硫基、酰基硫基、磺酰基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、叠氮基、卤代烷基(包括全氟烷基(例如三氟甲基))、卤代烷氧基、烷基硫烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基砜氨基(arylsulfonoamino)、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、烷基羧基、烷基羧基酰胺、氧杂、羟基、巯基、氨基(任选地被例如烷基、芳基或杂芳基单-或二取代)、亚氨基、甲酰胺、氨基甲酰基(任选地被例如烷基、芳基或杂芳基单-或二取代)、脒基、氨基磺酰基、酰基氨基、芳酰基氨基、(硫代)脲基、(芳基硫基)脲基、烷基(硫代)脲基、环烷基(硫代)脲基、芳氧基、芳烷氧基、或-O(CH₂)_n-OH、-O(CH₂)_n-NH₂、-O(CH₂)_nCOOH、-(CH₂)_nCOOH、-C(O)O(CH₂)_nR、-(CH₂)_nN(H)C(O)OR或N(R)S(O)₂R，其中n是1-4且R独立地选自氢、-烷基、-烯基、-炔基、-环烷基、-环烯基、-(C-连接的杂环烷基)、-(C-连接的杂环烯基)、-芳基和-杂芳基，其允许具有多种程度的取代。本领域技术人员应当理解的是如果适合，那么取代基例如杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基等或官能团例如-OH、-NHR等自身可被取代。本领域技术人员还应当理解的是，适合时取代的基团本身可被取代。

在具体的实施方案中，所述连接基L包含选自下列基团之一的基团：二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、胺(-NH-)、酯(-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-)、甲酰胺(-NH-C(＝O)-或-C(＝O)-NH-)、氨基甲酸酯(-NH-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-NH-)和脲基团(-NH-C(＝O)-NH-)。

在本发明的具体的实施方案中，所述连接基L包含m个选自下列的基团：亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基以及亚杂芳烷基基团，其中，各基团可任选地独立地被取代，连接基还包含n个独立地选自下列基团之一的基团：二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、胺(-NH-)、酯(-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-)、甲酰胺(-NH-C(＝O)-或-C(＝O)-NH-)、氨基甲酸酯(-NH-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-NH-)和脲基团(-NH-C(＝O)-NH-)，其中m＝n+1。在具体的实施方案中，m是2且n是1，或者m是3且n是2。在具体的实施方案中，连接基包含2或3个未取代的亚烷基基团以及分别为1或2个连接未取代的亚烷基基团的二硫化物、醚、硫醚、胺、酯、甲酰胺、氨基甲酸酯或脲基团。

在具体的实施方案中，所述连接基L不包含亚杂芳基。

在具体的实施方案中，线性链中的C原子独立地是任选地被取代的亚甲基基团(-CH₂-)的部分。在这样具体的实施方案中，任选存在的取代基独立地选自卤素和C_1-6-烷基，特别是甲基。

在具体的实施方案中，所述连接基L是稳定的连接基。

在本发明的上下文中，术语“稳定的连接基”是指(i)在酶的存在下，和(ii)在细胞内还原环境中稳定的连接基。

在具体的实施方案中，所述稳定的连接基不含(i)可被酶裂解的子结构，和/或(ii)二硫基。在具体的这样的实施方案中，所述连接基具有多达12个原子，特别是2至10个，更特别是4至9个，并且最特别是6至8个原子的长度。

在其他具体的实施方案中，所述连接基L是可裂解连接基。

在本发明的上下文中，术语“可裂解连接基”是指(i)可被酶裂解的连接基，或(ii)可还原连接基。在具体的实施方案中，所述术语仅指可通过酶裂解的连接基(而非可还原连接基)。

在本发明的上下文中，术语“可被酶裂解的连接基”是指可以被酶，特别是被溶酶体肽酶，例如组织蛋白酶B裂解，导致内化后与靶向抗体缀合的毒素运货(cargo)的细胞内释放的连接基(参见Dubowchik等人，Bioconjug Chem.13(2002)855-69)。在具体的实施方案中，可裂解连接基包含选自以下的二肽：Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Val-Ala、Phe-Cit和Val-Cit，特别是其中所述可裂解连接基在二肽和鹅膏毒素之间还包含对氨基苄基(PAB)间隔基。

在具体的这样的实施方案中，所述可裂解连接基包含结构L¹-L*-L²，其中L*为对氨基苄基二肽基团，L¹为将L*连接至鹅膏毒素的连接基的部分，特别地，其中L¹通过–NH-或–O-基团(特别是–C(＝O)-NH-、–C(＝O)-NH-O-或–C(＝O)-O-基团)连接至L*，并且其中L²为将L*连接至靶结合基团的连接基的部分，特别地其中L²通过–(CH₂)_m-基团(m为选自1至8，特别是1至5的整数)或者通过–(CH₂CH₂O)_n-基团(n为选自1至3，特别是1至2的整数)连接至L*。例如，在包含二肽Val-Ala的可裂解连接基的情况下，L¹-L*-L²的结构如下：

在具体的其它这样的实施方案中，L*包含二肽Val-Lys，并且具有以下结构：

在具体的实施方案中，所述连接基L¹为1至4个(特别地，1至3个原子，更特别地1至2个原子，并且甚至更特别地仅1个原子)独立地选自C、O、N和S的原子的线性链。在具体的实施方案中，所述线性链中至少50％的原子为C原子。在具体的实施方案中，所述线性链中的原子通过单键连接。

在具体的实施方案中，L¹为作为鹅膏毒素的一部分的–NH-或–O-基团。在具体的实施方案中，L¹为源自连接至中心色氨酸基团4’、5’、6’或7’位的羟基的–O-基团。在具体的实施方案中，L¹为源自羟基基团的–O-基团，所述羟基基团为本发明的三羟鹅膏毒肽衍生物的氨基酸残基1的羧酸基团的一部分。在具体的实施方案中，L¹为源自氨基基团的–NH-基团，所述氨基基团为本发明的三羟鹅膏毒肽衍生物的氨基酸残基1的甲酰胺基团的一部分。在具体的实施方案中，L¹为源自羟基基团的–O-基团，所述羟基基团为本发明的三羟鹅膏毒肽或三羟鹅膏毒肽酰胺衍生物的氨基酸残基3的一部分。

在本发明的上下文中，术语“可还原连接基”是指在细胞内还原环境中可以被裂解的连接基，特别是含有二硫基，导致被细胞内还原环境内化后与靶结合基团缀合的毒素运货的细胞内释放的连接基(参见Shen等人,J.Biol.Chem.260(1985),10905–10908)。在具体的实施方案中，所述可还原连接基包含基团：

其中R1至R4独立地选自H和甲基。

在具体的这样的实施方案中，这样的可裂解连接基具有多达20个原子，特别是6至18个，更特别是8至16个，最特别是10至15个原子的长度。在具体的这样的实施方案中，连接本发明的鹅膏毒素和可裂解二硫基团的连接基的部分为3个或4个C原子(特别是3个C原子)的线性链。在具体的实施方案中，所述线性链中的3个或4个C原子通过单键连接。在具体的实施方案中，所述连接基为n-亚丙基基团。

在具体的实施方案中，所述连接基存在，并且一侧连接至结合于中心色氨酸基团的苯环的羟基基团(即连接至4’、5’或7’-羟基取代基)。

在具体的其它实施方案中，所述连接基存在，并且一侧连接至本发明的鹅膏蕈碱衍生物中的位置上，其中所述位置选自：

(i)在S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺和7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的情况下，鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子处甲酰胺基团的氮原子(酰胺连接)；

(ii)在S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽、4’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽、7’-羟基-三羟鹅膏毒肽的情况下，鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子处酸基团的氧原子(酯连接)；

(iii)在本发明的鹅膏蕈碱的衍生物(其中氨基酸1的游离羧酸基团已被转化为基团–C(＝O)NH-OR1)的情况下，鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子处异羟肟酸基团的氧原子；

(iv)鹅膏毒素氨基酸3的δC-原子的羟基基团的氧原子，特别地，通过酯连接、醚连接或氨基甲酸酯连接；或者

(v)氨基酸4的环氮。

可通过本领域(特别是抗体-药物缀合物(ADC)领域)普通技术人员熟知的多种方法将连接基偶联至靶结合基团。

在具体的实施方案中，所述连接基通过脲基团连接至靶结合基团(…-连接基-NH-C(＝O)-NH-靶结合基团)。在具体的这样的实施方案中，所述脲基团由原先存在于靶结合基团的伯胺(诸如赖氨酸侧链的氨基基团)与氨基甲酸衍生物…-连接基-NH-C(O)-Z(其中Z为可被伯胺替代的离去基团)反应来得到。

在具体的其它实施方案中，所述连接基存在，并且通过硫醚基团连接至靶结合基团(…-连接基-S-靶结合基团)。因此，在这样的实施方案中，本发明涉及以下通式的缀合物：

鹅膏蕈碱–L–X*–S–Tbm，

其中鹅膏蕈碱为本发明的鹅膏蕈碱衍生物，L为连接基，X*为由巯基基团偶联至巯基反应性基团所得的基团，S为所述巯基基团的硫原子，特别是半胱氨酸氨基酸残基的巯基基团，并且Tbm是靶结合基团，特别是包含所述半胱氨酸残基的抗体或功能性抗体片段。在具体的实施方案中，所述半胱氨酸氨基酸残基(i)位于选自CL、CH1、CH2和CH3的抗体域；(ii)位于其中表现出与所述抗体域的序列最接近的同源性的种系序列包含不同于半胱氨酸的氨基酸残基的位置；以及(iii)位于溶剂暴露的位置。

在本发明的上下文中，术语“巯基反应性基团”是指与抗体的例如游离半胱氨酸的巯基基团选择性反应的基团，特别是在6.0至8.0范围内的pH值，更特别是在6.5至7.5范围内的pH值。特别地，术语“选择性”是指包含巯基反应性基团的分子与包含至少一个游离半胱氨酸残基的抗体的偶联反应的少于10％(特别是少于5％，更特别是少于2％)是与抗体的非半胱氨酸残基(例如赖氨酸残基)的偶联反应。在具体的实施方案中，所述巯基反应性基团选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、马来酰亚胺、在3位具有离去基团(特别是选自–Br和取代的巯基的离去基团(参见例如US 9,295,729))的马来酰亚胺、在4位具有离去基团(特别是选自–Br和取代的巯基的离去基团(参见例如US 9,295,729))的1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮、甲基磺酰基苯并噻唑、甲基磺酰基苯基四唑、甲基磺酰基苯基噁二唑(参见Toda等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,52(2013)12592-6)、3-芳基丙腈(参见Kolodych等人，Bioconjugate Chem.2015,26,197-200)和5-硝基-吡啶-2-基-二硫化物(…-L-S-S-(5-硝基-吡啶-2-基)。

在具体的实施方案中，连接至连接基的一侧并且可直接或间接连接至存在于靶结合基团的位置或官能团的位置或官能团是可与存在于一个靶结合基团或两个靶结合基团中的两个巯基反应的基团。在具体的实施方案中，所述巯基反应性基团为在3位和4位具有两个离去基团的马来酰亚胺，特别是选自3,4-二溴马来酰亚胺、3,4-双(芳基巯基)-马来酰亚胺(特别是3,4-二苯基巯基-马来酰亚胺)和3,4-双(杂芳基巯基)-马来酰亚胺(特别是3,4-双(2-吡啶基-硫烷基)-马来酰亚胺)。在具体的其它实施方案中，所述巯基反应性基团为在4位和5位具有两个离去基团的1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，特别是选自4,5-溴-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮、4,5-双(芳基巯基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮(特别是4,5-二苯基巯基-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮)和4,5-双(杂芳基巯基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮(特别是4,5-双(2-吡啶基-硫烷基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮)。

在具体的实施方案中，由巯基基团与巯基反应性基团的偶联所得的基团选自：巯基取代的乙酰胺；巯基取代的琥珀酰亚胺；巯基取代的琥珀酰胺酸；巯基取代的杂芳基，特别是巯基取代的苯并噻唑，巯基取代的苯基四唑和巯基取代的苯基噁二唑；和二硫化物，其中一个硫原子源自抗体的半胱氨酸残基。在具体的实施方案中，由巯基基团与巯基反应性基团的偶联所得的基团是巯基取代的琥珀酰亚胺。

在具体的实施方案中，存在于[00101]部分的通式中基团L-X*-S中的连接基L选自下组基团：

其中二肽序列两侧的–NH-和–CO-分别表示与所述二肽的羧基-和氨基端形成酰胺键的连接基的氨基和羰基基团。

在本发明的上下文中，术语“由巯基基团与巯基反应性基团的偶联所得的基团”是指由以下所得的结构：(i)存在于巯基反应性基团(例如溴乙酰胺基团、碘乙酰胺、4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基基团、烷基砜或杂芳基砜)中的离去基团Y被半胱氨酸残基中的硫原子亲核取代；(ii)半胱氨酸残基的HS-基团加成至巯基反应性基团(例如马来酰亚胺)的活化双键；或者(iii)活化的二硫化物或者甲烷硫代磺酸酯(methanethiosulfonate)用半胱氨酸残基的硫原子的二硫化物交换，例如以吡啶-2-巯基、5-硝基吡啶-2-巯基或甲烷亚磺酸酯作为离去基团；或者(iv)导致半胱氨酸残基的硫原子和作为巯基反应性基团一部分的反应性基团之间形成稳定的键的任何其它化学反应。

由巯基基团偶联所得的初级基团可任选地被进一步衍生，例如由马来酰亚胺所得的琥珀酰亚胺基硫醚可水解为以下通式的琥珀酰胺酸硫醚：

在具体的其它实施方案中，位点专一性偶联可通过存在于靶结合基团中的二硫化物桥还原，以及通过使两个半胱氨酸残基与存在于鹅膏蕈碱–L–X*构建体中的桥接基团X*反应来实现(参见Badescu等人Bridging disulfides for stable and defined antibodydrug conjugates.Bioconjugate Chemistry.25(2014)1124-1136)。

在类似的实施方案中，位点专一性偶联可通过存在于靶结合基团中的二硫化物桥还原，以及通过使两个半胱氨酸残基与存在于鹅膏蕈碱–L–X*构建体中的桥接基团X*反应来实现，特别地，其中X*为

(参见Bryden等人,Bioconjug Chem,25(2014)611-617；Schumacher等人,OrgBiomol Chem,2014,7261-7269)

在具体的其它实施方案中，偶联通过存在于连接基中的氨基基团通过转氨酶区域专一性偶联至存在于靶结合基团中的谷氨酰胺残基(特别地通过偶联至抗体的谷氨酰胺Q295)来实现。

在具体的实施方案中，偶联通过位点专一性缀合至包含N-聚糖侧链的靶结合基团来实现。特别地，所述N-聚糖侧链可被酶降解，随后与叠氮基-半乳糖进行转糖基作用。使用点击化学，可将这样修饰的靶结合基团偶联至适当地修饰的构建体鹅膏蕈碱–L–X*,其中X*为例如二苯并环辛炔(DIBO)或包含C-C三键的类似基团。例如构建体鹅膏蕈碱–L–NH₂可通过羟基琥珀酰亚胺基团的亲核取代来偶联至DIBO-SE：

然后，所得的DIBO-修饰的连接基构建体可偶联至上文提及的叠氮基衍生物。在其它供选择的实施方案中，可将所述靶结合基团通过掺入能够进行点击化学的非天然氨基酸(特别是通过掺入对-叠氮基甲基-L-苯基丙氨酸(pAMF))来修饰。

在具体的实施方案中，–L–X*中的连接基L为至少5个，特别是至少10个，更特别地10至20个原子(特别地10至18个原子，更特别地10至16个原子，并且甚至更特别地10至15个原子)的线性链，所述原子独立地选自C、O、N和S。在具体的实施方案中，所述线性链中至少60％为C原子。在具体的实施方案中，所述线性链中的原子通过单键连接。

在其它供选择的实施方案中，可直接或间接连接至存在于靶结合基团中的位置或官能团的位置或官能团不是乙炔基，或者更一般地，不是炔基，或者不是可与1,3偶极在1,3-偶极环加成(点击化学)中反应的基团

在具体的其它实施方案中，鹅膏蕈碱–L–X*构建体与靶结合基团的位点专一性偶联可通过将包含酮基的非天然氨基酸(特别是对乙酰基苯基丙氨酸(pAcPhe))掺入靶结合基团，并且通过使这样修饰的靶结合基团与鹅膏蕈碱–L–X*构建体(其中X*为羟基胺基团)反应来实现。

在其它实施方案中，甲酰基可通过甲酰基甘氨酸生成酶(FGE)(其对于识别序列CxPxR中的半胱氨酸基团是高度选择性的)来引入，以生成醛标签。这样的醛标签可与存在于鹅膏蕈碱–L–X*构建体中的适合的基团X*反应，特别地其中X*为

(参见Agarwal等人,Bioconjugate Chem 24(2013)846–851)。

在第二方面中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的缀合物。

在第三方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其用于治疗患者中的癌症，特别地其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。

如本文中所使用，疾病或病症的“治疗”意指实现以下一种或多种：(a)降低病症的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症的特征症状的发展；(c)抑制所治疗病症的特征症状的恶化；(d)限制或预防先前患有该病症的患者的病症复发；和(e)限制或预防先前有该病症症状的患者的症状复发。

如本文中所使用，治疗可包括向患者给药根据本发明的缀合物或药物组合物，其中“给药”包括体内给药，以及直接给药于离体组织，例如静脉移植物。

在具体的实施方案中，使用治疗有效量的本发明的缀合物。

“治疗有效量”是足以实现预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量会随诸如药剂的性质、给药途径、接受治疗剂的动物的大小和种类以及给药目的等因素而变化。每种个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域已建立的方法凭经验确定。

另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的鹅膏蕈碱衍生物，或鹅膏蕈碱衍生物与靶结合基团的本发明的缀合物，并且还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；和/或防腐剂。“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或者在美国药典或其它公认的药典中列出用于动物，更特别是人类。

在具体的实施方案中，药物组合物以全身给药的药物的形式使用。这包括肠胃外制剂，其中包括注射剂和输注剂。注射剂以安瓿的形式或所谓的即用型注射剂配制，例如，即用型注射器或一次性注射器，除此之外，用于多次抽取的可刺穿的烧瓶。注射剂的给药可以是皮下(s.c.)、肌内(i.m.)、静脉(i.v.)或皮内(i.c.)应用的形式。具体而言，可以生产分别合适的注射制剂，如晶体混悬剂、溶液、纳米粒或胶体分散系统，例如，水溶胶。

注射制剂还可生产为可用含水等张稀释剂溶解或分散的浓缩剂。输注剂也可以等张溶液、脂肪乳液、脂质体制剂和微乳液的形式制备。与注射剂相似，输注制剂也可以用于稀释的浓缩剂的形式制备。注射制剂还可以以恒定输注的形式应用于住院病人和门诊治疗中，例如通过微型泵。

可以向肠胃外药物制剂中加入例如白蛋白、血浆、扩容剂、表面活性物质、有机稀释剂、影响pH值的物质、络合物质或聚合物质，特别是影响本发明的靶结合基团毒素缀合物对蛋白质或聚合物的吸附的物质，或者它们也可以为了减少本发明的靶结合基团毒素缀合物对材料像注射工具或包装材料(例如塑料或玻璃)的吸附而加入。

包含靶结合基团的本发明的鹅膏蕈碱衍生物可在肠胃外制剂中与微载体或纳米粒结合，像例如与基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸或聚醚型聚氨酯的精细分散的颗粒结合。肠胃外制剂还可以被改变为贮库制剂，例如基于“多个单位原则”，如果本发明的靶结合基团毒素缀合物在药物中被分别以精细分散的、分散的或悬浮的形式或作为晶体的悬浮液引入，或者基于“单个单位原则”，如果本发明的靶结合基团毒素缀合物被包含在制剂中，例如在片剂中或随后被植入的棒中。这些以单个单位和多个单位制剂的植入物或贮库药物经常由所谓的生物可降解的聚合物像例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚型聚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或多糖组成。

在配制为肠胃外制剂的本发明的药物组合物生产期间加入的辅剂和载体特别是无菌水(灭菌水)，影响pH值的物质像例如有机或无机酸或碱以及其盐，调节pH值的缓冲物质，用于等张化的物质像例如氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖和果糖、表面活化剂和表面活性剂，分别地，以及乳化剂像例如聚氧乙烯山梨醇酐的脂肪酸偏酯(例如，吐温

)，或者例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯蓖麻油

)，脂肪油像例如花生油、豆油或蓖麻油，脂肪酸的合成酯像例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和中性油(例如

)，以及聚合辅剂像例如明胶、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，增加有机溶剂的溶解度的添加剂像例如丙二醇、乙醇、N,N-二甲基乙酰胺、丙二醇，或络合物形成物质像例如柠檬酸盐和尿素，防腐剂像例如苯甲酸羟丙基酯和甲酯、苯甲醇，抗氧化剂像例如亚硫酸钠，和稳定剂像例如EDTA。

当在优选的实施方案中将本发明的药物组合物配制为混悬剂时，加入防止本发明的靶结合基团毒素缀合物沉积的增稠剂，或确保沉积物再悬浮能力的表面活化剂和聚电解质，和/或络合物形成剂像例如EDTA。也可获得活性成分与多种聚合物的络合物。这样的聚合物的实例是聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纤维素、

或聚乙二醇山梨醇脂肪酸酯。本发明的靶结合基团毒素缀合物也可以包合物例如用环糊精的形式包含在液体制剂中。在具体的实施方案中，分散剂可作为另外的辅剂加入。为了生产冷冻干燥制剂，可使用支架剂像甘露醇、葡聚糖、蔗糖、人白蛋白、乳糖、PVP或明胶的变体。

实施例

在下文中，通过非限制性实施例更详细地解释本发明：

A.S-脱氧-α-鹅膏蕈碱HDP 30.0735的全合成

1.N-(叔丁氧羰基)-L-6-乙酰氧基-色氨酸HDP 30.2550的制备

将590.0mg(2.68mmol)6-羟基-L-色氨酸(CAS:13567-14-1)在30ml 1,4-二氧杂环己烷/水1:1(v,v)的混合物中悬浮。在氩气下，于环境温度下，一次性加入2.68ml(2.68mmol)1N NaOH。然后将所得的黄色溶液用574.6μl(2.68mmol)Boc酸酐(Boc₂O)处理，并在室温下搅拌24h。将溶液用1N盐酸酸化至pH 2.4，并用25ml乙酸乙酯萃取3次。将合并的乙酸乙酯萃取物用饱和NaCl溶液洗涤，并用MgSO₄干燥。过滤并蒸发至干燥得到785.0mg粗品物质。将粗品N-Boc-6-羟基-L-色氨酸在4.91ml(4.91mmol)1N NaOH中溶解，并用463.2ml(500.3mg,4.90mmol)乙酸酐处理。将反应混合物在氩气下搅拌3h，并用5％柠檬酸酸化。将水相用25ml乙酸乙酯萃取三次，用饱和NaCl洗涤，并用MgSO₄干燥。过滤并蒸发得到635mg粗品固体。

将粗品产物通过快速色谱法(在330g硅胶柱(检测波长254nm)上用CH₂Cl₂+1％乙酸至CH₂Cl₂/MeOH(15:1)+1％乙酸的梯度)纯化，并在与甲苯的共蒸发后得到564.4mg(56％收率)的白色粉末。

MS(ESI^-)实测值：361.08[M-H]^-；计算值：362.15(C₁₈H₂₂N₂O₆)

2.顺式,反式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-6-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚顺式-HDP 30.2555和反式HDP 30.2555(顺式,反式-6-乙酰氧基-Hpi)的制备

光氧化反应

所述光氧化反应用400W高压钠蒸气灯(Sirius X400灯230V,400W；在1.3m的距离下55000流明)或者用卤钨灯(500W)进行。将截除λ<490nm的光的滤光液(CuCl₂-CaCO₃)用于卤钨灯。

将亚甲蓝或玫瑰红用作染料敏化剂。

反应在500ml圆柱形反应容器(具有

硼硅酸盐玻璃制成的热交换套，平底且实验室扁法兰(flat laboratory flange(DN))，具有两个GL 18螺纹的连接器)中进行。灯至反应容器的距离为15cm，并且反应温度范围为3-4℃。

将最终产物在Teledyne ISCO快速色谱系统(具有330g Silica Redi Sept快速柱(Teledyne ISCO cat.69-2203-330))上纯化。溶剂CH₂Cl₂、CH₃OH、CH₃COOH为标准HPLC或BP级。

将干燥氧气(99.5％纯度)以2-4l/分钟的速率鼓泡通入反应混合物中。

将943.0mg(2.60mmol)N-(叔丁氧羰基)-L-6-乙酰氧基-色氨酸HDP 30.2550和100mg玫瑰红在500ml甲醇中溶解，并通过使用Huber低温恒温器(用乙二醇/水作为冷却介质)冷却至3℃。将反应溶液用400W高压钠蒸气灯照射。在照射期间，将缓慢的氧气流鼓泡通过反应溶液。在照射5h后，停止氧化和冷却，并将反应介质用10ml二甲基硫醚处理。将混合物搅拌2h，并通过使用旋转蒸发器(具有35℃的水浴温度)蒸发至干燥。将暗红色残渣在高真空中进一步干燥为1.20g的结晶固体。将粗产物在330g硅胶柱(检测波长254nm)上，用CH₂Cl₂+5％乙酸至CH₂Cl₂/MeOH(30:1)+5％乙酸的梯度纯化。洗脱得到380mg顺式-HDP30.2555和290mg反式-HDP 30.2555，并将其与甲苯共蒸发。在叔丁醇中冷冻干燥后，得到灰白色粉末形式的两个异构体。

顺式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-6-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(顺式-HDP30.2555)

380mg顺式-HDP 30.2555收率：39％

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝1.22,1.44,1.54[s,9H,C(CH₃)₃]；2.23(s,3H,OCOCH₃)；2.46-2.63(m,2H,CH₂)；4.14-4.29(m,1H,2-H)；5.35(s,1H,8a-H)；6.39-6.46(m,2H,7-H,5-H)；7.20-7.24(m,1H,4-H)

¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝20.93,28.45,31.12,42.80,61.12,69.44,82.21,85.82,87.93,104.97,112.98,124.84,129.42,151.51,154.04,155.97,171.34,175.79

MS(ESI⁺) 实测值：378.92[MH]⁺；计算值：378.14(C₁₈H₂₂N₂O₇)

MS(ESI⁺) 实测值：401.17[M+Na]⁺；计算值：401.14(C₁₈H₂₂N₂NaO₇)

UV/VIS(CH₃OH):λ_max＝296nm,239nm,215nm

λ_min＝266nm,227nm

反式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-6-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(反式-HDP30.2555)

290mg反式-HDP 30.2555收率：30％

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝1.22,1.45,1.54[s,9H,C(CH₃)₃]；2.22(s,3H,OCOCH₃)；2.55-2.73(m,2H,CH₂)；4.51-4.57(m,1H,2-H)；5.21-5.24(s,1H,8a-H)；6.36-6.41(m,2H,7-H,5-H)；7.17-7.18(m,1H,4-H)

¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝20.95,28.50,31.12,42.47,60.97,69.44,82.06,84.84,87.54,104.74,112.67,125.03,128.70,152.31,154.22,156.00,171.23,174.67

MS(ESI⁺) 实测值：379.00[MH]⁺；计算值：378.14(C₁₈H₂₂N₂O₇)

MS(ESI⁺) 实测值：779.00[2M+Na]⁺；计算值：779.28(C₃₆H₄₄N₄Na₂O₁₄)

UV/VIS(CH₃OH):λ_max＝299nm,241nm,215nm

λ_min＝268nm,228nm

3.S-脱氧-α-鹅膏蕈碱HDP 30.0735的制备

步骤1：HDP 30.0013

将FmocHypOH(10.0g，28.3mmol)悬浮在100ml 80％MeOH中，并加入Cs₂CO₃(4.6g，14.1mmol)。将悬浮液在50℃下搅拌30分钟直至完全溶解。将反应混合物浓缩至干燥，并于100ml DMF中再溶解。逐滴加入烯丙基溴(1.6ml，3.6g，29.7mmol)并将反应在室温下搅拌过夜。蒸馏出DMF，并将残余物溶于叔丁基甲基醚中。过滤沉淀物，并将澄清溶液吸附在硅藻土上，然后进行柱色谱分离。将化合物在220g硅胶上用正己烷/乙酸乙酯梯度进行纯化。

收率：11.5g,100％

步骤2：HDP 30.0400

将HDP 30.0013(5.0g，14.1mmol)、4-甲苯磺酸吡啶鎓(1.33g，5.3mmol)加入到1,3-二氢-2H-吡喃-2-基-甲氧基甲基树脂(5.0g，1.0mmol/g THP-树脂)于40ml二氯乙烷中的悬浮液中。将反应在80℃下搅拌过夜。冷却后，将树脂过滤并用二氯乙烷、二甲基甲酰胺、乙腈、二氯甲烷和叔丁基甲基醚充分洗涤。

装载量为0.62mmol/g(脱保护后通过芴甲基的紫外光谱测定)。

步骤3：HDP 30.2569(固相合成)

树脂预处理：

将HDP 30.0400(0.31g,0.25mmol)用N,N-二甲基巴比妥酸(241mg,1.55mmol)和Pd(PPh₃)₄(35mg,0.03mmol)处理。将树脂在室温下摇动过夜。之后将树脂用二氯甲烷、DMF、乙腈、二氯甲烷和叔丁基甲基醚充分洗涤，并在减压下干燥。

偶联操作：

将所有反应物和试剂在二氯甲烷/DMF(1:1,v/v)中溶解。将HDP 30.0477(参见WO2014/009025)(102mg,0.30mmol)在6.0ml二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺中溶解，并用4.0ml0.2N PyBOP/HOBt溶液和2ml DIEA(40％在DMF中)处理。在加入2.0ml N,N-二甲基甲酰胺后，将反应物通过微波辐射(20W,CEM微波反应器)加热至50℃持续8分钟，并在偶联后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤。

Fmoc-脱保护：

通过加入6.0ml N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶在50℃脱保护持续10分钟。将树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤(在最终氨基酸偶联后未脱保护)。

根据上述方案偶联所有其它氨基酸，称重如下所示：

完成后，将树脂最终转移入具有玻璃底的注射器，用DCM洗涤，并在减压下干燥。

树脂释放和B环形成

将5ml TFA、5ml DCM和10％MeOH的溶液吸入树脂，并在环境温度下摇动15分钟。将溶液分配入50ml反应瓶中，并将树脂用TFA/DCM 1:1加10％MeOH洗涤一次，并倒入同一烧瓶中。将反应瓶搅拌16h。加入三异丙基硅烷(0.5ml)，并将反应物真空浓缩。将残渣在500μlMeOH中溶解，并使肽在50ml冰冷TBME中沉淀。离心后，将上清液倾析，并将沉淀用50ml TBME洗涤一次，并在减压下干燥。

将沉淀在2ml甲醇中溶解，并通过制备型反相柱色谱法纯化。在减压下蒸除甲醇，并将剩余的水相冷冻干燥。

收率：136.5mg,62.5％

MS(ESI+) 实测值：1047.4[M+H]⁺；计算值：1047.4(C₄₅H₆₃N₁₀O₁₇S)

HPLC:91.9面积％

步骤4：环化(A-环形成,HDP 30.2572)

将上述冷冻干燥的单环中间体(136mg,130μmol)在16ml DMF中溶解，并用二苯基磷酰叠氮化物(DPPA,131μl,1300μmol,10eq)和二异丙基乙基胺(DIEA,162μl,1300μmol,10eq)处理。将反应物搅拌16h，并在完成后，用500μl水淬灭。通过HPLC监测转化。将混合物通过减压浓缩，在1ml甲醇中再次溶解，并通过制备型反相柱色谱法纯化。

收率：55.3mg,41％

MS(ESI+) 实测值：1029.33[M+Na]⁺；计算值：1030.10(C₄₅H₆₁N₁₀O₁₆S)

HPLC:99.2面积％

步骤5：乙酸酯脱保护(HDP 30.0735)

将HDP 30.2572(55.3mg,53.7μmol)在7N甲醇中的NH₃溶液(3.0ml)中溶解，并搅拌。通过HPLC/MS检查转化。完成(6–8h)后，将反应物真空浓缩，在100μl MeOH中再次悬浮，并通过制备型HPLC纯化。

收率：14.1mg,29％

HPLC:100％

MS(ESI+)实测值：903.3[M+H]⁺；计算值：902.9(C39H54N10O13S)

实测值：925.33[M+Na]⁺

4.6’-((3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-Val-Ala-PAB)-S-脱氧-α-鹅膏蕈碱(HDP30.2371)的制备

步骤1：HDP 30.2364

将S-脱氧-α-鹅膏蕈碱HDP 30.0735(30mg,33.2μmol)和HDP 30.1690(WO 2016/142049,78mg,133μmol＝4.0eq.)在1500μl干燥二甲基乙酰胺(DMA)中溶解。一次性加入0.2M碳酸氢铯水溶液(199μl,1.2eq.)，并将混合物在室温下搅拌。在1.5h和4h后，加入额外部分的99μl(0.6eq.)碳酸铯溶液。

18h后，将溶剂通过高真空蒸发。

将残渣在400μl甲醇中溶解，并滴加入冰冷的MTBE(10ml)中。在0℃下静止10min后，将所得的沉淀通过离心分离(4min,4000×g)。排出上清液，并将团块在另外的MTBE(10ml)中再悬浮，并重复离心。将真空干燥的粗产物在400μl甲醇中溶解，并通过制备型HPLC(Phenomenex Luna-C₁₈(2),10μm柱(250x 21.2mm)，含5％至100％甲醇的水的梯度)纯化。将产物流分合并，并减少至23mg(70％)无定形固体形式的产物。

MS(ESI+)[M+Na]⁺实测值：1430.58；计算值：1430.65(C₆₅H₉₇N₁₃NaO₁₈SSi)

通过蒸发早期的洗脱峰，回收了5mg(17％)的原料。

步骤2：HDP 30.2366

将HDP 30.2364(9.47mg,6.72μmol)在750μl三氟乙酸(TFA)中溶解。2分钟后，将挥发物真空移除，并将残渣在750μl水中溶解，并滴加3％氨直到达到pH 10，出现沉淀。

将溶液冻干，并随后通过制备型HPLC纯化(Phenomenex Luna-C₁₈(2),10μm柱250x21.2mm,含5-100％甲醇(0.05％TFA)的水(0.05％TFA)的梯度，以得到7.72mg(89％，基于TFA盐)产物。

MS(ESI⁺) [MH]⁺ 实测值：1178.42；计算值：1178.53(C₅₄H₇₆N₁₃O₁₅S)

步骤3HDP 30.2371

将HDP 30.2366(4.01mg,3.10μmol)在500μl干燥DMF中溶解。

将3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS,1.65mg,2eq.)在100μl DMF中溶解，随后加入2.1μl DIPEA。

在搅拌1h后，将反应混合物滴加入10ml冰冷的甲基叔丁基醚中。将管保持在冰上，持续10分钟，并以4000×g离心。将上清液移除，并将团块用10ml新鲜的甲基叔丁基醚洗涤。

将真空干燥的团块通过RP-18HPLC以含5-100％甲醇的水的梯度进行纯化。将纯流分蒸发至干燥，并由1ml叔丁醇/水冷冻干燥，以得到2.70mg(65％)无色粉末形式的产物。

MS(ESI+) [MH]⁺ 实测值：1329.3；计算值：1329.6(C₆₁H₈₁N₁₄O₁₈S)

[M+Na]⁺ 实测值：1351.5；计算值：1351.5(C₆₁H₈₀N₁₄NaO₁₈S)

B.S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺HDP 30.2548的全合成

1.N-(叔丁氧羰基)-L-5-乙酰氧基-色氨酸HDP 30.2531的制备

将800.0mg(3.63mmol)5-羟基-L-色氨酸(CAS:4350-09-8)在40ml 1,4-二氧杂环己烷/水1:1(v:v)的混合物中悬浮。在氩气下，于环境温度下，一次性加入3.64ml(3.64mmol)1N NaOH。然后将所得的黄色溶液用779.0μl(794.0mg,3.63mmol)Boc酸酐(Boc₂O)处理，并在室温下搅拌24h。将溶液用1N盐酸酸化至pH 2.4，并用35ml乙酸乙酯萃取3次。将合并的乙酸乙酯萃取物用饱和NaCl溶液洗涤，并用MgSO₄干燥。过滤并蒸发至干燥得到1.26g粗品物质。将粗品N-Boc-6-羟基-L-色氨酸在7.87ml(7.87mmol)1N NaOH中溶解，并用743.0μl(802.4mg,7.86mmol)乙酸酐处理。将反应混合物在氩气下搅拌3小时，并用5％柠檬酸酸化。将水相用25ml乙酸乙酯萃取三次，用饱和NaCl洗涤，并用MgSO₄干燥。过滤并蒸发。

将粗品产物通过快速色谱法(在330g硅胶柱(检测波长254nm)上用CH₂Cl₂+1％乙酸至CH₂Cl₂/MeOH(15:1)+1％乙酸的梯度)纯化，并在与甲苯的共蒸发后得到1020.0mg(78％收率)的白色粉末。

MS(ESI^-)实测值：361.08[M-H]^-；计算值：362.15(C₁₈H₂₂N₂O₆)

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝1.39(s,9H,C(CH₃)₃)；2.27(s,3H,OCOCH₃)；3.08-3.31(m,2H,CH₂)；4.39-4.41(m,1H,2-H)；6.81-6.83；7.13；7.24-7.26(m,2H,6-H,7-H)；7.30-7.32(1H,4-H)

2.顺式,反式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-5-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚顺式-HDP 30.2536和反式HDP 30.2536(顺式,反式-5-乙酰氧基-Hpi)的制备

光氧化反应

将亚甲蓝或玫瑰红用作染料敏化剂。

反应在500ml圆柱形反应容器(具有

将1.20g(3.17mmol)N-(叔丁氧羰基)-L-5-乙酰氧基-色氨酸HDP 30.2531和100mg玫瑰红在500ml甲醇中溶解，并通过使用Huber低温恒温器(用乙二醇/水作为冷却介质)冷却至3℃。将反应溶液用400W高压钠蒸气灯照射。在照射期间，将缓慢的氧气流鼓泡通过反应溶液。在照射4h后，停止氧化和冷却，并将反应介质用20ml二甲基硫醚处理。将混合物搅拌2h，并通过使用旋转蒸发器(具有35℃的水浴温度)蒸发至干燥。将暗红色残渣在高真空中进一步干燥为结晶固体。将粗产物在330g硅胶柱(检测波长254nm)上，用CH₂Cl₂+5％乙酸至CH₂Cl₂/MeOH(30:1)+5％乙酸的梯度纯化。

洗脱得到178mg顺式-HDP 30.2536和132mg反式-HDP 30.2536，并将其与甲苯共蒸发。在叔丁醇中冷冻干燥后，得到灰白色粉末形式的两个异构体。

顺式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-5-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(顺式-HDP30.2536)

178mg顺式-HDP 30.2536收率：15％

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝1.44,1.54(s,9H,C(CH₃)₃)；2.23(s,3H,OCOCH₃)；2.45-2.62(m,2H,CH₂)；4.18-4.33(m,1H,

2-H)；5.37(s,1H,8a-H)；6.63-6.67；6.82-6.84；(m,2H,7-H,6-H)；6.96-6.98(m,1H,4-H)

¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝20.86,28.46,31.12,42.81,61.21,82.14,85.60,111.49,117.83,123.98,132.77,144.99,148.03,156.07,172.01,175.89

MS(ESI^-) 实测值：377.17[M-H]^-；计算值：378.14(C₁₈H₂₂N₂O₇)

UV/VIS(CH₃OH):λ_max＝299nm,242nm,207nm

λ_min＝270nm,222nm

反式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-5-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(反式-HDP30.2536)

132mg反式-HDP 30.2536收率：11％

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝1.47,1.54[s,9H,C(CH₃)₃]；2.21(s,3H,OCOCH₃)；2.50-2.70(m,2H,CH₂)；4.51-4.56(m,1H,

2-H)；5.22-5.26(s,1H,8a-H)；6.58-6.63；6.80-6.81(m,6-H,7-H)；6.92(s,1H,4-H)

¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD,δ＝ppm)

δ＝20.88,28.50,31.12,42.60,61.11,82.05,85.38,111.26,117.88,124.07,131.94 144.66,148.95,156.11,172.01,174.81

MS(ESI⁺)实测值：379.00[MH]⁺；计算值：378.14(C₁₈H₂₂N₂O₇)

MS(ESI⁺)实测值：401.17[M+Na]⁺；计算值：401.14(C₁₈H₂₂N₂NaO₇)

MS(ESI^-)实测值：377.17[M-H]^-；计算值：378.14(C₁₈H₂₂N₂O₇)

UV/VIS(CH₃OH):λ_max＝302nm,244nm,208nm

λ_min＝272nm,224nm

3.S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺HDP 30.2548的制备

步骤1：HDP 30.0013

将FmocHypOH(10.0g，28.3mmol)悬浮在100ml 80％MeOH中，并加入Cs₂CO₃(4.6g，14.1mmol)。将悬浮液在50℃下搅拌30分钟直至完全溶解。将反应混合物浓缩至干燥，并于100mlDMF中再溶解。逐滴加入烯丙基溴(1.6ml，3.6g，29.7mmol)并将反应在室温下搅拌过夜。蒸馏出DMF，并将残余物溶于叔丁基甲基醚中。过滤沉淀物，并将澄清溶液吸附在硅藻土上，然后进行柱色谱分离。将化合物在220g硅胶上用正己烷/乙酸乙酯梯度进行纯化。

收率：11.5g,100％

步骤2:HDP 30.0400

装载量为0.62mmol/g(脱保护后通过芴甲基的紫外光谱测定)。

步骤3：HDP 30.2544(固相合成)

树脂预处理：

偶联操作：

Fmoc-脱保护:

根据上述方案偶联所有其它氨基酸，称重如下所示：

树脂释放和B环形成

收率：75.1mg,35.9％

MS(ESI⁺)实测值：1047.4[M+H]⁺；计算值：1047.4(C₄₅H₆₃N₁₀O₁₇S)

HPLC:99.3面积％

步骤4：环化(A-环形成,HDP 30.2546)

将上述冷冻干燥的单环中间体(49.4mg,47.2μmol)在3ml DMF中溶解，并用二苯基磷酰叠氮化物(DPPA,13μl,237μmol,5eq)和二异丙基乙基胺(DIEA,40μl,237μmol,5eq)处理。将反应物搅拌16h，并在完成后，用500μl水淬灭。通过HPLC监测转化。将混合物通过减压浓缩，在1ml甲醇中再次溶解，并通过制备型反相柱色谱法纯化。

收率：32.5mg,67.9％

MS(ESI⁺) 实测值：[M+H]⁺1029.33[MH]⁺1051.3[M+Na]⁺；计算值：1029.39；1051.42(C₄₅H₆₁N₁₀O₁₆S；C₄₅H₆₀N₁₀O₁₆SNa)

HPLC:88.3面积％

步骤5：乙酸酯脱保护(HDP 30.2548)

将HDP 30.2546(23.4mg,22.7μmol)在7N甲醇中的NH₃溶液(2.3ml)中溶解，并搅拌。通过HPLC/MS检查转化。完成(6–8h)后，将反应物真空浓缩，在100μl MeOH中再次悬浮，并通过制备型HPLC纯化。

收率：12.5mg,53.3％

HPLC:99％

MS(ESI⁺) 实测值：903.4[M+H]⁺；计算值：902.9(C₃₉H₅₄N₁₀O₁₃S)

实测值：925.4[M+Na]⁺

5.5’-((3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-Val-Ala-对氨基苄氧基)-S-脱氧-三羟鹅膏毒肽酰胺(HDP30.2602)的制备

步骤1：HDP 30.2563

将S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺HDP 30.2548(9.66mg,10.7μmol)和HDP30.1690(WO2016/142049,50.2mg,85.6μmol＝8.0eq.)在500μl干燥二甲基乙酰胺(DMA)中溶解。一次性加入1.0M碳酸氢铯水溶液(17.12μl,1.6eq.)，并将混合物在室温下搅拌。

在1.5h后，加入额外部分的17.12μl(1.6eq.)碳酸铯溶液。

8h后，将反应混合物用乙酸中和，通过离心过滤机(0.2μm)，并通过HPLC(Phenomenex Luna-C₁₈(2),10μm柱(250x 21.2mm)，以含(5-100％)乙腈的水的梯度)纯化。将产物流分合并，并减少至4.00mg(26％)无定形固体形式的产物。

MS(ESI⁺) [M+Na]⁺ 实测值：1430.58；计算值：1430.65(C₆₅H₉₇N₁₃NaO₁₈SSi)

步骤2：HDP 30.2378

将HDP 30.2563(7.53mg,5.34μmol)在500μl三氟乙酸/水/三异丙基硅烷95:5:5的混合物中溶解。5分钟后，将挥发物真空移除，并将残渣在1000μl水中溶解，并滴加3％氨直到达到pH 10。

将溶液冻干，并随后通过制备型HPLC纯化(Phenomenex Luna-C₁₈(2),10μm柱250x21.2mm,16分钟内含20-30％乙腈的水(0.05％TFA)的梯度)，以得到3.95mg(57％，基于TFA盐)产物。

MS(ESI⁺) [M+H]⁺ 实测值：1178.50；计算值：1178.53(C₅₄H₇₆N₁₃O₁₅S)

步骤3HDP 30.2602

将HDP 30.2578(3.95mg,3.06μmol)在400μl干燥DMF中溶解。

将3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS,1.63mg,2eq.)在81.4μlDMF中溶解，随后加入2.1μl(2eq.)DIPEA。

在搅拌2h后，将反应混合物通过离心过滤机(0.2μm)，并通过RP-18HPLC以含5-70％乙腈的水+0.05％TFA.的梯度纯化。将纯流分蒸发至干燥，并由2ml乙腈/水1:1冷冻干燥，得到2.73mg(67％)无色粉末形式的产物。

MS(ESI+) [M+H]⁺ 实测值：1329.33；计算值：1329.56(C₆₁H₈₁N₁₄O₁₈S)

C.S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的全合成

1.顺式,反式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-4-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚；顺式-和反式(顺式,反式-4-乙酰氧基-Hpi)的合成的示意图

2.S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的合成的示意图

D.S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的全合成

1.顺式,反式-1-(叔丁氧羰基)-2-羧基-3a-羟基-4-乙酰氧基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚；(顺式,反式-4-乙酰氧基-Hpi)的合成

与顺式,反式-4-乙酰氧基-Hpi的合成类似，由市售可得的7-羟基-L-色氨酸(而不是4-羟基-L-色氨酸)开始，进行顺式,反式-7-乙酰氧基-Hpi的合成。

2.S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的合成的示意图

与S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的合成类似，使用顺式,反式-7-乙酰氧基-Hpi代替顺式,反式-4-乙酰氧基-Hpi，进行S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的合成。

6.S-脱氧-α-鹅膏蕈碱HDP 30.0735和S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺HDP30.2548的体外细胞毒性

在HEK293和HEK293 OATP1B3细胞上的BrdU细胞增殖测定

HEK293-OATP1B3细胞培养平板用多聚-D-赖氨酸包被。

用多聚-D-赖氨酸包被：

ο 50ml无菌水中的5mg多聚-D-赖氨酸

ο在96孔板的各孔中50μl

ο在RT下孵育1h

ο用200μl无菌水洗涤孔两次

ο干燥至少2h(RT)

制备具有清底的黑色96孔板(具有2.0x 10³HEK293和HEK293 OATP1B3细胞/孔，以及90μl生长培养基(包含10％FCS和补剂)/孔)。对照：设置具有100μl培养基而没有细胞的“空白”，100μl培养基中的细胞设置为“背景”和“100％”。

·在37℃和5％CO₂下孵育24h。

HDP 30.0735、HDP 30.2548和α-鹅膏蕈碱的稀释方案：

将储备溶液在培养基中以1:1000稀释(1:10和1:100稀释)：

10μl鹅膏蕈碱衍生物储备溶液(1.0x 10^-2M)+90μl PBS＝100μl 1.0x 10^-3M

2μl稀释+198μl培养基＝200μl 1x10^-5M

进一步稀释：

A:200μl 1.0x10^-5 M

B:80μl生长培养基+20μl溶液A(1:5稀释)

C:80μl生长培养基+20μl溶液B(1:5稀释)

D:80μl生长培养基+20μl溶液C(1:5稀释)

E:80μl生长培养基+20μl溶液D(1:5稀释)

F:80μl生长培养基+20μl溶液E(1:5稀释)

G:80μl生长培养基+20μl溶液F(1:5稀释)

H:80μl生长培养基+20μl溶液G(1:5稀释)

将10μl各溶液加入至孔中(一式三份)。最终体积：100μl/孔。

最终剂量：起始1x 10^-6M；1:5稀释系列。

·在37℃和5％CO₂下孵育96h。

·96h后：Roche细胞增殖测定，根据制造商说明书测定发光。

·EC₅₀-浓度用Graphpad Prism 4.0数据分析软件确定。

7.：HDP 30.2347、HDP 2371和30.2602缀合物的合成

实施例：T-D265C-30.2371的合成

PBS缓冲液中的10mg Thiomab T-D265C用于缀合至HDP 30.2371。

调节抗体溶液至1mM EDTA：

2ml抗体溶液(10.0mg)+20μl 100mM EDTA,pH 8.0

抗体量：10mg＝6.9x 10^-8mol

半胱氨酸脱帽(uncapping)通过抗体与40当量的TCEP反应进行：

-2ml抗体溶液(6.9x 10^-8mol)+55.2μl 50mM TCEP溶液(2.76x 10^-6mol)

-在振荡器上于37℃下孵育3h。

-在Slide-A-Lyzer透析盒20,000MWCO中，在2.0l 1×PBS，1mM EDTA，pH 7.4中在4℃下连续透析两次，第一次透析大约4小时，第二次透析过夜

通过抗体与20当量的脱氢抗坏血酸(dhAA)反应进行氧化：

-大约2ml抗体溶液(6.9×10^-8mol)+27.6μl新鲜的50mM dhAA溶液(1.38×10^- ⁶mol)

-在振荡器上在室温下孵育3h。

使用6当量的HDP 30.2371与鹅膏蕈碱缀合并用25当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸淬灭：

将2mg HDP 30.2371溶解于200μl DMSO中＝10μg/μl

-大约2ml抗体溶液(＝9.5mg；6.53x 10^-8mol)+52.1μl HDP 30.2371(＝520.8μg；3.92x10^-7mol)。

-在室温下孵育1小时。

-通过加入16.3μl 100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(1.63×10^-6mol)淬灭。

-在室温下孵育15分钟(或在4℃下过夜)。

-使用pH 7.4的1×PBS平衡的1x PD-10柱纯化反应混合物。在石蜡膜上用Bradford试剂鉴定含蛋白质的流分，并将含蛋白质的流分合在一起。

-在2.0l PBS，pH 7.4和Slide-A-Lyzer透析盒20,000MWCO中，在4℃下过夜透析抗体溶液。

通过LC-ESI-MS-分析测定DAR。

将蛋白质浓度调节至5.0mg/ml(3.4×10^-5M)，并通过过滤使其达到无菌状态。在4℃下储存。

由此制备具有不同的抗体或具有不同的鹅膏蕈碱衍生物的ADC。根据各个抗体的MW计算抗体的分子量。相应地调节连接基毒素、TCEP、dhAA、N-乙酰基-L-半胱氨酸的量，以达到各自的当量。

8.HDP 30.2347、HDP 2371和30.2602缀合物的体外细胞毒性

在SKBR-3、JIMT-1、LnCap和22rv1细胞上的BrdU细胞增殖测定：

如上文(6.)中描述进行测定，具有以下变化：

细胞培养平板未用多聚-D-赖氨酸包被。

·ADC的稀释方案：

·将储备溶液在生长培养基中稀释至1.0x 10^-6M

进一步稀释：

A:100μl 1.0x 10^-6M

B:80μl生长培养基+20μl溶液A(1:5稀释)

C:80μl生长培养基+20μl溶液B(1:5稀释)

D:80μl生长培养基+20μl溶液C(1:5稀释)

E:80μl生长培养基+20μl溶液D(1:5稀释)

F:80μl生长培养基+20μl溶液E(1:5稀释)

G:80μl生长培养基+20μl溶液F(1:5稀释)

H:80μl生长培养基+20μl溶液G(1:5稀释)

·将10μl各溶液加入至孔中(一式三份)。最终体积：100μl/孔。

最终剂量：起始1x10^-7M；1:5稀释系列。

在Raji细胞和Nalm-6细胞上的WST-I测定：

·制备具有透明F-底的96孔板(具有2.0x 10³细胞/孔，以及90μl各个生长培养基(包含10％FCS和补剂)/孔)。对照：设置具有100μl培养基而没有细胞的“空白”，100μl培养基中的细胞设置为“仅细胞”。

·在37℃和5％CO₂下孵育24h。

·ADC的稀释方案：

·将储备溶液在生长培养基中稀释至1.0x 10^-6M

进一步稀释：

A:100μl 1.0x 10^-6M

B:80μl生长培养基+20μl溶液A(1:5稀释)

C:80μl生长培养基+20μl溶液B(1:5稀释)

D:80μl生长培养基+20μl溶液C(1:5稀释)

E:80μl生长培养基+20μl溶液D(1:5稀释)

F:80μl生长培养基+20μl溶液E(1:5稀释)

G:80μl生长培养基+20μl溶液F(1:5稀释)

H:80μl生长培养基+20μl溶液G(1:5稀释)

·将10μl各溶液加入至孔中(一式三份)。最终体积：100μl/孔。

最终剂量：起始1x10^-7M；1:5稀释系列。

·在37℃和5％CO₂下孵育96h。

·96h后：根据制造商说明书进行Roche WST-1细胞增殖测定。

·EC₅₀-浓度用Graphpad Prism 4.0数据分析软件确定。

Claims

1.式I的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物，

P₁为氢或保护基；

P₂为氢或保护基，特别是保护基；并且

R2选自OH、OR1和由1-7个氨基酸残基组成的多肽链。

2.权利要求1的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物，其中所述保护基当存在时独立地选自Boc、PhCH₂OCO-、CH₂＝CHCH₂O-CO-和三苯甲基。

3.权利要求1或2的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物，其中取代基R1-C(＝O)-O-连接至式I的5位。

4.权利要求1或2的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物，其中取代基R1-C(＝O)-O-连接至式I的6位。

5.合成包含鹅膏蕈碱衍生物的八个氨基酸残基的线性前体的方法，所述鹅膏蕈碱衍生物含有羟基化色氨酸基团，所述方法包括在所述前体的肽合成中使用权利要求1-5中任一项的2-羧基-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的羟基取代的衍生物的步骤。

6.合成包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物的方法，其包括以下步骤：

(i)导致或使得权利要求5的线性前体的半胱氨酸残基与色氨酸基团之间形成键；以及

(ii)通过权利要求5的线性前体的N端与所述前体的C端反应而导致或使得形成所述鹅膏蕈碱衍生物。

7.权利要求6的方法，其还包括所述半胱氨酸基团的硫原子的氧化以形成亚砜或砜，特别是亚砜。

8.包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物，其选自(i)S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽、4’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽、7’-羟基-三羟鹅膏毒肽，(ii)S-脱氧-4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、4’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺、S-脱氧-7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺和7’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺，(iii)(i)的鹅膏蕈碱的衍生物，其中氨基酸1的游离羧酸基团转化为羧酸酯–C(＝O)OR1或转化为基团–C(＝O)NH-OR1，其中R1选自烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的芳基和取代的杂芳基。

9.权利要求8的鹅膏蕈碱衍生物，其选自S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、5’-羟基-三羟鹅膏毒肽、S-脱氧-5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺和5’-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺。

10.缀合物，其包含(a)权利要求8或9的包含羟基化色氨酸基团的鹅膏蕈碱衍生物；(b)靶结合基团；和(c)任选存在的连接所述鹅膏蕈碱衍生物和所述靶结合基团的连接基。

11.药物组合物，其包含权利要求8或9的鹅膏蕈碱衍生物或者权利要求10的缀合物。

12.权利要求8或9的鹅膏蕈碱衍生物、权利要求10的缀合物或者权利要求11的药物组合物，其用于治疗患者中的癌症，特别地，其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。

13.构建体，其包含(a)权利要求8或9的鹅膏蕈碱衍生物；和(b)带有反应性基团Y的连接基团，所述反应性基团Y用于将所述鹅膏蕈碱衍生物连接至靶结合基团。