CN104470891B - 用于合成鹅膏毒素结构单元及鹅膏毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于合成作为鹅膏毒素合成的结构单元的γ,δ‑二羟异亮氨酸1(CAS号55399‑94‑5]的合成子的新方法，以及使用这样的结构单元合成鹅膏毒素的新方法。

Description

用于合成鹅膏毒素结构单元及鹅膏毒素的方法
技术领域
本发明涉及一种用于合成作为用于鹅膏毒素合成的结构单元(buildingblock)γ,δ-二羟异亮氨酸1(CAS号55399-94-5]的合成子的新方法，以及使用这样的结构单元合成鹅膏毒素的新方法。
发明背景
鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的环肽，被发现在毒鹅膏(Amanita phalloides)蘑菇中(参照图1)。鹅膏毒素特别地抑制哺乳动物细胞的DNA-依赖的RNA聚合酶II，从而也抑制受影响的细胞的转录和蛋白质生物合成。在细胞中转录的抑制导致生长和增殖的停止。虽然不是共价结合，但是鹅膏蕈碱和RNA聚合酶II之间的复合是很紧的(KD＝3nM)。鹅膏蕈碱从酶的解离是非常缓慢的过程，从而使受影响的细胞不太可能恢复。当转录的抑制持续时间过长时，细胞将经历程序性细胞死亡(凋亡)。
使用鹅膏毒素作为细胞毒性部分用于肿瘤治疗已经于1981进行了探索，通过使用连接于Trp的吲哚环(氨基酸4；参照图1)上的连接子经由重氮化将抗Thy1.2抗体连接到α-鹅膏蕈碱上(Davis&Preston,Science 1981,213,1385-1388)。Davis&Preston确定了连接的位点为位置7’。Morris&Venton也证明了位置7'的取代导致衍生物，该衍生物维持细胞毒活性(Morris&Venton,Int.J.PeptideProtein Res.1983,21419-430)。
专利申请EP 1859811A1(2007年11月28日公开)中描述了偶联物，其中，β鹅膏蕈碱的鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子被直接耦合(即没有连接子结构)至白蛋白或单克隆抗体HEA125、OKT3或PA-1。此外，显示了这些偶联物对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤细胞(Raji)和T-淋巴瘤细胞(Jurkat)的增殖的抑制效应。建议使用连接子，包括含有元件如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等的连接子，但没有明确地显示这样的构建体，并且没有提供更多的细节，如在鹅膏毒素上的连接位点。
专利申请WO 2010/115629和WO 2010/115630(均于2010年10月14日公开)描述了偶联物，其中抗体，如抗EpCAM抗体，例如人源化抗体huHEA125，通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC原子，(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6'C原子，或(iii)通过鹅膏毒素氨基酸3的δC原子连接到鹅膏毒素上，在每一种情况下直接地或经由抗体和鹅膏毒素之间的连接子。建议的连接子包含元件如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分和类似物。此外，显示了这些偶联物对乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)、胰腺癌(Capan-1细胞系)、结肠癌(Colo205细胞系)和胆管癌(OZ细胞系)的增殖的抑制效应。
鹅膏毒素可以从收集的毒鹅膏蘑菇子实体中分离，或者从纯培养中分离(Zhang P,Chen Z,Hu J,Wei B,Zhang Z,and Hu W,Production and characterizationof Amanitin toxins from a pure culture of Amanita exitialis,FEMS Microbiol Lett.2005Nov 15；252(2):223-8.Epub 2005Sep 15)。然而，可以得到的鹅膏毒素的量是相当低的(从天然子实体获得的量在约0.3-3mg/g干物质的范围内，从纯培养中获得上述量的约10％)且进一步修饰自然发生的鹅膏毒素变体的灵活性有限(参见[003]-[005]中讨论的和其中引用的文献)。
或者，使用担子菌类(basidiomycete)发酵获得鹅膏毒素(Muraoka S,andShinozawa T.,Effective production of amanitins by two-step cultivation of thebasidiomycete,Galerina fasciculata GF-060,J Biosci Bioeng.2000；89(1):73-6；所报告的产率为约5mg/l培养物)或A.fissa(Guo XW,Wang GL,and Gong JH,Cultureconditions and analysis of amanitins on Amanita spissa,Wei Sheng Wu Xue Bao.2006Jun；46(3):373-8；所报告的产率为约30μg/l培养物)。再次，产量很低，且进一步修饰自然发生的鹅膏毒素变体的灵活性也有限。
最后，已通过部分或全合成制备了鹅膏毒素(例如Zanotti G,C，和Wieland T.,Synthesis of analogues of amaninamide,an amatoxin from the whiteAmanita virosa mushroom,Int J Pept Protein Res.1987Oct；30(4):450-9；Zanotti G,Wieland T,Benedetti E,Di Blasio B,Pavone V，和Pedone C.,Structure-toxicityrelationships in the amatoxin series。Synthesis ofS-deoxy[gamma(R)-hydroxy-Ile3]-amaninamide,its crystal and molecular structureand inhibitory efficiency,Int J Pept Protein Res.1989Sep；34(3):222-8；Zanotti G,Petersen G，和Wieland T.,Structure-toxicity relationships in the amatoxin series。Structural variations of side chain 3and inhibition of RNA polymerase II,Int J PeptProtein Res.1992Dec；40(6):551-8)。
虽然将全合成路线应用于鹅膏毒素可以提供治疗用途所需的更多数量的鹅膏毒素的供给，并且通过使用适宜的原料作为结构单元可以提供多种新颖的鹅膏毒素变体的构建，但是最相关的鹅膏毒素，α鹅膏蕈碱和β-鹅膏蕈碱，以及鹅膏素和鹅膏素酰胺的全合成方法，到目前为止还未有报道。这可能，至少部分，归因于，到目前为止还没有可用的基本结构单元γ,δ-二羟异亮氨酸1或其合成子作为纯非对映异构体的事实。
发明目的
因此，现有技术中对于获得作为用于鹅膏毒素合成的结构单元的γ,δ-二羟异亮氨酸1或其合成子，并确定用于生产1或其合成子的方法有很高的需要。此外，确定用于合成鹅膏毒素的替代方法在现有技术中有高的需要。
发明概述
本发明是基于意外的发现，即γ,δ-二羟异亮氨酸1或其合成子，可以在多步方法中获得，其中，适当保护的天冬氨酸衍生物的区域选择性甲基化是关键步骤。
因此，在一个方面，本发明涉及一种用于γ,δ-二羟异亮氨酸1或化合物1的合成子的合成的方法，包含甲基化化合物3，特别是在二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂(LHMDS)的存在下使用甲基碘甲基化化合物3的步骤。
在可供选择的方面，本发明涉及一种用于γ,δ-二羟异亮氨酸1或化合物1的合成子的合成的方法，包含甲基化化合物3*(在化合物3的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)，特别是在二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂(LHMDS)的存在下使用甲基碘甲基化化合物3*的步骤。
在第二方面，本发明涉及化合物6。
在第三个方面，本发明涉及包含化合物6的试剂盒，以及至少一种附加的试剂，用于鹅膏毒素或其前体的合成。
在又一个方面，本发明涉及一种用于合成鹅膏毒素或其前体分子的方法，包含将化合物6耦合至羟脯氨酸，特别是通过使化合物6与羟脯氨酸-预装树脂(PS)L反应而将化合物6耦合至羟脯氨酸的步骤。
附图说明
图1示出不同鹅膏毒素的结构式。以粗体类型的数字(1至8)指定形成鹅膏毒素的8个氨基酸的标准编号。还示出了氨基酸1,3和4中原子的标记代号(分别地，希腊字母α到γ，希腊字母α到δ，和从1’至7’的数字)。
图2示出1H-和13C-NMR图谱，显示化合物6的70:30的非对映体的比率。
图3示出鹅膏毒素合成的一般合成方案。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明并不限于本文中所描述的具体方法，方案和试剂，因为这些可以变化的。也应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明将仅由所附权利要求限定的范围。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有通常由本领域普通技术人员理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语按“生物技术方面的多语言词汇表：(lUPAC推荐)”，Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)中所述进行定义。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”，和变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”，将被理解为隐含包含所述的整数，成分或步骤或整数或步骤的组，而任何其他整数，成分或步骤，或整数，成分或步骤的组也可任选地存在，包括实施方案，其中没有其他的整数，成分或步骤，或整数，成分或步骤的组存在。在后者这样的实施方案中，术语“包含”与“…组成”接近。
在整个说明书的文本中引用几个文件。本文引用的每一个文件(包含所有专利，专利申请，科学出版物，制造商的说明书，指南，GenBank检索号序列提交书等)，无论在上文或下文，均在相应的专利法下尽可能地以其整体通过引用并入本文。本文没有任何内容被解释为是承认由于在先发明而使本发明没有资格先于这些公开内容。
本发明现在将进一步描述。在下面的段落，本发明的不同方面进行更详细的限定。如此定义的每个方面可以与任何其他方面或多方面结合，除非明确地相反指示。特别是，指示为优选或有利的任何特征，可以与任何其它特征或指示为优选或有利的特征相结合。
因此，在一个方面，本发明涉及一种用于γ,δ-二羟异亮氨酸1或化合物1的合成子的合成的方法，其包含甲基化化合物3，特别是在二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂(LHMDS)的存在下使用甲基碘甲基化化合物3的步骤。
在可供选择的方面，本发明涉及一种用于γ,δ-二羟异亮氨酸1或化合物1的合成子的合成的方法，其包含甲基化化合物3*(在化合物3的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)，特别是在二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂(LHMDS)的存在下使用甲基碘甲基化化合物3*的步骤。
在本发明的上下文中，术语“合成子”指的是，或者可被用作，化学反应中特定的感兴趣的化合物的合成等价物的化合物。该定义包含这样的化合物，其中在所述化学反应所用条件下将是不稳定的或反应性的感兴趣的化合物部分由适当的保护基保护或遮掩，所述适当的保护基可在所述化学反应后裂开。
在一个具体的实施方案中，所述反应在醚中、约-10℃至约-80℃温度下进行约12至约20小时，特别是约16小时。在一个具体的实施方案中，反应是在-20℃，以四氢呋喃作为溶剂进行。在具体的实施方案中，得到大于30:1，特别是大于40:1，特别是约50:1的非对映体的纯度。
在本发明的上下文中，术语“约”或“近似”是指给定值或范围的90％至110％。
在具体实施方案中，所述方法还包含用于合成化合物3的以下步骤的一个或多个：
(a)L-天冬氨酸，一甲基酯A与2-甲基丙烯反应生成化合物B；
(b)B与苯甲醛反应生成化合物C；
(c)C与苯芴溴反应生成化合物3。
在一个替代方面的实施方案中，所述方法还包含用于合成化合物3*的以下步骤的一个或多个：
(a)L-天冬氨酸，一甲基酯A与2-甲基丙烯反应生成化合物B；
(b)B与苯甲醛反应生成化合物C；
(c)C与苄基溴反应生产化合物3*。
在一个具体的实施方案中，所述方法还包含以下一个或多个步骤：
(a)还原化合物2，特别是使用二异丁基氢化铝(DiBAl-H)，以生成化合物D；
(b)氧化羟基化合物D，特别是使用Swern氧化，以生成化合物E；
(c)转换E，特别是在Wittig反应条件下，以生成化合物4；
(d)转换4，特别是在Sharpless氧化条件下，以生成化合物F；
(e)转换F，特别是在催化酯化条件下，以生成化合物5；
和
(f)5的N-去保护，特别是使用钯催化加氢，以生成化合物6。
在一个替代性方面的具体实施方案，所述方法还包含以下一个或多个步骤：
(a)还原化合物2*，特别是用二异丁基氢化铝(DiBAl-H)，以生成化合物D*(在化合物D的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)；
(b)氧化羟基化合物D*，特别是使用Swern氧化，以生成化合物E*(在化合物E的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)；
(c)转换E*，特别是在Wittig反应条件下，以生成化合物4*(在化合物4的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)；
(d)转换4*，特别是在Sharpless氧化条件下，以生成化合物F*(在化合物F的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)；
(e)转换F*，特别是在催化酯化条件下，以生成化合物5*(在化合物5的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)；
和
(f)5*的N-去保护，特别是使用钯催化加氢，以生成化合物6。
在一个具体的实施方案中，所述方法还包含分离和纯化化合物6的步骤。在一个具体的实施方案中，化合物6使用沉淀法像盐酸盐和/或层析法纯化进行纯化。
在第二方面，本发明涉及化合物6。
在一个具体的实施方案中，化合物6具有大于90％，特别是大于95％的纯度。
在本发明的上下文中，术语“纯度”指的是存在的化合物6及其非对映异构体的总量。例如，大于90％的纯度，意味着在1g的组合物中包含有90％以上的化合物6，即，超过900mg的化合物6和/或它的立体异构体。剩余的部分，即杂质可以包含未反应的起始材料和其它反应物，溶剂，分解产物和/或副产物。
在一个具体的实施方案中，具有大于90％纯度的包含化合物6的组合物含有多于100mg的化合物6。
在一个具体的实施方案中，化合物6具有大于70:30的非对映体的纯度。
在本发明的上下文中，术语“非对映体的纯度”是指在包含化合物6的组合物中化合物6存在的量与所述组合物中其非对映异构体存在的量的比例。例如，大于70:30的非对映体的纯度，是指在包含化合物6及其非对映体的组合物中受保护的二羟异亮氨酸总量的70％以上是化合物6，而化合物6的所有非对映异构体的总量相应地小于30％。
在一个具体的实施方案中，具有非对映体的纯度大于70:30的包含化合物6的组合物包含大于100mg的化合物6。
在第三个方面，本发明涉及包含化合物6的试剂盒，特别是包含至少100mg的化合物6的试剂盒，以及至少一种附加的试剂，用于鹅膏毒素或其前体的合成。
在具体的实施方案中，在试剂盒中化合物6具有大于90％，特别是大于95％的纯度，和/或大于70:30非对映体的纯度。
在具体的实施方案中，所述至少一种附加的试剂从下面列表中选择：
(i)树脂，特别是从下组中选择的树脂：Merrifield树脂；Rink-Amid树脂；和THP树脂；
(ii)受保护的羟脯氨酸，特别是芴甲氧羰基(Fmoc-)-保护的O-烯丙基羟脯氨酸(FmocHypOAll)；
(iii)受保护的天冬酰胺，特别是Fmoc保护的N-三苯甲基天冬酰胺(Fmoc(N-Tri)AsnOH)；
(iv)受保护的Cys-Trp二肽，特别是具有-SH和-OH保护基团的Fmoc保护的Cys-Trp二肽(FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]OH)；
(v)受保护的甘氨酸，特别是Fmoc保护的甘氨酸(FmocGly)；
(vi)受保护的异亮氨酸，特别是Fmoc保护的异亮氨酸(Fmoclle)；
(vii)缩氨酸偶联试剂，特别是从下组中选出的缩氨酸偶联试剂：O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)；六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)；和o-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)；和
(viii)叔胺，特别是Ν,Ν二异丙基乙胺(DIPEA)。
在又一个方面，本发明涉及一种用于合成鹅膏毒素或其前体分子的方法，该方法包含步骤(a)将化合物6耦合至羟基脯氨酸，特别是通过化合物6与羟脯氨酸-预装树脂反应，特别是通过将化合物6耦合至固定在树脂L，例如四氢吡喃(THP)树脂上的FmocHypOH的自由C-末端。
在具体的实施方案中，剩余的氨基酸随后由N末端合成策略耦合。特别地，这种实施方案中，本发明的方法还包含以下一个或多个步骤：
(b)反复FmocN-去保护和使用Fmoc-(N-Tri)Asn OH；FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]OH、Fmoc-Gly OH、Fmoc-Ile OH、Fmoc-Gly OH的G耦合以生成化合物H：
(c)H的O-烯丙基和N-Fmoc去保护，然后环化，以生成化合物I(B-环闭合)：
(d)2-硝基芳磺胺N-去保护和从树脂分离I生成化合物J：
(e)J的液相环化生成鹅膏蕈碱衍生物K：
在又一个方面，本发明涉及用于在溶液中合成鹅膏毒素，或其前体分子的方法。
在某些实施方案中，这样的方法包括一个或多个以下步骤：
(a)耦合化合物6至羟脯氨酸，特别是通过化合物6与羟脯氨酸反应，特别是通过耦合化合物6至Fmoc(OtBu)HypOH的自由C-末端；
(b)反复FmocN-去保护和使用Fmoc-(N-Tri)Asn OH；FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]OH、Fmoc-Gly OH、Fmoc-Ile OH、Fmoc-Gly OH的M耦合以生成化合物N；
(c)N-和S-三苯甲基，O-叔丁基和N-叔丁氧羰保护基的酸去保护和通过Savige-Fontana反应的原位闭环(Savige&Fontana,Int J Pept Protein Res.15(1980)102-12)，得到化合物J。
在另一个方面，本发明涉及一种用于在溶液中合成鹅膏毒素或其前体分子的方法，其包含耦合化合物6至羟脯氨酸，特别是通过化合物6与羟脯氨酸反应，特别是通过耦合化合物6至Fmoc(OtBu)HypOH的自由C-末端的步骤。
在具体的实施方案中，鹅膏毒素是具有二羟异亮氨酸部分作为氨基酸3的鹅膏毒素(参见图1)。
在本发明的上下文中，术语“鹅膏毒素”包括由8个氨基酸组成的所有环肽，如从鹅膏属中分离并在Wieland,T.和Faulstich H中(Wieland T,Faulstich H.,CRC Crit Rev Biochem.1978Dec；5(3):185-260)描述的，并且还包括其所有的化学衍生物；还有其所有的半合成类似物；进一步地从根据天然化合物主要结构的结构单元构造的其所有合成类似物(环状的，8个氨基酸)，进一步地含有非羟基化氨基酸而非羟基化氨基酸的所有合成或半合成类似物，进一步地符合以下条件的所有合成或半合成类似物：其中硫醚亚砜部分被替换为硫化物、砜、或不同于硫的原子，例如作为鹅膏蕈碱的碳类似物中的碳原子，在每一种情况下，其中任何这样的衍生物或类似物通过抑制哺乳动物RNA聚合酶II是功能活性的。
在功能上，鹅膏毒素被定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或缩肽类。优选的鹅膏毒素是具有可与如上述定义的连接子分子或靶结合部分进行反应的官能团(例如羧基，氨基，羟基，硫醇或硫醇捕获组)的那些。特别适合于本发明偶联物的鹅膏毒素是如图1中所示的α-鹅膏蕈碱，β-鹅膏蕈碱，γ-鹅膏蕈碱，ε-鹅膏蕈碱，鹅膏素，鹅膏素酰胺(amaninamide)，鹅膏无毒环肽和肽羧酸以及其盐，化学衍生物，半合成类似物，以及合成类似物。本发明中使用的特别优选的鹅膏毒素是α-鹅膏蕈碱，β-鹅膏蕈碱，和鹅膏素酰胺。
本文所使用的，化合物的“化学衍生物”(或简称：“衍生物”)是指具有类似于化合物的化学结构，但含有不存在于化合物中的至少一个化学基团和/或不含有存在于化合物中的至少一个化学基团的物种。与衍生物相比，化合物被称为“母体”化合物。通常，“衍生物”可以由母体化合物以一个或多个化学反应步骤制备。
实例
在下文中，通过非限制性例子对本发明进行更详细地说明：
实例1
使用丙醛和N-PMP乙二醛胺(N-PMP Glyoxalimine)的曼尼希反应
1的关键结构特征之一是氨基和甲基的2S，3R构象。用于构造相邻立体中心的简单路径是曼尼希反应。但是这两种立体中心推测抗曼尼希型反应，具有高的非对映和对映控制。这个假设在J.Am.Chem.Society.,2006,128,1040-1041中通过使用容易描述的设计的有机催化剂进行描述。然而，不同的去除PMP-基的方法失败了，并给出了反应混合物，从而使得最终放弃了这种方法。在文献中已知去除可能是繁琐的且不成功的，虽然PMP-基对反应是必要的。
实例2
天门冬氨酸衍生物的烷基化
2.1简介
用于合成具有正确立体构型(2S，3R，4R)的γ,δ-二羟异亮氨酸合成子的替代方法从天冬氨酸衍生物3开始。类似的方法在文献中已有描述(参见Yoshida等,Alarge scale production of(3S,4S)-3-(tert-Butoxycarbonyl)amino-4-methylpyrrolidineand its analogs from L-Aspartic acid,Chem Pharm Bull(1996),44,1128–1131；Wolf和Rapoport,Conformationally constrained Peptides.Chirospecific Synthesis of4-Alkyl-Substituted g-Lactam-Bridged Dipeptides from L-Aspartic Acid’,J OrgChem(1989),54,3164-3173)。结果表明，这是至关重要的：(i)使用(ia)苄基和苯基芴基的组合，或(ib)两个苄基的组合用于保护自由氨基，和(ii)使用六甲基二硅基氮基锂(LHMDS)而非相应的钾盐。六甲基二硅基胺基钾(KHMDS)导致相反的构型。
2.2化合物2的合成
带有磁性搅拌棒、滴液漏斗和低温温度计的三颈圆底烧瓶中装入16.3mmol，8.7g的化合物3(参见实例3)，溶解于150ml无水四氢呋喃中，并冷却至-20℃。在15分钟内逐滴加入六甲基二硅基叠氮化锂，40ml在己烷中的1.0M溶液。反应在-20℃进行2小时，然后冷却至-80℃。最后加入12.2ml，19,6mmol，1.2当量的甲基碘。将反应缓慢加热并进一步在-20℃保持4小时。最后通过加入10ml甲醇将反应淬灭，温热至室温，倒入150ml水中。将水相用甲基叔丁基醚萃取，用MgSO4干燥并真空浓缩。粗制品：9.0g。粗制品的1H-NMR显示非对映选择性纯度超过5:1。产量7.2g，81％。
将粗制品通过快速色谱法纯化，330g二氧化硅，正己烷/叔丁基甲基醚0％至50％梯度洗脱。
1H-NMR:d 0.72(d,3H,J＝5.6Hz),1.03(s,9H),2.64(dt,1H,J＝5.6,8.4Hz),3.55(s,3H),3.85(d,1H,J＝8.4Hz),4.31(d,1H,J＝11.2Hz),4.65(d,1H,J＝11.2Hz),7.15–7.94(m,18H)。
2.3化合物2*的合成
类似于实例2.2，化合物2*可从3*合成。
实例3
化合物3的合成
3.1简介
根据由Dunn等人描述的方案(Dunn等.,Stereoselective synthesis of2,3-diamino acids.2,3-Diamino-4-phenylbutanoic acid,J.Org.Chem.55(1990)5017-25合成化合物3。
3.2化合物B的合成
在带有螺帽和搅拌棒的圆底玻璃量筒中放入25g，136mmol的L-天冬氨酸4-甲酯盐酸盐。单酯A悬浮于100ml二恶烷/四氢呋喃(1:1，V/V)和25ml硫酸中，并冷却至-30℃(低温恒温器)。2-甲基丙烯，冷凝入200g，3.56mol。盖上量筒并温热至室温。将反应混合物倒入1000ml饱和碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(5次400ml)萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥并真空浓缩。产量：17.88g，64.6％。
3.3化合物C的合成
带有温度计和搅拌棒的三颈圆底烧瓶中装入17.9g，87.9mmol的B，溶解于500ml甲醇和150ml乙酸中，逐滴加入苯甲醛，16.0ml，158mmol。反应在室温下进行2小时，最后冷却至0℃。在45分钟内加入氰基硼氢化钠，10.0g，159mmol，并在0℃下再搅拌15分钟。将反应混合物最后倒入1000ml碳酸氢钠中并搅拌10分钟。二氯甲烷萃取(5次250毫升)后，合并的有机相用MgSO4干燥并真空浓缩。粗制品：35g。产量14.3g，55.4％。
快速色谱法纯化，330g的SiO2，0至50％梯度正己烷/乙酸乙酯。
1H-NMR:d 1.42(s,9H),2.29(s,1H),2.62(t,2H,J＝9.2Hz),2.50(t,1H,J＝8Hz),3.62(s,3H),3.67(d,1H,17.6Hz),3.83(d,1H,J＝17.2Hz),7.19–7.30(m,5H)。
3.4化合物3的合成
在带有搅拌棒的圆底烧瓶中装入C 21.3g，51.6mmol，在500ml乙腈中。加入9-溴-9-苯基芴25.0g，77.8mmol，20.0g，60.3mmol硝酸铅，31.7g，149.3mmol K3PO4。将反应混合物在室温下保持2.0小时。完成后，反应用500ml二氯甲烷稀释，经Na2SO4干燥和硅藻土过滤。将产物在真空中浓缩。产量：16.2g，41.7％。
快速色谱法纯化，330g的SiO2，正己烷/乙酸乙酯，梯度0至50％。
1H-NMR:d 1.14(s,9H),1.92(dd,1H,J＝2.8,16Hz),2.54(dd,1H,10.8,15.8Hz),3.40(s,3H),3.86(d,1H,J＝13.6Hz),4.21(d,1H,J＝14Hz),7.17–7.83(m,18H)。
实例4
化合物6的合成
4.1化合物D的合成
带有搅拌棒、温度计和滴液漏斗的圆底烧瓶中装入16.4g，29.9mmol，溶解于150ml无水四氢呋喃中的2，并冷却至-30℃。在1小时内在惰性气氛(氩气)中加入1.0M二异丁基氢化铝溶液(150毫升)并再搅拌16小时。反应用十水合Na2SO4水解并温热至室温。将沉淀滤出并用叔丁基甲基醚充分洗涤。将有机相真空浓缩。产量：14.3g，92％。
快速色谱法纯化，330g的SiO2，正己烷/乙酸乙酯，梯度0至50％。
1H-NMR:d 0.45(d,3H,J＝6.8Hz),1.02(s,9H),3.09(d,1H,J＝10.8Hz),3.34(dq,1H,J＝7.2Hz,J＝14.8Hz),4.00(d,2H,J＝10.8Hz),4.36(d,1H,13.6Hz),4.73(d,1H,J＝13.6Hz),7.20–7.76(m,18H)。
4.2化合物E的合成
装有搅拌棒，温度计，滴液漏斗和氩气入口的圆底烧瓶中装入草酰氯3.28ml，35.5mmol在二氯甲烷中，并冷却至-80℃。缓慢加入用20ml二氯甲烷稀释的无水二甲基亚砜5.47ml，71.1mmol。将溶解于30ml二氯甲烷中的化合物D13.67g，25.9mmol历时15分钟加入。在-80℃下保持另外的15分钟后，加入三乙胺，将反应温热至室温。两个层分离，并且用二氯甲烷(4次150ml)萃取水层。将合并的有机相用MgSO4干燥并真空浓缩。粗制品：16.9g。将粗制品直接转化为烯烃。
4.3化合物4的合成
带有搅拌棒，温度计和氩气入口的圆底烧瓶中装入悬浮于120ml二甲亚砜中的氢化钠2.32g，57.9mmol。将悬浮液温热至50℃保持30分钟并冷却到室温。然后加入固体甲基三苯基溴化磷，搅拌15分钟。加入溶解在20毫升二甲基亚砜中的粗制品E，再搅拌16小时。水解(300毫升水)后，乙酸乙酯萃取(4次150ml)，将合并的有机相用水(3次150ml)和盐水充分洗涤，溶液用MgSO4干燥并真空浓缩。产量：13.3g，99.2％(2步)。
快速色谱法纯化，330g的SiO2，正己烷/乙酸乙酯，梯度0至80％。
1H-NMR:d 0.51(d,3H,J＝1.6Hz),1.05(s,9H),2.14(hept,1H,J＝0.8Hz),3.15(d,1H,10.8Hz),4.30(d,1H,J＝14Hz),4.49(dd,1H,J＝1.2,17.6Hz),4.57(d,1H,13.6Hz),5.03(d,1H,J＝0.8,10.8Hz),5.95(m,1H),7.26–7.60(m,18H)。
4.4化合物F的合成
在圆底烧瓶中装入100g AD-混合物(β，商业源)，并溶解在60ml叔丁醇/水(1:1，V/V)中。一次性加入溶于17ml二恶烷中的化合物5，3.75g，7.3mmol。将反应在室温下搅拌4天，直到反应完成。通过加入Na2SO3使反应猝灭并用乙酸乙酯(4次50ml)萃取，用饱和的NH4Cl和盐水洗涤，用MgSO4干燥并真空浓缩。产量：1.19g，29％。
快速色谱法纯化，330g的SiO2，二氯甲烷/甲基叔丁基醚，梯度0至80％。
1H-NMR:d 0.38(D,3H,J＝6.8Hz),1.03(s,9H),1.84(s+m,2H,J＝8.8Hz),3.24(dd,1H,J＝4.8,11.4Hz),3.38(d,2H,J＝10.9Hz),3.76(m,1H),4.40(d,1H,J＝13.3Hz),4.95(d,1H,J＝13.3Hz),5.55(s,1H),7.26–7.91(m,18H)。
4.4化合物5的合成
在带有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中装入溶解于75ml二氯甲烷中的F，2.1g，3.64mmol。加入过量的乙酸酐，5.0ml，52.3mmol和催化量二甲氨基吡啶。使反应在室温下搅拌过夜。产量：1.83g，81％。
快速色谱法纯化，330g的SiO2，己烷/甲基叔丁基醚梯度0％至20％。
1H-NMR:d 0.49(d,3H,J＝7.2Hz),1.05(s,9H),1.74(m,1H,J＝2.90Hz),1.88(s,3H),2.11(s,3H),3.18(d,1H,J＝10.5Hz),3.60(dd,1H,J＝2.3,12.2Hz),4.32(d,1H,J＝13.9Hz),4.74(d,1H,J＝13.9Hz),5.98(dd,1H,J＝2.4,84Hz),7.10–7.73(m,18H)。
4.4化合物6的合成
在配备有氩气入口和真空歧管的圆底烧瓶中装入在50毫升乙醇中的0.1M盐酸中溶解的5，2.0g，3.1mmol和200mg 10％的钯碳催化剂。用氢气冲洗烧瓶后，在室温下搅拌反应16小时。烧瓶用氩气冲洗，过滤并真空浓缩滤液。将澄清的油用正己烷(3次)处理以除掉苯基芴。得到的6的盐酸盐为白色固体。产量：0.92g，98％。
通过沉淀或色谱法纯化。
1H-NMR:(major isomer)d 1.16(d,3H,J＝6.8Hz),1.47(S,9H),2.06(s,3H),2.09(s,3H),2.78(m,1H,J＝7.7Hz),4.04(dd,1H,J＝3.9,12.5Hz),4.15(s,1H),4.52(dd,2H,J＝2.08,12.6Hz),5.02(m,2H),8.86(s,2H)。
13C-NMR:(主要异构体)d 11.5,20.8,21.7,35.0,53.9,62.4,72.2,84.9,166.2,169.9,170.7。
实例5
α-鹅膏毒素的合成
5.1化合物G的合成
在装配有玻璃质排液阀的开放式容器聚丙烯反应管中装入0.5g，0.5mmolFmocHypOH四氢吡喃聚苯乙烯，并使其在3.0ml二甲基甲酰胺中溶胀20分钟。通过排液阀除去溶剂后，将反应容器中装入溶解于1.5ml二甲基甲酰胺中的179mg，0.6mmol的6，1.5ml二甲基甲酰胺中的羟基苯并噻唑的1mM溶液，1.5毫升的二甲基甲酰胺中的(苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸盐的1mM溶液和259μl二异丙基乙胺。用玻璃棒均化后，将反应微波辅助加热至70℃保持4.0分钟，最后用二甲基甲酰胺(3次)和二氯甲烷(2次)洗涤。
约20mg的聚合物的等分试样用三氟乙酸/水/三乙基硅烷(8:2:10；体积/体积/体积)裂解用于质谱分析。
MS:582.92；[M-tBu+H]+；Fmoc-Hyp-二(O-乙酰基)二羟基-Ile-OtBu
5.2化合物H的合成
然后按如下使化合物G反复地进行Fmoc去保护并与剩余6个氨基酸耦合：
FMOC-N-去保护：
将树脂用4.5ml二甲基甲酰胺中的20％哌啶溶液处理两次，并微波辅助加热至70℃保持3分钟。然后将树脂用二甲基甲酰胺洗涤(3次)。
氨基酸耦合：
1.5毫升二甲基甲酰胺中的去保护树脂结合的缩氨酸相继与溶解于1.5ml二甲基甲酰胺中的氨基酸(参见列表)，1.5毫升的二甲基甲酰胺中的羟基苯并噻唑的1mM溶液，1.5毫升的二甲基甲酰胺中的(苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸盐的1mM溶液和259μl二异丙基乙胺反应。用玻璃棒均化后，将反应微波辅助加热至70℃保持4.0分钟，最后用二甲基甲酰胺(3次)和二氯甲烷(2次)洗涤。
将约20mg的聚合物的等分试样用三氟乙酸/水/三乙基硅烷(8:2:10；体积/体积/体积)裂解用于质谱分析。
被耦合的氨基酸：
1.Fmoc-(N-Tri)Asn OH
2.Fmoc-Cys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]OH
3.Fmoc-Gly OH
4.Fmoc-Ile OH
5.Fmoc-Gly OH
MS:1227.14；[M-tBu+H]+；1283.00；[M+H]+；FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]-Asn-Hyp-二(O-乙酰基)二羟基-Ile-OtBu。
MS:1453.98；[M-tBu+H]+；[M+H]+；FmocGly-Ile-Gly-Cys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]-Asn-Hyp-二(O-乙酰基)二羟基-Ile-OtBu。
5.3化合物I的合成；B-环闭合
B环环化之前树脂H相继进行烯丙基-和Fmoc-去保护：
烯丙基-O-去保护
在室温下，二氯甲烷中，使树脂与874mg，5.6mmolΝ,Ν二甲基巴比妥酸，258mg，0.224mmol的Pd(PPh3)4振摇过夜。16小时后，用二氯甲烷；二甲基甲酰胺；乙腈；和甲基叔丁基醚洗涤树脂。
FMOC-N-去保护：
树脂用4.5ml二甲基甲酰胺中的20％哌啶溶液处理两次，并微波辅助加热至70℃保持3分钟。然后将树脂用二甲基甲酰胺洗涤(3次)。
B-环形成
3.0毫升二甲基甲酰胺中的去保护树脂结合的缩氨酸与1.5ml二甲基甲酰胺中的1mM的羟基苯并噻唑溶液，1.5毫升的二甲基甲酰胺中的1mM的(苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸盐溶液和259μl二异丙基乙胺反应。用玻璃棒均化后，将反应微波辅助加热至70℃保持4.0分钟，最后用二甲基甲酰胺(3次)和二氯甲烷(2次)洗涤。
将约20mg的聚合物的等分试样用三氟乙酸/水/三乙基硅烷(8:2:10；体积/体积/体积)裂解用于质谱分析。
MS:1174.08；[M-tBu+H]+；1229.96；[M+H]+；[Gly-Ile-Gly-Cys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp))]ring-Asn-Hyp-二(O-乙酰基)二羟基-Ile-OtBu
5.42-NO2-苯磺酰-N-去保护和树脂分离，化合物J
使树脂I进行2-NO2-苯磺酰-去保护，最后与树脂分开。
2-NO2-苯磺酰-N-去保护
用在4ml二甲基甲酰胺中的500μl巯基乙醇和500μl氮杂双环十一烯重复处理树脂(3次)总共2小时。然后将树脂用二甲基甲酰胺，二氯甲烷，乙腈和甲基叔丁基醚强烈洗涤。
树脂分离：
然后将树脂用6ml三氟醋酸/水/三乙基硅烷(8:2:10；V/V/V)在室温下处理过夜，真空浓缩粗蛋白。
MS:989.18；[M-tBu+H]+；[Gly-Ile-Gly-Cys(S-2-(Trp))]ring-Asn-Hyp-二(O-乙酰基)二羟基-Ile-OtBu
5.5化合物K的合成；A-环形成
在带有搅拌棒的反应烧瓶中，将粗制品J溶解在25ml二甲基甲酰胺中。向该溶液中加入85μl，2.5mmol二异丙基乙胺和135μl，2.5mmol二苯基叠氮磷酸(diphenylphsophazide)。该反应混合物在室温下搅拌过夜。溶液最后真空浓缩，溶解在0.5ml甲醇中并纯化。产量：4.9mg。
将粗反应混合物通过预备的柱色谱纯化。
MS:858.94；[M+H]+
实例6
化合物3*的合成
类似于实施例3.4，化合物3*可通过使用苄基溴而非9-溴-9-苯基芴用于N-保护进行合成。
实例7
可选择的化合物6的合成
类似于实施例4，化合物6可以从化合物2*通过中间体化合物D*,E*,4*,F*和5*合成(每个中分别在相应化合物D，E，4，F和5中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基)。

Claims (16)

1.一种用于γ,δ-二羟异亮氨酸1或化合物6的合成方法，其包含以下步骤：
(d)在二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂(LHMDS)的存在下使用甲基碘甲基化化合物3或3*，所述化合物3*在化合物3中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基，以生成化合物2或2*，所述化合物2*在化合物2中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基；
(e)还原化合物2或化合物2*，以分别生成化合物D或D*，所述化合物D*在化合物D中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基；
(f)氧化羟基化合物D或D*，以分别生成化合物E或E*，所述化合物E*在化合物E中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基；
(g)在Wittig反应条件下转换E或E*，以分别生成化合物4或4*，所述化合物4*在化合物4中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基；
(h)在Sharpless氧化条件下转换化合物4或4*，以分别生成化合物F或F*，所述化合物F*在化合物F中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基；
(i)在催化酯化条件下转换F或F*，以分别生成化合物5或5*，所述化合物5*在化合物5中的氮原子上而非苯基芴基上具有第二苄基保护基；
以及
(j)使用钯催化加氢，使5或5*N-去保护，以生成化合物6：
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中，用二异丁基氢化铝还原化合物2或化合物2*，以分别生成化合物D或D*。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中，使用Swern氧化来氧化羟基化合物D或D*，以分别生成化合物E或E*。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的甲基化在醚中在-10℃至-80℃下进行12至20小时。
5.权利要求1至4任一项所述的方法，其还包含以下一个或多个步骤：
(a)L-天冬氨酸，一甲基酯A与2-甲基丙烯反应生成化合物B；
(b)B与苯甲醛反应生成化合物C；
(c)C与苯芴溴反应生成化合物3，或与苄基溴反应生成化合物3*；
6.权利要求1所述的方法，其还包含分离和纯化化合物6的步骤。
7.权利要求5所述的方法，其还包含分离和纯化化合物6的步骤。
8.权利要求6或7所述的方法，其中化合物6使用沉淀为盐酸盐和/或层析法纯化进行纯化。
9.结构为6的化合物：
10.权利要求9所述的化合物，其中化合物6具有大于90％的纯度。
11.权利要求9所述的化合物，其中化合物6具有大于95％的纯度。
12.权利要求9所述的化合物，其中化合物6具有大于70:30的非对映体的纯度。
13.一种用于鹅膏毒素或鹅膏毒素前体化合物K的合成的试剂盒，其包含化合物6，以及一种或多种附加的试剂：
其中所述一种或多种附加的试剂从下面列表中选择：
(i)从下组中选择的树脂：Merrifield树脂；Rink-Amid树脂；和THP树脂；
(ii)芴甲氧羰基(Fmoc-)-保护的O-烯丙基羟脯氨酸(FmocHypOAll)；
(iii)Fmoc保护的N-三苯甲基天冬酰胺(Fmoc(N-Tri)AsnOH)；
(iv)具有-SH和-OH保护基团的Fmoc保护的Cys-Trp二肽(FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]OH)；
(v)Fmoc保护的甘氨酸(FmocGly)；
(vi)Fmoc保护的异亮氨酸(Fmoclle)；
(vii)从下组中选出的缩氨酸偶联试剂：O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)；六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)；和o-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)；和
(viii)Ν,Ν二异丙基乙胺(DIPEA)。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少100mg的化合物6。
15.一种用于合成以二羟基异亮氨酸部分作为氨基酸3的式I所示鹅膏毒素：
或鹅膏毒素前体化合物K的方法，其包含以下步骤：
(a)将化合物6耦合至羟基脯氨酸，其通过化合物6与羟脯氨酸-预装树脂反应实现；
(b)反复的Fmoc-N-去保护和G与Fmoc-(N-Tri)Asn OH；FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]OH、Fmoc-Gly OH、Fmoc-Ile OH、Fmoc-Gly OH的耦合以生成化合物H：
(c)H的O-烯丙基和Fmoc-N去保护，然后环化，以生成化合物I(B-环闭合)：
(d)2-硝基芳磺胺N-去保护和从树脂分离I生成J：
(e)J的液相环化生成鹅膏蕈碱衍生物K：
16.权利要求15所述的方法，其中步骤(a)中，通过将化合物6耦合至固定在选自四氢吡喃(THP)树脂的树脂L上的FmocHypOH的自由C-末端，使化合物6与羟脯氨酸-预装载树脂反应。
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