JPH11137291A - アマニチン類の製造法 - Google Patents
アマニチン類の製造法Info
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- JPH11137291A JPH11137291A JP31054397A JP31054397A JPH11137291A JP H11137291 A JPH11137291 A JP H11137291A JP 31054397 A JP31054397 A JP 31054397A JP 31054397 A JP31054397 A JP 31054397A JP H11137291 A JPH11137291 A JP H11137291A
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- Japan
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- amanitins
- amanitin
- culture
- producing
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アマニチン類を安価に容易に入手しうるよう
工業的生産の方法を開発することを課題とする。 【解決手段】 ケコガサタケ属に属する菌株であるコレ
ラタケ（Galerina fasciculata）又はヒメアジロガサ
モドキ（Galerina helvoliceps）を培養することによ
り、アマニチン類を生産できることを見出した。
工業的生産の方法を開発することを課題とする。 【解決手段】 ケコガサタケ属に属する菌株であるコレ
ラタケ（Galerina fasciculata）又はヒメアジロガサ
モドキ（Galerina helvoliceps）を培養することによ
り、アマニチン類を生産できることを見出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】遺伝子転写、発現機構等を解
明するために必要なアマニチン類を工業的に生産するこ
とに関する。
明するために必要なアマニチン類を工業的に生産するこ
とに関する。
【０００２】
【従来の技術】アマニチン類は、化学合成されておら
ず、主に北部ヨーロッパ、北アメリカ等のテングタケ
（Amanita）属のタマゴテングタケ（Amanita phalloide
s）の天然に産する子実体（キノコ）からの抽出、精製
によって製造されており、ＲＮＡ合成酵素阻害薬などと
して使用される研究試薬の一つである。しかし、このキ
ノコは日本国内ではその発生が稀で、菌根菌類の仲間で
あるために、子実体の人工栽培に成功していないのみな
らず、菌糸体培養すら困難である。よって、アマニチン
類の生産は、地理的、自然的、季節的な条件の制約によ
り原料採取が限られ、天然物に頼らざるを得ないために
安定した供給ができていないのが現状である。
ず、主に北部ヨーロッパ、北アメリカ等のテングタケ
（Amanita）属のタマゴテングタケ（Amanita phalloide
s）の天然に産する子実体（キノコ）からの抽出、精製
によって製造されており、ＲＮＡ合成酵素阻害薬などと
して使用される研究試薬の一つである。しかし、このキ
ノコは日本国内ではその発生が稀で、菌根菌類の仲間で
あるために、子実体の人工栽培に成功していないのみな
らず、菌糸体培養すら困難である。よって、アマニチン
類の生産は、地理的、自然的、季節的な条件の制約によ
り原料採取が限られ、天然物に頼らざるを得ないために
安定した供給ができていないのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】アマニチン類を安価に
容易に入手しうるよう工業的生産の方法を開発すること
を課題とする。
容易に入手しうるよう工業的生産の方法を開発すること
を課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明者等は鋭意努力した結果、ケコガサタケ属に
属する菌株であるコレラタケ（Galerina fasciculat
a）又はヒメアジロガサモドキ（Galerina helvolicep
s）を培養することにより、アマニチン類を生産できる
ことを見出した。更に、これらの菌株においては、培養
の条件を最適化することで、培養物中のアマニチン類の
産生効率を飛躍的に増加させうること、また、本菌株を
固体上で生育させた場合、その培養物中に主にα-アマ
ニチンとその１/３程度のβ-アマニチンが見出される
が、液体培養にて生育させた培養物中には、主にα-ア
マニチンと、稀少性が高く、誘導体化原料としての利用
価値の高いγ-アマニチンが多く含まれることを知り、
培養方法の選択によって、各類縁体の選択的、且つ、効
率的な生産ができることを見出した。
め、本発明者等は鋭意努力した結果、ケコガサタケ属に
属する菌株であるコレラタケ（Galerina fasciculat
a）又はヒメアジロガサモドキ（Galerina helvolicep
s）を培養することにより、アマニチン類を生産できる
ことを見出した。更に、これらの菌株においては、培養
の条件を最適化することで、培養物中のアマニチン類の
産生効率を飛躍的に増加させうること、また、本菌株を
固体上で生育させた場合、その培養物中に主にα-アマ
ニチンとその１/３程度のβ-アマニチンが見出される
が、液体培養にて生育させた培養物中には、主にα-ア
マニチンと、稀少性が高く、誘導体化原料としての利用
価値の高いγ-アマニチンが多く含まれることを知り、
培養方法の選択によって、各類縁体の選択的、且つ、効
率的な生産ができることを見出した。
【０００５】すなわち、本発明は、（１）アマニチン類
を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物からア
マニチン類を採取することを特徴とする、アマニチン類
の製造法、（２）微生物が担子菌類に属する菌であるこ
とを特徴とする（１）に記載のアマニチン類の製造法、
（３）担子菌類がケコガサタケ属（Galerina）に属する
菌であることを特徴とする（２）に記載のアマニチン類
の製造法、（４）ケコガサタケ属（Galerina）に属する
菌がコレラタケ（Galerina fasciculata）又はヒメア
ジロガサモドキ（Galerina helvoliceps）であること
を特徴とする（３）に記載のアマニチン類の製造法、
（５）液体培養によりα-アマニチン、γ-アマニチンを
製造することを特徴とする（１）、（２）、（３）又は
（４）に記載のアマニチン類の製造法、（６）固体培養
によりα-アマニチン、β-アマニチンを製造することを
特徴とする（１）、（２）、（３）又は（４）に記載の
アマニチン類の製造法に関するものである。
を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物からア
マニチン類を採取することを特徴とする、アマニチン類
の製造法、（２）微生物が担子菌類に属する菌であるこ
とを特徴とする（１）に記載のアマニチン類の製造法、
（３）担子菌類がケコガサタケ属（Galerina）に属する
菌であることを特徴とする（２）に記載のアマニチン類
の製造法、（４）ケコガサタケ属（Galerina）に属する
菌がコレラタケ（Galerina fasciculata）又はヒメア
ジロガサモドキ（Galerina helvoliceps）であること
を特徴とする（３）に記載のアマニチン類の製造法、
（５）液体培養によりα-アマニチン、γ-アマニチンを
製造することを特徴とする（１）、（２）、（３）又は
（４）に記載のアマニチン類の製造法、（６）固体培養
によりα-アマニチン、β-アマニチンを製造することを
特徴とする（１）、（２）、（３）又は（４）に記載の
アマニチン類の製造法に関するものである。
【０００６】本発明は、以上の知見に基づくもので、ア
マニチン類を生産する能力を有する微生物を培養し、培
養物からアマニチン類を採取することを特徴とする、ア
マニチン類の新規製造法である。本発明において用いる
微生物は、アマニチン類産生能を有する微生物である
が、その例としてコレラタケ（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９
９）、ヒメアジロガサモドキ（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９
８）が挙げられる。また、前記コレラタケ又はヒメアジ
ロガサモドキの自然的及び人工的変異株はもちろん、ア
マニチン類の産生能を有する微生物は、すべて本発明方
法において使用することができる。
マニチン類を生産する能力を有する微生物を培養し、培
養物からアマニチン類を採取することを特徴とする、ア
マニチン類の新規製造法である。本発明において用いる
微生物は、アマニチン類産生能を有する微生物である
が、その例としてコレラタケ（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９
９）、ヒメアジロガサモドキ（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９
８）が挙げられる。また、前記コレラタケ又はヒメアジ
ロガサモドキの自然的及び人工的変異株はもちろん、ア
マニチン類の産生能を有する微生物は、すべて本発明方
法において使用することができる。
【０００７】本発明を実施するに際して、培養は一般の
担子菌の培養方法と同様に行いうるが、培養基として一
般には炭素源として例えばデンプン類、グルコース、グ
リセリン、マルトース、サッカロース等、窒素源とし
て、例えば麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、
コーンスチープリカー、綿実粉、酵母エキス等、並びに
無機質として例えば塩化カリウム、硫酸マグネシウム、
炭酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウムその
他の燐酸塩、金属塩等を加えた弱酸性ないし中性の培養
基が用いられる。必要に応じて消泡剤として、動物、植
物、鉱物油等を添加しても良い。この培養基に本菌を接
種し、１５〜３０℃の温度で通気攪拌下に培養する。通
常は、１０〜３０日間の培養期間で生産されるアマニチ
ン類の濃度は最高に達するが、培養期間中、培養物中の
アマニチン類の濃度等を測定し、アマニチン類の生産効
率が最良となるように適宜希釈や、培養液置換等の調節
を行うことで培養期間の短縮化や、アマニチン類産生の
効率化が図れる。
担子菌の培養方法と同様に行いうるが、培養基として一
般には炭素源として例えばデンプン類、グルコース、グ
リセリン、マルトース、サッカロース等、窒素源とし
て、例えば麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、
コーンスチープリカー、綿実粉、酵母エキス等、並びに
無機質として例えば塩化カリウム、硫酸マグネシウム、
炭酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウムその
他の燐酸塩、金属塩等を加えた弱酸性ないし中性の培養
基が用いられる。必要に応じて消泡剤として、動物、植
物、鉱物油等を添加しても良い。この培養基に本菌を接
種し、１５〜３０℃の温度で通気攪拌下に培養する。通
常は、１０〜３０日間の培養期間で生産されるアマニチ
ン類の濃度は最高に達するが、培養期間中、培養物中の
アマニチン類の濃度等を測定し、アマニチン類の生産効
率が最良となるように適宜希釈や、培養液置換等の調節
を行うことで培養期間の短縮化や、アマニチン類産生の
効率化が図れる。
【０００８】また、固体上での培養は、フスマ、糠など
の穀物粕類上や、培養液を寒天等の固化材を用いて培養
基を固化せしめたものに本菌を接種し、培養基表面及び
培地内部へ菌糸を蔓延させることによって行える。培養
条件は、同一組成の培地を用いて同様に行っても変化す
ることがあるので、その都度アマニチン類の濃度を経時
的に測定することが望ましい。なお、それぞれのアマニ
チン類縁体の定量は、エンジャルバートらの方法に準じ
て行うことができる。（ジャーナル・オブ・クロマトグ
ラフィー ５９８巻、２２７〜２３６ページ、１９９２
年）
の穀物粕類上や、培養液を寒天等の固化材を用いて培養
基を固化せしめたものに本菌を接種し、培養基表面及び
培地内部へ菌糸を蔓延させることによって行える。培養
条件は、同一組成の培地を用いて同様に行っても変化す
ることがあるので、その都度アマニチン類の濃度を経時
的に測定することが望ましい。なお、それぞれのアマニ
チン類縁体の定量は、エンジャルバートらの方法に準じ
て行うことができる。（ジャーナル・オブ・クロマトグ
ラフィー ５９８巻、２２７〜２３６ページ、１９９２
年）
【０００９】本アマニチン類は、培養濾液及び菌体内の
いずれにも生産されるが、特に菌体内に多く蓄積され
る。また、天然のきのこや、固体培養した菌糸体より抽
出されるアマニチン類は、その類縁体の中でも主にα-
アマニチンとその１/３程度のβ-アマニチンが多く含ま
れるのが通常であるが、菌糸体の液体培養によって得ら
れる類縁体は、β-アマニチンが微量で主にα-アマニチ
ンと、γ-アマニチンが多く含まれるため、培養方法の
操作によって各類縁体の生産を調節できることも特徴で
ある。
いずれにも生産されるが、特に菌体内に多く蓄積され
る。また、天然のきのこや、固体培養した菌糸体より抽
出されるアマニチン類は、その類縁体の中でも主にα-
アマニチンとその１/３程度のβ-アマニチンが多く含ま
れるのが通常であるが、菌糸体の液体培養によって得ら
れる類縁体は、β-アマニチンが微量で主にα-アマニチ
ンと、γ-アマニチンが多く含まれるため、培養方法の
操作によって各類縁体の生産を調節できることも特徴で
ある。
【００１０】こうして得られる培養物から目的とするア
マニチン類を採取するには、通常使用される物理化学的
方法を用いることができるが、例えば次のように操作す
る。培養物を濾過して菌体を得、ブレンダーなどで菌体
を磨砕し、抽出を行う。抽出溶媒としては、メタノー
ル、エタノール、水性ブタノール、酸性緩衝液等の本ア
マニチン類の物性に合致した溶媒を用いる。次いで、抽
出物を減圧濃縮し、有機溶媒を留去したものを酸性緩衝
液等に溶解し、ジエチルエーテルを加えて振盪後、油脂
分を含むエーテル相と不溶分を遠心分離などで除く。得
られたアマニチン類を含む水性粗抽出画分を、市販のオ
クタデシルシリカを固定相とする固相抽出カラムなどに
目的物を吸着させ、夾雑する親水性不純物を流し去る。
吸着された画分は、例えば、メタノール５〜８０％水溶
液などの有機溶媒を加えた水溶液を用いて目的物を溶出
させる。アマニチン類を含む溶出画分は、さらにオクタ
デシルシリカを担体とするカラムクロマトグラフィーで
精製することができる。
マニチン類を採取するには、通常使用される物理化学的
方法を用いることができるが、例えば次のように操作す
る。培養物を濾過して菌体を得、ブレンダーなどで菌体
を磨砕し、抽出を行う。抽出溶媒としては、メタノー
ル、エタノール、水性ブタノール、酸性緩衝液等の本ア
マニチン類の物性に合致した溶媒を用いる。次いで、抽
出物を減圧濃縮し、有機溶媒を留去したものを酸性緩衝
液等に溶解し、ジエチルエーテルを加えて振盪後、油脂
分を含むエーテル相と不溶分を遠心分離などで除く。得
られたアマニチン類を含む水性粗抽出画分を、市販のオ
クタデシルシリカを固定相とする固相抽出カラムなどに
目的物を吸着させ、夾雑する親水性不純物を流し去る。
吸着された画分は、例えば、メタノール５〜８０％水溶
液などの有機溶媒を加えた水溶液を用いて目的物を溶出
させる。アマニチン類を含む溶出画分は、さらにオクタ
デシルシリカを担体とするカラムクロマトグラフィーで
精製することができる。
【００１１】使用する溶媒系として例えば、メタノール
−酸性緩衝液系、アセトニトリルー酸性緩衝液系などの
水に易溶な有機溶媒との混合系がある。混合比は適宜そ
れを変化させ、極性を次第に小さくしながら溶出させ
る。これは段階的にも、或いはグラジェントに変化させ
てもよい。このようにして得られるアマニチン類は、β
-アマニチン、α-アマニチン、γ-アマニチンなどの類
縁体が認められ、それぞれのアマニチン類に相当する溶
出画分をフラクションコレクターなどを用いて分取し、
減圧下にて濃縮することで大略精製されたものが得られ
る。この段階で得られる各アマニチン類縁体粗抽出物を
更に精製するには、適宜の物理化学的方法を用いればよ
い。例えば、前述の方法で得られた各アマニチン画分を
それぞれゲル浸透クロマトグラフィーなどにかけること
により、目的の分子量に応じた画分を採取することがで
きる。
−酸性緩衝液系、アセトニトリルー酸性緩衝液系などの
水に易溶な有機溶媒との混合系がある。混合比は適宜そ
れを変化させ、極性を次第に小さくしながら溶出させ
る。これは段階的にも、或いはグラジェントに変化させ
てもよい。このようにして得られるアマニチン類は、β
-アマニチン、α-アマニチン、γ-アマニチンなどの類
縁体が認められ、それぞれのアマニチン類に相当する溶
出画分をフラクションコレクターなどを用いて分取し、
減圧下にて濃縮することで大略精製されたものが得られ
る。この段階で得られる各アマニチン類縁体粗抽出物を
更に精製するには、適宜の物理化学的方法を用いればよ
い。例えば、前述の方法で得られた各アマニチン画分を
それぞれゲル浸透クロマトグラフィーなどにかけること
により、目的の分子量に応じた画分を採取することがで
きる。
【００１２】すなわち、市販の液体クロマト用充填カラ
ム、例えばファルマシア社製スーパーデックスペプタイ
ドＨＲ１０/３０などを用いて、水系或いは有機溶媒を
含ませた溶出溶媒を用いて展開を行い、各アマニチンに
相当する画分のみを分取し、夾雑する不純物を除くこと
ができる。
ム、例えばファルマシア社製スーパーデックスペプタイ
ドＨＲ１０/３０などを用いて、水系或いは有機溶媒を
含ませた溶出溶媒を用いて展開を行い、各アマニチンに
相当する画分のみを分取し、夾雑する不純物を除くこと
ができる。
【００１３】このようにして得られる各アマニチンの類
縁体のそれぞれは、まだ若干の紫外部吸収を持つ不純物
を含むが、これはイオン交換樹脂等への吸脱着作用や、
特性の異なる担体を持つクロマトグラフなどの公知の方
法を適宜組み合わせることにより、取り除くことができ
る。以下、本発明を詳細に説明するために実施例を示す
が、もちろんこれに限定されるものではない。
縁体のそれぞれは、まだ若干の紫外部吸収を持つ不純物
を含むが、これはイオン交換樹脂等への吸脱着作用や、
特性の異なる担体を持つクロマトグラフなどの公知の方
法を適宜組み合わせることにより、取り除くことができ
る。以下、本発明を詳細に説明するために実施例を示す
が、もちろんこれに限定されるものではない。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明者は、まずアマニチン類を
含みかつ培養ができる腐朽菌を採取し、分離した株をス
クリーニングした結果、フウセンタケ科に属するコレラ
タケ（Galerina fasciculata）とヒメアジロガサモドキ
（G.helvoliceps）を見出した。これらの菌を液体中に
て深部培養を行い、培養菌糸体中より単離された物質を
同定したところ、α、β、γーアマニチンであることが
判明した。
含みかつ培養ができる腐朽菌を採取し、分離した株をス
クリーニングした結果、フウセンタケ科に属するコレラ
タケ（Galerina fasciculata）とヒメアジロガサモドキ
（G.helvoliceps）を見出した。これらの菌を液体中に
て深部培養を行い、培養菌糸体中より単離された物質を
同定したところ、α、β、γーアマニチンであることが
判明した。
【００１５】同定方法は、 １、ＨＰＬＣ-ＯＤＳでの４種類の溶出条件で、アマニ
チン標品と同一挙動であった。 ２、三次元ＵＶ、ＦＴ-ＩＲスペクトルが同一で、単離
結晶の熱分解温度も同一であった。 ３、３Ｔ３、ＳｉＨａの２種類のほ乳類培養細胞に対し
て、標準品と同一濃度で致死活性をあらわした。 ４、ＨＰＬＣ-ＧＰＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ ＨＲ10／30ゲル濾過カラムにおいて見積もられた
分子量は、約９２０であり、有機溶媒濃度を変化させて
溶出時間を変えても、標品と同一挙動であった。 ５、ＥＳＩ-ＭＳスペクトル測定において、分子量、フ
ラグメントイオン共に標品と一致した。 以上の結果によって同定を行った。
チン標品と同一挙動であった。 ２、三次元ＵＶ、ＦＴ-ＩＲスペクトルが同一で、単離
結晶の熱分解温度も同一であった。 ３、３Ｔ３、ＳｉＨａの２種類のほ乳類培養細胞に対し
て、標準品と同一濃度で致死活性をあらわした。 ４、ＨＰＬＣ-ＧＰＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ ＨＲ10／30ゲル濾過カラムにおいて見積もられた
分子量は、約９２０であり、有機溶媒濃度を変化させて
溶出時間を変えても、標品と同一挙動であった。 ５、ＥＳＩ-ＭＳスペクトル測定において、分子量、フ
ラグメントイオン共に標品と一致した。 以上の結果によって同定を行った。
【００１６】（実施例１）グルコース５ｇ/L 、マルツ
エキス２ｇ/L 、イーストエキス２ｇ/L 、塩化アンモニ
ウム０.１ｇ/L 、塩化カリウム０.１ｇ/L 、硫酸マグネ
シウム七水塩０.１ｇ/L 、硫酸カルシウム１/２水塩０.
２ｇ/L 、リン酸一カリウム１ｇ/L 、サイアミン塩酸塩
１ｍｇ/L 、ビオチン１００ｕｇ/L （ｐＨ５.０）を含
有する培地を調製し、その３０ｍｌずつを１００ｍｌ容
三角フラスコ２０本に入れ１２１℃で２０分加熱殺菌し
た。この培地に、コレラタケ（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９
９）を接種して２４.５℃、暗所で毎分１５０回転の旋
回振盪培養を７日間行ったものを種菌として次のタンク
培養に用いた。
エキス２ｇ/L 、イーストエキス２ｇ/L 、塩化アンモニ
ウム０.１ｇ/L 、塩化カリウム０.１ｇ/L 、硫酸マグネ
シウム七水塩０.１ｇ/L 、硫酸カルシウム１/２水塩０.
２ｇ/L 、リン酸一カリウム１ｇ/L 、サイアミン塩酸塩
１ｍｇ/L 、ビオチン１００ｕｇ/L （ｐＨ５.０）を含
有する培地を調製し、その３０ｍｌずつを１００ｍｌ容
三角フラスコ２０本に入れ１２１℃で２０分加熱殺菌し
た。この培地に、コレラタケ（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９
９）を接種して２４.５℃、暗所で毎分１５０回転の旋
回振盪培養を７日間行ったものを種菌として次のタンク
培養に用いた。
【００１７】３０L 容タンクに、前記の組成を有する液
体培地（ｐＨ５.０）２０L を入れ、１２１℃で３０分
間滅菌した後、前記で作成した種菌を５００ｍｌ接種
し、２４.５℃で毎分３０L の無菌空気を通気しながら
回転数２００回/分で攪拌培養した。
体培地（ｐＨ５.０）２０L を入れ、１２１℃で３０分
間滅菌した後、前記で作成した種菌を５００ｍｌ接種
し、２４.５℃で毎分３０L の無菌空気を通気しながら
回転数２００回/分で攪拌培養した。
【００１８】高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）によ
るアマニチン類の経時的測定の結果、２５日間の培養
で、培養物中のアマニチン類の濃度は最高に達した。得
られた培養物から、濾過により菌体を分取し、凍結乾燥
後、乾燥菌体１６２.２ｇを得た。この菌体を１０ｍＭ
当量の塩酸を加えたメタノール２L を加え、ホモゲナイ
ザーにて菌体を破砕し、攪拌抽出の後、遠心分離により
残渣と抽出液層に分け、液層を分取し、残渣は再び攪拌
抽出する操作を４回行い、得られた抽出液層を集めて減
圧下に濃縮し、黄褐色粘凋な抽出物を８.１ｇを得た。
るアマニチン類の経時的測定の結果、２５日間の培養
で、培養物中のアマニチン類の濃度は最高に達した。得
られた培養物から、濾過により菌体を分取し、凍結乾燥
後、乾燥菌体１６２.２ｇを得た。この菌体を１０ｍＭ
当量の塩酸を加えたメタノール２L を加え、ホモゲナイ
ザーにて菌体を破砕し、攪拌抽出の後、遠心分離により
残渣と抽出液層に分け、液層を分取し、残渣は再び攪拌
抽出する操作を４回行い、得られた抽出液層を集めて減
圧下に濃縮し、黄褐色粘凋な抽出物を８.１ｇを得た。
【００１９】この抽出物を１００ｍｌの純水に溶解し、
同量のジエチルエーテルを加え脱脂の後、水層を遠心分
離により回収した。この水層をあらかじめ水和させてお
いた市販固相抽出カラム（ウォーターズ社製Ｓｅｐ-Ｐ
ａｋ Ｖａｃ ｔＣ１８）に通液し、５０ｍｌの純水に
て洗浄の後、通過した液を捨て去った。更に、８０％メ
タノール５０ｍｌを通液し、通過した液を分取し、吸着
されていたアマニチン類を含む画分を回収し、減圧下に
濃縮した。
同量のジエチルエーテルを加え脱脂の後、水層を遠心分
離により回収した。この水層をあらかじめ水和させてお
いた市販固相抽出カラム（ウォーターズ社製Ｓｅｐ-Ｐ
ａｋ Ｖａｃ ｔＣ１８）に通液し、５０ｍｌの純水に
て洗浄の後、通過した液を捨て去った。更に、８０％メ
タノール５０ｍｌを通液し、通過した液を分取し、吸着
されていたアマニチン類を含む画分を回収し、減圧下に
濃縮した。
【００２０】得られた濃縮画分を前述のアマニチン類縁
体の定量法に準じて予めコンディショニングされたＯＤ
Ｓカラム（ウォーターズ社製マイクロボンダスフェアＣ
-１８-１００Å１９ｍｍＸ１５ｃｍ）を装着したＨＰＬ
Ｃ装置に導入し、紫外可視光ダイオードアレイ検出器で
モニターしながら各アマニチン類に相当する画分をそれ
ぞれ独立に分取、濃縮し、β、αおよびγ-アマニチン
の粗精製品を得た。
体の定量法に準じて予めコンディショニングされたＯＤ
Ｓカラム（ウォーターズ社製マイクロボンダスフェアＣ
-１８-１００Å１９ｍｍＸ１５ｃｍ）を装着したＨＰＬ
Ｃ装置に導入し、紫外可視光ダイオードアレイ検出器で
モニターしながら各アマニチン類に相当する画分をそれ
ぞれ独立に分取、濃縮し、β、αおよびγ-アマニチン
の粗精製品を得た。
【００２１】各粗精製品を含む濃縮画分をそれぞれ独立
に次のゲル濾過操作に供した。予め、５％アセトニトリ
ルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５.
０）にて平衡化させておいたゲル濾過カラム（ファルマ
シア社製スーパーデックスペプタイドＨＲ１０/３０）
に、粗精製した各アマニチン類縁体を導入し、紫外可視
光スペクトルをモニターしながら各類縁体の分子量及び
スペクトルが一致した溶出画分を分取濃縮した。
に次のゲル濾過操作に供した。予め、５％アセトニトリ
ルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５.
０）にて平衡化させておいたゲル濾過カラム（ファルマ
シア社製スーパーデックスペプタイドＨＲ１０/３０）
に、粗精製した各アマニチン類縁体を導入し、紫外可視
光スペクトルをモニターしながら各類縁体の分子量及び
スペクトルが一致した溶出画分を分取濃縮した。
【００２２】更に、それぞれの画分を予め溶離液として
１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ-酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ５.０）で平衡化した前記のＯＤＳカラ
ムを装着したＨＰＬＣ装置に各画分をそれぞれ導入し、
同溶離液のみを用いて展開を行い、紫外可視光ダイオー
ドアレイ検出器でモニターしながら各アマニチン類に相
当する画分をそれぞれ独立に分取し、凍結乾燥を行い、
α、β及びγ- アマニチンの白色粉末精製品をそれぞれ
１６５.２ｍｇ、１.０２ｍｇ、２７.８ｍｇを得た。
１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ-酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ５.０）で平衡化した前記のＯＤＳカラ
ムを装着したＨＰＬＣ装置に各画分をそれぞれ導入し、
同溶離液のみを用いて展開を行い、紫外可視光ダイオー
ドアレイ検出器でモニターしながら各アマニチン類に相
当する画分をそれぞれ独立に分取し、凍結乾燥を行い、
α、β及びγ- アマニチンの白色粉末精製品をそれぞれ
１６５.２ｍｇ、１.０２ｍｇ、２７.８ｍｇを得た。
【００２３】（実施例２）実施例１記載の培養基組成に
加え、培養基１L 当たり２０ｇの寒天粉末を加え加熱溶
解、殺菌後、内径９ｃｍの滅菌シャーレを用い、１枚当
たり２０ｍｌの培地を無菌的に分注、固化させた固体培
地１０枚を調製した。この培地の中央に、コレラタケ
（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９９）を接種して２４.５℃、
暗所で静置培養を３０日間行った。固体培地上で得られ
た培養物１０枚を寒天とともにはがし、凍結乾燥し、寒
天末等を含む乾燥菌糸体７.１ｇを得た。
加え、培養基１L 当たり２０ｇの寒天粉末を加え加熱溶
解、殺菌後、内径９ｃｍの滅菌シャーレを用い、１枚当
たり２０ｍｌの培地を無菌的に分注、固化させた固体培
地１０枚を調製した。この培地の中央に、コレラタケ
（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４９９）を接種して２４.５℃、
暗所で静置培養を３０日間行った。固体培地上で得られ
た培養物１０枚を寒天とともにはがし、凍結乾燥し、寒
天末等を含む乾燥菌糸体７.１ｇを得た。
【００２４】これを細分化し、実施例１で用いた塩酸酸
性メタノール１L を加え、実施例１と同様にホモゲナイ
ズ抽出を４回行い、減圧濃縮後、アマニチン類を含む画
分を得た。得られた液を以下、実施例１記載の方法と同
様に精製操作を行い、α、β及びγ- アマニチンの白色
粉末精製品をそれぞれ６.０８ｍｇ、２.２９ｍｇ、０.
０１２ｍｇ得た。
性メタノール１L を加え、実施例１と同様にホモゲナイ
ズ抽出を４回行い、減圧濃縮後、アマニチン類を含む画
分を得た。得られた液を以下、実施例１記載の方法と同
様に精製操作を行い、α、β及びγ- アマニチンの白色
粉末精製品をそれぞれ６.０８ｍｇ、２.２９ｍｇ、０.
０１２ｍｇ得た。
【００２５】（実施例３）実施例２に記載の方法で作製
した固体培地１０枚に、ヒメアジロガサモドキ（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６４９８）を接種し、２４.５℃、暗所で静
置培養を３０日間行った。固体培地上で得られた培養物
１０枚を寒天とともにはがし、凍結乾燥し、寒天末等を
含む乾燥菌糸体６.９ｇを得た。これを細分化し、実施
例１で用いた塩酸酸性メタノール１L を加え、実施例１
と同様にホモゲナイズ抽出を４回行い、減圧濃縮後、ア
マニチン類を含む濃縮画分を得た。得られた液を以下、
実施例１記載の方法と同様に精製操作を行い、α、β及
びγ- アマニチンの白色粉末精製品をそれぞれ３.５ｍ
ｇ、０.２９ｍｇ、０.０８ｍｇ得た。
した固体培地１０枚に、ヒメアジロガサモドキ（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６４９８）を接種し、２４.５℃、暗所で静
置培養を３０日間行った。固体培地上で得られた培養物
１０枚を寒天とともにはがし、凍結乾燥し、寒天末等を
含む乾燥菌糸体６.９ｇを得た。これを細分化し、実施
例１で用いた塩酸酸性メタノール１L を加え、実施例１
と同様にホモゲナイズ抽出を４回行い、減圧濃縮後、ア
マニチン類を含む濃縮画分を得た。得られた液を以下、
実施例１記載の方法と同様に精製操作を行い、α、β及
びγ- アマニチンの白色粉末精製品をそれぞれ３.５ｍ
ｇ、０.２９ｍｇ、０.０８ｍｇ得た。
【００２６】
【発明の効果】本発明での培養法による生産を行うこと
により、液体培養においては、主にα及びγ- アマニチ
ンを、また、固体上の培養においては、主にα及びβ-
アマニチンを選択的に生産することができる。本発明で
の培養法によるアマニチン類の生産では、天然物からの
抽出と異なり、成分的なバラツキもなく能率的に、且
つ、廉価で安定的に高純度で供給できることとなり、遺
伝子工学や、細胞生物学研究などへの利用、代謝研究で
の標識誘導体化の原材料などとして、極めて有益なる効
果を奏するものである。
により、液体培養においては、主にα及びγ- アマニチ
ンを、また、固体上の培養においては、主にα及びβ-
アマニチンを選択的に生産することができる。本発明で
の培養法によるアマニチン類の生産では、天然物からの
抽出と異なり、成分的なバラツキもなく能率的に、且
つ、廉価で安定的に高純度で供給できることとなり、遺
伝子工学や、細胞生物学研究などへの利用、代謝研究で
の標識誘導体化の原材料などとして、極めて有益なる効
果を奏するものである。
【図１】本発明で得られるα- アマニチンと市販標準品
の臭化カリ中の赤外吸収スペクトルの比較を示す図。
の臭化カリ中の赤外吸収スペクトルの比較を示す図。
【図２】本発明で得られるα- アマニチンと市販標準品
の質量分析スペクトルの比較を示す図。
の質量分析スペクトルの比較を示す図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (6)
- 【請求項１】 アマニチン類を生産する能力を有する微
生物を培養し、培養物からアマニチン類を採取すること
を特徴とする、アマニチン類の製造法。 - 【請求項２】 微生物が担子菌類に属する菌であること
を特徴とする請求項１に記載のアマニチン類の製造法。 - 【請求項３】 担子菌類がケコガサタケ属（Galerina）
に属する菌であることを特徴とする請求項２に記載のア
マニチン類の製造法。 - 【請求項４】 ケコガサタケ属（Galerina）に属する菌
がコレラタケ（Galerina fasciculata）又はヒメアジ
ロガサモドキ（Galerina helvoliceps）であることを
特徴とする請求項３に記載のアマニチン類の製造法。 - 【請求項５】 液体培養によりα-アマニチン、γ-アマ
ニチンを製造することを特徴とする請求項１、２、３又
は４に記載のアマニチン類の製造法。 - 【請求項６】 固体培養によりα-アマニチン、β-アマ
ニチンを製造することを特徴とする請求項１、２、３又
は４に記載のアマニチン類の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31054397A JPH11137291A (ja) | 1997-11-12 | 1997-11-12 | アマニチン類の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31054397A JPH11137291A (ja) | 1997-11-12 | 1997-11-12 | アマニチン類の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11137291A true JPH11137291A (ja) | 1999-05-25 |
Family
ID=18006509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31054397A Pending JPH11137291A (ja) | 1997-11-12 | 1997-11-12 | アマニチン類の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11137291A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104470891A (zh) * | 2012-07-13 | 2015-03-25 | 海德堡医药有限责任公司 | 用于合成鹅膏毒素结构单元及鹅膏毒素的方法 |
| EP3888691A1 (en) | 2016-11-14 | 2021-10-06 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. | Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers |
-
1997
- 1997-11-12 JP JP31054397A patent/JPH11137291A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104470891A (zh) * | 2012-07-13 | 2015-03-25 | 海德堡医药有限责任公司 | 用于合成鹅膏毒素结构单元及鹅膏毒素的方法 |
| CN104470891B (zh) * | 2012-07-13 | 2016-10-12 | 海德堡医药有限责任公司 | 用于合成鹅膏毒素结构单元及鹅膏毒素的方法 |
| US9676702B2 (en) | 2012-07-13 | 2017-06-13 | Heidelberg Pharma Gmbh | Methods for synthesizing amatoxin building block and amatoxins |
| EP3888691A1 (en) | 2016-11-14 | 2021-10-06 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. | Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers |
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