CN117241832A - B淋巴细胞特异性的鹅膏毒素抗体缀合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及缀合物，其包含鹅膏毒素、靶点为CD37的靶结合部分(即，CD37结合部分)以及任选的接头，所述接头连接所述鹅膏毒素与所述CD37结合部分。本发明还涉及所述缀合物的合成。此外，本发明涉及包含此类缀合物的药物组合物，其用于治疗免疫细胞、特别是B细胞和/或淋巴瘤相关的疾病和/或恶性肿瘤。

Description

B淋巴细胞特异性的鹅膏毒素抗体缀合物
技术领域
本申请涉及缀合物，其包含鹅膏毒素(amatoxin)、靶点为CD37的靶结合部分(即，CD37结合部分)以及任选的接头(linker)，所述接头连接所述鹅膏毒素与所述CD37结合部分。本发明还涉及所述缀合物的合成。此外，本发明涉及包含此类缀合物的药物组合物，用于治疗免疫细胞、特别是B细胞和/或淋巴瘤相关的疾病和/或恶性肿瘤。
背景技术
白细胞细胞表面蛋白CD37是“四跨膜蛋白(tetraspanin)”超家族(或四次跨膜蛋白超家族(transmembrane 4superfamily))的成员，其特征在于存在四个保守的跨膜结构域。四跨膜蛋白家族成员是被认为是信号转导的“分子促进剂”的膜蛋白，其参与广泛的生物学过程，包括细胞生长、存活、粘附、细胞间通讯和运输、通过外泌体(exosome)的细胞间通讯、肿瘤发生、转移以及免疫应答的调节。四跨膜蛋白成员也被描述为在广泛的细胞过程中具有功能性作用，包括细胞运动、发育和分化、激活、增殖、迁移和肿瘤侵袭(Hemler2001；Xu-Monette等人，2016)。
四跨膜蛋白家族成员包含细胞内的N-和C-末端、两个细胞外结构域(EC1和EC2)，以及特别是具有四个跨膜结构域(图2)。四跨膜蛋白的结构组成在物种间是高度保守的，具有在EC2结构域中的高度保守的“CCG”基序中的四个或更多个半胱氨酸残基。在人类中已鉴定出至少33种四跨膜蛋白(Zou等人，2018)。
四跨膜蛋白组织了专门的膜平台，称为“富含四跨膜蛋白的微结构域”(TEM)或“四跨膜蛋白网”，该膜平台整合膜受体，例如模式识别受体(PRR)和II类主要组织相容性复合体(MHC-II)、粘附蛋白和信号分子。重要的是，通过调节它们的相关膜伴侣的功能，四跨膜蛋白调节免疫应答的不同步骤。几种四跨膜蛋白可以正向或负向调节免疫受体的激活阈值。它们还通过控制粘附分子的表面水平和空间排列及其随后的细胞内信号转导，在APC的迁移过程中发挥作用。最后，四跨膜蛋白参与抗原加工，并通过控制T细胞共刺激和MHC-II依赖性抗原呈递，对幼稚T细胞的启动发挥重要作用(Saiz ML等人，2018；Zou等人，2018)。
CD37(四跨膜蛋白TSPAN26)的表达仅限于免疫系统的细胞，在正常细胞和特别是恶性成熟B细胞上丰度最高，在浆细胞中下调(Hemler 2001)。CD37在前B细胞向外周成熟B细胞阶段期间在B细胞上高表达，但在早期祖细胞或终末分化的浆细胞上不存在(Schwartz-Albiez等人，1988)。在T细胞和骨髓细胞上发现了较低的表达。
B细胞可以通过抗原的呈递和多种抗体、促炎性细胞因子和共刺激分子的产生来促进免疫应答。B细胞还可通过多种机制来抑制免疫应答，例如产生IL-10、IL-35和TGFβ1、诱导调节性T细胞以及清除自身抗原。许多细胞表面分子参与B细胞的发育和功能。四跨膜蛋白就是这样一个重要的分子家族(Zou等人，2018)。
CD37是一种已知与其他四跨膜蛋白超家族蛋白、B细胞上的II类主要组织相容性复合体(MHC)分子和整联蛋白复合的细胞表面糖蛋白；MHC-II在专门的抗原呈递细胞(APC)上表达，并在APC表面上与几种四跨膜蛋白(包括CD9、CD37、CD53、CD81和CD82)结合。CD37负调节MHC-II的聚类，并负调节MHC依赖性抗原向CD4+和CD8+T细胞的呈递(Saiz等人，2018)。CD37已显示出稳定膜C型凝集素受体Dectin-1的表面表达并损害其内化，并且可以抑制Dectin-1介导的TNF-α和IL-6的产生。已被描述与CD37结合的其他蛋白质包括ACPA、PURL、YBTO、PG8786 084、CD19、CD53、SYK、KARS、PTPN6、LYN、PIK3CD、PIK3CG、CD81和CR2(Zou等人，2018)。
选择性剪接产生编码CD37的不同同种型的多种转录物变体。CD37参与体液免疫应答和细胞免疫应答的调节和控制。
CD37对T细胞与B细胞的相互作用、免疫球蛋白G(IgG)/IgA的产生以及免疫应答与免疫耐受之间的平衡非常重要。小鼠体内CD37的破坏导致B细胞IgG产生的相对微妙的变化，并导致在次优刺激条件下特别明显的T细胞依赖性免疫应答缺陷。因此，CD37被认为可调节B细胞的体液应答以及T细胞与B细胞的相互作用(Knobeloch等人，2000)。小鼠的CD37缺失会导致B细胞淋巴瘤的自发发展。正如在Cd37-/-小鼠模型和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中观察到的那样，CD37的缺失以及CD37与细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)之间的相互作用导致白介素6(IL6)-AKT-STAT3通路的组成性激活、生发中心衍生的淋巴瘤自发发展、以及较差的临床结果(Xu-Monette等人，2016)。
在B细胞中，CD37在增殖和生存方面具有重要作用。CD37通过控制α(4)β(1)整联蛋白的迁移和聚集来调节其细胞质膜分布，这是激活Akt生存途径的必要步骤。据报道，当CD37在小鼠体内被敲除时，淋巴器官中分泌IgG的浆细胞数量减少，这可能是由于VCAM-1与Akt生存通路的α(4)β(1)整联蛋白的结合受损，导致生发中心中的浆细胞凋亡增加。在最近的一项研究中，小鼠的CD37的敲除可以通过失去对细胞因子信号抑制因子3的控制而组成性激活IL6通路来驱动B细胞淋巴瘤的进展。尽管CD37对B细胞的生存和提供持久的免疫保护至关重要，但也发现，当CD37被酪氨酸磷酸化并与信号因子结合时，可能引发事件级联，导致细胞凋亡。这项研究还发现，CD37通过其N末端结构域介导SHP1依赖性死亡，然而通过其C末端结构域通过介导PI3K依赖性生存来拮抗死亡信号(Zou等人，2018)。
除了在B细胞增殖和存活方面的作用外，CD37还在体内促进IgG1的产生，同时抑制IgA免疫应答。CD37缺失导致血清IgG1水平降低，并在次优的共刺激条件下改变B细胞对T细胞依赖性抗原的反应。
在T细胞中，四跨膜蛋白与T细胞受体(TCR)诱导的活化和增殖有关。肽与MHC的相互作用激活TCR，并启动Src激酶Fyn和Lck的下游信号级联。Lck随后激活参与T细胞活化和增殖的功能蛋白。Lck与CD4/CD8的相互作用在该通路中起着至关重要的作用；如果CD4与四跨膜蛋白CD81/82结合，则Lck从TCR信号通路中隔离。Spriel等人(2004)已经观察到CD37在T细胞增殖中通过影响TCR信号转导的早期事件的调节作用。CD37被发现可干扰Lck激酶的磷酸化，从而抑制TCR信号转导。CD37主要通过影响CD4-Lck在TCR信号相关微结构域中的分布动力学而与TCR信号转导偶联。因此，四跨膜蛋白通过影响靠近Lck动员的TCR-CD4/CD8级联来调节T细胞的生物学过程(Zou等人，2018)。
在B细胞恶性肿瘤中发现CD37表达增加(Zou等人，2018)。大多数B细胞恶性肿瘤都表达CD37，包括B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。在60％的伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)细胞系中检测到不同水平的CD37。尽管肿瘤B细胞中CD37的表达与其相应的B细胞对应物的成熟阶段相关，但B-CLL的CD37水平低于正常的成熟循环B淋巴细胞(Xu-Monette等人，2016)。Belov等人(2001)报道了利用抗体微阵列进行免疫表型分析，显示CD37是恶性CLL细胞(CD37高表达)与正常外周血淋巴细胞(CD37低表达)之间相比的良好鉴别物。
CD37于1986年首次通过鼠单克隆抗体MB-1描述和表征(Link等人，1986)，其也已用于放疗。
CD37可在表达高水平CD37的CLL和NHL患者中被单克隆抗体(例如奥乐妥珠单抗(otlertuzumab))所靶向。在与抗CD37抗体交叉连接后，CD37转导死亡信号(来自于与含有Src同源区2结构域的磷酸酶-1(SHP1)、LYN和磷脂酰肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)相关的N末端结构域)和相反的生存信号(来自于募集p85和PI3Kδ的C末端结构域)(Lapalombella等人，2012；Xu-Monette等人，2016)。
到目前为止，有限数量的CD37定向抗体治疗候选物已经在患者中进行了评估。这些药物可能通过多种机制发挥抗肿瘤的细胞毒性作用，包括细胞凋亡诱导、抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和补体依赖性细胞毒性。Stilgenbauer等人(2019)最近在CLL患者中使用抗体BI 836826进行的一项临床研究证实，CD37是一个有前景的治疗靶点。作为B细胞恶性肿瘤的疗法，结合CD37的小模块免疫药物蛋白质也已被推进临床测试(Zhao等人，2007)。
已经开发了抗体-药物缀合物(ADC)，其将细胞毒性试剂与肿瘤靶向抗体共价连接，以提高其抗肿瘤特异性和效力。该方法设计为通过ADC结合、内化和细胞内释放有效载荷，使细胞毒性化合物特异性递送到表达靶抗原的细胞。
已经描述了一种ADC，其由具有有效的体外抗B细胞系活性的抗CD37抗体与强效抗微管剂美登素DM1(maytansinoid DM1)经由硫醚接头4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMCC)缀合组成；所述ADC(IMGN529)导致正常细胞和CLL B细胞有效和特异性的消耗(Deckert等人，2013)。在产生可移植hCD37+白血病的小鼠CLL模型中，该ADC IMGN529消除了外周血白血病，并提高了总生存率；相反，仅使用IMGN529的抗体组分未能改变病程(Beckwith Ka等人，2014)。
这些数据表明，CD37定向疗法可能是有效的。然而，仍然很需要具有改进效力和功效谱的药物。
在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中，使用小分子布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂依鲁替尼(Ibrutinib)的治疗已成为标准的治疗方法。通过布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)慢性激活B细胞受体(BCR)信号传导被广泛认为是驱动B细胞淋巴瘤的疾病进展的主要机制之一。依鲁替尼在临床试验中对CLL表现出显著疗效，并且是美国FDA批准以任何治疗线用于治疗任何CLL患者的首个BTK抑制剂。它的使用已迅速成为复发性CLL患者和许多一线高危或老年患者的标准疗法(Brown，2018)。
然而，尽管BTK靶向药物依鲁替尼已显示出有前景的临床反应，但原发性或获得性的耐药的存在很常见，常常导致令人沮丧的临床结果。对依鲁替尼疗法的耐药性可通过基因突变、替代生存通路的上调或非依鲁替尼治疗所靶向的其他未知因素介导(George B等人，2020；Fuhrman等人，2014；Pula B等人，2019)。
已描述包含鹅膏毒素和肿瘤抗原特异性抗体或抗体片段或衍生物的抗体-药物缀合物(ADC)(WO2010/115629A2、WO2016/142049A1、WO2017/149077A1)。
发明内容
发明人惊讶地和出乎意料地发现，本发明的基于鹅膏毒素的缀合物，特别是包含CD37特异性抗体或抗体片段或抗体衍生物，无论是使用不可裂解接头或可裂解接头将抗CD37抗体或抗体片段或抗体衍生物连接至鹅膏毒素，在体外和体内均能克服依鲁替尼耐药性，并对CD37阳性的依鲁替尼耐药的靶细胞产生显著的细胞毒性作用。
因此，鉴于现有技术，本发明的一个目的是提供缀合物，其包含结合CD37的靶结合部分、至少一种鹅膏毒素和任选的至少一种接头，所述接头连接所述靶结合部分与所述至少一种毒素，如本申请中所述，该缀合物介导靶细胞中的细胞毒性作用。
本发明的另一个目的是提供缀合物，其包含结合CD37的靶结合部分、至少一种鹅膏毒素和任选的至少一种接头，其中所述靶结合部分是特异性结合CD37的抗体、其抗原结合片段或其抗原结合衍生物或抗体样蛋白。
本发明的另一个目的是提供包含此类缀合物的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供用于治疗癌症的方法的化合物。
本发明的另一个目的是提供缀合物，其包含结合CD37的靶结合部分、至少一种鹅膏毒素和任选的至少一种接头，用于治疗B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病，特别是用于治疗非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、里希特综合征(Richter syndrome)、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis)和显微镜下多血管炎(microscopicpolyangiitis)，以及寻常型天疱疮。
根据本发明的独立权利要求的方法和手段满足了这些和其他目的。从属权利要求涉及具体实施方案。
下面将详细讨论本发明及其特征的一般优点。
附图说明
图1：不同鹅膏毒素的马库什结构。粗体数字(1至8)表示形成鹅膏毒素的八个氨基酸的标准编号。还显示了氨基酸1、3和4中原子的标准指定(分别为希腊字母α至γ、希腊字母α至δ，以及数字1’至7’)。
图2：四跨膜蛋白的示意图。四跨膜蛋白包含四个跨膜结构域(TM1-4)、细胞内N-和C-末端，以及两个细胞外结构域(EC1和EC2)。CCG基序由半胱氨酸-半胱氨酸-甘氨酸和两个二硫键(细线)形成(根据Zou等人，2018)。
图3：通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析，抗CD37单克隆抗体chHH1-LALA-D265C分别与B细胞白血病(B-CLL)细胞系MEC-1和MEC-2、人伯基特淋巴瘤细胞系Raji和Ramos，以及人B细胞前体白血病(B-cell precursor leukemia)细胞系Nalm-6的结合。
图4：(A)CD37阳性的MEC-1细胞、(B)-(G)CD37阳性的MEC-2细胞使用不同的抗CD37抗体靶向的鹅膏毒素缀合物孵育96小时后，在CTG测定法中的体外细胞毒性研究结果。
图5：(A)-(D)在WST-1细胞增殖测定中使用不同的抗CD37抗体靶向的鹅膏毒素缀合物对CD37阳性的Raji-Luc细胞的体外细胞毒性研究结果。
图6：CD37阳性的Raji细胞使用不同的抗CD37抗体靶向的鹅膏毒素缀合物((A)-(E))在与所述鹅膏毒素缀合物孵育96小时后，在CTG测定法中的体外细胞毒性研究结果。
图7：CD37阳性的Ramos细胞使用不同的抗CD37抗体靶向的鹅膏毒素缀合物((A)-(D))在与所述鹅膏毒素缀合物孵育96小时后，在CTG测定法中的体外细胞毒性研究结果。
图8：使用不同的抗CD37-鹅膏毒素缀合物在散布的MEC2肿瘤异种移植模型中治疗180天的体内细胞毒性效力研究结果，图中显示了各治疗组的体重。
图9：使用所示的不同抗CD37-鹅膏毒素缀合物在散布的MEC2肿瘤异种移植模型中治疗180天的体内细胞毒性效力研究结果：生存率。
图10：使用不同的抗CD37-鹅膏毒素缀合物在散布的Raji-Luc肿瘤异种移植模型中治疗130天的体内细胞毒性效力研究结果，图中显示各治疗组的体重。
图11：使用不同的抗CD37-鹅膏毒素缀合物在散布的Raji-Luc肿瘤异种移植模型中治疗125天的体内细胞毒性效力研究结果：生物发光(相对于背景归一化)。
图12：使用不同的抗CD37-鹅膏毒素缀合物在散布的Raji-Luc肿瘤异种移植模型中治疗130天的体内细胞毒性效力研究结果：生存率。
图13：在食蟹猴(Macaca fascicularis)中的探索性毒性研究结果。以每组所示的递增剂量，使用所示的不同抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物，(A)、(D)丙氨酸转氨酶(ALT)血清水平(分别为平均值和中位值)；(B)、(E)天冬氨酸转氨酶(AST)血清水平(分别为平均值和中位值)；以及(C)、(E)乳酸脱氢酶(LDH)血清水平(分别为平均值和中位值)。
图14：在食蟹猴(Macaca fascicularis)中的探索性毒性研究结果。使用所示的不同抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物，(A)-(C)丙氨酸转氨酶(ALT)血清水平；(D)-(F)天冬氨酸转氨酶(AST)血清水平；以及(G)-(I)乳酸脱氢酶(LDH)血清水平。十字形表示被安乐死或已经死亡的动物。
图15：在食蟹猴(Macaca fascicularis)中的探索性毒性研究结果。使用所示的剂量在1.0至20mg/kg之间的非特异性抗体-鹅膏毒素缀合物历经200天的(A)丙氨酸转氨酶(ALT)血清水平；(B)天冬氨酸转氨酶(AST)血清水平；以及(C)乳酸脱氢酶(LDH)血清水平。
图16：用本发明的抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物治疗里希特综合征患者衍生的异种移植(PDX)模型(RS1316)的结果。(A)用所示本发明的鹅膏毒素缀合物治疗的动物在治疗后直到75天的生存图，(B)用所示鹅膏毒素缀合物单次治疗后，肾(kid)、肝(liv)、肺、骨髓(BM)、外周血(PB)、脑(bra)和脾(Spl)中残留的RS细胞(CD45+、CD19+、CD20+阳性细胞)的数量。
图17：通过流式细胞术评估的抗CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C抗体与人和食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)的结合。(A)左图：对照：仅用山羊抗人IgG(Fc)-AlexaFluor488 Fab染色的人PBMC；右图：用抗CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C和山羊抗人IgG(Fc)-AlexaFluor488 Fab二抗染色的人PBMC。(B)左图：对照：仅用山羊抗小鼠IgG(Fc)-AlexaFluor488 Fab染色的人PBMC；右图：用小鼠抗人CD37抗体和山羊抗小鼠IgG(Fc)-AlexaFluor488 F(ab)2-片段二抗染色的人PBMC。(C)左图：仅用山羊抗小鼠IgG(Fc)-AlexaFluor488 F(ab)2-片段染色的食蟹猴PBMC，右图：用抗CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C和山羊抗人IgG(Fc)-AlexaFluor488 Fab二抗染色的食蟹猴PBMC；(D)左图：仅用山羊抗小鼠IgG(Fc)-AlexaFluor488 F(ab)2-片段染色的食蟹猴PBMC，右图：用小鼠抗人CD37抗体和山羊抗小鼠IgG(Fc)-AlexaFluor488 F(ab)2-片段作为二抗染色的食蟹猴PBMC。
图18：本发明缀合物的细胞毒性。使用两种示例性缀合物评估了本发明缀合物对MEC-1、MEC-2、Ramos和Raji-luc细胞的细胞毒性依赖性:(A)缀合物XXV、(B)缀合物XXIII。结果表明，无论细胞表面表达的可检测的CD37表位的数量如何(与在MEC-2细胞上的高表达相比，在Ramos或MEC-1细胞上低表达)，本发明缀合物都对靶细胞具有高细胞毒性，其通过有效的细胞杀伤所证明。CD37表位的定量使用QuantumTM MESF试剂盒根据制造商的说明进行。
发明详述
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明并不限于所描述的装置的特定组成部件或所描述的方法的工艺步骤，因为这些装置和方法是可变化的。也应当理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而并不旨在是限制性的。应当注意，如在本说明书及所附权利要求中使用的，单数形式的“一种”、“一个”以及“该”包含单数和/或复数指代，除非上下文另有明确说明。也应当理解，在参数范围是以数值限定的情况中，其范围应视为包含这些限定数值。本文中对数值范围的提及仅旨在作为单个引用落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都纳入本说明书中，就如同它在本文中被单独引用一样。
在本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则术语“包括”以及变体如“包含”和“含有”应被理解为意味着包括所述的成员、整数或步骤，但不排除任何其他未提及的成员、整数或步骤。术语“由...组成”是术语“包括”的一个特定方案，其中排除任何其他未提及的成员、整数或步骤。
还应当理解，本文所公开的实施方案并不意味着被理解为彼此不相关的单独实施方案。讨论一个实施方案的特征也意味着公开了本文所示的其他实施方案的特征。在一种情况下，如果特定特征没有被一个实施方案公开，而是用另一个实施方案公开，那么本领域技术人员应当理解，这并不一定意味着所述特征不被所述另一个实施方案公开。本领域技术人员应当理解，本申请的要旨是也针对其他实施方案公开所述特征，但仅仅是为了清楚起见并且为了将说明书保持在可控制的篇幅下，并没有这样做。
此外，本文所引用的现有技术文件的内容均通过引用并入本文。尤其是公开了标准或常规方法的现有技术文件。在那种情况下，通过引用并入本文的主要目的是提供充分公开的内容，避免冗长的重复。本申请中使用的化学术语应当根据国际纯化学与应用化学联合会出版的“Compendium of Chemical Terminology”(ISBN:0-9678550-9-8)进行解释。
在本申请中，使用术语“约”，指的是其所使用的数值的+/-10％。
根据本发明的第一方面，本发明涉及缀合物，其包含：(i)靶结合部分、(ii)至少一种毒素以及(iii)任选的至少一个接头，所述接头连接所述靶结合部分与所述至少一种毒素，其中所述靶结合部分结合CD37，并且其中所述至少一种毒素是鹅膏毒素。
鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的双环肽，其发现于鬼笔鹅膏(Amanitaphalloides)蕈中(参见图1)。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶II，从而也抑制受影响的细胞的转录和蛋白质生物合成。对细胞转录的抑制导致生长和增殖停止。尽管没有共价键合，但鹅膏蕈碱(amanitin)和RNA聚合酶II之间的复合非常紧密(KD＝3nM)。鹅膏蕈碱从该酶上解离是一个非常缓慢的过程，因此受影响的细胞不太可能恢复。在对转录的抑制持续足够长时间时，细胞会经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
本发明的术语“鹅膏毒素(amatoxin)”包括从鹅膏属(Amanita)分离和在Wieland，T.和Faulstich H.(Wieland T,Faulstich H.,CRC Crit Rev Biochem.5(1978)185-260)中描述的由8个氨基酸组成的所有双环肽，及其所有化学衍生物；还包括其所有半合成类似物；还包括根据天然化合物的基本结构(环状，8个氨基酸)而由结构单元构建的其所有合成类似物；还包括含有非羟基化氨基酸替换羟基化氨基酸的所有合成或半合成类似物；并且还包括亚砜部分被砜、硫醚或者不同于硫的原子(例如鹅膏蕈碱的羰基类似物(carbanalog)中的碳原子)替换的所有合成和半合成类似物。
如本文所用，化合物的“衍生物”是指具有与该化合物相似的化学结构，但还含有未衍生的化合物中不存在的至少一个化学基团和/或缺少未衍生的化合物中存在的至少一个化学基团的物质。与衍生物进行比较的化合物被称为“母体”化合物。通常，“衍生物”可以由母体化合物通过一个或多个化学反应步骤产生。
如本文所用，化合物的“类似物”与该化合物结构上相关但不相同，并且表现出该化合物的至少一种活性。与类似物进行比较的化合物被称为“母体”化合物。前述活性包括但不限于：与另一种化合物的结合活性；抑制活性，例如酶抑制活性；毒性作用；活化活性，例如酶活化活性。不需要类似物表现出与母体化合物相同程度的这种活性。如果化合物表现出母体化合物活性的至少1％(更优选至少5％、更优选至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％，以及更优选至少50％)程度的相关活性，则该化合物被认为是本申请背景下的类似物。因此，如在本文中所用，“鹅膏毒素的类似物”是指与α-鹅膏蕈碱(amanitin)、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素(amanin)、三羟毒伞肽酰胺(amaninamide)、鹅膏无毒环肽(amanullin)和一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullinic acid)中的任何一种结构上相关，并且表现出与α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟毒伞肽酰胺、鹅膏无毒环肽和一羟鹅膏毒肽羧酸中的至少一种相比至少1％(更优选至少5％、更优选至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、50％、60％，以及更优选至少70％、80％、90％)的对哺乳动物RNA聚合酶II的抑制活性的化合物。适用于本发明中的“鹅膏毒素的类似物”甚至可表现出比α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟毒伞肽酰胺、鹅膏无毒环肽或一羟鹅膏毒肽羧酸中的任何一种更高的对哺乳动物RNA聚合酶II的抑制活性。抑制活性可通过测定发生50％抑制时的浓度(IC50值)来测量。对哺乳动物RNA聚合酶II的抑制活性可通过测量对细胞增殖的抑制活性来间接测量，或者，如本文所公开的，鹅膏毒素及其各衍生物的抑制活性可以例如使用Voss等人，BMC Molecular Biology 2014,15:7中所公开的RNA聚合酶II活性测定法进行评估。
“半合成类似物”是指通过使用来自天然来源的化合物(例如植物材料、细菌培养物、真菌培养物或细胞培养物)作为起始材料进行化学合成而获得的类似物。通常，本发明的“半合成类似物”是以从捕蝇蕈科(Amanitaceae family)的蕈类中分离的化合物作为原料起始合成的。相反，“合成类似物”是指通过小的(通常是石油化学的)结构单元的所谓全合成而合成的类似物。通常，该全合成是在没有生物方法辅助的情况下进行的。
根据本发明的一些实施方案，所述鹅膏毒素可选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、鹅膏素、三羟毒伞肽酰胺及其类似物、衍生物和盐。
功能上，鹅膏毒素被定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或缩酚酸肽。优选的鹅膏毒素是具有能够与下文所定义的接头分子或靶结合部分发生反应的官能团(例如羧基基团、氨基基团、羟基基团、硫醇或硫醇捕获基团)的那些。
在本发明的上下文中，术语“鹅膏蕈碱”特别是指基于1位是天冬氨酸或天冬酰胺残基、2位是脯氨酸残基(特别是羟脯氨酸残基)、3位是异亮氨酸、羟基异亮氨酸或二羟基异亮氨酸(或对于一羟鹅膏毒肽羧酸为天冬氨酸)、4位是色氨酸或羟基色氨酸残基(或对于前鹅膏无毒环肽(proamanullin)为脯氨酸)、5和7位是甘氨酸残基(或在一羟鹅膏毒肽羧酸和前鹅膏无毒环肽的情况下为异亮氨酸残基)、6位是异亮氨酸残基、8位是半胱氨酸残基、特别是被氧化成亚砜或砜衍生物的半胱氨酸衍生物的双环结构(鹅膏蕈碱的编号和代表性实例参见图1)，并且还包括其所有化学衍生物；还包括其所有半合成类似物；还包括根据天然化合物的基本结构(环状，8个氨基酸)由结构单元构建的其所有合成类似物；还包括含有非羟基化氨基酸替换羟基化氨基酸的所有合成或半合成类似物；还包括在任何此类衍生物或类似物通过抑制哺乳动物RNA聚合酶II而具有功能活性的各种情况下的所有合成和半合成类似物。
如本文所用，术语“靶结合部分”是指可与靶分子或靶表位特异性结合的任何分子或分子的一部分。在本申请的背景下，优选的靶结合部分是(i)抗体或其抗原结合片段；(ii)抗体样蛋白；和(iii)核酸适体(aptamer)、(iv)抗运载蛋白(anticalin)或(v)适用于本发明的“靶结合部分”，其分子量通常为40000Da(40kDa)或更高。
本申请上下文中的“接头”是指增加两种组分之间距离，例如以减少靶结合部分与鹅膏毒素之间的空间干扰的分子，其也可以降低鹅膏毒素与RNA聚合酶II相互作用的能力。该接头可用于另一个目的，即，它可以在被靶结合部分靶向的细胞中特异性地促进鹅膏毒素的释放。优选的是，该接头，以及优选的该接头的一侧与鹅膏毒素之间的键和该接头的另一侧与靶结合部分或抗体之间的键在细胞外(例如血液)的生理条件下是稳定的，同时它可以在细胞内裂解，特别是在靶细胞(例如癌细胞)内裂解。为了提供这种选择性的稳定性，该接头可包含优选pH敏感性或蛋白酶敏感性的官能团。或者，连接该接头与靶结合部分的键可提供选择性的稳定性。优选地，所述接头具有至少1个原子的长度，优选1-30个原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个原子)的长度，其中该接头的一侧与鹅膏毒素反应，且另一侧与靶结合部分反应。在本发明的上下文中，接头优选为任选地被取代的以下基团：C1-30-烷基、C1-30-杂烷基、C2-30-烯基、C2-30-杂烯基、C2-30-炔基、C2-30-杂炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基基团。该接头可含有一个或多个结构元件，如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、烃部分等。该接头还可含有这些结构元件的两个或更多个的组合。这些结构元件中的每一个都可存在于该接头中多于一次，例如两次、三次、四次、五次或六次。在一些实施方案中，该接头可含有二硫键。应当理解的是，该接头必须在一个步骤或两个或更多个后续步骤中连接至鹅膏毒素和靶结合部分。为达到这个目的，该接头将携带两个基团(优选在近端和远端)，所述基团可以(i)与鹅膏毒素或靶结合肽上的基团(优选活化的基团)形成共价键，或(ii)其被活化或者可以被活化以与鹅膏毒素上的基团形成共价键。因此，如果该接头存在，则优选化学基团位于该接头的远端和近端，所述基团是此类偶联反应的结果，例如酯、醚、氨基甲酸乙酯、肽键等。“接头”的存在是任选的，即，在靶结合部分-毒素缀合物的一些实施方案中，鹅膏毒素可以直接与靶结合部分的残基连接，但在本发明的优选实施方案中，鹅膏毒素经由接头与靶结合部分连接。
本发明还涉及缀合物，其包含结合CD37的靶结合部分、至少一种鹅膏毒素和任选的接头，其中所述靶结合部分选自：
(i)抗体，优选单克隆抗体，
(ii)其抗原结合片段，优选可变结构域(Fv)、Fab片段或F(ab)2片段，
(iii)其抗原结合衍生物，优选单链Fv(scFv)，以及
(iv)抗体样蛋白，
它们各自分别与CD37结合。
在优选实施方案中，所述CD37是人CD37(SEQ ID No.13)；在最优选的实施方案中，所述靶结合部分特异性结合的是人CD37的细胞外结构域。本文所用的术语“特异性结合”是指本发明的靶向部分(例如本文所公开的抗CD37抗体)以至少约10-6M、10-7M、10-8M，或约10- 8M至约10-9M、10-10M、10-11M、10-12M，或约5x10-9 M、5x10-10 M至约2.5x10-11 M、5x10-11 M、2.5x10-12 M、5x10-12 M的KD结合其抗原(例如人CD37的表位，优选人CD37的细胞外表位)。本发明的靶结合部分(例如本文所公开的抗体)的结合的KD的测定可以根据Kamat等人，Analytical Biochemistry 536(2017)16-31确定，或按照例如Noy-Porat等人，STARProtoc.2021Sep 15；2(4):100836所公开的确定。
所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物分别可以是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，或其抗体结合片段或抗原结合衍生物。
如本文所用，术语“抗体”应指由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段或其衍生的cDNA编码的一条或多条多肽链组成的蛋白质。所述免疫球蛋白基因包括轻链κ、λ和重链α、δ、ε、γ和μ恒定区基因，以及许多不同的可变区基因中的任何一个。
免疫球蛋白(抗体)的基本结构单元通常是由两个相同的多肽链对，即轻链(L，其分子量为约25kDa)和重链(H，其分子量为约50-70kDa)组成的四聚体。每条重链由重链可变区(缩写为VH或VH)和重链恒定区(缩写为CH或CH)组成。重链恒定区包括三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(缩写为VL或VL)和轻链恒定区(缩写为CL或CL)。VH和VL区可进一步细分为高变区，其也称为互补决定区(CDR)，其被更保守的称为框架区(FR)的区域所分散。每个VH和VL区都由从氨基末端到羧基末端依次以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列的三个CDR和四个FR构成。重链和轻链的可变区形成与抗原相互作用的结合结构域。
抗体的CDR区和框架区可根据本领域已知的不同编号方案来定义，例如Kabat(EAKabat,TT Wu,H.Bilofsky,M.Reid-Miller and H.Perry,Sequence of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda(1983))、Chothia(Cothia&Lesk,J Mol Biol.1987Aug 20；196(4):901-17)，或(ImMunoGeneTicsinformation,Lefranc等人，Dev Comp Immunol.(2003)27:55-77.)。在本发明的上下文中，对CDR的参考是根据Kabat给出的。
CDR对于抗体或其抗原结合部分的结合是最重要的。只要保留了结合抗原所需的三维结构，FR可以被其他序列取代。构建体的结构变化经常会导致与抗原失去足够的结合。
术语(单克隆)抗体的“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段，其保留以其天然形式特异性结合CD20抗原的能力。抗体的抗原结合部分的实例包括Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)、F(ab’)2片段(包含两个通过铰链区的二硫桥连接的Fab片段的二价片段)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，以及由VH结构域和分离的互补决定区(CDR)组成的dAb片段。
根据本发明的抗体或其抗体片段或抗体衍生物可以是单克隆抗体。如本文所使用的，术语“单克隆抗体(mAb)”是指对特定表位具有单一结合特异性和亲和力的抗体分子的制备物，表示同源性抗体群体，即由整个免疫球蛋白或其片段或衍生物组成的同源性群体。优选地，这种抗体选自IgG、IgD、IgE、IgA和/或IgM，或其片段或衍生物，优选地，本发明的单克隆抗体是IgG同种型，例如IgG1或IgG4，更优选IgG1同种型。
如本文所用，术语“片段”或“抗原结合片段”指保留靶结合能力的此类抗体的片段，例如CDR(互补决定区)、高变区、可变结构域(Fv)、IgG重链(由VH、CH1、铰链区、CH2和CH3区组成)、IgG轻链(由VL和CL区组成)和/或Fab和/或F(ab)2。
如本文所用，术语“衍生物”或“抗原结合衍生物”应指与普通抗体概念在结构上不同但仍具有一些结构关系的蛋白质构建体(例如scFv、Fab和/或F(ab)2)，以及双特异性、三特异性或更高特异性的抗体构建体，它们都与本发明的单克隆抗体具有大致相同的靶结合特异性。这些将在下文中解释。
本领域技术人员已知的其他抗体衍生物是二体(Diabodies)、骆驼科抗体(Camelid Antibodies)、结构域抗体(Domain Antibodies)、具有由scFv组成的两条链的二价同源二聚体、IgA(通过J链和分泌性组分连接的两个IgG结构)、鲨鱼抗体(IgNAR)、由新世界灵长类框架区和非新世界灵长类CDR组成的抗体、包含CH3+VL+VH的二聚构建体、包含CDR的其他支架蛋白形式、以及抗体缀合物(例如与药物、毒素、细胞因子、适体、核酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、治疗性多肽、放射性同位素或标签连接的抗体或其片段或衍生物)。
如本文所用，术语“抗体样蛋白”是指被工程化(例如通过Ig环的诱变)以特异性结合靶分子的蛋白质。通常，所述抗体样蛋白包含两端与蛋白质支架连接的至少一个可变肽环。这一双重结构约束将该抗体样蛋白的结合亲和力大幅增加至与抗体相当的水平。所述可变肽环的长度通常由10至20个氨基酸组成。支架蛋白可以是具有良好溶解性的任何蛋白。优选地，支架蛋白是小的球状蛋白质。抗体样蛋白包括但不限于affilin蛋白、亲和体(affibody)、抗运载蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(Binz等人，2005)。抗体样蛋白可来源于突变体的大文库(例如通过从大噬菌体展示文库中淘选)，并且可以与常规抗体类似的方式分离。同样，抗体样结合蛋白可以通过球状蛋白中的表面暴露残基的组合突变获得。
本发明的抗体样蛋白也可例如包含单结构域抗体片段(dAb)，也称为纳米抗体，其由12-15kDa的VH或VL结构域组成，并且是保持完整抗原结合特异性的最小的功能性抗体片段，例如骆驼科VH结构域(VHH)和被称为V-NAR的鲨鱼VH结构域，即IgNAR的抗原结合结构域(参见例如English等人，Antibody Therapeutics,2020,Vol.3,No.1 1-9)。
如本文所用，术语“Fab”涉及包含抗原结合区的IgG片段，所述片段由来自抗体的每条重链和轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。
如本文所用，术语“F(ab)2”涉及由通过二硫键彼此连接的两个Fab片段组成的IgG片段。
如本文所用，术语“scFv”涉及一种单链可变片段，其是通过短接头连接在一起的免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合物，通常包含丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G)残基。尽管去除了恒定区并引入了接头肽，但该嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性。
修饰的抗体形式是例如双特异性或三特异性抗体构建体、基于抗体的融合蛋白、免疫缀合物等。
IgG、scFv、Fab和/或F(ab)2是本领域技术人员熟知的抗体形式。相关的实践技术可从相应的教科书中获得。
根据本发明的优选实施方案，所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物分别为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物，更优选地，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或人抗体。
源自于小鼠的单克隆抗体(mAb)可能会引起不希望的免疫副作用，因为它们含有来自另一物种的蛋白质，可能会诱发抗药物的抗体。为了克服这个问题，已经设计了抗体人源化和成熟方法，以产生在施用于人时具有最小免疫原性的抗体分子，同时在理想情况下仍保留非人类的亲本抗体的特异性和亲和力(综述可参见Almagro和Fransson 2008))。例如，使用这些方法，将小鼠mAb的框架区替换为相应的人框架区(所谓的CDR移植)。WO200907861公开了通过重组DNA技术将非人抗体的CDR区连接至人恒定区，从而产生人源化形式的小鼠抗体。Medical Research Council的US6548640描述了CDR移植技术，并且Celltech的US5859205描述了人源化抗体的产生方法。
如本文所用，术语“嵌合抗体”涉及由抗体的原始抗原结合可变结构域组成的抗体，而恒定结构域衍生自不同的物种。由于抗体，特别是单克隆抗体，最初最常来源于小鼠，因此嵌合抗体通常包含人恒定结构域和小鼠可变结构域，以降低对人的免疫原性。临床疗法中使用的嵌合抗体的实例包括英夫利昔单抗(infliximab)、利妥昔单抗(rituximab)和阿昔单抗(abciximab)。
如本文所用，术语“人源化抗体”涉及抗体或其片段或衍生物，其中所述抗体的至少一部分恒定区和/或框架区以及任选的一部分CDR区衍生自人免疫球蛋白序列或调整为人免疫球蛋白序列。
本文所公开的抗体或其抗体片段或抗体衍生物可包含人源化序列，特别是基于优选的VH和VL的抗原结合区的人源化序列，其维持了适当的配体亲和力。为获得所述人源化序列而进行的氨基酸序列修饰可以发生在原始抗体的CDR区和/或框架区和/或抗体恒定区序列中。
所述抗体或其抗体片段或抗体衍生物可被糖基化。聚糖可以是重链的天冬酰胺297处的N-连接的寡糖链。
本发明的抗体或其片段或衍生物可通过用包含本发明抗体的编码序列的表达载体转染宿主细胞来产生。该表达载体或重组质粒是通过将编码抗体序列置于合适的调控遗传元件的控制之下产生的，所述调控遗传元件包括启动子和增强子序列，例如CMV启动子。重链和轻链序列可以从共转染的单个表达载体或从双表达载体表达。所述转染可以是瞬时转染或稳定转染。随后培养转染的细胞，以产生转染的抗体构建体。当进行稳定转染时，通过用适当的测定法(例如ELISA)进行筛选来选择分泌具有合适相关重链和轻链的抗体的稳定克隆，进行亚克隆，并进行繁殖以用于未来的生产。现有技术中已经描述了用于表达单克隆抗体的哺乳动物细胞的瞬时或稳定转染的相应方法。例如，等人，BMCBiotechnology 2013,13:52公开了一种在HEK293细胞中瞬时产生重组抗体的方法，Kamle等人，Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods(2022)p.31-39中公开了用于抗体瞬时表达和纯化的替代方法。用于产生稳定细胞克隆的方法在例如US2010/0311116 A1或US 7,491,532 B2中公开。产生单克隆抗体的细胞工程的指南由例如Costa,R.A.,等人，Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138报告。Kim,D.W.等人报告了人延伸因子1α启动子作为通用且有效的表达系统的应用(Gene 91(1990)217-223)。Buchman,A.R.,等人，(Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405)报告了内含子依赖性和内含子非依赖性的基因表达的比较。
根据本发明的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物分别可选自或衍生自：利洛托单抗(Tetulomab/Lilotomab)、奥乐妥珠单抗(TRU-016)和Naratuximab、BI 836826或Gen3009。
在本发明的优选实施方案中，在包含抗体或其抗原结合片段或其抗体结合衍生物或抗体样蛋白、至少一种鹅膏毒素和任选的接头的缀合物中，所述抗体或其片段或衍生物或抗体样蛋白包含以下互补决定区(CDR)：
根据SEQ ID No.1的CDRH1(DYNMY)、
根据SEQ ID No.2的CDRH2(YIDPYNGDTTYNQKFKG)、
根据SEQ ID No.3的CDRH3(SPYGHYAMDY)、
根据SEQ ID No.4的CDRL1(KASQDVSTAVD)、
根据SEQ ID No.5的CDRL2(WASTRHT)、
根据SEQ ID No.6的CDRL3(RQHYSTPFT)，
其中所述CDR包含在合适的蛋白质或氨基酸框架中，以便能够结合CD37，优选结合人CD37，最优选结合人CD3的细胞外结构域，特别优选结合包含在人CD37的EC1和/或EC2中的表位或由人CD37的EC1和/或EC2形成的表位，其中EC1包含SEQ ID NO.13的氨基酸39-59或由SEQ ID NO.13的氨基酸39-59组成，并且EC2包含SEQ ID No.13的氨基酸112-241或由SEQ IDNo.13的氨基酸112-241组成。本文所用的术语“表位”是指大分子(优选多肽)的一部分，其被抗原结合分子(例如本文所公开的本发明的抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物)识别，更特别地被所述分子的抗原结合位点识别。表位定义了抗体分子的最小结合位点，因此代表了抗体分子特异性的靶标。表位还可定义为结构表位或功能表位。“结构表位”由与抗体密切接触的区域中的氨基酸或其他分子组成，通常由结构揭示。“功能表位”是指对结合作出能量贡献的分子的那些部分，因此在其发生改变时结合亲和力将有所降低。结构表位可以是例如长度为约5个氨基酸至约10、15、20、25、30、40、45、50、100个氨基酸，或者长度为约6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45至约50、75、100个氨基酸的线性连续序列，或由多肽的三维结构形成并且可包含多肽的不连续的氨基酸的构象表位。
在一个实施方案中，包含在上文所公开的本发明缀合物中的抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物特异性地结合由SEQ ID NO.13的氨基酸39-59和/或由SEQ IDNO.13的氨基酸112-241形成的构象表位。所述构象表位可由一种以上的CD37蛋白质形成，例如由形成多聚体的两个、三个或四个CD37分子形成。
在一个实施方案中，包含在上文所公开的本发明缀合物中的本发明的抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物不与包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列的食蟹猴CD37特异性结合。因此，包含在本发明缀合物中的所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物不与包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的食蟹猴CD37特异性结合。本文中所使用的术语“不特异性结合”或其任何语法等价物应当表示，包含在本发明缀合物中的本发明的抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物的KD>10-6M、10-5M、10-4M。
在本发明的其他优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物或抗体样蛋白分别包含与根据SEQ ID No.7的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.7的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.7的氨基酸序列组成的重链可变区，以及与根据SEQ ID No.8的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ IDNo.8的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.8的氨基酸序列组成的轻链可变区。在本发明中可互换使用的术语“序列相似性”或“序列同一性”是指两个或更多个氨基酸或多核苷酸序列彼此之间或相对于参考序列之间的相似性或同一性。根据本发明的序列同一性可以例如在与相应的参考序列进行比较的每个序列的整个长度上确定(所谓的“整体比对”)，其特别适合于相同或相似长度的序列，或者在较短的、限定长度上确定(所谓的“局部比对”)，其更适合长度不等的序列。在这种背景下，与查询的氨基酸序列具有例如至少95％的“序列同一性”的氨基酸序列是指所述主题氨基酸序列的序列与查询序列相同，但是主题氨基酸序列可包括所述查询氨基酸序列的每100个氨基酸中最多5个氨基酸改变。换言之，为了获得与查询氨基酸序列具有至少95％同一性的序列的氨基酸序列，可在主题序列中插入最多5％(100个氨基酸中的5个)的氨基酸残基或将最多5％(100个氨基酸中的5个)的氨基酸残基替换为另一种氨基酸或使之缺失。序列同一性可以例如在SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的全长上计算，根据一个实施方案，与SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的序列同一性是在SEQ ID No.7或SEQ ID No.8的框架区的长度上计算的，排除SEQ ID NO:7中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的氨基酸序列，用于计算序列同一性，和/或排除SEQ ID NO:8中的SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:5、SEQID NO:6的氨基酸序列，用于计算序列同一性。
用于比较两个或更多个序列的序列同一性和序列相似性的方法在本领域中是众所周知的。两个序列的同一性百分比可以例如通过使用数学算法来确定。可以使用的数学算法的优选但非限制性的实例是Karlin等人，(1993),PNAS USA,90:5873-5877的算法。这种算法被整合在BLAST程序家族(也参见Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215,403-410或Altschul等人，(1997),Nucleic Acids Res,25:3389-3402，可通过互联网NCBI主页(ncbi.nlm.nih.gov)访问)和FASTA(Pearson(1990),Methods Enzymol.83,63-98；Pearson和Lipman(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85,2444-2448.)中。这些程序可以识别与其他序列在一定程度上相同的序列。此外，在Wisconsin Sequence Analysis Package(Devereux等人,1984,Nucleic Acids Res.,387-395；Womble Methods Mol Biol.2000；132:3-22)中可获得的程序，例如程序BESTFIT和GAP，可用于确定两个多肽序列之间的同一性百分比。BESTFIT利用(Smith和Waterman(1981),J.Mol.Biol.147,195-197.)的“局部序列相似性”算法，在两个序列之间找到最佳的单个区域相似性。例如，如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述，可以使用“空位BLAST”。或者，PSI-Blast可用于执行迭代搜索，检测分子之间的远距离关系。当使用上述BLAST、空位BLAST程序中的任何一个时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在本发明的其他优选实施方案中，上文所述的所述抗体包含与根据SEQ IDNo.9的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.9的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.9的氨基酸序列组成的重链，以及与根据SEQ IDNo.12的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成的轻链。
包含由根据SEQ ID No.9的氨基酸序列组成的重链和由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成的轻链的本发明的抗体在本文中被称为“chHH1-HDP”。
根据本发明的优选实施方案，上文描述的所述抗体已被基因工程化以包含根据EU编号系统(Edelman,G.M.等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))的重链118Cys、重链239Cys和/或重链265Cys，优选根据EU编号系统的重链265Cys，并且其中所述接头(如果存在)或所述鹅膏毒素分别经由所述重链118Cys或所述重链239Cys或所述重链265Cys残基连接至所述抗体，更优选地，所述鹅膏毒素经由所述重链265Cys连接至所述抗体。因此，所述基因工程化的重链118Cys、重链239Cys和/或重链265Cys残基可用于将抗体偶联至所述接头(如果存在)或所述鹅膏毒素。
如本文所用，术语“基因工程化”涉及在核苷酸和/或氨基酸取代、插入、缺失或反转(reversion)或其任何组合的意义上，通过基因技术方法对给定或天然多肽或蛋白质的氨基酸序列或其部分进行的修饰，所述基因技术方法例如是以下文献中描述的定向诱变：Biochem.J.(1986)Vol.237:1-7，或J Biol Chem.(2015)Vol.290(5):2577-2592。
如本文所用，术语“氨基酸取代”涉及蛋白质的氨基酸序列的修饰，其中，一个或多个氨基酸被相同数目的不同氨基酸替换，产生含有与原始蛋白质不同的氨基酸序列的蛋白质。保守性氨基酸取代应当理解为涉及由于大小、电荷、极性和/或构象相似而对蛋白质的结构和功能没有显著影响的取代。在该意义上，保守氨基酸组表示，例如非极性氨基酸Gly、Ala、Val、Ile和Leu；芳族氨基酸Phe、Trp和Tyr；带正电荷的氨基酸Lys、Arg和His；以及带负电荷的氨基酸Asp和Glu。下表1中显示了示例性的氨基酸取代：
原始残基 取代的实例
Ala(A) Val,Leu,Ile,Gly
Arg(R) His,Lys
Asn(N) Gln
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Pro,Ala
His(H) Lys,Arg
Ile(I) Leu,Val,Met,Ala,Phe
Leu(L) Ile,Val,Met,Ala,Phe
Lys(K) Arg,His
Met(M) Leu,Ile,Phe
Phe(F) Leu,Val,Ile,Tyr,Trp,Met
Pro(P) Ala,Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr,Phe
Tyr(Y) Trp,Phe
Val(V) Ile,Met,Leu,Phe,Ala
根据本发明的优选实施方案，上文描述的所述缀合物的抗体已被基因工程化以包含根据EU编号系统的重链234Ala和/或235Ala。
根据本发明的甚至更优选的实施方案，上文描述的所述缀合物的抗体已被基因工程化以包含根据EU编号系统的重链265Cys、234Ala和235Ala，并且所述接头(如果存在)或所述鹅膏毒素经由所述重链265Cys连接至所述抗体。
根据本发明的特别优选的实施方案，上文描述的所述缀合物的抗体包含与根据SEQ ID No.10或11的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.10或11的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.10或11的氨基酸序列组成的重链，以及与根据SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成的轻链。
包含由根据SEQ ID No.10的氨基酸序列组成的重链和由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成的轻链的抗体在本文中被称为“chHH1-HDP-D265C”。该抗体的重链包含基因工程化的根据EU编号系统的265Cys残基。
包含由根据SEQ ID No.11的氨基酸序列组成的重链和由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成的轻链的抗体在本文被称为“chHH1-HDP-LALA-D265C”。该抗体的重链包含基因工程化的根据EU编号系统的234Ala和235Ala残基以及265Cys残基。
在本发明的优选实施方案中，所述缀合物的抗体或其抗体片段或抗体衍生物与CD37分子的细胞外结构域结合。
在优选实施方案中，本发明涉及一种缀合物，该缀合物包含与CD37的细胞外结构域结合的如上所述的抗体或其抗体片段或抗体衍生物。
此外，本发明缀合物的细胞毒活性IC50可优于10x10-9 M、9x10-9 M、8x10-9M、7x10-9M、6x10-9 M、5x10-9 M、4x10-9 M、3x10-9 M、2x10-9 M，更优选优于10x10-10 M、9x10-10 M、8x10-10 M、7x10-10 M、6x10-10 M、5x10-10 M、4x10-10M、3x10-10 M、2x10-10 M，更优选优于10x10-11M、9x10-11 M、8x10-11 M、7x10-11M、6x10-11 M、5x10-11 M、4x10-11 M、3x10-11 M、2x10-11 M或1x10-11 M。
根据本发明的实施方案，所述接头(如果存在)或所述鹅膏毒素经由所述抗体的任何天然存在的Cys残基，优选经由形成所述抗体的链间二硫键的任何天然存在的Cy残基，和/或经由二硫键连接至所述抗体，并且可以例如如Behrens等人，MolPharm.2015November 02；12(11):3986-3998中所公开的那样进行。
根据本发明的优选实施方案，所述接头(如果存在)经由工程化的半胱氨酸残基重链118Cys、重链239Cys和/或重链265Cys中的一个或多个连接或偶联至所述抗体。接头与所述半胱氨酸工程化抗体的缀合可以例如WO 2016/142049 A1中所公开的那样进行。
根据本发明的优选实施方案，所述缀合物包含接头，其中所述接头可以是不可裂解或可裂解的接头。
在一些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段与鹅膏毒素缀合的接头是不可裂解的。不可裂解接头包括抗降解(例如蛋白水解)的稳定化学键。通常，不可裂解接头需要在靶细胞内进行蛋白水解降解，并表现出较高的细胞外稳定性。适用于本文的不可裂解接头还可包括选自以下的一个或多个基团：键、-(C＝O)-、C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基及其组合，这些基团中的每一个都可任选地被取代，和/或可包含一个或多个杂原子(例如，S、N或O)来代替一个或多个碳原子。这些基团的非限制性实例包括(CH2)p、(C＝O)(CH2)p和聚乙二醇(PEG；(CH2CH2O)p)单元，其中p为1至6的整数，对于每种情况下均独立地选择。
在一些实施方案中，本发明的不可裂解接头包括以下中的一个或多个：键、-(C＝O)-、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、-(CH2CH2O)p-基团，其中p为1至6的整数。
在一些实施方案中，每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6-亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被选自O、S和N的一个或多个杂原子中断，并且可任选地在每种情况下独立地被选自以下的1至5个取代基取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基-杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰基氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基(sulfanyl)、卤素、羧基、三卤甲基、氰基、羟基、巯基和硝基。
在一个实施方案中，本发明的不可裂解接头包含-(CH2)n-单元，其中n为2至12、或2至6、或6至12的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。
在优选实施方案中，本发明的不可裂解接头包含-(CH2)n单元，其中n为4、5或6，更优选地，其中n为6。
在特别优选的实施方案中，本发明的不可裂解接头是-(CH2)n-，其中n＝6，由下式表示：
根据一些实施方案，本文所公开的本发明的不可裂解接头包括硫醇反应性基团，其选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、甲基磺酰基苯并噻唑、4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基基团、甲基磺酰基苯基四唑或甲基磺酰基苯基噁二唑、吡啶-2-硫醇、5-硝基吡啶-2-硫醇、甲烷硫代磺酸酯或马来酰亚胺。
根据优选实施方案，所述硫醇反应性基团是如下所示的马来酰亚胺(马来酰亚胺基部分)：
根据优选实施方案，包括硫醇反应性基团马来酰亚胺(马来酰亚胺基部分)的本发明的不可裂解接头在偶联到本文所公开的本发明的鹅膏毒素之前具有如下结构：
并且也可称为1-正己基马来酰亚胺，其是不可裂解接头。接头末端的波浪线表示连接到鹅膏毒素的点。在将接头-鹅膏毒素与本文所公开的本发明抗体的反应性半胱氨酸、例如本文公开的本发明半胱氨酸工程化抗体的重链的Cys265缀合之后，所述接头具有以下结构：
其中S为硫原子，其表示存在于特异性结合人CD37的抗体或其抗原结合片段内的反应性取代基。接头末端的波浪线表示与鹅膏毒素连接的点。上述接头部分和鹅膏毒素-接头缀合物以及可与本文所述的组合物和方法结合使用的其它部分描述于例如专利申请公开号WO 2014/043403 A1和专利申请公开号WO2017/149077中进行了描述，其中每个专利申请的公开内容均通过引用整体并入本文。
本发明的“可裂解接头”应当理解为包含至少一个可裂解位点。如本文所用，术语“可裂解位点”是指在特定条件下在限定位置处易遭受特异性裂解的部分。所述条件为例如在特定体内或细胞隔室内的特定酶或还原性环境。例如，在还原性条件下裂解的接头可包括基于N-酰基腙的接头，例如在Bargh等人，Chem Soc Rev.2019Aug 12；48(16):4361-4374中所公开的。可在还原性条件下裂解的接头包括例如二硫化物。多种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB和SMPT形成的二硫化物接头(参见例如Thorpe等人,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等人,In Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery andTherapy of Cancer(C.W.Vogel编辑,Oxford U.Press,1987)。还参见美国专利号4,880,935，它们的公开内容通过引用全文并入本文，因为其涉及适用于共价缀合的接头。
根据一个实施方案，本发明的可裂解接头在高Fe(II)浓度下裂解，并且包括例如Fe(II)-反应性1,2,4-三氧杂环戊烷支架(TRX)。这种接头可特别用于治疗肿瘤细胞内Fe(II)浓度较高的肿瘤。相应的接头在例如以下文献中公开：Spangler等人，MolPharm.2018May 7；15(5):2054-2059。例如，在希望ADC有效载荷的溶酶体释放的情况下可使用的接头包括以下文献中公开的二硫化物缀合物：Pillow等人，Chem.Sci.,2017,8,366-370。在酸性条件下可水解的替代接头包括例如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等。还参见美国专利号5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等人,1989,Biol.Chem.264:14653-14661，其中每个文献的公开内容均通过引用全文并入本文，因为其涉及适合于共价缀合的接头。此类接头在中性pH条件下，例如在血液中的条件下不会裂解，但在低于pH 5.5或5.0(接近溶酶体的pH)下是可裂解的或经历自裂解。
本发明的可酶促裂解部分也可称为“可被酶裂解”。接头的酶裂解导致细胞内释放缀合至本文所公开的靶向部分或抗体的毒素部分或其内化后的代谢产物(参见Dubowchik等人,Bioconjug Chem.13(2002)855-69)。
所述可裂解接头可选自：可酶促裂解接头(优选可蛋白酶裂解接头)和可化学裂解接头(优选包含二硫桥的接头)。
根据本发明的优选实施方案，裂解位点是包含两个或更多个氨基酸的可酶促裂解部分。优选地，所述可酶促裂解部分包含缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)、缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、缬氨酸-赖氨酸(Val-Lys)、缬氨酸-精氨酸(Val-Arg)二肽、苯丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸(Phe Lys Gly Pro Leu Gly)或丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸(Ala Ala Pro Val)肽、或β-葡糖苷酸或β-半乳糖苷。
根据一些实施方案，所述裂解位点可被选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶的至少一种蛋白酶裂解。
半胱氨酸蛋白酶，也称为硫醇蛋白酶，是具有共同催化机制的蛋白酶，该催化机制涉及催化性三联体或二联体中的亲核性半胱氨酸硫醇。
金属蛋白酶是催化机制涉及金属的蛋白酶。大多数金属蛋白酶需要锌，但也有一些使用钴。金属离子通过三个配体与蛋白质配位。与金属离子配位的配体可随组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸而变化。第四个配位位置由不稳定的水分子占据。
丝氨酸蛋白酶是裂解蛋白质中的肽键的酶；丝氨酸在酶的活性位点处充当亲核性氨基酸。丝氨酸蛋白酶根据其结构分为两大类：糜蛋白酶样(胰蛋白酶样)或枯草杆菌蛋白酶样。
苏氨酸蛋白酶是在活性位点内携带苏氨酸(Thr)残基的蛋白水解酶家族。这类酶的原型成员是蛋白酶体的催化亚单元，然而，酰基转移酶趋同进化出相同的活性位点几何结构和机理。
天冬氨酸蛋白酶是一种蛋白酶催化类型，其使用与一个或多个天冬氨酸残基结合的活化水分子来催化其肽底物。通常，它们在活性位点中具有两个高度保守的天冬氨酸，并且在酸性pH下具有最佳活性。胃蛋白酶抑制剂抑制几乎所有已知的天冬氨酰蛋白酶。
在本发明的具体实施方案中，可裂解位点可被选自以下的至少一种物质裂解：组织蛋白酶A或B、基质金属蛋白酶(MMP)、弹性蛋白酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-半乳糖苷酶，优选组织蛋白酶B。
在特别优选的实施方案中，本发明的可酶促裂解接头包含选自Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Val-Ala、Phe-Cit和Val-Cit的二肽，特别地，其中该可裂解接头还包含所述二肽与鹅膏毒素之间的对-氨基苄基(PAB)间隔基：
因此，本文所公开的本发明的缀合物可包含可酶促裂解接头，其包含上文所公开的二肽-PAB部分Phe-Lys-PAB、Val-LysPAB、Phe-Ala-PAB、Val-Ala-PAB、Phe-Cit-PAB或Val-Cit-PAB中的任何一种。优选地，本发明的缀合物的可裂解接头包含二肽-PAB部分Val-Ala-PAB
其中，该PAB部分与所述鹅膏毒素连接。
根据一些实施方案，上文所公开的本发明的接头包括硫醇反应性基团，其选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、甲基磺酰基苯并噻唑，4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基基团、甲基磺酰基苯基四唑或甲基磺酰基苯基噁二唑、吡啶-2-硫醇、5-硝基吡啶-2-硫醇、甲烷硫代磺酸酯或马来酰亚胺。
根据优选实施方案，该硫醇反应性基团是如下所示的马来酰亚胺(马来酰亚胺基部分)：
根据特别优选的实施方案，本发明的接头包含以下结构：
在本发明的特定实施方案中，裂解位点是二硫键，并且特异性裂解通过还原性环境，例如细胞内还原性环境(例如酸性pH条件)进行。
根据本发明的优选实施方案，在所述缀合物中，所述接头(如果存在)或所述靶结合部分经由(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC原子、或(ii)鹅膏毒素氨基酸3的δC原子或(iii)鹅膏毒素氨基酸4的6’-C原子连接至所述鹅膏毒素。
在本发明的优选实施方案中，所述缀合物包含鹅膏毒素，所述鹅膏毒素含有(i)具有6’-脱氧位置的氨基酸4和(ii)具有S-脱氧位置的氨基酸8。
根据本发明的特别优选的实施方案，所述缀合物分别包含以下式(I)至(XI)的化合物中的任一项作为接头-鹅膏毒素部分：
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此外，根据本发明的特别优选的实施方案，所述缀合物包含作为靶结合部分的抗体，所述抗体与根据式(XII)至(XXII)中任一项的至少一个鹅膏毒素-接头部分缀合：
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其中所述鹅膏毒素-接头部分经由硫醚与抗体的半胱氨酸残基的硫醇基团偶联，并且其中n优选为1至7，例如1、2、3、4、5、6或7，优选地其中n为1、2或4，其中n表示与所述抗体连接的鹅膏毒素-接头部分的数目。将包含反应性马来酰亚胺基残基的相应的鹅膏毒素-接头部分与抗体的半胱氨酸残基的巯基缀合可以例如根据Juntula等人，NatBiotechnol.2008Aug；26(8):925-32中所描述的方法进行。
根据本发明的最特别优选的实施方案，所述缀合物选自：
(i)缀合物(XXIII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链由根据SEQ ID No.11的氨基酸序列组成或包含根据SEQID No.11的氨基酸序列，每条轻链由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成或包含根据SEQID No.12的氨基酸序列，
(ii)缀合物(XXIV)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XIII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(iii)缀合物(XXV)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XIV)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(iv)缀合物(XXVI)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XV)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ IDNo.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(v)缀合物(XXVII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XVI)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(vi)缀合物(XXVIII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XVII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(vii)缀合物(XXIX)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XVIII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(viii)缀合物(XXX)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XIX)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(ix)缀合物(XXXI)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XX)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ IDNo.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(x)缀合物(XXXII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XXI)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(xi)缀合物(XXXIII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XXII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
其中，对于缀合物(XXIII)至(XXXIII)，n为1至2。例如，缀合物(XXIII)至(XXXIII)可包含一个(n＝1)或两个(n＝2)本文所公开的鹅膏毒素-接头部分(XII)至(XXII)中的任何一种，所述鹅膏毒素-接头部分经由硫醚键与重链265Cys残基的巯基基团连接。因此，上文公开的本发明缀合物可具有的药物/抗体比(DAR)对于n＝1为DAR＝1，或对于n＝2为DAR＝2。
根据一个实施方案，本发明提供了一种用于制备抗体-药物缀合物的抗体，其中该抗体包含两条重链，每条重链由与SEQ ID NO:7相对应或与SEQ ID NO:7至少90％、95％相似的氨基酸序列组成或包含与SEQ ID NO:7相对应或与SEQ ID NO:7至少90％、95％相似的氨基酸序列，该抗体还包含两条轻链，每条轻链由与SEQ ID NO:8相对应或与SEQ ID NO:8至少90％、95％相似的氨基酸序列组成或包含与SEQ ID NO:8相对应或与SEQ ID NO:8至少90％、95％相似的氨基酸序列。
根据优选实施方案，用于制备如上所公开的本发明的抗体-药物缀合物的抗体包含两条重链和两条轻链，每条重链由优选根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列、更优选根据SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成或包含优选根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列、更优选根据SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列，每条轻链由根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成或包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
本发明抗体在制备抗体-药物缀合物(例如本文所公开的那些)中的用途特别有利于实现接头-毒素缀合物(例如本文所公开的接头-鹅膏毒素缀合物)经由与抗体的Cys265的马来酰亚胺-巯基键的位点特异性缀合，从而以高产率和高纯度获得位点特异性抗体-药物缀合物。此外，氨基酸取代L234A、L235A降低了本发明的抗体与FcγRI、II、II的结合，从而降低了所述抗体的效应物功能，所述功能是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，以及补体依赖性细胞毒性(CDC)。所得到的缀合物(例如具有可控的约DAR＝1或约DAR＝2且效应物功能降低的缀合物)的更高纯度和/或均匀性导致本发明的抗体-药物缀合物的更高的治疗指数(TI)。本文所用的术语“治疗指数”是指50％的个体表现出药物毒性作用的毒性剂量与50％的个体显示出治疗效果的药物最小浓度或量之间的比率。例如，TI也可以表示为TI＝TD50:ED50，并且是药物相对安全性的定量量度。这是对引起治疗效果的治疗剂的量与引起毒性的量之间的比较。因此，TI越大，对应于给定药物的相对安全性增加。
根据另一个方面，本发明提供了包含如上所述的缀合物的药物组合物。
所述药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的缓冲剂、表面活性剂、稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
以水性形式，所述药物制剂可即时施用，而以冻干形式，所述制剂可以在施用前转变成液体形式，例如通过添加注射用水，该注射用水可包含或不含防腐剂(例如但不限于苄醇)、抗氧化剂(例如维生素A、维生素E、维生素C、棕榈酸视黄醇酯和硒)、氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)、柠檬酸和柠檬酸钠、合成防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯，即对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)。
所述药物制剂还可包含一种或多种稳定剂，其可以是例如氨基酸、糖多元醇、二糖和/或多糖。所述药物制剂还可包含一种或多种表面活性剂、一种或多种等渗剂和/或一种或多种金属离子螯合剂，以及/或一种或多种防腐剂。
本文所述的药物制剂可适用于至少静脉内、肌肉内或皮下施用。或者，根据本发明的所述缀合物可以以允许生物活性物质在一定时间段内持续释放的储库制剂提供。
在本发明的另一个方面，提供了一种初级包装，例如预充式注射器或注射笔、小瓶或输液袋，其包含根据本发明前述方面所述的制剂。
所述预充式注射器或注射笔可包含冻干形式(其之后必须溶解，例如在施用前用注射用水溶解)或水性形式的制剂。所述注射器或注射笔经常是仅供单次使用的一次性制品，并且容积可以是0.1至20ml。然而，该注射器或注射笔也可以是多次使用或多剂量的注射器或注射笔。
所述小瓶也可包含冻干形式或水性形式的制剂，并且可用作单次或多次使用装置。作为多次使用装置，所述小瓶可具有更大的容积。
本文所公开的本发明的药物组合物可以例如提供为通过输液袋施用。输液袋通常含有水性形式的制剂，并且容积可以在20ml、50ml、75ml、100ml至125ml、250ml、300ml、500ml、750ml、1000ml、2500ml、5000ml之间，或在125ml、250ml至500ml、600ml、750ml之间。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及本文所公开的所述缀合物或药物组合物，其用于治疗B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病，特别是用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(DBNHL)、包括套细胞淋巴瘤(MCL)的非霍奇金淋巴瘤亚型、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、里希特综合征、原发性皮肤边缘区淋巴瘤(PCMZL)、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、急性髓性白血病(AML)、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎，以及寻常型天疱疮。
根据一个实施方案，本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的特征在于染色体17p13.1的缺失，其中该缺失是半合子的或纯合的(两个等位基因无效(nullizygous))。
因此，使用本文所公开的本发明缀合物或药物组合物治疗的本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的B细胞的特征在于染色体17p13.1的缺失，其中该缺失是半合子的或纯合的。本文中所用的术语“缺失”是指染色体17p13.1的整个基因组基因座的缺失，或指包含TP53基因和POLR2A基因的至少1、2、3、4、5、6、7Mb的缺失。所述B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病可能例如携带额外的细胞遗传学异常，例如易位，例如t(11；14)、t(4；14)、t(14；16)或t(14；20)易位。
例如，多发性骨髓瘤的标准护理治疗方案可包括例如Rajkumar和Kumar BloodCancer Journal(2020)10:94中所描述的那些。
根据一个实施方案，可例如使用本文所公开的本发明缀合物或药物组合物治疗的本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的B细胞的特征在于POLR2A基因的半合子缺失或TP53和POLR2A基因的半合子缺失。根据本发明使用的术语“半合子的”是指个体或细胞只有一个完整的等位基因或染色体片段，而不是通常的两个。半合子是指细胞或生物体，其基因组在给定基因座中仅包含一个完整等位基因，无论该等位基因是野生型还是突变型，例如，本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的细胞是染色体基因座17p13的半合子缺失，优选地，上述B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的细胞是基因TP53和POLR2A的半合子缺失。本文所用的“TP53”是指编码肿瘤抑制蛋白(P53)的“肿瘤蛋白53”基因，该蛋白包含转录激活结构域、DNA结合结构域和寡聚化结构域。所编码的蛋白质对不同的细胞应激作出反应，以调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢变化。该基因的突变与多种人类癌症有关，包括遗传性癌症，例如Li-Fraumeni综合征。
在大多数人类肿瘤中，肿瘤抑制基因TP53经常通过突变或缺失而失活。本文所用的“POLR2A”是指POLR2A基因，其编码人RNA聚合酶II复合物的最大亚基，并且对mRNA合成中的聚合酶活性是必不可少的。染色体17p13的半合子缺失，例如del(17p13.1)可以通过以下文献中所公开的荧光原位杂交(FISH)进行检测：Merz等人，Am J Hematol.2016Nov；91(11):E473-E477。
如上所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的细胞可能例如不是TP53和/或POLR2A缺失的同质细胞群。例如，约5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％至约70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，或约70％、75％、80％、85％至约90％、92.5％、95％、97.5％、100％的如上所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的细胞可以是del(17p13.1)、TP53和/或POLR2A的半合子缺失，或例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％的本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的细胞是del(17p13)的半合子缺失或TP53和/或POLR2A的半合子缺失。用于治疗特征为染色体17p13.1的半合子缺失或TP53和/或POLR2A的半合子缺失的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤的本发明缀合物或药物组合物是特别有利的，因为以染色体17p13.1、TP53和/或POLR2A的半合子缺失为特征的细胞对本文所公开的本发明缀合物或药物组合物的敏感度高至少10倍、25倍、50倍、100倍、250倍、500倍、1000倍。因此，例如确定本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病是否包含TP53和/或POLR2A半合子缺失的细胞或由TP53和/或POLR2A半合子缺失的细胞组成可能是有益的，因为可以使用减少至少10倍、25倍、50倍、100倍、250倍、500倍或1000倍的本文所公开的本发明缀合物或药物组合物来实现期望的治疗效果。评估对本文所公开的本发明缀合物或药物组合物的敏感度的测定法可以例如Nature.2015April 30；520(7549):697-701所述的那样进行。
根据本发明的一个方面，本文所公开的缀合物或药物组合物与免疫检查点抑制剂联合用于治疗如上所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病。在本发明的上下文中，术语“免疫检查点抑制剂”或简称“检查点抑制剂”或“ICI”是指直接或间接降低免疫细胞(例如T细胞)表面上发现的免疫检查点受体蛋白或分子的水平或抑制其功能的任何物质或化合物，或是指直接或间接降低与所述免疫检查点受体蛋白或分子结合的配体的水平或抑制其功能的任何物质或化合物，所述配体为可溶性化合物或位于免疫细胞抑制细胞的表面上。所述抑制细胞可以是，例如癌症细胞、调节性T细胞、致耐受性的抗原呈递细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关的巨噬细胞或癌症相关的成纤维细胞。所述配体通常能够结合免疫细胞上的免疫检查点受体蛋白或分子。免疫检查点受体蛋白-配体对的非限制性实例是PD-1、PD-L1。PD-1是一种在T细胞上发现的免疫检查点受体蛋白。PD-L1(其可被癌细胞过表达)与PD-1结合，帮助癌症细胞逃避宿主免疫系统的攻击。因此，免疫检查点抑制剂通过阻断T细胞上的PD-1(即，充当PD-I抑制剂)或阻断癌细胞上的PD-L1(即，充当PD-L1抑制剂)来防止PD-1/PD-L1相互作用，从而维持或恢复抗肿瘤的T细胞的活性，或阻断抑制性癌细胞的活性。
免疫检查点受体或分子包括但不限于，例如，PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、VISTA、OX40、GITR、ICOS、CD276(B7-H3)、B7-H4(VTCN1)、IDO、KIR、CD122、CD137、CD94/NKG2A、CD80、CD86、半乳糖凝集素(Galectin-3)、LSECtin、CD112、Ceacam-1、Gal-9、PtdSer、HMGB1、HVEM、CD155和BTLA(CD272)。
免疫检查点抑制剂包括免疫抑制性受体的拮抗剂，例如上文所公开的那些，例如PD-1，在这种情况下，其抑制PD-1/PD-L1通路中的PD-1或PD-L1。PD-1或PD-L1抑制剂的实例包括但不限于拮抗或阻断人PD-1功能的人源化抗体或人抗体，例如帕博利珠单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、JTX-4014、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、信迪利单抗(sintilimab)(IBI308)、多塔利单抗(dostarlimab)(TSR-042、WBP-285)、INCMGA00012(MGA012)、AMP-224、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、BCD-100、AGEN-2034、特瑞普利单抗(Toripalimab)(TAB001、JS001)或AMP-514(MEDI0680)；以及完全的人抗体，例如阻断PD-1的纳武利尤单抗(nivolumab)，或阻断PD-L1的例如阿维鲁单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、柯希利单抗(Cosibelimab)(CK-301)、WBP-3155(CS1001)和阿替利珠单抗(atezolizumab)，或重组抗PD-L1抗体CX-072。
帕博利珠单抗(以前也称为lambrolizumab；商品名为可瑞达(Keytruda)；也称为MK-3475)在例如Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine369(2):134-44中公开，是一种结合PD-1的人源化IgG4单克隆抗体；它在C228P处含有一个突变，该突变设计用于防止Fc介导的细胞毒性。帕博利珠单抗在例如US 8,354,509和WO2009/114335中进行了公开。它被FDA批准用于治疗不可切除的或转移性黑色素瘤患者和转移性NSCLC患者。
纳武利尤单抗(CAS注册号：946414-94-4；BMS-936558或MDX1106b)是一种完全的人IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PD-1，没有可检测的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。纳武利尤单抗例如在US 8,008,449和WO2006/121168中进行了公开。它已被FDA批准用于治疗不可切除的或转移性黑色素瘤、转移性NSCLC和晚期肾细胞癌患者。
匹地利珠单抗(CT-011；Cure Tech)是一种结合PD-1的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗例如在WO2009/101611中进行了公开。
PD1-1至PD1-5是指WO2018/220169中所公开的抗PD-1抗体。
本文中所用的INN还包括本文所公开的相应原始抗体的所有生物类似抗体，包括但不限于根据美国法典第42卷第262节第(k)小节和其他司法管辖区的同等法规授权的生物类似抗体。
根据本发明与本文所公开的本发明缀合物或药物组合物联合使用的免疫检查点抑制剂例如也可以是小分子(有机)化合物或大分子，例如肽或核酸。例如，根据本发明的小分子免疫检查点抑制剂包括CA-170，包括如WO15033301 A1中所公开的其前体AUNP-12；或例如BMS-8(CAS号1675201-90-7)。在本发明的至少一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是一种抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物。在优选实施方案中，该免疫检查点抑制剂是一种单克隆抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物。
在本发明的一些实施方案中，用于治疗本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的本发明缀合物或药物组合物可以与本文所公开的两种免疫检查点抑制剂联合使用，或包含两种免疫检查点抑制剂。例如，优选将本文所公开的缀合物或药物组合物与靶向不同免疫检查点的两种或更多种免疫检查点抑制剂联合使用，或包含靶向不同免疫检查点的两种或更多种免疫检查点抑制剂，所述的不同免疫检查点为例如CTLA-4和PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L1和TIGIT、PD-1/PD-L1和OX40、PD-1/PD-L1和VISTA、CTLA4和TIGIT、CTLA4和OX40。因此，本发明缀合物或药物组合物可以例如与下列免疫检查点抑制剂组合中的一个组合联合使用或包含下列免疫检查点抑制剂组合中的一个组合：
CTLA4和PD-1/PD-L1：
伊匹木单抗(Ipilimumab)与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合
PD-1/PD-L1和TIGIT：
替瑞利尤单抗(Tiragolumab)与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合，或BMS986207与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合。
PD-1/PD-L1和OX40：
BMS986178与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合
PD-1/PD-L1和VISTA：
CI-8993与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合OX40和PD-1/PD-L1：
MEDI0562与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合，或PF04518600与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合
TIM-3和PD-1/PD-L1：
MBG453与纳武利尤单抗、阿维鲁单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗中的一个联合
CTLA4和TIGIT：
伊匹木单抗与替瑞利尤单抗或BMS986207中的一个联合
CTLA4和OX40：
伊匹木单抗与MEDI0562或PF04518600联合
如果本发明缀合物或药物组合物仅与一种免疫检查点抑制剂联合或仅包含一种免疫检测点抑制剂，则选自上述PD-1、PD-L1和CTLA4抑制剂的检查点抑制剂是优选的免疫检查点抑制剂。因此，在一个实施方案中，本文所公开的本发明的缀合物优选与帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、西米普利单抗、JTX-4014、斯巴达珠单抗、信迪利单抗(IBI308)、多塔利单抗(TSR-042、WBP-285)、INCMGA00012(MGA012)、AMP-224、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、BCD-100、AGEN-2034、特瑞普利单抗(TAB001、JS001)或AMP-514(MEDI0680)、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、柯希利单抗(CK-301)、WBP-3155(CS1001)和阿替利珠单抗、CX-072、伊匹木单抗中的一种联合，用于治疗本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病。
根据一个实施方案，本发明的药物组合物优选与帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、西米普利单抗、JTX-4014、斯巴达珠单抗、信迪利单抗(IBI308)、多塔利单抗(TSR-042、WBP-285)、INCMGA00012(MGA012)、AMP-224、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5、BCD-100、AGEN-2034、特瑞普利单抗(TAB001、JS001)或AMP-514(MEDI0680)、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、柯希利单抗(CK-301)、WBP-3155(CS1001)和阿替利珠单抗、CX-072、伊匹木单抗中的一种联合，用于治疗本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病。
根据一个实施方案，本文所公开的本发明药物组合物与帕博利珠单抗联合，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(primarymediastinal B-cell lymphoma)、经典型霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
根据一个实施方案，本文所公开的本发明药物组合物与纳武利尤单抗联合，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤。
根据一个实施方案，本文所公开的本发明药物组合物与伊匹木单抗联合，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
根据一个实施方案，本文所公开的本发明药物组合物与伊匹木单抗和纳武利尤单抗联合，用于治疗经典型霍奇金淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
根据一个实施方案，本文所公开的本发明药物组合物与阿替利珠单抗联合，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤。
根据一个实施方案，本文所公开的本发明药物组合物与阿维鲁单抗联合，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤。
根据一个实施方案，本文所公开的本发明药物组合物与度伐利尤单抗联合，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗本文所公开的患者的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的本文所公开的本发明药物组合物，任选地包括施用本文所公开的免疫检查点抑制剂，其中该患者已经用治疗方案R-CHOP、CHOP、Hyper-CVAD或CVD中的一种进行了在先的标准护理疗法。
例如，标准护理疗法可包括用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的标准方案R-CHOP(利妥昔单抗+环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)。套细胞淋巴瘤的标准护理疗法可例如包括：1)“Hyper-CVAD”治疗方案，包括环磷酰胺、长春新碱、多柔比星(阿霉素(Adriamycin))和地塞米松，与高剂量甲氨蝶呤+阿糖胞苷(cytarabine)交替，或2)“剂量强化型”R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)，与利妥昔单抗和阿糖胞苷交替，或3)RDHAP(利妥昔单抗、地塞米松、阿糖胞苷、顺铂)。用于治疗滤泡性淋巴瘤(FC)的标准护理可例如包括使用利妥昔单抗或奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)与CHOP方案(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)或CVP方案(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)方案联合治疗。
非霍奇金淋巴瘤的标准护理疗法可例如包括仅用利妥昔单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法妥木单抗(ofatumumab)或替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)进行治疗，或将其与根据CHOP治疗方案(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)或CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)的化疗联合治疗。
与本文所公开的治疗选项一起使用的术语“联合”或“组合”及其任何语法等价物是指本文所公开的本发明药物组合物与本文所公开的免疫检查点抑制剂先后施用或相伴施用。例如，可以先施用本文所公开的本发明药物组合物，随后再施用本文所公开的免疫检查点抑制剂，或者先施用本文所公开的免疫检查点抑制剂，然后再施用本发明药物组合物。本发明药物组合物和本文所公开的免疫检查点抑制剂的先后施用是指所述药物组合物和所述免疫检查点抑制剂的施用时间彼此间隔15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时的施用方案，无论这两种药物中的哪一种先施用，所述药物组合物和所述免疫检查点抑制剂也可以例如在同一治疗方案或治疗周期内施用。相伴施用是指本文所公开的本发明药物组合物和免疫检查点抑制剂两者同时施用，或彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟内施用的施用方案。所有上述施用方案都被认为是本发明的“组合”。
本发明涉及上文描述的所述缀合物或药物组合物在制备用于治疗B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的药物中的用途，特别是用于治疗以下疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(DBNHL)、包括套细胞淋巴瘤(MCL)的非霍奇金淋巴瘤亚型、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、里希特综合征、原发性皮肤边缘区淋巴瘤(PCMZL)、多毛细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎，以及寻常型天疱疮。
根据一个实施方案，如上所公开的本发明缀合物或本发明药物组合物可用于治疗里希特综合征。里希特综合征被定义为慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤转变为侵袭性淋巴瘤，最常见的是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。里希特综合征发生在约2％-10％的CLL患者中，具有高度侵袭性，通常难以治疗，治疗结果不佳，在诊断后生存期约为8至14个月。大约80％的病例与潜在的CLL在克隆上相关，而其余20％患者具有与克隆无关的DLBCL，预后更好，与新生的DLBCL相似(Vaisitti等人，2018)。CLL B细胞的种系遗传特征、临床特征、生物学和体细胞遗传特征与某些CLL疗法的组合与里希特综合征的高风险相关。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所公开的用于治疗患者的里希特综合征的本发明的药物组合物，任选地包括施用本文所公开的免疫检查点抑制剂。例如，本文所公开的本发明药物组合物可以任选地与本文所公开的已被用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的免疫检查点抑制剂(例如伊匹木单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗或纳武利尤单抗)联合。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗患者的里希特综合征的本文所公开的本发明药物组合物，任选地包括施用本文所公开的免疫检查点抑制剂，其中，该患者已经使用下述治疗方案之一进行了在先的标准护理疗法：R-CHOP，Hyper CVXD，以下的组合：利妥昔单抗和GM-CSF，与hyper CVXD和MTX/阿糖胞苷交替；或OFAR，或使用例如90Y、替伊莫单抗的放射免疫疗法。本文所用的“HyperCVXD”是指包括分次施用环磷酰胺、长春新碱、柔红霉素脂质体(liposomal daunorubicin)和地塞米松的治疗方案。“OFAR”是指包括施用奥沙利铂、氟达拉滨、阿糖胞苷和利妥昔单抗的治疗方案(例如Tsimberidou等人，JClinOncol.2008Jan 10；26(2):196-203所公开的)。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗本文所公开的患者的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的本文所公开的本发明药物组合物，任选地包括施用本文所公开的免疫检查点抑制剂，其中所述B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的B细胞在其细胞表面上表达少于130000个CD37表位，或在其细胞表面上表达约32500、35000、40000、45000、50000、60000、75000、100000至约11000、120000、125000、130000，或约11000、120000、125000至约130000个CD37表位。例如，CD37的细胞表面表达可以根据E Cabral Filho等人，Int J Nanomedicine.2015；10:4393-4404中公开的方法或如本文中所公开的使用QuantumTM MESF试剂盒进行。
在一个实施方案中，本发明还涉及一种治疗患有本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的患者的方法，其中，该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的所述缀合物或药物组合物。
在一个实施方案中，治疗患有本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的患者的本发明方法还包括：向患者施用治疗有效量的本文所述的所述缀合物或药物组合物与一种或多种本文所公开的免疫检查点抑制剂的联合。本发明缀合物或药物组合物与本文所公开的一种或多种免疫检查点抑制剂可以先后施用，或相伴施用。例如，可以先施用本文所述的缀合物或药物组合物，然后再施用所述一种或多种检查点抑制剂，或者可以先施用所述一种或多种检查点抑制剂，然后施用本文所述的缀合物或药物组合物。根据向所述患者施用的在治疗方法中使用的一种或多种免疫检查点抑制剂，如果所述一种或多种检查点抑制剂按顺序施用，则可能是有利的。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗患有本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的患者的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的所述缀合物或药物组合物，以及任选的本文所公开的一种或多种免疫检查点抑制剂，其中该患者已经经历过在先的包括R-CHOP、CHOP、Hyper-CVAD或CVD治疗方案其中之一的标准护理疗法。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗本文所公开的患有B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的患者的方法，其中该方法包括：
-(步骤1)通过方法A)制备根据式(II)、(III)、(IX)、(X)、(XI)中任一个的缀合物，或通过方法B)制备根据式(I)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(XIII)中任一个的缀合物，其中方法A和方法B包括以下方法步骤：
该方法使用WO 2018/115466 A1中所公开的偶联剂2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一种，或
其中a1)、a2)、b1)、B2)和b3)是指
a1)接头溴化物、1M NaOH、DMSO；a2)100℃，DMSO
a1)-a2)公开于WO 2016/142049 A1的实施例2中
b1)接头溴化物、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、0.2M碳酸铯水溶液；b2)1.)TFA、2.)氨水；b3)3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯、DIPEA、DMF，b1)-b3)如WO 2019/030173 A1中所述。
-(步骤2)将根据式(II)、(III)、(IX)、(X)、(XI)、(I)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(XIII)中任一个的化合物与本发明所述的靶结合部分缀合，所述靶结合部分特异性结合由B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病表达的人CD37，其中如WO2016/142049A1中所公开的进行偶联，
-(步骤3)向患有本文所公开的B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的患者施用包含步骤2中获得的缀合物的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗患有里希特综合征的患者的方法，其中该方法包括向所述患者施用治疗有效量的上文所公开的本发明缀合物或药物组合物，其中该缀合物或药物组合物可以例如作为单一疗法施用，或与上文所公开的免疫检查点抑制剂联合施用。
根据一个实施方案，本发明涉及多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15的多核苷酸。
根据一个实施方案，本发明涉及宿主细胞，其包含编码至少一个根据SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一种多核苷酸。本文所用的术语“宿主”细胞是指包含本发明的多核苷酸的原核或真核细胞，其中该多核苷酸可以是表达载体。优选本发明的宿主细胞是真核细胞，例如酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、昆虫细胞(例如Sf9、Sf21、S2、Hi5或BTI-TN-5B1-4)，更优选地，本发明的宿主细胞是选自以下的哺乳动物细胞：HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK 293F、NS0、per.C6、MCF-7、HeLa、Cos-1、Cos-7、PC-12、3T3、Vero、vero-76、PC3、U87、SAOS-2、LNCAP、DU145、A431、A549、B35、H1299、HUVEC、Jurkat、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、Caco-2、CHO、CHO-K1、CHO-B11、CHO-DG44、BHK、AGE1.HN、Namalwa、WI-38、MRC-5、HepG2、L-929、RAB-9、SIRC、RK13、11B11、1D3、2.4G2、A-10、B-35、C-6、F4/80、IEC-18、L2、MH1C1、NRK、NRK-49F、NRK-52E、RMC、CV-1、BT、MDBK、CPAE、MDCK.1、MDCK.2和D-17。
序列
表1:本发明的氨基酸序列和DNA序列
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实施例
尽管已经在附图和前面的描述中详细说明和描述了本发明，但是这样的说明和描述应被认为是说明性或示例性的，而非限制性的；本发明并不限于所公开的实施方案。通过研究附图、公开内容和所附权利要求书，本领域技术人员在实施所要求保护的本发明时可以理解和实现所公开的实施方案的其他变通方案。在权利要求书中，“包含/包括”一词不排除其他元件或步骤，并且“一种”或“一个”不排除多个。在互不相同的从属权利要求中记载某些措施的唯一事实并不表示不能有利地使用这些措施的组合。权利要求中的任何参考标志都不应被解释为限制本发明的范围。
本文所公开的所有氨基酸序列均显示为从N末端到C末端；本文所公开的所有核酸序列均显示为5’—>3’。
实施例1：鹅膏毒素-抗体缀合物的合成和鉴定
实施例1.1：CD37特异性抗体的表达
在CHO细胞中表达实施例中使用的CD37特异性单克隆抗体(chHH1-HDP、chHH1-HDP-D265C和chHH1-HDP-LALA-D265C)，并通过蛋白A色谱法进行纯化。获得的产量约为58mg/L。经测定，该制备物含有93.90％的抗体单体和仅1.54％至1.88％的高分子量聚集体。
还在HEK293细胞中表达实施例中使用的CD37特异性单克隆抗体(chHH1-HDP、chHH1-HDP-D265C和chHH1-HDP-LALA-D265C)，并通过蛋白A色谱法和尺寸排阻色谱法(SEC)进行纯化。获得的产量约为50mg/L。经测定，该制备物含有95.26％的抗体单体和仅2.38％的高分子量聚集体。
实施例1.2：鹅膏毒素-接头构建体的合成
实施例1.3：抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物的合成
采用所谓的Thiomab技术将抗体缀合至鹅膏毒素-接头缀合物上。在这种方法中，通过将该毒素-接头构建体的马来酰亚胺残基与该抗体中的半胱氨酸残基的游离SH基团偶联来进行缀合，如以下反应方案所示：
Junutula等人(2008)公开了这种缀合方法的原理，其内容通过引用并入本文。
本实验中使用的抗体在两个Fc结构域中都包含D265C取代，以得到具有游离SH基团的半胱氨酸残基。WO2016/142049A1中公开了相应的技术，其内容通过引用并入本文，并且其产生了具有约为2的固定的药物-抗体比(“DAR”)和位点特异性缀合的匀质产物。
实施例2：CD37特异性抗体chHH1-HDP与淋巴瘤细胞系的结合
实施例2.1：细胞计数法结合测定
通过荧光激活细胞分选(FACS)分析，测试抗CD37单克隆抗体chHH1-HDP-LALA-D265C与CD37阳性的B细胞白血病(B-CLL)细胞系MEC-1和MEC-2以及与人伯基特淋巴瘤细胞系Raji和Ramos以及与CD37阴性的人B细胞前体白血病(B-cell precursor leukemia)细胞系Nalm-6的结合。抗体chHH1-HDP-LALA-D265C显示出与CD37阳性的MEC-1、MEC-2、Raji和Ramos细胞系的强结合(图3)。用Nalm-6细胞未检测到结合。
为了通过流式细胞术估计每个细胞结合的抗体(ABC)，使用BD Quantibrite PE管(Becton Dickinson)，在与该测定相同的仪器设置下运行，使得FL2轴可以转换为每个细胞结合的PE分子的数量。通过使用已知的PE与抗体的比率，每个细胞的PE分子可以转化为每个细胞的抗体数量(Iyer等人，1997)。结果显示于表2中。
表2:通过流式细胞术评估每个细胞结合的抗CD37抗体分子
实施例2.2：Biacore结合测定
通过表面等离子体共振(Biacore)相互作用分析，确认单克隆抗体chHH1-HDP-LALA-D265C与CD37的结合。使用抗Fab捕获(FAB2G)生物传感器捕获0.1μM chHH1-HDP-LALA-D265C。或者，用抗生蛋白链菌素(SA)传感器捕获生物素化的单克隆抗体chHH1-HDP-LALA-D265C。将在具有Fc融合标签部分(Thr 106至Lys 330)的HEK293细胞中表达的包含氨基酸Ala 113至Asn 240的CD37构建体以31.25nM至500nM的浓度(1:2稀释步骤)添加到传感器中，并评估CD37构建物的结合。
或者，使用在昆虫细胞中表达的包含氨基酸1-281的CD37构建体来确认单克隆抗体chHH1-HDP-LALA-D265C与CD37的结合。
实施例3：抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物的体外细胞毒性
在CD37阳性的MEC-1细胞和CD37阳性的MEC-2细胞(B慢性淋巴细胞白血病)；CD37阳性的Raji-Luc、Raji和Ramos细胞(伯基特淋巴瘤)；以及CD37阴性的Nalm-6细胞(B细胞前体白血病)上分别使用不同的抗CD37抗体靶向的鹅膏毒素缀合物孵育96小时后，以CTG测定法或WST-1测定法中进行体外细胞毒性研究。结果如下面的图所示：图4A(MEC-1细胞)；图4B-G(MEC-2细胞)；图5A-D(Raji-Luc细胞)、图6A-E(Raji细胞)、图7A-D(Ramos细胞)。结果汇总在表3中。
细胞生存的定量测定是通过使用CTG(CellTiter Glo 2.0)测定法(Promega)进行的，这是一种基于所存在的ATP的定量来测定培养物中活细胞数量的均相方法(homogeneous method)，ATP的存在标志着代谢活性细胞的存在。通过使用该测定法，产生了由荧光素酶反应产生的“辉光型”发光信号，该信号可被检测到。
在一些实验中，细胞生存的定量测定是通过使用市售的WST-1测定法(Roche)进行的。“细胞增殖测定试剂”WST-1设计用于使用多孔板模式通过分光光度法定量细胞群的细胞生存，并且是基于微红色四唑盐WST-1(4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基-苯基)-2H-5-四唑鎓]-1,3-苯磺酸盐)裂解为暗红色甲瓒(Formazan)。
所有测试的抗CD37 ATAC在CD37阳性细胞系上均显示出皮摩尔范围内的体外细胞毒性。观察到对CD37阴性细胞无细胞毒活性。
表3:体外细胞毒性实验结果汇总
实施例4：抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在小鼠模型中的体内细胞毒性
实施例4.1：抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在散布的MEC-2肿瘤异种移植模型中的 细胞毒性作用
使用各种抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在散布的MEC2肿瘤异种移植模型中治疗140天，进行体内细胞毒性效力研究。
研究概述：
在研究开始前3天通过在CB17 Scid小鼠中i.v.(静脉内)注射2.5x106个MEC-2细胞来完成肿瘤细胞接种。在第0天分别以最大耐受剂量(MTD)的1/8和1/16通过单剂量静脉注射进行治疗。这项研究的读数为体重和生存率。治疗后第138天的结果如图10(体重)和图11(生存率)所示。与对照组相反，所有缀合物治疗的组的体重均正常。
表4:在散布的MEC-2肿瘤异种移植模型中的细胞毒性效力研究的研究组；罗马数字指的是本文所公开的鹅膏毒素缀合物。
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治疗组在表4中定义。分析中排除了第10组(chHH1-HDP-LALA-D265C，p.o.(口服)，单剂量；10mg/kg)。第11组(伊布替尼)的治疗是使用伊布替尼，口服一周5次，持续3周，剂量为25mg/kg。
所用的缩写：“chHH1-HDP-LALA-D265C”是指包含重链和轻链的未缀合抗体，所述重链和轻链各自含有根据SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列。“chHH1-HDP-D265C”是指包含重链和轻链的未缀合的抗CD37抗体，所述重链和轻链各自含有根据SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列。抗体诸如chHH1-HDP-D265C的例如-(XII)形式的后缀是指本文所公开的连接至所述抗体的相应的鹅膏毒素-接头缀合物。
实施例4.2：抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在散布的Raji-Luc肿瘤异种移植模型中 的细胞毒性效力
使用各种抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在散布的Raji-Luc肿瘤异种移植模型中治疗89天，进行体内细胞毒性效力研究。
研究概述：
在研究开始前3天通过在CB17 Scid小鼠中静脉内注射2.5x106个Raji-Luc细胞来完成肿瘤细胞接种。在第0天分别以食蟹猴MTD最大耐受剂量(MTD)的1/16和1/64通过单剂量静脉内注射进行治疗。这项研究的读数是体重、生物发光和生存率。治疗后第89天的结果如图10(体重)、图11(生物发光)和图12(生存率)所示。与对照组相反，所有缀合物治疗的组的体重均正常。
治疗组如表5中定义。
表5:在散布的Raji-Luc肿瘤异种移植模型中进行细胞毒性效力研究的研究组。
总之，散布的小鼠异种移植肿瘤模型(MEC-2和Raji-Luc)和CD37阳性患者来源的异种移植物(PDX；里希特综合征)模型是在单剂量实验中进行的。
在小鼠异种移植模型中，在整个研究期间(>100天)，两种抗CD37 ATAC在MEC-2模型中采用1/16的MTD，在Raji-Luc模型中采用1/64的MTD，实现了80-100％的总生存率。低至0.1mg/kg剂量的单剂量疗法在治疗后第7天引起快速和完全的肿瘤消退。所测试的ATAC在小鼠体内的耐受性显示为>15mg/kg。
实施例5：抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在食蟹猴中的探索性毒性研究
使用不同的抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在食蟹猴中进行了探索性毒性研究。
每组分配三只猴子(体重3kg)。在CHO细胞中表达的抗CD37单克隆抗体用于与不同的鹅膏毒素-接头构建体缀合。三组的分配和剂量如下:
·缀合物XXIII：5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg
·缀合物XXIV：1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg
·缀合物XXV：1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg
关于丙氨酸转氨酶(ALT)评估、天冬氨酸转氨酶(AST)评估和乳酸脱氢酶(LDH)评估的结果如图13-15所示。
本研究中使用的抗体对动物(包括非人的灵长类动物(NHP))的CD37没有交叉反应。因此，将接头-鹅膏毒素衍生物缀合到非结合的抗DIG抗体上。这种抗DIG缀合物显示出良好的耐受性，表明在NHP中具有较低的脱靶毒性。除肝的转氨酶和LDH观察到轻度至中度且短暂的增加外，血液学和临床化学参数都不受影响。
总之，通过使用抗CD37抗体靶向的鹅膏毒素缀合物(ATAC)，实现了对CD37阳性细胞系的靶向细胞毒性药物递送。有效载荷鹅膏蕈碱的作用模式在体外和体内都导致有效的抗肿瘤潜力，在非人的灵长类动物中具有良好的耐受性。所显示的实验数据表明，使用ATAC治疗B细胞淋巴瘤和其他B细胞相关的恶性肿瘤，包括经历里希特氏转化(Richter’stransformation)的恶性肿瘤，是一种很有前景的方法。
实施例6：抗CD37抗体-鹅膏毒素缀合物在衍生自里希特综合征(RS)患者的异种移植(PDX)模型中的探索性毒性研究
研究概述：
衍生自里希特综合征患者的异种移植(PDX)模型是根据Cancer Res(2018)；78(13)；3413-20(修订)调整的。
简言之，将来自外周血或淋巴结的总共2×107个原发性里希特综合征细胞重悬于Matrigel(BD Biosciences)中，并皮下注射(双胁侧)到8周龄CB17 Scid小鼠免疫受损小鼠体内，放置使其增长。然后收集肿瘤块，部分破坏肿瘤块，并将肿瘤细胞作为单细胞悬浮液重新注入Matrigel中。重复这些步骤几次，以获得稳定的里希特综合征模型。
对于静脉内注射模型，将从肿瘤块中纯化的107个里希特综合征细胞重悬于PBS中，并注射到小鼠的尾静脉中。每组n＝4只小鼠在移植后15天进行治疗，如图16A所示。如图所示，给小鼠注射单剂量的缀合物XXIII、XXIV或XXVI。PBS对照组中的所有小鼠在移植后68天内死亡。接受静脉注射5mg/kg剂量的缀合物XXVI的组中，一只动物在移植后第90天死亡。结果表明，单剂量的缀合物XXIII、XXIV、XXVI的治疗在不同剂量下具有良好的耐受性，并且对治疗RS有效。
器官中残留的RS疾病活性的评估
为了评估移植动物的器官中残留的RS疾病活性，对小鼠实施安乐死，收集外周血和器官(肾、脾、骨髓、肺、肝和脑)，使用抗人抗体(CD45PerCPCy5.5/CD19APC/CD20FITC)通过流式细胞术评估疾病散播情况。结果如图16B所示，表明单剂量的本发明缀合物可以显著降低(在缀合物XXIV 5mg的情况下)或甚至消除移植动物的器官中的RS疾病活性。
实施例7：抗CD37抗体的交叉反应性评估
通过流式细胞术评估抗CD37的chHH1-HDP-LALA-D265C与食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)的交叉反应性。作为对照，使用同一类抗体对人PBMC进行染色。根据标准方案进行FACS分析。简而言之：将PBMC重悬于300μL染色培养基中(3.3x105个细胞/50μL染色培养基)。将每个样品的50μl细胞悬浮液(＝每个样品3.3x105个细胞)滴入U型孔板的一个孔中。将50μl预稀释的同种型溶液和抗体溶液添加到每个孔中的样品中，并在冰上孵育30分钟，然后添加100μl冰冷的PBS，并在4℃下以300g离心6分钟。丢弃所得的上清液，用200μl冰冷的PBS(pH 7.4)洗涤细胞，然后在4℃下以300g离心6分钟。重复一次洗涤步骤。丢弃上清液，将细胞重悬于100μl的二抗溶液中。对于未处理的样品(对照)，使用100μl染色培养基。将细胞在避光的冰上孵育30分钟。加入100μl冰冷的PBS，并将细胞在4℃下以300g离心6分钟。丢弃上清液，用200μl冰冷的PBS(pH 7.4)洗涤细胞两次，并在4℃下以300g离心6分钟。随后丢弃上清液，并将细胞重悬于200μl新鲜制备的固定液中。将细胞储存在4℃的固定液中，避光，直到使用FACSuite Software在BD FACSLyric设备中进行分析。结果如图17所示，表明chHH1-HDP-LALA-D265C没有表现出与食蟹猴CD37特异性结合。
所使用的抗体：
-抗人CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C，10.0mg/ml，储存于4℃，在染色培养基中稀释至100μg/ml(1μl抗体稀释液+99μl染色培养基)；
-小鼠抗人CD37(Novus Biologicals)，储存于-20℃，在染色培养基中(1μl抗体稀释液+99μl染色培养基)1:100稀释
-山羊抗人IgG(Fc)-AlexaFluor488 Fab：1.5mg/ml(Jackson Immuno；109-546-008)(储存：-70℃)
-山羊抗小鼠IgG(Fc)-AlexaFluor488 F(ab)2-片段：1.5mg/ml(invitrogen：A11001)
染色培养基：RPMI 1640、25mM HEPES、3％ FCS、0.02％叠氮化钠
固定液：2％多聚甲醛的PBS溶液
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Claims (28)

1.缀合物，其包含(i)靶结合部分、(ii)至少一种毒素以及(iii)任选的至少一个接头，所述接头连接所述靶结合部分与所述至少一种毒素，其中所述靶结合部分结合CD37，并且其中所述至少一种毒素是鹅膏毒素。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述靶结合部分选自：
(i)抗体，优选单克隆抗体，
(ii)其抗原结合片段，优选可变结构域(Fv)、Fab片段或F(ab)2片段，
(iii)其抗原结合衍生物，优选单链Fv(scFv)，以及
(iv)抗体样蛋白，
它们各自分别结合CD37，优选结合人CD37，最优选结合人CD37的细胞外结构域。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物分别为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体、或其抗体结合片段或抗原结合衍生物。
4.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述抗体选自：利洛托单抗(Lilotomab)、奥乐妥珠单抗(TRU-016)，以及Naratuximab、BI836826或GEN3009。
5.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物分别包含以下互补决定区(CDR)：
根据SEQ ID No.1的CDRH1(DYNMY)、
根据SEQ ID No.2的CDRH2(YIDPYNGDTTYNQKFKG)、
根据SEQ ID No.3的CDRH3(SPYGHYAMDY)、
根据SEQ ID No.4的CDRL1(KASQDVSTAVD)、
根据SEQ ID No.5的CDRL2(WASTRHT)、
根据SEQ ID No.6的CDRL3(RQHYSTPFT)，
并且其中所述CDR包含在合适的蛋白质框架中，以便能够结合CD37，优选结合人CD37，最优选结合人CD37的细胞外结构域。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段或其抗原结合衍生物分别包含：与根据SEQ ID No.7的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQID No.7的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.7的氨基酸序列组成的重链可变区，以及与根据SEQ ID No.8的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.8的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.8的氨基酸序列组成的轻链可变区。
7.根据权利要求5和6中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含：与根据SEQ ID No.9的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.9的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.9的氨基酸序列组成的重链，以及与根据SEQ IDNo.12的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成的轻链。
8.根据权利要求2-6中任一项所述的缀合物，其中所述抗体已被基因工程化以包含根据EU编号系统的重链118Cys、重链239Cys或重链265Cys，优选根据EU编号系统的重链265Cys，并且其中所述接头(如果存在)或所述鹅膏毒素分别经由所述重链118Cys或所述重链239Cys或所述重链265Cys连接至所述抗体。
9.根据权利要求2-6和8中任一项所述的缀合物，其中所述抗体已被基因工程化以包含根据EU编号系统的重链234Ala和/或235Ala。
10.根据权利要求2-6中任一项所述的缀合物，其中所述抗体已被基因工程化以包含根据EU编号系统的重链265Cys、234Ala和235Ala，并且其中所述接头(如果存在)或所述鹅膏毒素经由所述重链265Cys残基连接至所述抗体。
11.根据权利要求5或权利要求6所述的缀合物，其中所述抗体包含：与根据SEQ IDNo.10或11的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ ID No.10或11的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.10或11的氨基酸序列组成的重链，以及与根据SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少90％序列相似性、优选与根据SEQ IDNo.12的氨基酸序列具有至少95％序列相似性、最优选由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成的轻链。
12.根据权利要求2-6中任一项所述的缀合物，其中所述接头(如果存在)或所述鹅膏毒素经由所述抗体的任何天然存在的Cys残基、优选经由形成所述抗体的链间二硫键的任何天然存在的Cys残基和/或经由二硫键连接至所述抗体。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的缀合物，其中所述接头是不可裂解接头或可裂解接头。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述可裂解接头选自：可酶促裂解接头，优选可蛋白酶裂解接头，和可化学裂解接头，优选包含二硫键的接头。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的缀合物，其中所述接头(如果存在)或所述靶结合部分经由以下原子连接至所述鹅膏毒素：(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC原子，或(ii)鹅膏毒素氨基酸3的δC原子，或(iii)鹅膏毒素氨基酸4的6’-C原子。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的缀合物，其中所述鹅膏毒素包含：(i)具有6’-脱氧位置的氨基酸4和(ii)具有S-脱氧位置的氨基酸8。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物分别包含以下的式(I)至(XI)的化合物中的任一项作为接头-鹅膏毒素部分：
18.根据权利要求2-12中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含抗体作为靶结合部分，所述抗体经由硫醚键与根据式XII至XXII中任一项的鹅膏毒素-接头部分缀合：
其中所述鹅膏毒素-接头部分与所述抗体的半胱氨酸残基的巯基基团偶联，并且其中n优选为1至7。
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述鹅膏毒素-接头部分与所述抗体的半胱氨酸残基的巯基基团偶联，并且其中n为1或2。
20.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述缀合物选自：
(i)缀合物(XXIII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链由根据SEQ ID No.11的氨基酸序列组成或包含根据SEQ IDNo.11的氨基酸序列，且每条轻链由根据SEQ ID No.12的氨基酸序列组成或包含根据SEQID No.12的氨基酸序列，
(ii)缀合物(XXIV)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XIII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(iii)缀合物(XXV)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XIV)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(iv)缀合物(XXVI)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XV)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(v)缀合物(XXVII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XVI)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(vi)缀合物(XXVIII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XVII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ IDNo.12的氨基酸序列，
(vii)缀合物(XXIX)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XVIII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ IDNo.12的氨基酸序列，
(viii)缀合物(XXX)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XIX)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ IDNo.12的氨基酸序列，
(ix)缀合物(XXXI)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XX)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(x)缀合物(XXXII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XXI)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列，
(xi)缀合物(XXXIII)，所述缀合物由作为靶结合部分的抗体和与抗体缀合的至少一个式(XXII)的鹅膏毒素-接头部分组成，所述抗体经由所述接头与所述抗体的根据EU编号系统的重链265Cys残基的巯基基团的硫醚键缀合至所述鹅膏毒素-接头部分，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，每条重链具有根据SEQ ID No.11的氨基酸序列，且每条轻链具有根据SEQ IDNo.12的氨基酸序列，
其中n为1至2。
21.药物组合物，其包含如权利要求1-20中任一项所述的缀合物。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其还包含一种或多种药学上可接受的缓冲剂、表面活性剂、稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
23.根据权利要求1-20中任一项所述的缀合物或权利要求21或22中所述的药物组合物，其用于治疗B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病，特别是用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(DBNHL)、包括套细胞淋巴瘤(MCL)的非霍奇金淋巴瘤亚型、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、里希特综合征、原发性皮肤边缘区淋巴瘤(PCMZL)、多毛细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎，以及寻常型天疱疮。
24.根据权利要求23所述用途的缀合物或药物组合物，其与检查点抑制剂联合使用。
25.根据权利要求23或权利要求24所述用途的缀合物或药物组合物，其中所述B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的特征在于TP53、POLR2A或del(17p13)的半合子缺失。
26.根据权利要求1-20中任一项所述的缀合物或权利要求21-22中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的药物中的用途，特别是用于治疗以下疾病的药物中的用途：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(DBNHL)、包括套细胞淋巴瘤(MCL)的非霍奇金淋巴瘤亚型、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、里希特综合征、原发性皮肤边缘区淋巴瘤(PCMZL)、多毛细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎，以及寻常型天疱疮。
27.治疗患有B淋巴细胞相关的恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫性疾病的患者的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1-20中任一项所述的缀合物或权利要求21-22中任一项所述的药物组合物。
28.根据权利要求27所述的治疗患者的方法，其中所述患者患有里希特综合征，并且其中所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-20中任一项所述的缀合物或权利要求21-22中任一项所述的药物组合物作为单一疗法，或将其与免疫检查点抑制剂联合施用。
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