JP7165720B2 - アマニチンの新規な合成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、中央のトリプトファン部分に結合したOH基を有するアマニチン誘導体を合成するための新規方法に関する。
本発明はさらに、中央のトリプトファン部分の4’、5’または7’位に結合するOH基を有する、新規なアマニチン誘導体、そのようなアマニチン誘導体の新規な複合体、およびそのような複合体を含む医薬組成物に関する。
アマトキシンは、Amanitaphalloidesのキノコに見られる8個のアミノ酸で構成される環状ペプチドである(図1を参照)。
アマトキシンは、哺乳類細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼIIを特異的に阻害し、それにより影響を受ける細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。
細胞での転写の阻害は、成長と増殖の停止を引き起こす。
共有結合はしないが、アマニチンとRNAポリメラーゼIIの複合体は非常に強固である(KD=3ナノモル)。
酵素からのアマニチンの解離は非常に遅いプロセスであるため、影響を受けた細胞の回復はほとんどない。
転写の阻害が長すぎると、細胞はプログラムされた細胞死(アポトーシス)を起こす。
Davis & Prestonは、結合位置を、7’位と特定した。
Morris & Ventonは、7’位での置換が、細胞傷害活性を維持する誘導体を齎すことも実証した(Morris & Venton、Int.J.Peptide Protein Res.21(1983)419-430)。
さらに、乳癌細胞(MCF-7)、バーキットリンパ腫細胞(Raji)およびTリンパ腫細胞(Jurkat)の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果を示した。
アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含むリンカーを含む、リンカーの使用が提案されたが、そのような構築物は実際には示されておらず、結合部位などの詳細は、アマトキシンでは、提供されなかった。
(i)アマトキシンアミノ酸1のγC-原子、
(ii)アマトキシンアミノ酸4の6’C-原子、または
(iii)アマトキシンアミノ酸3のδC-原子、
を介してアマトキシンに結合している複合体を記載しており、それぞれの場合、当該抗体は、アマトキシンと、直接またはリンカーを介して抗体と結合する。
提案されたリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等の要素を含む。
さらに、乳がん細胞(細胞株MCF-7)、膵臓がん(細胞株Capan-1)、結腸癌(細胞株Colo205)、および胆管癌(細胞株OZ)の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果が示された。
さらに、特許出願PCT/EP2016/078984[WO 2017/089607として公開]は、容易に入手可能な(2S、3R、4S)-L-4-ヒドロキシイソロイシンを、出発材料の1つとして使用した、γ-およびε-アマニチンの誘導体の全合成について記述している。
しかしながら、これらの方法、および、これまで追求してきた、他のすべての完全な、または部分的な合成アプローチは、Savige-Fontanaに記載の方法を用いて、アマトキシンのコアに、中央のトリプトファン部分を組み込むものである。
この方法では、シス-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール(「Hpi」)が、直鎖アマニチン前駆体構造に組み込まれる。
酸触媒Hpi-システインカップリング反応では、中心のトリプトファン部分を有するアマンチニ環系が形成される。
したがって、Savige-Fontanaによる方法から得られるアマニチン生成物は、さらなる置換基のない中心トリプトファン部分を含む。
天然に存在する、α-、β-、γ-、およびε-アマニチンは、しかしながら、中心の6’-ヒドロキシ-トリプトファン部分を含み、その6’-ヒドロキシ基は、アマニチンの官能化のための官能基として、たとえば、直接またはリンカーを介して、標的部分に結合することによって、成功裏に使用されてきた(たとえば、WO 2010/115629、WO 2010/115630、およびWO2012/041504を参照)。
したがって、合成アマニチンの場合、上記のように、
(i)アマトキシンアミノ酸1のγC-原子を介して、または
(ii)アマトキシンアミノ酸3のδC-原子を介して、あるいは、
WO 2012/119787に記載されているように、トリプトファン部分の窒素原子を介して官能化を行う必要があった。
しかし、Hpiのインドール部分のフェニル環に結合した置換基を有する誘導体は、これまでに記載されていない。
過去に追行したアプローチは、これらのアマニチンにおいて、コアのトリプトファン部分に結合している6’-ヒドロキシ部分が、組み込まれないので、α-、β-、γー、および/またはε-アマニチンの天然構造は、まだ得られなかったという事実によって制限されていた。
したがって、合成アマニチンを官能化するためのオプションはこれまでかなり制限されてきた。
さらに、官能化に利用可能なオプションの範囲を拡大することが非常に望ましいからである。
なぜなら、立体障害や反応性のような因子は、合成アマニチンおよびその複合体の反応性、生物活性および/または安定性に強い影響を与える可能性があるからである。
しかし、非常に有毒のアマニチンを含む複合体の安定性および有効性は、ヒトへの投与のための治療分子として想定される使用のために最も重要である。
従って、中央のトリプトファン部分のフェニル環に結合したOH基を有するアマトキシンを合成する、コスト効率的かつ堅牢な方法の大きな必要性が依然として存在する。
特に、確立されたSavige-Fontana反応において使用でき、そして、そのようなOH基の取り込みを引き起こすことができるようにセットアップされた出発物質を特定する、強い必要性がある。
本発明は、アマニチン誘導体の合成において、OH基の導入を可能にする、Hpiの変異体を合成できるという予想外の観察に基づいている。
R1は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され;
P1は、水素または保護基、特に、Boc、PhCH2OCO-、CH2=CHCH2O-CO-、およびトリチルから選択される保護基であり、
P2は、水素または保護基、特に、保護基であり、特に、Boc、PhCH2OCO-、CH2=CHCH2O-CO-、およびトリチルから選択される保護基であり、および、
R2は、OH、OR1、および1~7個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
(i)システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする;そして、
(ii)本発明の直鎖状前駆体のN‐末端を、前記前駆体のC‐末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすかまたは可能にする。
(i)S-デスオキシ-4’-OH-アマニン、4’-OH-アマニン、S-デスオキシ-5’-OH-アマニン、5’-OH-アマニン、S-デスオキシ-7’-OH-アマニン、7’-OH-アマニン、
(ii)S-デスオキシ-4’-OH-アマニンアミド、4’-OH-アマニンアミド、S-デスオキシ-5’-OH-アマニンアミド、5’-OH-アマニンアミド、S-デスオキシ-7’-OH-アマニンアミド、および7’-OH-アマニンアミド、
(iii)(i)に記載のアマニチンの誘導体、
から選択された、水酸化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体に関し、
ここで、アミノ酸1の遊離カルボン酸部分は、カルボン酸エステル、‐C(=O)OR1または、部分-C(=O)NH-OR1へ変換され、
R1は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択される。
(a)本発明の水酸化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体;
(b)標的結合部分、および;
(c)所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー;
を含む複合体に関する。
(a)本発明のアマニチン誘導体;および
(b)前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Yを担持するリンカー部分、を含む構築物に関連する。
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の、特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、これらは異なる場合があることを理解されたい。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
一方、任意の追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群も、追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群が存在しない実施態様を含めて、所望により、存在していてもよい。
そのような後者の実施形態では、「含む」という用語は、「からなる」と隣接して使用される。
ここで引用された各文書(すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書、GenBankアクセッション番号シーケンス・サブミッションなどを含む)は、上記または下記にかかわらず、それぞれの特許法において、可能な範囲でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書のいかなるものも、本発明が、先行発明によって、そのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
以下の節で、本発明の異なる側面をより詳細に定義する。
そのように定義された各局面は、明確に反対に示されない限り、他の任意の局面と組み合わすことができる。
特に、好ましいまたは有利であると示されている特徴は、好ましいまたは有利であると示されている他の特徴と組み合わせることができる。
R1は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され;
P1は、水素または保護基であり;
P2は、水素または保護基であり;および、
R2は、OH、OR1、および1~7個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
当業者は、当技術分野で利用可能であり、窒素原子を保護する必要がある場合には、対応する窒素原子に結合することができ、N-保護はもはや必要でないときには除去することができる、異なる保護基に非常に詳しい。
特定の実施形態では、N‐保護は、N‐アシル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、P1および/またはP2はアシル基である。
特定の他の実施形態では、N‐保護は、N‐アルキル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、P1および/またはP2はアルキル基である。
別の特定の実施形態では、2位に結合した官能基に関して、位置3aのヒドロキシ基と位置8aの水素原子がトランス配置である。
特定の実施形態では、本発明によるアミノ置換誘導体は、シスーおよびトランスー配置を有する化合物の混合物である。
(i)システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする;そして
(ii)本発明の直鎖状前駆体のN‐末端を、前記前駆体のC‐末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすまたは可能にする。
(i)S-デスオキシ-4’-OH-アマニン、4’-OH-アマニン、S-デスオキシ-5’-OH-アマニン、5’-OH-アマニン、S-デスオキシ-7’-OH-アマニン、7’-OH-アマニン、
(ii)S-デスオキシ-4’-OH-アマニンアミド、4’-OH-アマニンアミド、S-デスオキシ-5’-OH-アマニンアミド、5’-OH-アマニンアミド、S-デスオキシ-7’-OH-アマニンアミド、7’-OH-アマニンアミド、
(iii)(i)に記載のアマニチン誘導体;
から選択され、ここで、アミノ酸1の遊離カルボン酸部分は、カルボン酸エステルC(=O)OR1または-C(=O)NH-OR1部分に変換される。
ここで、R1は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアルキル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールから選択される。
(a)本発明のヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体;
(b)標的結合部分;および
(c)所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー。
(a)本発明のアマニチン誘導体;および
(b)前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Yを担持するリンカー部分、
を含む構築物に関連する。
本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、アマニタ属から単離された、8個のアミノ酸から構成されるすべての環状ペプチドを含み、Wieland,T.およびFaulstich H.(WielandT,Faulstich H.,CRC Crit Rev Biochem.5(1978)185-260)に記載されている、
本発明の文脈において、用語「アマニチン」は、以下に基いた、二環式構造を指す。
1位のアスパラギン酸またはアスパラギン残基、
2位のプロリン残基、特に、ヒドロキシプロリン残基、
3位のイソロイシン、ヒドロキシイソロイシンまたはジヒドロキシイソロイシン、
4位のヒドロキシトリプトファン残基、
5位および7位のグリシン残基、
6位のイソロイシン残基、および
8位のシステイン残基、特に、酸化されてスルホキシドまたはスルホン誘導体になったシステイン誘導体(アマニチンの番号付けと代表例については、図1を参照してください)。
さらに、そのすべての化学誘導体を含み、
さらにそのすべての半合成類似体;
さらに、天然化合物(環状、8個のアミノ酸)のマスター構造によるビルディングブロックから構築されたそのすべての合成類似体、
さらに、ヒドロキシル化アミノ酸の代わりに、非ヒドロキシル化アミノ酸を含むすべての合成または半合成類似体(ただし、トリプトファン部分のフェニル環に少なくとも1つのヒドロキシ基が存在する)、さらに、哺乳類のRNAポリメラーゼIIを阻害することによる、任意のそのような誘導体または類似体が機能的に活性である各場合の、すべての合成または半合成類縁体。
好ましいアマトキシンは、上に定義した、リンカー分子または標的結合部分と反応できる官能基(たとえば、カルボキサミドまたはヒドロキサム酸などのカルボン酸基またはカルボン酸誘導体、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールまたはチオール捕捉基)を有するものである。
本発明の複合体に特に適しているアマトキシンは、図1に示すように、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマヌリン、またはアマヌリン酸のジデオキシ変異体、あるいは、アマニン、アマニンアミド、γ-アマニン、またはγ-アマニンアミドのモノデオキシ変異体ならびにその塩、化学誘導体、半合成類似体、および合成類似体である。
たとえば、90%を超える純度は、本発明の複合体を、90%を超えて含む組成物1ミリグラムを意味し、すなわち、900マイクログラムを超えるそのような複合体を含むことを意味する。
残りの部分、すなわち不純物には、未反応の出発物質と他の試薬、溶媒、切断生成物および/または副産物が含まれる可能性がある。
したがって、たとえば、従来技術の複合体の複雑な調製物におそらく存在する可能性がある本発明の複合体の微量は、明示的に除外される。
本出願の文脈における好ましい標的結合部分は、
(i)抗体またはその抗原結合フラグメント;
(ii)抗体様タンパク質;および
(iii)核酸アプタマー、である。
本発明における使用に適した「標的結合部位」は、典型的に、分子量40000Da(40kDa)以上を有する。
特に、標的分子は、腫瘍関連抗原、特に、1つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に、非腫瘍細胞の表面と比較して、増加した濃度および/または異なる立体配置で存在する抗原またはエピトープである、
特に、前記抗原またはエピトープは、1つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に存在するが、非腫瘍細胞の表面には存在しない。
特定の実施形態では、標的結合部分は、PSMA、CD19、CD269、シアリルルイスa(sialyl Lewisa)、HER-2/neuおよび上皮細胞接着分子(EpCAM)から選択される抗原のエピトープに特異的に結合する。
他の実施形態において、前記抗原またはエピトープは、自己免疫疾患に関与する細胞上で優先的に発現される。
特定のそのような実施形態では、標的結合部分は、IL-6受容体(IL-6R)のエピトープに特異的に結合する。
したがって、「その抗原結合フラグメント」という用語は、少なくとも機能的な抗原結合ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。
また、含まれるのは、標的タンパク質、たとえば、PSMA、CD19、CD269、sialylLewisa、HER-2/neuおよびEpCAMから選択される標的タンパク質に、特異的に結合する、たとえば、ファージディスプレイを含む技術を介して選択される、免疫グロブリン様タンパク質である。
本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであり得る。
本発明での使用に適した「抗体およびその抗原結合フラグメント」には、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロ複合体、多重特異性、ヒト、ヒト化(特に、CDR移植)、脱免疫、または、キメラ抗体、単鎖抗体(たとえば、scFv)、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、ダイアボディまたはテトラボディ(HolligerP.ら、Proc Natl Acad Sci USA.90(1993)6444-8)、ナノボディ、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(anti-idiotypic (anti-Id) antibodies)(たとえば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変ドメインを、単独で、または以下の全体または一部と組み合わせて含んでもよい:ヒンジ領域、CL、CH1、CH2、およびCH3ドメイン。
また、ヒンジ領域、CL、CH1、CH2、およびCH3ドメインと可変ドメインの任意の組み合わせを含む抗原結合フラグメントも本発明に含まれる。
特に、抗体は、ヒト、げっ歯類(たとえば、マウス、ラット、モルモット、またはウサギ)、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、またはイヌの起源からです。
抗体が、ヒトまたはマウス起源であることが特に好ましい。
本明細書で使用される、「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、そして、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または、1つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックであって、そして、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離される抗体が含まれる(たとえば、Kucherlapati & Jakobovitsによる米国特許第5,939,598号に記載されている。)。
典型的には、そのような抗体様タンパク質は、両端でタンパク質足場に結合した、少なくとも1つの可変ペプチドループを含む。
この二重の構造上の制約により、抗体様タンパク質の結合親和性が、抗体のそれに匹敵するレベルまで大幅に増加する。
可変ペプチドループの長さは、通常、10~20個のアミノ酸から成る。
足場タンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。
特に、足場タンパク質は小さな球状タンパク質である。
抗体様タンパク質には、アフィボディ、アンチカリン、および設計されたアンキリンリピートタンパク質が含まれるが、これらに限定されない(レビューについては、Binzら、Nat Biotechnol.2005、1257-68を参照)。
抗体様タンパク質は、変異体の大きなライブラリーに由来し、たとえば、大きなファージディスプレイライブラリーからパニングされ(panned)、通常の抗体と同様に単離されうる。
また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質の表面に露出した残基のコンビナトリアル変異誘発によって得ることができる。
核酸アプタマーは、DNAまたはRNA分子であり得る。
アプタマーは、修飾、たとえば、2’-フッ素置換ピリミジンなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
リンカーが結合の場合、アマトキシンの抗体への直接結合により、アマトキシンがRNAポリメラーゼIIと相互作用する能力が低下する可能性がある。
特定の実施形態では、リンカーは、2つの成分間の距離を増加させ、本事例では、抗体とアマトキシンとの間など、これらの成分間の立体干渉を軽減する。
特定の実施形態では、リンカーは、その主鎖において、1~30個の原子の連続鎖(たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30原子)を有する。
つまり、リンカーの長さは、アマトキシン部分と抗体の間の原子または結合の数によって測られる最も短い結合として定義される。
ここで、リンカー主鎖の一方の側はアマトキシンと反応し、他方の側は抗体と反応しうるか、または反応した。
本発明の文脈において、リンカーは、特に、所望により置換された、C1-20-アルキレン、C1-20-ヘテロアルキレン、C2-20-アルケニレン、C2-20-ヘテロアルケニレン、C2-20-アルキニレン、C2-20-ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、またはヘテロアラルキレン基である。
リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの1つまたは複数の構造要素を含んでもよい。
リンカーは、これらの構造要素の2つ以上の組み合わせを含むこともできる。
これらの構造要素のそれぞれは、リンカー内に1回以上、たとえば、2回、3回、4回、5回、または6回存在してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含んでもよい。
リンカーは、アマトキシンおよび抗体に対して、単一のステップで、またはその後の2つ以上のステップで結合する必要があることが理解されている。
そのために、リンカーは、特に近位端と遠位端に2つの基を持つ。これは、
(i)リンクされる成分の1つに存在する基、特にアマトキシンまたは標的結合ペプチドの活性化された基に共有結合を形成できるか、または
(ii)アマトキシン上の基と共有結合を形成するために活性化されているか、または活性化できる。
したがって、そのようなカップリング反応の結果である化学基、たとえば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合などが、リンカーの遠位端および近位端にあることが好ましい。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも60%がC原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
特定の実施形態において、アルキレン基は、低級アルキレン基であってもよい。
「低級アルキレン」という用語は、1~6個の炭素原子、特定の実施形態では、1~5個または1~4個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。
アルキレン基の例には、メチレン(-CH2-)、エチレン(-CH2-CH2-)、n-プロピレン、n-ブチレン、n-ペンチレン、およびn-ヘキシレンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書における「アルキニレン」という用語は、炭素-炭素結合の少なくとも1つが三重結合であり、他の結合が、単結合、二重結合、またはさらなる三重結合であってもよい、2~20個の炭素原子を有する基を指す。
アルケニレン基の例には、エテニレン(-CH=CH-)、1-プロペニレン、2-プロペニレン、1-ブテニレン、2-ブテニレン、3-ブテニレンなどが含まれる。
アルキニレン基の例には、エチニレン、1-プロピニレン、2-プロピニレンなどが含まれる。
そして、「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は3~12個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、そして、そのような環は少なくとも部分的に不飽和である(ただし、任意のアリレン環を除く)。
シクロアルキレンの例には、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロヘプチレンが含まれるが、これらに限定されない。
シクロアルケニレンの例には、シクロペンテニレンおよびシクロヘキセニレンが含まれるが、これらに限定されない。
「所望により置換された」という用語は、本明細書で定義されるように、リンカーが非置換であるか、1つ以上の置換基で、本明細書で定義されるように置換されることを意味するものとする。
置換基が、ケト(またはオキソ、すなわち=O)基、チオまたはイミノ基などである場合、リンカー骨格原子上の2つの水素が置き換えられる。
例示的な置換基には、たとえば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、(チオ)エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、(チオ)アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ペルフルオロアルキル(トリフルオロメチルなど)を含むハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ(所望により、たとえばアルキル、アリール、またはヘテロアリールにより一置換または二置換)、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル(所望により、アルキル、アリール、またはヘテロアリールによりモノまたはジ置換)、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、(チオ)ウレイド、(アリールチオ)ウレイド、アルキル(チオ)ウレイド、シクロアルキル(チオ)ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、または-O(CH2)n-OH、-O(CH2)n-NH2、-O(CH2)nCOOH、-(CH2)nCOOH、-C(O)O(CH2)nR、-(CH2)nN(H)C(O)OR、または-N(R)S(O)2R(ここで、nは1-4、そして、Rは、独立して、水素、-アルキル、-アルケニル、-アルキニル、-シクロアルキル、-シクロアルケニル、-(C‐リンクヘテロシクロアルキル)、-(C‐リンクヘテロシクロアルケニル)、-アリール、および-ヘテロアリールを含み、複数の置換度が許可される。
適切な場合、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどの置換基、または-OH、-NHRなどの官能基をそれ自体が置換されることは、当業者には理解されよう。
適切な場合には、置換部分自体も、同様に置換されることも当業者には理解されよう。
式中、各基は、所望により、独立して置換されていてもよく、リンカーはさらに、以下の部分の1つから独立して選択される、n個の部分を含む:ジスルフィド(-S‐S-)、エーテル(-O-)、チオエーテル(-S-)、アミン(-NH-)、エステル(-OC(=O)-または-C(=O)-O-)、カルボキサミド(-NH-C(=O)-または-C(=O)-NH-)、ウレタン(-NH-C(=O)-O-または-OC(=O)-NH-)、および尿素部分(-NH-C(=O)-NH-)、ここで、m=n+1である。
特定の実施形態では、mは2であり、nは1であり、または、mは3であり、nは2である。
特定の実施形態において、リンカーは、2または3個の非置換アルキレン基、および、それぞれ、前記非置換アルキレン基をリンクする、1または2個の、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタンまたは尿素部分を含む。
特定のこのような実施形態では、所望の置換基は、ハロゲンおよびC1-6-アルキル、特にメチルから独立して選択される。
(i)酵素の存在下で、および
(ii)細胞内還元環境で、
安定しているリンカーを指す。
(i)酵素切断可能な基本構造、および/または
(ii)ジスルフィド基
を含まない。
特定のそのような実施形態では、リンカーは、最長12原子、特に、2~10原子、より特に、4~9原子、そして、最も特に、6~8原子の長さを有する。
(i)酵素によって切断可能な、または
(ii)還元可能な
リンカーを指す。
特定の実施形態では、この用語は、酵素により切断可能なリンカーのみを指す(還元可能なリンカーではない)。
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Val-Ala、Phe-Cit、およびVal-Citから選択されるジペプチドを含み、特に、切断可能なリンカーは、ジペプチドとアマトキシンの間のp-アミノベンジル(PAB)スペーサーをさらに含む。
L*は、p-アミノベンジルジペプチド部分であり、
L1は、L*をアマトキシンに結合するリンカーの一部であり、特に、ここで、
L1は、-NH-または-O-基、特に-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH-O-または-C(=O)-O-基を介して、L*に結合する。そして、ここで、
L2は、L*を標的結合部分に接続するリンカーの一部であり、特に、
L2は、-(CH2)m-部分(mは、1から8、特に、1~5から選択される整数である)を介して、または-(CH2CH2O)n-部分(nは1~3、特に、1~2から選択される整数である)を介して、L*に接続する。
たとえば、ジペプチドのVal-Alaを含む切断可能なリンカーの場合には、L1-L*-L2の構造は以下の通りである。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも50%が、炭素原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
特定の実施形態では、L1は、アマトキシンの一部である-NH-または-O-基である。
特定の実施形態では、L1は、中央のトリプトファン部分の4’、5’、6’または7’位に結合したOH基に由来する-O-基である。
特定の実施形態では、L1は、本発明によるアマニン誘導体のアミノ酸残基1のカルボン酸基の一部であるヒドロキシル基に由来する-O-基である。
特定の実施形態では、L1は、本発明によるアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基1のカルボキサミド基の一部であるアミノ基に由来する-NH-基である。
特定の実施形態では、L1は、本発明によるアマニンまたはアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基3の一部であるヒドロキシル基に由来する-O-基である。
特定の実施形態では、還元性リンカーは、以下の部分を含む。
特定のこのような実施形態では、本発明による、アマトキシンに連結するリンカーの部分、および切断可能なジスルフィド基は、3または4個のC原子、特に、3個のC原子の直線鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の3または4個のC原子は単結合により結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、n-プロピレン基である。
(i)S-デスオキシ-4’-OH-アマニンアミド(amaninamide)、4’-OH-アマニンアミド(amaninamide)、S-デスオキシ-5’-OH-アマニンアミド(amaninamide)、5’-OH-アマニンアミド(amaninamide)、S-デスオキシ-7’-OH-アマニンアミド(amaninamide)および7’-OH-アマニンアミド(amaninamide)の場合、アマトキシン(amatoxin)アミノ酸1のγC原子のカルボキサミド基の窒素原子(アミド結合);
(ii)S-デスオキシ-4’-OH-アマニン、4’-OH-アマニン、S-デスオキシ-5’-OH-アマニン、5’-OH-アマニン、S-デスオキシ-7’-OH-アマニンおよび7’-OH-アマニンの場合、アマトキシン(amatoxin)アミノ酸1のγC原子における酸基の酸素原子(エステル結合);
(iii)アミノ酸1の遊離カルボン酸部分が、部分-C(=O)NH-OR1に変換された、前記本発明のアマニチンの誘導体の場合には、アマトキシンアミノ酸1のγC原子でのヒドロキサム酸基の酸素原子;
(iv)アマトキシンアミノ酸3のδC原子のヒドロキシ基の酸素原子(特に、エステル結合、エーテル結合またはウレタン結合を介した);または、
(v)アミノ酸4の環窒素。
特定のそのような実施形態では、尿素部分は、リジン側鎖のアミノ基などの標的結合部分に元々存在する一級アミンとカルバミン酸誘導体…-リンカー-NH-C(O)-Z(ここで、Zは、第一級アミンで置換することができる脱離基である)との反応から齎される。
したがって、そのような実施形態では、本発明は、下記一般式の複合体に関係する。
アマニチン-L-X*-S-Tbm、
式中、
アマニチンは、本発明によるアマニチン誘導体であり、
Lは、リンカーであり、
X*は、チオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、
Sは、前記チオール基の硫黄原子、特に、システインアミノ酸残基のチオール基であり、そして、
Tbmは標的結合部分、特に、前記システインアミノ酸残基を含む抗体または機能的抗体フラグメントである。
特定の実施形態では、前記システインアミノ酸残基は、
(i)CL、CH1、CH2、およびCH3から選択される抗体ドメインに位置し、
(ii)前記抗体ドメインの配列に最も近い相同性を示す、生殖系列配列が、システインとは異なるアミノ酸残基を含む位置に存在し、そして、
(iii)溶剤に曝される位置に存在する。
特に、「選択的に」という用語は、チオール反応性基を含む分子と、少なくとも1つの遊離システイン残基を含む抗体とのカップリング反応の10%未満(特に5%未満、より特に2%未満)が、抗体の非システイン残基(たとえば、リジン残基)とのカップリング反応であることを意味する。
特定の実施形態では、チオール反応性基は、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、3位に脱離基(特に、脱離基は、-Brおよび置換チオールから選択される)を有するマレイミド(たとえば、US9,295,729を参照)、4位に脱離基(特に、-Brおよび置換チオールから選択される脱離基)を有する1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン(たとえば、US9,295,729を参照)、メチルスルホニルベンゾチアゾール、メチルスルホニルフェニルテトラゾール、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール(Todaら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.、52(2013)12592-6参照)、3-アリールプロピオニトリル(Kolodychら、Bioconjugate Chem.2015、26、197-200を参照)、および5-ニトロ-ピリジン-2-イル-ジスルフィド(…-L―S-S-(5-ニトロ-ピリジン-2-イル)から選択される。
特定の実施形態において、チオール反応性基は、3および4位に2つの脱離基を有するマレイミドであり、特に、3,4-ジブロモマレイミド、3,4-ビス(アリールチオ)-マレイミド、特に、3,4-ジフェニルチオ-マレイミド、および3,4-ビス(ヘテロアリールチオ)-マレイミド、特に、3,4-ビス(2-ピリジニル-スルファニル)-マレイミドから選択され、
特定の他の実施形態では、チオール反応性基は、特に、4,5-ブロモ-1,2-ジヒドロピリダジン-3、6-ジオン、4,5-ビス(アリールチオ)-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン、特に、4,5-ジフェニルチオ-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン、および4,5-ビス(ヘテロアリールチオ)-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオン、特に、4,5-ビス(2-ピリジニル-スルファニル)-1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオンから選択される、4および5位に2つの脱離基を有する、1,2-ジヒドロピリダジン-3,6-ジオンである。
・チオール置換アセトアミド;
・チオール置換スクシンイミド;
・チオール置換スクシンアミド酸;
・チオール置換ヘテロアリール;特に、チオール-置換ベンゾチアゾール、チオール置換フェニルテトラゾールおよびチオール置換フェニルオキサジアゾール;および
・ジスルフィド。
但し、1つの硫黄原子が抗体のシステイン残基に由来する。
特定の実施形態において、チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分は、チオール置換スクシンイミドである。
(アマニチン側)-(CH2)2-S‐S-(CH2)2-X-S- (Tbm側);
(アマニチン側)-(CH2)3-S‐S-(CH2)2-XーS- (Tbm側);
(アマニチン側)-(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S- (Tbm側);
(アマニチン側)-(CH2)3-S-S-(CH2)3-X-S- (Tbm側);
(アマニチン側)-(CH2)4-S-S-(CH2)4-X-S- (Tbm側);
(アマニチン側)-(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-(CH2)3-S-S- (Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S-(Tbm側)
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
(アマニチン側)-CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S-(Tbm側);
そして、ここで、ジペプチド配列に隣接する-NH-および-CO-は、それぞれ、ジペプチドのカルボキシ末端およびアミノ末端にアミド結合を形成するリンカーのアミノおよびカルボニル部分を表す。
(i)チオール反応性基に存在する脱離基Yの、システイン残基の硫黄原子による求核置換、たとえば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド、4,6-ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イルアミノ基、アルキルスルホンまたはヘテロアリールスルホン;
(ii)チオール反応性基の活性化二重結合へのシステイン残基のHS基の付加、たとえば、マレイミド;または、
(iii)システインの残基の硫黄原子(たとえば、脱離基として、ピリジン-2-チオール、5-ニトロピリジン-2-チオールまたはメタンスルフィネート)と、活性化ジスルフィドまたはメタンチオスルホネートのジスルフィド交換、;または
(iv)システイン残基の硫黄原子とチオール反応性基の一部である反応性部分との間に安定した結合をもたらす他の化学反応。
特に、N-グリカン側鎖は酵素的に分解されることができ、続いて、アジド-ガラクトースによる糖転移が起こる。
クリック ケミストリーを使用して、そのような修飾された標的結合部分は、適宜変更された構築物であるアマニチン-L-X*(X*は、たとえば、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)またはC-C三重結合を含む類似の部分である。)にカップリングさせることができる。
たとえば、構築物である、アマニチン-L-NH2は、ヒドロキシスクシンイミド部分の求核置換によって、DIBO-SEに結合させることができる。
別の実施形態において、標的結合部分は、クリック ケミストリーを可能にする非天然アミノ酸の取り込みにより、特に、パラアジドメチル-L-フェニルアラニン(pAMF)の取り込みにより、修飾され得る。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも60%がC原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
このようなアルデヒドタグは、アマニチン-L-X*構築物に存在する適切な基X*と反応することができる。
特に、X*は
特に、前記癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。
(a)障害の重症度を軽減すること;
(b)治療中の障害に特徴的な症状の発現を制限または防止すること;
(c)治療中の障害に特徴的な症状の悪化を抑制すること;
(d)以前に障害を患っていた患者の障害の再発を制限または防止すること;および
(e)以前に障害の症状を示していた患者の症状の再発を制限または防止すること。
所定の治療薬の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療薬を受領する動物のサイズと種、および投与の目的などの要因によって異なる。
各個々の場合の有効量は、当技術分野で確立された方法に従って当業者によって経験的に決定され得る。
これには、特に、注射剤と輸液を含む非経口剤が含まれる。
注射剤は、アンプルの形または、いわゆる即使用可能な注射剤、たとえば、すぐに使える注射器または使い捨て注射器のいずれかで処方され、これとは別に、複数回の引出しのための穿刺可能なフラスコに製剤化される。
注射剤の投与は、皮下(sc)、筋肉内(im)、静脈内(iv)または皮内(ic)投与の形態であり得る。
特に、結晶、溶液、ナノ粒子、またはたとえばヒドロゾルなどのコロイド分散系の懸濁液として、それぞれ適切な注射製剤を製造することが可能である。
輸液は、等張液、脂肪乳剤、リポソーム製剤およびマイクロエマルジョンの形態で調製することもできる。
注射剤と同様に、輸液製剤は希釈用の濃縮液の形で調製することもできる。
注射製剤は、たとえば、ミニポンプを介して、入院治療と外来治療の両方で永続的な輸液の形で適用することもできる。
また、非経口製剤は、本発明の標的結合部分毒素複合体が、それぞれ、微細に、分散、分散および懸濁した形態で導入される場合、たとえば、「複数ユニット原理」に基づいた、デポー製剤として改変することもできる。
または、本発明の標的結合部分毒素複合体が、製剤中、たとえば、錠剤または後に埋め込まれるロッドに封入される場合、薬剤中の結晶の懸濁液として、または。「単一ユニット原理」に基づき、改変することもできる。
単一ユニットおよび複数ユニット製剤の、これらのインプラントまたはデポー薬剤は、多くの場合、たとえば、乳酸とグリコール酸のポリエステル、ポリエーテル、ウレタン、ポリアミノ酸、ポリ(メタ)アクリレートまたは多糖類などの、いわゆる生分解性ポリマーで構成される。
アクア ステリリサタ(滅菌水)、
pH値に影響を与える物質(たとえば、有機または無機酸または塩基ならびにその塩など)、
pH値調整用の緩衝物質、
等張化のための物質(たとえば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコースおよびフルクトースなど)、
界面活性剤および界面活性剤、および、
乳化剤(たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル(たとえば、Tween(R))または、たとえば、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル(たとえばCremophor(R))など)
脂肪油(たとえば、ピーナッツ油、大豆油、ヒマシ油など)
脂肪酸の合成エステル(たとえば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および、中性油(たとえば、Miglyol(R))、)、および、
高分子アジュバント(たとえば、ゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンなど)、
有機溶媒の溶解度を高める添加剤(たとえば、プロピレングリコール、エタノール、N、N-ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなど)、または、
複合体形成物質(たとえば、クエン酸や尿素など)、
防腐剤(たとえば、安息香酸ヒドロキシプロピルエステルやメチルエステルなど)、ベンジルアルコールなど)、
たとえば、亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、および、
EDTAなどの安定剤である。
活性成分とさまざまなポリマーの複合体を実現することも可能である。
そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Pluronics(R)またはポリエチレングリコール ソルビット脂肪酸エステルである。
本発明の標的結合部分毒素複合体は、たとえば、シクロデキストリンを含む包接化合物(inclusion compound)の形態で液体製剤に組み込むこともできる。
特定の実施形態では、さらなるアジュバントとして、分散剤を加えることができる。
凍結乾燥物の製造には、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、PVP、または様々なゼラチンなどの足場剤を使用できる。
以下において、本発明を非限定的な実施例によりさらに詳細に説明する。
A. S-デスオキシ-α-アマニチン(HDP30.0735)の全合成
アルゴン下、2.68ミリリットル(2.68ミリモル)の1NのNaOHを、周囲温度で、一挙に加えた。
得られた黄色溶液を、無水Boc(Boc2O)574.6マイクロリットル(2.68ミリモル)で処理し、そして、24時間、室温で、撹拌した。
1Nの塩酸で、pH2.4に酸性化し、酢酸エチル25ミリリットルで、3回抽出した
合わせた酢酸エチル抽出液を、飽和NaCl溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。
ろ過と蒸発乾固により、785.0ミリグラムの粗物質が得られた。
粗N-Boc-6-OH-L-トリプトファンを、1N水酸化ナトリウム4.91ミリリットル(4.91ミリモル)に溶解し、そして、463.2ミリリットル(500.3ミリグラム、4.90ミリモル)無水酢酸で処理した。
反応混合物を、3時間、アルゴン下に撹拌し、そして、5%クエン酸で酸性にした。
水相を、25ミリリットルの酢酸エチルで3回抽出し、飽和NaClで洗浄し、そして、MgSO4で乾燥させた。
濾過および蒸発により、635ミリグラムの粗固体を得た。
MS(ESI-) 実測値:361.08[M-H]-;
計算値:362.15(C18H22N2O6)
2. cis、trans-1-(tert-ブトキシカルボニル)-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-6-アセトキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール(cis-HDP 30.2555およびtrans HDP 30.2555(cis、trans-6-アセトキシ-Hpi))の調製
光酸素付加は、400Wの高圧ナトリウム蒸気ランプ(シリウス X400 ランプ 230V、400W;1.3メーターの距離で、55,000ルーメン)または代替的に、タングステン-ハロゲンランプ(500W)を用いて行われた。
タングステンーハロゲンランプには、λ<490ナノメートルの光を遮断するフィルター溶液(CuCl2-CaCO3)を使用する。
ランプから反応容器までの距離は、15センチメーターであり、反応温度は3~4℃の範囲であった。
溶媒CH2Cl2、CH3OH、CH3COOHは、標準的なHPLCまたはBP等級であった。
反応溶液に、400W高圧ナトリウム蒸気ランプを照射した。照射中、酸素のゆっくりした流れを反応溶液に吹き込んだ。5時間照射した後、酸素付加および冷却は停止し、そして、反応媒体を、10ミリリットルのジメチルスルフィドで処理した。
混合物を、2時間撹拌し、そして、水浴温度が35℃のロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。
暗赤色残渣を、高真空中で、さらに乾燥させ、結晶性固体(1.20グラム)を得た。
粗生成物を、CH2Cl2+5%酢酸から、CH2Cl2/MeOH(30:1)+5%酢酸の勾配で、330グラムのシリカゲルカラム(検出波長254ナノメートル)で精製した。
380ミリグラムのcis-HDP 30.2555と290ミリグラムのtrans-HDP 30.2555が溶出し、トルエンと共蒸発した。tert-ブタノール中で凍結乾燥した後、両方の異性体がオフホワイトの粉末として得られた。
シス-1-(tert-ブトキシカルボニル)-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-6-アセトキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール(cis-HDP 30.2555)
380ミリグラムのシスーHDP 30.2555を得た(収率39%)
1H-NMR(400MHz、CD3OD、δ=ppm)
δ=1.22,1.44,1.54[s,9H,C(CH3)3];2.23(s,3H,OCOCH3);2.46-2.63(m,2H,CH2);4.14-4.29(m,1H,2-H);5.35(s,1H,8a-H);6.39-6.46(m,2H,7-H,5-H);7.20-7.24(m,1H,4-H)
13C-NMR(100MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=20.93,28.45,31.12,42.80,61.12,69.44,82.21,85.82,87.93,104.97,112.98,124.84,129.42,151.51,154.04,155.97,171.34,175.79
MS(ESI+) 実測値:378.92[MH]+;
計算値:378.14(C18H22N2O7)
MS(ESI+) 実測値:401.17[M+Na]+;
計算値:401.14(C18H22N2NaO7)
UV/VIS(CH3OH):λmax=296ナノメートル,239ナノメートル、215ナノメートル
λmin=266ナノメートル、227ナノメートル
トランス-1-(tert-ブトキシカルボニル)-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-6-アセトキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール(トランスーHDP 30.2555)
290mgのトランスーHDP 30.2555を得た(収率30%)
1H-NMR(400MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=1.22,1.45,1.54[s,9H,C(CH3)3];2.22(s,3H,OCOCH3);2.55-2.73(m,2H,CH2);4.51-4.57(m,1H,2-H);5.21-5.24(s,1H,8a-H);6.36-6.41(m,2H,7-H,5-H);7.17-7.18(m,1H,4-H)
13C-NMR(100MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=20.95,28.50,31.12,42.47,60.97,69.44,82.06,84.84,87.54,104.74,112.67,125.03,128.70,152.31,154.22,156.00,171.23,174.67
MS(ESI+) 実測値:379.00[MH]+;
計算値:378.14(C18H22N2O7)
MS(ESI+) 実測値:401.17[M+Na]+;
計算値:401.14(C18H22N2NaO7)
MS(ESI+) 実測値:779.00[2M+Na]+;
計測値:779.28(C36H44N4Na2O14)
UV/VIS(CH3OH):λmax=299ナノメートル、241ナノメートル、215ナノメートル
λmin=268ナノメートル、228ナノメートル
3. S-デスオキシ-α―アマニチン HDP 30.0735の調製
ステップ1:HDP 30.0013
完全に溶解するまで、懸濁液を50℃で、30分間撹拌した。
反応混合物を、濃縮乾固し、そして、DMF100ミリリットルに再溶解した。
臭化アリル(1.6ミリリットル、3.6グラム、29.7ミリモル)を滴下し、そして、反応物を、室温で、一晩撹拌した。
DMFを留去し、そして、残渣を、tert-ブチルメチルエーテルに溶解した。
沈殿物をろ過し、そして、透明な溶液を、カラムクロマトグラフィーの前にセライトに吸収させた。化合物を、n-ヘキサン/酢酸エチル勾配を用いて、220グラムのシリカゲルで精製した。
収率:11.5グラム、100%
ステップ2:HDP 30.0400
反応物を、80℃で、一晩撹拌した。
冷却した後、樹脂を濾過し、そして、広範囲に、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびtert-ブチルメチルエーテルで洗浄した。
HDP 30.0400(0.31グラム、0.25ミリモル)を、N、N-ジメチルバルビツール酸(241ミリグラム、1.55ミリモル)およびPd(PPh3)4(35ミリグラム、0.03ミリモル)で処理した。
樹脂を、室温で一晩振盪した。その後、樹脂を、ジクロロメタン、DMF、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびtert-ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄し、そして、減圧下で乾燥させた。
すべての反応物と試薬は、ジクロロメタン/DMF(1:1、v/v)に溶解した。
HDP30.0477(WO2014/009025参照)(102ミリグラム、0.30ミリモル)を、6.0ミリリットルのジクロロメタン/N、N-ジメチルホルムアミドに溶解し、そして、0.2N溶液のPyBOP/HOBtの4.0ミリリットルおよび2ミリリットルのDIEA(40%DMF)で処理した。
2.0ミリリットルのN、N-ジメチルホルムアミドを添加後、反応物をマイクロ波照射(20W、CEMマイクロ波反応器)で、8分間、50℃に加熱し、そして、カップリングした後、N、N-ジメチルホルムアミドで洗浄した。
脱保護は、20%ピペリジンのN、N-ジメチルホルムアミド溶液6.0ミリリットルを、50℃で、10分間添加した。樹脂を、N、N-ジメチルホルムアミドで洗浄した(最後のアミノ酸のカップリングの後、脱保護しない)。
(0.102グラム、0.30ミリモル 1.5当量HDP30.0477 分子量:339.6、上記参照)
0.72グラム、 1.2ミリモル 5.0当量FmocAsn(Trt)OH 分子量:599.7
0.71グラム、 1.2ミリモル 5.0当量FmocCys(OTrt)OH 分子量:586.7
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量FmocGlyOH 分子量:297.3
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量FmoclleOH 分子量:353.4
0.36グラム、 1.2ミリモル 5.0当量FmocGlyOH 分子量:297.3
0.114グラム、 0.30ミリモル 1.5当量HDP30.2555 分子量:378.4
5ミリリットルのTFA、5ミリリットルのDCM+10%MeOHの溶液を樹脂に吸引し、周囲温度で、15分間振盪した。
溶液を、50ミリリットルの反応フラスコに分注し、樹脂をTFA/DCM1:1+10%MeOHで1回洗浄し、同じフラスコに注いだ。
反応フラスコを16時間撹拌した。
トリイソプロピルシラン(0.5ミリリットル)を加え、反応物を真空で濃縮した。
残渣を、500マイクロリットルのMeOHに溶解し、ペプチドを50ミリリットルの氷冷TBMEに沈殿させた。
遠心分離後、上清をデカントし、沈殿物を50ミリリットルのTBMEで1回洗浄し、減圧下で乾燥させた。
収量:136.5ミリグラム、62.5%
MS(ESI+) 実測値:1047.4[M+H]+;
計算値:1047.4(C45H63N10O17S)
HPLC:91.9面積%
ステップ4:環化(A環形成、HDP 30.2572)
反応物を、16時間攪拌し、完了したら、500マイクロリットルの水でクエンチした。
変換を、HPLCで監視した。混合物を減圧により濃縮し、1ミリリットルのメタノールに再溶解し、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量:55.3ミリグラム、41%
MS(ESI+) 実測値:1029.33[M+Na]+;
計算値:103010(C45H61N10O16S)
HPLC:99.2面積%
ステップ5:酢酸脱保護(HDP 30.0735)
変換は、HPLC/MSで確認した。完了後(6~8時間)、反応物を真空濃縮し、100マイクロリットルのMeOHに再懸濁し、分取HPLCで精製した。
収量:14.1ミリグラム、29%
HPLC:100%
MS(ESI+) 実測値:903.3[M+H]+;
計算値:902.9(C39H54N10O13S)
実測値:925.33[M+Na]+
4. 6’-((3-マレイミドプロパンアミド-Val-Ala-PAB)-S-デオキシ-α-アマニチン(HDP 30.2371)の調製
ステップ1:HDP 30.2364
0℃で10分間放置した後、得られた沈殿物を、遠心分離(4分、4000×g)により分離した。
上清を排出し、そして、ペレットを、追加のMTBE(10ミリリットル)に再懸濁し、そして、遠心分離を繰り返した。
真空乾燥した粗生成物を、400マイクロリットルのメタノールに溶解し、そして、Phenomenex Luna-C18(2)、10マイクロメートルのカラム(250x21.2ミリメートル)で、5%~100%のメタノール水溶液により、分取HPLCにより精製した。生成物画分を合わせて、非晶質固体として23ミリグラム(70%)の生成物を得た。
MS(ESI+) 実測値:1430.58[M+Na]+;
計算値:1430.65(C65H97N13NaO18SSi)
2分後、揮発物を真空で除去し、そして、残留物を、750マイクロリットルの水に溶解し、そして、pH10に到達して、沈殿が生じるまで、3%アンモニアを滴下する。
MS(ESI+) 実測値:1178.42[MH]+;
計算値:1178.53(C54H76N13O15S)
ステップ3:HDP30.2371
チューブを氷上で10分間保持し、そして、4000×gで遠心分離した。
上清を除去し、そして、ペレットを10ミリリットルの新鮮なメチル-tert-ブチルエーテルで洗浄した。
純粋な画分を蒸発乾固させ、そして、1ミリリットルのtert-ブタノール/水から凍結乾燥させて、2.70ミリグラム(65%)の生成物を無色の粉末として得た。
MS(ESI+) 実測値:1329.3 [MH]+;
計算値:1329.6(C61H81N14O18S)
実測値:1351.5 [M+Na]+;
計算値:1351.5(C61H80N14NaO18S)
B. S-デスオキシ-5’-ヒドロキシ-アマニンアミド HDP 30.2548の全合成
アルゴン下に、3.64ミリリットル(3.64ミリモル)の1N NaOHを、周囲温度で、一度に加えた。
次に、得られた黄色の溶液を、779.0マイクロリットル(794.0ミリグラム、3.63ミリモル)の無水Boc(Boc2O)で処理し、そして、室温で、24時間、攪拌した。
溶液を、1N塩酸でpH2.4に酸性化し、そして、酢酸エチル35ミリリットルで、3回抽出した。
合わせた酢酸エチル抽出液を、飽和NaCl溶液で洗浄し、そして、MgSO4で乾燥させた。
濾過および蒸発乾固により、1.26グラムの粗物質を得た。
粗製N-Boc-6-ヒドロキシ-L-トリプトファンを、7.87ミリリットル(7.87ミリモル)の1N NaOHに溶解し、そして、743.0マイクロリットル(802.4ミリグラム、7.86ミリモル)無水酢酸で処理した。
反応混合物を、アルゴン下で3時間撹拌し、そして、5%クエン酸で酸性化した。
水相を、25ミリリットルの酢酸エチルで3回抽出し、飽和NaClで洗浄し、そして、MgSO4で乾燥させた。ろ過と蒸発をした。
MS(ESI-) 実測値:361.08[M-H]-;
計算値:362.15(C18H22N2O6)
1H-NMR(400MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=1.39(s,9H,C(CH3)3);2.27(s,3H,OCOCH3);3.08-3.31(m,2H,CH2);4.39-4.41(m,1H,2-H);6.81-6.83;7.13;7.24-7.26(m,2H,6-H,7-H);7.30-7.32(1H,4-H)
2. cis、trans-1-(tert-ブトキシカルボニル)-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-5-アセトキシ-1,2,3,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール cis-HDP 30.2536およびtrans HDP 30.2536(cis、trans-5-アセトキシ-Hpi)の調製
光酸素付加は、400Wの高圧ナトリウム蒸気ランプ(Sirius X400 ランプ 230V、400W、1.3メーターの距離で、55,000ルーメン)または代替で、タングステン-ハロゲンランプ(500W)で行った。
タングステンハロゲンランプには、λ<490ナノメートルの光を遮断するフィルターソリューション(CuCl2-CaCO3)が使用される。
反応は、GL 18スレッドを備えた2つのコネクタを備えた、DURAN(R)ホウケイ酸ガラス製の熱交換ジャケット、平底、およびフラットラボフランジ(DN)を備えた、500ミリリットルの円筒形反応容器で実施した。
ランプから反応容器までの距離は15cmで、そして、反応温度は、3~4℃の範囲であった。
溶媒、CH2Cl2、CH3OH、CH3COOHは、標準HPLCまたはBPグレードであった。
乾燥酸素(純度99.5%)を、1分あたり、2~4リットルの速度で、反応混合物に吹き込んだ。
反応溶液に、400Wの高圧ナトリウム蒸気ランプを照射した。
照射中、反応溶液にゆっくりした酸素の流れを吹き込んだ。
4時間の照射後、酸素付加と冷却を停止し、そして、反応媒体を、20ミリリットルのジメチルスルフィドで処理した。
混合物を、2時間撹拌し、そして、35℃の水浴温度でロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。
暗赤色の残留物を、高真空でさらに乾燥させて、結晶性固体を得た。
粗生成物を、CH2Cl2+5%酢酸からCH2Cl2/MeOH(30:1)+5%酢酸の勾配で、330グラムのシリカゲルカラム(検出波長254ナノメートル)で精製した。
tert-ブタノール中で凍結乾燥した後、両方の異性体が、オフホワイトの粉末として得られた。
シス-1-(tert-ブトキシカルボニル)-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-5-アセトキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール(cis-HDP 30.2536)
178ミリグラムのcis-HDP 30.2536 収率:15%
1H-NMR(400MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=1.44,1.54(s,9H,C(CH3)3);2.23(s,3H,OCOCH3);2.45-2.62(m,2H,CH2);4.18-4.33(m,1H,2-H);5.37(s,1H,8a-H);6.63-6.67;6.82-6.84;(m,2H,7-H,6-H);6.96-6.98(m,1H,4-H)
13C-NMR(100MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=20.86,28.46,31.12,42.81,61.21,82.14,85.60,111.49,117.83,123.98,132.77,144.99,148.03,156.07,172.01,175.89
MS(ESI+) 実測値:379.00[MH]+;
計算値:378.14(C18H22N2O7)
MS(ESI+) 実測値:401.17[M+Na]+;
計算値:401.14(C18H22N2NaO7)
MS(ESI-) 実測値:377.17[M-H]-;
計算値:378.14(C18H22N2O7)
UV/VIS(CH3OH):λmax=299ナノメートル,242ナノメートル,207ナノメートル
λmin=270ナノメートル,222ナノメートル
トランス-1-(tert-ブトキシカルボニル)-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-5-アセトキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール(trans-HDP30.2536)
132ミリグラムのtrans-HDP 30.2536 収率:11%
1H-NMR(400MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=1.47,1.54[s,9H,C(CH3)3];2.21(s,3H,OCOCH3);2.50-2.70(m,2H,CH2);4.51-4.56(m,1H,2-H);5.22-5.26(s,1H,8a-H);6.58-6.63;6.80-6.81(m,6-H,7-H);6.92(s,1H,4-H)
13C-NMR(100MHz,CD3OD,δ=ppm)
δ=20.88,28.50,31.12,42.60,61.11,82.05,85.38,111.26,117.88,124.07,131.94144.66,148.95,156.11,172.01,174.81
MS(ESI+) 実測値:379.00[MH]+;
計算値:378.14(C18H22N2O7)
MS(ESI+) 実測値:401.17[M+Na]+;
計算値:401.14(C18H22N2NaO7)
MS(ESI-) 実測値:377.17[M-H]-;
計算値:378.14(C18H22N2O7)
UV/VIS(CH3OH):λmax=302ナノメートル,244ナノメートル,208ナノメートル
λmin=272ナノメートル,224ナノメートル
3. S-デスオキシ-5’-ヒドロキシ-アマニンアミド HDP 30.2548の調製
ステップ1:HDP 30.0013
完全に溶解するまで、懸濁液を、50℃で、30分間撹拌した。
反応混合物を濃縮乾固し、DMF100ミリリットルに再溶解した。
臭化アリル(1.6ミリリットル、3.6グラム、29.7ミリモル)を滴下し、そして、反応物を、室温で、一晩撹拌した。
DMFを留去し、そして、残渣をtert-ブチルメチルエーテルに溶解した。
沈殿物をろ過し、そして、透明な溶液をカラムクロマトグラフィーの前にセライトに吸収させた。
化合物を、n-ヘキサン/酢酸エチル勾配を用いて、220グラムのシリカゲルで精製した。
収率:11.5グラム,100%
ステップ2:HDP 30.0400
加えた。反応液を、80℃で一晩撹拌した。冷却後、樹脂をろ過し、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびtert-ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄した。
HDP 30.0400(0.31グラム、0.25ミリモル)を、N,N-ジメチルバルビツール酸(241ミリグラム、1.55ミリモル)およびPd(PPh3)4(35ミリグラム、0.03ミリモル)で処理した。
樹脂を、室温で、一晩振盪した。
その後、樹脂を、ジクロロメタン、DMF、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびtert-ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄し、減圧下で乾燥させた。
すべての反応物と試薬を、ジクロロメタン/DMF(1:1、v/v)に溶解した。
HDP 30.0477[WO 2014/009025を参照](102ミリグラム、0.30ミリモル)を、6.0ミリリットルのジクロロメタン/N、N-ジメチルホルムアミドに溶解し、0.2NのPyBOP/HOBt溶液4.0ミリリットルおよび2ミリリットルのDIEA(DMF中40%)で処理した。
2.0ミリリットルのN、N-ジメチルホルムアミドの添加後、反応物をマイクロ波照射(20W、CEMマイクロ波反応器)により、8分間、50℃に加熱し、カップリング後に、N、N-ジメチルホルムアミドで洗浄した。
脱保護は、50℃で、10分間、N、N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン6.0ミリリットルの添加により実施された。
樹脂を、N、N-ジメチルホルムアミドで洗浄した(最終アミノ酸のカップリング後に脱保護なし)。
(0.102グラム, 0.30ミリモル 1.5当量 HDP30.0477 MW:339.6,上記参照)
0.72グラム, 1.2ミリモル 5.0当量 FmocAsn(Trt)OH MW:599.7
0.71グラム, 1.2ミリモル 5.0当量 FmocCys(OTrt)OH MW:586.7
0.36グラム, 1.2ミリモル 5.0当量 FmocGlyOH MW:297.3
0.36グラム, 1.2ミリモル 5.0当量 FmocIleOH MW:353.4
0.36グラム, 1.2ミリモル 5.0当量 FmocGlyOH MW:297.3
0.114グラム, 0.30ミリモル 1.5当量 HDP30.2536 MW:378.4
5ミリリットルのTFA、5ミリリットルのDCM+10%MeOHの溶液を、樹脂に吸引し、そして、周囲温度で、15分間振盪した。
溶液を50ミリリットルの反応フラスコに分注し、そして、樹脂を、TFA/DCM1:1+10%MeOHで1回洗浄し、そして、同じフラスコに注いだ。
反応フラスコを、16時間撹拌した。トリイソプロピルシラン(0.5ミリリットル)を加え、そして、反応液を真空で濃縮した。
残渣を、500マイクロリットルのMeOHに溶解し、そして、ペプチドを、50ミリリットルの氷冷TBMEに沈殿させた。
遠心分離後、上清をデカントし、そして、沈殿物を、50ミリリットルのTBMEで1回洗浄し、そして、減圧下で乾燥させた。
融点:75.1ミリグラム,35.9%
MS(ESI+) 実測値:1047.4[M+H]+;
計算値:1047.4(C45H63N10O17S)
HPLC:99.3面積%
ステップ4:環化(A環形成,HDP 30.2546)
反応物を、16時間攪拌し、完了したら、500マイクロリットルの水でクエンチした。変換をHPLCで監視した。混合物を減圧により濃縮し、1ミリリットルのメタノールに再溶解し、そして、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
融点:32.5ミリグラム,67.9%
MS(ESI+)実測値:[M+H]+1029.33[MH]+1051.3[M+Na]+;
計算値:1029.39;1051.42(C45H61N10O16S;C45H60N10O16SNa)
HPLC:88.3面積%
ステップ5:アセテートの脱保護(HDP 30.2548)
完了後(6~8時間)、反応物を真空濃縮し、100マイクロリットルのMeOHに再懸濁し、分取HPLCで精製した。
収率:12.5ミリグラム,53.3%
HPLC:99%
MS(ESI+) 実測値:903.4[M+H]+;
計算値:902.9(C39H54N10O13S)
実測値:925.4[M+Na]+
5. 5’-((3-マレイドプロパンアミド)-Val-Ala-p-アミニノベンジルオキシ)-S-デオキシ-アマニンアミド(HDP 30.2602)の調製
ステップ1:HDP 30.2563
1.0モルの炭酸水素セシウム水溶液(17.12マイクロリットル、1.6当量)を、一度に加え、混合物を室温で撹拌した。
生成物の画分を合わせて、非晶質固体として、4.00ミリグラム(26%)の生成物を得た。
MS(ESI+) 実測値:1430.58[M+Na]+
計算値:1430.65(C65H97N13NaO18SSi)
ステップ2:HDP 30.2378
5分後、揮発物を真空で除去し、残留物を1000マイクロリットルの水に溶解し、そして、pH10に達するまで、3%アンモニアを滴下した。
MS(ESI+) 実測値:1178.50[M+H]+
計算値:1178.53(C54H76N13O15S)
ステップ3:HDP 30.2602
純粋な画分を蒸発乾固させ、2ミリリットルのアセトニトリル/水1:1から凍結乾燥させて、2.73ミリグラム(67%)の生成物を無色の粉末として得た。
MS(ESI+) 実測値:1329.33;[M+H]+
計算値:1329.56(C61H81N14O18S)
C. S-デスオキシ-4’-ヒドロキシ-アマニンアミドの全合成
1.cis、trans-1-(tert-ブトキシカルボニル)-2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-4-アセトキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドール(シス、トランス-4-アセトキシ-Hpi)の合成;
cis、trans-7-アセトキシ-Hpiの合成は、4-ヒドロキシ-L-トリプトファンの代わりに、市販の7-ヒドロキシ-L-トリプトファンから開始して、cis、trans-4-アセトキシ-Hpiの合成と同様に行う。
S-デスオキシ-7’-ヒドロキシ-アマニンアミドの合成は、シス、トランス-4-アセトキシ-Hpiの代わりにシス、トランス-7-アセトキシ-Hpiを使用して、S-デスオキシ-4’-ヒドロキシ-アマニンアミドの合成と同様に行う。
HEK293およびHEK293 OATP1B3細胞でのBrdU細胞増殖アッセイ
HEK293-OATP1B3細胞培養プレートを、ポリ-D-リジンでコーティングした。
ポリ-D-リジンによるコーティング:
〇50ミリリットルの滅菌水中、5ミリグラムのポリ D-リジン
〇96ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットル
〇室温で、1時間のインキュベーション
〇ウェルを、200マイクロリットルの滅菌水で2回洗浄する。
〇少なくとも2時間の乾燥(室温)
対照:「ブランク」は、細胞なしの培地100マイクロリットルで設定し、「背景」および「100%」は、培地100マイクロリットル中の細胞で設定した。
●37℃、5%CO2で、24時間のインキュベーション
ストック原液を、培地で、1:1000(1:10および1:100希釈)に希釈した:
10マイクロリットルのアマニチン誘導体ストック溶液(1.0x10-2モル)+90マイクロリットルのPBS=100マイクロリットル 1.0x10-3モル
2マイクロリットルの希釈+198マイクロリットルの培地=200マイクロリットル 1x10-5モル
さらなる希釈:
A:200マイクロリットル 1.0x10-5モル
B:増殖培地の80マイクロリットル+溶液Aの20マイクロリットル(1:5希釈)
C:増殖培地の80マイクロリットル+溶液Bの20マイクロリットル(1:5希釈)
D:増殖培地の80マイクロリットル+溶液Cの20マイクロリットル(1:5希釈)
E:増殖培地の80マイクロリットル+溶液Dの20マイクロリットル(1:5希釈)
F:増殖培地の80マイクロリットル+溶液Eの20マイクロリットル(1:5希釈)
G:増殖培地の80マイクロリットル+溶液Fの20マイクロリットル(1:5希釈)
H:増殖培地の80マイクロリットル+溶液Gの20マイクロリットル(1:5希釈)
最終容量:100マイクロリットル/ウェル
最終用量:1×10-6モルで開始:1:5希釈系列。
●37℃、5%CO2で96時間のインキュベーション。
●96時間後:ロシュ細胞増殖アッセイ、メーカーの指示に従って発光。
●EC50-濃度は、Graphpad Prism 4.0 データ分析ソフトウェアを使用して決定した。
実施例:T-D265C-30.2371の合成:
PBS緩衝液中の、10ミリグラムのチオマブ T-D265Cは、HDP 30.2371への結合のために使用された。
抗体溶液を、1ミリモルのEDTAに調整:
2ミリリットルの抗体溶液(10.0ミリグラム)+20マイクロリットルの100ミリモルのEDTA、pH8.0
抗体量:10ミリグラム=6.9x10-8モル
-2ミリリットルの抗体溶液(6.9x10-8モル)+55.2マイクロリットルの50ミリモルのTCEP溶液(2.76×10-6モル)
-シェーカー上、37℃で、3時間インキュベート。
-スライド-A-Lyzer透析カセット 20000 MWCOで、2.0リットルの1×PBS、1ミリモルのEDTA、pH7.4で、4℃にて2回の連続透析:最初の透析 約4時間、2回目の透析は一晩
-約2ミリリットルの抗体溶液(6.9x10-8モル)+27.6マイクロリットルの新しい50ミリモルのdhAA溶液(1.38x10-6モル)
-シェーカーで、RTで、3時間インキュベートする。
200マイクロリットルのDMSOに、2ミリグラムのHDP 30.2371を可溶化する=10マイクログラム/マイクロリットル
-約2ミリリットルの抗体溶液(=9.5ミリグラム;6.53x10-8モル)+52.1マイクロリットルのHDP 30.2371(=520.8マイクログラム;3.92x10-7モル)。
-RTで、インキュベート、1時間。
-16.3マイクロリットルの100ミリモルのN-アセチル-L-システイン(1.63×10-6モル)の添加によってクエンチ。
-RTで、15分間インキュベート(または、一晩、4℃)。
-1×PBS、pH7.4で平衡化した、1XPD-10カラムを使って反応混合物を精製。
パラフィルム上のブラッドフォード試薬でタンパク質含有画分を特定し、タンパク質含有画分をまとめる。
-2.0リットルのPBS、pH7.4とスライド-A-Lyzer透析セット 200 00MWCOで、4℃で、一晩、抗体溶液の透析。
タンパク質濃度を、5.0ミリグラム/ミリリットル(3.4x10-5モル)に調整し、ろ過により無菌状態にする。4℃で保管。
抗体の分子量は、それぞれの抗体の分子量に従って計算された。それに応じて、リンカー毒素、TCEP、dhAA、N-アセチル-L-システインの量を調整して、それぞれの当量に到達させた。
SKBR-3、JIMT-1、LnCap、および22rv1細胞でのBrdU細胞増殖アッセイ:
アッセイは、以下の変更を加えて、上記(6.)のように行った。
●ADCの希釈スキーム:
●ストック溶液を、成長培地で、1.0x10-6モルに希釈した
さらなる希釈:
A:100マイクロリットル 1.0x10-6モル
B:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットル 溶液A(1:5希釈)
C:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットル 溶液B(1:5希釈)
D:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットル 溶液C(1:5希釈)
E:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットル 溶液D(1:5希釈)
F:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットル 溶液E(1:5希釈)
G:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットル 溶液F(1:5希釈)
H:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットル 溶液G(1:5希釈)
●各溶液10マイクロリットルをウェル3個に加えた。
最終容量:100マイクロリットル/ウェル。
最終用量:1×10 -7 モルで開始;1:5希釈系列
Raji細胞およびNalm-6細胞についてのWST-Iアッセイ:
●2.0x103細胞/ウェルおよび10%FCSおよびサプリメントを含むウェルあたり90マイクロリットルの各増殖培地を含む、透明な、F底、96ウェルプレートを調製した。
対照:「ブランク」は、細胞を含まない100マイクロリットルの培地で設定した。
「細胞のみ」は、100マイクロリットルの培地中の細胞で設定された。
●37℃、5%CO2で24時間のインキュベーション。
●ADCの希釈スキーム:
●ストック溶液を、増殖培地で1.0x10-6モルに希釈した
さらなる希釈:
A:100マイクロリットル 1.0x10-6モル
B:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットルの溶液A(1:5希釈)
C:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットルの溶液B(1:5希釈)
D:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットルの溶液C(1:5希釈)
E:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットルの溶液D(1:5希釈)
F:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットルの溶液E(1:5希釈)
G:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットルの溶液F(1:5希釈)
H:80マイクロリットルの増殖培地+20マイクロリットルの溶液G(1:5希釈)
●各溶液10マイクロリットルをウェル3個に加えた。
最終容量:100マイクロリットル/ウェル。
最終用量:1×10 -7 モルで開始:1:5希釈系列
●37℃、5%CO2で96時間のインキュベーション。
●96時間後:製造元の指示に従って、Roche WST-1細胞増殖アッセイ。
●EC50-濃度は、Graphpad Prism 4.0データ分析ソフトウェアを使用して決定した。
Claims (17)
- 保護基が存在する場合、該保護基が、Boc、PhCH2OCO-、CH2=CHCH2O-CO-、およびトリチルから、独立して選択される、請求項1に記載の、2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドールのOH置換誘導体。
- 置換基R1-C(=O)-O-が、式Iの5位に置換している、請求項1または2に記載の、2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドールのOH置換誘導体。
- 置換基R1-C(=O)-O-が、式Iの6位に置換している、請求項1または2に記載の、2-カルボキシ-3a-ヒドロキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドールのOH置換誘導体。
- ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の、8個のアミノ酸残基を含む、直鎖状前駆体の合成のための方法であって、
前記前駆体のペプチド合成において、請求項1~4のいずれか一項に記載の、2-カルボキシー3a-ヒドロキシ-1,2,3,3a,8,8a-ヘキサヒドロピロロ[2,3-b]インドールのOH置換誘導体を使用するステップを含む方法。 - ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の合成方法であって、
(i)システイン残基と、請求項5に記載された直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすか、または可能にし、そして
(ii)請求項5に記載の直鎖状前駆体のN末端を、前記前駆体のC末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすかまたは可能にするステップを含む。 - システイン部分の硫黄原子を酸化して、スルホキシドまたはスルホンを形成することをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- システイン部分の硫黄原子を酸化して、スルホキシドを形成することを含む、請求項7に記載の方法。
- (i)S-デスオキシ-4’-OH-アマニン、4’-OH-アマニン、S-デスオキシ-5’-OH-アマニン、5’-OH-アマニン、S-デスオキシ-7’-OH-アマニン、7’-OH-アマニン、
(ii)S-デスオキシ-4’-OHーアマニンアミド、4’-OH-アマニンアミド、S-デスオキシ-5’-OHーアマニンアミド、5’-OH-アマニンアミド、S-デスオキシ-7’-OHーアマニンアミド、7’-OH-アマニンアミド、
(iii)(i)のアマニチン誘導体、
から選択される、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体であって、ここで、
アミノ酸1の遊離カルボン酸部分が、カルボン酸エステル-C(=O)OR1または部分-C(=O)NH-OR1に変換され、
R1は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択される。 - S-デスオキシ-5’-OH-アマニン、5’-OH-アマニン、S-デスオキシ-5’-OH-アマニンアミド、および5’-OH-アマニンアミドから選択される、請求項9に記載のアマニチン誘導体。
- (a)請求項9または10のヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体;
(b)標的結合部分;および、
(c)所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー;
を含む複合体。 - 請求項9または10に記載のアマニチン誘導体または請求項11に記載の複合体を含む医薬組成物。
- 患者における癌の治療に使用するための、請求項9もしくは10に記載のアマニチン誘導体または請求項11に記載の複合体。
- 患者における癌の治療に使用するための、請求項9もしくは10に記載のアマニチン誘導体または請求項11に記載の複合体であって、癌が、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫から選択される、アマニチン誘導体または複合体。
- 患者における癌の治療に使用するための、請求項12に記載の医薬組成物。
- 患者における癌の治療に使用するための、請求項12に記載の医薬組成物であって、癌が、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫から選択される、医薬組成物。
- (a)請求項9または10に記載のアマニチン誘導体;および
(b)前記アマニチン誘導体を標的結合部分に結合するための反応性基Yを有するリンカー部分;を含む、構築物。
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