JP4449015B2

JP4449015B2 - シクロスポリン誘導体の製造方法

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Publication number: JP4449015B2
Application number: JP2004007488A
Authority: JP
Inventors: 一雄大田; 仁上松; 桂金子; 外志夫土田
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 2004-01-15
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2024-01-15
Also published as: JP2005198543A

Description

本発明は、シクロスポリンＡの血中及び尿中代謝物の定量測定用標準品として利用可能なシクロスポリン誘導体の生物学的変換による製造方法に関する。

式(II)で示されるシクロスポリン誘導体は、主にシクロスポリンＡの血中及び尿中代謝物の定量測定用標準品として用いられる（非特許文献１参照）。

（式中、Ｒ¹が水酸基のときは、Ｒ²はメチル基、Ｒ³は水素原子を示し、
Ｒ²が水素原子のときは、Ｒ¹およびＲ³は水素原子を示し、
Ｒ³が水酸基のときは、Ｒ¹は水素原子、Ｒ²はメチル基を示す。）

式(II)で示されるシクロスポリン誘導体の製造方法は、兎の肝臓をすりつぶした後に遠心分離により調製した肝ミクロゾーム画分にシクロスポリンＡを加えて酵素変換によりシクロスポリン誘導体を製造する方法（非特許文献２参照）、シクロスポリンＡを投与した動物の尿から代謝物であるシクロスポリン誘導体を製造する方法（非特許文献３参照）がある。しかし、これらの生物学的変換法ではシクロスポリン誘導体を大量に製造することは困難である。

クリニカル・バイオケミストリー（Clin. Biochem.）24,23-35(1991) ファーマコロジカル・リサーチ（Pharmacol. Res.）28,73-84(1993) クリニカル・ケミストリー（Clin. Chem.）39,457-466(1993)

本発明は、大量製造が可能な生物学的変換方法によるシクロスポリンＡを原料とした、式(II)で示されるシクロスポリン誘導体の新規な製造方法を提供するものである。

本発明者らは、上記課題を解決するために広範な微生物群から下記式（I）で示されるシクロスポリンＡを選択的に水酸化または脱メチル化し、式(II)で示されるシクロスポリン誘導体に変換しうる微生物を探索したところ、高い選択性を有する微生物を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、式(I)

で表されるシクロスポリンＡの
式(II)

（式中、Ｒ¹が水酸基のときは、Ｒ²はメチル基、Ｒ³は水素原子を示し、
Ｒ²が水素原子のときは、Ｒ¹およびＲ³は水素原子を示し、
Ｒ³が水酸基のときは、Ｒ¹は水素原子、Ｒ²はメチル基を示す。）
で表されるシクロスポリン誘導体への生物学的変換方法による、式(II)で示されるシクロスポリン誘導体の製造方法であって、
(Ａ)前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ノカルディア（Nocardia）属、シュウドノカルディア（Pseudonocardia）属またはストレプトスポランギウム（Streptosporangium）属のいずれかの属に属する菌株またはその培養菌体の存在下で、式(I)で示されるシクロスポリンＡをインキュベーション処理する工程、
(Ｂ)インキュベーション処理液から式(II)で示されるシクロスポリン誘導体を採取する工程、
を含んでなる方法、を提供するものである。

本発明の生物学的変換方法では、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ノカルディア（Nocardia）属、シュウドノカルディア（Pseudonocardia）属またはストレプトスポランギウム（Streptosporangium）属のいずれかの属に属し、前記式(I)で示されるシクロスポリンＡを前記式(II)で示されるシクロスポリン誘導体へ変換する能力を有する微生物の培養菌体またはその培養菌体の調製物であれば、種および株の種類を問うことなく使用することができる。

特に式(II-A)

で表されるシクロスポリン誘導体を製造するときには、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）属またはストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌株を用いることができる。

そのような微生物の好ましい例として、ダクチロスポランギウム・バリエスポラム（Dactylosporangium variesporum）NBRC14104株、ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）AF528株を挙げることができる。

ダクチロスポランギウム・バリエスポラムNBRC14104株は、NBRC:独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門に保存されており、容易に入手することができる。また、ストレプトミセス・エスピーAF528株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年１２月３日付けでStreptomyces sp. AF528として寄託されている(受託番号 FERM P-19605)。

なお、AF528株の菌学的性状は次のとおりである。
（1）菌体成分
AF528株の細胞壁からLL型のジアミノピメリン酸が検出された。
菌体の主要脂肪酸としてＣ_{16:0 ISO}、Ｃ_{15:0 ANTEISO}、Ｃ_{17:1 ANTEISO}などが検出されたが、10-メチル脂肪酸は検出されなかった。主要メナキノン成分としてMK-9(H6)、MK-9(H8)が検出された。

(2)16S rDNAの部分塩基配列（約500塩基）の解析
AF528株の培養液を集菌後、PrepMan Method(Applied Biosystems社製)を用いてDNA抽出を行った。PCR増幅には、MicroSeq500 16SrDNA Kit(Applied Biosystems社製) を用い、PCR産物の精製、サイクルシークエンスには、MicroSeq500 16SrDNA Bacterial Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いた。サーマルサイクラーには、GeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems社製)を、DNAシークエンサーにはABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製)を使用した。なお、基本操作はApplied Biosystems社製のプロトコール（P/N4308132 Rev.A）に従った。得られた本菌株の16s rRNA遺伝子の5'末端側の約500塩基は、配列番号１のとおりである。

MicroSeq Bacterial Identification System Software V.1.4.1を用い、得られた16s rDNAの部分塩基配列をデータベース（MicroSeq Bacterial 500 Library v.0023、Applied Biosystems社）の配列データと比較し、相同性を調べた。

その結果、AF528株の16s rDNAの部分塩基配列は、Streptomyces californicusの16s rDNAの部分塩基配列とは97.6％、Streptomyces griseoplanusの16s rDNAの部分塩基配列とは97.4％、Streptomyces anulatusの16s rDNAの部分塩基配列とは97.2％の相同性を示した。

以上の菌学的性状から、本発明者らは本菌株がストレプトミセス（Streptomyces）属に属すると判断した。

また、式(II-B)

で表されるシクロスポリン誘導体を製造するときには、ノカルディア（Nocardia）属またはシュウドノカルディア（Pseudonocardia）属に属する菌株を用いることができる。

そのような微生物の好ましい例として、ノカルディア・エスピー（Nocardia sp.）610株、シュウドノカルディア・オウトトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica） ATCC35204株を挙げることができる。

ノカルディア・エスピー（Nocardia sp.）610株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年１２月３日付けでNocardia sp. 610として寄託されている(受託番号 FERM P-19607)。また、シュウドノカルディア・オウトトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica） ATCC35204株は、ATCC:American Type Culture Collectionに保存されており、容易に入手することができる。

さらに式(II-C)

で表されるシクロスポリン誘導体を製造するときには、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）属またはストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌株を用いることができる。

そのような微生物の好ましい例として、ストレプトスポランギウム・エスピー（Streptosporangium sp.） AF935株、ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）NBRC13785株等を挙げることができる。

ストレプトスポランギウム・エスピー（Streptosporangium sp.） AF935株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年１２月３日付けでStreptosporangium sp. AF935として寄託されている(受託番号 FERM P-19606)。また、ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）NBRC13785株は、NBRC:独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門に保存されており、容易に入手することができる。

なお、AF935株の菌学的性状は次のとおりである。
（1）菌体成分
AF935株の細胞壁からmeso型のジアミノピメリン酸が検出された。
菌体の主要脂肪酸としてＣ_{16:0 ISO}、Ｃ_{17:0 10Methyl}、Ｃ_{16:0 10Methyl}などが検出された。主要メナキノン成分としてMK-9、MK-9(H2)、MK-9(H4)が検出された。

(2)16S rDNAの部分塩基配列（約500塩基）の解析
AF935株の培養液を集菌後、PrepMan Method(Applied Biosystems社製)を用いてDNA抽出を行った。PCR増幅には、MicroSeq500 16SrDNA Kit(Applied Biosystems社製) を用い、PCR産物の精製、サイクルシークエンスには、MicroSeq500 16SrDNA Bacterial Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いた。サーマルサイクラーには、GeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems社製)を、DNAシークエンサーにはABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製)を使用した。なお、基本操作はApplied Biosystems社製のプロトコール（P/N4308132 Rev.A）に従った。得られた本菌株の16s rRNA遺伝子の5'末端側の約500塩基は、配列番号２のとおりである。

その結果、AF935株の16s rDNAの部分塩基配列は、Streptosporangium roseumおよびStreptosporangium vulgareの16s rDNAの部分塩基配列とは98.4％、Streptomyces griseoplanusの16s rDNAの部分塩基配列とは97.4％、Streptosporangium nondiastaticumの16s rDNAの部分塩基配列とは96.6％の相同性を示した。

以上の菌学的性状から、本発明者らは本菌株がストレプトスポランギウム（Streptosporangium）属に属すると判断した。

本発明によれば、前述した性質をもつ微生物の培養菌体またはその培養菌体の調製物の存在下で、出発原料(基質)であるシクロスポリンＡがインキュベーション処理される。この処理は前記微生物を培養する際に、その培養液中に基質を添加して行うか、あるいは場合により前記微生物の培養菌体を集菌し、例えばそのまま、もしくは凍結乾燥処理、噴霧乾燥処理、有機溶媒（例えばアセトン）処理、破砕処理等の前処理を行った後に緩衝液中に懸濁し、これに基質を添加し、インキュベーションして行うこともできる。

培養液への基質の添加は、培養前または培養開始後一定期間経過したときのいずれの時期に行ってもよい。上記菌体は上記の微生物を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造できる。このような培養菌体の調製物を用意するための微生物の培養および、基質が添加された状態で行われる微生物の培養は、原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことができるが、通常は液体培養による振とう培養、通気攪拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。

培養に用いられる培地としては、これら微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地等いずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としてのグルコース、マルトース、キシロース、フルクトース、シュークロース、スターチ、デキストリン、グリセリン、マンニトール、オートミール、エタノール等を単独または組合せて用いることができる。

窒素源としては、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、麦芽エキス、酵母エキス、尿素、クエン酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム等の無機窒素源を、単独または組合せて用いることができる。その他、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、ビタミン類も必要に応じ添加して使用することができる。なお、培養中発泡が著しいときは、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。

好適な培地として、例えば、Ｆ１培地（ポテト澱粉20g/L、グルコース10g/L、大豆粉20g/L、リン酸二水素カリウム1g/L、硫酸マグネシウム・７水和物0.5g/L）あるいはＣ培地（ポテト澱粉20g/L、グルコース20g/L、大豆粉20g/L、酵母エキス5g/L、塩化ナトリウム2.5g/L、炭酸カルシウム3.2g/L、金属イオン混合液2mL/L（金属イオン混合液組成：硫酸銅・５水和物0.25g/L、硫酸亜鉛・７水和物0.25g/L、塩化マンガン・４水和物0.25g/L））を挙げることができる。

培養条件は、上記微生物が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、pH5.0〜10.0、20〜30℃、好ましくはpH6.5〜8.0、25〜28℃であり、通常1〜3日、好ましくは2〜3日程度培養する。上述した各種の培養条件は、使用する微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できる。

また、培養菌体の調製物は、培養終了後、遠心分離または濾過により分離した菌体または凍結乾燥処理、噴霧乾燥処理、有機溶媒処理、破砕処理等の前処理を行った菌体を適当な溶液に懸濁して調製する。菌体の懸濁に使用できる溶液は、前記した培地であるか、あるいはトリス-酢酸、トリス-塩酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等の緩衝液を単独または混合したものである。また、必要に応じてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）還元型〔NAD(P)H〕を添加する。緩衝液のpHは、好ましくは6.0〜9.0、さらに好ましくは7.0〜8.5である。

基質となるシクロスポリンＡは、そのまま、あるいは水溶性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド(DMSO)等に溶解して培養液または菌体の懸濁液に添加することができ、その添加量は、例えば培養液の場合、培養液１リットル当り0.01〜15gであり、好ましくは0.1〜2gである。基質の添加は一度に行ってもよいが、添加量が比較的多い場合は、数度にわたって、または連続的に行ってもよい。基質添加後は、１〜３日間、好ましくは１日間、振とうあるいは通気攪拌等の操作を行い、反応を進行させることにより基質である式(I)で示されるシクロスポリンＡを、式(II)で示される目的のシクロスポリンＡ誘導体に変換することができる。

こうして生成した、目的の式(II)で示される目的のシクロスポリンＡ誘導体を反応混合物から単離するには、種々の既知精製手段を選択、組合せて行うことができる。例えば、疎水性吸着樹脂への吸着・溶出や、酢酸エチル、ｎ-ブタノール等を用いた溶媒抽出、シリカゲル等によるカラムクロマトグラフィー法、あるいは薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組合せ、場合により反復使用することにより、分離精製することができる。

以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。また培養液からのシクロスポリンＡおよびその誘導体の分析は高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLC）を用いて行った。分析条件は、カラムはInertsil ODS-3 (4.6 mmI.D.×150 mm：ジーエルサイエンス社製)、移動相はH₂O/CH₃CN=28/72 (V/V)、カラム温度は75℃、流速は1.0 mL/min、検出は波長215 nmのUV吸収で行った。本分析条件でのシクロスポリンＡ、式(II-A)で示されるシクロスポリン誘導体、式(II-B)で示されるシクロスポリン誘導体、式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体の保持時間は、それぞれ11.5分、5.0分、7.1分、5.1分であった。なお、下記の例中のパーセント(％)は、特に断りのない限り、容量パーセントを示す。

実施例１（式(II-A)で示されるシクロスポリン誘導体の製造）
Ｃ培地[グルコース20g/L、スタビローズ20g/L、酵母エキス5g/L、大豆粉20g/L、炭酸カルシウム3.5g/L、塩化ナトリウム3.0g/L、pH7.4]を500mL容エルレンマイヤーフラスコに50mL分注し、121℃、20分間高圧蒸気滅菌した。これにISP2斜面寒天培地に生えたダクチロスポランギウム・バリエスポラムNBRC14104株を接種し、28℃、220rpm、72時間回転振とう培養した。得られた培養液を同様に殺菌した100mLのNo.3培地[グリセリン2％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、肉エキス0.5％、(NH₄)₂HPO₃ 0.1％、CaCO₃ 0.32 ％、NaCl 0.25％、MgSO₄・7H₂O 0.03％、殺菌前pH 7.0]を入れた500mL容のエルレンマイヤーフラスコ50本に1mLずつ植菌し、28℃で72時間振とう培養を行った。この培養液にフラスコ当たり1.25mLのDMSOに溶かしたシクロスポリンＡを10mg添加して（最終濃度100mg/L）、28℃で振とうしながら変換反応を24時間行った。

変換反応終了後、約５Lの集めた反応液から6000rpm、10分の遠心分離によって菌体を除いて上清を得た。この上清を等量のトルエンで２回抽出してシクロスポリンＡおよびその変換物をトルエン層に抽出した。トルエン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下にトルエンを留去して残渣を得た。残渣を少量のトルエンで溶かして水飽和酢酸エチルで充填したシリカゲルカラム（15mm I.D.×390mm、シリカゲル60N（関東化学社製）30g）に付し、水飽和酢酸エチルで溶出した。溶出液は約16mLずつ分画し各フラクションをHPLCで分析して、式(II-A)で示されるシクロスポリン誘導体を含んでいるフラクションNo.16〜32を一つにまとめて減圧下に溶媒を留去して式(II-A)で示されるシクロスポリン誘導体の粗精製物を51.7mg得た。さらに、分取HPLC(移動相：水/アセトニトリル=30/70 (V/V)、カラム：Inertsil ODS-3 10mmI.D.×250mm、カラム温度：75℃、流速：5.0 mL/min)によるピーク分取を行い、分取画分のアセトニトリルを減圧下に除いた後、凍結乾燥により目的の式（II-A）で示されるシクロスポリン誘導体を49.5 mg得た。

実施例２（式(II-B)で示されるシクロスポリン誘導体の製造）
Ｃ培地を500mL容エルレンマイヤーフラスコに50mL分注し、121℃、20分間高圧蒸気滅菌した。これにISP2斜面寒天培地に生えたノカルディア・エスピー（Nocardia sp.）610株を接種し、28℃、220rpm、72時間回転震盪培養した。得られた培養液を同様に殺菌した100mLのNo.12培地[グルコース2％、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、コーンスティープリカー１％、乾燥酵母0.3％、CaCO₃0.3％、NaCl１％、殺菌前pH 7.4]を入れた500mL容のエルレンマイヤーフラスコ50本に1mLずつ植菌し、28℃で72時間振とう培養を行った。この培養液にフラスコ当たり1.25mLのDMSOに溶かしたシクロスポリンＡを10mg添加して（最終濃度100mg/L）、28℃で振とうしながら変換反応を24時間行った。

変換反応終了後、約５Lの集めた反応液から6000rpm、10分の遠心分離によって菌体を除いて上清を得た。この上清を等量のトルエンで２回抽出してシクロスポリンＡおよびその変換物をトルエン層に抽出した。トルエン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下にトルエンを留去して残渣を得た。残渣を少量のトルエンで溶かして水飽和酢酸エチルで充填したシリカゲルカラム（15mm I.D.×390mm、シリカゲル60N（関東化学製）30g）に付し、水飽和酢酸エチルで溶出した。溶出液は約16mLずつ分画し各フラクションをHPLCで分析して、式(II-A)で示されるシクロスポリン誘導体を含んでいるフラクションNo.17〜30を一つにまとめて減圧下に溶媒を留去して式(II-B)で示されるシクロスポリン誘導体の粗精製物を21.0mg得た。さらに、分取HPLC(移動相：水/アセトニトリル=30/70 (V/V)、カラム：Inertsil ODS-3 10mmI.D.×250mm、カラム温度：75℃、流速：5.0 mL/min)によるピーク分取を行い、分取画分のアセトニトリルを減圧下に除いた後、凍結乾燥により目的の式（II-B）で示されるシクロスポリン誘導体を15.5mg得た。

実施例３（式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体の製造）
Ｃ培地を500mL容エルレンマイヤーフラスコに50mL分注し、121℃、20分間高圧蒸気滅菌した。これにISP2斜面寒天培地に生えたストレプトスポランギウム・エスピー（Streptosporangium sp.） AF935株を接種し、28℃、220rpm、72時間回転震盪培養した。得られた培養液を同様に殺菌した500mL容のエルレンマイヤーフラスコに入れた100mLのDF3培地[可溶性澱粉5.0％、コーンスティープリカー3.0％、リン酸一カリウム0.05％、硫酸マグネシウム・７水和物0.05％、炭酸カルシウム0.5％、pH7.0]50本に1mLずつ植菌し、28℃で72時間振とう培養を行った。この培養液にフラスコ当たり1.25mLのDMSOに溶かしたシクロスポリンＡを10mg添加して（最終濃度100mg/L）、28℃で振とうしながら変換反応を24時間行った

変換反応終了後、集めた反応液５Lを6000rpm、10分の遠心分離によって菌体を除いて上清を得た。この上清を等量のトルエンで２回抽出して代謝物をトルエン層に抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下にトルエンを留去して残渣を得た。残渣を少量のトルエンで溶かして水で飽和した酢酸エチルで充填したシリカゲルカラム（15mm I.D.×390mm、シリカゲル60N（関東化学製）30g）に付し、溶出液は約30mLずつ分画し各フラクションをHPLCで分析して、式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体を含んでいるフラクションNo.19〜30を一つにまとめて減圧下に溶媒を留去して式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体の粗精製物を17.0mg得た。さらに、分取HPLC(移動相：水/アセトニトリル=30/70、カラム：Inertsil ODS-3 10mm I.D.×250mm、カラム温度：75℃、流速：5.0 mL/min)によるピーク分取を行い、分取画分のアセトニトリルを減圧下に除いた後、凍結乾燥により目的の式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体15.0mgを得た。

実施例４（式(II-A)で示されるシクロスポリン誘導体の製造）-2-
ストレプトミセス・エスピー AF528株を用いて式(II-A)で示されるシクロスポリン誘導体の製造を行った。本培養の培地がNo.19培地[グルコース 0.2％、ポテト澱粉 0.2％、グリセリン 4％、ペプトン 0.5％、酵母エキス 0.5％、大豆粉 0.5％、乾燥酵母 0.5％、CaCO₃ 0.2％、NaCl 0.5％、殺菌前pH 6.4]である以外は実施例１と同様に行い、目的の式（II-A）で示されるシクロスポリン誘導体を12.1mg得た。

実施例５（式(II-B)で示されるシクロスポリン誘導体の製造）-2-
シュウドノカルディア・オウトトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica） ATCC35204株を用いて式(II-B)で示されるシクロスポリン誘導体の製造を行った。本培養の培地がDF3培地であること以外は実施例２と同様に行い、目的の式(II-B) で示されるシクロスポリン誘導体を8.2mg得た。

実施例６（式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体の製造）-2-
ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）NBRC13785株を用いて式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体の製造を行った。使用菌株以外は実施例３と同様に行い、目的の式(II-C) で示されるシクロスポリン誘導体を5.6mg得た。

Claims

式(I)

で表されるシクロスポリンＡの
式(II-C)

で表されるシクロスポリン誘導体への生物学的変換方法による、式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体の製造方法であって、
(Ａ)前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、ストレプトミセス（Streptomyces）属またはストレプトスポランギウム（Streptosporangium）属に属する菌株またはその培養菌体の存在下で、式(I)で示されるシクロスポリンＡをインキュベーション処理する工程、
(Ｂ)インキュベーション処理液から式(II-C)で示されるシクロスポリン誘導体を採取する工程、
を含んでなる方法。