KR20230159480A - B-림프구 특이적 아마톡신 항체 접합체 - Google Patents

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미하엘 쿨케
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하이델베르크 파마 리서치 게엠베하
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Abstract

본 출원은 아마톡신, 표적이 CD37인 표적-결합 모이어티, 즉 CD37-결합 모이어티, 및 임의로 상기 아마톡신과 상기 CD37-결합 모이어티를 연결하는 링커를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 접합체의 합성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역 세포-, 특히 B-세포 및/또는 림프종 연관 질환 및/또는 악성종양의 치료에 사용하기 위한 이러한 접합체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

Description

B-림프구 특이적 아마톡신 항체 접합체
본 출원은 아마톡신, 표적이 CD37인 표적-결합 모이어티, 즉 CD37-결합 모이어티, 및 임의로 상기 아마톡신과 상기 CD37-결합 모이어티를 연결하는 링커를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 접합체의 합성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역 세포-, 특히 B-세포 및/또는 림프종 연관 질환 및/또는 악성종양의 치료에 사용하기 위한 이러한 접합체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
백혈구 세포 표면 단백질 CD37은 4개의 보존된 막횡단 도메인의 존재를 특징으로 하는 "테트라스파닌" 슈퍼패밀리 또는 막횡단 4 슈퍼패밀리의 구성원이다. 테트라스파닌 패밀리 구성원은 세포 성장, 생존, 부착, 세포-세포 소통, 및 트래픽킹, 엑소솜을 통한 세포간 소통, 종양발생, 전이, 및 면역 반응의 조절을 포함한 광범위한 생물학적 과정에 수반되는 신호 전달의 "분자 촉진제"로서 간주되는 막 단백질이다. 테트라스파닌 구성원은 또한 세포 운동성, 발생 및 분화, 활성화, 증식, 이동 및 종양 침습을 포함한 광범위한 세포 과정에서 기능적 역할을 갖는 것으로 기재되었다 (Hemler 2001; Xu-Monette et al. 2016).
테트라스파닌 단백질 패밀리 구성원은 세포내 N- 및 C-말단, 2개의 세포외 도메인 (EC1 및 EC2), 구체적으로 4개의 막횡단 도메인을 함유한다 (도 2). 테트라스파닌의 구조적 조성은 종들 사이에서 고도로 보존되며, EC2 도메인 내의 고도로 보존된 "CCG" 모티프에 4개 이상의 시스테인 잔기를 갖는다. 적어도 33종의 테트라스파닌이 인간에서 확인되었다 (Zou et al. 2018).
테트라스파닌은 패턴 인식 수용체 (PRR) 및 주요 조직적합성 복합체 부류 II (MHC-II), 부착 단백질 및 신호전달 분자와 같은 막 수용체를 통합하는, "테트라스파닌-풍부 마이크로-도메인" (TEM) 또는 "테트라스파닌 웹"으로 불리는 특수화된 막 플랫폼을 조직화한다. 중요하게는, 그의 회합된 막 파트너의 기능의 조정을 통해, 테트라스파닌은 면역 반응의 상이한 단계를 조절한다. 여러 테트라스파닌은 면역 수용체의 활성화 역치를 양성 또는 음성 조절할 수 있다. 이들은 또한 부착 분자의 표면 수준 및 공간 배열 및 그의 후속 세포내 신호전달을 제어함으로써 APC의 이동 동안 역할을 한다. 마지막으로, 테트라스파닌은 항원 프로세싱에 참여하고, T-세포 공동-자극 및 MHC-II-의존성 항원 제시의 제어를 통한 나이브 T 세포의 프라이밍에 중요하다 (Saiz ML et al. 2018; Zou et al. 2018).
CD37 (테트라스파닌 TSPAN26)의 발현은 면역계의 세포로 제한되며, 정상 및 특히 악성 성숙 B 세포 상에서 가장 높은 존재비를 갖고, 형질 세포에서 하향조절된다 (Hemler 2001). CD37은 프리-B에서 말초 성숙 B-세포 단계 동안 B 세포 상에서 고도로 발현되지만, 초기 전구 세포 또는 최종 분화된 형질 세포 상에서는 부재한다 (Schwartz-Albiez et al. 1988). 보다 낮은 발현이 T 세포 및 골수 세포 상에서 발견되었다.
B 세포는 항원의 제시 및 다양한 항체, 염증유발 시토카인 및 공동-자극제의 생산을 통해 면역 반응을 촉진할 수 있다. B 세포는 또한 다양한 메카니즘, 예컨대 IL-10, IL-35 및 TGFβ1의 생산, 조절 T 세포의 유도, 및 자가 항원의 클리어런스를 통해 면역 반응을 억제할 수 있다. 많은 세포 표면 분자가 B 세포 발생 및 기능에 관여한다. 테트라스파닌은 분자의 하나의 이러한 중요한 패밀리이다 (Zou et al. 2018).
CD37은 다른 막횡단 4 슈퍼패밀리 단백질, B 세포 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 II 분자, 및 인테그린과 복합체화하는 것으로 공지된 세포 표면 당단백질이고; MHC-II는 전문 항원-제시 세포 (APC) 상에서 발현되고, APC의 표면에서 CD9, CD37, CD53, CD81, 및 CD82를 포함한 여러 테트라스파닌과 회합한다. CD37은 MHC-II 클러스터링을 음성적으로 조절하고, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 MHC-의존성 항원 제시를 음성적으로 조절한다 (Saiz et al. 2018). CD37은 막 C-유형 렉틴 수용체 덱틴-1 표면 발현을 안정화시키고, 그의 내재화를 손상시키고, 덱틴-1-매개 TNF-α 및 IL-6 생산을 억제하는 것으로 나타났다. CD37에 결합하는 것으로 기재된 다른 단백질은 ACPA, PURL, YBTO, PG8786 084, CD19, CD53, SYK, KARS, PTPN6, LYN, PIK3CD, PIK3CG, CD81, 및 CR2를 포함한다 (Zou et al. 2018).
대안적 스플라이싱은 CD37의 상이한 이소형을 코딩하는 다중 전사체 변이체를 생성한다. CD37은 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 다의 조절 및 제어에 관여한다.
CD37은 T-세포-B-세포 상호작용, 이뮤노글로불린 G (IgG)/IgA 생산, 및 면역 반응과 관용 사이의 균형에 중요하다. 마우스에서 CD37의 파괴는 B 세포 IgG 생산에서 비교적 미묘한 변경, 및 준최적 자극 조건 하에 특히 명백한 T 세포-의존성 면역 반응 결핍을 생성하였다. 따라서, CD37은 B 세포 체액 반응 뿐만 아니라 T 세포-B 세포 상호작용을 조절하는 것으로 결론지었다 (Knobeloch et al. 2000). 마우스에서의 CD37-결핍은 B 세포 림프종 상에서 자발적 발생으로 이어질 수 있다. Cd37-/- 마우스 모델 및 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)을 갖는 환자에서 관찰된 바와 같이, CD37의 상실 및 CD37과 시토카인 신호전달 3의 억제자 (SOCS3) 사이의 상호작용은 인터류킨 6 (IL6)-AKT-STAT3 경로의 구성적 활성화, 배 중심-유래 림프종의 자발적 발생, 및 보다 불량한 임상 결과를 유발한다 (Xu-Monette et al. 2016).
B 세포에서, CD37은 증식 및 생존에서 엄청난 역할을 한다. CD37은 Akt 생존 경로를 활성화하는 데 필요한 단계인 α(4)β(1) 인테그린의 이동성 및 클러스터링을 제어함으로써 α(4)β(1) 인테그린의 형질 막 분포를 조절한다. IgG-분비 형질 세포의 수는, 아마도 Akt 생존 경로에 대한 α(4)β(1) 인테그린에 대한 VCAM-1의 손상된 회합이 배 중심에서 형질 세포의 아폽토시스를 증가시킴으로 인해, 마우스에서 CD37이 녹아웃될 때 림프성 기관에서 감소되는 것으로 보고된다. 최근 연구에서, 마우스에서의 CD37 녹아웃은 시토카인 신호전달 3의 억제자의 제어를 상실함으로써 IL6 경로의 구성적 활성화를 통해 B 세포 림프종 진행을 유도할 수 있었다. CD37은 B 세포가 생존하고 오래 지속되는 면역 보호를 제공하기 위해 중요하지만, CD37이 티로신 인산화되고 신호전달 인자와 결합할 때 아폽토시스를 일으키는 사건의 캐스케이드를 촉발할 수 있음이 또한 밝혀졌다. 연구는 또한 CD37이 그의 N-말단 도메인을 통해 SHP1-의존성 사멸을 매개하는 반면, PI3K-의존성 생존을 매개함으로써 C-말단 도메인을 통한 사멸 신호를 길항한다는 것을 밝혀내었다 (Zou et al. 2018).
B 세포 증식 및 생존에서의 그의 역할 이외에도, CD37은 생체내에서 IgA 면역 반응을 억제하면서 IgG1 생산을 촉진한다. CD37 결핍은 준최적 공동자극 조건 하에 혈청 IgG1 수준의 감소를 유발하고, T 세포-의존성 항원에 대한 B 세포 반응을 변경시킨다.
T 세포에서, 테트라스파닌은 T-세포 수용체 (TCR)-유도된 활성화 및 증식에 연루된다. 펩티드와 MHC의 상호작용은 TCR을 활성화시키고, Src 키나제 Fyn 및 Lck의 하류 신호전달 캐스케이드를 개시한다. Lck는 후속적으로 T 세포 활성화 및 증식에 관여하는 기능적 단백질을 활성화시킨다. Lck와 CD4/CD8의 상호작용은 이 경로에서 결정적인 역할을 하고; CD4가 테트라스파닌 CD81/82와 회합하면, Lck는 TCR 신호전달 경로로부터 격리된다. TCR 신호전달의 초기 사건에 영향을 미침으로써 T 세포 증식에서 CD37에 대한 조절 역할이 문헌 [Van Spriel et al. (2004)]에 의해 관찰되었다. CD37은 Lck 키나제의 인산화를 방해하여 TCR 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀졌다. CD37은 주로 TCR 신호 연관 마이크로도메인에 대한 CD4-Lck 분포의 역학에 영향을 미침으로써 TCR 신호 전달에 커플링된다. 따라서, 테트라스파닌은 Lck 동원에 근접한 TCR-CD4/CD8 캐스케이드에 영향을 미침으로써 T 세포 생물학적 과정을 조절한다 (Zou et al. 2018).
증가된 CD37 발현은 B 세포 악성종양에서 발견되었다 (Zou et al. 2018). B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL) 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병 (B-CLL)을 포함한 대부분의 B-세포 악성종양은 CD37을 발현한다. CD37은 버킷 림프종 세포주의 60%에서 가변 수준에서 검출되었다. 신생물성 B 세포에서의 CD37 발현은 그의 상응하는 B-세포 대응부의 성숙 단계와 상관관계가 있지만, B-CLL은 정상 성숙 순환 B 림프구보다 더 낮은 CD37 수준을 갖는다 (Xu-Monette et al. 2016). 문헌 [Belov et al. (2001)]은 면역표현형결정을 위해 항체 마이크로-어레이를 이용하는 것이 CD37이 악성 CLL 세포 (높은 CD37 발현) 대 정상 말초 혈액 림프구 (낮은 CD37 발현) 사이의 우수한 판별자임을 나타낸다는 것을 보고하였다.
CD37은 1986년에 뮤린 모노클로날 항체 MB-1에 의해 최초로 기재되고 특징화되었으며 (Link et al., 1986), 이는 또한 방사선요법에 사용되었다.
CD37은 높은 수준의 CD37을 발현하는 CLL 및 NHL을 갖는 환자에서 모노클로날 항체 (예를 들어 오틀레투주맙)에 의해 표적화될 수 있다. 항-CD37 항체와의 교차-라이게이션 시, CD37은 사멸 신호 (Src 상동성 영역 2 도메인-함유 포스파타제-1 (SHP1), LYN 및 포스파티딜이노시톨 3-키나제 γ (PI3Kγ)와 연관된 N-말단 도메인으로부터) 및 반대 생존 신호 (p85 및 PI3Kδ를 동원하는 C-말단 도메인으로부터) 둘 다를 전달한다 (Lapalombella et al. 2012; Xu-Monette et al. 2016).
지금까지 제한된 수의 CD37-지시된 항체 치료 후보가 환자에서 평가되었다. 이러한 작용제는 아폽토시스 유도, 항체-의존성 세포성 세포독성, 항체-의존성 세포성 식세포작용 및 보체-의존성 세포독성을 포함한 다중 메카니즘을 통해 항종양 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. CLL 환자에서 항체 BI 836826을 사용한 문헌 [Stilgenbauer et al. (2019)]에 의한 최근의 임상 연구는 CD37이 유망한 치료 표적을 나타냄을 확인하였다. CD37-결합 소형 모듈 면역제약 단백질은 또한 B-세포 악성종양의 치료로서 임상 시험으로 진행되었다 (Zhao et al. 2007).
세포독성제를 종양-표적화 항체에 공유 연결하여 그의 항종양 특이성 및 효력을 증진시키는 항체-약물 접합체 (ADC)가 개발되었다. 이러한 접근법은 ADC 결합, 내재화 및 세포내 페이로드 방출을 통해 표적 항원을 발현하는 세포로의 세포독성 화합물의 특이적 전달을 가능하게 하도록 설계된다.
티오에테르 링커, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)를 통해 강력한 항미세관제인 메이탄시노이드 DM1에 접합된, B-세포주에 대해 강력한 시험관내 활성을 갖는 항-CD37 항체로 이루어진 ADC가 기재된 바 있고; 상기 ADC (IMGN529)는 정상 및 CLL B 세포의 강력하고 특이적인 고갈을 발생시켰다 (Deckert et al. 2013). 이식가능한 hCD37+ 백혈병이 발달된 뮤린 CLL 모델에서, ADC IMGN529는 말초 혈액 백혈병을 제거하고, 전체 생존을 개선시켰으며; 대조적으로, IMGN529 단독의 항체 성분은 질환 과정을 변경시킬 수 없었다 (Beckwith KA et al. 2014).
이들 데이터는 CD37-지시된 요법이 효과적일 수 있음을 시사한다. 그러나, 개선된 효력 및 효능 프로파일을 갖는 작용제에 대한 상당한 필요가 여전히 존재한다.
만성 림프구성 백혈병 (CLL)에서, 소분자 브루톤 티로신 키나제 (BTK) 억제제 이브루티닙을 사용한 치료는 표준 관리가 되었다. 브루톤 티로신 키나제 (BTK)를 통한 B-세포 수용체 (BCR) 신호전달의 만성 활성화는 B-세포 림프종에서 질환 진행을 유도하는 주요 메카니즘 중 하나인 것으로 널리 간주된다. 이브루티닙은 임상 시험에서 CLL에서 현저한 효능을 입증하였고, 임의의 차수의 요법에서 임의의 CLL 환자의 요법에 대해 미국 식품 의약품국에 의해 승인된 최초의 BTK 억제제였다. 그의 사용은 급속하게, 재발성 CLL 환자 뿐만 아니라 많은 최전선 고위험 또는 고령 환자에 대한 표준 관리가 되었다 (Brown 2018).
그러나, BTK-표적화제 이브루티닙이 유망한 임상 반응을 나타냈지만, 1차 또는 후천성 내성의 존재는 통상적이며, 종종 형편없는 임상 결과를 유도한다. 이브루티닙 요법에 대한 내성은 유전자 돌연변이, 대안적 생존 경로의 상향조절, 또는 이브루티닙 요법에 의해 표적화되지 않는 다른 미지의 인자를 통해 매개될 수 있다 (George B et al. 2020; Fuhrman et al. 2014; Pula B et al. 2019).
아마톡신 및 종양 항원-특이적 항체, 항체 단편 또는 유도체를 포함하는 항체 약물 접합체 (ADC)가 기재되어 있다 (WO 2010/115629A2, WO 2016/142049A1, WO 2017/149077A1).
발명의 개요
본 발명자들은 놀랍게도 예상외로, 특히 CD37-특이적 항체, 또는 항체 단편 또는 항체 유도체를 항-CD37 항체, 또는 항체 단편 또는 항체 유도체를 아마톡신에 연결하는 비-절단가능한 링커 또는 절단가능한 링커와 함께 포함하는 본 발명에 따른 아마톡신-기재 접합체가 시험관내 및 생체내에서 이브루티닙 내성을 극복하고 CD37-양성 이브루티닙-내성 표적 세포에 대해 유의한 세포독성 효과를 발휘할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
따라서, 선행 기술의 관점에서, 본 발명의 한 목적은 본 출원에 기재된 바와 같이 표적 세포에서 세포독성 효과를 매개하는, CD37에 결합하는 표적 결합 모이어티, 적어도 1개의 아마톡신, 및 임의로 상기 표적 결합 모이어티를 상기 적어도 1개의 독소와 연결하는 적어도 1개의 링커를 포함하는 접합체를 제공하는 것이었다.
본 발명의 하나의 추가의 목적은 CD37에 결합하는 표적 결합 모이어티, 적어도 1개의 아마톡신, 및 임의로 적어도 1개의 링커를 포함하며, 여기서 상기 표적 결합 모이어티는 CD37에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체 또는 항체-유사 단백질인 접합체를 제공하는 것이었다.
본 발명의 하나의 추가의 목적은 이러한 접합체를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이었다.
본 발명의 하나의 추가의 목적은 암의 치료 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하는 것이었다.
본 발명의 하나의 추가의 목적은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 특히 비-호지킨 림프종, 여포성 림프종, 미만성 대 B 세포 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군, 류마티스 관절염, 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 현미경적 다발혈관염 및 심상성 천포창의 치료에 사용하기 위한, CD37에 결합하는 표적 결합 모이어티, 적어도 1개의 아마톡신, 및 임의로 적어도 1개의 링커를 포함하는 접합체를 제공하는 것이었다.
상기 및 추가의 목적은 본 발명의 독립 청구항에 따른 방법 및 수단에 의해 충족된다. 종속 청구항은 구체적 실시양태에 관한 것이다.
본 발명 및 그의 특색의 일반적 이점은 하기에 상세히 논의될 것이다.
도 1. 다양한 아마톡신의 마쿠쉬 구조. 볼드체 (1 내지 8)의 숫자는 아마톡신을 형성하는 8개 아미노산의 표준 넘버링을 지정한다. 아미노산 1, 3, 및 4 내의 원자의 표준 명칭이 또한 제시된다 (각각 그리스 문자 α 내지 γ, 그리스 문자 α 내지 δ, 및 숫자 1' 내지 7').
도 2. 테트라스파닌 단백질의 개략도. 테트라스파닌은 4개의 막횡단 도메인 (TM1-4), 세포내 N- 및 C-말단, 및 2개의 세포외 도메인 (EC1 및 EC2)을 포함한다. CCG 모티프는 시스테인-시스테인-글리신 및 2개의 디술피드 결합 (얇은 선)에 의해 형성된다 (문헌 [Zou et al. 2018]로부터).
도 3. 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석에 의한, 각각 B-세포 백혈병 (B-CLL) 세포주 MEC-1 및 MEC-2, 인간 버킷 림프종 세포주 Raji 및 Ramos, 및 인간 B-세포 전구체 백혈병 세포주 Nalm-6에 대한 항-CD37 모노클로날 항체 chHH1-LALA-D265C의 결합.
도 4. 96시간 동안의 인큐베이션 후 CTG 검정에서 상이한 항-CD37-항체-표적화된 아마톡신 접합체를 사용한, (a) CD37-양성 MEC-1 세포, (b) - (g) CD37-양성 MEC-2 세포에 대한 시험관내 세포독성 연구의 결과.
도 5. (a) - (d) WST-1 세포 증식 검정에서 상이한 항-CD37-항체-표적화된 아마톡신 접합체를 사용한 CD37-양성 Raji-Luc 세포에 대한 시험관내 세포독성 연구의 결과.
도 6. 나타낸 바와 같은 아마톡신-접합체와 96시간 동안 인큐베이션한 후 CTG 검정에서 상이한 항-CD37-항체-표적화된 아마톡신 접합체 ((a) - (e))를 사용한 CD37-양성 Raji 세포에 대한 시험관내 세포독성 연구의 결과.
도 7. 나타낸 바와 같은 아마톡신-접합체와 96시간 동안 인큐베이션한 후 CTG 검정에서 상이한 항-CD37-항체-표적화된 아마톡신 접합체 ((a) - (d))를 사용한 CD37-양성 Ramos 세포에 대한 시험관내 세포독성 연구의 결과.
도 8. 180일의 처리에 걸친 파종성 MEC2 종양 이종이식편 모델에서 다양한 항-CD37 아마톡신 접합체를 사용한 생체내 세포독성 효능 연구의 결과이며, 개별 처리군의 체중을 보여줌.
도 9. 180일의 처리에 걸친 파종성 MEC2 종양 이종이식편 모델에서 나타난 바와 같은 다양한 항-CD37 아마톡신 접합체를 사용한 생체내 세포독성 효능 연구의 결과: 생존.
도 10. 130일의 처리에 걸친 파종성 Raji-Luc 종양 이종이식편 모델에서 다양한 항-CD37 아마톡신 접합체를 사용한 생체내 세포독성 효능 연구의 결과이며, 개별 처리군의 체중을 보여줌.
도 11. 125일의 처리에 걸친 파종성 Raji-Luc 종양 이종이식편 모델에서 다양한 항-CD37 아마톡신 접합체를 사용한 생체내 세포독성 효능 연구의 결과: 생물발광 (배경 정규화됨).
도 12. 130일의 처리에 걸친 파종성 Raji-Luc 종양 이종이식편 모델에서 다양한 항-CD37 아마톡신 접합체를 사용한 생체내 세포독성 효능 연구의 결과: 생존.
도 13. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에서의 탐색적 독성 연구의 결과. 각각의 군에 대해 나타낸 바와 같은 상승 용량으로, 나타낸 바와 같은 상이한 항-CD37 항체-아마톡신 접합체를 사용한 (a), (d) 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 혈청 수준 (각각 평균 및 중앙); (b), (e) 아스파르테이트 트랜스-아미나제 (AST) 혈청 수준 (각각 평균 및 중앙); 및 (c), (e) 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 혈청 수준 (각각 평균 및 중앙).
도 14. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서의 탐색적 독성 연구의 결과. 나타낸 바와 같은 상이한 항-CD37 항체-아마톡신 접합체를 사용한 (a) - (c) 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 혈청 수준; (d) - (f) 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) 혈청 수준; 및 (g) - (i) 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 혈청 수준. 십자가표시는 안락사되거나 동물이 사망하였음을 나타낸다.
도 15. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서의 탐색적 독성 연구의 결과. 나타낸 바와 같은 1.0 내지 20 mg/kg의 용량으로 비특이적 항체-아마톡신 접합체를 사용한 200일 초과에 걸친 (a) 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 혈청 수준; (b) 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) 혈청 수준; 및 (c) 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 혈청 수준.
도 16. 본 발명의 항-CD37 항체-아마톡신 접합체로 처리된 리히터 증후군 환자-유래 이종이식편 (PDX) 모델 (RS1316)의 결과. (a) 처리 후 75일까지의 나타낸 바와 같은 본 발명의 아마톡신 접합체로 처리된 동물의 생존 플롯, (b) 나타낸 바와 같은 아마톡신 접합체로의 단일 처리 후 신장 (kid), 간 (liv), 폐, 골수 (BM), 말초 혈액 (PB), 뇌 (bra) 및 비장 (Spl)에서의 잔류 RS 세포 (CD45+, CD19+, CD20+ 양성 세포)의 수.
도 17. 유동 세포측정법에 의해 평가된 인간 및 시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한 항-CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C 항체의 결합. (a) 좌측 패널: 대조군: 염소 항-인간 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 Fab 단독으로 염색된 인간 PBMC; 우측 패널: 항-CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C 및 염소 항-인간 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 Fab 2차 항체로 염색된 인간 PBMC. (b) 좌측 패널: 대조군: 염소 항-마우스 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 Fab 단독으로 염색된 인간 PBMC; 우측 패널: 마우스 항-인간 CD37 항체 및 염소 항-마우스 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 F(ab)2-단편 2차 항체로 염색된 인간 PBMC. (c) 좌측 패널: 염소 항-마우스 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 F(ab)2-단편 단독으로 염색된 시노몰구스 PBMC, 우측 패널: 항-CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C 및 염소 항-인간 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 Fab 2차 항체로 염색된 시노몰구스 PBMC; (d) 좌측 패널: 염소 항-마우스 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 F(ab)2-단편 단독으로 염색된 시노몰구스 PBMC, 우측 패널: 마우스 항-인간 CD37 항체 및 2차 항체로서의 염소 항-마우스 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 F(ab)2-단편으로 염색된 시노몰구스 PBMC.
도 18. 본 발명의 접합체의 세포독성. 본 발명의 접합체의 세포독성의 의존성을 MEC-1, MEC-2, Ramos 및 Raji-luc 세포 상에서 2종의 예시적인 접합체 (a) 접합체 XXV, (b) 접합체 XXIII를 사용하여 평가하였다. 결과는 세포 표면 상에서 발현된 검출가능한 CD37 에피토프의 수 (MEC-2 세포 상에서의 높은 발현과 비교하여 Ramos 또는 MEC-1 세포 상에서의 낮은 발현)와 관계없이, 본 발명의 접합체가 효과적인 세포 사멸에 의해 입증된 바와 같이 표적 세포 상에서 높은 세포독성을 갖는다는 것을 가리킨다. CD37 에피토프의 정량화를 제조업체의 지침에 따라 퀀텀(Quantum)™ MESF 키트를 사용하여 수행하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 장치의 특정한 구성요소 부분 또는 기재된 방법의 공정 단계로 제한되지 않으며, 이는 이러한 장치 및 방법이 달라질 수 있기 때문임을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 목적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 단수 및/또는 복수 지시대상을 포함한다는 것을 유의해야 한다. 또한, 수치에 의해 한정되는 파라미터 범위가 주어지는 경우에, 범위는 이들 한계 값을 포함하는 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 기능하도록 의도된다. 본원에 달리 나타내지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다.
본 명세서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다" 및 변형어, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 구성원, 정수 또는 단계의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 언급되지 않은 구성원, 정수 또는 단계의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 용어 "이루어진다"는 용어 "포함하다"의 특정한 실시양태이며, 여기서 임의의 다른 언급되지 않은 구성원, 정수 또는 단계는 배제된다.
추가로, 본원에 개시된 실시양태는 서로 관련되지 않을 개별 실시양태로서 이해되도록 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 한 실시양태와 함께 논의된 특색은 또한 본원에 제시된 다른 실시양태와 관련하여서도 개시되도록 의도된다. 한 경우에, 특정 특색이 한 실시양태와 함께 개시되지 않으나 또 다른 실시양태와 함께 개시되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 특색이 상기 다른 실시양태와 함께 개시되는 것을 의미하지는 않는다는 것을 반드시 의미하지는 않음을 이해할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 특색을 또한 다른 실시양태에 대해 개시하는 것이 본 출원의 요지이지만, 단지 명확성을 위해 및 명세서를 관리가능한 부피로 유지하기 위해 이는 수행되지 않았음을 이해할 것이다.
또한, 본원에 언급된 선행 기술 문헌의 내용은 참조로 포함된다. 이는, 특히 표준 또는 상용 방법을 개시하는 선행 기술 문헌을 지칭한다. 이러한 경우에, 참조로 포함하는 것은 주로 충분한 구현가능 개시내용을 제공하고 장황한 반복을 피하는 목적을 갖는다. 본 출원 전반에 걸쳐 사용된 화학적 용어는 국제 순수 응용 화학 연합(International Union of Pure and Applied Chemistry)에 의해 공개된 문헌 ["Compendium of Chemical Terminology", ISBN: 0-9678550-9-8]에 따라 해석되어야 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 용어 "약"은 사용되는 수치의 +/- 10%를 지칭할 것이다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 본 발명은 (i) 표적 결합 모이어티, (ii) 적어도 1개의 독소, 및 (iii) 임의로 상기 표적 결합 모이어티를 상기 적어도 1개의 독소와 연결하는 적어도 1개의의 링커를 포함하며, 여기서 상기 표적 결합 모이어티는 CD37에 결합하고, 상기 적어도 1개의 독소는 아마톡신인 접합체에 관한 것이다.
아마톡신은 아마니타 팔로이데스 버섯에서 발견되는 8개의 아미노산으로 구성된 비시클릭 펩티드이다 (도 1 참조). 아마톡신은 포유동물 세포의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II를 특이적으로 억제하고, 이에 의해 또한 영향을 받은 세포의 전사 및 단백질 생합성을 억제한다. 세포에서의 전사의 억제는 성장 및 증식의 정지를 유발한다. 공유 결합되지는 않았지만, 아마니틴과 RNA-폴리머라제 II 사이의 복합체는 매우 단단하다 (KD = 3 nM). 효소로부터의 아마니틴의 해리는 매우 느린 과정이고, 따라서 영향을 받은 세포의 회복을 가능하지 않게 만든다. 전사의 억제가 충분히 길게 지속되는 경우에, 세포는 프로그램화된 세포 사멸 (아폽토시스)을 겪을 것이다.
본 발명에 따른 용어 "아마톡신"은 아마니타(Amanita) 속으로부터 단리되고 문헌 [Wieland, T. and Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 5 (1978) 185-260)]에 기재된 바와 같은 8개의 아미노산으로 구성된 모든 비시클릭 펩티드, 추가로 그의 모든 화학적 유도체; 추가로 그의 모든 반합성 유사체; 추가로 천연 화합물의 마스터 구조에 따른 빌딩 블록으로부터 구축된 그의 모든 합성 유사체 (시클릭, 8개의 아미노산), 및 추가로 히드록실화 아미노산 대신에 비-히드록실화 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체, 추가로 술폭시드 모이어티가 술폰, 티오에테르에 의해, 또는 황과 상이한 원자, 예를 들어 아마니틴의 카르바나로그(carbanalog)에서와 같은 탄소 원자에 의해 대체된 모든 합성 또는 반합성 유사체를 포함한다.
본원에 사용된 화합물의 "유도체"는 화합물과 유사한 화학 구조를 갖지만, 그것이 유래된 화합물에 존재하지 않는 적어도 1개의 화학적 기를 함유하고/거나 그것이 유래된 화합물에 존재하는 적어도 1개의 화학적 기가 결핍된 종을 지칭한다. 유도체가 비교되는 화합물은 "모" 화합물로 공지되어 있다. 전형적으로, "유도체"는 1개 이상의 화학 반응 단계에서 모 화합물로부터 생성될 수 있다.
본원에 사용된 화합물의 "유사체"는 화합물과 구조적으로 관련되지만 동일하지는 않으며, 화합물의 적어도 하나의 활성을 나타낸다. 유사체가 비교되는 화합물은 "모" 화합물로 공지되어 있다. 상기 언급된 활성은, 비제한적으로, 또 다른 화합물에 대한 결합 활성; 억제 활성, 예를 들어 효소 억제 활성; 독성 효과; 활성화 활성, 예를 들어 효소-활성화 활성을 포함한다. 유사체가 이러한 활성을 모 화합물과 동일한 정도로 나타낼 필요는 없다. 화합물이 모 화합물의 활성의 적어도 1% (보다 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%)의 정도로 관련 활성을 나타내는 경우에, 화합물은 본 출원의 문맥 내에서 유사체로서 간주된다. 따라서, 본원에 사용된 "아마톡신의 유사체"는 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 아마눌린산 중 어느 하나와 구조적으로 관련되고, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 및 아마눌린산 중 적어도 하나와 비교하여 포유동물 RNA 폴리머라제 II에 대해 적어도 1% (보다 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 50%, 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%)의 억제 활성을 나타내는 화합물을 지칭한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 "아마톡신의 유사체"는 심지어 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린 또는 아마눌린산 중 어느 하나보다 포유동물 RNA 폴리머라제 II에 대해 더 큰 억제 활성을 나타낼 수 있다. 억제 활성은 50% 억제가 발생하는 농도 (IC50 값)를 결정함으로써 측정될 수 있다. 포유동물 RNA 폴리머라제 II에 대한 억제 활성은 세포 증식에 대한 억제 활성을 측정함으로써 간접적으로 결정될 수 있거나, 또는 대안적으로 본원에 개시된 바와 같은 아마톡신 및 그의 각각의 유도체의 억제 활성은 예를 들어 문헌 [Voss et al. BMC Molecular Biology 2014, 15:7]에 개시된 바와 같은 RNA 폴리머라제 II 활성 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"반합성 유사체"는 천연 공급원 (예를 들어 식물 물질, 박테리아 배양물, 진균 배양물 또는 세포 배양물)으로부터의 화합물을 출발 물질로서 사용하여 화학적 합성에 의해 수득된 유사체를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 "반합성 유사체"는 아마니타세아에(Amanitaceae) 과의 버섯으로부터 단리된 화합물로부터 출발하여 합성되었다. 대조적으로, "합성 유사체"는 작은 (전형적으로 석유화학) 빌딩 블록으로부터 소위 전체 합성에 의해 합성된 유사체를 지칭한다. 통상적으로, 이러한 전체 합성은 생물학적 과정의 도움 없이 수행된다.
본 발명의 일부 실시양태에 따라, 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드 및 그의 유사체, 유도체 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
기능적으로, 아마톡신은 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 억제하는 펩티드 또는 뎁시펩티드로서 정의된다. 바람직한 아마톡신은 하기 정의된 바와 같은 링커 분자 또는 표적-결합 모이어티와 반응할 수 있는 관능기 (예를 들어 카르복실 기, 아미노 기, 히드록시 기, 티올 또는 티올-포획 기)를 갖는 것이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "아마니틴"은 특히 위치 1의 아스파르트산 또는 아스파라긴 잔기, 위치 2의 프롤린 잔기, 특히 히드록시프롤린 잔기, 위치 3의 이소류신, 히드록시이소류신 또는 디히드록시이소류신 (또는 아마눌산의 경우 아스파르트산), 위치 4의 트립토판 또는 히드록시트립토판 잔기 (또는 프로아마눌린의 경우 프롤린), 위치 5 및 7의 글리신 잔기 (또는 아마눌산 및 프로아마눌린의 경우 이소류신 잔기), 위치 6의 이소류신 잔기, 및 위치 8의 시스테인 잔기, 특히 술폭시드 또는 술폰 유도체로 산화된 시스테인의 유도체 (아마니틴의 넘버링 및 대표적인 예에 대해, 도 1 참조)를 기재로 하는 비시클릭 구조를 지칭하고, 추가로 그의 모든 화학적 유도체; 추가로 그의 모든 반합성 유사체; 추가로 천연 화합물의 마스터 구조에 따른 빌딩 블록으로부터 구축된 그의 모든 합성 유사체 (시클릭, 8개 아미노산), 추가로 히드록실화 아미노산 대신에 비-히드록실화 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체, 추가로 모든 합성 또는 반합성 유사체를 포함하며, 여기서 각각의 경우에 임의의 이러한 유도체 또는 유사체는 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 억제함으로써 기능적으로 활성이다.
본원에 사용된 용어 "표적-결합 모이어티"는 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 본 출원의 문맥에서 바람직한 표적-결합 모이어티는 (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편; (ii) 항체-유사 단백질; 및 (iii) 핵산 압타머, (iv) 안티칼린, 또는 (v) 본 발명에 사용하기에 적합한 "표적-결합 모이어티"이며, 전형적으로 40,000 Da (40 kDa) 이상의 분자량을 갖는다.
본 출원의 맥락에서 "링커"는 예를 들어 표적 결합 모이어티와 아마톡신 사이의 입체 간섭을 완화시키기 위해 2개의 성분 사이의 거리를 증가시키는 분자를 지칭하며, 이는 그렇지 않으면 RNA 폴리머라제 II와 상호작용하는 아마톡신의 능력을 감소시킬 수 있다. 링커는 표적 결합 모이어티에 의해 표적화되는 세포에서 특이적으로 아마톡신의 방출을 용이하게 할 수 있기 때문에 또 다른 목적을 제공할 수 있다. 링커 및 바람직하게는 한 측면 상의 링커와 아마톡신 사이의 결합 및 다른 측면 상의 링커와 표적 결합 모이어티 또는 항체 사이의 결합은 세포 외부의 생리학적 조건, 예를 들어 혈액 하에 안정한 반면, 세포 내부에서, 특히 표적 세포, 예를 들어 암 세포 내부에서 절단될 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 선택적 안정성을 제공하기 위해, 링커는 바람직하게는 pH-감수성 또는 프로테아제 감수성인 관능기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 링커를 표적 결합 모이어티에 연결하는 결합은 선택적 안정성을 제공할 수 있다. 바람직하게는 링커는 적어도 1개, 바람직하게는 1-30개 원자 길이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 원자)의 길이를 가지며, 여기서 링커의 한 측면은 아마톡신과 반응하고, 다른 측면은 표적-결합 모이어티와 반응한다. 본 발명의 문맥에서, 링커는 바람직하게는 임의로 치환된, C1-30-알킬, C1-30-헤테로알킬, C2-30-알케닐, C2-30-헤테로알케닐, C2-30-알키닐, C2-30-헤테로알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 헤테로아르알킬 기이다. 링커는 1개 이상의 구조적 요소, 예컨대 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디술피드, 탄화수소 모이어티 등을 함유할 수 있다. 링커는 또한 이들 구조적 요소 중 2개 이상의 조합을 함유할 수 있다. 이들 구조적 요소 중 각각의 하나는 링커에 1회 초과, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 디술피드 결합을 포함할 수 있다. 링커는 단일 단계에서 또는 2개 이상의 후속 단계에서 아마톡신 및 표적 결합 모이어티에 부착되어야 하는 것으로 이해된다. 이를 위해, 링커는 바람직하게는 근위 및 원위 말단에, 2개의 기를 보유할 것이며, 이는 (i) 기, 바람직하게는 아마톡신 또는 표적 결합-펩티드 상의 활성화된 기에 공유 결합을 형성할 수 있거나 또는 (ii) 아마톡신 상의 기와 공유 결합을 형성하도록 활성화되거나 또는 활성화될 수 있다. 따라서, 링커가 존재하는 경우, 화학적 기, 예를 들어 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩티드 결합 등이 이러한 커플링 반응의 결과인 링커의 원위 및 근위 말단에 있는 것이 바람직하다. "링커"의 존재는 임의적이며, 즉 아마톡신은 표적-결합 모이어티 독소 접합체의 일부 실시양태에서 표적-결합 모이어티의 잔기에 직접 연결될 수 있지만, 본 발명의 바람직한 실시양태에서 아마톡신은 링커를 통해 표적 결합 모이어티에 커플링된다.
본 발명은 추가로 CD37에 결합하는 표적 결합 모이어티, 적어도 1개의 아마톡신 및 임의로 링커를 포함하며, 여기서 상기 표적 결합 모이어티는
(i) 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체,
(ii) 그의 항원-결합 단편, 바람직하게는 가변 도메인 (Fv), Fab 단편 또는 F(ab)2 단편,
(iii) 그의 항원-결합 유도체, 바람직하게는 단일-쇄 Fv (scFv), 및
(iv) 항체-유사 단백질
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
각각 CD37에 결합하는 것인 접합체에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 CD37은 인간 CD37 (서열식별번호: 13)이고; 가장 바람직한 실시양태에서, 이는 상기 표적-결합 모이어티가 특이적으로 결합하는 인간 CD37의 세포외 도메인이다. 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 그의 항원, 예컨대 예를 들어 인간 CD37의 에피토프, 바람직하게는 인간 CD37의 세포외 에피토프에 대해 적어도 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 또는 약 10-8 M 내지 약 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 또는 약 5 x 10-9 M, 5 x 10-10 M 내지 약 2.5 x 10-11 M, 5 x 10-11 M, 2.5 x 10-12 M, 5 x 10-12 M의 KD를 갖는 본 발명의 표적화 모이어티, 예컨대 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 항-CD37 항체의 결합을 지칭한다. 본 발명의 표적-결합 모이어티, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 항체의 결합의 KD의 결정은 문헌 [Kamat et al. Analytical Biochemistry 536 (2017) 16-31]에 개시된 방법론에 따라, 또는 예를 들어 문헌 [Noy-Porat et al. STAR Protoc. 2021 Sep 15;2(4):100836]에 개시된 바와 같이 결정될 수 있다.
상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체는 각각 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 유도체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 유전자 또는 이뮤노글로불린 유전자의 단편 또는 그로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩되는 1개 이상의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 단백질을 지칭할 것이다. 상기 이뮤노글로불린 유전자는 경쇄 카파, 람다 및 중쇄 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 임의의 많은 상이한 가변 영역 유전자를 포함한다.
기본 이뮤노글로불린 (항체) 구조 단위는 통상적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄, 경쇄 (L, 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 중쇄 (H, 약 50-70 kDa의 분자량을 가짐)로 구성된 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (CH 또는 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역 (CL 또는 CL로 약칭됨)을 함유한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL 영역은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 형성한다.
항체의 CDR 및 프레임워크 영역은 관련 기술분야에 공지된 상이한 넘버링 방식, 예컨대 카바트 (EA Kabat, TT Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)), 코티아 (Cothia & Lesk, J Mol Biol. 1987 Aug 20;196 (4):901-17), 또는 IMGT® (ImMunoGeneTics information, Lefranc et al. Dev Comp Immunol. (2003) 27:55-77)에 따라 정의될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, CDR에 대한 언급은 카바트에 따라 제공된다.
CDR은 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합에 가장 중요하다. 항원의 결합에 필요한 3차원 구조가 유지되는 한, FR은 다른 서열로 대체될 수 있다. 구축물의 구조적 변화는 대부분 항원에 대한 충분한 결합의 상실로 이어진다.
용어 (모노클로날) 항체의 "항원 결합 부분"은 CD20 항원에 그의 천연 형태로 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 부분의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, 및 VH 도메인 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어진 dAb 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 항체 유도체는 모노클로날 항체일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" ("mAb")는 균질한 항체 집단, 즉 전체 이뮤노글로불린 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 균질한 집단을 나타내는, 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 항체는 IgG, IgD, IgE, IgA 및/또는 IgM, 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 본 발명의 모노클로날 항체는 IgG 이소형, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4, 보다 바람직하게는 IgG1 이소형의 것이다.
본원에 사용된 용어 "단편" 또는 "항원-결합 단편"은 표적 결합 능력을 보유하는 이러한 항체의 단편, 예를 들어 CDR (상보성 결정 영역), 초가변 영역, 가변 도메인 (Fv), IgG 중쇄 (VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 이루어짐), IgG 경쇄 (VL 및 CL 영역으로 이루어짐), 및/또는 Fab 및/또는 F(ab)2를 지칭할 것이다.
본원에 사용된 용어 "유도체" 또는 "항원-결합 유도체"는 공통 항체 개념과 구조적으로 상이하지만 여전히 일부 구조적 관계를 갖는 단백질 구축물, 예를 들어 scFv, Fab 및/또는 F(ab)2, 뿐만 아니라 이중-, 삼중- 또는 보다 고도의 특이적 항체 구축물을 지칭할 것이며, 이들 모두는 본 발명의 모노클로날 항체와 거의 동일한 표적-결합 특이성을 갖는다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 항체 유도체는 디아바디, 낙타류 항체, 도메인 항체, scFv로 이루어진 2개의 쇄를 갖는 2가 동종이량체, IgA (J 쇄 및 분비 성분에 의해 연결된 2개의 IgG 구조), 상어 항체 (IgNAR), 신세계 영장류 프레임워크 플러스 비-신세계 영장류 CDR로 이루어진 항체, CH3+VL+VH를 포함하는 이량체화된 구축물, CDR을 포함하는 다른 스캐폴드 단백질 포맷, 및 항체 접합체 (예를 들어, 약물, 독소, 시토카인, 압타머, 핵산, 예컨대 데스옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 치료 폴리펩티드, 방사성동위원소 또는 표지에 연결된 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체)이다.
본원에 사용된 용어 "항체-유사 단백질"은 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 (예를 들어 Ig 루프의 돌연변이유발에 의해) 조작된 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항체-유사 단백질은 양쪽 말단에서 단백질 스캐폴드에 부착된 적어도 하나의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 제약은 항체-유사 단백질의 결합 친화도를 항체와 대등한 수준으로 크게 증가시킨다. 가변 펩티드 루프의 길이는 전형적으로 10 내지 20개의 아미노산으로 이루어진다. 스캐폴드 단백질은 우수한 용해도 특성을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 스캐폴드 단백질은 작은 구상 단백질이다. 항체-유사 단백질은 비제한적으로 아필린 단백질, 아피바디, 항-칼린, 및 설계된 안키린 반복 단백질을 포함한다 (Binz et al., 2005). 항체-유사 단백질은, 예를 들어 대형 파지 디스플레이 라이브러리로부터 패닝함으로써 돌연변이체의 대형 라이브러리로부터 유래될 수 있고, 정규 항체와 유사하게 단리될 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질은 구형 단백질 내의 표면-노출 잔기의 조합 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 항체-유사 단백질은, 예를 들어 12-15 kDa의 VH 또는 VL 도메인으로 이루어지고 완전한 항원-결합 특이성을 보유하는 가장 작은 기능적 항체 단편인 나노바디로도 공지된 단일-도메인 항체 단편 (dAb), 예컨대 예를 들어 낙타류 VH 도메인 (VHH), 및 IgNAR의 항원-결합 도메인인 V-NAR로 불리는 상어 VH 도메인을 또한 포함할 수 있다 (예를 들어 문헌 [English et al. Antibody Therapeutics, 2020, Vol. 3, No. 1 1-9] 참조).
본원에 사용된 용어 "Fab"는 항원 결합 영역을 포함하는 IgG 단편에 관한 것이며, 상기 단편은 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄로부터의 1개의 불변 및 1개의 가변 도메인으로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "F(ab)2"는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 Fab 단편으로 이루어진 IgG 단편에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "scFv"는 통상적으로 세린 (S) 및/또는 글리신 (G) 잔기를 포함하는 짧은 링커와 함께 연결된, 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합체인 단일-쇄 가변 단편에 관한 것이다. 이 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩티드의 도입에도 불구하고, 원래 이뮤노글로불린의 특이성을 보유한다.
변형된 항체 포맷은 예를 들어 이중- 또는 삼중특이적 항체 구축물, 항체-기반 융합 단백질, 면역접합체 등이다.
IgG, scFv, Fab 및/또는 F(ab)2는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 항체 포맷이다. 관련 구현가능 기술은 각각의 교과서로부터 이용가능하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체는 각각 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 유도체이고, 보다 바람직하게는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화 또는 인간 항체이다.
마우스로부터 유래된 모노클로날 항체 (mAb)는 이들이 항-약물 항체를 도출할 수 있는 또 다른 종으로부터의 단백질을 함유한다는 사실로 인해 원치않는 면역학적 부작용을 유발할 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 항체 인간화 및 성숙 방법은 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화도를 이상적으로 여전히 보유하면서 인간에게 적용될 때 최소 면역원성을 갖는 항체 분자를 생성하도록 설계되었다 (검토를 위해 문헌 [Almagro and Fransson 2008] 참조). 이들 방법을 이용하여, 예를 들어 마우스 mAb의 프레임워크 영역을 상응하는 인간 프레임워크 영역으로 대체한다 (소위 CDR 그라프팅). WO 200907861은 재조합 DNA 기술에 의해 비-인간 항체의 CDR 영역을 인간 불변 영역에 연결시킴으로써 인간화 형태의 마우스 항체를 생성하는 것을 개시한다. 의료 연구 협의회(Medical Research Council)에 의한 US 6548640은 CDR 그라프팅 기술을 기재하고, 셀테크(Celltech)에 의한 US 5859205는 인간화 항체의 생산을 기재한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 불변 도메인이 상이한 종으로부터 유래된 항체의 원래 항원-결합 가변 도메인으로 이루어진 항체에 관한 것이다. 항체, 특히 모노클로날 항체는 원래 가장 종종 마우스로부터 유래되었기 때문에, 전형적으로 키메라 항체는 인간에서 면역원성을 감소시키기 위해 인간 불변 도메인 및 마우스 가변 도메인을 함유한다. 임상 요법에 사용되는 키메라 항체의 예는 인플릭시맙, 리툭시맙 및 압식시맙을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 항체의 불변 영역 및/또는 프레임워크 영역의 적어도 일부분, 및 임의로 CDR 영역의 일부분이 인간 이뮤노글로불린 서열로부터 유래되거나 또는 그에 대해 조정된 것인 항체, 그의 단편 또는 유도체에 관한 것이다.
본원에 개시된 항체, 그의 항체 단편 또는 항체 유도체는 적절한 리간드 친화도를 유지하는, 특히 바람직한 VH- 및 VL-기반 항원-결합 영역의 인간화 서열을 포함할 수 있다. 상기 인간화 서열을 수득하기 위한 아미노산 서열 변형은 원래 항체의 CDR 영역 및/또는 프레임워크 영역 및/또는 항체 불변 영역 서열에서 발생할 수 있다.
상기 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 항체 유도체는 글리코실화될 수 있다. 글리칸은 중쇄의 아스파라긴 297에서 N-연결된 올리고사카라이드 쇄일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단편 또는 유도체는 숙주 세포를 본 발명에 따른 항체에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 생산될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 코딩 항체 서열을 예를 들어 CMV 프로모터와 같은 프로모터 및 인핸서 서열을 포함한 적합한 조절 유전자 요소의 제어 하에 놓음으로써 생산된다. 중쇄 및 경쇄 서열은 공동-형질감염된 개별 발현 벡터로부터, 또는 이중 발현 벡터로부터 발현될 수 있다. 상기 형질감염은 일시적 형질감염 또는 안정한 형질감염일 수 있다. 형질감염된 세포를 후속적으로 배양하여 형질감염된 항체 구축물을 생산한다. 안정한 형질감염이 수행되면, 적절하게 회합된 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 분비하는 안정한 클론이 적절한 검정, 예컨대 예를 들어 ELISA로 스크리닝함으로써 선택되고, 서브클로닝되고, 향후 생산을 위해 증식된다. 모노클로날 항체의 발현을 위한 포유동물 세포의 일시적 또는 안정한 형질감염을 위한 상응하는 방법은 선행 기술에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Jaeger et al. BMC Biotechnology 2013, 13:52]은 HEK293 세포에서의 재조합 항체의 일시적 생산 방법을 개시하고, 문헌 [Kamle et al. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods (2022) p.31-39]은 항체의 일시적 발현 및 정제를 위한 대안적 방법을 개시한다. 안정한 세포 클론을 생성하는 방법은 예를 들어 US 2010/0311116 A1 또는 US 7,491,532 B2에 개시되어 있다. 모노클로날 항체 생산을 위한 세포 조작에 대한 지침은 예를 들어 문헌 [Costa, R.A., et al. Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 74 (2010) 127-138]에 보고되어 있다. 문헌 [Kim, D.W., et al.]은 다기능적이고 효율적인 발현 시스템으로서 인간 신장 인자 1 알파 프로모터의 사용을 보고한다 (Gene 91 (1990) 217-223). 인트론-의존성 및 인트론 비의존성 유전자 발현의 비교는 문헌 [Buchman, A.R., et al. (Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 4395- 4405)]에 보고되어 있다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체는 각각 테툴로맙 (릴로토맙), 오틀레투주맙 (TRU-016), 및 나라툭시맙, BI 836826, 또는 Gen3009로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있거나 또는 이들로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 적어도 1개의 아마톡신 및 임의로 링커를 포함하는 접합체에서, 상기 항체 또는 그의 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질은 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하며:
서열식별번호: 1에 따른 CDRH1 (DYNMY),
서열식별번호: 2에 따른 CDRH2 (YIDPYNGDTTYNQKFKG),
서열식별번호: 3에 따른 CDRH3 (SPYGHYAMDY),
서열식별번호: 4에 따른 CDRL1 (KASQDVSTAVD),
서열식별번호: 5에 따른 CDRL2 (WASTRHT),
서열식별번호: 6에 따른 CDRL3 (RQHYSTPFT),
여기서 상기 CDR은 CD37, 바람직하게는 인간 CD37, 가장 바람직하게는 인간 CD37의 세포외 도메인, 특히 바람직하게는 인간 CD37의 EC1 및/또는 EC2에 포함되거나 또는 그에 의해 형성된 에피토프에 결합할 수 있도록 적합한 단백질 또는 아미노산 프레임워크로 포함되고, 여기서 EC1은 서열식별번호: 13의 아미노산 39-59를 포함하거나 또는 그로 이루어지고, EC2는 서열식별번호: 13의 아미노산 112-241을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 본원에 사용된 용어 "에피토프"는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 항원-결합 분자, 예컨대 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체에 의해, 보다 특히 상기 분자의 항원-결합 부위에 의해 인식되는 거대분자, 바람직하게는 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 에피토프는 항체 분자에 대한 최소 결합 부위를 규정하고, 따라서 항체 분자의 특이성의 표적을 나타낸다. 에피토프는 구조적 에피토프 또는 기능적 에피토프로서 추가로 정의될 수 있다. "구조적 에피토프"는 일반적으로 구조에 의해 밝혀진 항체와 밀접하게 접촉하는 영역 내의 아미노산 또는 다른 분자로 이루어진다. "기능적 에피토프"는 결합에 대한 강력한 기여를 하여 이들이 변화되는 경우에 결합 친화도의 감소가 있는 분자의 부분으로서 정의된다. 구조적 에피토프는 예를 들어 약 5개 아미노산 내지 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 100개 아미노산 길이, 또는 약 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 내지 약 50, 75, 100개 아미노산의 선형 연속 서열, 또는 폴리펩티드의 3차원 구조에 의해 형성되고 폴리펩티드의 불연속 아미노산을 포함할 수 있는 입체형태적 에피토프일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 접합체에 포함된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체는 서열식별번호: 13의 아미노산 39-59 및/또는 서열식별번호: 13의 아미노산 112-241에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 입체형태적 에피토프는 1개 초과의 CD37 단백질에 의해, 예를 들어 다량체를 형성하는 2, 3 또는 4개의 CD37 분자에 의해 형성될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 접합체에 포함된 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체는 서열식별번호: 13에 따른 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 CD37에 특이적으로 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 접합체에 포함된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체는 서열식별번호: 16에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 시노몰구스 CD37에 특이적으로 결합하지 않는다. 본원에 사용된 용어 "특이적 결합 없음" 또는 그의 임의의 문법적 등가물은 본 발명에 따른 접합체에 포함된 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체가 > 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M의 KD를 갖는다는 것을 나타낼 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체 또는 항체-유사 단백질은 각각 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 용어 "서열 유사성" 또는 "서열 동일성" (둘 다 본 발명 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용됨)은 서로에 대한 또는 참조 서열에 대한 2개 이상의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 유사성 또는 동일성을 지칭한다. 본 발명에 따른 서열 동일성은, 예를 들어 동일하거나 유사한 길이의 서열에 특히 적합한 각각의 참조 서열과 비교되는 각각의 서열의 전체 길이에 걸쳐 (소위 "전반적 정렬"), 또는 동일하지 않은 길이의 서열에 보다 적합한 보다 짧은 한정된 길이에 걸쳐 (소위 "국부 정렬") 결정될 수 있다. 상기 문맥에서, 질의 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들어 95%의 "서열 동일성"을 갖는 아미노산 서열은 대상 아미노산 서열이 질의 아미노산 서열의 각각의 100개의 아미노산당 최대 5개의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 것을 제외하고는 대상 아미노산 서열의 서열이 질의 서열과 동일한 것을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 질의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성의 서열을 갖는 아미노산 서열을 수득하기 위해, 대상 서열 내의 최대 5% (100개 중 5개)의 아미노산 잔기가 삽입되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 결실될 수 있다. 서열 동일성은 예를 들어 한 실시양태에 따라 서열식별번호: 7, 또는 서열식별번호: 8의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있고, 서열식별번호: 7, 또는 서열식별번호: 8에 대한 서열 동일성은 서열 동일성의 계산을 위해 서열식별번호: 7 내의 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 제외하고/하거나 서열 동일성의 계산을 위해 서열식별번호: 8 내의 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 제외하고 서열식별번호: 7, 또는 서열식별번호: 8의 프레임워크 영역의 길이에 걸쳐 계산된다.
2개 이상의 서열의 동일성 및 서열 유사성을 비교하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 2개의 서열이 동일한 백분율은 예를 들어 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 바람직하지만 비제한적인 예는 문헌 [Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 BLAST 패밀리의 프로그램 (또한 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 또는 Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402] 참조), 월드 와이드 웹 사이트 ncbi.nlm.nih.gov에서 NCBI의 홈페이지를 통해 접근가능한 프로그램 및 FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448)에 통합된다. 특정 정도로 다른 서열과 동일한 서열은 이들 프로그램에 의해 확인될 수 있다. 또한, 위스콘신 서열 분석 패키지 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395; Womble Methods Mol Biol. 2000;132:3-22)에서 이용가능한 프로그램, 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP를 사용하여 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 % 동일성을 결정할 수 있다. BESTFIT는 문헌 [Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197]의 "국소 서열 유사성" 알고리즘을 사용하고 2개의 서열 사이의 최상의 단일 유사성 영역을 발견한다. 예를 들어, "갭드 BLAST"는 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다. 임의의 상기 BLAST, 갭드 BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 상기 항체는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.
서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 본 발명의 항체는 본원에서 "chHH1-HDP"로 명명된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 기재된 바와 같은 상기 항체는 EU 넘버링 시스템 (Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969))에 따른 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및/또는 중쇄 265Cys, 바람직하게는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전자 조작되었고, 여기서 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 아마톡신은 각각 상기 중쇄 118Cys 또는 상기 중쇄 239Cys 또는 중쇄 265Cys 잔기를 통해 상기 항체에 연결되고, 보다 바람직하게는 상기 아마톡신은 상기 중쇄 265Cys를 통해 상기 항체에 연결된다. 따라서, 상기 유전자 조작된 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및/또는 중쇄 265Cys 잔기는 항체를 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 아마톡신에 커플링시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자 조작된" 또는 "유전자 조작"은 유전자 기술적 방법, 예컨대 예를 들어 문헌 [Biochem. J. (1986) Vol. 237: 1-7, 또는 J Biol Chem. (2015) Vol. 290(5): 2577-2592]에 기재된 바와 같은 부위-지정 돌연변이유발에 의한, 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 복귀, 또는 그의 임의의 조합의 의미에서의 주어진 또는 천연 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열 또는 그의 일부의 변형에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 치환"은 단백질의 아미노산 서열의 변형에 관한 것이며, 여기서 1개 이상의 아미노산이 동일한 수의 상이한 아미노산으로 대체되어, 원래 단백질과 상이한 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 생산한다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 크기, 전하, 극성 및/또는 입체형태로 인해 단백질의 구조 및 기능에 유의하게 영향을 미치지 않는 치환에 관한 것으로 이해된다. 이러한 의미에서 보존적 아미노산의 군은, 예를 들어 비-극성 아미노산 Gly, Ala, Val, Ile 및 Leu; 방향족 아미노산 Phe, Trp 및 Tyr; 양으로 하전된 아미노산 Lys, Arg 및 His; 및 음으로 하전된 아미노산 Asp 및 Glu를 나타낸다. 예시적인 아미노산 치환은 하기 표 1에 제시된다.
Figure pct00001
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 기재된 바와 같은 상기 접합체의 항체는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 234Ala 및/또는 235Ala를 포함하도록 유전자 조작되었다.
본 발명의 보다 더 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 기재된 바와 같은 상기 접합체의 항체는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys, 234Ala 및 235Ala를 포함하도록 유전자 조작되었고, 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 아마톡신은 상기 중쇄 265Cys 잔기를 통해 상기 항체에 연결된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 기재된 바와 같은 상기 접합체의 항체는 서열식별번호: 10 또는 11에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 10 또는 11에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 10 또는 11에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.
서열식별번호: 10에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체는 본원에서 "chHH1-HDP-D265C"로 명명된다. 이 항체의 중쇄는 EU 넘버링 시스템에 따른 유전자 조작된 265Cys 잔기를 포함한다.
서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체는 본원에서 "chHH1-HDP-LALA-D265C"로 명명된다. 이 항체의 중쇄는 EU 넘버링 시스템에 따라 유전자 조작된 234Ala 및 235Ala 잔기 및 265Cys 잔기를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 접합체의 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 항체 유도체는 CD37 분자의 세포외 도메인에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 CD37의 세포외 도메인에 결합하는 상기 기재된 바와 같은 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 접합체는 10 x 10-9 M, 9 x 10-9 M, 8 x 10-9 M, 7 x 10-9 M, 6 x 10-9 M, 5 x 10-9 M, 4 x 10-9 M, 3 x 10-9 M, 2 x 10-9 M, 바람직하게는 10 x 10-10 M, 9 x 10-10 M, 8 x 10-10 M, 7 x 10-10 M, 6 x 10-10 M, 5 x 10-10 M, 4 x 10-10 M, 3 x 10-10 M, 2 x 10-10 M보다 우수한, 보다 바람직하게는 10 x 10-11 M, 9 x 10-11 M, 8 x 10-11 M, 7 x 10-11 M, 6 x 10-11 M, 5 x 10-11 M, 4 x 10-11 M, 3 x 10-11 M, 2 x 10-11 M, 또는 1 x 10-11 M보다 우수한 IC50의 세포독성 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 아마톡신은 상기 항체의 임의의 자연 발생 Cys 잔기를 통해, 바람직하게는 상기 항체의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 임의의 자연 발생 Cys 잔기를 통해, 및/또는 디술피드 연결을 통해 상기 항체에 연결되고, 예를 들어 문헌 [Behrens et al. Mol Pharm. 2015 November 02; 12(11): 3986-3998]에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 존재하는 경우에 상기 링커는 조작된 시스테인 잔기 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 및/또는 중쇄 265Cys 중 1개 이상을 통해 상기 항체에 연결되거나 커플링된다. 상기 시스테인-조작된 항체에 대한 링커의 접합은 예를 들어 WO 2016/142049 A1에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 기재된 바와 같은 상기 접합체는 링커를 포함하며, 여기서 상기 링커는 비-절단가능한 링커 또는 절단가능한 링커일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 아마톡신을 접합시키는 링커는 비-절단가능하다. 비-절단가능한 링커는 분해 (예를 들어, 단백질분해)에 내성인 안정한 화학 결합을 포함한다. 일반적으로, 비-절단가능한 링커는 표적 세포 내부에서 단백질분해적 분해를 필요로 하고, 높은 세포외 안정성을 나타낸다. 본원에 사용하기에 적합한 비-절단가능한 링커는 결합, -(C=O)-, C1-C6 알킬렌, C1-C6 헤테로알킬렌, C2-C6 알케닐렌, C2-C6 헤테로알케닐렌, C2-C6 알키닐렌, C2-C6 헤테로알키닐렌, C3-C6 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 및 그의 조합으로부터 선택된 1개 이상의 기를 추가로 포함할 수 있고, 이들 각각은 임의로 치환될 수 있고/거나 1개 이상의 탄소 원자 대신에 1개 이상의 헤테로원자 (예를 들어, S, N, 또는 O)를 포함할 수 있다. 이러한 기의 비제한적 예는 (CH2)p, (C=O)(CH2)p, 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG; (CH2CH2O)p), 단위를 포함하며, 여기서 p는 각 경우에 독립적으로 선택된 1-6의 정수이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-절단가능한 링커는 결합, -(C=O)-, -C(O)NH- 기, -OC(O)NH- 기, C1-C6 알킬렌, C1-C6 헤테로알킬렌, C2-C6 알케닐렌, C2-C6 헤테로알케닐렌, C2-C6 알키닐렌, C2-C6 헤테로알키닐렌, C3-C6 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, -(CH2CH2O)p- 기 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 p는 1-6의 정수이다.
일부 실시양태에서, 각각의 C1-C6 알킬렌, C1-C6 헤테로알킬렌, C2-C6 알케닐렌, C2-C6 헤테로알케닐렌, C2-C6 알키닐렌, C2-C6 헤테로알키닐렌, C3-C6 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 또는 헤테로아릴렌에는 O, S 및 N으로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자가 임의로 개재될 수 있고, 각 경우에 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 알크아릴, 알킬 헤테로아릴, 아미노, 암모늄, 아실, 아실옥시, 아실아미노, 아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 우레이도, 카르바메이트, 아릴, 헤테로아릴, 술피닐, 술포닐, 히드록실, 알콕시, 술파닐, 할로겐, 카르복시, 트리할로메틸, 시아노, 히드록시, 메르캅토, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 비-절단가능한 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-12 또는 2-6 또는 6-12의 정수, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 비-절단가능한 링커는 -(CH2)n 단위를 포함하며, 여기서 n은 4, 5 또는 6이고, 보다 바람직하게는 n은 6이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 비-절단가능한 링커는 하기 화학식에 의해 나타내어지는 -(CH2)n-이고, 여기서 n=6이다:
Figure pct00002
.
일부 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 비-절단가능한 모이어티 또는 링커는 브로모 아세트아미드, 아이오도 아세트아미드, 메틸술포닐벤조티아졸, 4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노 기 메틸-술포닐 페닐테트라졸 또는 메틸술포닐 페닐옥사디아졸, 피리딘-2-티올, 5-니트로피리딘-2-티올, 메탄티오술포네이트 또는 말레이미드로부터 선택된 티올 반응성 기를 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 티올 반응성 기는 하기 도시된 바와 같은 말레이미드 (말레이미딜 모이어티)이다:
Figure pct00003
바람직한 실시양태에 따르면, 티올 반응성 기 말레이미드 (말레이미딜 모이어티)를 포함하는 본 발명의 비-절단가능한 링커는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 아마톡신에 커플링되기 전의 구조를 가지며:
Figure pct00004
,
비-절단가능한 링커인 1-n-헥실-말레이미드로도 지칭될 수 있다. 링커 말단의 파상선은 아마톡신에 대한 부착 지점을 나타낸다. 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 항체의 반응성 시스테인, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 중쇄의 Cys265에 대한 링커-아마톡신의 접합 후에, 상기 링커는 하기 구조를 가지며:
Figure pct00005
,
여기서 S는 인간 CD37에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기를 나타내는 황 원자이다. 링커 말단의 파상선은 아마톡신에 대한 부착 지점을 나타낸다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 관련하여 특히 유용한 상기 링커 모이어티 및 아마톡신-링커 접합체는, 예를 들어 특허 출원 공개 WO 2014/043403 A1 및 특허 출원 공개 번호 WO 2017/149077에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명에 따른 "절단가능한 링커"는 적어도 1개의 절단 부위를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 용어 "절단 부위"는 특정한 조건 하에 정의된 위치에서의 특이적 절단에 감수성인 모이어티를 지칭할 것이다. 상기 조건은, 예를 들어 특정 신체 또는 세포 구획에서의 특정 효소 또는 환원성 환경이다. 예를 들어, 환원 조건 하에 절단되는 링커는 예를 들어 문헌 [Bargh et al. Chem Soc Rev. 2019 Aug 12;48(16):4361-4374]에 개시된 바와 같은 N-아실 히드라존-기재 링커를 포함할 수 있다. 환원 조건 하에 절단가능한 링커는, 예를 들어 디술피드를 포함한다. 예를 들어, SATA (N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔), SPDB 및 SMPT를 사용하여 형성될 수 있는 것을 포함한 다양한 디술피드 링커가 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987)] 참조). 또한, 미국 특허 번호 4,880,935를 참조하고, 그의 각각의 개시내용은 공유 접합에 적합한 링커에 관한 것이면 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 절단가능한 링커는 높은 Fe(II) 농도 하에 절단되고, 예를 들어 Fe(II)-반응성 1,2,4-트리옥솔란 스캐폴드 (TRX)를 포함한다. 이러한 링커는 종양 세포 내의 보다 높은 Fe(II) 농도를 특징으로 하는 종양의 치료에 특히 유용할 수 있다. 상응하는 링커는 예를 들어 문헌 [Spangler et al. Mol Pharm. 2018 May 7;15(5):2054-2059]에 개시되어 있다. 예를 들어 ADC 페이로드의 리소솜 방출이 바람직한 경우에 사용될 수 있는 링커는 문헌 [Pillow et al. Chem. Sci., 2017, 8, 366-370]에 개시된 바와 같은 디술피드 접합체를 포함한다. 산성 조건 하에 가수분해가능한 대안적 링커는 예를 들어 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니트산 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661]을 참조하고, 그의 각각의 개시내용은 공유 접합에 적합한 링커에 관한 것이면 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 링커는 중성 pH 조건, 예컨대 혈액 중의 조건 하에 절단되지 않지만, 절단가능하거나 또는 리소솜의 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서 자기-절단을 겪는다.
본 발명에 따른 효소적으로 절단가능한 모이어티는 또한 "효소에 의해 절단가능한" 것으로 지칭될 수 있다. 링커의 효소적 절단은 내재화 후에 본원에 개시된 바와 같은 표적화 모이어티 또는 항체 또는 그의 대사물에 접합된 독소 적재물의 세포내 방출을 유발한다 (문헌 [Dubowchik et al., Bioconjug Chem. 13 (2002) 855-69] 참조).
상기 절단가능한 링커는 효소적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 프로테아제-절단가능한 링커, 및 화학적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 디술피드 가교를 포함하는 링커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 절단 부위는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 효소적으로 절단가능한 모이어티이다. 바람직하게는, 상기 효소적으로 절단가능한 모이어티는 발린-알라닌 (Val-Ala), 발린-시트룰린 (Val-Cit), 발린-리신 (Val-Lys), 발린-아르기닌 (Val-Arg) 디펩티드, 페닐알라닌-리신-글리신-프롤린-류신-글리신 (Phe Lys Gly Pro Leu Gly) 또는 알라닌-알라닌-프롤린-발린 (Ala Ala Pro Val) 펩티드, 또는 β-글루쿠로니드 또는 β-갈락토시드를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 절단 부위는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제 및 아스파르트산 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제에 의해 절단가능할 수 있다.
티올 프로테아제로도 공지된 시스테인 프로테아제는 촉매 트리아드(triad) 또는 디아드(dyad)에서 친핵성 시스테인 티올을 수반하는 공통적인 촉매 메카니즘을 공유하는 프로테아제이다.
메탈로프로테아제는 촉매 메카니즘이 금속을 수반하는 프로테아제이다. 대부분의 메탈로프로테아제는 아연을 필요로 하지만, 일부는 코발트를 사용한다. 금속 이온은 3개의 리간드를 통해 단백질에 배위된다. 금속 이온을 배위하는 리간드는 히스티딘, 글루타메이트, 아스파르테이트, 리신 및 아르기닌에 따라 달라질 수 있다. 제4 배위 위치는 불안정한 물 분자에 의해 차지된다.
세린 프로테아제는 단백질 내의 펩티드 결합을 절단하는 효소이고; 세린은 효소의 활성 부위에서 친핵성 아미노산으로서 작용한다. 세린 프로테아제는 그의 구조에 기초하여 2개의 광범위한 카테고리에 속한다: 키모트립신-유사 (트립신-유사) 또는 서브틸리신-유사.
트레오닌 프로테아제는 활성 부위 내에 트레오닌 (Thr) 잔기를 보유하는 단백질분해 효소의 패밀리이다. 이러한 부류의 효소의 원형 구성원은 프로테아솜의 촉매 서브유닛이지만, 아실트랜스퍼라제는 수렴적으로 동일한 활성 부위 기하구조 및 메카니즘을 진화시켰다.
아스파르트산 프로테아제는 그의 펩티드 기질의 촉매작용을 위해 1개 이상의 아스파르테이트 잔기에 결합된 활성화된 물 분자를 사용하는 촉매 유형의 프로테아제 효소이다. 일반적으로, 이들은 활성 부위에 2종의 고도로 보존된 아스파르테이트를 갖고, 산성 pH에서 최적으로 활성이다. 거의 모든 공지된 아스파르틸 프로테아제는 펩스타틴에 의해 억제된다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 절단가능한 부위는 카텝신 A 또는 B, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 엘라스타제, β-글루쿠로니다제 및 β-갈락토시다제, 바람직하게는 카텝신 B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 작용제에 의해 절단가능하다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 효소적으로 절단가능한 링커는 Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함하고, 특히 여기서 절단가능한 링커는 디펩티드와 아마톡신 사이에 p-아미노벤질 (PAB) 스페이서를 추가로 포함한다:
Figure pct00006
.
따라서, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체는 상기 개시된 바와 같은 디펩티드-PAB 모이어티 Phe-Lys-PAB, Val-Lys-PAB, Phe-Ala-PAB, Val-Ala-PAB, Phe-Cit-PAB, 또는 Val-Cit-PAB 중 어느 하나를 포함하는 효소적으로 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 접합체의 절단가능한 링커는 디펩티드-PAB 모이어티 Val-Ala-PAB를 포함하며:
Figure pct00007
,
여기서 PAB 모이어티는 아마톡신에 연결된다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 개시된 바와 같은 본 발명의 링커는 브로모 아세트아미드, 아이오도 아세트아미드, 메틸술포닐벤조티아졸, 4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노 기 메틸-술포닐 페닐테트라졸 또는 메틸술포닐 페닐옥사디아졸, 피리딘-2-티올, 5-니트로피리딘-2-티올, 메탄티오술포네이트 또는 말레이미드로부터 선택된 티올 반응성 기를 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 티올 반응성 기는 하기 도시된 바와 같은 말레이미드 (말레이미딜 모이어티)이다:
Figure pct00008
.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 링커는 하기 구조를 포함한다.
Figure pct00009
.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 절단 부위는 디술피드 결합이고, 특이적 절단은 환원 환경, 예를 들어 세포내 환원 환경, 예컨대 예를 들어 산성 pH 조건에 의해 수행된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 기재된 바와 같은 상기 접합체에서, 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 표적 결합 모이어티는 (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자, 또는 (ii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 4의 6'-C-원자를 통해 상기 아마톡신에 연결된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 접합체는 (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 접합체는 링커-아마톡신 모이어티로서 각각 하기 화학식 (I) 내지 (XI)의 화합물 중 임의의 것을 포함한다:
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
.
또한, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 접합체는 하기 화학식 (XII) 내지 (XXII) 중 어느 하나에 따른 적어도 1개의 아마톡신 링커 모이어티에 접합된 표적 결합 모이어티로서 항체를 포함하며:
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
여기서 상기 아마톡신 링커 모이어티는 티오에테르를 통해 항체의 시스테인 잔기의 티올 기에 커플링되고, 여기서 n은 바람직하게는 1 내지 7, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7이고, 바람직하게는 n은 1, 2 또는 4이고, 여기서 n은 상기 항체에 연결된 아마톡신-링커 모이어티의 수를 나타낸다. 항체의 시스테인 잔기의 술프히드릴 기에 대한 반응성 말레이미딜-잔기를 포함하는 상응하는 아마톡신 링커 모이어티의 접합은 예를 들어 문헌 [Juntula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 가장 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 접합체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(i) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXIII),
(ii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XIII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXIV),
(iii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XIV)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXV),
(iv) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XV)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXVI),
(v) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XVI)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXVII),
(vi) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XVII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXVIII),
(vii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XVIII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXIX),
(viii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XIX)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXX),
(ix) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XX)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXXI),
(x) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XXI)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXXII),
(xi) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XXII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXXIII),
여기서 접합체 (XXIII) 내지 (XXXIII)에 대해 n은 1 내지 2이다. 예를 들어, 접합체 (XXIII) - (XXXIII)은 티오에테르 연결을 통해 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기에 연결된 본원에 개시된 바와 같은 아마톡신-링커 모이어티 (XII)-(XXII) 중 어느 하나를 1개 (n=1) 또는 2개 (n=2) 포함할 수 있다. 따라서, 상기 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체는 약물-대-항체 비 (DAR)가 n=1인 경우 DAR=1, 또는 n=2인 경우 DAR=2일 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 항체-약물-접합체의 제조에 사용하기 위한 항체를 제공하며, 여기서 항체는 각각의 중쇄가 서열식별번호: 7에 상응하거나 또는 그에 대해 적어도 90%, 95% 유사한 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 경쇄가 서열식별번호: 8에 상응하거나 또는 그에 대해 적어도 90%, 95% 유사한 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 개시된 본 발명에 따른 항체-약물-접합체의 제조에 사용하기 위한 항체는 각각의 중쇄가 바람직하게는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 서열식별번호: 10 또는 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 중쇄, 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다.
항체-약물-접합체, 예컨대 예를 들어 본원에 개시된 것의 제조에서의 본 발명의 항체의 사용은 항체의 Cys265에 대한 말이미드-술프히드릴 연결을 통해 링커-독소 접합체, 예컨대 본원에 개시된 링커-아마톡신 접합체의 부위 특이적 접합을 달성하여 부위-특이적 항체-약물 접합체를 높은 수율 및 순도로 달성하는 데 특히 유리하다. 또한, 아미노산 치환 L234A, L235A는 FcγRI, II, II에 대한 본 발명의 항체의 결합을 감소시킴으로써, 상기 항체의 이펙터 기능을 감소시키며, 이는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP), 뿐만 아니라 보체-의존성 세포독성 (CDC)이다. 생성된 접합체, 예를 들어 약 DAR=1 또는 약 DAR=2로 제어된 접합체의 보다 높은 순도 및/또는 균질성 및 이펙터 기능의 감소 둘 다는 본 발명의 항체-약물-접합체의 보다 큰 치료 지수 (TI)를 발생시킨다. 본원에 사용된 용어 "치료 지수"는 개체의 50%가 약물의 독성 효과를 나타내는 독성 용량 대 개체의 50%가 치료 효과를 나타내는 약물의 최소 농도 또는 양의 비를 지칭한다. TI는 예를 들어 또한 TI=TD50:ED50처럼 표현될 수 있고, 약물의 상대적 안전성의 정량적 측정치이다. 이는 치료 효과를 유발하는 치료제의 양을 독성을 유발하는 양과 비교하는 것이다. 따라서, 보다 큰 TI는 주어진 약물의 증가된 상대적 안전성에 상응한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 상기 접합체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
상기 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 완충제, 계면활성제, 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
수성 형태에서는, 상기 제약 제제는 즉시 투여 가능할 수 있는 반면, 동결건조 형태의 상기 제제는 투여 전에, 예를 들어 보존제, 예컨대 예를 들어 벤질 알콜, 항산화제, 예컨대 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 레티닐 팔미테이트, 및 셀레늄, 아미노산 시스테인 및 메티오닌, 시트르산 및 시트르산나트륨, 합성 보존제, 예컨대 파라벤 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있는 주사용수의 첨가에 의해 액체 형태 내로 전달될 수 있다.
상기 제약 제제는, 예를 들어 아미노산, 당 폴리올, 디사카라이드 및/또는 폴리사카라이드일 수 있는 1종 이상의 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제약 제제는 1종 이상의 계면활성제, 1종 이상의 등장화제, 및/또는 1종 이상의 금속 이온 킬레이트화제, 및/또는 1종 이상의 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 제약 제제는 적어도 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 상기 접합체는 특정 기간에 걸쳐 생물학적 활성제의 지속 방출을 가능하게 하는 데포 제제로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 이전 측면에 따른 상기 제제를 포함하는 1차 포장, 예컨대 사전충전된 시린지 또는 펜, 바이알 또는 주입 백이 제공된다.
사전충전된 시린지 또는 펜은 동결건조 형태 (이는 이어서 투여 전에, 예를 들어 주사용수로 가용화되어야 함) 또는 수성 형태의 제제를 함유할 수 있다. 상기 시린지 또는 펜은 종종 단일 사용을 위한 일회용 물품이고, 0.1 내지 20 ml의 부피를 가질 수 있다. 그러나, 시린지 또는 펜은 또한 다중-사용 또는 다중-용량 시린지 또는 펜일 수 있다.
상기 바이알은 또한 동결건조 형태 또는 수성 형태의 제제를 함유할 수 있고, 단일 또는 다중 사용 장치로서 기능할 수 있다. 다중 사용 장치로서, 상기 바이알은 보다 큰 부피를 가질 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 제약 조성물은 예를 들어 주입 백을 통한 투여를 위해 제공될 수 있다. 주입 백은 전형적으로 수성 형태의 제제를 함유하고, 20 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml 내지 125 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 750 ml, 1000 ml, 2500 ml, 5000 ml, 또는 125 ml, 250 ml 내지 500 ml, 600 ml, 750 ml의 부피를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 특히 비-호지킨 림프종 (NHL), 여포성 림프종, 미만성 대 B 세포 비-호지킨 림프종 (DBNHL), 하기를 포함한 비-호지킨 림프종의 하위유형: 외투 세포 림프종 (MCL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 리히터 증후군, 원발성 피부 변연부 림프종 (PCMZL), 모발상 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 류마티스 관절염, 다발혈관염 및 현미경적 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 심상성 천포창의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 상기 접합체 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환은 염색체 17p13.1의 결실을 특징으로 하며, 여기서 결실은 반접합성 또는 동형접합성 (비접합성)이다.
따라서, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물로 치료될 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 B-세포는 염색체 17p13.1의 결실을 특징으로 하며, 여기서 결실은 반접합성 또는 동형접합성이다. 본원에 사용된 용어 "결실"은 염색체 17p13.1의 전체 게놈 유전자좌의 상실, 또는 TP53 유전자 및 POLR2A 유전자를 포괄하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Mb의 상실을 지칭한다. 상기 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환은 예를 들어 추가의 세포유전 이상, 예컨대 전위, 예컨대 t(11;14), t(4;14), t(14;16) 또는 t(14;20)를 보유할 수 있다.
다발성 골수종에 대한 표준 관리 치료 옵션은 예를 들어 문헌 [Rajkumar and Kumar Blood Cancer Journal (2020) 10:94]에 기재된 바와 같은 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물로 치료될 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 B-세포는 POLR2A 유전자, 또는 TP53 및 POLR2A 유전자의 반접합성 손실을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 사용되는 용어 "반접합성"은 일반적인 2개보다는 유전자 또는 염색체 절편의 단지 하나의 전체 대립유전자를 갖는 개체 또는 세포를 지칭한다. 반접합체는 그의 게놈이 대립유전자가 야생형이든 또는 돌연변이체이든 주어진 유전자좌에서 단지 1개의 전체 대립유전자를 포함하는 세포 또는 유기체를 지칭하며, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 세포는 염색체 유전자좌 17p13에 대한 반접합체이고, 바람직하게는 상기 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 세포는 유전자 TP53 및 POLR2A에 대한 반접합체이다. 본원에 사용된 "TP53"은 전사 활성화, DNA 결합 및 올리고머화 도메인을 포함하는 종양 억제 단백질 (P53)을 코딩하는 "종양 단백질 53" 유전자를 지칭한다. 코딩된 단백질은 다양한 세포 스트레스에 반응하여 표적 유전자의 발현을 조절함으로써, 세포 주기 정지, 아폽토시스, 노화, DNA 복구, 또는 대사의 변화를 유도한다. 이 유전자에서의 돌연변이는 유전성 암, 예컨대 리-프라우메니 증후군을 포함한 다양한 인간 암과 연관된다.
종양 억제 유전자 TP53은 대다수의 인간 종양에서 돌연변이 또는 결실에 의해 빈번하게 불활성화된다. 본원에 사용된 "POLR2A"는 인간 RNA 폴리머라제 II 복합체의 가장 큰 서브유닛을 코딩하고 mRNA 합성에서 폴리머라제 활성에 필수적인 POLR2A 유전자를 지칭한다. 염색체 17p13의 반접합성 손실, 예를 들어 del(17p13.1)은 문헌 [Merz et al. Am J Hematol. 2016 Nov;91(11):E473-E477]에 개시된 바와 같은 형광 계내 혼성화 (FISH)에 의해 검출될 수 있다.
상기 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 세포는 예를 들어 TP53 및/또는 POLR2A의 상실과 관련하여 균질한 세포 군이 아닐 수 있다. 예를 들어, 상기 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 세포의 약 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60% 내지 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 약 70%, 75%, 80%, 85% 내지 약 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 100%가 del(17p13.1), TP53 및/또는 POLR2A에 대해 반접합성일 수 있거나, 또는 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 세포의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%가 del(17p13), 또는 TP53 및/또는 POLR2A에 대해 반접합성이다. 염색체 17p13.1, 또는 TP53 및/또는 POLR2A의 반접합성 상실을 특징으로 하는 B 림프구-연관 악성종양의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물은, 염색체 17p13.1, TP53 및/또는 POLR2A의 반접합성 상실을 특징으로 하는 세포가 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물에 대해 적어도 10배, 25배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1000배 더 감수성이기 때문에 특히 유리하다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물의 적어도 10배, 25배, 50배, 100배, 250배, 500배 또는 1000배 미만이 목적하는 치료 효과를 달성하는 데 사용될 수 있기 때문에, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환이 TP53 및/또는 POLR2A의 상실에 대해 반접합성인 세포를 포함하거나 또는 그로 이루어지는지 여부를 결정하는 데 유익할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물에 대한 감수성을 평가하기 위한 검정은 예를 들어 문헌 [Nature. 2015 April 30; 520(7549): 697-701]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 접합체 또는 제약 조성물은 상기 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에서 면역 체크포인트 억제제와 조합되어 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "면역 체크포인트 억제제" 또는 간단히 "체크포인트 억제제" 또는 "ICI"는 면역 세포 (예를 들어, T 세포)의 표면 상에서 발견되는 면역 체크포인트 수용체 단백질 또는 분자의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나 또는 그의 기능을 억제하는 임의의 작용제 또는 화합물, 또는 가용성 화합물로서 또는 면역 세포-억제 세포의 표면 상에서 상기 면역 체크포인트 수용체 단백질 또는 분자에 결합하는 리간드의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나 그의 기능을 억제하는 임의의 작용제 또는 화합물을 지칭한다. 이러한 억제 세포는, 예를 들어 암 세포, 조절 T 세포, 면역관용성 항원 제시 세포, 골수-유래 억제 세포, 종양-연관 대식세포, 또는 암-연관 섬유모세포일 수 있다. 상기 리간드는 전형적으로 면역 세포 상의 면역 체크포인트 수용체 단백질 또는 분자에 결합할 수 있다. 면역 체크포인트 수용체 단백질-리간드 쌍의 비제한적 예는 PD-1, PD-L1이다. PD-1은 T-세포 상에서 발견되는 면역 체크포인트 수용체 단백질이다. 암 세포에 의해 과다-발현될 수 있는 PD-L1은 PD-1에 결합하고, 암 세포가 숙주 면역계 공격을 회피하는 것을 돕는다. 따라서, 면역 체크포인트 억제제는 T 세포 상의 PD-1을 차단함으로써 (즉, PD-1 억제제로서 작용함) 또는 암 세포 상의 PD-L1을 차단함으로써 (즉, PD-L1 억제제로서 작용함) PD-1/PD-L1 상호작용을 방지함으로써, 항종양 T-세포 활성을 유지 또는 회복시키거나 또는 억제 암 세포 활성을 차단한다.
면역 체크포인트 수용체 또는 분자는, 예를 들어 PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, OX40, GITR, ICOS, CD276 (B7-H3), B7-H4 (VTCN1), IDO, KIR, CD122, CD137, CD94/NKG2A, CD80, CD86, 갈렉틴-3, LSECtin, CD112, 세아캄-1, Gal-9, PtdSer, HMGB1, HVEM, CD155 및 BTLA (CD272)를 비제한적으로 포함한다.
면역 체크포인트 억제제는 면역 억제 수용체, 예컨대 상기 개시된 것, 예를 들어 PD-1의 길항제를 포함하며, 이는 이 경우에 PD-1/PD-L1 경로에서 PD-1 또는 PD-L1을 억제한다. PD-1 또는 PD-L1 억제제의 예는, 비제한적으로, 인간 PD-1 기능을 길항 또는 차단하는 인간화 또는 인간 항체 예컨대 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, JTX-4014, 스파르탈리주맙, 신틸리맙 (IBI308), 도스타를리맙 (TSR-042, WBP-285), INCMGA00012 (MGA012), AMP-224, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, BCD-100, AGEN-2034, 토리팔리맙 (TAB001, JS001), 또는 AMP-514 (MEDI0680), 뿐만 아니라 완전 인간 항체 예컨대 PD-1 차단 니볼루맙 또는 차단 PD-L1 예컨대 아벨루맙, 두르발루맙, 코시벨리맙 (CK-301), WBP-3155 (CS1001) 및 아테졸리주맙 또는 재조합 항-PD-L1 프로바디 CX-072를 포함한다.
예를 들어 문헌 [Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369(2):134-44]에 개시된 펨브롤리주맙 (이전에 람브롤리주맙으로도 공지됨; 상표명 키트루다(Keytruda); MK-3475로도 공지됨)은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG4 모노클로날 항체이고; 이는 Fc-매개 세포독성을 방지하도록 설계된 C228P에서의 돌연변이를 함유한다. 펨브롤리주맙은 예를 들어 US 8,354,509 및 WO 2009/114335에 개시되어 있다. 이는 절제불가능한 또는 전이성 흑색종을 앓고 있는 환자 및 전이성 NSCLC를 갖는 환자의 치료에 대해 FDA에 의해 승인되었다.
니볼루맙 (CAS 등록 번호: 946414-94-4; BMS-936558 또는 MDX1106b)은 검출가능한 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)이 결여된, PD-1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙은 예를 들어 US 8,008,449 및 WO 2006/121168에 개시되어 있다. 이는 절제불가능한 또는 전이성 흑색종, 전이성 NSCLC 및 진행성 신세포 암종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다.
피딜리주맙 (CT-011; 큐어 테크(Cure Tech))은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체이다. 피딜리주맙은 예를 들어 WO 2009/101611에 개시되어 있다.
PD1-1 내지 PD1-5는 WO 2018/220169에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 INN은 또한, 미국에서 42 USC §262 서브섹션 (k) 하에 인가된 바이오시밀러 항체 및 다른 관할권에서의 등가의 규정을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 개시된 바와 같은 상응하는 기원 항체의 모든 바이오시밀러 항체를 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물과 조합하여 본 발명에 따라 사용하기 위한 면역 체크포인트 억제제는 예를 들어 또한 소분자 (유기) 화합물 또는 대분자, 예컨대 펩티드 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 소분자 면역 체크포인트 억제제는 WO 15033301 A1에 개시된 바와 같은 CA-170 (그의 전구체 AUNP-12 포함); 또는 예를 들어 BMS-8 (CAS 번호 1675201-90-7)을 포함한다. 본 발명의 적어도 한 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 항원 결합 유도체이다. 바람직한 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 항원 결합 유도체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 2종의 면역 체크포인트 억제제와 조합되거나 또는 그를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 접합체 또는 제약 조성물은 상이한 면역 체크포인트를 표적화하는 2종 이상의 면역 체크포인트 억제제, 예를 들어 CTLA-4 및 PD-1/PD-L1, PD-1/PD-L1 및 TIGIT, PD-1/PD-L1 및 OX40, PD-1/PD-L1 및 VISTA, CTLA4 및 TIGIT, CTLA4 및 OX40과 조합되거나 또는 그를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 접합체 또는 제약 조성물은 예를 들어 면역 체크포인트 억제제의 하기 조합 중 하나와 조합되거나 또는 그를 포함할 수 있다:
CTLA4 - PD-1/PD-L1:
니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 이필리무맙
PD-1/PD-L1 및 TIGIT:
니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 티라골루맙; 또는 니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 BMS986207;
PD-1/PD-L1 및 OX40:
니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 BMS986178
PD-1/PD-L1 및 VISTA:
니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 CI-8993
OX40 및 PD-1/PD-L1:
니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 MEDI0562, 또는 니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 PF04518600
TIM-3 및 PD-1/PD-L1:
니볼루맙, 아벨루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, 두르발루맙, 아테졸리주맙 중 하나와 조합된 MBG453
CTLA4 및 TIGIT:
티라골루맙 또는 BMS986207 중 하나와 조합된 이필리무맙.
CTLA4 및 OX40:
MEDI0562 또는 PF04518600 중 하나와 조합된 이필리무맙.
상기 개시된 바와 같은 PD-1, PD-L1 및 CTLA4 억제제의 군으로부터 선택된 체크포인트 억제제는 본 발명에 따른 접합체 또는 제약 조성물이 단지 1종의 면역 체크포인트 억제제와 조합되거나 또는 그를 포함하는 경우에 바람직한 면역 체크포인트 억제제이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 접합체는 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위해 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, JTX-4014, 스파르탈리주맙, 신틸리맙 (IBI308), 도스타를리맙 (TSR-042, WBP-285), INCMGA00012 (MGA012), AMP-224, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, BCD-100, AGEN-2034, 토리팔리맙 (TAB001, JS001), 또는 AMP-514 (MEDI0680), 아벨루맙, 두르발루맙, 코시벨리맙 (CK-301), WBP-3155 (CS1001) 및 아테졸리주맙, CX-072, 이필리무맙 중 하나와 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위해 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, JTX-4014, 스파르탈리주맙, 신틸리맙 (IBI308), 도스타를리맙 (TSR-042, WBP-285), INCMGA00012 (MGA012), AMP-224, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5, BCD-100, AGEN-2034, 토리팔리맙 (TAB001, JS001), 또는 AMP-514 (MEDI0680), 아벨루맙, 두르발루맙, 코시벨리맙 (CK-301), WBP-3155 (CS1001) 및 아테졸리주맙, CX-072, 이필리무맙 중 하나와 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종; 원발성 종격 B-세포 림프종, 전형적 호지킨 림프종; 다발성 골수종의 치료에 사용하기 위한 펨브롤리주맙과 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 미만성 대 B-세포 림프종, B-세포 비-호지킨 림프종 또는 여포성 림프종의 치료에 사용하기 위한 니볼루맙과 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종 또는 외투 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한 이필리무맙과 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 전형적 호지킨 림프종; B-세포 비-호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종; 다발성 골수종의 치료에 사용하기 위한 이필리무맙 및 니볼루맙과 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한 아테졸리주맙과 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한 아벨루맙과 조합된다.
한 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한 두르발루맙과 조합된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제의 투여를 임의로 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 환자에서의 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기서 환자는 치료 요법 R-CHOP, CHOP, 하이퍼-CVAD, 또는 CVD 중 하나를 사용한 선행 표준 관리 치료를 받았다.
예를 들어, 표준 관리 치료는 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL)의 치료에 사용하기 위한 표준 요법, R-CHOP (리툭시맙 플러스 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)를 포함할 수 있다. 외투 세포 림프종에 대한 표준 관리 치료는 예를 들어 1) 고-용량 메토트렉세이트 플러스 시타라빈과 교호하는, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 (아드리아마이신) 및 덱사메타손을 포함하는 "하이퍼-CVAD" 치료 요법, 또는 2) 리툭시맙 및 시타라빈과 교호하는, "용량-강화" R-CHOP (리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손), 또는 3) RDHAP (리툭시맙, 덱사메타손, 시타라빈, 시스플라틴)를 포함할 수 있다. 여포성 림프종 (FC)의 치료를 위한 표준 관리는 예를 들어 리툭시맙, 또는 오비누투주맙을 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손) 또는 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손) 요법과 조합하여 사용하는 치료를 포함할 수 있다.
비-호지킨 림프종에 대한 표준 관리 치료는 예를 들어 리툭시맙, 오비누투주맙, 오파투무맙 또는 이브리투모맙 티욱세탄을 단독으로 사용하는, 또는 CHOP 치료 요법 (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손), 또는 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손)에 따른 화학요법과 조합하는 치료를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 치료 옵션과 함께 사용된 용어 "조합하다" 또는 "조합" 및 그의 임의의 문법적 등가물은 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물 및 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제의 연속 또는 병용 적용을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물이 먼저 투여된 후, 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제가 후속 투여될 수 있거나, 또는 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제가 먼저 투여된 후, 본 발명의 제약 조성물이 후속 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물 및 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제의 연속 투여는 둘 중 어느 것이 먼저 투여되는 순서에 관계없이 서로 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 떨어진 상기 제약 조성물 및 상기 면역 체크포인트 억제제의 투여 요법을 지칭할 것이고, 상기 제약 조성물 및 상기 면역 체크포인트 억제제는 또한 예를 들어 동일한 치료 요법 또는 치료 주기 내에 투여될 수 있다. 병용 투여는 둘 다 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물 및 면역 체크포인트 억제제 둘 다가 동시에, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10분 간격 내에 투여되는 투여 요법을 지칭할 것이다. 상기 언급된 모든 투여 요법은 본 발명에 따른 "조합"으로 간주된다.
본 발명은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료, 특히 비-호지킨 림프종 (NHL), 여포성 림프종, 미만성 대 B 세포 비-호지킨 림프종 (DBNHL), 하기를 포함한 비-호지킨 림프종의 하위유형: 외투 세포 림프종 (MCL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 리히터 증후군, 원발성 피부 변연부 림프종 (PCMZL), 모발상 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 류마티스 관절염, 다발혈관염 및 현미경적 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 심상성 천포창의 치료를 위한 의약의 제조에서의 상기 기재된 바와 같은 상기 접합체 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에 따르면, 상기 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 본 발명의 제약 조성물은 리히터 증후군의 치료에 사용될 수 있다. 리히터 증후군은 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구성 림프종의 공격성 림프종, 가장 통상적으로는 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)으로의 변환으로서 정의된다. CLL 환자의 대략 2%-10%에서 발생하는 리히터 증후군은 고도로 공격적이고, 종종 치료에 불응성이며, 진단 후 대략 8-14개월의 생존의 불량한 결과를 갖는다. 사례의 대략 80%는 기저 CLL과 클론 관련되지만, 환자의 나머지 20%는 클론 비관련 DLBCL을 갖고, 신생 DLBCL의 것과 유사한 보다 우수한 예후를 갖는다 (Vaisitti et al. 2018). CLL B 세포의 배선 유전자 특징, 임상 특색, 생물학적 및 체세포 유전자 특징, 및 특정 CLL 요법의 조합은 리히터 증후군의 보다 높은 위험과 연관된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 임의로 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제의 투여를 포함하는, 환자에서 리히터 증후군의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)의 치료에 사용된 면역 체크포인트 억제제, 예를 들어 이필리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 니볼루맙과 임의로 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 임의로 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제의 투여를 포함하는, 환자에서 리히터 증후군의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기서 환자는 치료 요법 R-CHOP, 하이퍼-CVXD, 리툭시맙 및 GM-CSF와 교호 하이퍼 CVXD 및 MTX/시타라빈의 조합; 또는 OFAR, 또는 예를 들어 90Y, 이브리투모맙, 티욱세탄을 사용한 방사선면역요법 중 하나를 사용한 선행 표준 관리 치료를 받았다. 본원에 사용된 "하이퍼CVXD"는 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 리포솜 다우노루비신 및 덱사메타손의 분할 투여를 포함하는 치료 요법을 지칭한다. "OFAR"은 옥살리플라틴, 플루다라빈, 시타라빈 및 리툭시맙의 투여를 포함하는 치료 요법을 지칭한다 (예를 들어 문헌 [Tsimberidou et al. J Clin Oncol. 2008 Jan 10;26(2):196-203]에 개시된 바와 같음).
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제의 투여를 임의로 포함하는, 환자에서 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 B-세포는 그의 세포 표면 상에 130.000개 미만의 CD37 에피토프를 발현하거나, 또는 그의 세포 표면 상에 약 32.500, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 75.000, 100.000 내지 약 110.00, 120.000, 125.000, 130.000, 또는 약 110.00, 120.000, 125.000 내지 약 130.000개의 CD37 에피토프를 발현한다. 예를 들어, CD37의 세포 표면 발현은 문헌 [E Cabral Filho et al. Int J Nanomedicine. 2015; 10: 4393-4404]에 개시된 방법에 따라, 또는 퀀텀™ MESF 키트를 사용하여 본원에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 또한 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 상기 접합체 또는 제약 조성물을 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 본 발명의 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 상기 접합체 또는 제약 조성물을 본원에 개시된 바와 같은 1종 이상의 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물 및 본원에 개시된 바와 같은 1종 이상의 면역 체크포인트 억제제는 순차적으로 또는 병용으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 접합체 또는 제약 조성물이 먼저 투여되고, 이어서 1종 이상의 체크포인트 억제제가 투여될 수 있거나, 또는 1종 이상의 체크포인트 억제제가 본원에 기재된 바와 같은 접합체 또는 제약 조성물의 투여 전에 투여될 수 있다. 상기 환자에게 투여되는 치료 방법에 사용되는 1종 이상의 면역 체크포인트 억제제에 따라, 상기 1종 이상의 체크포인트 억제제가 순차적으로 투여되는 것이 유리할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 상기 접합체 또는 제약 조성물을 임의로 본원에 개시된 바와 같은 1종 이상의 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 환자는 치료 요법 R-CHOP, CHOP, 하이퍼-CVAD, 또는 CVD 중 하나를 포함하는 선행 표준 관리 치료를 받았다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- (단계 1) 방법 A)에 의해 화학식 (II), (III), (IX), (X), (XI) 중 임의의 것에 따른 접합체를 생산하거나, 또는 방법 B)에 의해 화학식 (I), (IV), (V), (VI), (VII), (XIII) 중 임의의 것에 따른 접합체를 생산하며, 여기서 방법 A 및 방법 B는 하기 방법 단계를 포함하는 것인 단계:
Figure pct00021
WO 2018/115466 A1에 개시된 바와 같은 커플링 시약 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 또는 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중 하나를 사용함, 또는
Figure pct00022
여기서 a1), a2), b1), B2) 및 b3)은 하기를 지칭함:
a1) 링커 브로마이드, 1M NaOH, DMSO; a2) 100℃, DMSO
a1)-a2)는 WO 2016/142049 A1의 실시예 2에 개시된 바와 같음
b1) 링커 브로마이드, N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 물 중 0.2 M 탄산세슘; b2) 1.) TFA, 2.) 수성 암모니아; b3) 3-(말레이미도)프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, DIPEA, DMF
b1)-b3)은 WO 2019/030173 A1에 기재된 바와 같음
- (단계 2) 임의의 화학식 (II), (III), (IX), (X), (XI), (I), (IV), (V), (VI), (VII), (XIII)에 따른 화합물을 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역에 의해 발현된 인간 CD37에 특이적으로 결합하는 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 표적-결합 모이어티에 접합시키며, 여기서 커플링은 WO 2016/142049 A1에 개시된 바와 같이 수행되는 것인 단계
- (단계 3) 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환을 앓는 환자에게 단계 2에서 수득된 접합체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 상기 개시된 바와 같은 본 발명의 접합체 또는 제약 조성물을 리히터 증후군을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 접합체 또는 제약 조성물은 예를 들어 단독요법으로서, 또는 상기 개시된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제와 조합되어 투여될 수 있는 것인, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 서열식별번호: 11 및/또는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14 및/또는 서열식별번호: 15를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "숙주" 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 숙주 세포가 진핵 세포, 예컨대 효모 세포 (예를 들어 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈반니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 클루이베로미세스락티스(Kluyveromyceslactis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 곤충 세포 (예를 들어 Sf9, Sf21, S2, Hi5, 또는 BTI-TN-5B1-4)인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 HEK293, HEK293T, HEK293E, HEK 293F, NS0, per.C6, MCF-7, HeLa, Cos-1, Cos-7, PC-12, 3T3, 베로(Vero), 베로-76, PC3, U87, SAOS-2, LNCAP, DU145, A431, A549, B35, H1299, HUVEC, Jurkat, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, Caco-2, CHO, CHO-K1, CHO-B11, CHO-DG44, BHK, AGE1.HN, 나말바(Namalwa), WI-38, MRC-5, HepG2, L-929, RAB-9, SIRC, RK13, 11B11, 1D3, 2.4G2, A-10, B-35, C-6, F4/80, IEC-18, L2, MH1C1, NRK, NRK-49F, NRK-52E, RMC, CV-1, BT, MDBK, CPAE, MDCK.1, MDCK.2, 및 D-17로부터 선택된 포유동물 세포이다.
서열
표 1: 본 발명의 아미노산 서열 및 DNA 서열
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
실시예
본 발명이 도면 및 상기 설명에서 상세히 예시되고 기재되었지만, 이러한 예시 및 설명은 제한적인 것이 아니라 예시적 또는 대표적인 것으로 간주되어야 하며; 본 발명은 개시된 실시양태로 제한되지 않는다. 개시된 실시양태에 대한 다른 변형은 도면, 개시내용 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 청구된 발명을 실시하는 데 있어서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고 실시될 수 있다. 청구범위에서, 단어 "포함하는"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않고, 단수형은 복수를 배제하지 않는다. 특정 조치가 상호 상이한 종속 청구항에서 언급된다는 단순한 사실은 이들 조치의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 나타내지 않는다. 청구범위 내의 임의의 참조 부호는 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 제시되고; 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'->3'로 제시된다.
실시예 1: 아마톡신 항체 접합체의 합성 및 특징화
실시예 1.1: CD37-특이적 항체의 발현
실시예에서 사용된 CD37-특이적 모노클로날 항체 (chHH1-HDP, chHH1-HDP-D265C, 및 chHH1-HDP-LALA-D265C)를 CHO 세포에서 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 달성된 수율은 약 58 mg/리터였다. 제제는 93.90% 항체 단량체, 및 단지 1.54% 내지 1.88% 고분자량 응집체를 함유하는 것으로 결정되었다.
실시예에서 사용된 CD37-특이적 모노클로날 항체 (chHH1-HDP, chHH1-HDP-D265C 및 chHH1-HDP-LALA-D265C)를 또한 HEK293 세포에서 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 달성된 수율은 약 50 mg/리터였다. 제제는 95.26% 항체 단량체, 및 단지 2.38% 고분자량 응집체를 함유하는 것으로 결정되었다.
실시예 1.2: 아마톡신-링커 구축물의 합성
실시예 1.3: 항-CD37 아마톡신 접합체의 합성
항체를 소위 티오mab(Thiomab) 기술에 의해 아마톡신 링커 접합체에 접합시켰다. 이러한 접근법에서, 접합은 하기 반응식에 제시된 바와 같이 독소 링커 구축물의 말레이미드 잔기를 항체 내의 시스테인 잔기의 유리 SH 기에 커플링시킴으로써 일어난다.
Figure pct00026
이러한 접합 방법의 원리는 문헌 [Junutula et al. (2008)]에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 실험에 사용된 항체는 유리 SH 기를 갖는 시스테인 잔기를 제공하기 위해 둘 다의 Fc 도메인에 D265C 치환을 포함한다. 각각의 기술은 WO 2016/142049 A1에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함되고, 이는 약 2의 고정된 약물 대 항체 비 ("DAR") 및 부위 특이적 접합을 갖는 균질 생성물을 생성한다.
실시예 2: 림프종 세포주에 대한 CD37-특이적 항체 chHH1-HDP의 결합
실시예 2.1: 세포 세포측정법 결합 검정
CD37-양성 B-세포 백혈병 (B-CLL) 세포주 MEC-1 및 MEC-2 뿐만 아니라 인간 버킷 림프종 세포주 Raji 및 Ramos 및 CD37-음성인 것으로 공지된 인간 B-세포 전구체 백혈병 세포주 Nalm-6에 대한 항-CD37 모노클로날 항체 chHH1-HDP-LALA-D265C의 결합을 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석에 의해 시험하였다. 항체 chHH1-HDP-LALA-D265C는 CD37-양성 MEC-1, MEC-2, Raji 및 Ramos 세포주에 강하게 결합하는 것으로 나타났다 (도 3). Nalm-6 세포로는 결합이 검출되지 않았다.
유동 세포측정법에 의해 세포당 결합된 항체 (ABC)를 추정하기 위해, BD 퀀티브라이트(Quantibrite) PE 튜브 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하였고, 이는 FL2 축이 세포당 결합된 PE 분자의 수로 전환될 수 있도록 검정과 동일한 기기 설정에서 실행되었다. PE 대 항체의 공지된 비를 사용함으로써, 세포당 PE 분자는 이어서 세포당 항체의 수로 전환될 수 있다 (Iyer et al. 1997). 결과는 표 2에 제시된다.
표 2: 유동 세포측정법에 의한 세포당 결합된 항-CD37 항체 분자의 추정
실시예 2.2: 비아코어 결합 검정
CD37에 대한 모노클로날 항체 chHH1-HDP-LALA-D265C의 결합을 표면-플라즈몬 공명 (비아코어) 상호작용 분석에 의해 확인하였다. 항-Fab 포획 (FAB2G) 바이오센서를 사용하여 0.1 μM chHH1-HDP-LALA-D265C를 포획하였다. 대안적으로, 비오티닐화 모노클로날 항체 chHH1-HDP-LALA-D265C를 스트렙타비딘 (SA) 센서에 의해 포획하였다. Fc 융합 태그 모이어티 (Thr 106 내지 Lys 330)를 갖는 HEK293 세포에서 발현된 아미노산 Ala 113 내지 Asn 240을 포함하는 CD37 구축물을 31.25 nM 내지 500 nM의 농도로 센서에 첨가하고 (1:2 희석 단계), CD37 구축물의 결합을 평가하였다.
대안적으로, 곤충 세포에서 발현된 아미노산 1 내지 281을 포함하는 CD37 구축물을 CD37에 대한 모노클로날 항체 chHH1-HDP-LALA-D265C의 결합의 확인에 사용하였다.
실시예 3: 시험관내 항-CD37 아마톡신 접합체의 세포독성
시험관내 세포독성 연구를, 96시간 동안 인큐베이션 후 CTG 검정, 또는 WST-1 검정에서 상이한 항-CD37-항체-표적화된 아마톡신 접합체를 사용하여, 각각 CD37-양성 MEC-1 세포 및 CD37-양성 MEC-2 세포 (B-만성 림프구성 백혈병); 각각 CD37-양성 Raji-Luc, Raji 및 Ramos 세포 (버킷 림프종); 및 CD37-음성 Nalm-6 세포 (B-세포 전구체 백혈병)에 대해 수행하였다. 결과는 도 4a (MEC-1 세포), 도 4b - g (MEC-2 세포), 도 5a - d (Raji-Luc 세포), 도 6a - e (Raji 세포), 도 7a - d (Ramos 세포)에 제시된다. 결과는 표 3에 요약된다.
세포 생존율의 정량적 결정은 대사적 활성 세포의 존재를 신호하는, 존재하는 ATP의 정량화에 기초하여 배양물 중 생존 세포의 수를 결정하는 균질 방법인 CTG (셀타이터 글로(CellTiter Glo) 2.0) 검정 (프로메가(Promega))을 사용함으로써 수행하였다. 검정의 사용에 의해, 루시페라제 반응에 의해 생성된 "글로우-유형" 발광 신호가 생성되고, 이를 검출할 수 있다.
일부 실험에서 세포 생존율의 정량적 결정을 상업적으로 입수가능한 WST-1 검정 (로슈)을 사용하여 수행하였다. "세포 증식 시약" WST-1은 다중-웰-플레이트 포맷을 사용하여 세포 집단에서 세포 생존율의 분광광도 정량화에 사용되도록 설계되고, 약간 적색인 테트라졸륨 염 WST-1 (4-[3-(4-아이오도페닐)-2-(4-니트로-페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 술포네이트)의 암적색 포르마잔으로의 절단을 기반으로 한다.
모든 시험된 항-CD37 ATAC는 CD37-양성 세포주에 대해 피코몰 범위의 시험관내 세포독성을 나타냈다. CD37-음성 세포에 대한 세포독성 활성은 관찰되지 않았다.
표 3: 시험관내 세포독성 결과의 요약
Figure pct00028
실시예 4: 생체내 마우스 모델에서의 항-CD37 아마톡신 접합체의 세포독성
실시예 4.1: 파종성 MEC-2 종양 이종이식편 모델에서 항-CD37 아마톡신 접합체의 세포독성 효능
140일의 처리에 걸친 파종성 MEC-2 종양 이종이식편 모델에서 다양한 항-CD37 항체 아마톡신 접합체를 사용하여 생체내 세포독성 효능 연구를 수행하였다.
연구 개요:
종양 세포 접종을 제-3일에 CB17 Scid 마우스에서 2.5 x 106개 MEC-2 세포의 i.v. 주사에 의해 수행하였다. 제0일에 각각 1/8 용량의 최대 허용 용량 (MTD) 및 1/16 용량의 MTD로 단일 용량 i.v. 주사에 의해 처리를 수행하였다. 연구의 판독은 체중 및 생존이었다. 처리 후 제138일의 결과가 도 10 (체중) 및 도 11 (생존)에 제시된다. 접합체로 처리된 모든 군은 대조군과 대조적으로 정상적으로 체중이 증가하였다.
표 4: 파종성 MEC-2 종양 이종이식편 모델에서의 세포독성 효능 연구의 연구 군; 로마 숫자는 본원에 개시된 바와 같은 아마톡신 접합체를 지칭한다.
Figure pct00029
처리군은 표 4에 정의되어 있다. 군 10 (chHH1-HDP-LALA-D265C, p.o., 단일 용량; 10 mg/kg)은 분석에서 제외하였다. 군 11 (이브루티닙)을 이브루티닙 p.o. 5x/w로 3주 동안 용량 25 mg/kg으로 처리하였다.
사용된 약어: "chHH1-HDP-LALA-D265C"는 각각 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 비접합된 항체를 지칭한다. "chHH1-HDP-D265C"는 각각 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 비접합 항-CD37 항체를 지칭한다. 예를 들어 항체, 예컨대 chHH1-HDP-D265C에 대한 -(XII) 형태의 접미어는 본원에 개시된 바와 같이 상기 항체에 연결된 각각의 아마톡신-링커 접합체를 지칭한다.
실시예 4.2: 파종성 Raji-Luc 종양 이종이식편 모델에서 항-CD37 아마톡신 접합체의 세포독성 효능
89일의 처리에 걸친 파종성 Raji-Luc 종양 이종이식편 모델에서 다양한 항-CD37 항체 아마톡신 접합체를 사용하여 생체내 세포독성 효능 연구를 수행하였다.
연구 개요:
종양 세포 접종을 제-3일에 CB17 Scid 마우스에서 2.5 x 106개 Raji-Luc 세포의 i.v. 주사에 의해 수행하였다. 제0일에 각각 시노몰구스 1/16 용량의 최대 허용 용량 (MTD) 및 1/64 용량의 MTD로 단일 용량 i.v. 주사에 의해 처리를 수행하였다. 연구의 판독은 체중, 생물발광 및 생존이었다. 처리 후 제89일의 결과가 도 10 (체중), 도 11 (생물발광) 및 도 12 (생존)에 제시된다. 접합체로 처리된 모든 군은 대조군과 대조적으로 정상적으로 체중이 증가하였다.
처리군은 표 5에 정의된 바와 같다.
표 5: 파종성 Raji-Luc 종양 이종이식편 모델에서의 세포독성 효능 연구의 연구 군.
Figure pct00030
요약하면, 파종성 마우스 이종이식 종양 모델 (MEC-2 및 Raji-Luc) 및 CD37-양성 환자 유래 이종이식편 (PDX; 리히터 증후군) 모델을 단일-용량 실험에서 수행하였다.
마우스 이종이식편 모델에서, 연구의 전체 지속기간 (>100일) 동안 80 - 100% 전체 생존은 MEC-2 모델에서 1/16의 MTD 및 Raji-Luc 모델에서 1/64의 MTD에 의한 2종의 항-CD37 ATAC로 달성되었다. 0.1 mg/kg만큼 낮은 용량으로의 단일-용량 처리는 처리 7일 후에 신속하고 완전한 종양 완화를 유발하였다. 마우스에서 시험된 ATAC의 내약성은 > 15 mg/kg인 것으로 나타났다.
실시예 5: 시노몰구스 원숭이에서 항-CD37 아마톡신 접합체를 사용한 탐색적 독성 연구
시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서의 탐색적 독성 연구를 상이한 항-CD37 항체-아마톡신 접합체를 사용하여 수행하였다.
군당 3마리의 원숭이를 할당하였다 (3 kg 체중). CHO 세포에서 발현된 항-CD37 모노클로날 항체를 상이한 아마톡신-링커 구축물과의 접합에 사용하였다. 3개의 군을 하기와 같이 할당하고 투여하였다:
· 접합체 XXIII: 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg
· 접합체 XXIV: 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg
· 접합체 XXV: 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg
알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 평가, 아스파르테이트 트랜스-아미나제 (AST) 평가, 및 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 평가에 관한 결과가 도 13-15에 제시된다.
본 연구에 사용된 항체는 비-인간 영장류 (NHP)를 포함한 동물에서 CD37에 대해 교차-반응성이 아니다. 따라서, 링커-아마니틴 유도체를 비-결합 항-DIG 항체에 접합시켰다. 이 항-DIG 접합체는 NHP에서의 낮은 오프 타겟 독성을 나타내는 우수한 내약성을 밝혀내었다. 혈액학 및 임상 화학 파라미터는 간 트랜스아미나제 및 LDH를 제외하고는 영향을 받지 않았고; 경도 내지 중등도 및 일시적 증가가 관찰되었다.
결론적으로, CD37-양성 세포주로의 표적화된 세포독성 약물 전달은 항-CD37 항체-표적화된 아마톡신 접합체 (ATAC)를 사용함으로써 달성되었다. 페이로드 아미니틴의 작용 방식은 비-인간 영장류에서 우수한 내약성과 함께 시험관내 및 생체내에서 효율적인 항종양 잠재력을 유도하였다. 제시된 실험 데이터는 유망한 접근법으로서 B-세포 림프종 및 다른 B-세포-연관 악성종양, 예컨대 리히터 형질전환을 겪은 악성종양의 요법에서 ATAC를 사용하는 것을 시사한다.
실시예 6: 리히터 증후군 (RS) 환자-유래 이종이식편 (PDX) 모델에서 항-CD37 아마톡신 접합체를 사용한 탐색적 독성 연구
연구 개요:
리히터 증후군에 대한 환자-유래 이종이식편 (PDX) 모델은 문헌 [Cancer Res (2018); 78(13); 3413-20]으로부터 변형되어 개조되었다.
간략하게, 말초 혈액 또는 림프절로부터의 총 2 x 107개 1차 리히터 증후군 세포를 매트리겔(Matrigel) (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 재현탁시키고, 8-주령 CB17 Scid 마우스 면역손상 마우스에 피하 주사하고 (이중 측복부), 생착되도록 두었다. 이어서, 종양 덩어리를 수집하고, 부분적으로 파괴하고, 종양 세포를 매트리겔 중 단일-세포 현탁액으로서 재주사하였다. 이들 단계를 수회 반복하여 리히터 증후군의 안정한 모델을 수득하였다.
정맥내 모델의 경우, 종양 덩어리로부터 정제된 107개 리히터 증후군 세포를 PBS에 재현탁시키고, 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 각각 n=4 마우스의 군을 도 16a에 나타낸 바와 같이 생착 15일 후에 처리하였다. 마우스에 나타낸 바와 같은 접합체 XXIII, XXIV 또는 XXVI의 단일 용량을 주사하였다. PBS 대조군 내의 모든 마우스는 생착 후 68일 이내에 사망하였다. 접합체 XXVI를 5 mg/kg i.v.의 용량으로 투여받은 군 중 1마리의 동물은 생착 후 제90일에 사망하였다. 결과는 접합체 XXIII, XXIV, XXVI의 단일 용량을 사용한 처리가 상이한 용량에서 잘 허용되고 RS를 치료하는 데 효과적임을 나타낸다.
기관에서의 잔류 RS 질환 활성의 평가
생착된 동물의 기관에서의 잔류 RS 질환 활성을 평가하기 위해, 마우스를 안락사시키고, 말초 혈액 및 기관 (신장, 비장, 골수, 폐, 간 및 뇌)을 수집하고, 항-인간 항체 (CD45PerCPCy5.5/CD19APC/CD20FITC)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 질환 확산을 평가하였다. 결과를 도 16b에 도시하였으며, 이는 본 발명의 접합체의 단일 용량이 생착된 동물의 기관으로부터 RS 질환 활성을 유의하게 감소시키거나 (접합체 XXIV, 5 mg의 경우에), 또는 심지어 제거할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: 항-CD37 항체의 교차반응성의 평가
시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 항-CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C의 교차 반응성을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 대조군으로서, 인간 PBMC를 동일한 세트의 항체를 사용하여 염색하였다. 표준 프로토콜에 따라 FACS 분석을 수행하였다. 간략하게, PBMC를 300 μL 염색 배지 (3.3 x 105개 세포 / 50 μl 염색 배지) 중에 재현탁시켰다. 각각의 샘플에 대한 50 μl 세포 현탁액 (= 샘플당 3.3 x 105개 세포)을 U-웰 플레이트의 하나의 웰 내로 피펫팅하였다. 50 μl의 사전-희석된 이소형 및 항체 용액을 각각의 웰 내의 샘플에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 100 μl 빙냉 PBS를 첨가하고, 4℃에서 300 g로 6분 원심분리하였다. 생성된 상청액을 폐기하고, 세포를 200 μl 빙냉 PBS, pH 7.4로 세척한 후, 4℃에서 300 g로 6분 원심분리하였다. 세척 단계를 1회 반복하였다. 상청액을 폐기하고, 세포를 2차 항체 용액 100 μl 중에 재현탁시켰다. 비처리된 샘플 (대조군)에 대해 100 μl 염색 배지를 사용하였다. 세포를 빛으로부터 보호된 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl 빙냉 PBS를 첨가하고, 세포를 4℃에서 300 g로 6분에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포를 200 μl 빙냉 PBS, pH 7.4로 2회 세척하고, 4℃에서 300 g로 6분 원심분리하였다. 후속적으로 상청액을 폐기하고, 세포를 200 μl의 새로 제조된 고정 용액에 재현탁시켰다. 세포를 FACSuite 소프트웨어를 사용하여 BD FACSLyric 장치에서 분석할 때까지 빛으로부터 보호된 4℃의 고정 용액 중에 저장하였다. 결과를 도 17에 도시하였으며, 이는 chHH1-HDP-LALA-D265C가 시노몰구스 CD37에 대한 특이적 결합을 나타내지 않음을 나타낸다.
사용된 항체:
- 4℃에서 저장된 항-인간 CD37 chHH1-HDP-LALA-D265C 10.0 mg/ml, 염색 배지 중 100 μg/ml로 희석됨 (1 μl 항체 희석물 + 99 μL 염색 배지);
- -20℃에서 저장된 마우스 항-인간 CD37 (노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)), 염색 배지 중 1:100 희석물 (1 μl 항체 희석물 + 99 μL 염색 배지)
- 염소 항-인간 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 Fab: 1.5 mg/ml (잭슨 이뮤노(Jackson Immuno); 109-546-008) (저장: - 70℃)
- 염소 항-마우스 IgG (Fc)-알렉사플루오르488 F(ab)2-단편: 1.5 mg/ml (인비트로젠(invitrogen): A11001)
염색 배지: RPMI 1640, 25mM HEPES, 3% FCS, 0.02% Na-아지드
고정 용액: PBS 중 2% 파라포름알데히드
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280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 11 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of chHH1-HDP-LALA-D265C comprising amino acid substitutions L235A, L235A and D265C <400> 11 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Ile His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Tyr Gly His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Cys Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of chHH1-HDP, chHH1-HDP-265C, chHH1-HDP-LALA-D265C, respectively <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Asn Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe 20 25 30 Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly 35 40 45 Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser 50 55 60 Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Ala Thr Gln Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln Arg 100 105 110 Ala Gln Leu Glu Arg Ser Leu Arg Asp Val Val Glu Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Lys Tyr Gly Thr Asn Pro Glu Glu Thr Ala Ala Glu Glu Ser Trp Asp 130 135 140 Tyr Val Gln Phe Gln Leu Arg Cys Cys Gly Trp His Tyr Pro Gln Asp 145 150 155 160 Trp Phe Gln Val Leu Ile Leu Arg Gly Asn Gly Ser Glu Ala His Arg 165 170 175 Val Pro Cys Ser Cys Tyr Asn Leu Ser Ala Thr Asn Asp Ser Thr Ile 180 185 190 Leu Asp Lys Val Ile Leu Pro Gln Leu Ser Arg Leu Gly His Leu Ala 195 200 205 Arg Ser Arg His Ser Ala Asp Ile Cys Ala Val Pro Ala Glu Ser His 210 215 220 Ile Tyr Arg Glu Gly Cys Ala Gln Gly Leu Gln Lys Trp Leu His Asn 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ser Ile Val Gly Ile Cys Leu Gly Val Gly Leu Leu Glu 245 250 255 Leu Gly Phe Met Thr Leu Ser Ile Phe Leu Cys Arg Asn Leu Asp His 260 265 270 Val Tyr Asn Arg Leu Ala Arg Tyr Arg 275 280 <210> 14 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of chHH1-HDP-LALA-265C, DNA sequence <400> 14 gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgtactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtga tactacctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240 atccatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatcccct 300 tatggtcact atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagct 360 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc cgggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgtg cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 15 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of chHH1-HDP, chHH1-HDP-265C, chHH1-HDP-LALA-265C, DNA sequence <400> 15 gacattgtga tgacccagtc tcacaaactc ttgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag actggtatca acagaaacca 120 ggacaatctc ctaaactact gattaactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag tatgcaggct 240 gaagacctgg cactttatta ctgtcgacaa cattatagca ctccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa acgaacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc cggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 16 <211> 345 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> Cynomolgus CD37 <400> 16 Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe 20 25 30 Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly 35 40 45 Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser 50 55 60 Gly Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Ala Thr Gln Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln Arg 100 105 110 Ala Gln Leu Glu Arg Ser Leu Gln Asp Ile Val Glu Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Lys Tyr His Thr Asn Pro Glu Glu Thr Ala Ala Glu Glu Ser Trp Asp 130 135 140 Tyr Val Gln Phe Gln Val Ser Pro Leu Leu Gln Leu Pro Pro Arg Leu 145 150 155 160 Thr Arg Leu Ser Pro Val Leu Arg Gly Asp Ser Thr Pro Thr Trp Pro 165 170 175 Arg Pro Pro Ala Leu His Asp Leu Thr His Ser Gln Pro Leu Pro Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Ala Thr Pro Gln Met Thr Gln Leu Ala Pro Ala Trp Pro 195 200 205 Ser Leu Pro Val Pro Arg Pro Trp His Gly Phe Ala Ile Tyr Leu Gly 210 215 220 Arg Leu Arg Pro Arg Pro Asp Pro Ala Pro Thr Gly Gly Ser Gln Ala 225 230 235 240 Pro Ser Pro Lys Thr Leu Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg Ser Glu 245 250 255 Ser Gly Phe His Arg Thr Pro Pro Arg Met Arg Leu Thr Gly Ser Arg 260 265 270 Thr Pro Ile His Leu Ser Gly Ile Arg Gly Ser Ile Ala Pro Pro Thr 275 280 285 Asn Leu Trp Phe Arg Ala Arg Arg Cys Ser Tyr Phe Pro Ser Pro Arg 290 295 300 Ser Pro Arg Asp Pro Ser Leu Pro Ala Pro Phe Pro Val Met Ser Pro 305 310 315 320 Gly Pro Gly Pro Ile Ala Thr Pro Ala His Trp Pro Pro Leu His Thr 325 330 335 His His Leu Val Pro Cys Phe Pro Thr 340 345

Claims (28)

  1. (i) 표적 결합 모이어티, (ii) 적어도 1개의 독소, 및 (iii) 임의로 상기 표적 결합 모이어티를 상기 적어도 1개의 독소와 연결하는 적어도 1개의 링커를 포함하며, 여기서 상기 표적 결합 모이어티는 CD37에 결합하고, 상기 적어도 1개의 독소는 아마톡신인 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 결합 모이어티가
    (i) 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체,
    (ii) 그의 항원-결합 단편, 바람직하게는 가변 도메인 (Fv), Fab 단편 또는 F(ab)2 단편,
    (iii) 그의 항원-결합 유도체, 바람직하게는 단일-쇄 Fv (scFv), 및
    (iv) 항체-유사 단백질
    로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각 CD37, 바람직하게는 인간 CD37, 가장 바람직하게는 인간 CD37의 세포외 도메인에 각각 결합하는 것인 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체가 각각 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 유도체인 접합체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체가 테툴로맙 (릴로토맙), 오틀레투주맙 (TRU-016), 및 나라툭시맙, BI836826, 또는 GEN3009로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체가 각각 하기 상보성-결정 영역 (CDR):
    서열식별번호: 1에 따른 CDRH1 (DYNMY),
    서열식별번호: 2에 따른 CDRH2 (YIDPYNGDTTYNQKFKG),
    서열식별번호: 3에 따른 CDRH3 (SPYGHYAMDY),
    서열식별번호: 4에 따른 CDRL1 (KASQDVSTAVD),
    서열식별번호: 5에 따른 CDRL2 (WASTRHT),
    서열식별번호: 6에 따른 CDRL3 (RQHYSTPFT)
    을 포함하며,
    여기서 상기 CDR은 CD37, 바람직하게는 인간 CD37, 가장 바람직하게는 인간 CD37의 세포외 도메인에 결합할 수 있도록 적합한 단백질 프레임워크로 포함되는 것인 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체가 각각 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 접합체.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것인 접합체.
  8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys 또는 중쇄 265Cys, 바람직하게는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전자 조작되고, 여기서 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 아마톡신이 각각 상기 중쇄 118Cys 또는 상기 중쇄 239Cys 또는 중쇄 265Cys 잔기를 통해 상기 항체에 연결되는 것인 접합체.
  9. 제2항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 234Ala 및/또는 235Ala를 포함하도록 유전자 조작된 것인 접합체.
  10. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys, 234Ala 및 235Ala를 포함하도록 유전자 조작되었고, 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 아마톡신이 상기 중쇄 265Cys 잔기를 통해 상기 항체에 연결되는 것인 접합체.
  11. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 10 또는 11에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 10 또는 11에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 10 또는 11에 따른 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 유사성을 갖는, 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 유사성을 갖는, 가장 바람직하게는 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것인 접합체.
  12. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 아마톡신이 상기 항체의 임의의 자연 발생 Cys 잔기를 통해, 바람직하게는 상기 항체의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 임의의 자연 발생 Cys 잔기를 통해 및/또는 디술피드 연결을 통해 상기 항체에 연결되는 것인 접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 비-절단가능한 링커 또는 절단가능한 링커인 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 효소적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 프로테아제-절단가능한 링커, 및 화학적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 디술피드 가교를 포함하는 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우에 상기 링커, 또는 상기 표적 결합 모이어티가 (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자, 또는 (ii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 4의 6'-C-원자를 통해 상기 아마톡신에 연결되는 것인 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아마톡신이 (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 것인 접합체.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 링커-아마톡신 모이어티로서 각각 하기 화학식 (I) 내지 (XI)의 화합물 중 임의의 것을 포함하는 접합체:
    Figure pct00031

    Figure pct00032

    Figure pct00033

    Figure pct00034

    Figure pct00035
    .
  18. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 (XII) 내지 (XXII) 중 어느 하나에 따른 티오에테르 연결을 통해 아마톡신 링커 모이어티에 접합된 표적 결합 모이어티로서 항체를 포함하며:
    Figure pct00036

    Figure pct00037

    Figure pct00038

    Figure pct00039

    Figure pct00040

    여기서 상기 아마톡신 링커 모이어티는 항체의 시스테인 잔기의 티올 기에 커플링되고, n은 바람직하게는 1 내지 7인 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 아마톡신 링커 모이어티가 항체의 시스테인 잔기의 티올 기에 커플링되고, n이 1 또는 2인 접합체.
  20. 제2항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    (i) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXIII),
    (ii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XIII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXIV),
    (iii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XIV)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXV),
    (iv) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XV)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXVI),
    (v) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XVI)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXVII),
    (vi) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XVII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXVIII),
    (vii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XVIII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXIX),
    (viii) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XIX)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXX),
    (ix) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XX)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXXI),
    (x) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XXI)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXXII),
    (xi) 항체의 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys 잔기의 술프히드릴 기와의 링커의 티오에테르 연결을 통해 화학식 (XXII)의 적어도 1개의 아마톡신-링커 모이어티에 접합된, 표적 결합 모이어티로서 각각의 중쇄가 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 각각의 경쇄가 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항체로 이루어진 접합체 (XXXIII),
    여기서 n은 1 내지 2인 접합체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 1종 이상의 제약상 허용되는 완충제, 계면활성제, 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 특히 비-호지킨 림프종 (NHL), 여포성 림프종, 미만성 대 B 세포 비-호지킨 림프종 (DBNHL), 하기를 포함한 비-호지킨 림프종의 하위유형: 외투 세포 림프종 (MCL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 리히터 증후군, 원발성 피부 변연부 림프종 (PCMZL), 모발상 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 류마티스 관절염, 다발혈관염 및 현미경적 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 심상성 천포창의 치료에 사용하기 위한 접합체 또는 제약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 체크포인트 억제제와 조합된 접합체 또는 제약 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환이 TP53, POLR2A 또는 del(17p13)의 반접합성 상실을 특징으로 하는 것인 접합체 또는 제약 조성물.
  26. B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료를 위한, 특히 비-호지킨 림프종 (NHL), 여포성 림프종, 미만성 대 B 세포 비-호지킨 림프종 (DBNHL), 하기를 포함한 비-호지킨 림프종의 하위유형: 외투 세포 림프종 (MCL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 리히터 증후군, 원발성 피부 변연부 림프종 (PCMZL), 모발상 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 류마티스 관절염, 다발혈관염 및 현미경적 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 심상성 천포창의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 접합체 또는 제21항 또는 제22항의 제약 조성물의 용도.
  27. B 림프구-연관 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환을 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 접합체 또는 제21항 또는 제22항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 환자가 리히터 증후군을 앓고 있고, 치료 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 접합체 또는 제21항 또는 제22항의 제약 조성물을 단독요법으로서, 또는 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
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